TW201903140A - 體外型之人工肝臟、及體外型之人工肝臟用或肝細胞培養用之器具 - Google Patents

體外型之人工肝臟、及體外型之人工肝臟用或肝細胞培養用之器具 Download PDF

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Abstract

本發明之課題在於提供一種使用高功能肝細胞之人工肝臟。本發明提供一種體外型之人工肝臟，其具備包含以下之至少一個模組： ・血漿成分入口埠及血漿成分出口埠； ・具備血漿成分入口埠及血漿成分出口埠之血漿成分循環室；及 ・與血漿成分循環室鄰接地配置，藉由使氨透過但不使肝細胞透過之分離膜而與血漿成分循環室隔開，而培養具有氨代謝功能之肝細胞的肝細胞培養室。

Description

體外型之人工肝臟、及體外型之人工肝臟用或肝細胞培養用之器具
本發明係關於一種使用具有氨代謝功能之肝細胞的體外型之人工肝臟、及體外型之人工肝臟用或肝細胞培養用之器具。
在日本，包括急性期管理在內之醫療技術已提高之現在依然不斷出現肝衰竭導致之死亡者。其中猛爆性肝炎之死亡率為70~90%，非常高，為預後不良之疾病。於肝衰竭治療中，肝移植術之治療效果最高，但由於供體不足或急性肝衰竭發展迅速，無法施行肝移植術之病例較多。
另一方面，使人工結構物中培養之肝細胞進行肝功能輔助的混合型人工肝臟(混合型人工肝臟支持系統(Hybrid-artificial livers support system，HALSS))作為至肝移植術前、或自體肝再生前之期間用於輔助肝臟之功能者而受到期待。
作為混合型人工肝臟，先前一直研究使用中空纖維型、多層平板型等可將細胞維持為高密度之培養器。又，為了對此種高密度之培養器內之肝細胞供給充分之氧，研究使用氧合機。例如，專利文獻1提出一種形成有循環迴路之中空纖維型人工肝臟之灌注及培養系統，該循環迴路係包含將肝細胞封入至中空纖維內腔中之中空纖維模組、氧合裝置、送液泵、貯液器、及連結該等之導管的灌注迴路，灌注液藉由送液泵而自貯液器流經中空纖維模組之外部，並再次返回至貯液器中。又，專利文獻2提出有一種混合型人工肝臟，其特徵在於包含：血液流通路徑，其於血液導入部與血液導出部之間依序含有血漿分離裝置與血球-血漿混合部；及血漿循環路徑，其使由上述血漿分離裝置分離之血漿經過含有肝細胞之血漿處理裝置流入至上述血球-血漿混合部；且於上述血漿處理裝置或較其靠上游側設置有用以將血漿處理裝置之導出側血漿中之溶氧濃度維持為0.5 ppm以上之氧合器。
關於混合型人工肝臟，對所使用之細胞或使用其之情形時之裝置構成亦進行了研究。例如，專利文獻3中作為適合用於混合型人工肝臟等肝功能輔助裝置者，提出有一種細胞株，其係源自人肝臟之細胞株，且藉由P450 3A4等藥物代謝酶基因及麩醯胺合成酶基因等氨代謝酶基因而轉形。又，引用文獻4中作為可減少體外循環血液量、且可提高淨化效率之血液淨化裝置，提出有一種血液淨化裝置，其具有：生物側血液循環迴路，其具備用以將血液分離為血球與血漿之血漿分離器；及人工器官模組側血漿循環迴路，其具備將由血漿分離器分離之血漿進行淨化之人工器官模組；且該血液淨化裝置之特徵在於：人工器官模組側血漿循環迴路形成獨立於生物側血液循環迴路之閉路。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利特開平10-33671號公報 [專利文獻2]日本專利特開平10-234850號公報 [專利文獻3]日本專利特開2003-274963號公報 [專利文獻4]日本專利特開2004-49301號公報
[發明所欲解決之問題]
本發明者等人對用於混合型人工肝臟之人工肝細胞進行研究，獲得一種理論上可無限增殖且具有較高之氨代謝功能之肝細胞(日本專利特願2016-037518，於本案提出申請時尚未公開)。並且，由於該肝細胞之培養物形成片狀之網狀結構，故而對可保持此種片狀之網狀結構不變而構成體外型之人工肝臟的模組形狀進行了銳意研究。其結果為，想出一種培養容器，其包含如下2室：來自患者之血漿成分進行循環之部分、及與其利用分離膜隔開之用以培養肝細胞之部分；並且發現此種培養容器適於各種肝細胞之培養，從而完成本發明。
本發明提供以下。 [1]一種體外型之人工肝臟，其具備包含以下之至少一個模組： ・血漿成分入口埠及血漿成分出口埠； ・具備血漿成分入口埠及血漿成分出口埠之血漿成分循環室；及 ・與血漿成分循環室鄰接地配置，藉由使氨透過但不使肝細胞透過之分離膜而與血漿成分循環室隔開，而培養具有氨代謝功能之肝細胞的肝細胞培養室。 [2]如1所記載之人工肝臟，其中血漿成分循環室配置於肝細胞培養室之上。 [3]如1或2所記載之人工肝臟，其中肝細胞係具有100 μg/dl/24 h以上之氨代謝功能且可構成網狀結構體之人工肝細胞。 [4]如1至3中任一項所記載之人工肝臟，其中肝細胞係於無血清且無飼養源(feeder)環境下培養。 [5]如1至4中任一項所記載之人工肝臟，其中每1個模組至少培養1.0×106 個肝細胞。 [6]如1至5中任一項所記載之人工肝臟，其具備複數個模組，且培養有5.0×109 ~5.0×1011 個肝細胞。 [7]如1至6中任一項所記載之人工肝臟，其具有1×104 ~1×106 cm2 之有效培養面積。 [8]一種體外型之人工肝臟用或肝細胞培養用之器具，其至少具備以下： ・血漿成分入口埠及血漿成分出口埠； ・具備血漿成分入口埠及血漿成分出口埠之血漿成分循環室；及 ・與血漿成分循環室鄰接地配置，藉由使氨透過但不使肝細胞透過之分離膜而與血漿成分循環室隔開之用以培養肝細胞的肝細胞培養室。 [9]如8所記載之器具，其中肝細胞培養室具備用以導入肝細胞之細胞導入埠。 [10]如9所記載之器具，其中肝細胞培養室具備用以排出空氣之排氣埠。 [11]如8至10中任一項所記載之器具，其於肝細胞培養室內具備抑制分離膜之變形之機構。
又，本發明提供以下。 [1]一種人工肝細胞，其具有100 μg/dl/24 h以上之氨代謝功能，且可構成網狀結構體。 [2]如1所記載之人工肝細胞，其可於無血清且無飼養源環境下培養。 [3]如1或2所記載之人工肝細胞，其係由人工多能性幹(iPS，Induced pluripotent stem)細胞誘導而成者。 [4]如3所記載之人工肝細胞，其中iPS細胞係使用仙台病毒載體所製造者。 [5]一種人工肝細胞之製造方法，其包括以下之步驟： 分化誘導步驟1，其將iPS細胞於含有活化素(Activin)A之分化誘導培養基I中進行培養； 分化誘導步驟2，其將由分化誘導步驟1獲得之細胞於含有骨形成蛋白4(BMP4)及纖維母細胞生長因子2(FGF2)之分化誘導培養基II中進行培養；及 分化誘導步驟3，其將由分化誘導步驟2獲得之細胞於含有肝細胞生長因子(HGF)、抑瘤素M、地塞米松、以及N,N'-(亞甲基雙(4,1-伸苯基))二乙醯胺(N,N'-(methylenebis(4,1-phenylene))diacetamide)(FH1)及/或2-(N-(5-氯-2-甲基苯基)(甲磺醯胺基)-N-(2,6-二氟苯基)-乙醯胺(2-(N-(5-chloro-2-methylphenyl)(methylsulfonamido)-N-(2,6-difluorophenyl)-acetamide)(FPH1)之分化誘導培養基III中進行培養而獲得人工肝細胞。 [6]如5所記載之製造方法，其中iPS細胞係使用仙台病毒載體所製造者。 [7]如5或6所記載之製造方法，其中分化誘導培養基III含有FH1及FPH1。 [8]如5至7中任一項所記載之人工肝細胞，其中分化誘導步驟1~3係於無血清且無飼養源環境下實施。 [9]如5至8中任一項所記載之製造方法，其中分化誘導步驟1及分化誘導步驟2係合計進行2~14天， 分化誘導步驟3係進行2~14天。 [發明之效果]
根據本發明，提供一種混合型人工肝臟，其具備將肝細胞維持為片狀之至少一個模組。 根據本發明，提供一種混合型人工肝臟用之器具、及肝細胞培養用之器具，可將肝細胞維持為片狀之組織、且循環流不會直接傳至肝細胞。
本發明提供一種體外型之人工肝臟，其具備包含以下之至少一個模組： ・血漿成分入口埠及血漿成分出口埠； ・具備血漿成分入口埠及血漿成分出口埠之血漿成分循環室；及 ・與血漿成分循環室鄰接地配置，藉由使氨透過但不使肝細胞透過之分離膜而與血漿成分循環室隔開，而培養具有氨代謝功能之肝細胞的肝細胞培養室。
＜模組、人工肝臟、肝細胞培養器＞ 圖1係構成人工肝臟之模組之實施態樣之一例的剖面圖。模組之內部藉由分離膜5分割為血漿成分循環室3與肝細胞培養室4。模組可以隔著分離膜5之方式附設模組蓋7與模組本體8而形成。血漿成分循環室3與肝細胞培養室4可以任意方式配置，較佳為如圖1所示於肝細胞培養室4之上配置血漿成分循環室3。血漿成分循環室3具備血漿成分入口埠1及血漿成分出口埠2。於肝細胞培養室4中培養有肝細胞9。肝細胞可於無血清且無飼養源環境下培養。下文對可使用之肝細胞之例進行詳細說明。為了避免分離膜5變形，可於模組設置抑制分離膜5之變形之機構、例如分離膜支架6。又，肝細胞培養室4可具備用以導入肝細胞之細胞導入埠、或用以於導入肝細胞時排出空氣之排氣埠。
使用時，模組內部大致被血漿成分填滿，血漿成分經由血漿成分入口埠1及血漿成分出口埠2進行循環。可通過分離膜5之相對低分子之成分自血漿成分循環室3向肝細胞培養室4內擴散。
再者，作為於模組內循環之血漿成分，除了血漿以外，亦可為含有血漿之全血。又，於如下文所述將模組用作用於毒性試驗等之肝細胞之培養器之情形時，適於細胞之培養之培養基作為血漿成分於模組內循環。又，於導入肝細胞前、在人工肝臟及其他用途中使用前、或使用後等，出於洗淨、環境調整、適應等目的，可於模組內循環等張液等。與本發明相關而稱為血漿成分時，除了特別記載之情形以外，包括血漿、全血、培養基、及等張液。
藉由設為利用分離膜5將血漿成分循環室3與肝細胞培養室4隔開之構成，肝細胞不會進入至血漿成分循環室中。又，僅來自循環流之相對低分子之成分通過分離膜而向肝細胞培養室擴散，循環流不會直接流入至肝細胞培養室內。由於肝細胞培養室內之液體不會大幅移動，故而可防止肝細胞培養室內培養之肝細胞本身之損傷、或由肝細胞形成之結構體之損傷。因此，認為可較高地維持肝細胞之功能。又，藉由採用此種結構，可將模組設為薄型而製成適於積層之形狀。因此，於需要大量肝細胞之情形時，可使用複數個模組而確保分離膜之面積為一定以上。並且，可對大量細胞補充充分量之氧等，又，可充分地利用肝細胞代謝氨等廢棄物。
模組整體之形狀並無特別限定，可設為圓形、方形等適當形狀。又，模組之尺寸亦無特別限定，可適當設定。於尤佳之態樣中，模組係每個模組可至少培養1.0×106 個肝細胞之尺寸。此種模組可將容積設為1~10 ml，又，可將培養時肝細胞可吸附之面之面積(有效培養面積)設為1~20 cm2 。
構成模組之素材自適於肝細胞之培養者中選擇即可。尤其是由於通常肝細胞吸附於肝細胞培養室4之內側之面進行培養，因此較佳為自對肝細胞具有相容性者中選擇。又，模組素材較佳為可滅菌者，且較佳為透明。進而，較佳為容許作為醫療用具者。作為模組素材之具體例，可列舉：聚碸、聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚醯亞胺、聚碳酸酯、聚甲基戊烯、或聚苯乙烯等之嵌段共聚物。
分離膜使用可使氨透過之多孔膜，例如使用分子區分能力為300 kDa以上之膜。分離膜較佳為具有肝細胞無法透過之孔徑、例如0.65 μm以下之孔徑之孔。作為分離膜之素材，較佳為容許作為醫療用具者。又，較佳為可滅菌者。作為分離膜素材之具體例，可列舉纖維素系膜、或合成高分子系膜，更詳細而言，可列舉：再生纖維素(RC)、銅銨嫘縈(CR)、皂化纖維素(SCA)、表面改質再生纖維素、乙酸纖維素(CA)、二乙酸纖維素(CDA)、三乙酸纖維素(CTA)、聚丙烯腈(PAN)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、乙烯-乙烯醇共聚物(EVAL)、聚碸(PS)、聚醯胺(PA)、聚酯系聚合物合金(PEPA)。
模組可具有抑制分離膜之變形之機構(分離膜支架6)。抑制分離膜之變形之機構可設於分離膜之下側，可製成使用對肝細胞或生物無毒性之素材之格子狀、網狀等之結構物。
藉由至少一個此種模組而構成人工肝臟。模組之個數可根據1個模組之大小、及應當用作人工肝臟之肝細胞之數量而決定。例如，於使用如上所述之每1個可培養106 個左右之肝細胞之尺寸(容積1~10 ml、有效培養面積1~20 cm2 )之模組的情形時，設想相對於一隻體重約20 g之小鼠使用1~5個，相對於一隻體重約200 g之大鼠使用10~50個。
於用於人(成人)之情形時，設想需要5.0×109 ~5.0×1011 個、更特定為1×1010 ~1×1011 個肝細胞。此種人工肝臟之有效膜培養面積可為1×104 ~1×106 cm2 ，更特定可為1.9×104 ~1.9×105 cm2 。於使用複數個模組之情形時，可將模組彼此並列連結，又，亦可串列連結。
通常，混合型人工肝臟有安裝於體外而與血管連接者、留置於體內而與血管連接者、或不與血管連接而留置於腹腔內者之三種形態。本發明之人工肝臟係體外型。於使用如下文所述之來自iPS細胞之肝細胞之情形時，就避免伴隨細胞移入等而產生之風險之方面而言，亦較佳為體外型。
包含由本發明提供之上述模組之器具不僅可用於人工肝臟，而且亦可用於肝細胞之培養。於器具內培養之肝細胞或包含肝細胞之肝臟組織可用於各種用途。例如，可用於以下各種試驗：安全性試驗；毒性試驗；吸收、分佈、代謝及排出試驗(ADME)；藥物代謝與藥物動力學試驗(DMPK)；藥物相互作用試驗；及抗病毒活性試驗等。又，可用於醫藥品之篩選(例如，高脂血症藥、高血壓治療藥、低分子化合物醫藥、或抗體醫藥之篩選)、及藥物開發靶標篩選。進而，可用作疾病模型、傳染病模型、動物模型之替代品。又，亦可用於大量培養、高密度培養、高維度培養等生物學研究。
於用於肝細胞之培養之情形時，可使細胞培養用之培養基代替血漿成分於模組內循環。
＜系統、迴路＞ 圖2係使用人工肝臟之系統之實施態樣之一例的模式圖。使用人工肝臟之體外循環系統於使用血漿分離器11之情形時，可包含患者10側之第一循環迴路20(患者側迴路)、及配置有人工肝臟12之第二循環迴路21(人工肝臟側迴路)。視需要利用送液泵等使採自患者10之血液於循環迴路20中循環。若將血液導入至血漿分離器11，則血漿自患者之血液分離，經分離之血漿流向循環迴路21。為了使血漿流向循環迴路21，亦可利用送液泵。若將血漿導入至人工肝臟12，則藉由在構成人工肝臟之模組內部培養之肝細胞而進行氨等有害物質之代謝。又，導入至人工肝臟12之血漿亦具有向人工肝臟內部之肝細胞供給氧等必需物質之作用。藉由肝細胞減少有害物質而自人工肝臟12導出之血漿進入至循環迴路20而與流經循環迴路20內之血液一起回血至患者10。
使用本發明之人工肝臟之體外循環系統之構成並不限於使用血漿分離器之態樣，亦可不使用血漿分離器而製成模仿先前之血液透析系統之構成。具體而言，可製成於既有之血液透析之迴路中連接本發明之人工肝臟代替透析器的構成。
＜肝細胞＞ 繼而，對本發明之人工肝臟所使用之肝細胞進行說明。本發明可使用先前研究用於混合型人工肝臟之各種肝細胞。
肝細胞可為經株化之細胞，亦可為成人或胎兒等之肝臟之細胞之初代培養細胞，且亦可為由幹細胞誘導而成之細胞。作為株化細胞之例，可列舉如下者：BRL-3A(源自大鼠肝之細胞株，產生MSA(multiplication-stimulating activity，增殖刺激活性)(類體介素(somatomedin))蛋白，(水牛大鼠(Buffalo rat)))、LMH(雞肝細胞癌，二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine)誘發)、RL-34(由大鼠正常肝確立之細胞株，停止利用膠原蛋白增殖，(韋斯大鼠(Wistar rat)))、ARLJ301-3(大鼠肝上皮細胞株，(F344/DuCrj大鼠))、FAA-HTC1(大鼠肝細胞癌，2-乙醯胺基茀(2-acetylaminofluorene)誘發，(F344/DuCrj大鼠))、RLN-B2(由大鼠正常肝確立之細胞株，(Donryu大鼠))、RLN-J-5-2(由大鼠正常肝確立之細胞株，(Donryu大鼠))、Ac2F(由大鼠正常肝確立之細胞株，核型為二倍體，(Donryu大鼠))、dRLa-74純系2(大鼠肝臟，腺瘤，(Donryu大鼠))、dRLh-84(大鼠肝細胞癌，(Donryu大鼠))、AH66tc(大鼠腹水肝癌，(Donryu大鼠))、AH70Btc(大鼠腹水肝癌，(Donryu大鼠))、RLN-8(由大鼠正常肝確立之細胞株，(Donryu大鼠))、RLN-10(由大鼠正常肝確立之細胞株，(Donryu大鼠))、Ac2F(DT)(源自大鼠Ac2F，利用3'-甲基-4-二甲胺基偶氮苯(3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene)之表現型表現株，(Donryu大鼠))、Ac2F(ST)(源自大鼠Ac2F，自然轉形株，(Donryu大鼠))、dRLN-4(源自大鼠肝之細胞株，3'-甲基-4-二甲胺基偶氮苯誘發，(Donryu大鼠))、dRLN-9(源自大鼠肝之細胞株，3'-甲基-4-二甲胺基偶氮苯誘發，(Donryu大鼠))、dRLN-6(源自大鼠肝之細胞株，3'-甲基-4-二甲胺基偶氮苯誘發，(Donryu大鼠))、3'-mRLN-30(源自大鼠肝之細胞株，3'-甲基-4-二甲胺基偶氮苯誘發，(Donryu大鼠))、3'-mRLN-31(源自大鼠肝之細胞株，3'-甲基-4-二甲胺基偶氮苯誘發，(Donryu大鼠))、3'-mRLh-2(大鼠肝細胞癌，(Donryu大鼠))、IAR-20(大鼠未轉形肝細胞株，(BD-IV rat))、JTC-16 P3(大鼠腹水肝癌，源自JTC-16，無血清適應株，(Donryu大鼠))、RLC-10.P3(源自大鼠RLC-10細胞，無血清適應株，(JAR-1大鼠))、NCTC純系1469(由小鼠正常肝確立之細胞株，(C3H/An小鼠))、BRL-3A(源自大鼠肝之細胞株，產生MSA(體介素(somatomedin))蛋白，(水牛大鼠))、AH601.P3(JTC27)(大鼠可移植腹水肝癌，無血清適應株，(Donryu大鼠))、AH601(JTC27)(大鼠可移植腹水肝癌，(Donryu大鼠))、M(源自大鼠肝，藉由DAB(diaminobenzidine，二胺基聯苯胺)株化，(JAR大鼠))、M.P3(源自大鼠肝，藉由DAB株化之M細胞之無血清/無脂質培養基適應株，(JAR大鼠))、NCTC純系1469(由小鼠正常肝確立之細胞株，(C3H/An小鼠))、FLS3(小鼠肝基質細胞株)、FLS5(小鼠肝基質細胞株)、TLR2(小鼠肝細胞株，利用溫度敏感性SV40大T基因進行永生化，培養溫度33℃(C57BL/6基因轉殖小鼠(transgenic mouse)))、TLR3(小鼠肝細胞株，利用溫度敏感性SV40大T基因進行永生化，培養溫度33℃(C57BL/6基因轉殖小鼠))、WB-F344(大鼠肝上皮細胞株，據報告類似於卵圓細胞(oval cell)之表現型，(Fischer F344大鼠))、FF101(大鼠肝細胞癌，3'-甲基-4-二甲胺基偶氮苯誘發，無血清培養，(Donryu大鼠))、AH601.P3(JTC27)(大鼠可移植腹水肝癌，無血清適應株)、AH-7974.P3(大鼠腹水肝癌，源自JTC-16，無血清適應株)、RLC-10.P3(源自大鼠RLC-10細胞，無血清適應株)、M.P3(源自大鼠肝，藉由DAB株化之M細胞之無血清/無脂質培養基適應株)、RI-T(大鼠肝星狀細胞(伊東細胞)株，利用SV40 T抗原永生化(韋斯大鼠))、TMNK-1(人永生化肝內皮細胞)、HUH-6純系5(人肝胚細胞瘤，高分化型)、HuH-7(人肝細胞癌，分化型)、HLE(人肝細胞癌，未分化型)、HLF(人肝細胞癌，未分化型)、PLC/PRF/5(人肝細胞癌，HBs抗原陽性)、HuCCT1(人膽管癌)、HuH28(人膽管癌)、JHH-4(人肝細胞癌)、LI90(人肝伊東(Ito)細胞，有限增殖)、亞歷山大細胞(Alexander cells)(人肝細胞癌，HBs抗原陽性，PLC/PRF/5株之別名)、OCUG-1(人膽囊癌，惡性)、huH-1(人肝細胞癌，HBs抗原陽性)、JHH-2(人肝細胞癌)、JHH-5(人肝細胞癌)、JHH-6(人肝細胞癌)、JHH-7(人肝細胞癌，組入有HBV基因)、OZ(人膽管癌)、NOZ(人膽囊癌，中分化型管狀腺癌)、Hep G2(人肝細胞癌)、JHH-1(人肝細胞癌)、GS-3A4-HepG2(人肝細胞癌，人麩醯胺合成酶，CYP3A4強制表現細胞)、TYGBK-1(人膽囊癌)、TYBDC-1(人膽管腺癌(由膽管癌之肝轉移灶確立))、KKU-055(人膽管癌細胞)、MMNK-1(源自人永生化膽管之細胞株)、KKU-213(人膽管癌細胞)、KKU-100(人膽管癌細胞)、TWNT-1(人肝伊東(Ito)細胞，LI90之永生化細胞株)、TYGBK-8(人膽囊癌(中分化管狀癌))、DR-EcoScreen(小鼠芳香烴(aryl hydrocarbon)受體之體外(in vitro)轉錄活化分析所使用之細胞株)。
於尤佳之態樣中，使用具有100 μg/dl/24 h以上之氨代謝功能，且可構成網狀結構體之人工肝細胞。繼而，對該高功能人工肝細胞進行詳細說明。
＜人工肝細胞＞ [網狀結構體] 關於細胞之特徵，所謂「可構成網狀結構體」係指於將成為對象之細胞於適當之條件下培養之情形時，構成特定之網狀結構體。網狀結構體係藉由以適當之密度將細胞接種於視需要經細胞外基質(ECM)、例如基質膠(matrigel)(註冊商標)、玻尿酸、肝素、纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、玻璃黏連蛋白、或其他ECM塗佈之培養器中，使用適當之培養基培養數天而構成。網狀結構體包括至少1個細胞程度之寬度~1000 μm(更特定為數個細胞程度之寬度~500 μm，進一步特定為20~250 μm)之繩狀之部分及圓形、橢圓形等之空隙之部分。空隙之直徑典型為100~2000 μm，更特定為200~1000 μm，進一步特定為300~1000 μm。又，網狀結構體可具有1~3個細胞程度之10~60 μm之厚度。
[氨代謝功能] 本發明中提及氨代謝功能時，除了特別記載之情形以外，係指於適當之條件下培養成為對象之細胞之情形時之氨代謝功能。氨代謝功能之測定方法為業者所熟知，較佳為不使用飼養源細胞(HUVECs、MSCs等)而使用下文所述之化合物(FH1)，使用視需要經ECM塗佈之培養器進行吸附培養。更詳細之條件可參照本說明書之實施例之項所記載之方法。
於較佳之態樣中，人工肝細胞具有較高之氨代謝功能。具體而言，人工肝細胞可具有100 μg/dl/24 h以上、較佳為120 μg/dl/24 h以上、更佳為與初代肝細胞之代謝功能(160~200 μg/dl/24 h)相同程度即160 μg/dl/24 h、進而較佳為180 μg/dl/24 h之氨代謝功能。
[培養上之特徵]無血清及 / 或無飼養源環境下之培養：
作為用以培養人工肝細胞之培養基，可利用為了培養肝細胞所開發之各種既有之培養基。作為可利用之培養基之例，可列舉下文所述之分化誘導培養基III或HCM™ BulletKit™培養基(Lonza Walkersville, Inc)或HBM™基礎培養基(Lonza Walkersville, Inc)。
人工肝細胞可於無血清及/或無飼養源環境下、較佳為於無血清且無飼養源環境下培養。所謂於無血清且無飼養源環境下培養係使用不含動物血清及人血清之培養基，於目標人工肝細胞以外之細胞、例如胎鼠纖維母細胞或飼養源細胞(人臍帶靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)、間葉系肝細胞(mesenchymal stECMells，MSCs)不共存之環境下培養。
ECM 塗佈： 於培養人工肝細胞時，可利用各種既有之培養器。關於培養器素材，業者可適當選擇，就增殖良好、且維持較高之功能之觀點而言，較佳為使用塗佈有ECM之培養器。較佳之ECM之例為基質膠(matrigel)(註冊商標)、玻尿酸、肝素、纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、及玻璃連結蛋白、蛋白多糖(硫酸軟骨素蛋白多糖、硫酸乙醯肝素蛋白多糖、硫酸角質素蛋白多糖、硫酸皮膚素蛋白多糖)、各種膠原蛋白、明膠、肌糖蛋白(tenascin)、內動素(entactin)、彈力蛋白、及小纖維蛋白(fibrillin)等。
維持、繼代： 確認人工肝細胞可使用下文所述之分化誘導培養基III進行10天左右之連續培養。認為藉由以適當之密度接種，可進行繼代、增殖。所謂適當之密度例如係人工肝細胞正好互相相接之密度。於密度低於該密度之情形時，增殖較差，又，於密度高於該密度之情形時，可能自表現出三維結構之區域誘導顯著之細胞死亡。
＜人工肝細胞之製造方法＞ 較佳之態樣中使用之人工肝細胞可藉由包括以下步驟之方法而製造： 分化誘導步驟1，其將iPS細胞於含有活化素A之分化誘導培養基I中進行培養； 分化誘導步驟2，其將由分化誘導步驟1獲得之細胞於含有骨形成蛋白4(BMP4)及纖維母細胞生長因子2(FGF2)之分化誘導培養基II中進行培養；及 分化誘導步驟3，其將由分化誘導步驟2獲得之細胞於含有肝細胞生長因子(HGF)、抑瘤素M、地塞米松及具有N-苯基-2-(N-苯基甲磺醯胺基)乙醯胺(N-phenyl-2-(N-phenylmethylsulfonamido) acetamide)骨架之化合物之分化誘導培養基III中進行培養而獲得人工肝細胞。
分化誘導步驟1： 於分化誘導步驟1中，將iPS細胞於至少含有活化素A之分化誘導培養基I中進行培養。
iPS 細胞： 為了獲得較佳之態樣中所使用之肝細胞，作為起始細胞，使用源自人或非人動物之iPS細胞。iPS細胞之獲得方法及確立方法為業者所熟知。人iPS細胞可從Riken BioResource Research Center購入或者從京都大學或國立成育醫療研究中心分讓。可獲得且較佳之iPS細胞之例例如為：藉由利用反轉錄病毒載體向源自臍帶之纖維母細胞(RCB0436 HUC-F2)中導入4因子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)所確立之人之人工多能性幹(iPS)細胞株HiPS-RIKEN-1A(理化學研究所，HPS0003)、藉由利用反轉錄病毒載體向源自臍帶之纖維母細胞(RCB0197 HUC-Fm)中導入4因子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)所確立之人iPS細胞株HiPS-RIKEN-2A(理化學研究所，HPS0009)、藉由利用反轉錄病毒載體向源自臍帶之纖維母細胞中導入3因子(Oct3/4、Sox2、Klf4)所獲得之人iPS細胞株HiPS-RIKEN-12A(理化學研究所，HPS0029)、藉由使用仙台病毒載體導入4因子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)所確立之人iPS細胞株Nips-B2(理化學研究所，HPS0223)等。
仙台病毒載體之使用： 於確立iPS細胞時，作為用以導入因子之載體，較佳為使用仙台病毒載體。由於反轉錄病毒載體係進入細胞之核中作為DNA(deoxyribonucleic acid，去氧核糖核酸)進行基因表現者，因此於將所獲得之iPS細胞用於患者時，雖然極為罕見，但擔憂載體主動地進入至患者之染色體內、或與染色體DNA發生基因重組。另一方面，仙台病毒載體係不進入至細胞核中，於細胞質內複製自身之基因組而產生大量之蛋白質者。該基因組來自RNA(ribonucleic acid，核糖核酸)，與患者之染色體之DNA物質性地不同，因此認為原理上不存在仙台病毒載體改變核內之患者之染色體的風險。
使用仙台病毒(SeV)載體確立iPS細胞之方法為業者所熟知，例如藉由利用添加了搭載有重新編程因子表現單元之仙台病毒載體之培養基培養市售之人纖維母細胞等而確立。作為搭載有重新編程因子表現單元之仙台病毒載體，例如可列舉CytoTune-iPS(DNAVEC股份有限公司製造)等。
分化誘導培養基 I ： 該步驟所使用之分化誘導培養基I含有Wnt3A或活化素A等細胞激素。較佳為至少含有活化素A。關於細胞激素之量，例如Wnt3A為10~50 ng/mL左右，較佳為25 ng/ml左右，活化素A為10~100 ng/ml左右，較佳為100 ng/ml左右。
分化誘導培養基I中無血清，例如可於RPMI1640等基本之組成中添加上述細胞激素與血清替代品而使用。作為血清替代品，可列舉B27(註冊商標)(Life Technologies公司製造)、KnockOut(註冊商標)血清替代品(Life Technologies公司製造)等。分化誘導培養基I之具體之構成例係本案說明書之實施例之項所記載之組成者。B27之組成可參照G.J. Brewer et al. Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented NeurobasalTM, a New Serum-free Medium Combination. Journal of Neuroscience Research 35567476 (1993)。
本步驟係藉由使用分化誘導培養基I，將iPS細胞於37℃、5% CO2 培養箱中培養數天而進行。分化誘導步驟1之培養時間具體而言為4~10天，較佳為6~8天，更佳為7天。分化誘導步驟1可進行至形態上具有內胚層細胞之特徵為止。
分化誘導步驟2： 於分化誘導步驟2中，將由分化誘導步驟1獲得之細胞於分化誘導培養基II中進行培養。
分化誘導培養基 II ： 該步驟所使用之分化誘導培養基II含有各種細胞激素，例如纖維母細胞生長因子2(FGF2)、骨形成因子4(BMP4)、肝細胞生長因子(HGF)。關於細胞激素之量，例如，FGF2為5~50 ng/ml，BMP4為5~50 ng/ml，HGF為5~50 ng/ml，較佳為FGF2為10 ng/ml左右，BMP4為20 ng/ml左右，HGF為20 ng/ml左右。分化誘導培養基II至少含有骨形成蛋白4(BMP4)及纖維母細胞生長因子2(FGF2)。分化誘導培養基II亦可設為無血清，例如可於RPMI1640等基本之組成中添加上述細胞激素與血清替代品而使用。分化誘導培養基II之具體之構成例係本案說明書之實施例之項所記載之組成者。
本步驟可藉由使用分化誘導培養基II，將步驟1中獲得之細胞於37℃、5% CO2 培養箱中進行培養而實施。分化誘導步驟2之培養時間具體而言為1~6天，較佳為2~5天，更佳為3~4天。
分化誘導步驟3： 本步驟係將由分化誘導步驟2獲得之細胞於分化誘導培養基III中進行培養而獲得人工肝細胞之步驟。
分化誘導培養基 III ： 此處所使用之細胞激素及激素之例為抑瘤素M(OSM)或地塞米松等。關於所使用之量，例如OSM為10~50 ng/ml，地塞米松為0.05~0.5 μM，較佳為OSM為25 ng/ml左右，地塞米松為0.1 μM左右。分化誘導培養基III至少含有肝細胞生長因子(HGF)、抑瘤素M、地塞米松、以及N,N'-(亞甲基雙(4,1-伸苯基))二乙醯胺(FH1)及/或2-(N-(5-氯-2-甲基苯基)(甲磺醯胺基)-N-(2,6-二氟苯基)-乙醯胺(FPH1)。分化誘導培養基III之具體之構成例係本案說明書之實施例之項所記載之組成者。
FH1 及 FPH1 ： 分化誘導培養基III含有下式表示之N,N'-(亞甲基雙(4,1-伸苯基))二乙醯胺(FH1)及/或2-(N-(5-氯-2-甲基苯基)(甲磺醯胺基)-N-(2,6-二氟苯基)-乙醯胺(FPH1)。
[化1]
[化2]
於較佳之態樣中，分化誘導培養基III含有FH1及FPH1。
本步驟可藉由將於分化誘導步驟2中獲得之細胞於分化誘導培養基III中培養數天~數週左右而實施。於該培養期間，較佳為至少3天1次、較佳為以每天之頻度更換培養基。
其他條件： 分化誘導步驟1~3均可於血清及/或無飼養源環境下，較佳為無血清且無飼養源環境下實施。又，可視需要使用塗佈有ECM之培養器實施。
肝細胞之確認： 已知肝實質細胞於胚胎學上係繼類胚體中之心肌細胞出現後出現。已知實驗中觀察到肝實質細胞於由類胚體分化之心肌細胞附近表現。
作為確認經過分化誘導步驟1~3之細胞向肝細胞分化之方法，可藉由轉運蛋白(TTR)、α-胎蛋白(AFP)胎兒肝細胞、a1-抗胰蛋白酶(AAT)、酪胺酸轉胺酶(TAT)、色胺酸加氧酶(TO)、酪胺酸轉胺酶、去唾液酸糖蛋白受體(ASGR)、白蛋白等肝細胞(胎兒肝細胞)特異性標記物基因表現、或肝細胞特異性標記物蛋白質之表現、或者利用抗白蛋白抗體進行之免疫染色等進行確認。又，於小鼠之肝細胞中，確認到較多具有2核之細胞，因此可藉由以形態學方式確認細胞核而加以確認。 較佳為如上述人工肝細胞之項所述般，以可構成網狀結構體、具有較高之氨代謝功能作為指標。 [實施例]
＜iPS細胞之製作＞ [iPS細胞之製作] 藉由下述之方法製作iPS細胞。 1.將POIETICS(註冊商標)臍帶血CD34+細胞(Cat. No. 2C-101A)、POIETICS(註冊商標)經動員之CD34+細胞(Cat. No. 2G-101B)解凍。 2.使用CytoTune(註冊商標)iPS 2.0仙台病毒重編程套組(Sendai Reprogramming Kit)，按照套組所附之操作說明製作iPS細胞。
[iPS細胞之確認] 進行下述步驟確認獲得iPS細胞。
免疫染色： 1.藉由CytoSpin(註冊商標)將253G1(從理研獲得)及CiPS貼附於載玻片(800 rpm，5 min)。 2.藉由4%多聚甲醛(Nacalai Tesque)加以固定(15 min，室溫)。 3.藉由PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸鹽緩衝液)洗淨3次。 4.室溫下阻斷(0.3% TritonX-100，1% BSA(bovine serum albumin，牛血清白蛋白)，10% AB血清或BlockingOne-Histo(Nacalai Tesque))10~20 min。 5.室溫下進行0.1% Tween PBS處理5 min。 6.利用R&D之人多能性stECMell 3色免疫細胞化學套組於室溫或o/n、4℃下以3 hr各稀釋10倍。 7.藉由PBS洗淨。 8.藉由VECTA SHIELD(註冊商標) Hard Set with DAPI封入。 9.藉由一體式螢光顯微鏡BZ-9000(KEYENCE)進行觀察。
流式細胞測量術： 1.藉由Accutase於37℃下處理5 min，將253G1(來自理研)及CiPS剝離並回收 2.藉由SSEA-4 FITC、SSEA-3 PE、TRA-1-81 PE(各終濃度1 μg/ml)抗體進行染色(4℃，30 min)。 3.藉由FACSCalibur進行測定。 4.藉由CellQuest或FlowJo進行解析。
形態觀察： 於下文所述之培養法中，定期藉由一體式螢光顯微鏡BZ-9000(KEYENCE)進行觀察。
SeV 載體 (CytoTune_iPS2.0) 之脫落確認： 1.藉由12孔盤培養iPS細胞。 2.藉由PBS洗淨。 3.藉由1 ml/孔之10%中性福馬林加以固定(5 min，室溫)。 4.藉由PBS洗淨。 5.添加抗Sev抗體(藉由0.1% TritonX-100/PBS稀釋成1/500)500 μl。 6.於37℃下反應1 h。 7.藉由PBS洗淨。 8.添加Dyelight550標記抗兔IgG抗體(藉由0.1% TritonX-100/PBS稀釋成1/500)500 μl。 9.於37℃下反應1 h。 10.藉由PBS洗淨。 11.藉由一體式螢光顯微鏡BZ-9000(KEYENCE)進行觀察。
結果： 將免疫染色及流式細胞測量術之結果示於圖3，將定期觀察細胞之形態獲得之結果示於圖4，將確認rSeV載體自CiPS細胞脫落之結果示於圖5。CiPS細胞從製作起至擴大培養之全部步驟中無飼養源。又，藉由自感染起大致3個月之繼代，可獲得sReV脫落之CiPS。
＜用以誘導CiPS-Hep之iPS細胞之準備＞ 藉由下述之方法準備用以誘導源自iPS之高功能肝細胞(CiPS-Hep)之iPS細胞。再者，於iPS細胞群落觀察等上述所製作之iPS細胞之確認中，實施本項所示之方法。
[塗佈有層黏連蛋白之培養皿之製作] 1.預先於4℃下將層黏連蛋白-51) (-80℃)融解。注意不要以手溫熱。 2.將PBS3) 以1 ml/well裝入至6孔盤2) 中，使其遍及整體。 3.預先於4℃下將裝有PBS之6孔盤與200 μl吸嘴冷卻。 4.將融解之層黏連蛋白-5澆入至裝有PBS之孔中，快速搖晃10次左右，使其遍及整體。由於層黏連蛋白-5之吸附性非常強，因此絕對不要吸液。 5.於4℃下培育一晚，或於37℃下培育2小時以上進行塗佈。不要於37℃下放置不管。 6.於不立即使用之情形時可藉由封口膜密封2層，並且於4℃下保存。(1週)
[冷凍細胞之解凍與培養] 1.將P2之離心分離機設定為20℃。 2.預先將各種抑制劑(以下之步驟9所使用之4種)自-30℃之冷凍庫中取出。 3.製備培養用培養基(以下記載為ReproFF2)。
[表1]
4.將ReproFF2於15 ml試管7) 中各分注9 ml及4 ml，於37℃下加溫。 5.藉由PBS(-)將塗佈有層黏連蛋白之培養皿清洗2次，預先將1 ml之PBS(-)裝入至孔中。 6.自液態氮中取出冷凍細胞，於37℃之水浴中浸漬2 min加以融解。於冷凍細胞之體積較少之情形時，加入適量經溫熱之培養基，藉由溫和地吸液將其快速解凍。 7.將經解凍之細胞回收，轉移至裝有培養用培養基9 ml之15 ml試管中，溫和地倒置混合而加以混合。 8.離心分離 條件：160 g，5 min，R.T. 有加速器，有制動 9.於離心過程中製備4 ml之培養用培養基+各種抑制劑。
[表2]
10.將離心後之15 ml試管回收，小心地去除上清液。 11.添加1 ml之抑制劑培養用培養基，藉由吸液使細胞團塊溫和地散開。 12.將塗佈有層黏連蛋白之培養皿之PBS(-)去除，將細胞懸浮培養液轉移至孔中。藉由剩餘之抑制劑培養用培養基清洗15 ml試管，並移至孔中。 13.搖晃培養皿，使細胞均勻地擴展，於37℃、5%CO2 下培育。 14.第二天溫和地混合孔中之培養基後，去除上清液。 15.再次添加培養用培養基+各種抑制劑4 ml，於37℃、5%CO2 下培養。
[培養基更換] 1.去除培養上清液。 2.以4 ml/well添加新鮮之培養用培養基ReproFF2。 3.每隔2~3天(週一、週三、週五)進行上述操作。
[細胞之繼代] 1.製作塗佈有層黏連蛋白之培養皿。 2.去除培養上清液。 3.添加PBS(-) 1 ml，將細胞表面洗淨。 4.去除PBS(-)，以1 ml/well添加ESGRO完全Accutase12) ，於37℃、5%CO2 下培育5 min。 5.藉由吸液將孔中未剝離之細胞剝離，將細胞溶液回收至15 ml試管中。 6.於孔中添加1 ml之ReproFF2，將孔內洗淨，將溶液回收至15 ml試管中，進而向15 ml試管中再添加1 ml之ReproFF2，使總體積(Total volume)成為3 ml。 7.將經調整之細胞懸浮液充分混合後，藉由錐蟲藍染色液13) 稀釋成2倍並進行細胞計數。 8.以根據繼代之孔數成為5×105 cells/well之方式將細胞懸浮液分注於新的15 ml試管中。視需要將剩餘之細胞冷凍保存。 9.進行離心分離。條件：160 g，5 min，R.T. 有加速器，有制動 10.於離心過程中以成為4 ml/well之方式調整培養用培養基+抑制劑。
[表3]
11.離心後去除上清液，使用培養用培養基+抑制劑，藉由吸液使細胞團塊散開，接種於各塗佈有層黏連蛋白之孔中。 12.於培養盤記載日期、iPS細胞之名稱、繼代數，於37℃、5%CO2 下進行培養。 按照週一→週五→週三→週一之間隔持續繼代。
[細胞之冷凍保存] 1.與細胞繼代時同樣地剝離細胞並進行計數。 2.將細胞懸浮液進行離心分離。條件：160 g，5 min，R.T. 有加速器，有制動 3.於冷凍所使用之血清試管(serum tube)14) 標記日期、細胞名、繼代數。 4.離心後，充分去除上清液，以成為1×106 cells/500 μl之方式使細胞懸浮於STECMELLBANKER15) 中。 5.以500 μl/根之方式將細胞懸浮液分注於經標記之血清試管中。 6.分注後，將血清試管放入至-80℃之超低溫冷凍庫中。 7.於1~3天後以內將冷凍之細胞自-80℃轉移至液態氮細胞保存系統加以保管。
＜CiPS-Hep之誘導＞ 藉由下述之方法由CiPS細胞分化誘導高功能肝細胞(CiPS-Hep)。
[第1天：源自iPS之高功能肝細胞分化誘導步驟1：將培養基更換為源自iPS之高功能肝細胞分化誘導培養基I(以下稱為培養基I)] 1.製備必需量(4 ml/well)之培養基I。
[表4]
2.將上清液去除，添加1 ml之無血清RPMI1640，將細胞表面洗淨。 3.以成為4 ml/well之方式添加培養基I。 4.每天進行去除上清液並添加新鮮之培養基I之作業至第6天。
[第7天：源自iPS之高功能肝細胞分化誘導步驟2：將培養基更換為源自iPS之高功能肝細胞分化誘導培養基II(以下稱為培養基II)] 1.製備必需量(4 ml/well)之培養基II。
[表5]
2.溫和地將培養上清液吸液後，去除上清液，以成為4 ml/well之方式添加培養基II。 3.每天進行去除上清液並添加新鮮之培養基II之作業至第9天。
[第10天：源自iPS之高功能肝細胞分化誘導步驟3]1. 培養盤之基質膠塗佈 1.1.於4℃下將低生長因子型BD基質膠(BD matrigel growth factor reduced)20) 300 μl解凍。 1.2.預先將24孔盤培養皿21) 、KnockOut-DMEM22) 於4℃下冷卻。 1.3.將基質膠融解後，添加等量之KnockOut-DMEM，藉由吸液充分混合。 1.4.以每孔200 μl之方式將基質膠稀釋液裝入24孔盤培養皿中，使其遍及孔整體。 1.5.於常溫下將24孔盤培養皿靜置3小時以上進行塗佈。
2. 源自 iPS 細胞之高功能肝細胞之繼代 2.1.以成為1 ml/well之方式製備源自iPS之高功能肝細胞分化誘導培養基III(以下為培養基III)。
[表6]
2.2.去除培養上清液，藉由PBS(-)1 ml洗淨細胞表面。 2.3.添加1 ml之ESGRO完全Accutase，於37℃下培育5 min。 2.4.小心地吸液而將細胞剝離，將細胞溶液回收至15 ml試管中。 2.5.藉由1 ml之HCM將孔內洗淨，將溶液回收至15 ml試管中，進而再向15 ml試管添加1 ml之HCM，使總體積成為3 ml。 2.6.將細胞懸浮液充分混合，藉由錐蟲藍稀釋成2倍進行細胞計數。 2.7.以根據繼代之孔數成為1.0×106 cells/well之方式向新的15 ml試管中分注必需量。 2.8.於160 g、5 min、R.T.下進行離心分離。 2.9.於離心過程中於基質膠塗佈孔中添加1 ml之PBS(-)，洗淨而去除上清液。將該洗淨作業重複2次，於孔中添加1 ml之PBS(-)。 2.10.離心後去除上清液，於進行黏著培養(Adhesion cultivation)之情形時，亦去除基質膠塗佈孔之上清液後，使用培養基III，藉由吸液使細胞團塊散開，接種至基質膠塗佈孔。 於進行漂浮培養(Floating cultivation)之情形時，使用培養基III，藉由吸液使細胞團塊散開，接種至經MPC處理之培養盤(MD6，帶蓋(with Lid)，低細胞結合力(Low-Cell Binding)，Nalge Nunc International, Japan)。 於使用HUVEC及MSC作為飼養源細胞之情形時，作為黏著培養，適當地進行共培養(參照下文揭示之非專利文獻1)。 2.11.於培養盤記載日期、細胞之名稱等，於37℃、5%CO2 之培養箱內培養。 2.12.隔天進行去除上清液並添加新鮮之培養基III之作業至第17天。
[第17天：CiPS-Hep完成→氨代謝試驗] 1.以成為1 ml/well×2之方式製備HBM(混合物-)+氨水(以下稱為氨培養基)。
[表7]
2.去除培養上清液，藉由1 ml之HBM將細胞表面洗淨1次，藉由氨HBM將細胞表面洗淨1次。 3.去除上清液，以1 ml/well添加氨培養基。 4.以每孔1 ml之方式於空孔中加入氨培養基及HBM，作為陽性對照及陰性對照。 5.於37℃、5%CO2 下培養24 hr。
[第18天：回收氨代謝試驗樣品] 1.將上清液回收至微量離心管中，以500 g離心分離5 min。 2.以每根300 μl之方式將上清液回收至3根新微量離心管中，於-80℃進行冷凍。 3.藉由PBS洗淨孔，添加1 ml之胰蛋白酶EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)30) ，於37℃下培育5 min。 4.小心地吸液而將細胞剝離，使細胞溶液通過FACS(fluorescence activated cell sorting，螢光激活細胞分選)試管31) 。 5.藉由1 ml之HBM洗淨，使總體積成為2 ml。 6.藉由錐蟲藍進行計數。
＜iPS-HEP細胞之確認＞ 進行下述步驟，確認獲得iPS細胞。
氨測試 Wako32) ： 1.使上清液溶解。 2.以8000 rpm於4℃下離心5 min。 3.製作氨稀釋液。不使用套組內之標準液及標準稀釋液。於HBM(不添加其他)960 μl中添加銨離子標準液(1000 mg/L) 40 μl，進行漩渦攪拌，製成標準液。
[表8]
4.將樣品之上清液及氨稀釋液各200 μl轉移至新微量離心管中。 5.添加800 μl之除蛋白液，進行漩渦攪拌。 6.以8000 rpm於4℃下離心5 min。 7.於離心過程中接通微盤讀取器及個人電腦之電源，預先選擇Tecan i-control。 8.以每孔60 μl之方式將上清液分注於96孔平底盤中。複製(Duplicate)。 9.以每孔60 μl之方式於各孔中添加顯色試液A。 10.開蓋放置於微盤讀取器，對盤進行攪拌。(雙擊振動(Shaking)，設置為10 sec、普通(normal)，點擊開始(Stat)) 11.以每孔30 μl之方式於各孔中添加顯色試液B。 12.放置於微盤讀取器，對盤進行攪拌。 13.以每孔60 μl之方式於各孔中添加顯色試液C。儘量快速。 14.放置於微盤讀取器，對盤進行攪拌。 15.於37℃、CO2 5%培養箱中培育20 min。 16.於4℃下冷卻10 min以上而停止反應。 17.將盤之底面擦拭乾淨，對準左上放置於微盤讀取器。 18.測定吸光度(620或630 nm)。(雙擊測量(Measure)之吸光度(Absorbance)。620 nm。選擇以細節(Details)測定之孔。點擊開始(Start))
RT-PCR ： 1.使用ISOGEN II(NIPPON GENE)，按照隨附之操作說明，萃取RNA。 2.藉由NanoDrop(註冊商標)測定RNA濃度。 3.藉由PrimeScript高保真RT-PCR套組合成cDNA。 4.藉由Veriti 96孔熱循環儀(Applied Biosystems)實施PCR。 5.引子組如以下所述。
[表9]
7.藉由1%瓊脂糖凝膠對RT-PCR產物進行電泳。 8.藉由凝膠紅(Gel Red)進行染色並觀察。
結果： 將所獲得之iPS-HEP細胞之照片示於圖6。所獲得之細胞係構成特徵性之網狀結構體者。空隙之直徑約為300~1000 μm，網部分之寬度約為20~200 μm。具有1~3個細胞程度之約10~60 μm之厚度。
將所獲得之氨代謝試驗及RT-PCR之結果示於圖7~11。可知iPS-HEP細胞根據培養條件而具有與初代肝細胞之代謝功能(160~200 μg/dl/24 h)相同程度之氨代謝功能。又，與使用飼養源細胞(人臍帶靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)、間葉系肝細胞(mesenchymal stECMells，MSCs))相比，使用化合物(FH1、FPH1)時氨代謝功能之增強效果較高。
＜實施例所使用之材料一覽＞
[表10]
＜實施例所引用之文獻＞ 非專利文獻1：T. Takebe et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature 499, 481-484 (2013), doi:10. 1038/nature 12271, Published online 03 July 2013 [產業上之可利用性]
期待由本發明獲得之體外型之人工肝臟於肝移植術前或自體肝之再生前之期間用於輔助肝臟之功能。
1‧‧‧血漿成分入口埠
2‧‧‧血漿成分出口埠
3‧‧‧血漿成分循環室
4‧‧‧肝細胞培養室
5‧‧‧分離膜
6‧‧‧分離膜支架(抑制分離膜之變形之機構)
7‧‧‧模組蓋
8‧‧‧模組本體
9‧‧‧肝細胞
10‧‧‧患者
11‧‧‧血漿分離器
12‧‧‧人工肝臟
20‧‧‧循環迴路1(患者側迴路)
21‧‧‧循環迴路2(人工肝臟側迴路)
[序列表非關鍵文字]
SEQ ID NO.:1 hALB For SEQ ID NO.:2 hALB Rev SEQ ID NO.:3 hHNF4a For SEQ ID NO.:4 hHNF4a Rev SEQ ID NO.:5 hOCT4 For SEQ ID NO.:6 hOCT4 Rev SEQ ID NO.:7 hCYP3A4 For SEQ ID NO.:8 hCYP3A4 Rev SEQ ID NO.:9 hβ-肌動蛋白For SEQ ID NO.:10 hβ-肌動蛋白Rev
圖1係構成人工肝臟之模組之實施態樣之一例的剖面圖。 圖2係使用人工肝臟之系統之實施態樣之一例的模式圖。圖中之箭頭表示血液等於迴路內流動之方向。 圖3係源自臍帶血(Cord blood)CD34陽性細胞之iPS細胞(CiPS)。 圖4係源自臍帶血CD34陽性細胞之iPS細胞(CiPS)。 圖5係rSeV載體自CiPS脫落之確認。 圖6係由經最佳化之iPS細胞誘導之高功能肝細胞。 圖7係氨代謝量之確認。可知與使用飼養源細胞(HUVECs(human umbilical vein endothelial cell，人臍靜脈內皮細胞)、MSCs(mesenchymal stem cell，間葉系幹細胞))相比，使用化合物(FH1、FPH1)者代謝功能增強效果較高。 圖8係氨代謝量之確認。可知所獲得之iPS-HEP細胞根據培養條件而保持與初代肝細胞之代謝功能(160~200 μg/dl/24 h)相同程度之氨代謝功能。 圖9係肝細胞標記物之確認(RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，反轉錄-聚合酶鏈反應))。 圖10係肝細胞標記物之確認(RT-PCR)。 圖11係肝細胞標記物之確認(RT-PCR)。

Claims (11)

  1. 一種體外型之人工肝臟，其具備包含以下之至少一個模組： 血漿成分入口埠及血漿成分出口埠； 具備血漿成分入口埠及血漿成分出口埠之血漿成分循環室；及 與血漿成分循環室鄰接地配置，藉由使氨透過但不使肝細胞透過之分離膜而與血漿成分循環室隔開，而培養具有氨代謝功能之肝細胞的肝細胞培養室。
  2. 如請求項1之人工肝臟，其中血漿成分循環室配置於肝細胞培養室之上。
  3. 如請求項1或2之人工肝臟，其中肝細胞係具有100 μg/dl/24 h以上之氨代謝功能且可構成網狀結構體之人工肝細胞。
  4. 如請求項1至3中任一項之人工肝臟，其中肝細胞係於無血清且無飼養源環境下培養。
  5. 如請求項1至4中任一項之人工肝臟，其中每1個模組至少培養1.0×106 個肝細胞。
  6. 如請求項1至5中任一項之人工肝臟，其具備複數個模組，且培養5.0×109 ~5.0×1011 個肝細胞。
  7. 如請求項1至6中任一項之人工肝臟，其具有1×104 ~1×106 cm2 之有效培養面積。
  8. 一種體外型之人工肝臟用或肝細胞培養用之器具，其至少具備以下： 血漿成分入口埠及血漿成分出口埠； 具備血漿成分入口埠及血漿成分出口埠之血漿成分循環室；及 與血漿成分循環室鄰接地配置，藉由使氨透過但不使肝細胞透過之分離膜而與血漿成分循環室隔開之用以培養肝細胞的肝細胞培養室。
  9. 如請求項8之器具，其中肝細胞培養室具備用以導入肝細胞之細胞導入埠。
  10. 如請求項9之器具，其中肝細胞培養室具備用以排出空氣之排氣埠。
  11. 如請求項8至10中任一項之器具，其於肝細胞培養室內具備抑制分離膜之變形之機構。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112604048A (zh) * 2020-12-04 2021-04-06 广东乾晖生物科技有限公司 全肝型生物人工肝支持系统专用管路

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020097449A1 (en) * 2018-11-09 2020-05-14 Figene, Llc Means and methods of preventing or reversing aging

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS583722B2 (ja) * 1978-12-28 1983-01-22 日機装株式会社 物質交換装置
US5605835A (en) * 1988-05-23 1997-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Bioreactor device with application as a bioartificial liver
JPH0292270A (ja) * 1988-09-30 1990-04-03 Terumo Corp 細胞培養装置
US5866420A (en) * 1993-10-08 1999-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Artificial liver device
US6472200B1 (en) * 1999-07-23 2002-10-29 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Device and method for performing a biological modification of a fluid
JPH1033671A (ja) 1996-07-24 1998-02-10 Jms Co Ltd 中空糸型人工肝臓とその灌流及び培養システム
JPH10234850A (ja) 1997-02-27 1998-09-08 Asahi Medical Co Ltd ハイブリッド型人工肝臓
ATE373079T1 (de) * 1999-06-21 2007-09-15 Gen Hospital Corp Zellkultursysteme und verfahren für einrichtungen zur organunterstützung
US6136593A (en) * 1999-08-23 2000-10-24 Circe Biomedical, Inc. Astrocyte apparatus for bioprocessing a circulating fluid
JP2003274963A (ja) 2002-03-22 2003-09-30 Japan Science & Technology Corp 遺伝子組換え細胞株及びそれを用いた肝機能補助装置
JP2004049301A (ja) 2002-07-16 2004-02-19 Asahi Medical Co Ltd 血液浄化装置
WO2004024300A1 (en) * 2002-09-11 2004-03-25 The Regents Of The University Of Michigan Ultrafiltration membrane, device, bioartificial organ and methods
PT2578081E (pt) * 2006-10-11 2016-06-17 Massachusetts Inst Technology Composições, métodos e dispositivos para o tratamento de doenças hepáticas
US9506024B2 (en) * 2010-08-06 2016-11-29 Tissuse Gmbh Circulation system
US20190194607A1 (en) * 2011-01-31 2019-06-27 Dnavec Corporation Highly functional liver cells derived from pluripotent stem cells, method for producing same, and method for testing metabolism/toxicity of drug
JP6356006B2 (ja) 2014-08-05 2018-07-11 旭化成株式会社 メタクリル系樹脂組成物製成形品
SI3059307T2 (sl) * 2015-02-20 2022-08-31 Inserm(Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Uporaba laminina za diferenciacijo pluripotentnih celic v hepatocite

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112604048A (zh) * 2020-12-04 2021-04-06 广东乾晖生物科技有限公司 全肝型生物人工肝支持系统专用管路

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