TW201920274A - 抗人類IgG4單株抗體,及利用該抗體之人類IgG4測定試藥 - Google Patents
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Abstract
提供抗原決定位存在於序列編號4表示的人類IgG4之CH3的抗人類IgG4之單株抗體、產生其之融合瘤、使用該單株抗體之IgG4之檢測方法及使用於其之套組。
Description
本發明係關於抗人類IgG4單株抗體,及利用該抗體之人類IgG4測定試藥。 若使用本發明之抗人類IgG4抗體,可特異性地檢測測定試樣中之人類IgG4,於IgG4相關疾病等之診斷或臨床檢査的領域中極為有效。
近年來提倡IgG4相關疾病之新的疾病概念,其係具有於全身之各臟器產生之可能性的疾病,故必需可進行已知之各臟器疾病與其之鑑別(非專利文獻1)。IgG4相關疾病綜合診斷基準2011受到提倡,擬定了將血液中之IgG4值135mg/dL以上定為高IgG4血症的診斷基準。被檢驗患者中亦有報告了超過5000mg/dL之例子,於臨床檢査之現場中呈現疑似低值之檢査結果被視為問題(非專利文獻2)。又,血中IgG4測定試藥,被要求應用於在醫院及檢査中心等廣為導入的通用型之一般生化學自動分析裝置。
血中IgG4測定試藥對通用自動分析裝置應用時,可列舉以下之2個課題。 IgG4為具備約146000之分子量的異四聚體分子,使用抗體係適於檢測該分子。 因此,作為第1課題,可列舉作為測定試藥之重要構成要素的抗體之特異性。IgG4為IgG次類型之1種,已知與其他次類型IgG1、IgG2或IgG3之相同性非常高(非專利文獻3、非專利文獻4)。通常健康者血清中約以IgG1:65%、IgG2:23%、IgG3:8%、IgG4:4%之比例存在,健康者中之基準值係IgG1:351~962;IgG2:239~838;IgG3:8.5~140;IgG4:4.5~117(mg/dL),由於IgG4之量比少,故必需製作具有可僅反應於IgG4之優良特異性的抗體。
作為使用抗體之測定方法,係使用間接酵素抗體法(ELISA法)、間接螢光抗體法、CLEIA法(化學發光酵素免疫測定法)等之間接抗體法;單向放射狀免疫擴散法(single radial immunodiffusion method:SRID)或雙向免疫擴散法(double immunodiffusion method:DID)等之免疫擴散法;分類為免疫比濁法(immunoturbidimetry:TIA)或免疫散射比濁法(immunonephelometry:NIA)之乳膠(粒子)凝集法等,但目前於臨床檢査之現場常用者,為即使以低濃度之標的分子亦可檢測之基於檢測抗原與抗體之結合所致之凝集體的乳膠(粒子)凝集法等之免疫比濁法(immunoturbidimetry:TIA)或免疫散射比濁法(immunonephelometry:NIA)。 但是血液或尿等試樣中之抗原濃度大幅大於測定範圍時,有誘導抗原過剩所致之凝集抑制的可能性(稱作帶現象或前驅(prozone)現象)。其結果,測定值成為假性低值,有造成誤診斷之虞。IgG4的情況時,如上述般,健康者與高IgG4血症患者之間有近1000倍之濃度差,實際上於IgG4測定試藥中產生前驅現象的事例係有被報告(非專利文獻2)。 因此,作為第2課題,係要求作為血中IgG4測定試藥,亦測定出高濃度之IgG4。
關於前述第1課題,已知有對人類IgG4之單株抗體(專利文獻1)。但是,IgG次類型當中雖對IgG4之特異性高,但一般而言單株抗體之認識部位(抗原決定位)係為1個,故對於抗體:抗原之凝集體形成而言可能有不適宜的情況。可應用於使用免疫比濁法之IgG4之測定的IgG4特異性單株抗體尚未為人所知,且可適應於使用單株抗體之通用自動分析裝置的IgG4測定試藥亦尚未為人所知。 作為解決該問題之方法,可列舉藉由使單株抗體成為擬多價,而亦解決前述課題2之方法。例如,專利文獻2中記載將單株抗體生物素化,以鏈黴親和素(streptavidin)形成多聚體之方法,專利文獻3中記載使用蛋白質A或抗免疫球蛋白抗體等而形成多聚體之方法,進而專利文獻4中記載將單株抗體固定化於不溶性承載體之方法。但是,不管何種方法,用以形成單株抗體之多價的步驟均為繁雜,特別是難以將抗體之價數經常控制為一定,係有維持作為以免疫比濁法為測定原理的通用自動分析裝置對應之試藥的性能耗費成本與時間的缺點。 用以得到多株抗體之方法即基於一般的動物實驗性手法,將人類IgG4對山羊、綿羊,或兔子等誘發免疫以取得該抗血清,所產生之抗體絕大部分為抗各IgG次類型所共通部分者,必需有對IgG4以外之其他次類型亦可反應的抗體之吸收步驟,至獲得抗IgG4之特異性抗體為止,需要非常繁雜的純化步驟。該抗血清中所含有的抗IgG4之特異性抗體的相對或絕對的存在量,與藉由前述純化步驟,所期望之抗IgG4之特異性抗體的產量非常少之問題受到顧慮。 又,已知有取得對IgG次類型之任一種而言特異性高的多株抗體之方法(專利文獻5)。依照該方法,不需如上述之純化步驟,因免疫耐受而可取得抗原特異性之多株抗體,但免疫耐受之誘發程度,係存在有受誘發免疫之動物個體差,又,至引起免疫耐受為止,耗費時間,故欲恆定地取得所期望之抗IgG4之特異性抗體,必需有多數的被免疫動物,就成本以及動物愛護之觀點而言難以說是適當的方法。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特開昭61-286754號公報 [專利文獻2]日本特開平4-350559號公報 [專利文獻3]日本特開2001-337092號公報 [專利文獻4]國際公開2008/012944號公報 [專利文獻5]日本特表2001-501579號公報 [非專利文獻]
[非專利文獻1]N Engl J Med 2012;366:539-551 [非專利文獻2]Arthritis Rheumatol. 2014 Jan;66(1):213-7 [非專利文獻3]J Mol Biol. 2014 Feb 6;426(3):630-44 [非專利文獻4]Front Immunol. 2014;5:520 [非專利文獻5]Consensus statement on the pathology of IgG4-related disease(Modern Pathology 2012 25, 1181–1192) [非專利文獻6]Epitope mapping of human immunoglobulin specific murine monoclonal antibodies with domain switched deleted and point mutated chimeric antibodies(Journal of Immunological Methods 158 1993 107-122)
[發明所欲解決之課題]
有鑑於該問題,本發明之目的為提供對IgG4特異性與親和性更高的單株抗體、產生其之融合瘤、使用該單株抗體之IgG4之檢測方法及使用於其之套組。 [用以解決課題之手段]
免疫學的粒子凝集法(乳膠(粒子)凝集法),係將抗體固定化於不溶性承載體,對其混合含有作為測定對象之抗原的試樣,藉由產生基於抗原-抗體反應之免疫凝集反應,來測定作為測定對象之抗原的方法。該方法為了提高檢測感度,所使用之抗體亦以使用多株抗體等之認識多種抗原決定位之複數種抗體為佳。其係因藉由對1個抗原分子結合複數個抗體(不溶性承載體)而引起凝集之故。另一方面各抗體分子中即使有親和性低者亦無妨。
另一方面,免疫學的粒子凝集阻止法(乳膠(粒子)凝集阻止法),係藉由混合固定化有抗原之不溶性承載體、抗抗原之游離抗體、含有抗原之試樣,使固定化於不溶性承載體之抗原與試樣中所含有的抗原進行競爭,結果抑制了凝集形成,藉以測定作為測定對象之抗原量的方法。免疫學的粒子凝集阻止法中,即使存在有大幅大於測定範圍之抗原濃度時,亦見不到前驅現象,因此就測定原理而言,可說是應用於通用自動分析裝置,且避免前驅現象之風險的理想的方法。但是,該方法不適於使用多株抗體。其係由於存在有複數個抗原決定位,容易引起透過試樣內抗原與載持於承載體之抗原的凝集,故相較於單株抗體(認識單一抗原決定位)而言,有測定系統的感度下降,難以描繪衰減曲線的可能性之故。
因以上所述,本案發明者等人深入研究的結果,成功製作適於用以檢測人類IgG4之免疫學的粒子凝集阻止法(乳膠(粒子)凝集阻止法)的單株抗體,而完成本案發明。
亦即,本發明,其本發明之構成係如以下[1]至[21]所述。 [1]一種單株抗體,其係對於人類IgG4特異性結合之單株抗體,其中前述抗體之抗原決定位,存在於序列編號4所示之人類IgG4之重鏈恆定區域的221號至327號之胺基酸序列,且包含299號之麩胺酸; [2]如[1]之單株抗體,其係以解離常數5.0×10-10
以下結合於前述人類IgG4; [3]一種單株抗體,較佳為如[1]或[2]之單株抗體,其係具有重鏈可變區域及輕鏈可變區域之抗人類IgG4之抗體,其中重鏈可變區域之互補性決定區域(Complementarity Determining Region;以下記載為CDR)1、2及3分別為序列編號9、10及11表示之胺基酸序列,輕鏈可變區域之CDR1、2及3分別為序列編號12、13及14表示之胺基酸序列; [4]如[3]之單株抗體,其中重鏈可變區域具有序列編號5之胺基酸序列,輕鏈可變區域具有序列編號6之胺基酸序列; [5]如[4]之單株抗體,其係融合瘤MaI4-08所產生。
[6]一種單株抗體,較佳為如[1]或[2]之單株抗體,其係具有重鏈可變區域及輕鏈可變區域之抗人類IgG4之抗體,其中重鏈可變區域之互補性決定區域CDR1、2及3分別為序列編號15、16及17表示之胺基酸序列,抗體之輕鏈可變區域之CDR1、2及3分別為序列編號18、19及20表示之胺基酸序列; [7]如[6]之單株抗體,其中重鏈可變區域具有序列編號7之胺基酸序列,輕鏈可變區域具有序列編號8之胺基酸序列; [8]如[7]之單株抗體,其係融合瘤MaI4-09所產生。
[9]一種每1分子具備2個以上之如[1]~[8]中任一項之單株抗體之抗原(認識)結合部位之多價抗體或多價抗體片段、更佳為每1分子具備2個之二價抗體或二價抗體片段; [10]如[9]之抗體片段,其係F(ab’)2
。
[11]一種方法,其係使用如[1]~[8]中任一項之單株抗體或如[9]或[10]之抗體片段,來測定檢測試樣中之人類IgG4; [12]如[11]之方法,其係免疫比濁法或免疫散射比濁法; [13]如[12]之方法,其係免疫學的粒子凝集法; [14]如[12]之方法,其係免疫學的粒子凝集阻止法; [15]如[11]之方法,其係免疫組織化學(IHC)染色; [16]如[11]之方法,其係以流動式細胞分析進行。
[17]一種方法,其係如[14]之方法;其係藉由 (1)使試樣中之人類IgG4與如[1]~[8]中任一項之單株抗體或如[9]或[10]之抗體片段結合;接著 (2)添加固定有人類IgG4或其胜肽片段之不溶性承載體,與未與試樣中之人類IgG4結合之上述單株抗體或抗體片段之間引起凝集反應,然後 (3)檢測凝集之不溶性承載體,來檢測測定試樣中之人類IgG4。
[18]一種人類IgG4之測定套組,其包含如[1]~[8]中任一項之單株抗體或如[9]或[10]之抗體片段。
[19]一種套組,其係用於如[14]或[17]之方法之套組;其包含 (1)如[1]~[8]中任一項之單株抗體或如[9]或[10]之抗體片段; (2)單離人類IgG4或其胜肽片段;及 (3)不溶性承載體; [20]如[19]之套組,其中(2)單離人類IgG4或其胜肽片段,係吸附於(3)不溶性承載體。 [21]如[19]或[20]之套組,其中(3)不溶性承載體為乳膠粒子。
[22]如[11]~[17]中任一項之方法,其係用以輔助IgG4相關疾病之診斷; [23]如[18]~[21]中任一項之套組,其係使用於IgG4相關疾病診斷。 [24]一種經單離之胜肽,其係由序列編號4所示之人類IgG4之重鏈恆定區域之221號至327號之胺基酸序列的全部或一部分所構成,且包含299號之麩胺酸。
藉由本發明之實施形態,可效率良好地檢測定量生體試樣中之IgG4,可有助於各種疾病之診斷。例如雖不限定於此,但可有助於IgG4相關疾病(以血清IgG4高值與對罹患臟器之明顯的IgG4陽性漿細胞浸潤為特徵的全身性、慢性發炎性疾病)之診斷,如此之疾病,可列舉米庫利茲病(Mikulicz disease)、Kuttner腫瘤、涙腺炎、IgG4相關眼疾病、IgG4相關呼吸器官疾病、發炎性假性腫瘤、縱隔纖維症、腸炎、硬化性膽管炎、IgG4相關肝疾病、本身免疫性胰臟炎(AIP)、IgG4相關腎臟病、腹膜後纖維變性、攝護腺炎、本身免疫性腦下垂體炎、甲狀腺炎、肥厚性硬膜症、IgG4相關淋巴節症、關節炎、發炎性腹部大動脈瘤、動脈周圍炎。
本發明之實施形態之單株抗體,例如係以純化人類IgG4為免疫原來誘發動物之免疫,使該動物產生之抗人類IgG4抗體產生細胞與骨髓腫瘤細胞融合以得到的融合瘤所產生。所用的動物並無限定,係有人類以外之動物例如小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、兔子等。特佳為IgG之次類型為IgG1、IgG2a、IgG2b,及IgG3之小鼠。
上述融合瘤可藉由以下方法得到。亦即,將人類IgG4,使用Freund之完全、不完全佐劑、氫氧化鋁佐劑、百日咳佐劑等之已週知者一起混合,製作致敏用佐劑液,分為數次對小鼠、大鼠等之動物每隔1~3週對腹腔內皮下或尾靜脈給與藉以誘發免疫。致敏抗原量係1μg~100mg之間,一般而言較佳為50μg左右。免疫次數一般為2~7次,但已知有各種方法。接著使來自脾臟等之抗體產生細胞與骨髓腫瘤細胞(骨髓瘤細胞)等之於試驗管內具有增殖能力的細胞融合。抗體產生細胞可由小鼠、裸小鼠、大鼠等之脾臟等得到。 作為上述融合法,可藉由其本身已週知之Kohler與Milstein的固定方法(Nature.256,495.1975),使用聚乙二醇(PEG)來融合。亦可藉由仙台病毒、電融合法來進行融合。
由上述融合之細胞選擇產生認識人類IgG4之抗體的融合瘤之方法,可如下般進行。亦即,藉由限數稀釋法,自藉由HAT培養基及HT培養基中生存之細胞所製作的群落中選擇融合瘤。於由播種於96孔盤等中之融合細胞所成之群落培養上清液中含有抗人類IgG4之抗體時,於將人類IgG4固定化於試驗盤上的分析盤上置入上清液,反應後藉由使抗小鼠免疫球蛋白-HRP標誌抗體等之2次標誌抗體進行反應的ELISA法,可選擇抗人類IgG4之單株抗體產生殖株。標誌抗體之標誌物質,除了HRP以外,且可使用鹼性磷酸酯酶等之酵素、螢光物質、放射性物質等。又,可藉由以僅結合有阻攔(blocking)劑之BSA的分析盤同時進行ELISA,作為控制組,來篩選人類IgG4特異性抗體。換言之可選擇於人類IgG4試驗盤為陽性、於BSA之ELISA為陰性的殖株。
本發明之實施形態之融合瘤,於產生認識人類IgG4之單株抗體的融合瘤當中,特別以產生與人類IgG4結合,且不結合於其他人類免疫球蛋白(其他IgG(IgG1、IgG2、IgG3)、IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE及IgM)抗體的融合瘤為期望。 此處,「結合於人類IgG4,且不結合於其他人類免疫球蛋白」,例如簡便而言係指於通常之ELISA中,使下述以外之測定條件為相同時,含有人類IgG4作為作為固相抗原時,以不含任何人類免疫球蛋白者為對照(空白)時之吸光度的比顯示為40以上、較佳為50以上、更佳為100以上者,且,含有人類IgG4以外作為固相抗原時,以不含任何人類免疫球蛋白者作為對照(空白)時之吸光度的比為顯示5以下、較佳為2以下者。 又,係指相較於其他人類免疫球蛋白,對人類IgG4顯示更高的結合親和性者,亦可使用結合速度常數與解離常數來評估。具體而言,本發明之較佳實施形態之抗體中,係以4.0×105
以上、通常4.0×105
~6.0×105
之結合速度常數,以及5.0×10-10
以下、通常5.0×10-10
~3.0×10-10
之解離常數結合於人類IgG4之重鏈恆定區域之特定抗原決定位。
上述融合瘤能夠以通常細胞培養所用的培養基,例如α-MEM、RPMI1640、ASF、S-clone等培養,由其培養上清液回收單株抗體。又,亦可將融合瘤所來源的動物、裸小鼠預先以鯊肝油烷(pristane)處理,藉由對該動物將細胞予以腹腔內注射,使腹水累積,由該腹水回收單株抗體。 由上述之上清液、腹水回收單株抗體之方法,可使用通常之方法。例如可列舉以硫酸銨、硫酸鈉等所進行的鹽析法或層析、離子交換層析、以蛋白質A、蛋白質G等所進行的親和性層析等。
可藉由使用本發明之實施形態之單株抗體的免疫測定法,高感度且特異性地檢測檢體中之人類IgG4。作為對象之檢體,可列舉自檢體採取、單離之血液、血清、血漿等。亦可為全身的病變組織,例如來自腦下垂體、涙腺、唾腺、甲狀腺、攝護腺、支氣管上皮、肺泡間隔、胰管、後腹膜、膽管壁,或風濕性關節炎滑膜的生物檢體樣品。
「免疫測定法」意指利用抗原與抗體之反應,測定生物學試樣中所含有的物質量之生化學的試驗測定法。
使用本發明之實施形態之單株抗體的「免疫測定法」之檢測方法,可列舉三明治ELISA法、化學發光酵素免疫測定法(CLEIA法)、螢光免疫測定法(FIA)、乳膠(粒子)凝集法(比濁法)等,更佳為乳膠(粒子)凝集阻止法。
「ELISA法」意指ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)/EIA(EnzymeImmuno Assay)),係指使用酵素反應來檢測定量試樣中所含物質之濃度的方法。係藉由使用基於酵素反應之顯色發光作為訊號來檢測測定對象。 「競爭ELISA法」意指測定「標誌之抗原」與「試樣中所存在之抗原」,於競爭條件下以何種比例結合於抗體的ELISA法。
「免疫比濁法」係指使抗體與抗原反應,形成免疫複合體之沈降物,對該凝集塊照射光,以自動分析器計測散射所致之照射光的衰減(吸光度)來測定檢體中所含有的抗原量之方法。
「免疫散射比濁法」係指使抗體與抗原反應,形成免疫複合體之沈降物,對該複合物照光,藉由測定散射之光,來檢測檢體中所含有的抗原之方法。
「乳膠(粒子)凝集法」,係指將抗體固相化於乳膠粒子,於抗原存在下使乳膠粒子凝集,藉由觀察該凝集,來檢測抗原之方法。 「乳膠(粒子)凝集阻止法」,係指將抗原固相化於乳膠粒子,觀察乳膠粒子之凝集,以觀察「結合於乳膠粒子之抗原」與「試樣中所存在之抗原」,於競爭條件下以何種比例結合於抗體,以間接地檢測「試樣中所存在之抗原」的方法。 不管何種情況,其凝集之觀察,可計測散射所致之照射光的衰減(吸光度)(免疫比濁法)、亦可測定散射之光(免疫散射比濁法)。
本案發明之實施形態中,「結合於乳膠粒子之抗原」不一定必需與「試樣中所存在之抗原」為同一分子,只要係於與本案發明之抗體或其抗原結合片段的結合中,與「試樣中所存在之抗原」競爭的分子即可。若相反地來定義,將本案發明之抗體使用「乳膠(粒子)凝集阻止法」時,「結合於乳膠粒子之抗原」及「試樣中所存在之抗原」較佳包含該抗體之抗原決定位。
抗原決定位(epitope)係指抗體所認識之抗原的一部分。人類IgG4,為由可變區域VL與恆定區域CL所構成的輕鏈2分子;及由可變區域VH與恆定區域CH1、絞鏈區域、恆定區域CH2及恆定區域CH3所構成的重鏈2分子;所構成之具備約146000之分子量的異四聚體分子,但抗體並非認識其全體,而是僅認識抗原之較小的一部分而結合。為了作為抗原決定位而發揮功能,至少10胺基酸殘基、更佳為5胺基酸殘基之長度為必要。該抗體結合部分亦稱為「抗原決定位」或「抗原決定基 (antigenic determinant)」。 本發明之實施形態之抗體,係要求認識IgG4,且不認識IgG1、IgG2及IgG3。由於輕鏈係於IgG1~IgG4共通,故抗原決定位期望位於重鏈、特別是重鏈恆定區域。IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之重鏈恆定區域各自係以序列編號1、2、3及4表示,期望以序列編號1~3與序列編號4之相同性低的部分為抗原決定位,如後述實施例中所實證的,就無對其他IgG次類型之交差反應,達成對IgG4之特異性結合的觀點,期望為特別是存在於人類IgG4之CH3區域,更具體而言,係存在於序列編號4所示之人類IgG4之重鏈恆定區域的221號至327號之胺基酸序列之範圍內,且包含299號之麩胺酸的抗原決定位。換言之,本發明之較佳實施形態之抗體的抗原決定位,係由序列編號4所示之人類IgG4之重鏈恆定區域之221號至327號之胺基酸序列的全部或一部分所構成,且包含299號之麩胺酸。因此,依照本發明之較佳之其他實施形態,亦提供包含抗原決定位之胜肽,更具體而言,係由序列編號4所示之人類IgG4之重鏈恆定區域的221號至327號之胺基酸序列的全部或一部分(通常係5個至50個、較佳為10個至30個)所構成,且包含299號之麩胺酸的胜肽。
「乳膠(粒子)凝集法」,通常若不使用抗原決定位不同的複數個單株抗體(多株)則不引起凝集,但IgG4本身,係輕鏈與重鏈之異二聚體的二聚體,因此亦有即使以單株抗體亦可應用於凝集反應者。進一步地,若使複數個抗體分子吸附於乳膠粒子,則即使抗體分子為一價抗體分子(每1分子有1個抗原(認識)結合部位)亦可引起凝集。 「1價抗體」,係指將天然之抗體以木瓜蛋白酶處理所得的Fab片段,或基因工程地使輕鏈可變區域與重鏈可變區域結合之scFV(single-chain variable fragment)等。
另一方面,「乳膠(粒子)凝集阻止法」的情況時,使用複數之多株抗體等之結合常數、抗原決定位、特異性不同的抗體時,於測定系統內之反應有出現偏差的可能性,因此多株抗體不適宜。 進一步地,所用的抗體為一價抗體分子時,不引起透過抗體(吸附抗原)之乳膠粒子間的凝集反應,因此同樣不適宜。抗原(認識)結合部位,每1分子必需有2個以上,必需為天然之免疫球蛋白型(IgG(2價)、IgA(4價)、IgD(2價)、IgE(2價)及IgM(10價)),或以胃蛋白酶處理所得的F(ab’)2
(2價)或上述「1價抗體」之多聚體抗體。
「抗原(認識)結合部位」,係表示可結合於抗原之抗體的最小部位。係指包含重鏈及輕鏈之互補性決定區域(CDR)的部位,但不限定於此。亦可包含輕鏈之可變區域的VL
區域與重鏈之可變區域的VH
區域。此等可基因工程地,或透過SS鍵等來結合。
乳膠本來係指聚合物樹脂之膠體狀水分散物,但本案中,「乳膠粒子」係指具有均勻粒子徑之聚合物樹脂。只要係可用於通常之免疫測定法的乳膠粒子,則無特殊限定,較期望為以聚苯乙烯為主材料者。 本案所用之乳膠粒子的粒子徑,係50nm~500nm、較佳可為75nm~306nm、更佳可為100nm~111nm。
實施本發明之實施形態之測定方法時,可使用用以免疫測定人類IgG4之套組來進行,且其係包含(1)本發明抗體、(2)單離人類IgG4或其胜肽片段及(3)固相支持體之套組。 該套組中,可預先個別製作固相支持體與單離人類IgG4或其胜肽片段溶液,測定IgG4時,使抗體吸附於固相支持體;亦可預先以使抗體吸附於固相支持體的狀態提供。於使檢體中之單離人類IgG4或其胜肽片段與抗體結合後,為了去除未吸附於固相支持體的成分,該套組中較佳包含洗淨液。洗淨液例如可使用包含界面活性劑之Tris緩衝液。 進一步地,本發明之套組中,亦可依需要添加並包含檢體稀釋液。檢體稀釋液例如可使用Tris等之緩衝液。該緩衝液中亦可依需要添加EDTA・2Na等之鉗合劑、食鹽等之無機鹽。
「單離人類IgG4或其胜肽片段」,如上所述,係作為「結合於乳膠粒子之抗原」使用,因此必需包含本發明抗體之抗原決定位。可為將天然之IgG4分子單離純化者、亦可為基因工程地所製作之其「胜肽片段」,例如將人類IgG4之輕鏈或重鏈的恆定區域之一部分或全部予以選殖者。該人類IgG4之重鏈的恆定區域之一部分或全部,可包含序列編號4之胺基酸序列之一部分或全部。
本發明之實施形態中,亦可藉由使用本發明之單株抗體的三明治分析ELISA法,來測定IgG4。此時,作為單株抗體,於本發明抗體以外,亦可使用其他抗IgG4之別的抗體來實施。以三明治分析測定IgG4之方法的具體例子係如以下所述。首先,使作為一次抗體之本發明抗體,吸附於固相支持體,例如試驗盤,然後與檢體,例如血清中的IgG4反應,將固相支持體洗淨,接著,使所吸附之IgG4,與經生物素化的2次抗體,例如經生物素化之別的抗IgG4之單株抗體或多株抗體反應,與過氧化酶標誌鏈黴親和素反應後,進行過氧化酶酵素反應,接著進行顯色反應,藉此可檢測IgG4。又,亦可藉由使用將2次抗體直接以過氧化酶或鹼性磷酸酯酶等予以酵素標誌者,進行同樣的測定。又,結合於2次標誌抗體之物質,依測定方法,並不限於酵素,亦可為放射線同位素、螢光物質、磁性物質、膠體等。
本發明之實施形態中,進行使用本發明抗體的三明治分析ELISA時,可使用三明治分析ELISA用之套組來實施。 以三明治分析ELISA法來實施本發明之測定方法時,亦可藉由使用例如用以將IgG4進行免疫測定之套組,來測定IgG4,其係包含i)固相支持體、ii)本發明抗體、iii)經標誌之別的抗IgG4之抗體,及iv)用以檢測標誌之成分的套組。 用以檢測標誌之成分,係指用以測定抗體經標誌者的成分,標誌為生物素時,係包含過氧化酶標誌鏈黴親和素、四甲基聯苯胺之過氧化酶酵素基質,及過酸化氫之試藥,標誌為鹼磷酸酯酶時,係包含p-硝基苯基磷酸之試藥。該套組中亦可依需要包含洗淨液。 本發明中,使用該套組時,於使檢體中之IgG4結合於抗體後,為了去除未吸附於固相支持體之成分,較佳包含洗淨液。洗淨液例如可使用包含界面活性劑之Tris緩衝液。進一步地,本發明之套組中,亦可依需要,添加並包含檢體稀釋液。檢體稀釋液例如可使用Tris等之緩衝液。該緩衝液中亦可依需要添加EDTA・2Na等之鉗合劑、食鹽等之無機鹽。
進一步地,於本發明中,亦可藉由利用本發明之單株抗體的組織免疫染色法檢測檢體中之人類IgG4的存在。亦即,例如由人類之腦下垂體、涙腺、唾腺、甲狀腺、攝護腺、支氣管上皮、肺泡間隔、胰管、後腹膜、膽管壁、風濕性關節炎滑膜組織等,藉由通常之方法,例如配製冷凍切片,使其與本發明之單株抗體反應,接著例如與經過氧化酶或鹼磷酸酯酶等之酵素標誌的二次抗體反應,接著顯色,藉此可特異性地檢測IgG4之存在。 如此的以組織免疫染色法所進行的檢測,可使用包含i)本發明之單株抗體、ii)經標誌之二次抗體及iii)顯色試藥作為構成成分的套組來實施。經標誌之二次抗體,例如可列舉經過氧化酶或鹼磷酸酯酶等之酵素標誌的來自動物之抗IgG抗血清、抗IgG多株抗體等,顯色試藥係使用用以使標誌所用的酵素顯色之通常使用的顯色基質等之試藥。
本發明中,進行使用本發明抗體的化學發光酵素免疫測定法(CLEIA法)、螢光免疫測定法(FIA)或乳膠凝集法時,可各使用週知之化學發光酵素免疫測定法(CLEIA法)用套組、螢光免疫測定法(FIA)用套組或乳膠凝集法用之套組來實施。 [實施例]
藉由以下之實施例、比較例及參考例以更詳細說明本發明,但本發明不受此等實施例限定。
<實施例1>單株抗體之製作與評估 (1)單株抗體製作用抗原之選擇與準備 根據週知之方法(例如Kohler and Milstein,Nature (1975)256,p.495-497)製作產生認識人類IgG4之單株抗體的融合瘤。作為抗原使用的IgG4係由人類血清配製。具體而言係將人類血清藉由硫酸銨沈澱區分/透析後,遵照CaptureSelectIgG4 Affinity Matrix(Thermo Fisher Scientific股份有限公司)之產品添附文件,純化IgG4抗原。
(2)免疫 將由人類血清以上述方法純化之0.5mg/mL人類IgG4與同體積量之Freund完全佐劑(Sigma-Aldrich)充分混合至乳化,製作乳化懸浮液。將4週齡Balb/c小鼠以二乙基醚麻醉,將上述乳化懸浮液以每1隻50μg之人類IgG4實施腹腔內給與。以約2週間隔分別對小鼠注射與上述同樣地以Freund不完全佐劑(Sigma-Aldrich)所製作的乳化懸浮液6次。作為最終免疫,係由上述第6次注射起約3週後,同樣地注射乳化懸浮液。
(3)融合瘤之確立 自最終免疫起3日後,於二乙基醚麻醉下,將外科手術所摘出的脾臟予以無菌性地分散,配製脾臟細胞。使用聚乙二醇,使脾臟細胞數與骨髓瘤細胞P3-X63-Ag8-U1(P3U1)數之融合比率為5:1,來實施融合。將融合細胞分散於10% FBS(HyClone公司)ASF(COSMO BIO股份有限公司)HAT(COSMO BIO股份有限公司)培養基,分注於48孔試驗盤(住友Bakelite),於37℃、5% CO2
條件下培養。以下之篩選所用的融合瘤群落數為4481。
(4)篩選 以1)對IgG4之結合能力確認、2)特異性確認、3)對免疫學的凝集阻止法之適應性確認的3階段來實施所得融合瘤之篩選。
1)對IgG4之結合能力評估 將使用作為上述抗原之純化的人類IgG4以0.1μg/孔的方式分注於96孔試驗盤(Nunc)。以振盪器以700rpm、25.0℃之條件振盪1小時。廢棄液體而以300μL之PBST(10mM磷酸二氫鈉;150mM氯化鈉;0.05%聚氧乙烯(20)山梨醇酐單月桂酸酯;pH7.4)洗淨3次後,添加100μL之阻攔緩衝液(10mM磷酸二氫鈉;150mM氯化鈉;1%Blockace粉末(大日本住友製藥);pH7.4),4℃保存1夜以上。同樣地以PBST洗淨後,各添加100μL之融合瘤群落之培養上清液,於與上述相同條件下振盪。同樣地以PBST洗淨後,各添加100μL之經抗體稀釋緩衝液(10mM磷酸二氫鈉;150mM氯化鈉;0.05%聚氧乙烯(20)山梨醇酐單月桂酸酯;0.05%牛血清白蛋白;pH7.4)稀釋10000倍的抗小鼠IgG(H+L) HRP標誌抗體(Life Technologies),於與上述相同條件下振盪。同樣地以PBST洗淨後,添加100μL之SureBlue(KPL)。於室溫靜置15分鐘後,添加100μL之0.5mol/L硫酸(和光純藥工業)。以微試驗盤讀取儀(BIO-RAD)測定波長450nm。合計4481孔中,選定確認有對IgG4之結合能力的192孔。將選定之融合瘤予以單殖株化,繼續培養。
2)特異性評估 評估由於1)中選定之殖株所產生的抗體之特異性。將Myeloma人類IgG1(EMD Millipore)、Myeloma人類IgG2(EMD Millipore)、Myeloma人類IgG3(Sigma-Aldrich)、Myeloma人類IgG4(EMD Millipore)以PBS(-)調整為1μg/mL。將所調整之試樣於96孔試驗盤(Thermo Fisher)中各添加100μL。以振盪器振盪以後之操作係與上述1)同樣地進行。192殖株中,選定相較於Myeloma人類IgG1、2、3,對Myeloma人類IgG4顯示較強的反應之8殖株。
(3)對免疫學的粒子凝集阻止法之適應性評估 於由2)中選定之殖株所產生的抗體中,評估對免疫學的凝集阻止法之適用性。 1)第一試藥(R1)之配製 於2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)緩衝溶液1中,添加各含有如上述般選定之8殖株由來的產生抗體之溶液,使成為15μg/mL之濃度,作為第一試藥。 2)第二試藥(R2)之配製 於2%濃度之粒徑107nm的聚苯乙烯製之乳膠粒子溶液18mL中,添加自人類血清以通常方法粗純化之人類IgG4 0.35mg/mL溶液18mL,於室溫攪拌1小時,使人類IgG4物理吸附於乳膠粒子。之後以20,000rpm進行90分鐘離心分離,將上清液廢棄,回收沈澱物。於該沈澱物添加含有3%濃度牛血清白蛋白之被覆緩衝液24mL使其懸浮,進行超音波處理使完全分散後,於室溫攪拌1小時。接著,再度進行離心分離,於所得沈澱物添加12mL之HEPES緩衝溶液2使其懸浮,進行超音波處理,使完全分散後,以HEPES緩衝溶液2調整為乳膠濃度0.12%得到人類IgG4致敏乳膠粒子懸浮液,使用作為對各第一試藥共通之第二試藥。 再者,各試藥之組成係如以下所述。 HEPES緩衝溶液1 25mM 2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(埼京化成工業);100mM 3-(環己基胺基)-1-丙磺酸(埼京化成工業);150mM 氯化鈉(和光純藥工業);1mM EDTA・2Na(和光純藥工業);3.3%葡聚糖70(東京化成工業);0.1% Blockace(大日本住友製藥);0.09% 疊氮化鈉(和光純藥工業);pH7.40。 被覆緩衝液 25mM 2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(埼京化成工業);150mM 氯化鈉(和光純藥工業);1mM EDTA・2Na(和光純藥工業);3% 牛血清白蛋白(Merck Millipore);0.09% 疊氮化鈉(和光純藥工業);pH7.50。 HEPES緩衝溶液2 500mM 2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(埼京化成工業);25mM 2-嗎啉基乙磺酸(和光純藥工業);1mM EDTA・2Na(和光純藥工業);150mM L-精胺酸鹽酸鹽(和光純藥工業);0.075% ProClin 950(Sigma-Aldrich);pH6.00。
3)吸光度變化量之測定 使用將人類IgG4濃度分別調整為0.0、1.6、6.3、12.5、25.0、50.0mg/dL之標準人類血清,作為標準試樣。再者0.0mg/dL係使用生理食鹽水。使用日立7180型自動分析裝置,對試樣3μL,使第一試藥120μL、第二試藥120μL進行反應,以主波長570nm、副波長800nm,於18~28測光點間(相當於R2添加後約1分鐘後至4分鐘後),以2點終端法測定吸光度變化量(n=2)。自8殖株中之5殖株所產生的抗體,於0.0mg/dL時顯示最大的吸光度變化量,隨著人類IgG4濃度上昇,吸光度變化量減少。因而,5殖株(MaI4-09、MaI4-08、MaI4-01、MaI4-06、MaI4-03)係顯示對免疫學的凝集阻止法的適應性。另一方面,關於其他3殖株(MaI4-02、MaI4-04、MaI4-05),未觀察到於0.0mg/dL時之最大的吸光度變化量,及伴隨人類IgG4濃度上昇之吸光度變化量的減少,對免疫學的凝集阻止法並未適應(圖1)。由產生顯示對免疫學的凝集阻止法之適應性的抗體之5殖株當中,選定產生於0.0mg/dL時之吸光度變化量高的抗體之前2名殖株,用於之後的解析。
(4)寄存 上述選定之融合瘤MaI4-08及MaI4-09,係於2015年9月1日對於獨立行政法人產品評價技術基盤機構內專利微生物寄存中心,於2015年9月1日以收件編號NITE AP-02112(MaI4-08)及NITE AP-02113(MaI4-09)收件,於2015年9月14日生存確認後,給予寄存編號NITE P-02112(MaI4-08)及NITE P-02113(MaI4-09)(寄存證明2015年9月30日發行)。 以下記載寄存之特定內容。 [1]寄存機關名稱/收件地址 名稱:獨立行政法人 產品評價技術基盤機構產業技術總合研究所 專利微生物寄存中心 收件地址:日本國千葉縣木更津市Kazusa鎌足2-5-8(郵遞區號292-0818) [2]寄存日:2015年9月1日 [3]寄存編號 NITE P-02112(融合瘤MaI4-08) NITE P-02113(融合瘤MaI4-09) 之後,為了將相同融合瘤國際寄存,對獨立行政法人產品評價技術基盤機構內專利微生物寄存中心申請微生物移管,於2018年6月8日以收件編號NITE ABP-02112(MaI4-08)及NITE ABP-02113(MaI4-09)收件。
(5)以細胞培養法產生單株抗體 作為由上述融合瘤產生抗體的方法,係根據週知之方法(例如單株抗體:生化學實驗法 東京化學同人)進行。具體而言,為了產生單株抗體,係有in Vitro之培養及In Vivo之培養。In Vitro之培養係有於培養液中培養融合瘤等,另一方面,In Vivo之培養方法係有製作小鼠腹水之方法等,茲選擇In Vitro之培養,取得含有單株抗體之培養液上清液。
(6)單株抗體之純化 如上述,作為純化單株抗體之方法,係根據週知之方法(例如單株抗體:生化學實驗法 東京化學同人)進行。單株抗體之純化,一般而言係進行親和性層析純化,有使用載持蛋白質G或蛋白質A等的瓊脂糖管柱(sepharose column),茲選擇載持蛋白質G的蛋白質G瓊脂糖管柱(GE Healthcare)來進行純化。測定所得單株抗體之280nm吸光度,確認抗體濃度。調整濃度後,以0.45μm以下濾器過濾滅菌。
(7)抗體之確認 將MaI4-08、MaI4-09產生抗體,分別遵照Iso-Gold Rapid Mouse-Monoclonal Isotyping Kit(with κ and λ) (BioAssay Works)之產品添附文件,實施同型(isotype)之鑑定。同型係如表1所述。
(8)以ELISA評估特異性 以PBS(-),將Myeloma人類IgA1(Abcam)、 Myeloma人類IgA2(Abcam)、Myeloma人類IgD(Abcam)、Myeloma人類IgE(Abcam)、Myeloma人類IgM(Abcam)、Myeloma人類IgG1(EMD Millipore)、 Myeloma人類IgG2(EMD Millipore)、Myeloma人類IgG3(Sigma-Aldrich)、Myeloma人類IgG4(EMD Millipore)調整為1μg/mL。將經調整之試樣於96孔試驗盤(Thermo Fisher)中各添加100μL。以振盪器以700rpm、25.0℃之條件振盪1小時。廢棄液體,以300μL之PBST洗淨3次後,添加100μL之阻攔緩衝液,於4℃保存1夜以上。同樣地以PBST洗淨後,分別各添加經抗體稀釋緩衝液調整為1μg/mL的MaI4-08、MaI4-09產生抗體100μL,於與上述相同條件下振盪。同樣地以PBST洗淨後,各添加經抗體稀釋緩衝液稀釋4000倍的抗小鼠IgG HRP標誌抗體(Abcam)100μL,於與上述相同條件下振盪。同樣地以PBST洗淨後,添加100μL之SureBlue(KPL)。MaI4-08、MaI4-09分別於5、3分鐘後,添加0.5mol/L硫酸(和光純藥)100μL。以微試驗盤讀取儀(BIO-RAD)測定波長450nm。其結果,相較於其他調整試樣,確認到Myeloma人類IgG4有較強訊號(表2及3、圖2及3)。
(9)單株抗體之胺基酸序列解析 將MaI4-08、MaI4-09分別藉由Fusion Antibodies公司的實驗指南(protocol),進行mRNA抽出、選殖及定序。解析的結果,MaI4-08之可變區域為序列編號5(重鏈可變區域)及序列編號6(輕鏈可變區域),MaI4-09之可變區域為序列編號7(重鏈可變區域)及序列編號8(輕鏈可變區域),CDR之胺基酸序列係如表4所示。
<實施例2>使用MaI4-08、MaI4-09產生抗體之測定試藥配製及測定 (1)試藥之配製 1)第一試藥(R1)之配製 於2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)緩衝溶液1中,添加MaI4-08或MaI4-09產生抗體溶液為15μg/mL之濃度,作為第一試藥。又,配製將MaI4-05產生抗體及市售抗體HP6025(Merck Millipore)同樣地添加於HEPES緩衝溶液1而得的溶液,作為對照試藥。 2)第二試藥(R2)之配製 於2%濃度之粒徑107nm的聚苯乙烯製之乳膠粒子溶液18mL中,添加自人類血清以通常方法粗純化的人類IgG4 0.35mg/mL溶液18mL,於室溫攪拌1小時,使人類IgG4物理吸附於乳膠粒子。之後以20,000rpm進行90分鐘離心分離,廢棄上清液,回收沈澱物。於該沈澱物添加含有3%濃度之牛血清白蛋白的被覆緩衝液24mL使其懸浮,進行超音波處理使完全分散後,於室溫攪拌1小時。接著,再度進行離心分離,於所得之沈澱物添加12mL之HEPES緩衝溶液2,使其懸浮,進行超音波處理使完全分散後,以HEPES緩衝溶液2調整為乳膠濃度0.12%,得到人類IgG4致敏乳膠粒子懸浮液,使用作為對各第一試藥共通之第二試藥。
再者,各試藥之組成係如以下所述。
(2)吸光度變化量之測定 使用將人類IgG4濃度分別調整為1.6、6.3、12.5、25、50mg/dL的標準人類血清,作為標準試樣。本測定中係以將檢體試樣之測定稀釋20倍來測定為前提,因此最終的標準試樣濃度係成為20倍,而為31.3、125、250、500、1000mg/dL。以後記載之試樣濃度均為20倍後之最終的試樣濃度。人類IgG4濃度0.0mg/dL之試樣係使用含有氯化鈉0.85%之生理食鹽水。人類IgG4濃度之測定係使用日立7180型自動分析裝置,對試樣3μL使第一試藥120μL、第二試藥120μL進行反應,以主波長570nm、副波長800nm,於18~28測光點間(相當於R2添加後約1分鐘後至4分鐘後),以2點終端法測定吸光度變化量(n=2)。
(3)測定結果 使用上述試藥,將測定人類IgG4濃度時的吸光度變化量分別示於表8以及圖4、5、6及7。
如表8以及圖4至7所示,使用MaI4-08產生抗體或MaI4-09產生抗體作為第一試藥所用之小鼠抗人類IgG4單株抗體時,隨著人類IgG4濃度增高,吸光度變化量減少。另一方面,使用以MaI4-05產生抗體及市售抗體HP6025配製之對照試藥時,見不到人類IgG4濃度依賴性的吸光度變化。由以上可知,以MaI4-05產生抗體及市售之抗體HP6025所配製之試藥,難以應用於以自動分析裝置之乳膠(粒子)凝集阻止法。另一方面,明顯可知以MaI4-08及MaI4-09產生抗體所配製之試藥,可應用於乳膠(粒子)凝集阻止法,有用於使用自動分析裝置之人類IgG4濃度測定。
(4)稀釋直線性之評估 對於使用MaI4-08產生抗體或MaI4-09產生抗體作為第一試藥所用之小鼠抗人類IgG4單株抗體的情況,進行稀釋直線性之評估。使用將人類IgG4濃度調整為1000mg/dL的標準人類血清作為試樣,使用以含有氯化鈉0.85%之生理食鹽水階段稀釋的試樣作為檢體。人類IgG4濃度0.0mg/dL之試樣係直接使用生理食鹽水。人類IgG4濃度之測定係使用日立7180型自動分析裝置,對試樣3μL,使第一試藥120μL、第二試藥120μL進行反應,以主波長570nm、副波長800nm,於18~28測光點間(相當於R2添加後約1分鐘後至4分鐘後),以2點終端法測定吸光度變化量(n=2)。由表6之結果製成檢量線,算出試樣中之人類IgG4濃度。
(5)對前驅現象之耐性之評估 對於使用MaI4-08產生抗體或MaI4-09產生抗體作為第一試藥所用之小鼠抗人類IgG4單株抗體的情況,進行對前驅現象之耐性評估。使用將人類IgG4濃度調整為8000mg /dL的標準人類血清作為試樣,以含有氯化鈉0.85%之生理食鹽水進行階段稀釋,使用作為檢體。人類IgG4濃度之測定係使用日立7180型自動分析裝置,對試樣3uL,使第一試藥120μL、第二試藥120uL進行反應,以主波長570nm、副波長800nm,於18~28測光點間(相當於R2添加後約1分鐘後至4分鐘後),以2點終端法測定吸光度變化量(n=2)。由表6之結果製成檢量線,算出試樣中之人類IgG4濃度。
(6)對人類IgG4之特異性之評估 對於使用MaI4-08產生抗體或MaI4-09產生抗體作為第一試藥所用之小鼠抗人類IgG4單株抗體的情況,進行對人類IgG4之特異性之評估。使用調整為3000mg/dL的Myeloma人類IgG4溶液(EMD Millipore)作為試樣。又,使用經同樣調整之Myeloma人類IgG1溶液(EMD Millipore)、Myeloma人類IgG2溶液(EMD Millipore)、Myeloma人類IgG3溶液(Sigma-Aldrich),作為對照試樣。空白試樣係使用生理食鹽水。人類IgG4濃度之測定係使用日立7180型自動分析裝置,對試樣3μL,使第一試藥120μL、第二試藥120μL進行反應,以主波長570nm、副波長800nm,於18~28測光點間(相當於R2添加後約1分鐘後至4分鐘後),以2點終端法測定吸光度變化量(n=2)。由表6之結果製成檢量線,算出試樣中之人類IgG4濃度。
(7)測定結果 結果分別示於圖8~13、表9及10。 使用本發明之融合瘤所產生之小鼠抗人類IgG4單株抗體於第一試藥時,可知於0~1000mg/dL之檢量範圍具有充分的稀釋直線性(圖8及9)。又,關於前驅現象,未見到測定值降低至8000mg/dL(圖10及11)。進一步地,幾乎觀察不到對IgG1、IgG2、IgG3之反應性(圖12及13、表9及10)。
如以上所述,新得知了不僅篩選階段,且即使被報告作為抗IgG4單株抗體之抗體(HP6025)(非專利文獻6),亦有不適於免疫學的粒子凝集阻止法的抗體。為了明確得知適於免疫學的粒子凝集阻止法的抗體與不適合的抗體之不同,係進行抗體之相互作用之解析及抗原決定位解析。
<實施例3>相互作用之解析 配製MaI4-08及MaI4-09之產生抗體,與作為對照之MaI4-05產生抗體及HP6025為1mg/mL。又,配製由人類血清純化之1 mg/mL的IgG4。依照住化分析中心股份有限公司之實驗指南,將IgG4以胺偶合法固定化於晶片,使用Biacore機種進行傳感圖(sensorgram)的取得。所得之結合速度常數(ka
)、解離速度常數(kd
)及解離常數(KD)如表11所示。3種抗體當中,MaI4-05產生抗體之結合速度常數ka
為MaI4-08及MaI4-09產生抗體之10分之1以下,HP6025抗體之結合速度常數ka
為MaI4-08及MaI4-09產生抗體之100分之1以下。
<實施例4>抗原決定位之解析 由Uniprot取得人類IgG4重鏈恆定區域之胺基酸序列(P01861、序列編號4)。設計使所得胺基酸序列部分缺損之分別以序列編號4及25~35表示之胺基酸序列H1~12(圖14)的N末端連結有GST標籤之胜肽。H1(序列編號4)係由人類IgG4重鏈恆定區域全長之胺基酸序列所構成者。H2係由人類IgG4重鏈恆定區域之1至274號之胺基酸序列所構成者(序列編號25)。H3係由人類IgG4重鏈恆定區域之1至220號之胺基酸序列所構成者(序列編號26)。H4係由人類IgG4重鏈恆定區域之1至165號之胺基酸序列所構成者(序列編號27)。H5係由人類IgG4重鏈恆定區域之1至110號之胺基酸序列所構成者(序列編號28)。H6係由人類IgG4重鏈恆定區域之1至55號之胺基酸序列所構成者(序列編號29)。H7係由人類IgG4重鏈恆定區域之56至327號之胺基酸序列所構成者(序列編號30)。H8係由人類IgG4重鏈恆定區域之111至327號之胺基酸序列所構成者(序列編號31)。H9係由人類IgG4重鏈恆定區域之166至327號之胺基酸序列所構成者(序列編號32)。H10係由人類IgG4重鏈恆定區域之221至327號之胺基酸序列所構成者(序列編號33)。H11係由人類IgG4重鏈恆定區域之275至327號之胺基酸序列所構成者(序列編號34)。H12係由人類IgG4重鏈恆定區域之99至220號之胺基酸序列所構成者(序列編號35)。
又,設計人類IgG4重鏈CH3區域中之胺基酸序列(H10、序列編號33)中,將人類IgG4特異序列部分地取代為人類IgG1重鏈恆定區域所對應的胺基酸之分別以序列編號36~44表示的胺基酸序列H31-39(圖15)之N末端連結有GST標籤之胜肽。H31係基於H10之胺基酸序列,將人類IgG4重鏈恆定區域之235號之麩醯胺殘基取代為精胺酸殘基者(序列編號36)。H32係基於H10之胺基酸序列,將人類IgG4重鏈恆定區域之289號之精胺酸殘基取代為離胺酸殘基者(序列編號37)。H33係基於H10之胺基酸序列,將人類IgG4重鏈恆定區域之299號之麩胺酸殘基取代為麩醯胺殘基者(序列編號38)。H34係基於H10之胺基酸序列,將人類IgG4重鏈恆定區域之325號之白胺酸殘基取代為脯胺酸殘基者(序列編號39)。H35係基於H10之胺基酸序列,將人類IgG4重鏈恆定區域之235號之麩醯胺殘基取代為精胺酸殘基、289號之精胺酸殘基取代為離胺酸殘基、299號之麩胺酸殘基取代為麩醯胺殘基、325號之白胺酸殘基取代為脯胺酸殘基者(序列編號40)。H36係將人類IgG4重鏈恆定區域之221至327號之胺基酸序列中的IgG4特異序列全部取代為對應的IgG1之胺基酸序列者(序列編號41)。H37係基於H10之胺基酸序列,將人類IgG4重鏈恆定區域之289號之精胺酸殘基取代為離胺酸殘基、325號之白胺酸殘基取代為脯胺酸殘基者(序列編號42)。H38係基於H10之胺基酸序列,將人類IgG4重鏈恆定區域之289號之精胺酸殘基取代為離胺酸殘基、299號之麩胺酸殘基取代為麩醯胺、325號之白胺酸殘基取代為脯胺酸殘基者(序列編號43)。H39係基於H36之胺基酸序列,將人類IgG4重鏈恆定區域之299號之麩醯胺殘基取代為麩胺酸殘基者(序列編號44)。
基於所設計之各胺基酸序列,藉由GenScript公司的實驗指南設計適合在大腸菌表現蛋白質的鹼基序列,製作插入有各鹼基序列之載體pGEX-6P-1(GE Healthcare Bioscience)。於大腸菌BL21株導入所製作之表現質體得到轉形體。將轉形體以通常之方法培養,以IPTG誘導蛋白質表現。離心分離收集菌後,以通常之溶解液溶解,進行超音波處理。於所得之溶解液6μL中添加SDS樣品緩衝液6μL。各配製之試樣係於95℃進行5分鐘加熱處理。於添加有SDS電泳緩衝液之5~20%電泳凝膠(Atto)的各孔,各添加10μL上述大腸菌破碎試樣。又,分子量標準品(BIORAD)亦同樣地添加於孔中,進行電泳。電泳結束後,將電泳凝膠以轉印緩衝液轉印於PVDF膜(Merck Millipore)。將PVDF膜浸漬於膜阻攔緩衝液,於室溫震盪30分鐘。對MaI4-08、MaI4-09、MaI4-05產生抗體之胺基,使用POD標誌套組(同人化學研究所)實施POD標誌處理。將所得之標誌抗體以PBST各稀釋1000倍。將PVDF膜以PBST洗淨後,將分別配製之前述抗體溶液添加於PVDF膜,於室溫反應1小時。將PVDF膜以PBST洗淨後,使用ECL Prime Western Blotting Detection Reagents(GE Healthcare)以Image Quant Las4000檢測訊號。
其結果,MaI4-08及MaI4-09產生抗體,均於H-1、H-7、H-8、H-9及H-10確認到訊號。因而明顯可知MaI4-08及MaI4-09產生抗體之抗原決定位,係存在於人類IgG4之重鏈恆定區域之221號至327號之胺基酸序列(圖16及圖17)。 進一步地,關於MaI4-08、MaI4-09產生抗體,於299號之麩胺酸受到保存的條件(H-10、H-31、H-32、H-34、H-37)下係確認到訊號,但將299號之麩胺酸取代為麩醯胺之條件(H-33、H-35、H-36、H-38)下未確認到訊號。因此明顯可知MaI4-08、MaI4-09產生抗體之抗原決定位,係存在於必需包含人類IgG4重鏈恆定區域之299號之麩胺酸殘基的人類IgG4重鏈恆定區域之221號至327號之胺基酸序列(圖18及圖19)。 另一方面,MaI4-05產生抗體,僅於99至110號之胺基酸序列,亦即包含絞鏈區域之序列(H-1、H-2、H-3、H-4、H-5、H-7、H-12)確認到訊號。因此,明顯可知MaI4-05產生抗體之抗原決定位係存在於人類IgG4重鏈恆定區域之99至110號之胺基酸序列(圖20)。
H-1至H-12,以及H-31至H-39之胺基酸序列如以下所示。
又,各試藥之組成係如以下所述。[產業上之可利用性]
如以上所詳細說明的,本發明之免疫測定法中,藉由使用對測定對象目標物質(人類IgG4)反應性及選擇性高的抗體,可去除反應系中之競爭物質(IgG1~3等)的影響,特異性地精密測定目標物質。若使用本發明之抗人類IgG4抗體,可特異性地檢測測定試樣中之人類IgG4,於IgG4相關疾病等之診斷或臨床檢査的領域中極為有效。
[圖1]選定殖株之對免疫學的粒子凝集阻止法之適應性評估 [圖2]以ELISA進行之MaI4-08抗體之特異性評估 圖2為於MaI4-08產生抗體中,表示對各人類球蛋白之ELISA反應吸光度。 [圖3]以ELISA進行之MaI4-09產生抗體之特異性評估 圖3為於MaI4-09產生抗體中,表示對各人類球蛋白之ELISA反應吸光度。 [圖4]使用MaI4-08產生抗體之抗體吸光度變化量之測定 圖4為混合人類IgG4之標準試樣、含有MaI4-08產生抗體之緩衝液(第一試藥)、含有人類IgG4致敏乳膠之緩衝液(第二試藥),顯示反應時的吸光度變化。再者,係使用將人類IgG4濃度分別調整為1.6、6.3、12.5、25、50mg/dL之標準人類血清,作為標準試樣。本測定中係以將檢體試樣之測定稀釋20倍來測定為前提,因此最終的標準試樣濃度為20倍,係成為31.3、125、250、500、1000mg/dL。以後記載之試樣濃度係全部為20倍後的最終試樣濃度。 [圖5]使用MaI4-09產生抗體之抗體吸光度變化量之測定 圖5為混合人類IgG4之標準試樣、含有MaI4-09產生抗體之緩衝液(第一試藥)、含有人類IgG4致敏乳膠之緩衝液(第二試藥),顯示反應時的吸光度變化。其他條件係與圖4相同。 [圖6]使用MaI4-05產生抗體之抗體吸光度變化量之測定(比較例) 圖6為混合人類IgG4之標準試樣、含有MaI4-05產生抗體之緩衝液(第一試藥)、含有人類IgG4致敏乳膠之緩衝液(第二試藥),顯示反應時的吸光度變化。其他條件係與圖4相同。 [圖7]使用HP6025之抗體吸光度變化量之測定(比較例) 圖7為混合人類IgG4之標準試樣、含有HP6025之緩衝液(第一試藥)、含有人類IgG4致敏乳膠之緩衝液(第二試藥),顯示反應時的吸光度變化。其他條件係與圖4相同。 [圖8]使用MaI4-08產生抗體之稀釋直線性之評估 圖8為混合0~1000mg/dL之人類IgG4階段稀釋系列試樣、含有MaI4-08產生抗體之緩衝液(第一試藥)、含有人類IgG4致敏乳膠之緩衝液(第二試藥),顯示反應時的測定值。 [圖9]使用MaI4-09產生抗體之稀釋直線性之評估 圖9為混合0~1000mg/dL之人類IgG4階段稀釋系列試樣、含有MaI4-09產生抗體之緩衝液(第一試藥)、含有人類IgG4致敏乳膠之緩衝液(第二試藥),顯示反應時的測定值。 [圖10]使用MaI4-08產生抗體之對前驅現象的耐性之評估 圖10為混合0~8000mg/dL之人類IgG4階段稀釋系列試樣、含有MaI4-08產生抗體之緩衝液(第一試藥)、含有人類IgG4致敏乳膠之緩衝液(第二試藥),顯示反應時的測定值。 [圖11]使用MaI4-09產生抗體之對前驅現象的耐性之評估 圖11為混合0~8000mg/dL之人類IgG4階段稀釋系列試樣、含有MaI4-09產生抗體之緩衝液(第一試藥)、含有人類IgG4致敏乳膠之緩衝液(第二試藥),顯示反應時的測定值。 [圖12]MaI4-08產生抗體之對人類IgG4的特異性評估 圖12為混合3000mg/dL之人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3及人類IgG4之各試樣、含有MaI4-08產生抗體之緩衝液(第一試藥)、含有人類IgG4致敏乳膠之緩衝液(第二試藥),顯示反應時的測定值。 [圖13]MaI4-09產生抗體之對人類IgG4的特異性評估 圖13為混合3000mg/dL之人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3及人類IgG4之各試樣、含有MaI4-09產生抗體之緩衝液(第一試藥)、含有人類IgG4致敏乳膠之緩衝液(第二試藥),顯示反應時的測定值。 [圖14]顯示由Uniprot取得之人類IgG4重鏈恆定區域之胺基酸序列H1(P01861、序列編號4),及其序列部分缺損的各胜肽H2~12之胺基酸序列的比對。99號~110號顯示絞鏈區域。 [圖15]顯示人類IgG4重鏈恆定區域之胺基酸序列(序列編號4)之221號至327號之CH3區域之胺基酸序列(H-10),以及H-10之一部分取代為人類IgG1重鏈恆定區域之相對應的胺基酸(粗字)之胺基酸序列(H-31~H-39)的比對。 [圖16]MaI4-08產生抗體之對胜肽H1~12的西方點墨解析 [圖17]MaI4-09產生抗體之對胜肽H1~12的西方點墨解析 [圖18]MaI4-08產生抗體之對胜肽H10及H31~39的西方點墨解析 [圖19]MaI4-09之對胜肽H10及H31~39的西方點墨解析 [圖20]MaI4-05之對胜肽H1~12的西方點墨解析
Claims (20)
- 一種單株抗體,其係對於人類IgG4特異性結合之單株抗體,其中前述抗體之抗原決定位,存在於序列編號4所示之人類IgG4之重鏈恆定區域的221號至327號之胺基酸序列,且包含299號之麩胺酸。
- 如請求項1之單株抗體,其係以解離常數5.0×10-10 以下結合於前述人類IgG4。
- 一種單株抗體,其係具有重鏈可變區域及輕鏈可變區域之抗人類IgG4之抗體,其中重鏈可變區域之互補性決定區域(Complementarity Determining Region;以下記載為CDR)1、2及3分別為序列編號9、10,及11表示之胺基酸序列,輕鏈可變區域之CDR1、2及3分別為序列編號12、13及14表示之胺基酸序列。
- 如請求項3之單株抗體,其中重鏈可變區域具有序列編號5之胺基酸序列,輕鏈可變區域具有序列編號6之胺基酸序列。
- 如請求項4之單株抗體,其係融合瘤MaI4-08所產生。
- 一種單株抗體,其係具有重鏈可變區域及輕鏈可變區域之抗人類IgG4之抗體,其中重鏈可變區域之互補性決定區域CDR1、2及3分別為序列編號15、16,及17表示之胺基酸序列,抗體之輕鏈可變區域之CDR1、2及3分別為序列編號18、19及20表示之胺基酸序列。
- 如請求項6之單株抗體,其中重鏈可變區域具有序列編號7之胺基酸序列,輕鏈可變區域具有序列編號8之胺基酸序列。
- 如請求項7之單株抗體,其係融合瘤MaI4-09所產生。
- 一種二價抗體分子或二價抗體片段,其具備2個之如請求項1~8中任一項之單株抗體的抗原結合部位。
- 如請求項9之抗體片段,其係F(ab’)2 。
- 一種測定檢測試樣中之人類IgG4之方法,其係使用如請求項1~8中任一項之單株抗體或如請求項9或10之二價抗體分子或二價抗體片段。
- 如請求項11之方法,其係免疫學的粒子凝集阻止法。
- 如請求項12之方法,其係藉由 (1)使試樣中之人類IgG4與如請求項1~8中任一項之單株抗體或如請求項9或10之二價抗體分子或二價抗體片段結合,接著 (2)添加固定有人類IgG4或其胜肽片段之不溶性承載體,與未與試樣中之人類IgG4結合之上述單株抗體或二價抗體分子或二價抗體片段之間引起凝集反應,然後 (3)檢測凝集之不溶性承載體,來檢測測定試樣中之人類IgG4。
- 一種人類IgG4之測定套組,其包含如請求項1~8中任一項之單株抗體或如請求項9或10之二價抗體分子或二價抗體片段。
- 一種套組,其係用於如請求項13之方法之套組,其包含 (1)如請求項1~8中任一項之單株抗體或如請求項9或10之二價抗體分子或二價抗體片段; (2)單離人類IgG4或其胜肽片段;及 (3)不溶性承載體。
- 如請求項15之套組,其中(2)單離人類IgG4或其胜肽片段,係吸附於(3)不溶性承載體。
- 如請求項15或16之套組,其中(3)不溶性承載體為乳膠粒子。
- 如請求項11~13中任一項之方法,其係用以輔助IgG4相關疾病之診斷。
- 如請求項14~17中任一項之套組,其係使用於IgG4相關疾病診斷。
- 一種經單離之胜肽,其係由序列編號4所示之人類IgG4之重鏈恆定區域之221號至327號之胺基酸序列的全部或一部分所構成,且包含299號之麩胺酸。
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