TW201822810A - 一種預防和治療脂肪肝的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種預防和/或治療受試者脂肪肝及其相關病症的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原；另一方面，本發明還涉及用於預防和/或治療受試者脂肪肝及其相關病症的包含纖溶酶原的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒。

Description

一種預防和治療脂肪肝的方法
本發明涉及一種預防和/或治療脂肪代謝紊亂及其相關病症的方法，包括給藥易患或患有脂肪代謝紊亂及其相關病症的受試者有效量的纖溶酶原，以消減脂肪在身體組織器官的異常沉積，從而實現預防和/或治療脂肪代謝紊亂及其相關病症、併發症的目的。
脂肪代謝紊亂又稱為脂肪代謝障礙，是代謝性疾病中的一種，是由原發性或獲得性因素造成的血液及其他組織器官中脂質(脂類)及其代謝產物質和量的異常。脂質的代謝包括脂類在小腸內消化、吸收，由淋巴系統進入血循環(通過脂蛋白轉運)，經肝臟轉化，儲存於脂肪組織，需要時被組織利用。脂質在體內的主要功用是氧化供能，脂肪組織是機體的能量倉庫，脂肪也能協同皮膚、骨骼、肌肉保護內臟，防止體溫散發和幫助食物中脂溶性維生素的吸收。磷脂是所有細胞膜的重要結構成分，膽固醇是膽酸和類固醇激素(腎上腺皮質激素和性腺激素)的前體。脂類代謝受遺傳、神經體液、激素、酶以及肝臟等組織器官的調節。當這些因素有異常時，可造成脂代謝紊亂和有關器官的病理生理變化，如高脂蛋白血症及其造成的臨床症候群、肥胖症、脂肪肝等。
高脂蛋白血症(Hyperlipoproteinemia)由血液中的脂蛋白過高所致。血液中的脂質如甘油三脂(TG)、游離膽固醇(FC)、膽固醇脂(CE)和磷 脂等很少溶於水，只有與載脂蛋白(APO)組成巨分子複合物(脂蛋白)，才能在血中溶解、運轉和代謝。當血脂高於正常人上限即為高脂血症(Hyperlipemia)。由於血脂在血中以脂蛋白形式運輸，故高脂血症也稱為高脂蛋白血症。一般以成人空腹血甘油三脂超過160mg/dl，膽固醇超過260mg/dl，兒童膽固醇超過160mg/dl為標準[1]。
高脂蛋白血症(高脂血症)是動脈粥樣硬化病變的重要原因之一，是體內脂質代謝異常的表現。由於血脂或脂蛋白的種類不同，超出正常範圍的血脂或脂蛋白種類也可不同，所以世界衛生組織(WHO)將高脂蛋白血症分為五型：I型，主要是乳糜微粒增加，血清混濁呈乳白色，其中含大量甘油三酯(TG)；Ⅱ型，又分成Ⅱa型和Ⅱb兩亞型，前者主要為低密度脂蛋(LDL)明顯增加，後者極低密度脂蛋白(VLDL)也有增加；Ⅲ型，血清常混濁LDL和VLDL皆有增加，電泳上兩者融合；Ⅳ型，主要為VLDL增加，血清或有混濁；V型，乳糜微粒及VLDL皆有增加，血清混濁呈乳白色。其中以Ⅱ型和Ⅳ型最常見[1]。
高脂血症根據病因可分為原發性和繼發性兩大類。原發性多由於脂質和脂蛋白代謝先天性缺陷(或遺傳性缺陷)以及某些環境因素(包括飲食、營養和藥物等)通過未知的機理而引起。繼發性主要繼發於某種疾病，如糖尿病、肝臟疾病、腎臟疾病、甲狀腺疾病，以及飲酒、肥胖。飲食與生活方式等環境因素也是該病的病因。
糖尿病常合併脂質代謝紊亂因此糖尿病又稱為“糖脂病”[2]。糖尿病的發病機制與B細胞功能損傷及胰島素抵抗相關，表現為慢性高血糖，而糖代謝的紊亂又常合併脂質代謝的紊亂。糖尿病脂代謝紊亂已 經成為心血管疾病獨立的危險因素，其主要表現為高甘油三脂血症、低水準的HDL、以及LDL濃度增加。
糖尿病脂質代謝紊亂的發生機制尚不清楚，但眾多證據表明胰島素抵抗是其發生的中心環節。近年來的研究還發現腸胰島素抵抗也參與其中。對糖尿病動物模型和人群研究發現與脂代謝相關的某些基因表達異常進一步導致胰島素抵抗。糖尿病患者動脈粥樣硬化的發生與多種因素相關，但血漿脂質水準的異常是最主要的因素。研究表明，糖尿病患者心血管疾病的發病率和死亡率明顯高於非糖尿病患者，糖尿病已經成為心血管疾病的獨立危險因素[3]。
近年來，腎病與脂代謝紊亂的關係愈來愈引人注目，在慢性進行性腎損傷時常伴隨脂代謝異常，而高脂血症又可促進並加重腎臟的損害，除了介導腎小球損傷外，在小管間質損傷中也起作用。1913年Munk首先描述了腎病症候群的血脂異常。有學者報導，70%-10%的腎病症候群患者可出現高脂血症。其主要表現為血總膽固醇(TC)明顯增加，且以低密度脂蛋白膽固醇升高為主，甘油三酯(TG)的輕度增加，其中低密度脂蛋白(LDL)的升高與尿蛋白有一定的相關性[4]。慢性腎功能不全患者以中度甘油三酯血症為主，血漿總膽固醇水準一般正常，VLDLC、中等密度脂蛋白膽固醇(IDLC)中膽固醇增加。高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)減少，各種脂蛋白中的甘油三酯含量均增加。其根本原因就是尿毒癥環境對甘油三酯的合成及分解代謝的不利影響以及對膽固醇逆向轉運的抑制作用[5]。
隨著腎移植療法的普遍推廣以及各種新型免疫抑制劑(特別是CsA、強的松)的廣泛應用，慢性腎功能衰竭(CRF)病人的生存期顯著延 長，然而腎移植後高脂血症的發生率非常高。腎移植術後高脂血症主要表現為血漿總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDLC)水準增高[6]。
臨床研究證實，脂質代謝紊亂與糖尿病腎病之間有一定的相關性。糖尿病患者脂代謝紊亂，升高的脂類沉積在腎小球基底膜，刺激基底膜細胞增殖和細胞外間質生成。早在1936年，Kimmelstiel和Wilson便在糖尿病腎病患者的腎小動脈、腎小球和腎小管內發現有大量的脂質沉積[7]。脂代謝異常使腎小球和腎小管間質纖維化是導致腎功能進行性損害的重要原因之一[8]。
脂代謝紊亂也可導致肥胖症(肥胖綜合症)的發生。肥胖症分單純性和繼發性兩類。單純性肥胖指無明顯內分泌代謝疾病的肥胖。又可分為體質性肥胖及獲得性肥胖兩種。體質性肥胖有家族遺傳史，患者自幼進食豐富，入量過剩，從小肥胖，脂肪細胞呈增生肥大。獲得性肥胖大多由於營養過度和/或體力活動減少所致，如人到中年後生活物質條件的改善、疾病恢復和休養充分、產後停止體育鍛煉或體力勞動等。脂肪細胞呈肥大變化，沒有增生現象，治療效果較好。繼發性肥胖主要為神經內分泌疾病所致。神經內分泌對代謝有重要調節作用：①下丘腦有調節食欲的中樞，中樞神經系統炎症後遺症、創傷、腫瘤等均可引起下丘腦功能異常，使食欲旺盛而造成肥胖。②胰島素分泌增多，如早期非胰島素依賴型糖尿病患者注射過多胰島素，致高胰島素血症；胰島B細胞瘤分泌過多的胰島素，這都使脂肪合成增加，引起肥胖。③垂體功能低減，特別是促性腺激素及促甲狀腺激素減少引起性腺及甲狀腺功能低下時，可發生肥胖症。④經 產婦或口服女性避孕藥者易發生肥胖，這提示雌激素有促進脂肪合成的作用。⑤皮質醇增多症常伴有向心性肥胖。⑥甲狀腺功能減退，由於代謝率低下，脂肪堆積，且伴粘液水腫。⑦性腺低下也可肥胖，如肥胖性生殖無能症(腦性肥胖症，弗洛利克氏症候群，外傷、腦炎、垂體瘤、顱咽管瘤等損傷下丘腦所致，表現為向心性肥胖，伴尿崩症及性發育遲緩)。
脂代謝紊亂常導致脂肪肝。脂肪肝是指由於各種原因引起的肝細胞內脂肪堆積過多的病變。肝臟在脂質代謝中起著特別重要的作用，它能合成脂蛋白，有利於脂質運輸，也是脂肪酸氧化和酮體形成的主要場所。正常時肝含脂品質不多，約為4%，其中主要是磷脂。若肝臟不能及時將脂肪運出，脂肪在肝細胞中堆積，即形成脂肪肝。
脂肪肝可以是一個獨立的疾病也可以由其它原因所致，例如肥胖性脂肪肝、酒精性脂肪肝、快速減肥性脂肪肝、營養不良性脂肪肝、糖尿病脂肪肝、藥物性脂肪肝等。
某些藥物或化學毒物通過抑制蛋白質的合成而致脂肪肝，如四環素、腎上腺皮質激素、嘌呤黴素、環已胺、吐根堿以及砷、鉛、銀、汞等。降脂藥也可通過干擾脂蛋白的代謝而形成脂肪肝。
脂肪肝的危害之一是其促進動脈粥樣硬化的形成，導致動脈粥樣硬化的原因之一是脂肪肝患者常伴有高血脂症，血液粘稠度增加，其中的低密度脂蛋白(LDL)因其分子量極小，很容易穿過動脈血管內膜在血管壁沉著，使動脈彈性降低，管徑變窄，柔韌性減弱，最終導致血液迴圈障礙。脂肪肝的危害之二是誘發或加重高血壓、冠心病，容易導致心肌梗塞而猝死。脂肪肝的危害之三是腦病脂肪肝症候群(Reye症候群)。脂肪肝的 危害之四是導致肝硬化、肝功能衰竭、肝癌。
脂肪肝是肝臟脂代謝失調的產物，同時又是加重肝臟損傷的致病因素，這是一種互為因果、惡性循環的發展。肝細胞中脂滴增多，使肝細胞脂肪變性、腫大，細胞核被擠壓偏離中心。脂肪的代謝工要在線粒體中進行，脂肪向細胞外運輸主要通過光面內質網，脂肪在肝細胞內的堆積進一步加重線粒體和內質網的負擔降低其功能，進而影響其他營養素、激素、維生素的代謝。長期的肝細胞變性會導致肝細胞的再生障礙和壞死，進而形成肝纖維化、肝硬化。肝硬化繼發肝細胞癌的機率較高。
脂肪肝的危害之五是急性妊娠性脂肪肝，病死率高。此病又稱產科急性黃色肝萎縮，是一種較少見、預後兇險的妊娠合併症。多發生在懷孕的最後三個月，臨床表現常與急重肝相似，可出現急性肝功能衰竭、胰腺炎、腎功能衰竭、全身凝血異常而導致快速死亡，首次妊娠的孕婦居多。
脂肪肝的危害之六是誘發或加重糖尿病。肥胖性脂肪肝患者若血糖濃度超過正常水準，雖未達到糖尿病的診斷標準，一般認為是糖尿病前期。脂肪肝與糖尿病常常相伴而生，而且互相影響，這給臨床治療帶來了更大的困難。
本發明研究發現纖溶酶原可以預防和/或消減脂肪在身體組織器官的異常沉積，例如可以預防和消減脂質在血液、血管壁、內臟器官以及器官間的組織內的異常沉積，改善這些組織器官的功能，從而為脂肪代謝紊亂及其相關病症、以及其伴隨的疾病或併發症提供了全新的預防和治療方案。
本發明涉及如下各項：
在一方面，本發明涉及：項1.一種用於預防和/或治療受試者脂肪肝及其相關病症的方法，包括給藥受試者預防和/或治療有效量的纖溶酶原，所述受試者患有、懷疑患有脂肪肝及其相關病症或具有患上脂肪肝及其相關病狀的風險。
項2.項1的方法，其中所述脂肪肝包括肥胖性脂肪肝、酒精性脂肪肝、快速減肥性脂肪肝、營養不良性脂肪肝、糖尿病脂肪肝、藥物性脂肪肝。
在又一方面，本發明涉及：項3.一種用於預防和/或治療受試者脂肪肝及其相關病症的方法，包括給藥受試者預防和/或治療有效量的纖溶酶原，其中所述脂肪肝為內分泌紊亂疾病、糖代謝疾病、肝臟疾病、腎臟疾病、心血管疾病、腸道疾病、甲狀腺疾病、膽囊或膽道疾病、肥胖症、飲酒、藥物治療引發或伴隨的。
項4.項3的方法，其中所述脂肪肝為高血壓、糖尿病、慢性肝炎、腎損傷、慢性腎小球腎炎、慢性腎盂腎炎、腎病症候群、腎功能不全、腎移植、尿毒癥、甲狀腺功能低下、阻塞性膽囊炎、阻塞性膽管炎、雌激素治療引發或伴隨的。
在又一方面，本發明涉及：項5.一種用於預防和/或治療受試者肝臟脂質沉積及其相關病症的方法，包括給藥受試者預防和/或治療有效量的纖溶酶原，所述受試者患有、懷疑患有肝臟脂質沉積及其相關病症或具有患上脂肪肝及其相關病狀的風險。
項6.項5的方法，其中所述肝臟脂質沉積為內分泌紊亂疾病、糖代謝疾病、肝臟疾病、腎臟疾病、心血管疾病、腸道疾病、甲狀腺疾病、膽囊或膽道疾病、肥胖症、飲酒、藥物治療引發或伴隨的。
項7.項6的方法，其中所述肝臟脂質沉積為高血壓、糖尿病、慢性肝炎、腎損傷、慢性腎小球腎炎、慢性腎盂腎炎、腎病症候群、腎功能不全、腎移植、尿毒癥、甲狀腺功能低下、阻塞性膽囊炎、阻塞性膽管炎、藥物治療引發或伴隨的。
在又一方面，本發明涉及：項8.一種消減動脈粥樣硬化受試者肝臟脂質沉積的方法，包括給藥所述受試者有效量的纖溶酶原。
在又一方面，本發明涉及：項9.一種消減糖尿病受試者肝臟脂質沉積的方法，包括給藥所述受試者有效量的纖溶酶原。
在又一方面，本發明涉及：項10.一種消減高脂血症受試者肝臟脂質沉積的方法，包括給藥所述受試者有效量的纖溶酶原。
項11.項10的方法，其中所述高脂血症為選自如下的一項或多項：血清甘油三酯(TG)升高、血清低密度脂蛋白(LDL)升高、極低密度脂蛋白(VLDL)升高。
項12.項10或11的方法，其中所述高脂血症包括高膽固醇血症、高甘油三酯血症、混合型高脂血症和低高密度脂蛋白血症。
項13.根據項1-12任一項的方法，其中所述纖溶酶原可與一種或多種其它藥物或治療方法聯合施用。
項14.項13的方法，其中所述一種或多種其它藥物包括糖尿病治療用藥物、動脈粥樣硬化治療用藥物、腎病症候群治療用藥物、腎 功能不全治療用藥物、尿毒癥治療用藥物、腎移植治療用藥物、脂肪肝治療用藥物、肝硬化治療用藥物、肥胖症治療用藥物。
項15.根據項14的方法，其中所述其它藥物包括：降血脂藥物、抗血小板藥物、降血壓藥物、擴張血管藥物、降血糖藥物、抗凝血藥物、溶血栓藥物，保肝藥物，抗心律失常藥物，強心藥物，利尿藥物，抗感染藥物、抗病毒藥物、免疫調節藥物、炎症調節類藥物、抗腫瘤藥物、激素類藥物、甲狀腺素。
項16.一種用於項1-15任一項的方法的纖溶酶原。
在又一方面，本發明涉及：項17.一種藥物組合物，其包含藥學上可接受的載劑和用於項1-15中任一項所述方法的纖溶酶原。
在又一方面，本發明涉及：項18.一種預防性或治療性試劑盒，其包含：(i)用於項1-15中任一項所述方法的纖溶酶原和(ii)用於遞送所述纖溶酶原至所述受試者的構件(means)。
項19.根據項18所述的試劑盒，其中所述構件為注射器或小瓶。
項20.項18或19的試劑盒，其還包含標籤或使用說明書，該標籤或使用說明書指示所述纖溶酶原被投予至所述受試者以實施項1-15中任一項所述方法。
在又一方面，本發明涉及：項21.一種製品，其包含：包含標籤的容器；和包含(i)用於項1-15中任一項所述方法的纖溶酶原或包含纖溶酶原的藥物組合物，其中所述標籤指示所述纖溶酶原或組合物被投予至 所述受試者以實施項1-15中任一項所述方法。
項22.項20的試劑盒或項21的製品，還包含另外的一個或多個構件或容器，該構件或容器中含有其他藥物。
項23.項22的試劑盒或製品，其中所述其他藥物選自如下一項或多項：糖尿病治療用藥物、動脈粥樣硬化治療用藥物、腎病症候群治療用藥物、腎功能不全治療用藥物、尿毒癥治療用藥物、腎移植治療用藥物、脂肪肝治療用藥物、肝硬化治療用藥物、肥胖症治療用藥物。
項24.項23的試劑盒或製品，其中所述其他藥物選自如下一項或多項：降血脂藥物、抗血小板藥物、降血壓藥物、擴張血管藥物、降血糖藥物、抗凝血藥物、溶血栓藥物，保肝藥物，抗心律失常藥物，強心藥物，利尿藥物，抗感染藥物、抗病毒藥物、免疫調節藥物、炎症調節類藥物、抗腫瘤藥物、激素類藥物、甲狀腺素。
項25.根據項1-15任一項的方法或項16的纖溶酶原、項17的藥物組合物、項19-20、22-24任一項的試劑盒或項21-24任一項的製品，其中所述纖溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性。
項26.根據項1-15任一項的方法或項16的纖溶酶原、項17的藥物組合物、項19-20、22-24任一項的試劑盒或項21-24任一項的製品，其中所述纖溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。
項27.根據項1-15任一項的方法或項16的纖溶酶原、項17的藥物組合物、項19-20、22-24任一項的試劑盒或項21-24任一項的製品，其中所述纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。
項28.根據項1-15任一項的方法或項16的纖溶酶原、項17的藥物組合物、項19-20、22-24任一項的試劑盒或項21-24任一項的製品，其中所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性的變體。
項29.根據項1-15任一項的方法或項16的纖溶酶原、項17的藥物組合物、項19-20、22-24任一項的試劑盒或項21-24任一項的製品，其中所述纖溶酶原為天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。
項30.根據項1-15任一項的方法或項16的纖溶酶原、項17的藥物組合物、項19-20、22-24任一項的試劑盒或項21-24任一項的製品，其中所述纖溶酶原為來自靈長類動物或齧齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。
項31.根據項1-15任一項的方法或項16的纖溶酶原、項17的藥物組合物、項19-20、22-24任一項的試劑盒或項21-24任一項的製品，其中所述纖溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10或12所示。
項32.根據項1-15任一項的方法或項16的纖溶酶原、項17的藥物組合物、項19-20、22-24任一項的試劑盒或項21-24任一項的製品，其中所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原。
項33.根據項1-15任一項的方法或項16的纖溶酶原、項17的藥物組合物、項19-20、22-24任一項的試劑盒或項21-24任一項的製品，其中所述受試者是人。
項34.根據項1-15任一項的方法或項16的纖溶酶原、項17的藥物組合物、項19-20、22-24任一項的試劑盒或項21-24任一項的製品，其中所述受試者缺乏或缺失纖溶酶原。
項35.根據項34的方法、纖溶酶原、藥物組合物、試劑盒或製品，所述缺乏或缺失是先天的、繼發的和/或局部的。
本發明還涉及纖溶酶原用於實施項1-15任一項的方法的用途。
本發明還涉及纖溶酶原在製備用於項1-15任一項的方法的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒中的用途。
本發明還涉及預防和/或治療受試者脂肪代謝紊亂及其相關病症。
一方面，本發明涉及預防和/或治療受試者脂肪代謝紊亂及其相關病症的方法，包括給藥受試者預防和/或治療有效量的纖溶酶原，其中所述受試者易患脂肪代謝紊亂、患有脂肪代謝紊亂或罹患其它疾病並伴有脂肪代謝紊亂。本發明還涉及纖溶酶原用於預防和/或治療受試者脂肪代謝紊亂及其相關病症的用途。本發明還涉及纖溶酶原在製備用於預防和/或治療受試者脂肪代謝紊亂及其相關病症的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒中的用途。進一步地，本發明還涉及用於預防和/或治療受試者脂肪代謝紊亂及其相關病症的纖溶酶原。本發明還涉及用於預防和/或治療受試者脂 肪代謝紊亂及其相關病症的包含纖溶酶原的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒。
在一些實施方案中，所述脂肪代謝紊亂為內分泌紊亂疾病、糖代謝疾病、肝臟疾病、腎臟疾病、心血管疾病、腸道疾病、甲狀腺疾病、膽囊或膽道疾病、肥胖症、飲酒、藥物治療引發或伴隨的脂肪代謝紊亂。在一些實施方案中，所述脂肪代謝紊亂為高血壓、糖尿病、慢性肝炎、肝硬化、腎損傷、慢性腎小球腎炎、慢性腎盂腎炎、腎病症候群、腎功能不全、腎移植、尿毒癥、甲狀腺功能低下、阻塞性膽囊炎、阻塞性膽管炎、藥物或激素治療引發或伴隨的脂肪代謝紊亂。在一些實施方案中，所述脂肪代謝紊亂為高脂血症、高脂蛋白血症、脂肪肝、動脈粥樣硬化、肥胖症、臟器脂肪沉積。在又一些實施方案中，所述動脈粥樣硬化包括包括主動脈粥樣硬化、冠狀動脈粥樣硬化、腦動脈粥樣硬化、腎動脈粥樣硬化、肝動脈粥樣硬化、腸系膜動脈粥樣硬化、下肢動脈粥樣硬化。
在又一個方面，本發明涉及預防和/或消減受試者脂肪在身體組織器官異常沉積的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於預防和/或消減受試者脂肪在身體組織器官異常沉積的用途。本發明還涉及纖溶酶原在製備用於預防和/或消減受試者脂肪在身體組織器官異常沉積的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒中的用途。進一步地，本發明還涉及用於預防和/或消減受試者脂肪在身體組織器官異常沉積的纖溶酶原。本發明還涉及用於預防和/或消減受試者脂肪在身體組織器官異常沉積的包含纖溶酶原的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒。
在又一個方面，本發明涉及預防和/或治療受試者脂肪在身 體組織器官異常沉積導致的病症的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於預防和/或治療受試者脂肪在身體組織器官異常沉積導致的病症的用途。本發明還涉及纖溶酶原在製備用於預防和/或治療受試者脂肪在身體組織器官異常沉積導致的病症的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒中的用途。進一步地，本發明還涉及用於預防和/或治療受試者脂肪在身體組織器官異常沉積導致的病症的包含纖溶酶原的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒。
在一些實施方案中，所述脂肪在身體組織器官異常沉積是指脂肪在血液，皮下組織、血管壁、內臟器官的異常沉積。在一些實施方案中，所述脂肪在身體組織器官異常沉積導致的病症包括肥胖症，高脂血症、高脂蛋白血症、脂肪肝、動脈粥樣硬化、脂質性心臟損害、脂質性腎損害，脂質性胰島損害。
在又一個方面，本發明涉及預防和/或治療受試者脂肪代謝紊亂所致病症的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於預防和/或治療受試者脂肪代謝紊亂所致病症的用途。本發明還涉及纖溶酶原在製備用於預防和/或治療受試者脂肪代謝紊亂所致病症的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒中的用途。進一步地，本發明還涉及用於預防和/或治療受試者脂肪代謝紊亂所致病症的纖溶酶原。本發明還涉及用於預防和/或治療受試者脂肪代謝紊亂所致病症的包含纖溶酶原的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒。在一些實施方案中，所述病症包括肥胖症，高脂血症、高脂蛋白血症、脂肪肝、動脈粥樣硬化、脂質性心臟組織損傷，脂質性腎損傷。
在又一個方面，本發明涉及通過減少脂肪異常沉積治療受試者疾病的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於通過減少脂肪異常沉積治療受試者疾病的用途。本發明還涉及纖溶酶原在製備用於通過減少脂肪異常沉積治療受試者疾病的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒中的用途。進一步地，本發明還涉及用於通過減少脂肪異常沉積治療受試者疾病的纖溶酶原。本發明還涉及通過減少脂肪異常沉積治療受試者疾病的包含纖溶酶原的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒。
在一些實施方案中，所述疾病包括動脈粥樣硬化、冠心病、心絞痛、心肌梗死、心律失常、脂肪肝、肝硬化，腦缺血、腦梗死、腎功能不全、腎病症候群、腎功能不全、肥胖症。
在又一個方面，本發明涉及預防和/或治療受試者組織器官脂質性損傷的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於預防和/或治療受試者組織器官脂質性損傷的用途。本發明還涉及纖溶酶原在製備用於預防和/或治療受試者組織器官脂質性損傷的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒中的用途。進一步地，本發明還涉及用於預防和/或治療受試者組織器官脂質性損傷的纖溶酶原。本發明還涉及用於預防和/或治療受試者組織器官脂質性損傷的包含纖溶酶原的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒。
在一些實施方案中，所述組織器官包括動脈管壁、心臟、肝臟、腎臟、胰腺。
在又一個方面，本發明涉及改善受試者高脂血症的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於改善受試者 高脂血症的用途。本發明還涉及纖溶酶原在製備用於改善受試者高脂血症的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒中的用途。進一步地，本發明還涉及用於改善受試者高脂血症的纖溶酶原。本發明還涉及用於改善受試者高脂血症的包含纖溶酶原的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒。
在一些實施方案中，所述高脂血症選自如下的一項或多項：高膽固醇血症、高甘油三酯血症、混合型高脂血症和低高密度脂蛋白血症。
在又一個方面，本發明涉及降低受試者動脈粥樣硬化風險的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於降低受試者動脈粥樣硬化風險的用途。本發明還涉及纖溶酶原在製備用於降低受試者動脈粥樣硬化風險的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒中的用途。進一步地，本發明還涉及用於降低受試者動脈粥樣硬化風險的纖溶酶原。本發明還涉及用於降低受試者動脈粥樣硬化風險的包含纖溶酶原的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒。
在一些實施方案中，所述受試者患有高血壓、肥胖症、糖尿病、慢性肝炎、肝硬化、腎損傷、慢性腎小球腎炎、慢性腎盂腎炎、腎病症候群、腎功能不全、腎移植、尿毒癥、甲狀腺功能低下、阻塞性膽囊炎或阻塞性膽管炎，或所述受試者服用影響脂肪代謝的藥物或激素。在一些實施方案中，所述纖溶酶原通過選自如下的一項或多項降低受試者動脈粥樣硬化風險：降低血中總膽固醇水準、甘油三酯水準、低密度脂蛋白水準、提高血中高密度脂蛋白水準。
在又一個方面，本發明涉及通過改善受試者高脂血症治療疾病的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用 於通過改善受試者高脂血症治療疾病的用途。本發明還涉及纖溶酶原在製備用於通過改善受試者高脂血症治療疾病的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒中的用途。進一步地，本發明還涉及用於通過改善受試者高脂血症治療疾病的纖溶酶原。本發明還涉及用於通過改善受試者高脂血症治療疾病的包含纖溶酶原的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒。
在一些實施方案中，所述病症包括糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病、心絞痛、心肌梗死、心律失常、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化，腦供血不足、腦缺血、腦梗死、慢性腎炎、慢性腎盂腎炎、腎功能不全、腎病症候群、尿毒癥、肥胖症。
在又一個方面，本發明涉及預防和/或治療受試者高血脂相關病症的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。本發明還涉及纖溶酶原用於預防和/或治療受試者高血脂相關病症的用途。本發明還涉及纖溶酶原在製備用於預防和/或治療受試者高血脂相關病症的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒中的用途。進一步地，本發明還涉及用於預防和/或治療受試者高血脂相關病症的纖溶酶原。本發明還涉及用於預防和/或治療受試者高血脂相關病症的包含纖溶酶原的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒。在一些實施方案中，所述病症包括糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病、心絞痛、心肌梗死、心律失常、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化，腦供血不足、腦缺血、腦梗死、慢性腎炎、慢性腎盂腎炎、腎功能不全、腎病症候群、尿毒癥、肥胖症。
在本發明的上述任一實施方案中，所述纖溶酶原可與一種或多種其它藥物或治療方法聯合施用。在一些實施方案中，所述一種或多種 其它藥物包括高血壓治療藥物、糖尿病治療用藥物、動脈粥樣硬化治療用藥物、慢性腎小球腎炎治療藥物、慢性腎盂腎炎治療藥物、腎病症候群治療用藥物、腎功能不全治療用藥物、尿毒癥治療用藥物、腎移植治療用藥物、脂肪肝治療用藥物、肝硬化治療用藥物、肥胖症治療用藥物。在一些實施方案中，所述其它藥物包括：降血脂藥物、抗血小板藥物、降血壓藥物、擴張血管藥物、降血糖藥物、抗凝血藥物、溶血栓藥物，保肝藥物，抗心律失常藥物，強心藥物，利尿藥物，抗感染藥物、抗病毒藥物、免疫調節藥物、炎症調節類藥物、抗腫瘤藥物、激素類藥物、甲狀腺素。在一些進一步的實施方案中，所述藥物包括降血脂藥物：他汀類；貝特類；煙酸；消膽胺；安妥明；不飽和脂肪酸如益壽甯、血脂平及心脈樂；藻酸雙酯鈉；抗血小板藥物：阿司匹林；潘生丁；氯吡格雷；西洛他；擴張血管藥物：肼苯噠嗪；硝酸甘油和消心痛；硝普鈉；α硝受體阻斷劑如呱唑嗪；α受體阻斷劑如酚妥拉明；β拉受體興奮劑如舒喘靈；卡托普利、依那普利；心痛定、硫氮卓酮；柳丁氨酸、長壓定、前列腺素、心鈉素；溶血栓藥物：尿激酶和鏈激酶；組織型纖溶酶原啟動劑；單鏈尿激酶型纖溶酶原啟動劑；TNK-組織型纖溶酶原啟動劑；抗凝血藥物：肝素；依諾肝素；那曲肝素；比伐盧定。
在本發明的上述任一實施方案中，所述纖溶酶原可與序列2、6、8、10或12具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、 1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。
在一些實施方案中，所述纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。在一些實施方案中，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性的變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原為天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原為來自靈長類動物或齧齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10或12所示。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原。
在一些實施方案中，所述受試者是人。在一些實施方案中，所述受試者缺乏或缺失纖溶酶原。在一些實施方案中，所述缺乏或缺失是先天的、繼發的和/或局部的。
在一些實施方案中，所述藥物組合物包含藥學上可接受的載劑和用於前述方法的纖溶酶原。在一些實施方案中，所述試劑盒可以是預防性或治療性試劑盒，其包含：(i)用於前述方法的纖溶酶原和(ii)用於遞送所述纖溶酶原至所述受試者的構件(means)。在一些實施方案中，所述構件為注射器或小瓶。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含標籤或使用說明書，該標籤或使用說明書指示將所述纖溶酶原投予所述受試者以實施前述任一方法。
在一些實施方案中，所述製品包含：含有標籤的容器；和包 含(i)用於前述方法的纖溶酶原或包含纖溶酶原的藥物組合物，其中所述標籤指示將所述纖溶酶原或組合物投予所述受試者以實施前述任一方法。
在一些實施方案中，所述試劑盒或製品還包含另外的一個或多個構件或容器，該構件或容器中含有其他藥物。在一些實施方案中，所述其他藥物選自下組：降血脂藥物、抗血小板藥物、降血壓藥物、擴張血管藥物、降血糖藥物、抗凝血藥物、溶血栓藥物，保肝藥物，抗心律失常藥物，強心藥物，利尿藥物，抗感染藥物、抗病毒藥物、免疫調節藥物、炎症調節類藥物、抗腫瘤藥物、激素類藥物、甲狀腺素。
在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原可通過全身或局部給藥，優選通過以下途徑施用：靜脈內、肌內、皮下給予纖溶酶原來進行治療。在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤體重計算)或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800mg/cm2、0.01-600mg/cm2、0.1-400mg/cm2、1-200mg/cm2、1-100mg/cm2、10-100mg/cm2(以每平方釐米體表面積計算)的劑量施用，優選至少重複一次，優選至少每天施用。
本發明明確涵蓋了屬於本發明實施方案之間的技術特徵的所有組合，並且這些組合後的技術方案在本申請中已經明確公開，就像上述技術方案已經單獨且明確公開一樣。另外，本發明還明確涵蓋各個實施方案及其要素的之間的組合，該組合後的技術方案在本文中明確公開。
定義
本發明所述的“脂肪代謝紊亂”又稱“脂肪代謝異常”、“脂肪代謝障礙”，為脂肪代謝發生異常、紊亂或障礙所引發的臨床或病理表現的總稱。在本文中，“脂肪代謝紊亂”、“脂肪代謝異常”、“脂肪代謝障礙”可互換使用。本發明中“脂肪代謝”、“脂代謝”、“脂質代謝”可互換使用。
“脂肪代謝紊亂相關病症”是與脂肪代謝紊亂相關的病症的總稱。所述的相關，可以是病因相關、發病機理相關、病理表現相關、臨床症狀相關和/或治療原則相關。
“血脂”是甘油三酯、膽固酶和磷脂等的總稱，脂蛋白是由載脂蛋白和血脂組成的球型大分子複合體，由於脂蛋白包含膽固醇、甘油三酯的成分不同及密度大小不同被分為5大類：乳糜微粒(CM)極低密度脂蛋白(VLDL)中密度脂蛋白(IDL)低密度脂蛋白(LDL)高密度脂蛋白(HDL)。依據血脂危險水準，臨床最常見的異常脂蛋白血症類型：高膽固醇血症、高甘油三酯血症、混合型高脂血症和低高密度脂蛋白血症。繼發性血脂異常見於糖尿病、甲狀腺功能低下、腎病綜合症、腎移植、嚴重肝病、阻塞性膽道疾病、肥胖症、飲酒、藥物治療，例如雌激素治療等，如能排除繼發性血脂異常可考慮原發性血脂異常。
“高血脂”是指血漿中的膽固醇、甘油三脂、磷脂和未脂化的脂酸等血脂成分增高的病理狀況。
“高血脂相關病症”是指病因、發病機理、病理表現、臨床症狀和/或治療原則與高血脂相關的病症。優選所述病症包括但不限於糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病、心絞痛、心肌梗死、心律失常、慢 性肝炎、脂肪肝、肝硬化，腦供血不足、腦缺血、腦梗死、慢性腎炎、慢性腎盂腎炎、腎功能不全、腎病症候群、尿毒癥、肥胖症。
由於脂肪代謝或運轉異常使血漿中一種或幾種脂質異常稱為“高脂血症”、“高血脂症”或“血脂異常”(dyslipidemia)。
由於脂質不溶或微溶於水，必須與蛋白質結合成脂蛋白才能在血液迴圈中運轉，因此高脂血症常為“高脂蛋白血症”的反映。
本發明的“高血脂相關病症”也可稱為“高脂血症相關病症”、“高脂蛋白血症相關病症”。
“脂肪肝”是指由於各種原因引起的肝細胞內脂肪堆積過多的病變，其可以是一個獨立的疾病也可以由其它原因所致，例如肥胖性脂肪肝、酒精性脂肪肝、快速減肥性脂肪肝、營養不良性脂肪肝、糖尿病脂肪肝、藥物性脂肪肝等。
在脂肪肝情況下，肝細胞中脂滴增多，使肝細胞脂肪變性、腫大，細胞核被擠壓偏離中心。脂肪的代謝工要在線粒體中進行，脂肪向細胞外運輸主要通過光面內質網，脂肪在肝細胞內的堆積進一步加重線粒體和內質網的負擔降低其功能，進而影響其他營養素、激素、維生素的代謝。長期的肝細胞變性會導致肝細胞的再生障礙和壞死，進而形成肝纖維化、肝硬化。
“動脈粥樣硬化”是一種慢性的、漸進性動脈疾病，發病時動脈中沉積的脂肪部分或全部堵塞血流。當原本光滑、堅實的動脈內膜變粗糙、增厚，並被脂肪、纖維蛋白、鈣和細胞碎屑堵塞時，便出現動脈粥樣硬化。動脈粥樣硬化是個漸進的過程。當血液中的脂類濃度大大增加時， 便會沿著動脈壁形成脂肪條紋。這些條紋會導致脂肪和膽固醇沉積，這些沉澱依附在原本平滑的動脈內膜上，從而形成小結。這些小結下面繼而長出纖維化的瘢痕組織，導致鈣沉積。沉積的鈣逐漸演變為無法除去的白堊狀堅硬薄膜(稱為動脈粥樣斑)。動脈內部的這層永久薄膜會阻礙動脈的正常擴張和收縮，從而減緩了動脈內的血流速度，從而很容易形成血塊，妨礙或阻止血液流經動脈。
人們尚未確定動脈粥樣硬化的確切原因，但是人們已經發現了重要的致病因素：高脂血症、高血壓、有吸煙史、有動脈粥樣硬化家族史(60歲以前患上該病)或糖尿病。高脂血症能促進脂肪條紋的形成。因高血壓對動脈施加一定的恒力，加速了動脈阻塞和硬化過程，因此能增加動脈粥樣硬化的患病率。抽煙可以引致動脈收縮，限制血液流動，因而為動脈阻塞創造了條件。糖尿病也能促使動脈粥樣硬化的發生，特別是對於很小的動脈。
僅就動脈粥樣硬化症而言，人們感覺不到任何症狀。僅當與體內的某個重要器官相連的動脈被堵塞後，才會發現此病。因該器官中的動脈受阻而引起的症狀較為明顯。例如，如果心臟供血動脈部分受阻，人們就可能感到心絞痛；但是如果完全被阻塞，就可能導致心臟病(由受阻動脈供血的心臟組織死亡)。如果動脈粥樣硬化影響到腦部動脈，人們會感覺眩暈、視線模糊和暈厥，甚至可能導致中風(由受阻動脈供血的腦組織死亡，從而引起神經損傷，如受死亡腦組織控制的肢體出現癱瘓)。通向腎部的動脈受阻還可能導致腎衰竭。通向眼部的血管受阻可能導致失明。四肢動脈阻塞可能導致各肢體的病變。
動脈粥樣硬化是冠心病、腦梗死、外周血管病的主要原因。脂質代謝障礙為動脈粥樣硬化的病變基礎，其特點是受累動脈病變從內膜開始，一般先有脂質和複合糖類積聚、出血及血栓形成，進而纖維組織增生及鈣質沉著，並有動脈中層的逐漸蛻變和鈣化，導致動脈壁增厚變硬、血管腔狹窄。病變常累及大中肌性動脈，一旦發展到足以阻塞動脈腔，則該動脈所供應的組織或器官將缺血或壞死。
動脈粥樣硬化是一種全身性疾病，一個器官血管發生動脈粥樣硬化病變，意味著其他地方的血管也可能已經存在同樣的病變；同樣，一個器官發生血管事件，意味著其他地方發生血管事件的危險性增加。
圖1 24-25周糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後肝臟油紅O染色圖片。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠肝臟的脂質沉積面積要顯著小於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能減少脂肪在糖尿病小鼠肝臟中的沉積。
圖2 ApoE動脈粥樣硬化模型小鼠給予纖溶酶原30天後肝臟油紅O染色代表性圖片。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠肝臟脂肪沉積明顯少於給溶媒PBS對照組，且定量分析統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能減少脂肪在動脈粥樣硬化模型小鼠肝臟中的沉積。
圖3 16周高脂血症模型小鼠給予纖溶酶原30天後肝臟油紅O染色觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠肝臟脂肪沉積明顯少於給溶媒PBS對照 組，且定量分析統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能改善脂肪在高脂血症模型小鼠肝臟中的沉積。
圖4 16周高脂血症模型小鼠給予纖溶酶原30天後主動脈竇油紅O染色觀察結果。A、C為給溶媒PBS對照組，B、D為給纖溶酶原組，E為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠主動脈竇脂肪沉積明顯少於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能改善脂肪在高脂血症模型小鼠主動脈竇中的沉積。
圖5 16周高脂血症模型小鼠給予纖溶酶原30天後主動脈竇HE染色代表性圖片。A、C為給溶媒PBS對照組，B、D為給纖溶酶原組。結果顯示，給溶媒PBS對照組主動脈管壁可見泡沫細胞沉積(箭頭所指)，斑塊沉積嚴重；給纖溶酶原組主動脈管壁僅可見輕度的泡沫細胞沉積，且內膜下未見明顯的粥樣斑塊沉積，給纖溶酶原組主動脈損傷較輕。說明纖溶酶原能改善高脂血症模型小鼠主動脈竇內壁由於脂質沉積所導致的損傷。
圖6 16周高脂血症模型小鼠給予纖溶酶原30天後心臟纖維蛋白免疫組化染色圖片。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠心臟纖維蛋白的陽性表達明顯少於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能減少高血脂所致的心臟損傷。
圖7 16周高脂血症模型小鼠給予纖溶酶原30天後心臟IgM免疫染色代表性圖片。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠心臟IgM的陽性表達明顯少於給溶媒PBS對照組，說明纖溶酶原能減輕高血脂所致心臟損傷。
圖8 16周高脂血症模型小鼠給予纖溶酶原30天後心臟天狼星紅染色代表性圖片。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組膠原的沉積明顯少於給溶媒PBS對照組，說明纖溶酶原能減輕高脂血症模型小鼠心臟纖維化。
圖9 16周高脂血症模型小鼠給予纖溶酶原30天後血清肌鈣蛋白檢測結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組血清心肌肌鈣蛋白濃度明顯高於給纖溶酶原組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能顯著修復高血脂心臟的損傷。
圖10 3%膽固醇高脂血症模型小鼠給予纖溶酶原10天和20天後血清高密度脂蛋白膽固醇檢測結果。結果顯示，給予纖溶酶原後給纖溶酶原組小鼠血清HDL-C濃度明顯高於給溶媒PBS對照組，且二者在給藥10天和20天後高密度脂蛋白濃度均統計差異極顯著(**表示P<0.01)。說明纖溶酶原能有效提高高脂血症模型小鼠血清中高密度脂蛋白膽固醇的含量，改善高脂血症模型小鼠血脂紊亂。
圖11 3%膽固醇高脂血症模型小鼠給予纖溶酶原20天後血清總膽固醇檢測結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠總膽固酶濃度明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能降低高脂血症模型小鼠血清中總膽固醇的含量，具有降低血脂的功能。
圖12 3%膽固醇高脂血症模型小鼠給予纖溶酶原20天後血清低密度脂蛋白膽固醇檢測結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠LDL-C濃度明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能降低高脂血症模型小鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇的含量，具有改善高 血脂的功能。
圖13 3%膽固醇高脂血症模型小鼠給予纖溶酶原20天後血清動脈粥樣硬化指數檢測結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠動脈粥樣硬化指數明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異極顯著(**表示P<0.01)。說明纖溶酶原能有效降低高脂血症模型小鼠發生動脈粥樣硬化的風險。
圖14 3%膽固醇高脂血症模型小鼠給予纖溶酶原20天後血清心臟風險險指數結果。結果顯示，給纖溶酶原組CRI明顯小於給溶媒PBS對照組，且統計差異極其顯著(**表示P<0.01)。說明纖溶酶原能有效的降低高脂血症模型小鼠發生心臟疾病的風險。
圖15 24-25周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天後主動脈HE染色圖片。A、C為給溶媒PBS對照組，B、D為給纖溶酶原組。結果顯示，給溶媒PBS對照組血管管壁有泡沫細胞沉積(箭頭標識)，中層彈性膜排列紊亂，血管壁增厚，管壁凸凹不均；給纖溶酶原組中層彈性膜結構規則，呈波浪形，血管管壁厚度均勻。表明注射纖溶酶原對糖尿病所致的主動脈損傷具有一定的修復作用。
圖16 26周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後心室油紅O染色代表性圖片。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠心室脂質沉積(箭頭標識)明顯少於給溶媒PBS對照組。說明纖溶酶原能減少糖尿病小鼠心室脂質沉積，促進心室損傷的修復。
圖17 26周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後血清中高密度脂蛋白膽固酶的含量檢測結果。結果顯示，在對糖尿病小鼠連續注射人源纖溶酶源35天後，給纖溶酶原組小鼠血清中HDL-C的含量高於給溶媒PBS對 照組，且統計差異顯著。說明注射纖溶酶原能促進血清高密度脂蛋白膽固醇的含量升高，改善糖尿病小鼠血脂紊亂。
圖18 24-25周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天後血清中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的含量檢測結果。結果顯示，糖尿病模型小鼠連續注射人源纖溶酶源31天後，給纖溶酶原組小鼠血清中的LDL-C含量低於給溶媒PBS對照組，統計差異接近顯著(P=0.1)。說明纖溶酶原能降低糖尿病小鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇的含量。
圖19 ApoE動脈粥樣硬化模型小鼠給予纖溶酶原30天後血清總膽固醇檢測結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠總膽固醇濃度明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能降低ApoE動脈粥樣硬化模型小鼠血清中總膽固醇的含量，改善動脈粥樣硬化模型小鼠血脂紊亂。
圖20 ApoE動脈粥樣硬化模型小鼠給予纖溶酶原30天後血清甘油三酯檢測結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠甘油三酯濃度明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能夠降低ApoE動脈粥樣硬化模型小鼠血清中甘油三酯的含量，改善動脈粥樣硬化模型小鼠血脂紊亂。
圖21 ApoE動脈粥樣硬化模型小鼠給予纖溶酶原30天後血清低密度脂蛋白膽固醇檢測結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠LDL-C濃度明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能降低ApoE動脈粥樣硬化模型小鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇的含量，改善動脈粥樣硬化模型小鼠血脂紊亂。
圖22 ApoE動脈粥樣硬化模型小鼠給予纖溶酶原30天後主動脈竇油紅O染色代表性圖片。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠主動脈竇脂肪沉積明顯少於給溶媒PBS對照組。說明纖溶酶原能改善脂肪在動脈粥樣硬化模型小鼠主動脈竇中的沉積。
圖23 16周齡高脂血症模型小鼠給予纖溶酶原30天後主動脈竇天狼星紅染色代表性圖片。A、C為給溶媒PBS對照組，B、D為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組主動脈竇血管內壁膠原蛋白沉積(箭頭標識)的面積明顯小於給溶媒PBS對照組，說明纖溶酶原能消減高脂血症模型小鼠主動脈竇纖維化水準。
圖24 ApoE動脈粥樣硬化模型小鼠給予纖溶酶原30天後心臟係數統計結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠心臟臟器係數明顯低於給溶媒PBS對照組。說明纖溶酶原能改善ApoE動脈粥樣硬化模型小鼠心臟損傷所致的心臟代償性肥大。
圖25 給予纖溶酶原30天後3%膽固醇高脂血症模型小鼠腎臟天狼星紅染色觀察結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組腎臟膠原蛋白沉積(箭頭標識)明顯少於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著；給纖溶酶原組纖維化基本恢復到正常水準。說明纖溶酶原能有效減少3%膽固醇高脂血症模型小鼠腎臟纖維化。
圖26 給予纖溶酶原30天後3%膽固醇高脂血症模型小鼠腎臟油紅O觀察結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠腎臟脂肪沉積(箭 頭標識)明顯少於給溶媒PBS對照組，且定量分析統計差異顯著；此外，給纖溶酶原組脂質沉積水準與空白對照組小鼠相似。說明纖溶酶原能消減脂肪在高脂血症模型小鼠腎臟中的沉積，從而減少脂肪沉積所致的腎臟損傷。
發明詳述
纖溶酶是纖溶酶原啟動系統(PA系統)的關鍵組分。它是一種廣譜的蛋白酶，能夠水解細胞外基質(ECM)的幾個組分，包括纖維蛋白、明膠、纖連蛋白、層粘連蛋白和蛋白聚糖[9]。此外，纖溶酶能將一些金屬蛋白酶前體(pro-MMPs)啟動形成具有活性的金屬蛋白酶(MMPs)。因此纖溶酶被認為是胞外蛋白水解作用的一個重要的上游調節物[10,11]。纖溶酶是由纖溶酶原通過兩種生理性的PAs：組織型纖溶酶原啟動劑(tPA)或尿激酶型纖溶酶原啟動劑(uPA)蛋白水解形成的。由於纖溶酶原在血漿和其他體液中相對水準較高，傳統上認為PA系統的調節主要通過PAs的合成和活性水準實現。PA系統組分的合成受不同因素嚴格調節，如激素、生長因數和細胞因數。此外，還存在纖溶酶和PAs的特定生理抑制劑。纖溶酶的主要抑制劑是α 2-抗纖溶酶(α 2-antiplasmin)。PAs的活性同時被uPA和tPA的纖溶酶原啟動劑抑制劑-1(PAI-1)抑制以及主要抑制uPA的溶酶原啟動劑抑制劑-2(PAI-2)調節。某些細胞表面具有直接水解活性的uPA特異性細胞表面受體(uPAR)[12,13]。
纖溶酶原是一個單鏈糖蛋白，由791個氨基酸組成，分子量約為92kDa[14,15]。纖溶酶原主要在肝臟合成，大量存在於胞外液中。血漿中纖溶酶原含量約為2μM。因此纖溶酶原是組織和體液中蛋白質水解活性的 一個巨大的潛在來源[16,17]。纖溶酶原存在兩種分子形式：谷氨酸-纖溶酶原(Glu-plasminogen)和賴氨酸-纖溶酶原(Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纖溶酶原具有一個氨基末端(N-末端)谷氨酸，因此被稱為谷氨酸-纖溶酶原。然而，在纖溶酶存在時，谷氨酸-纖溶酶原在Lys76-Lys77處水解成為賴氨酸-纖溶酶原。與谷氨酸-纖溶酶原相比，賴氨酸-纖溶酶原與纖維蛋白具有更高的親和力，並可以更高的速率被PAs啟動。這兩種形式的纖溶酶原的Arg560-Val561肽鍵可被uPA或tPA切割，導致二硫鍵連接的雙鏈蛋白酶纖溶酶的形成[18]。纖溶酶原的氨基末端部分包含五個同源三環，即所謂的kringles，羧基末端部分包含蛋白酶結構域。一些kringles含有介導纖溶酶原與纖維蛋白及其抑制劑α 2-AP特異性相互作用的賴氨酸結合位點。最新發現一個纖溶酶原為38kDa的片段，其中包括kringles1-4，是血管生成的有效抑制劑。這個片段被命名為血管抑素，可通過幾個蛋白酶水解纖溶酶原產生。
纖溶酶的主要底物是纖維蛋白，纖維蛋白的溶解是預防病理性血栓形成的關鍵[19]。纖溶酶還具有對ECM幾個組分的底物特異性，包括層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖和明膠，表明纖溶酶在ECM重建中也起著重要作用[15,20,21]。間接地，纖溶酶還可以通過轉化某些蛋白酶前體為活性蛋白酶來降解ECM的其他組分，包括MMP-1，MMP-2，MMP-3和MMP-9。因此，有人提出，纖溶酶可能是細胞外蛋白水解的一個重要的上游調節器[22]。此外，纖溶酶具有啟動某些潛在形式的生長因數的能力[23-25]。在體外，纖溶酶還能水解補體系統的組分並釋放趨化補體片段。
“纖溶酶”是存在於血液中的一種非常重要的酶，能將纖維 蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體。
“纖溶酶原”是纖溶酶的酶原形式，根據swiss prot中的序列，按含有信號肽的天然人源纖溶酶原氨基酸序列(序列4)計算由810個氨基酸組成，分子量約為90kD，主要在肝臟中合成並能夠在血液中迴圈的糖蛋白，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全長的纖溶酶原包含七個結構域：位於C末端的絲氨酸蛋白酶結構域、N末端的Pan Apple(PAp)結構域以及5個Kringle結構域(Kringle1-5)。參照swiss prot中的序列，其信號肽包括殘基Met1-Gly19，PAp包括殘基Glu20-Val98，Kringle1包括殘基Cys103-Cys181，Kringle2包括殘基Glu184-Cys262，Kringle3包括殘基Cys275-Cys352，Kringle4包括殘基Cys377-Cys454，Kringle5包括殘基Cys481-Cys560。根據NCBI資料，絲氨酸蛋白酶域包括殘基Val581-Arg804。
Glu-纖溶酶原是天然全長的纖溶酶原，由791個氨基酸組成(不含有19個氨基酸的信號肽)，編碼該序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。在體內，還存在一種是從Glu-纖溶酶原的第76-77位氨基酸處水解從而形成的Lys-纖溶酶原，如序列6所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。Delta-纖溶酶原(δ-plasminogen)是全長纖溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5結構的片段，僅含有Kringle1和絲氨酸蛋白酶域[26,27]，有文獻報導了delta-纖溶酶原的氨基酸序列(序列8)[27]，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列7。小纖溶酶原(Mini-plasminogen)由Kringle5和絲氨酸蛋白酶域組成，有文獻報導其包括殘基Val443-Asn791(以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始氨基酸)[28]，其氨基酸序列如序列10所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纖溶酶原 (Micro-plasminogen)僅含有絲氨酸蛋白酶結構域，有文獻報導其氨基酸序列包括殘基Ala543-Asn791(以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始氨基酸)[29]，也有專利文獻CN102154253A報導其序列包括殘基Lys531-Asn791(以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始氨基酸)，本專利序列參考專利文獻CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。
本發明的“纖溶酶”與“纖維蛋白溶酶”、“纖維蛋白溶解酶”可互換使用，含義相同；“纖溶酶原”與“纖溶酶原”、“纖維蛋白溶解酶原”可互換使用，含義相同。
在本申請中，所述纖溶酶原“缺乏”的含義為受試者體內纖溶酶原的含量比正常人低，低至足以影響所述受試者的正常生理功能；所述纖溶酶原“缺失”的含義為受試者體內纖溶酶原的含量顯著低於正常人，甚至表達極微，只有通過外源提供才能維持生命。
本領域技術人員可以理解，本發明纖溶酶原的所有技術方案適用於纖溶酶，因此，本發明描述的技術方案涵蓋了纖溶酶原和纖溶酶。
在迴圈過程中，纖溶酶原採用封閉的非活性構象，但當結合至血栓或細胞表面時，在纖溶酶原啟動劑(plasminogen activator，PA)的介導下，其轉變為呈開放性構象的活性纖溶酶。具有活性的纖溶酶可進一步將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體，進而溶解血栓。其中纖溶酶原的PAp結構域包含維持纖溶酶原處於非活性封閉構象的重要決定簇，而KR結構域則能夠與存在於受體和底物上的賴氨酸殘基結合。已知多種能夠作為纖溶酶原啟動劑的酶，包括：組織纖溶酶原啟動劑(tPA)、尿激 酶纖溶酶原啟動劑(uPA)、激肽釋放酶和凝血因數XII(哈格曼因數)等。
“纖溶酶原活性片段”是指在纖溶酶原蛋白中，能夠與底物中的靶序列結合並發揮蛋白水解功能的活性片段。本發明涉及纖溶酶原的技術方案涵蓋了用纖溶酶原活性片段代替纖溶酶原的技術方案。本發明所述的纖溶酶原活性片段為包含纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶域的蛋白質，優選，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含序列14、與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的氨基酸序列的蛋白質。因此，本發明所述的纖溶酶原包括含有該纖溶酶原活性片段、並且仍然保持該纖溶酶原活性的蛋白。
目前，對於血液中纖溶酶原及其活性測定方法包括：對組織纖溶酶原啟動劑活性的檢測(t-PAA)、血漿組織纖溶酶原啟動劑抗原的檢測(t-PAAg)、對血漿組織纖溶酶原活性的檢測(plgA)、血漿組織纖溶酶原抗原的檢測(plgAg)、血漿組織纖溶酶原啟動劑抑制物活性的檢測、血漿組織纖溶酶原啟動劑抑制物抗原的檢測、血漿纖維蛋白溶酶-抗纖維蛋白溶酶複合物檢測(PAP)。其中最常用的檢測方法為發色底物法：向受檢血漿中加鏈激酶(SK)和發色底物，受檢血漿中的PLG在SK的作用下，轉變成PLM，後者作用於發色底物，隨後用分光光度計測定，吸光度增加與纖溶酶原活性成正比。此外也可採用免疫化學法、凝膠電泳、免疫比濁法、放射免疫擴散法等對血液中的纖溶酶原活性進行測定。
“直系同源物或直系同系物(ortholog)”指不同物種之間的同源物，既包括蛋白同源物也包括DNA同源物，也稱為直向同源物、垂直同源物。其具體指不同物種中由同一祖先基因進化而來的蛋白或基因。 本發明的纖溶酶原包括人的天然纖溶酶原，還包括來源於不同物種的、具有纖溶酶原活性的纖溶酶原直系同源物或直系同系物。
“保守取代變體”是指其中一個給定的氨基酸殘基改變但不改變蛋白質或酶的整體構象和功能，這包括但不限於以相似特性(如酸性，鹼性，疏水性，等)的氨基酸取代親本蛋白質中氨基酸序列中的氨基酸。具有類似性質的氨基酸是眾所周知的。例如，精氨酸、組氨酸和賴氨酸是親水性的鹼性氨基酸並可以互換。同樣，異亮氨酸是疏水氨基酸，則可被亮氨酸，蛋氨酸或纈氨酸替換。因此，相似功能的兩個蛋白或氨基酸序列的相似性可能會不同。例如，基於MEGALIGN演算法的70%至99%的相似度(同一性)。“保守取代變體”還包括通過BLAST或FASTA演算法確定具有60%以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能達75%以上更好，最好能達85%以上，甚至達90%以上為最佳，並且與天然或親本蛋白質或酶相比具有相同或基本相似的性質或功能。
“分離的”纖溶酶原是指從其天然環境分離和/或回收的纖溶酶原蛋白。在一些實施方案中，所述纖溶酶原會純化(1)至大於90%、大於95%、或大於98%的純度(按重量計)，如通過Lowry法所確定的，例如超過99%(按重量計)，(2)至足以通過使用旋轉杯序列分析儀獲得N端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)至同質性，該同質性是通過使用考馬斯藍或銀染在還原性或非還原性條件下的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定的。分離的纖溶酶原也包括通過生物工程技術從重組細胞製備，並通過至少一個純化步驟分離的纖溶酶原。
術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用， 指任何長度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遺傳編碼的和非遺傳編碼的氨基酸，化學或生物化學修飾的或衍生化的氨基酸，和具有經修飾的肽主鏈的多肽。該術語包括融合蛋白，包括但不限於具有異源氨基酸序列的融合蛋白，具有異源和同源前導序列(具有或沒有N端甲硫氨酸殘基)的融合物；等等。
關於參照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分數(%)”定義為在必要時引入缺口以實現最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術範圍內的多種方式實現，例如使用公眾可得到的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員能決定用於比對序列的適宜參數，包括對所比較序列全長實現最大對比需要的任何演算法。然而，為了本發明的目的，氨基酸序列同一性百分數值是使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生的。
在採用ALIGN-2來比較氨基酸序列的情況中，給定氨基酸序列A相對於給定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對於、與、或針對給定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計算：分數X/Y乘100
其中X是由序列比對程式ALIGN-2在該程式的A和B比對中評分為相同匹配的氨基酸殘基的數目，且其中Y是B中的氨基酸殘基的總數。應當領會，在氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等的情況 下，A相對於B的%氨基酸序列同一性會不等於B相對於A的%氨基酸序列同一性。除非另有明確說明，本文中使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2電腦程式獲得的。
如本文中使用的，術語“治療”和“處理”指獲得期望的藥理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分預防疾病或其症狀，和/或部分或完全治癒疾病和/或其症狀，並且包括：(a)預防疾病在受試者體內發生，所述受試者可以具有疾病的素因，但是尚未診斷為具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滯其形成；和(c)減輕疾病和/或其症狀，即引起疾病和/或其症狀消退。
術語“個體”、“受試者”和“患者”在本文中可互換使用，指哺乳動物，包括但不限於鼠(大鼠、小鼠)、非人靈長類、人、犬、貓、有蹄動物(例如馬、牛、綿羊、豬、山羊)等。
“治療有效量”或“有效量”指在對哺乳動物或其它受試者施用以治療疾病時足以實現對疾病的所述預防和/或治療的纖溶酶原的量。“治療有效量”會根據所使用的纖溶酶原、要治療的受試者的疾病和/或其症狀的嚴重程度以及年齡、體重等而變化。
本發明纖溶酶原的製備
纖溶酶原可以從自然界分離並純化用於進一步的治療用途，也可以通過標準的化學肽合成技術來合成。當通過化學合成多肽時，可以經液相或固相進行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中將序列的C末端氨基酸附接於不溶性支援物，接著序貫添加序列中剩餘的氨基酸)是適合纖溶酶原化學合成的方法。各種形式的SPPS，諸如Fmoc和Boc可用於合成纖溶酶原。用於固相合成的技術描述於Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis；第 3-284頁於The Peptides：Analysis,Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield，等J.Am.Chem.Soc.,85：2149-2156(1963)；Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)；和Ganesan A.2006 Mini Rev.Med Chem.6：3-10和Camarero JA等2005 Protein Pept Lett.12：723-8中。簡言之，用其上構建有肽鏈的功能性單元處理小的不溶性多孔珠。在偶聯/去保護的重複迴圈後，將附接的固相游離N末端胺與單個受N保護的氨基酸單元偶聯。然後，將此單元去保護，露出可以與別的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之後將其切掉。
可以使用標準重組方法來生產本發明的纖溶酶原。例如，將編碼纖溶酶原的核酸插入表達載體中，使其與表達載體中的調控序列可操作連接。表達調控序列包括但不限於啟動子(例如天然關聯的或異源的啟動子)、信號序列、增強子元件、和轉錄終止序列。表達調控可以是載體中的真核啟動子系統，所述載體能夠轉化或轉染真核宿主細胞(例如COS或CHO細胞)。一旦將載體摻入合適的宿主中，在適合於核苷酸序列的高水準表達及纖溶酶原的收集和純化的條件下維持宿主。
合適的表達載體通常在宿主生物體中作為附加體或作為宿主染色體DNA的整合部分複製。通常，表達載體含有選擇標誌物(例如氨苄青黴素抗性、潮黴素抗性、四環素抗性、卡那黴素抗性或新黴素抗性)以有助於對外源用期望的DNA序列轉化的那些細胞進行檢測。
大腸桿菌(Escherichia coli)是可以用於複製主題抗體編碼多核苷酸的原核宿主細胞的例子。適合於使用的其它微生物宿主包括桿菌，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)，諸如 沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。在這些原核宿主中，也可以生成表達載體，其通常會含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如複製起點)。另外，會存在許多公知的啟動子，諸如乳糖啟動子系統，色氨酸(trp)啟動子系統，beta-內醯胺酶啟動子系統，或來自噬菌體λ的啟動子系統。啟動子通常會控制表達，任選在操縱基因序列的情況中，並且具有核糖體結合位點序列等，以啟動並完成轉錄和翻譯。
其他微生物，諸如酵母也可用於表達。酵母(例如釀酒酵母(S.cerevisiae))和畢赤酵母(Pichia)是合適的酵母宿主細胞的例子，其中合適的載體根據需要具有表達控制序列(例如啟動子)、複製起點、終止序列等。典型的啟動子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。誘導型酵母啟動於特別包括來自醇脫氫酶、異細胞色素C、和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。
在微生物外，哺乳動物細胞(例如在體外細胞培養物中培養的哺乳動物細胞)也可以用於表達並生成本發明的抗-Tau抗體(例如編碼主題抗-Tau抗體的多核苷酸)。參見Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、和經轉化的B細胞或雜交瘤。用於這些細胞的表達載體可以包含表達控制序列，如複製起點，啟動子和增強子(Queen等，Immunol.Rev.89：49(1986))，以及必需的加工資訊位元點，諸如核糖體結合位點，RNA剪接位點，多聚腺苷酸化位點，和轉錄終止子序列。合適的表達控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛 乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等衍生的啟動子。參見Co等，J.Immunol.148：1149(1992)。
一旦合成(化學或重組方式)，可以依照本領域的標準規程，包括硫酸銨沉澱，親和柱，柱層析，高效液相層析(HPLC)，凝膠電泳等來純化本發明所述的纖溶酶原。該纖溶酶原是基本上純的，例如至少約80%至85%純的，至少約85%至90%純的，至少約90%至95%純的，或98%至99%純的或更純的，例如不含污染物，所述污染物如細胞碎片，除主題抗體以外的大分子，等等。
藥物配製劑
可以通過將具有所需純度的纖溶酶原與可選的藥用載體，賦形劑，或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences,16版，Osol,A.ed.(1980))混合形成凍乾製劑或水溶液製備治療配製劑。可接受的載體、賦形劑、穩定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，並包括緩衝劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化苄烷銨(benzalkonium chleride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少於約10個殘基)；蛋白質如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物)；和/或非離子表面活性劑，例如 TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。優選凍乾的抗-VEGF抗體配製劑在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作為參考。
本發明的配製劑也可含有需治療的具體病症所需的一種以上的活性化合物，優選活性互補並且相互之間沒有副作用的那些。例如，抗高血壓的藥物，抗心律失常的藥物，治療糖尿病的藥物等。
本發明的纖溶酶原可包裹在通過諸如凝聚技術或介面聚合而製備的微膠囊中，例如，可置入在膠質藥物傳送系統(例如，脂質體，白蛋白微球，微乳劑，納米顆粒和納米膠囊)中或置入粗滴乳狀液中的羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。這些技術公開於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。
用於體內給藥的本發明的纖溶酶原必需是無菌的。這可以通過在冷凍乾燥和重新配製之前或之後通過除菌濾膜過濾而輕易實現。
本發明的纖溶酶原可製備緩釋製劑。緩釋製劑的適當實例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質，例如膜或微膠囊。緩釋基質實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15：167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12：98-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3773919,EP 58,481)，L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22：547(1983))，不可降解的乙烯-乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出處同上)，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨醯脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續釋放分子100天 以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。可以根據相關機理來設計使蛋白穩定的合理策略。例如，如果發現凝聚的機理是通過硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制濕度、採用合適的添加劑、和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。
給藥和劑量
可以通過不同方式，例如通過靜脈內，腹膜內，皮下，顱內，鞘內，動脈內(例如經由頸動脈)，肌內來實現本發明藥物組合物的施用。
用於胃腸外施用的製備物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和可注射有機酯，如油酸乙酯。水性載體包括水、醇性/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。胃腸外媒介物包含氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、或固定油。靜脈內媒介物包含液體和營養補充物、電解質補充物，等等。也可以存在防腐劑和其他添加劑，諸如例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體，等等。
醫務人員會基於各種臨床因素確定劑量方案。如醫學領域中公知的，任一患者的劑量取決於多種因素，包括患者的體型、體表面積、年齡、要施用的具體化合物、性別、施用次數和路徑、總體健康、和同時施用的其它藥物。本發明包含纖溶酶原的藥物組合物的劑量範圍可以例如為例如每天約0.0001至2000mg/kg，或約0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，10mg/kg，50mg/kg等等)受試者體重。例如，劑量可以是1mg/kg體重或50mg/kg體重或在1-50mg/kg的範圍，或至少1mg/kg。高於或低於此例示性範圍的劑量也涵蓋在內，特別是考慮到上 述的因素。上述範圍中的中間劑量也包含在本發明的範圍內。受試者可以每天、隔天、每週或根據通過經驗分析確定的任何其它日程表施用此類劑量。例示性的劑量日程表包括連續幾天1-10mg/kg。在本發明的藥物施用過程中需要即時評估治療效果和安全性。
製品或藥盒
本發明的一個實施方案涉及一種製品或藥盒，其包含可用於治療由糖尿病引起的心血管病及其相關病症的本發明纖溶酶原或纖溶酶。所述製品優選包括一個容器，標籤或包裝插頁。適當的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑膠製成。所述容器含有組合物，所述組合物可有效治療本發明的疾病或病症並具有無菌入口(例如所述容器可為靜脈內溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射針穿透的塞子的)。所述組合物中至少一種活性劑為纖溶酶原/纖溶酶。所述容器上或所附的標籤說明所述組合物用於治療本發明所述由糖尿病引起的心血管病及其相關病症。所述製品可進一步包含含有可藥用緩衝液的第二容器，諸如磷酸鹽緩衝的鹽水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可進一步包含從商業和使用者角度來看所需的其它物質，包括其它緩衝液，稀釋劑，過濾物，針和注射器。此外，所述製品包含帶有使用說明的包裝插頁，包括例如指示所述組合物的使用者將纖溶酶原組合物以及治療伴隨的疾病的其它藥物給藥患者。
實施例
實施例1 纖溶酶原改善糖尿病小鼠肝臟脂質沉積
24-25周齡雄性db/db小鼠10隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各5隻。實驗開始當天記為第0天並稱重分組，第1天 開始給纖溶酶原或PBS。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2ml/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射給予相同體積的PBS，連續給藥35天。在第36天處死小鼠取肝臟組織4%多聚甲醛固定24-48小時，分別於15%、30%蔗糖中4℃過夜沉底，OCT包埋，冰凍切片厚度8μm，油紅O染色15min，75%酒精分化5秒，蘇木素染核30s，甘油明膠封片。切片在200倍光學顯微鏡下觀察。
染色結果顯示，給纖溶酶原組(圖1B)小鼠肝臟的脂質沉積面積顯著小於給溶媒PBS對照組(圖1A)，且統計差異顯著(P=0.02)(圖1C)。說明纖溶酶原能減少脂肪在糖尿病小鼠肝臟中的沉積。
實施例2纖溶酶原改善ApoE動脈粥樣硬化小鼠肝臟脂質沉積
6周齡雄性ApoE小鼠13隻飼餵高脂高膽固醇飼料(南通特洛菲，TP2031)16周以誘導動脈粥樣硬化模型[30,31]。成模後的小鼠繼續飼餵高脂高膽固醇飼料。在給藥前三天每隻取血50μl以檢測總膽固醇(T-CHO)含量，並根據T-CHO含量隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組7隻，給纖溶酶原組6隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，給藥30天。於第31天處死小鼠，取材肝臟組織於4%多聚甲醛固定24-48小時，分別於15%、30%蔗糖中4℃過夜沉底，OCT包埋，冰凍切片厚度8μm，油紅O染色15min，75%酒精分化5秒，蘇木素染核30s，甘油明膠封片。切片在200倍光學顯微鏡下觀察。
染色結果顯示，給纖溶酶原組(圖2B)小鼠肝臟脂肪沉積 明顯少於給溶媒PBS對照組(圖2A)，且定量分析統計差異顯著(P=0.02)(圖2C)。說明纖溶酶原能減少脂肪在動脈粥樣硬化模型小鼠肝臟中的沉積。
實施例3纖溶酶原消減脂肪在16周高脂血症模型小鼠肝臟中的沉積
6周齡雄性C57小鼠11隻飼餵高脂高膽固醇飼料(南通特洛菲，貨號TP2031)16周以誘導高脂血症模型[32,33]，此模型定為16周高脂血症模型。成模後的小鼠繼續飼餵高膽固醇飼料。在給藥前三天每隻取血50μl以檢測總膽固醇(T-CHO)含量，並根據T-CHO含量隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組6隻，給纖溶酶原組5隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS。給藥30天，並於第31天處死小鼠，取肝臟於4%多聚甲醛固定24-48小時，分別於15%、30%蔗糖中4℃過夜沉底，OCT包埋，冰凍切片厚度8μm，油紅O染色15min，75%酒精分化5秒，蘇木素染核30s，甘油明膠封片。切片在200倍光學顯微鏡下觀察。
油紅O染色可顯示脂質沉積，反映脂質沉積的程度[34]。結果顯示，給纖溶酶原組(圖3B)小鼠肝臟脂肪沉積明顯少於給溶媒PBS對照組(圖3A)，且定量分析統計差異顯著(圖1C)。說明纖溶酶原能消減脂肪在高脂血症模型小鼠肝臟中的沉積。
實施例4 纖溶酶原減少脂質在16周高脂血症模型小鼠主動脈竇中的沉積
6周齡雄性C57小鼠11隻飼餵高脂高膽固醇飼料(南通特洛菲，貨號TP2031)16周以誘導高脂血症模型[32,33]，此模型定為16周高脂血症 模型。成模後的小鼠繼續飼餵高膽固醇飼料。在給藥前三天每隻取血50μl以檢測總膽固醇(T-CHO)含量，並根據T-CHO含量隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組6隻，給纖溶酶原組5隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS。給藥30天，並於第31天處死小鼠，取心臟組織於4%多聚甲醛固定24-48小時，分別於15%、30%蔗糖中4℃過夜沉底，OCT包埋，主動脈竇冰凍切片厚度8μm，油紅O染色15min，75%酒精分化5秒，蘇木素染核30s，甘油明膠封片。切片在40(圖4A、4B)、200倍(圖4C、4D)倍光學顯微鏡下觀察。
結果顯示，給纖溶酶原組(圖4B、4D)小鼠主動脈竇脂肪沉積明顯少於給溶媒PBS對照組(圖4A、4C)，且統計差異顯著(圖2E)。說明纖溶酶原能減少脂質在高脂血症模型小鼠主動脈竇中的沉積。
實施例5 纖溶酶原改善16周高脂血症模型小鼠主動脈竇損傷
6周齡雄性C57小鼠11隻飼餵高脂高膽固醇飼料(南通特洛菲，貨號TP2031)16周以誘導高脂血症模型[32,33]，此模型定為16周高脂血症模型。成模後的小鼠繼續飼餵高膽固醇飼料。在給藥前三天每隻取血50μl以檢測總膽固醇(T-CHO)含量，並根據T-CHO含量隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組6隻，給纖溶酶原組5隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS。給藥30天，並於第31天處死小鼠，取心臟組織於4%多聚甲醛固定24-48小時。固定後的組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。 固定後的組織樣本經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。主動脈竇組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1%鹽酸酒精分化後氨水返藍並酒精梯度脫水封片，切片在40(圖5A、B)、200倍(圖5C、D)光學顯微鏡下觀察。
結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖3A、C)主動脈竇內壁泡沫細胞沉積(箭頭所指)，斑塊沉積重；給纖溶酶原組(圖3B、D)主動脈竇內壁僅可見輕度的泡沫細胞沉積，且內膜下未見明顯的粥樣斑塊沉積，給纖溶酶原組主動脈竇內壁損傷較輕。說明纖溶酶原能改善高脂血症模型小鼠動脈竇內壁損傷。
實施例6 纖溶酶原降低16周高脂血症模型小鼠心臟纖維蛋白的表達
6周齡雄性C57小鼠11隻飼餵高脂高膽固醇飼料(南通特洛菲，貨號TP2031)16周以誘導高脂血症模型[32,33]，此模型定為16周高脂血症模型。成模後的小鼠繼續飼餵高膽固醇飼料。在給藥前三天每隻取血50μl以檢測總膽固醇(T-CHO)含量，並根據T-CHO含量隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組6隻，給纖溶酶原組5隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS。給藥30天，並於第31天處死小鼠，取心臟組織於4%多聚甲醛固定24-48小時。固定後的組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水孵育15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，用PAP筆圈出組織。以3%雙氧水孵 育15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。兔抗小鼠纖維蛋白抗體(Abcam)4℃孵育過夜，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水、二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。
纖維蛋白原是纖維蛋白的前體，在組織存在損傷的情況下，作為機體對損傷的一種應激反應，纖維蛋白原水解成纖維蛋白沉積在損傷部位[35,36]。因此，可將損傷局部纖維蛋白水準作為損傷程度的一個標誌。
免疫組化染色結果顯示，給纖溶酶原組小鼠(圖6B)心臟纖維蛋白的陽性表達明顯少於給溶媒PBS對照組(圖6A)，且統計差異顯著(圖6C)，說明纖溶酶原能減少高血脂所致的心肌損傷。
實施例7 纖溶酶原有效保護16周高脂血症模型小鼠心肌損傷
6周齡雄性C57小鼠11隻飼餵高脂高膽固醇飼料(南通特洛菲，貨號TP2031)16周以誘導高脂血症模型[32,33]，此模型定為16周高脂血症模型。成模後的小鼠繼續飼餵高膽固醇飼料。在給藥前三天每隻取血50μl以檢測總膽固醇(T-CHO)含量，並根據T-CHO含量隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組6隻，給纖溶酶原組5隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS。給藥30天，並於第31天處死小鼠，取心臟組織於4%多聚甲醛固定24-48小時。固定後的組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。 組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水孵育15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，用PAP筆圈出組織。以3%雙氧水孵育15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。山羊抗鼠IgM(HRP)抗體(Abcam)室溫孵育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素染核30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。
IgM抗體在清除凋亡和壞死細胞過程中發揮著重要作用，損傷的組織器官局部IgM抗體的水準與損傷程度呈正相關[37,38]。因此，檢測組織器官局部IgM抗體的水準能夠反映該組織器官的損傷程度。
免疫染色結果顯示，給纖溶酶原組小鼠(圖7B)心臟IgM的陽性表達明顯少於給溶媒PBS對照組(圖7A)，說明纖溶酶原能減少高脂血症模型動物心臟的損傷。
實施例8纖溶酶原減輕16周高脂血症模型小鼠心臟纖維化
6周齡雄性C57小鼠11隻飼餵高脂高膽固醇飼料(南通特洛菲，貨號TP2031)16周以誘導高脂血症模型[32,33]，此模型定為16周高脂血症模型。成模後的小鼠繼續飼餵高膽固醇飼料。在給藥前三天每隻取血50μl以檢測總膽固醇(T-CHO)含量，並根據T-CHO含量隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組6隻，給纖溶酶原組5隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS。給藥30天，並於第31天處死小鼠，取心臟組織於4%多聚甲醛固定24-48小時。固定後的組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。 組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次，以0.1%天狼星紅飽和苦味酸染色30分鐘後，流水沖洗2min，蘇木素染色1分鐘，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，流水沖洗，烘乾後中性樹膠封片，在200倍光學顯微鏡下觀察。
天狼星紅染色可使膠原持久染色，作為病理切片特殊染色方法，天狼星紅染色可以特異顯示膠原組織。
染色結果顯示，給纖溶酶原組(圖8B)膠原的沉積明顯少於給溶媒PBS對照組(圖8A)，說明纖溶酶原能減輕高脂血症模型小鼠心臟組織膠原蛋白的沉積，減輕心肌纖維化。
實施例9 纖溶酶原修復16周高脂血症模型小鼠心肌損傷
6周齡雄性C57小鼠11隻飼餵高脂高膽固醇飼料(南通特洛菲，貨號TP2031)16周以誘導高脂血症模型[32,33]，此模型定為16周高脂血症模型。成模後的小鼠繼續飼餵高膽固醇飼料。在給藥前三天每隻取血50μl以檢測總膽固醇(T-CHO)含量，並根據T-CHO含量隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組6隻，給纖溶酶原組5隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS。給藥30天，第30天給藥後小鼠開始禁食，禁食16小時，第31天摘眼球取血，離心獲得上清，採用心肌肌鈣蛋白(Cardiac troponin I,CTNI)檢測試劑盒(南京建成)檢測血清中肌鈣蛋白的濃度。
心肌肌鈣蛋白I是心肌損傷的重要標誌物，其血清濃度能夠反映心肌損傷的程度[39]。
檢測結果顯示，給溶媒PBS對照組血清心肌肌鈣蛋白濃度明 顯高於給纖溶酶原組，且統計差異顯著(圖9)。說明纖溶酶原能顯著改善高脂血症模型小鼠心臟損傷。
實施例10 纖溶酶原提高3%膽固醇高脂血症模型小鼠血清高密度脂蛋白膽固醇濃度
9周齡雄性C57小鼠16隻飼餵3%膽固醇高脂飼料(南通特洛菲)4周，誘導高脂血症[32,33]，此模型定為3%膽固醇高脂血症模型。成模後的小鼠繼續飼餵3%膽固醇高脂飼料。在給藥前三天每隻小鼠取血50μL，檢測總膽固醇，並根據總膽固醇濃度和體重隨機分為兩組，每組各8隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，給藥20天。在第10、20天小鼠禁食16小時，第11、21天紮眼眶靜脈叢取血50μl，離心獲得上清，用以檢測血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。本文中高密度脂蛋白膽固醇含量通過檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號A112-1)所述方法檢測。
高密度脂蛋白是一種抗動脈粥樣硬化的血漿脂蛋白，是冠心病的保護因數，俗稱“血管清道夫”。
檢測結果顯示，給纖溶酶原組小鼠血清HDL-C濃度明顯高於給溶媒PBS對照組，且二者在給藥10、20天後HDL-C濃度均有統計學差異(圖10)。說明纖溶酶原能提高高脂血症模型小鼠血清中高密度脂蛋白膽固醇的含量，改善高脂血症小鼠血脂紊亂。
實施例11 纖溶酶原降低3%膽固醇高脂血症模型小鼠血清總膽固醇水準
9周齡雄性C57小鼠16隻飼餵3%膽固醇高脂飼料(南通特洛 菲)4周，誘導高脂血症[32,33]，此模型定為3%膽固醇高脂血症模型。成模後的小鼠繼續飼餵3%膽固醇高脂飼料。在給藥前三天每隻小鼠取血50μL，檢測總膽固醇，並根據總膽固醇濃度和體重隨機分為兩組，每組各8隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，給藥20天。在第20天小鼠禁食16小時，第21天紮眼眶靜脈叢取血50μL，離心獲得上清，採用總膽固醇檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號A111-1)進行總膽固醇檢測。
檢測結果顯示，給纖溶酶原組小鼠總膽固醇濃度明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(圖11)。說明纖溶酶原能降低高脂血症模型小鼠血清中總膽固醇的含量。
實施例12 纖溶酶原降低3%膽固醇高脂血症模型小鼠血清低密度脂蛋白膽固醇水準
9周齡雄性C57小鼠16隻飼餵3%膽固醇高脂飼料(南通特洛菲)4周，誘導高脂血症[32,33]，此模型定為3%膽固醇高脂血症模型。成模後的小鼠繼續飼餵3%膽固醇高脂飼料。在給藥前三天每隻小鼠取血50μl，檢測總膽固醇，並根據總膽固醇濃度和體重隨機分為兩組，每組各8隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，給藥20天。在第20天小鼠禁食16小時，第21天紮眼眶靜脈叢取血50μL，離心獲得上清，採用低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號A113-1)進行低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)檢測。
低密度脂蛋白是一種運載膽固醇進入外周組織細胞的脂蛋 白顆粒，可被氧化成氧化低密度脂蛋白，當低密度脂蛋白，尤其是氧化修飾的低密度脂蛋白(OX-LDL)過量時，它攜帶的膽固醇便積存在動脈壁上，引發動脈硬化。因此低密度脂蛋白膽固醇被稱為“壞的膽固醇”。
結果顯示，給纖溶酶原組小鼠(LDL-C)濃度明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(圖12)。說明纖溶酶原能降低高脂血症模型小鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇的含量，改善高脂血症小鼠血脂紊亂。
實施例13 纖溶酶原降低3%膽固醇高脂血症模型小鼠動脈粥樣硬化形成的風險
9周齡雄性C57小鼠16隻飼餵3%膽固醇高脂飼料(南通特洛菲)4周，誘導高脂血症[32,33]，此模型定為3%膽固醇高脂血症模型。成模後的小鼠繼續飼餵3%膽固醇高脂飼料。在給藥前三天每隻小鼠取血50μl，檢測總膽固醇(T-CHO)，並根據總膽固醇濃度和體重隨機分為兩組，每組各8隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS。在第20天給藥後小鼠開始禁食，禁食16小時，第21天紮眼眶靜脈叢取血50μL，離心獲得上清，總膽固醇含量採用總膽固醇檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號A111-1)進行檢測；高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量採用高密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號A112-1)進行檢測。
動脈粥樣硬化指數，是臨床上預測動脈粥樣硬化的綜合指標，認為它在用作對冠心病風險程度的估計方面臨床意義比單項的總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白更大[40]。動脈粥樣硬化指數= (T-CHO-HDL-C)/HDL-C。
計算結果顯示，給纖溶酶原組小鼠動脈粥樣硬化指數明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(圖13)。說明纖溶酶原能降低高脂血症模型小鼠發生動脈粥樣硬化的風險。
實施例14纖溶酶原降低3%膽固醇高脂血症模型小鼠心臟發病風險
9周齡雄性C57小鼠16隻飼餵3%膽固醇高脂飼料(南通特洛菲)4周，誘導高脂血症[32,33]，此模型定為3%膽固醇高脂血症模型。成模後的小鼠繼續飼餵3%膽固醇高脂飼料。在給藥前三天每隻小鼠取血50μl，檢測總膽固醇(T-CHO)，並根據總膽固醇濃度隨機分為兩組，每組各8隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS。在第20天給藥後小鼠開始禁食，禁食16小時，第21天紮眼眶靜脈叢取血50μL，離心獲得上清，總膽固醇含量採用總膽固醇檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號A111-1)進行檢測；高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量採用高密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號A112-1)進行檢測。心臟風險指數=T-CHO/HDL-C。
心臟風險指數(cardiac risk index，CRI)用以評估血脂紊亂誘發心臟疾病的風險[40]。
結果顯示，給纖溶酶原組CRI明顯小於給溶媒PBS對照組，且統計差異極其顯著(圖14)。說明纖溶酶原能有效的降低高脂血症模型小鼠發生心臟疾病的風險。
實施例15纖溶酶原減輕糖尿病小鼠主動脈管壁的損傷
24-25周齡雄性db/db小鼠10隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各5隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組，第1天開始給PBS或纖溶酶原，連續給藥31天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2ml/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射給予相同體積的PBS。在第32天處死小鼠並取主動脈在10%中性福馬林固定液中固定24小時。固定後的主動脈經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1%鹽酸酒精分化後氨水返藍並酒精梯度脫水封片，切片在400倍(圖15A、B)光學顯微鏡以及1000倍(圖15C、D)油鏡下觀察。
糖尿病合併高血脂是糖尿病較為常見的併發症，是糖尿病大血管病變的重要危險因數[41]。
染色結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖15A、C)血管管壁有泡沫細胞沉積(箭頭標識)，中層彈性膜排列紊亂，血管壁增厚，管壁凸凹不均；給纖溶酶原組(圖15B、D)中層彈性膜結構規則，呈波浪形，血管管壁厚度均勻。表明注射纖溶酶原可減輕糖尿病小鼠主動脈管壁的脂質沉積，對動脈管壁脂質沉積導致的損傷具有一定的保護作用。
實施例16纖溶酶原降低糖尿病小鼠心室脂質沉積
26周齡雄性db/db小鼠9隻隨機分組，給纖溶酶原組4隻，給溶媒PBS對照組5隻。給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，給藥35天。於第36天處死小鼠，取心臟於4%多聚甲醛固定24-48小時，分別於15%、30%蔗糖中4℃過 夜沉底，OCT包埋，冰凍切片厚度8μm，油紅O染色15min，75%酒精分化5秒，蘇木素染核30s，甘油明膠封片。切片在200倍光學顯微鏡下觀察。
結果顯示，給纖溶酶原組小鼠(圖16B)心室脂質沉積(箭頭標識)明顯少於給溶媒PBS對照組(圖16A)。說明纖溶酶原能減少脂肪在糖尿病小鼠心室沉積，促進心室損傷的修復。
實施例17纖溶酶原提高糖尿病小鼠血清中的高密度脂蛋白膽固醇水準
26周齡雄性db/db小鼠20隻隨機分組，給纖溶酶原組11隻，給溶媒PBS對照組各9隻。實驗開始當天記為第0天並稱重分組，第1天開始給纖溶酶原或PBS，連續給藥35天。給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，對照組尾靜脈注射同體積的PBS。第36天小鼠摘眼球采全血，4℃ 3500r/min離心10分鐘，取上清液並採用高密度脂蛋白檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號A112-1)檢測血清中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)濃度。
檢測結果顯示，給纖溶酶原組小鼠血清中HDL-C的含量高於給溶媒PBS對照組，統計差異顯著(圖17)。說明注射纖溶酶原能促進血清高密度脂蛋白膽固醇的含量升高，改善糖尿病血脂紊亂。
實施例18纖溶酶原降低糖尿病小鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇
24-25周齡雄性db/db小鼠10隻隨機分組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組各5隻，並取3隻db/m作為正常對照組。實驗開始當天記為第0天稱重分組，第1天開始給纖溶酶原或PBS，連續給藥31天。給纖溶酶原組 尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，正常對照組小鼠不作任何處理。第32天小鼠摘眼球采全血，4℃ 3500r/min離心10分鐘，取上清液並採用低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號A113-1)檢測血清中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)濃度。
結果顯示，糖尿病模型小鼠連續注射人源纖溶酶源31天後，給纖溶酶原組小鼠血清中的LDL-C含量低於給溶媒PBS對照組，且統計差異接近顯著(P=0.1)(圖18)。說明纖溶酶原能降低血清中LDL-C的含量。
實施例19纖溶酶原降低ApoE動脈粥樣硬化小鼠血清總膽固醇的含量
6周齡雄性ApoE小鼠13隻飼餵高脂高膽固醇飼料(南通特洛菲，TP2031)16周以誘導動脈粥樣硬化模型[30,31]。成模後的小鼠繼續飼餵高脂高膽固醇飼料。在給藥前三天每隻取血50μl以檢測總膽固醇(T-CHO)含量，並根據T-CHO含量隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組7隻，給纖溶酶原組6隻。開始給藥定為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，給藥30天。在第30天小鼠禁食16小時，第31天摘除眼球取血，離心獲得上清採用總膽固醇檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號A111-1)進行總膽固醇檢測。
檢測結果顯示，給纖溶酶原組小鼠總膽固醇濃度明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(P=0.014)(圖19)。說明纖溶酶原能降低ApoE動脈粥樣硬化模型小鼠血清中總膽固醇的含量，改善動脈粥樣硬化的 血脂紊亂。
實施例20 纖溶酶原降低ApoE動脈粥樣硬化小鼠血清甘油三酯的含量
6周齡雄性ApoE小鼠13隻飼餵高脂高膽固醇飼料(南通特洛菲，TP2031)16周以誘導動脈粥樣硬化模型[30,31]。成模後的小鼠繼續飼餵高脂高膽固醇飼料。在給藥前三天每隻取血50μl以檢測總膽固醇(T-CHO)含量，並根據T-CHO含量隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組7隻，給纖溶酶原組6隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，給藥30天。在第30天小鼠禁食16小時，第31天摘眼球取血，離心獲得上清採用甘油三酯檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號A110-1)進行甘油三酯檢測。
檢測結果顯示，給纖溶酶原組小鼠甘油三酯濃度明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(P=0.013)(圖20)。說明纖溶酶原能降低ApoE動脈粥樣硬化模型小鼠血清中甘油三酯的含量，改善動脈粥樣硬化血脂紊亂。
實施例21 纖溶酶原降低ApoE動脈粥樣硬化小鼠血清低密度脂蛋白膽固醇的含量
6周齡雄性ApoE小鼠13隻飼餵高脂高膽固醇飼料(南通特洛菲，TP2031)16周以誘導動脈粥樣硬化模型[30,31]。成模後的小鼠繼續飼餵高脂高膽固醇飼料。在給藥前三天每隻取血50μl以檢測總膽固醇(T-CHO)含量，並根據T-CHO含量隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組7隻，給纖溶酶 原組6隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，給藥30天。第30天小鼠禁食16小時，第31天摘眼球取血，離心獲得上清採用低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號A113-1)進行LDL-C檢測。
結果顯示，給纖溶酶原組小鼠LDL-C濃度明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(P=0.017)(圖21)。說明纖溶酶原能降低ApoE動脈粥樣硬化模型小鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇含量，改善動脈粥樣硬化模型小鼠血脂紊亂。
實施例22 纖溶酶原改善脂質在ApoE動脈粥樣硬化小鼠主動脈竇中的沉積
6周齡雄性ApoE小鼠13隻飼餵高脂高膽固醇飼料(南通特洛菲，TP2031)16周以誘導動脈粥樣硬化模型[30,31]。成模後的小鼠繼續飼餵高脂高膽固醇飼料。在給藥前三天每隻取血50μl以檢測總膽固醇(T-CHO)含量，並根據T-CHO含量隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組7隻，給纖溶酶原組6隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，給藥30天。於第31天處死小鼠，取心臟組織於4%多聚甲醛固定24-48小時，分別於15%、30%蔗糖中4℃過夜沉底，OCT包埋，冰凍切片厚度8μm，油紅O染色15min，75%酒精分化5秒，蘇木素染核30s，甘油明膠封片。切片在40倍光學顯微鏡下觀察。
染色結果顯示，給纖溶酶原組(圖22B)小鼠主動脈竇脂肪 沉積明顯少於給溶媒PBS對照組(圖22A)。說明纖溶酶原能減少脂質在動脈粥樣硬化模型小鼠主動脈竇中的沉積。
實施例23 纖溶酶原降低16周高脂血症模型小鼠主動脈竇纖維化
6周齡雄性C57小鼠11隻飼餵高脂高膽固醇飼料(南通特洛菲，貨號TP2031)16周以誘導高脂血症模型[32,33]，此模型定為16周高脂血症模型。成模後的小鼠繼續飼餵高膽固醇飼料。在給藥前三天每隻取血50μl以檢測總膽固醇(T-CHO)含量，並根據T-CHO含量隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組6隻，給纖溶酶原組5隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS。給藥30天，於第31天處死小鼠，取心臟於4%多聚甲醛固定24-48小時。固定後的組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。主動脈竇切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次，以0.1%天狼星紅飽和苦味酸染色30分鐘後，流水沖洗2min，蘇木素染色1分鐘，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，流水沖洗，烘乾後中性樹膠封片，在40(圖23A、23B)、200倍(圖23C、23D)光學顯微鏡下觀察。
結果顯示，給纖溶酶原組(圖23B,23D)主動脈竇血管內壁膠原蛋白沉積(箭頭標識)的面積明顯小於給溶媒PBS對照組(圖23A、23C)，說明纖溶酶原能夠消減高脂血症模型小鼠主動脈竇纖維化水準。
實施例24 纖溶酶原改善ApoE動脈粥樣硬化小鼠心臟代償性肥大
6周齡雄性ApoE小鼠13隻飼餵高脂高膽固醇飼料(南通特洛 菲，TP2031)16周以誘導動脈粥樣硬化模型[47,48]。成模後的小鼠在給藥前三天每隻取血50μl以檢測總膽固醇(T-CHO)含量，並根據T-CHO含量隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組7隻，給纖溶酶原組6隻。開始給藥定為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1mL/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS。給藥30天，給藥期間繼續飼餵高脂高膽固醇飼料。於給藥的第31天稱重後處死小鼠，取心臟稱重，並計算心臟係數。心臟係數(%)=心臟重量/體重×100。
結果顯示，給纖溶酶原組小鼠心臟係數明顯低於給溶媒PBS對照組(圖24)。說明纖溶酶原能減輕ApoE動脈粥樣硬化模型小鼠由於心臟損傷所致的心臟代償性肥大。
實施例25 纖溶酶原降低3%膽固醇高脂血症模型小鼠腎臟纖維化
9周齡雄性C57小鼠16隻飼餵3%膽固醇高脂飼料(南通特洛菲)4周，誘導高脂血症[32,33]，此模型定為3%膽固醇高脂血症模型，成模後的小鼠繼續飼餵3%膽固醇高脂飼料。另取相同周齡的雄性C57小鼠5隻作為空白對照組，實驗期間飼餵普通維持飼料。在給藥前三天每隻小鼠取血50μL，檢測總膽固醇，模型小鼠根據總膽固醇濃度和體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各8隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，給藥週期30天，於第31天處死小鼠，取腎臟於4%多聚甲醛固定24-48小時。固定後的組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。腎臟組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次，以0.1% 天狼星紅飽和苦味酸染色30分鐘後，流水沖洗2min，蘇木素染色1分鐘，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，流水沖洗，烘乾後中性樹膠封片，在200倍光學顯微鏡下觀察。
結果顯示，給纖溶酶原組(圖25C)腎臟膠原蛋白沉積(箭頭標識)明顯少於給溶媒PBS對照組(圖25B)，且統計差異顯著(圖25D)；給纖溶酶原組纖維化基本恢復到正常水準(圖25A)。說明纖溶酶原能有效的減少3%膽固醇高脂血症模型小鼠腎臟纖維化。
實施例26 纖溶酶原降低3%膽固醇高脂血症模型小鼠腎臟脂肪沉積
9周齡雄性C57小鼠16隻飼餵3%膽固醇高脂飼料(南通特洛菲)4周，誘導高脂血症[32,33]，此模型定為3%膽固醇高脂血症模型，成模後的小鼠繼續飼餵3%膽固醇高脂飼料。另取相同周齡的雄性C57小鼠5隻作為空白對照組，實驗期間飼餵普通維持飼料。在給藥前三天每隻小鼠取血50μL，檢測總膽固醇，模型小鼠根據總膽固醇濃度和體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各8隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，給藥30天。第31天處死小鼠，取腎臟於4%多聚甲醛固定24-48小時，分別於15%、30%蔗糖中4℃過夜沉底，OCT包埋，冰凍切片厚度8μm，油紅O染色15min，75%酒精分化5秒，蘇木素染核30秒，甘油明膠封片。切片在400倍光學顯微鏡下觀察。
結果顯示，給纖溶酶原組(圖26C)小鼠腎臟脂肪沉積(箭頭標識)明顯少於給溶媒PBS對照組(圖26B)，且定量分析統計差異顯著(圖 26D)；此外，給纖溶酶原組脂質沉積水準與空白對照組小鼠(圖26A)相似。說明纖溶酶原能消減脂肪在高脂血症模型小鼠腎臟中的沉積，從而減少脂肪沉積所致腎的髒損傷。
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<211> 367
<212> PRT
<213> Mini-plg(小纖維蛋白溶酶原)氨基酸序列
<400> 10
<210> 11
<211> 750
<212> DNA
<213> icro-plg(微纖維蛋白溶酶原)核酸序列
<400> 11
<210> 12
<211> 249
<212> PRT
<213> Micro-plg(微纖維蛋白溶酶原)氨基酸序列
<400> 12
<210> 13
<211> 684
<212> DNA
<213> 絲氨酸蛋白酶(結構)域的核酸序列
<400> 13
<210> 14
<211> 228
<212> PRT
<213> 絲氨酸蛋白酶(結構)域的氨基酸序列
<400> 14

Claims (10)

  1. 一種用於預防和/或治療受試者脂肪肝及其相關病症的方法，包括給藥受試者預防和/或治療有效量的纖溶酶原，所述受試者患有、懷疑患有脂肪肝及其相關病症或具有患上脂肪肝及其相關病狀的風險。
  2. 請求項1的方法，其中所述脂肪肝包括肥胖性脂肪肝、酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、快速減肥性脂肪肝、營養不良性脂肪肝、糖尿病脂肪肝、藥物性脂肪肝。
  3. 一種用於預防和/或治療受試者脂肪肝及其相關病症的方法，包括給藥受試者預防和/或治療有效量的纖溶酶原，其中所述脂肪肝為內分泌紊亂疾病、糖代謝疾病、肝臟疾病、腎臟疾病、心血管疾病、腸道疾病、甲狀腺疾病、膽囊或膽道疾病、肥胖症、飲酒、藥物治療引發或伴隨的。
  4. 請求項3的方法，其中所述脂肪肝為高血壓、糖尿病、慢性肝炎、腎損傷、慢性腎小球腎炎、慢性腎盂腎炎、腎病症候群、腎功能不全、腎移植、尿毒癥、甲狀腺功能低下、阻塞性膽囊炎、阻塞性膽管炎、雌激素治療引發或伴隨的。
  5. 一種用於預防和/或治療受試者肝臟脂質沉積及其相關病症的方法，包括給藥受試者預防和/或治療有效量的纖溶酶原，所述受試者患有、懷疑患有肝臟脂質沉積及其相關病症或具有患上脂肪肝及其相關病狀的風險。
  6. 請求項5的方法，其中所述肝臟脂質沉積為內分泌紊亂疾病、糖代謝疾病、肝臟疾病、腎臟疾病、心血管疾病、腸道疾病、甲狀腺疾病、膽 囊或膽道疾病、肥胖症、飲酒、藥物治療引發或伴隨的。
  7. 請求項6的方法，其中所述肝臟脂質沉積為高血壓、糖尿病、慢性肝炎、腎損傷、慢性腎小球腎炎、慢性腎盂腎炎、腎病症候群、腎功能不全、腎移植、尿毒癥、甲狀腺功能低下、阻塞性膽囊炎、阻塞性膽管炎、藥物治療引發或伴隨的。
  8. 一種消減動脈粥樣硬化受試者肝臟脂質沉積的方法，包括給藥所述受試者有效量的纖溶酶原。
  9. 一種消減糖尿病受試者肝臟脂質沉積的方法，包括給藥所述受試者有效量的纖溶酶原。
  10. 一種消減高脂血症受試者肝臟脂質沉積的方法，包括給藥所述受試者有效量的纖溶酶原。
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