TW201809255A - 容器之製造方法及其製造裝置、和細胞培養容器、細胞培養方法、細胞培養容器之製造方法及細胞培養容器之製造裝置 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種降低污染之風險，並且亦較佳地於同一容器內效率良好地對細胞進行培養、分化誘導等處理之容器。又，提供一種能夠確保廣範圍且平坦之培養面等之細胞培養容器。
容器之製造方法包含：將袋狀膜容器載置於形成有凹部之載置台，向所載置之袋狀膜容器之內部導入流體，一面對載置台及按壓構件中之至少一者加熱，一面利用按壓構件對載置於載置台之袋狀膜容器加壓。另一方面，細胞培養容器包含：第1容器壁，其具有透氣性，為底面，由平面狀之膜構成；及第2容器壁，其具有鼓出形狀，該鼓出形狀接觸於該第1容器壁之周緣部並且相對於第1容器壁而突出；第1容器壁至少於與埠口接觸之區域以外呈平面狀。

Description

容器之製造方法及其製造裝置、和細胞培養容器、細胞培養方法、細胞培養容器之製造方法及細胞培養容器之製造裝置
本發明係關於一種能夠儲存各種液體等之容器之製造方法及其製造裝置。又，本發明係關於一種培養各種細胞之技術，更具體而言，係關於一種具有透氣性且能夠培養細胞之細胞培養容器、使用該細胞培養容器之細胞培養方法、及該細胞培養容器之製造方法。
於由基因治療或再生醫療所代表之現代醫療領域中，將作為目的之細胞(包含組織、微生物、病毒等)於人工環境下進行培養、分化誘導。而且，近年來，特別謀求於人工環境下效率良好地對大量的上述細胞進行培養、分化誘導。
此處，當進行細胞之培養、分化誘導時，就對增殖之細胞進行必要之培養基成分之供給之觀點而言，將培養基中之細胞密度維持於適當之範圍變得重要。其原因在於：若隨著細胞之增殖而培養基中之細胞密度變高，則會因培養基成分之枯竭或細胞自身之代謝產物之累積等而妨礙細胞之增殖。另一方面，亦存在下述見解，即對於細胞之高效率之增殖而言，形成某程度之細胞之凝集塊是重要的；培養基中之細胞密度過低，亦 無法使細胞有效率地增殖、分化誘導。
此種背景下，先前以來使用如下方法：反覆進行繼代培養，以恰當地維持培養基中之細胞密度。
作為此種繼代培養之方法，有時將孔板或燒瓶等用作培養容器。
例如於專利文獻1中，揭示有如下技術：以成為適度之細胞密度之方式，使用孔板，將細胞與培養基一併加入至各個孔而開始培養(參照段落[0027]等)。於該專利文獻1中提出有：於孔內使細胞充分增殖後，轉移至燒瓶，加入新培養基，於增殖至一定量之時刻，轉移至容量更大之燒瓶而進行相同之處理，藉此大量培養細胞。
又，於專利文獻2中，揭示有如下技術：於形成為長方體等多面體形狀之燒瓶類型之培養容器之一側之面，形成多個凹陷。於該專利文獻2中，首先於上述多個凹陷形成細胞之凝集塊，繼而將其移動至形成於容器內之對面之寬幅之培養面，而成為更大之凝集塊。
另一方面，作為以上述形態等而培養之培養細胞，根據該培養中之存在形態，可分類為黏著培養系細胞及懸浮培養系細胞。
黏著培養系細胞係附著於培養細胞之培養容器之例如底面等而增殖之培養細胞。於該黏著培養系細胞中，除了進行將既有之培養細胞轉移至新培養容器而使其增殖之繼代培養以外，亦適當進行培養基更換。
此處，關於上述細胞培養，先前以來提出有以下所示之培養容器。
作為例如於實驗室中較佳使用之容器，已知有具有無偏斜之平坦之底 面之培養皿(皮氏培養皿)或培養燒瓶。其中，培養皿亦可使用蓋將容器內密閉，於排氣型蓋設置有肋，可選擇排氣/非排氣位置。又，與培養皿同樣地，底面平坦之培養燒瓶亦因培養面均一性、平滑性優異，故亦存在於顯微鏡觀察時可獲得良好之視野之優點。
另一方面，針對使用培養皿或培養燒瓶之開放系細胞培養，亦已知於栓緊之空間內進行細胞培養之封閉系細胞培養。於此種封閉系細胞培養中，就欲確保透明性或透氣性並且抑制污染風險之需求而言，較佳使用由具有柔軟性之樹脂形成之細胞培養袋。
然而，於普通細胞培養袋中，因若注入培養液則成為培養面之底面會變得不平坦之問題，而提出有例如專利文獻3般之細胞培養用托盤狀容器。即，專利文獻3所揭示之細胞培養用托盤狀容器成為如下構成：第1容器壁具有透明且包含單一之平面狀之底面之凹部及形成於該凹部之周緣之凸緣狀部，第2容器壁具有透氣性，且具有能夠變形之柔軟性。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2011-241159號公報
[專利文獻2]日本特開2006-055069號公報
[專利文獻3]日本專利第4780462號
然而，當以此方式進行繼代培養時，於將細胞配置於孔板之各個孔時或將細胞自孔板轉移至燒瓶時，需要重複多次移液操作，增加了繁瑣之作業。又，每當繼代時必須將細胞移動至新燒瓶等培養容器，故而不僅作業變得繁瑣，而且意外之細菌或病毒等之污染之風險亦變高。
又，於如專利文獻2般之燒瓶類型之培養容器中，只有於將堵住開口部之蓋卸下，將開口部敞開時才能進行氣體更換。因此，不僅無法對培養中之細胞供給充分量之氧，而且於氣體更換時，亦無法避免污染之風險。進而，於以非實驗室級別之規模大量培養細胞時，使用容量有限之燒瓶類型之培養容器並不實際。
進而，關於細胞培養容器，確實，若是根據專利文獻3，的確能夠某程度確保培養面之平坦性，但如下所述，應改善之課題仍多。
即，於例如以iPS細胞等所代表之黏著培養系細胞中，細胞之增殖程度取決於面積之寬窄，故而單純僅確保平坦之培養面並不足夠，需要儘可能使培養面平坦且廣範圍。尤其是，以用於再生醫療等為目的之細胞等極為珍貴，其培養需要大量時間及費用，故而亦要求高效率。
進而，細胞培養所需之培養基(培養液)非常昂貴，故而亦潛在地存在儘可能有效率地使用少量之培養基之需求。因此，必須將細胞之培養所需之培養面設為儘可能廣範圍且平面狀體，並且使用相對少量之培養基使培養液遍及上述培養面之各個角落。
又，較理想為使培養基之液厚廣範圍且均一，以便於播種後沈澱至底面之細胞於密度上均一地分佈，並且培養基之營養成分均一地遍及所有細胞。
然而，於包含專利文獻3在內之先前類型之細胞培養容器中，完全沒有關於上述課題之認識或提示。
本發明鑒於解決作為一例之上述課題，其目的之一在於提供一種能夠恰當地維持培養時之細胞密度，並且降低污染之風險，且能夠於同一容器內效率良好地培養、分化誘導細胞之細胞培養容器之製造方法及其製造裝置。
又，本發明之目的之一在於提供一種能夠確保廣範圍且平坦之培養面，並且即便為少量之培養液，亦能夠以均一之厚度遍及培養面之各個角落之細胞培養容器、細胞培養方法、及細胞培養容器之製造方法。
為了達成上述目的，本實施形態中之容器之製造方法之特徵在於包含如下步驟：將袋狀膜容器載置於形成有凹部之載置台；向所載置之上述袋狀膜容器之內部導入流體；及一面對上述載置台及與載置於上述載置台之上述袋狀膜容器相對向之按壓構件中之至少一者加熱，一面利用上述按壓構件對所載置之上述袋狀膜容器加壓。
又，本實施形態中之容器之製造裝置之特徵在於包含：載置台，其於載置袋狀膜容器之載置面形成有凹部；流體導入裝置，其向載置於上述載置面之上述袋狀膜容器之內部導入流體；按壓構件，其配置成能夠相對於上述載置面進退，對導入有上述流體之上述袋狀膜容器加壓；及加熱裝置，其對上述載置台及上述按壓構件中之至少一者加熱。
為了達成上述目的，本實施形態中之細胞培養容器之特徵在於，包含：第1容器壁，其具有透氣性，為底面，由平面狀之膜構成；第2 容器壁，其具有鼓出形狀，該鼓出形狀接觸於上述第1容器壁之周緣部並且於較上述周緣部更內側處相對於上述第1容器壁而突出；及埠口，其與由上述第1容器壁及上述第2容器壁之鼓出形狀包圍之培養空間連通；上述第1容器壁至少於與上述埠口接觸之區域以外呈平面狀。
又，本實施形態中之細胞培養方法係使用本實施形態中之細胞培養容器者，其特徵在於：以使上述第1容器壁相對於上述第2容器壁成為下方之方式載置上述第1容器壁，並經由上述埠口注入細胞及培養液。
又，本實施形態中之細胞培養容器之製造方法之特徵在於具有如下步驟：於使由具有透氣性之膜構成之第1容器壁及與上述第1容器壁相對向地配置之第2容器壁重疊之狀態下，將上述第1容器壁載置於載置台；於上述第2容器壁之中央部敞開之狀態下，利用約束構件按壓上述第1容器壁及上述第2容器壁之周緣部；於利用上述約束構件按壓上述周緣部之狀態下，向上述第1容器壁與上述第2容器壁之間導入流體；及一面利用按壓構件按壓上述第2容器壁之中央部，一面至少對上述按壓構件加熱。
又，本實施形態中之細胞培養容器之製造裝置係包含由平面狀之膜構成之第1容器壁、及具有接觸於上述第1容器壁之周緣部並且相對於上述第1容器壁而突出之鼓出形狀之第2容器壁者，其特徵在於包含：載置台，其載置上述第1容器壁；流體導入裝置，其向載置於上述載置台之上述第1容器壁與上述第2容器壁之間之空間導入流體；按壓構件，其配置成能夠相對於上述載置台進退，對在上述空間導入有上述流體之上述第2容器壁加壓；加熱裝置，其對上述按壓構件加熱；及約束構件，其與 上述載置台相對向地配置，約束載置於該載置台之上述第2容器壁之周邊；一面利用上述約束構件約束上述第2容器壁，一面利用上述加熱裝置對上述按壓構件加熱，並且利用上述流體導入裝置向上述第1容器壁與上述第2容器壁之間之空間導入上述流體。
根據本發明，能夠有效率地製造於表面形成有1或多個凹陷之容器。而且，能夠有效率地製造如下容器，即，尤其是於應用於細胞培養之用途之情形時，能夠恰當地維持培養時之細胞密度而抑制增殖所需之培養基成分之枯竭，異物等之污染風險亦得以抑制。
又，根據本發明，能夠藉由成為底面之平面狀之第1容器壁確保廣範圍且平坦之培養面，並且即便為少量之培養液，亦能夠藉由具有鼓出形狀之第2容器壁，使培養液遍及培養面之各個角落。進而，能夠於「恰當地維持培養時之細胞密度，不會發生增殖所需之培養基成分之枯竭，污染風險得以抑制」之狀態下，進行高品質之細胞之大量培養。
1‧‧‧細胞培養容器
2‧‧‧容器本體
3‧‧‧注入取出埠口
4‧‧‧凹陷
10‧‧‧細胞培養容器
11‧‧‧第1容器壁
12‧‧‧第2容器壁
13、14、15‧‧‧埠口
21、71‧‧‧按壓構件
22‧‧‧載置台本體
23‧‧‧容器支持部
24、74‧‧‧加熱裝置
25‧‧‧驅動機構
26、75‧‧‧流體導入裝置
27‧‧‧抽吸裝置
28‧‧‧調溫裝置
29、72‧‧‧約束構件
73、T‧‧‧載置台
CP‧‧‧控制裝置
圖1係表示第1實施形態之細胞培養容器1之概略之說明圖，(a)為俯視圖，(b)為側視圖，(c)為仰視圖。
圖2係表示第1實施形態中之細胞培養容器之製造裝置20之概略構成之示意圖。
圖3係說明第1實施形態中之細胞培養容器之製造裝置20中之載置台 22及按壓構件21之構造之示意圖。
圖4係第1實施形態中之細胞培養容器之製造裝置20之狀態轉變圖。
圖5係說明第1實施形態中之細胞培養容器之製造方法之流程圖。
圖6係表示第2實施形態中之細胞培養容器之製造裝置30之概略構成之示意圖。
圖7係第2實施形態中之細胞培養容器之製造裝置30之狀態轉變圖。
圖8係說明第2實施形態中之細胞培養容器之製造方法之流程圖。
圖9係表示第3實施形態中之細胞培養容器之製造裝置40之概略構成之示意圖。
圖10係表示第4實施形態中之細胞培養容器之製造裝置50之概略構成之示意圖。
圖11係說明第4實施形態中之細胞培養容器之製造裝置50中之按壓構件21與約束構件29之位置關係之示意圖。
圖12係第4實施形態中之細胞培養容器之製造裝置50之狀態轉變圖。
圖13係說明第4實施形態中之細胞培養容器之製造方法之流程圖。
圖14係表示變形例1中之細胞培養容器之製造裝置60之概略構成之示意圖。
圖15係說明變形例2中之加熱裝置24與約束構件29之示意圖。
圖16係說明變形例3中之載置台22之示意圖。
圖17係第5實施形態中之細胞培養容器10之外觀立體圖。
圖18係第5實施形態中之細胞培養容器10之側視圖。
圖19係第5實施形態中之細胞培養容器10之前視圖。
圖20係表示第5實施形態中之細胞培養容器10之製造裝置及製造方法之圖。
圖21係表示先前類型之細胞培養容器與實施形態之細胞培養容器10之比較之圖。
圖22係表示變形例4中之細胞培養容器10之圖。
圖23係表示變形例5中之細胞培養容器10之圖。
以下，適當一面參照圖式，一面對應用於細胞培養之用途之情形時之本發明之容器之製造方法及容器之製造裝置等進行具體說明。再者，為了便於進行說明，於以下之記載中，分別規定了X方向、Y方向、及Z方向，但並非意在限定或減縮本發明之權利範圍者。
≪第1實施形態≫
[細胞培養容器1]
圖1所示之細胞培養容器1係於底面設置有多個凹陷之細胞培養容器，具備：容器本體2，其由具有透氣性之公知之塑膠膜構成；及注入取出用埠口3，其由可供培養基或細胞等流通之管狀之構件構成。
容器本體2具有周邊部經密封，其頂面2a側台地狀地鼓出之鼓出形狀，且係以「成為平坦面之頂面2a之緣部傾斜而與周邊部相連」之方式而形成。並且，於容器本體2之底面2b，設置有成為細胞培養部之凹陷4。再者，於本實施形態中，設置有多個凹陷4，但只要至少設置1個即可。又，容器本體2之大小並無特別限定，例如較佳設為長20~1000mm、 寬20~1000mm。
又，關於形成容器本體2之塑膠膜之透氣性，依據JIS K 7126之透氣度試驗方法，較佳為於試驗溫度37℃下測定之氧之穿透度為5000mL/(m2‧day‧atm)以上。
作為用於形成此種容器本體2之塑膠膜之材料，只要具有所需之透氣性，便無特別限定。例如可列舉：聚乙烯、聚丙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚酯、矽酮系彈性體、聚苯乙烯系彈性體、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物(FEP)等熱塑性樹脂。其等可使用單層，亦可將同種或異種之材料積層使用，若考慮密封周邊部時之熱熔性，則較佳為具有作為密封層而發揮功能之層。
又，該塑膠膜較佳為一部分或全部具有透明性，以便能夠確認細胞培養之進行狀況或細胞之狀態等。
設置於容器本體2之底面2a之凹陷4較佳為能夠抑制容器本體2內之細胞之移動並且使培養中之細胞停留於一個凹陷4之程度的開口徑(直徑)。再者，凹陷4之開口徑可設為所有凹陷4均相同，亦可例如將底面2b分割成多個區域，針對各個區域使凹陷4之開口徑不同等，而使設置於底面2a之凹陷4包含開口徑不同之兩種以上之凹部。又，於圖1所示之細胞培養容器1中，係將凹陷4之形狀設為球冠狀，以便使細胞易於集中至凹陷4之底部，但凹陷4之形狀並不限定於此。
又，為了避免細胞滯留至底面2b之凹陷4以外之部分，凹陷4占底面2b之面積較佳為於不損及成形性之範圍內儘可能大，具體而言，較佳為相對於底面2b之面積為30~90%。凹陷4之排列較佳為設為圖 示般之錯位狀，使凹陷4占底面2b之面積儘可能大，亦可視需要排列成格子狀。
如上所述，注入取出用埠口3由能夠供培養基或細胞等流通之管狀之構件構成，形成注入取出用埠口3之管狀之構件例如可使用聚乙烯、聚丙烯、氯乙烯、聚苯乙烯系彈性體、FEP等熱塑性樹脂，藉由射出成形、擠出成形等成形為特定之形狀。
於使用如上之細胞培養容器1進行細胞培養時，一面維持封閉系統，一面經由連接於注入取出用埠口3之液體輸送管，將培養對象之細胞與培養基一併注入至容器本體2。然後，注入至容器本體2之細胞於培養基中沈澱而集中至各凹陷4之底部。
[細胞培養容器1之製造裝置]
其次，使用圖2及圖3，對本實施形態中之細胞培養容器之製造裝置20進行說明。
如圖2所示，細胞培養容器之製造裝置20包含按壓構件21、載置台T、加熱裝置24、及流體導入裝置26而構成。
按壓構件21具備對載置於載置台T之載置面之袋狀膜容器加壓之功能。再者，袋狀膜容器後來成為細胞培養容器1之基底，且係尚未形成有凹陷4或鼓出形狀之容器。該按壓構件21例如由鋁或鐵等金屬或塑膠等樹脂形成。如圖3所示，按壓構件21之外形例如為矩形狀，例如設定為略大於載置於上述載置面之袋狀膜容器之外形。再者，關於按壓構件21中之XY平面方向之大小，只要最低限度為具有能夠按壓上述鼓出形狀中之平坦之頂面之程度之面積即可，於例如具有於第4實施形態中說明之 約束構件29之情形時等，限制於其內側。
而且，按壓構件21與驅動機構25連接，配置成能夠經由該驅動機構25而相對於載置面進退。於下述細胞培養容器之製造時，按壓構件21對載置於載置面且導入有流體之袋狀膜容器加壓。再者，關於驅動機構25並無特別限制，可應用液壓缸機構或滾珠螺桿機構或電動馬達機構等公知之驅動機構。
載置台T係於載置袋狀膜容器之載置面形成有凹部之支持台，具備支持該袋狀膜容器之功能。再者，本實施形態之載置台T對應於上述細胞培養容器1之凹陷4而形成有多個凹部，若細胞培養容器1之凹陷4為1個，則凹部亦成為1個。即，於本實施形態之載置台T形成有1個或多個凹部。
本實施形態之載置台T由載置台本體部22及容器支持部23此2個材料構成。
載置台本體部22由熱導率低於容器支持部23之材料形成。而且，如圖2及圖3所示，於載置台本體部22之上表面設置有凹部，於該凹部內收納有容器支持部23。又，載置台本體部22亦具備當袋狀膜容器載置於載置台T時支持該袋狀膜容器之周邊之功能。換言之，載置台本體部22承擔作為支持袋狀膜容器之周邊之載置面之功能。
容器支持部23由熱導率高於載置台本體部22之材料形成。於本實施形態中，容器支持部23係使用鋁，並且載置台本體部22係使用鑄鐵。再者，亦可如下述圖16所示之例等般，載置台本體部22與容器支持部23由相同材料形成，並非一定要使熱導率不同。
如圖3所示，於容器支持部23之上表面(載置袋狀膜容器之載置面)形成有多個凹部23a。該凹部23a對應於上述細胞培養容器1之凹陷4。因此，凹部23a之開口徑可設為所有凹部23a均相同。或，亦可藉由將容器支持部23之載置面分割成多個區域，針對各個區域使凹部23a之開口徑不同等操作，而包含開口徑不同之兩種以上之凹部23a。
又，雖然將凹部23a之形狀設為球冠狀，但凹部23a之形狀並不限定於此，亦可為柱狀等。
進而，關於凹部23a之排列，亦是較佳設為如圖示般之錯位狀，使凹部23a之佔有面積儘可能大，但亦可視需要排列成格子狀。
加熱裝置24具備對載置台T及按壓構件21中之至少一者加熱之功能。本實施形態之加熱裝置24例如可例示鎳鉻合金線等電阻加熱裝置，可埋設於按壓構件21或載置台本體部22或容器支持部23。
更具體而言，本實施形態之加熱裝置24埋設於載置台本體部22之內部(參照圖2)，並且埋設於按壓構件21中之成為按壓側之底面側(參照圖3)。
其中，埋設於載置台本體部22之加熱裝置24以對應於細胞培養容器1之底面2b之方式，跨及載置台本體部22之整個表面而配置。藉此，能夠不會漏掉設置於底面2b之多個凹陷4地傳遞熱。
另一方面，埋設於按壓構件21之加熱裝置24並非廣泛地配置於按壓構件21之底面，而是配置成對應於成為上述細胞培養容器1之頂面2a之緣部之位置。藉此，能夠省去無意義之加熱，從而有效率地對必要之部位進行加熱。
流體導入裝置26具備向載置於載置台T之載置面的袋狀膜 容器之內部導入流體之功能。本實施形態中之流體導入裝置26經由上述注入取出用埠口3向袋狀膜容器之內部導入流體。再者，由流體導入裝置26導入之流體可例示液體或氣體。其中，作為流體，具體可應用純水等，另一方面，作為氣體，可應用淨化後之空氣(清潔空氣)或氮氣等非活性氣體。其中，就操作或處理之容易性之觀點而言，於本實施形態中，應用清潔空氣。
又，本實施形態之流體導入裝置26亦具備調整導入至袋狀膜容器之內部之流體之供給壓之功能。藉此，能夠於藉由按壓構件21對袋狀膜容器加壓之前後，將上述供給壓設為固定或可變。
再者，流體導入裝置26亦可具備控制流體之供給流量之功能，來代替調整上述流體之供給壓之功能。藉此，藉由控制供給至袋狀膜容器之內部之流體之流量，能夠容易地進行上述容器本體2之鼓出形狀中之突出量之控制。更具體而言，例如於使突出量較小之鼓出形狀形成於容器本體2之情形時(換言之，適於較薄之液厚(少液量)之容器)，流體導入裝置26亦能以使供給至袋狀膜容器內之流體之供給流量變少之方式進行控制。另一方面，於使突出量較大之鼓出形狀形成於容器本體2之情形時(換言之，適於較厚之液厚(大液量)之容器)，流體導入裝置26亦能以使供給至袋狀膜容器內之流體之供給流量變多之方式進行控制。
又，本實施形態之細胞培養容器之製造裝置20亦可進而包含控制裝置CP。該控制裝置CP具備控制上述加熱裝置24、驅動機構25及流體導入裝置26之動作之功能。具體而言，作為控制裝置CP，可例示具備未圖示之記憶體或CPU之電腦。再者，細胞培養容器之製造裝置20不一定 必須具備控制裝置CP，亦可經由LAN等網路自遠處之場所進行遠距操作。
[細胞培養容器1之製造方法]
其次，使用圖4及圖5，對本實施形態中之細胞培養容器之製造方法進行說明。圖4係本實施形態中之細胞培養容器之製造裝置20之狀態轉變圖，圖5係說明亦對應於圖4之狀態轉變圖之細胞培養容器之製造方法之流程圖。
首先，如圖4(a)及圖5之步驟1所示，將袋狀膜容器1'載置於形成有多個凹部23a之載置台T。此時，較佳為以使袋狀膜容器1'之周邊由載置台本體22支持之方式進行載置。
於在步驟1中載置袋狀膜容器1'之後，如圖4(b)及圖5之步驟2所示，向袋狀膜容器1'之內部導入流體。此時，於本實施形態中，流體導入裝置26以如上方式以供給壓f1供給淨化後之清潔空氣。再者，如上所述，流體導入裝置26亦可基於供給流量而非供給壓進行清潔空氣之供給動作。
繼而，如圖4(c)以及圖5之步驟3及步驟4所示，一面對載置台T及與載置於該載置台T之袋狀膜容器1'相對向之按壓構件21中之至少一者加熱，一面利用按壓構件21對所載置之袋狀膜容器1'加壓。換言之，於向袋狀膜容器1'之內部導入流體之後，使按壓構件21接近載置台T而對袋狀膜容器1'加壓。
再者，關於此時之加熱溫度，較佳為不會使袋狀膜容器1'熔融而軟化之程度之溫度，例如可設定為80℃左右。
又，步驟3與步驟4亦可不為該順序，例如亦可於利用按壓構件21對袋狀膜容器1'加壓後，藉由加熱裝置24對載置台T及按壓構件21中之至少 一者加熱。此時，於本實施形態中，流體導入裝置26以如上方式以供給壓f3供給淨化後之清潔空氣。
於本實施形態中，加熱裝置24設置於按壓構件21及載置台T該兩者。藉此，能夠利用設置於載置台T之加熱裝置24對袋狀膜容器1'中之後來成為凹陷4之區域加熱，進而，能夠利用設置於按壓構件21之加熱裝置24效率良好地對後來成為鼓出形狀之區域加熱。
於步驟3及步驟4中開始對袋狀膜容器1'加熱及加壓之後，如圖5之步驟5所示，判定是否經過了特定之時間t1。
作為該特定之時間t1，只要能形成上述凹陷4或鼓出形狀，便無特別限制，例如可設為數秒鐘~數分鐘左右。
如此，於本實施形態中，藉由使按壓構件21與載置台T相隔特定距離，並且向袋狀膜容器1'之內部導入流體，能夠於袋狀膜容器1'形成頂面突出之鼓出形狀。
再者，於該步驟3~5中，流體導入裝置26亦可於按壓構件21之上述加壓之前後調整流體之供給壓。即，因按壓構件21向袋狀膜容器1'之加壓使容器內部之壓力變高，而藉由流體導入裝置26調整流體之供給壓，能夠抑制容器內部之壓力過度地變化。換言之，流體導入裝置26亦可於控制裝置CP之控制下，以根據按壓構件21賦予之加壓力而使袋狀膜容器1'之內壓成為固定之方式，使流體之供給壓成為固定之值(設為f1=f3)。再者，流體導入裝置26亦可於控制裝置CP之控制下，以根據按壓構件21賦予之加壓力而使袋狀膜容器1'之內壓變化(增加或減少)之方式，使流體之供給壓成為可變(設為f1≠f3)。
而且，於在步驟5中判定為經過了特定之時間t1之情形時，如圖4(d)及圖5之步驟6所示，經由驅動機構25使按壓構件21退避後，取出袋狀膜容器1'而結束。於取出之袋狀膜容器1'形成有上述多個凹陷4或鼓出形狀，藉此製造本實施形態之細胞培養容器1。
≪第2實施形態≫
其次，參照圖6~8，對本發明之第2實施形態進行說明。
此處，關於第2實施形態中之細胞培養容器之製造裝置30與第1實施形態之不同點，可列舉：於容器支持部23設置有抽吸流路23b、具備抽吸裝置27、進而具備調溫裝置28等。
因此，以下，主要說明與第1實施形態之不同點，關於與第1實施形態相同之構成或具有相同功能之要素，標註與第1實施形態相同之符號，適當省略其說明(關於下述其他實施形態或變形例亦相同)。
再者，於本實施形態中，係設為具備抽吸裝置27及調溫裝置28該兩者之構成而進行說明，但並不限於該形態，只要具備至少一者即可。
如圖6所示，細胞培養容器之製造裝置30進而包含抽吸裝置27，構成為具有調溫裝置28來作為加熱裝置24之替代。
抽吸裝置27具備如下功能：於已向載置於載置台T之袋狀膜容器1'之內部導入流體時，經由形成於該載置台T之多個凹部23a而進行抽吸。又，於本實施形態之容器支持部23形成有與凹部23a連續之流路23b，該流路23b貫通載置台本體22之一部分而與抽吸裝置27連接。
而且，抽吸裝置27與未圖示之負壓源連接，可於控制裝置CP之控制下經由流路23b進行抽吸動作。藉此，當載置袋狀膜容器1'時， 凹部23a之內部成為負壓狀態，故而袋狀膜容器1'之底面(載置於容器支持部23之面)被抽吸。
因此，根據本實施形態之抽吸裝置27，能夠於「在袋狀膜容器1'之底面形成上述凹陷4」時進行輔助。
調溫裝置28不僅具備於第1實施形態中說明之加熱裝置24之功能，而且進而具備使載置台T及按壓構件21中之至少一者冷卻之冷卻裝置之功能。作為該調溫裝置28之具體例，可應用各種公知之裝置，例如可例示珀爾帖元件等。再者，調溫裝置28可應用兼具加熱功能及冷卻功能之單一之元件，亦可設為例如個別地具備鎳鉻合金線等加熱裝置及風扇等冷卻裝置之形態。
[細胞培養容器1之製造方法]
其次，使用圖7及圖8，對第2實施形態中之細胞培養容器之製造方法進行說明。圖7係本實施形態中之細胞培養容器之製造裝置30之狀態轉變圖，圖8係說明亦對應於圖7之狀態轉變圖之細胞培養容器之製造方法之流程圖。
首先，如圖7(a)及圖8之步驟1所示，於袋狀膜容器1'載置形成有多個凹部23a之載置台T。此時，較佳為以使袋狀膜容器1'之周邊由載置台本體22支持之方式進行載置。
於在步驟1中載置袋狀膜容器1'之後，如圖7(b)及圖8之步驟2所示，向袋狀膜容器1'之內部導入流體。此時，流體導入裝置26以供給壓f1供給淨化後之清潔空氣。
繼而，如圖7(c)以及圖8之步驟3~步驟5所示，對載置 台T及按壓構件21中之至少一者加熱，利用按壓構件21對袋狀膜容器1'加壓，進而，經由載置台T之凹部23a進行抽吸。
此時，作為利用調溫裝置28(加熱裝置)之加熱溫度，較佳為不會使袋狀膜容器1'熔融而軟化之程度之溫度，例如可設定為80℃左右。
又，按壓構件21係以加壓力F之大小對袋狀膜容器1'加壓，抽吸裝置27係以抽吸力f2之大小進行抽吸。即，於本實施形態中，於已向載置於載置台T之袋狀膜容器1'之內部導入流體時，經由形成於載置台T之多個凹部23a進行抽吸動作。
如此，對袋狀膜容器1'施加利用按壓構件21造成之加壓力F及利用抽吸裝置27造成之抽吸力f2，控制裝置CP進行如下控制：以使袋狀膜容器1'之內壓略微上升之方式，調整流體導入裝置26之供給壓(該情形時，f1<f3之關係成立)。藉此，亦抑制對袋狀膜容器1'之內部施加過度之壓力。再者，與第1實施形態同樣地，控制裝置CP亦可進行使流體導入裝置26之供給壓成為固定之值(即，f1=f3)或減少之控制。
又，步驟3~步驟5未必要為該順序，只要使該等步驟至少於一時期並行，則可同時進行，亦可適當改變順序。
於步驟3~步驟5開始後，如圖8之步驟6所示，判定是否經過了特定之時間t1。
作為該特定之時間t1，只要能形成上述凹陷4或鼓出形狀，便無特別限制，例如亦可為數秒鐘~數分鐘左右。
而且，於在步驟5中判定為經過了特定之時間t1之情形時，如圖7(d)及圖8之步驟7所示，使載置台T及按壓構件21中之至少一者 冷卻。更具體而言，調溫裝置28作為冷卻裝置而發揮功能，作為上述加熱裝置，對加熱之區域執行冷卻之動作。又，關於調溫裝置28之冷卻溫度，無特別限制，較理想為會使成形中軟化之膜固化之程度之溫度，可例示：若進行加熱至80℃左右，則例如冷卻至50℃左右。
再者，當調溫裝置28進行上述冷卻動作時，並行地執行利用按壓構件21之加壓動作、利用流體導入裝置26之流體之導入動作、及利用抽吸裝置27之抽吸動作。
藉此，於袋狀膜容器1'中後來成為凹陷4或鼓出形狀之部位在成形時即被冷卻固化。因此，根據本實施形態，當成形結束而進行脫模時能夠防止容器形狀之變形，能夠更確實地於細胞培養容器1形成凹陷4或鼓出形狀。
於步驟7開始後，如圖8之步驟8所示，判定是否經過了特定之時間t2。
再者，該步驟8中之判定係根據袋狀膜容器1'之溫度是否達到了固化溫度此基準而進行。因此，該特定之時間t2可例如由「對到達上述固化溫度之時間加上略微之餘裕後之時間」而決定，只要能形成上述凹陷4或鼓出形狀，便無特別限制，例如亦可為數秒鐘~數分鐘左右。
而且，於在步驟8中判定為經過了特定之時間t2之情形時，如圖7(e)及圖8之步驟9所示，經由驅動機構25使按壓構件21退避後，取出袋狀膜容器1'而結束。於取出之袋狀膜容器1'形成有上述多個凹陷4或鼓出形狀，藉此製造本實施形態之細胞培養容器1。
≪第3實施形態≫
其次，參照圖9，對本發明之第3實施形態進行說明。
此處，關於第3實施形態中之細胞培養容器之製造裝置40與第1實施形態之不同點，可列舉：未搭載容器支持部23之載置台本體22係載置台T、形成於該載置台T之凹部成為貫通的孔等。再者，於本實施形態中，形成於載置台T之孔亦可不一定為貫通孔。
即，圖9所示之細胞培養容器之製造裝置40包含形成有多個貫通孔22a之載置台本體22而構成。其中，貫通孔22a對應於第1實施形態中之凹部23a，成為自載置台本體22之載置面(載置袋狀膜容器1'之面)跨及相反側之底面而貫通之形狀。如此，於本發明中，形成於載置袋狀膜容器1'之載置面之凹部並不限於未貫通至下方之形狀，亦可如本實施形態般，形成貫通之孔而存在。
≪第4實施形態≫
其次，參照圖10~13，對本發明之第4實施形態進行說明。
此處，關於第4實施形態中之細胞培養容器之製造裝置50與第1實施形態之不同點，可列舉個點等：具有約束構件29，一面利用約束構件29約束袋狀膜容器1'之周邊，一面利用流體導入裝置26向袋狀膜容器1'之內部導入流體。
又，第4實施形態中之細胞培養容器1之特徵亦在於以下方面：形成有凹陷4之底面呈平面狀，另一方面，頂面具備突出之鼓出形狀。再者，本實施形態中之「平面狀」係指於X方向及Y方向上為平面，且係指與XY平面平行之單一之面。
即，如圖10所示，本實施形態中之細胞培養容器之製造裝置50包含約束袋狀膜容器1'之周邊之約束構件29而構成。該約束構件29 與載置面相對向地配置，具備約束載置於該載置面之袋狀膜容器1'之周邊之功能。又，約束構件29藉由驅動機構25，能夠與按壓構件21獨立地朝載置台T下降。
再者，約束構件29與按壓構件21未必得獨立地下降，例如亦可經由彈簧使約束構件29與驅動機構25連接，而與按壓構件21一起下降。
又，亦可於載置台本體22中之與約束構件29相對向之區域形成凹部，於該凹部內配置岩絨或聚胺酯樹脂等隔熱材料。
如圖11所示，本實施形態之約束構件29係以與袋狀膜容器1'之周邊相對向之方式，設置於按壓構件21之周圍。於本實施形態中，約束構件29分離成4個，其中一個(圖11中之左端之約束構件)具有對應於注入取出用埠口3之外形之形狀。藉此，分離之約束構件29之各者能夠約束袋狀膜容器1'之周邊。
再者，約束構件29之材質並無限制，例如可例示鋁或鐵等金屬材料。又，約束構件29較理想為由熱導率低於按壓構件21之材料構成，以儘可能不會自按壓構件21傳遞熱。又，約束構件29亦可不一定要分離成4個，例如亦可如使用圖15於下文所述般設為全周連接在一起之一體構造，亦可設為將4個中之若干個連接在一起之構造。
[細胞培養容器1之製造方法]
其次，使用圖12及圖13，對第4實施形態中之細胞培養容器之製造方法進行說明。圖12係本實施形態中之細胞培養容器之製造裝置50之狀態轉變圖，圖13係說明亦對應於圖12之狀態轉變圖之細胞培養容器之製造方法 之流程圖。
首先，如圖12(a)及圖13之步驟1所示，將袋狀膜容器1'載置於形成有多個凹部23a之載置台T。此時，較佳為以使袋狀膜容器1'之周邊受載置台本體22支持之方式進行載置。
於在步驟1中載置袋狀膜容器1'之後，如圖12(b)及圖13之步驟2所示，使約束構件29朝載置台T下降，約束袋狀膜容器1'之周邊。
繼而，如圖12(c)及圖13之步驟3所示，藉由流體導入裝置26向袋狀膜容器1'之內部導入流體。此時，利用約束構件29約束袋狀膜容器1'之周邊，並向載置於載置台T之袋狀膜容器1'之內部導入流體。於本實施形態中，流體導入裝置26亦以供給壓f1供給淨化後之清潔空氣。
繼而，如圖12(d)以及圖13之步驟4~步驟6所示，對載置台T及按壓構件21中之至少一者加熱，利用按壓構件21對袋狀膜容器1'加壓，進而經由載置台T之凹部23a進行抽吸。
此時，作為由加熱裝置24所生成之加熱溫度，較佳為不會使袋狀膜容器1'熔融而軟化之程度之溫度，例如可設定為80℃左右。
又，按壓構件21係以加壓力F之大小對袋狀膜容器1'加壓，抽吸裝置27係以抽吸力f2之大小進行抽吸。
如此，對袋狀膜容器1'施加利用按壓構件21造成之壓力F且利用抽吸裝置27造成之抽吸力f2，控制裝置CP係以如下方式進行控制：使流體導入裝置26之供給壓自f1變化至f3，以使袋狀膜容器1'之內壓略微降低(該情形時，f1>f3之關係成立)。藉此，亦能抑制對袋狀膜容器1'之內部施加過度之壓力。再者，控制裝置CP亦能夠以使袋狀膜容器1'之內壓 為固定(即，f1=f3)或略微上升之方式控制流體導入裝置26之供給壓。
又，步驟4~步驟6亦可不為該順序，只要使該等步驟至少於一時期並行，則可同時進行，亦可適當改變順序。
於步驟4~步驟6開始後，如圖13之步驟7所示，判定是否經過了特定之時間t1。
作為該特定之時間t1，只要能形成上述凹陷4或鼓出形狀，便無特別限制，例如可設為數秒鐘~數分鐘左右。
而且，於在步驟7中判定為經過了特定之時間t1之情形時，如圖12(e)及圖13之步驟8所示，經由驅動機構25使按壓構件21退避後，取出袋狀膜容器1'而結束。於取出之袋狀膜容器1'中，於平面狀之底面形成有多個凹陷4，並且亦形成有頂面突出之鼓出形狀，藉此完成本實施形態之細胞培養容器1。
上述第1實施形態~第4實施形態可於不脫離本發明之主旨之範圍內進行各種變形。以下，對可適當應用於上述第1實施形態~第4實施形態之變形例進行說明。
<變形例1>
圖14係表示變形例1之細胞培養容器之製造裝置60之概略構成之示意圖。
上文所說明之各實施形態之加熱裝置24或調溫裝置28設置於按壓構件21及載置台T該兩者。然而，本發明並不限定於該形態，加熱裝置24(或調溫裝置28)亦可設置於按壓構件21及載置台T中之至少一者。
即，如圖14所示，細胞培養容器之製造裝置60成為如下形 態：加熱裝置24並未埋設於按壓構件21，加熱裝置24埋設於容器支持部23。當然，於本變形例1中，亦可成為如下形態：加熱裝置24埋設於按壓構件21，加熱裝置24並未埋設於容器支持部23。
<變形例2>
圖15係表示變形例2之約束構件29及加熱裝置24之概略構成之示意圖。於上述圖11所說明之實施形態中，約束構件29成為分離成多個之形態，埋設於按壓構件21之加熱裝置24亦成為分離成多個之形態。
然而，本發明並不限定於該態樣，如圖15所示，約束構件29亦可成為像是包圍按壓構件21之周圍般連續之形狀。
又，關於埋設於按壓構件21之加熱裝置24，亦可對應於「袋狀膜容器1'中之成為細胞培養容器1之頂面2a之緣部之位置」而成為圈狀(環狀)之形態。
再者，如該圖所示，約束構件29與按壓構件21之間隙較佳為儘可能窄。其原因在於：若該間隙較大，則當向袋狀膜容器1'之內部注入流體(空氣等)時，於該間隙部分膜會延伸。因此，就此種觀點而言，可插入按壓構件21之約束構件29之內孔之直徑較理想為儘可能靠近按壓構件21之外緣(即，袋狀膜容器1'之邊界)，並且角部亦與按壓構件21之角部同樣地呈R狀。
<變形例3>
圖16係表示變形例3之載置台T之概略構成之示意圖。
於上文所說明之第1、第2及第4實施形態中，係由載置台本體22及容器支持部23構成載置台T。然而，本發明並不限定於該態樣，例如亦可 於載置台本體22之上表面形成對應於上述凹部23a之凹部22b，並且形成隔熱槽22a。
即，載置台T亦可由載置台本體22構成。再者，隔熱槽22a之寬度或深度並無特別限制，例如可將寬度設為1~5mm，將深度設為5~10mm左右。
而且，當製造細胞培養容器1時，例如亦可將袋狀膜容器1'之周邊載置於較隔熱槽22a更靠外側之區域，進而，將袋狀膜容器1'之剩餘部(後來形成凹陷4之區域)載置於隔熱槽22a之內側之區域。
藉此，於凹部22b側之區域產生之熱被隔熱槽22a遮斷，從而抑制其到達袋狀膜容器1'之周邊。
再者，例如於並不怎麼需要考慮對袋狀膜容器1'之周邊之熱影響之情形時，隔熱槽22a並非必需，亦可適當將其省略。
≪第5實施形態≫
[細胞培養容器10]
圖17係表示本發明之第5實施形態之細胞培養容器10之外觀立體圖。
細胞培養容器10係以膜基底之軟包材料為材料且形成為袋狀之具有可撓性之細胞培養用容器。該細胞培養容器10具有適於細胞培養之透氣性，並且較佳為其一部分或全部具有透明性，以便能夠確認內容物。
此種細胞培養容器10至少包含第1容器壁11、第2容器壁12、及埠口13而構成。又，細胞培養容器10之外形較佳設為例如於X方向上為20~1000mm，於Y方向上為20~1000mm之長方形狀。
第1容器壁11由具有透氣性且成為底面之平面狀之膜構 成。而且，如圖18所示，本實施形態之第1容器壁11較佳為例如具有30~200μm之厚度z1。此處，本實施形態中之「底面」係指細胞培養容器10載置於載置台等時成為底之面，且係指與下述第2容器壁12相比，於Z方向上成為下側之面。又，本實施形態中之「平面狀」係指於X方向及Y方向上為平面，且係指與XY平面平行之單一之面。
關於該第1容器壁11所具備之透氣性，依據JIS K 7126之透氣度試驗方法，較佳為於試驗溫度37℃下測定之氧之穿透度為5000mL/(m2‧day‧atm)以上。
又，構成第1容器壁11之膜較佳為一部分或全部具有透明性，以便能夠確認細胞培養之進行狀況或細胞之狀態等。作為用於此種膜之材料，只要具有上述透氣性，便無特別限定。例如可列舉：聚乙烯、聚丙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚酯、矽酮系彈性體、聚苯乙烯系彈性體、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物(FEP)等熱塑性樹脂。其等可使用單層，亦可將同種或異種之材料積層使用，若考慮密封周邊部時之熱熔性，則較佳為具有作為密封層而發揮功能之層。
又，如該圖所示，第1容器壁11具有周緣部11a及中央部11b而構成。其中，周緣部11a係與下述第2容器壁12之周緣部12a相對向之區域。又，中央部11b係較上述周緣部11a更靠內側之區域，且係形成下述培養空間S之區域。
第2容器壁12具有鼓出形狀12z，該鼓出形狀12z接觸於第1容器壁11之周緣部11a並且於較該周緣部11a更內側處相對於第1容器壁11而突出。此種第2容器壁12與第1容器壁11同樣地，由具有透氣性之 膜構成。
更具體而言，關於第2容器壁12所具備之透氣性，依據JIS K 7126之透氣度試驗方法，較佳為於試驗溫度37℃下測定之氧之穿透度為5000mL/(m2‧day‧atm)以上。即，第2容器壁12之透氣性亦可設定為與第1容器壁11之透氣性相等。又，構成第2容器壁12之膜較佳為一部分或全部具有透明性，以便能夠確認細胞培養之進行狀況或細胞之狀態等，進而，亦可由與第1容器壁11相同之材料構成。
又，如圖18所示，本實施形態之第2容器壁12較佳為例如具有30~200μm之厚度z2者。即，第2容器壁12之厚度z2亦可設定為與第1容器壁11之厚度z1相等。換言之，亦可使第1容器壁11與第2容器壁12之厚度比實質上成為1。
該第2容器壁12具有周緣部12a、上升部12b、及中央部12c而構成。其中，周緣部12a係與第1容器壁11之周緣部11a接觸之區域。又，中央部12c係較下述上升部12b更靠內側之區域，且係於Z方向上與中央部11b隔著相當於形成培養空間S之所欲之高度而配置之區域。上升部12b係以使中央部12c與第1容器壁11相隔之方式自第1容器壁11上升之區域。
再者，於本實施形態中，第1容器壁11之周緣部11a與第2容器壁12之周緣部12a亦可相互藉由熱熔接而密封，藉此，能更確實地確保培養空間S之密閉性。然而，並不限定於該態樣，例如亦可為經由公知之黏著劑使第1容器壁11之周緣部11a與第2容器壁12之周緣部12a固定之態樣。
又，於儘可能較寬地確保培養液之液厚均一且平坦之培養面之思想下，上升部12b之寬度越窄越佳，周緣部之密封區域之寬度亦越窄越佳。
於本實施形態中，由上述上升部12b及中央部12c形成台地狀地鼓出之鼓出形狀12z，於該鼓出形狀12z之內部形成有培養空間S。再者，培養空間S之Z方向上之高度並無特別限制，只要以成為對應於培養之細胞之狀態之適當之液厚之方式適當設定即可，雖然亦取決於培養容器之大小，但例如可設為數mm~數十mm。
再者，如圖18或圖19所示，中央部12c亦可為平面。換言之，第2容器壁12中之形成培養空間之頂面(中央部12c)較佳為平面狀。又，第2容器壁12之上升部12b係如下所述藉由加熱使膜變形成台地狀之一部分之區域，亦可使硬度高於中央部12c。換言之，亦可將第2容器壁12中之形成鼓出形狀12z之上升部12b之硬度設定為高於鼓出形狀12z中之與上升部12b不同之區域(中央部12c)之硬度。進而，亦可將中央部12c之硬度設定為等於中央部11b之硬度。換言之，亦可將第2容器壁12之中央部12c之硬度設定為實質上等於與該中央部12c對向之第1容器壁11之中央部11b之硬度。
如圖18及圖19所示，埠口13係與由第1容器壁11及第2容器壁12包圍之培養空間S連通之構件。埠口13係能夠流通培養基或細胞等之管狀之構件。埠口13例如係使用聚乙烯、聚丙烯、氯乙烯、聚苯乙烯系彈性體、FEP等熱塑性樹脂，藉由射出成形或擠出成形等成形為特定之形狀。
再者，為了避免因第2容器壁12之中央部12c與第1容器 壁11之中央部11b貼附而堵住埠口13，亦可於埠口13設置自其基端突出至培養空間S內之防埠口堵塞片。於設置此種防埠口堵塞片之情形時，較佳為以使防埠口堵塞片位於培養空間S側之中央部12c側之方式進行設置，以便不會妨礙存在於第1容器壁11中之中央部11b之表面之細胞。
又，於本實施形態中，亦能以如下方式構成：將埠口13之剖面設為半圓狀，使該埠口13中之與第1容器壁11接觸之面成為平面狀，並且使與第2容器壁12接觸之面成為曲面狀。
藉此，抑制於埠口13及第2容器壁12之間產生間隙，從而防止培養液自培養空間S漏出。
又，於本實施形態中，較佳為至少第1容器壁11之表面與第2容器壁12之頂面相互平行。藉此，能夠較大地確保培養空間S，即便為相對少量之培養液，亦能夠使培養液有效率地遍及培養空間S之各個角落。
而且，進而較佳為，如圖19所示，亦可使第1容器壁11之表面、第2容器壁12之頂面(中央部12c)及埠口13之底面相互平行。換言之，較佳為本實施形態之埠口13之底面(與第1容器壁11接觸之接觸面)與第1容器壁11之表面為同一平面。藉此，能夠使相對少量之培養液進一步有效率地遍及培養空間S之各個角落。
[細胞培養容器10之製造方法及細胞培養容器10之製造裝置]
其次，使用圖20，對本實施形態中之細胞培養容器10之製造方法及製造裝置進行說明。
即，細胞培養容器10係使用包含以下分別說明之按壓構件71、約束構件72、載置台73、加熱裝置74及流體導入裝置75之細胞培養容器之製造裝置70，經由以下所示之各步驟而製造。
首先，如圖20(a)所示，於使「由具有透氣性之膜構成之第1容器壁11」及「與該第1容器壁11相對向地配置之第2容器壁12」重疊之狀態下，將第1容器壁11載置於載置台73。此時，第1容器壁11之周緣部11a與第2容器壁12之周緣部12a較佳為例如藉由熱熔接而密封。
又，較佳為，於第1容器壁11及第2容器壁12之端部設置有上述埠口13。將該圖20(a)所示之第1容器壁11、第2容器壁12及埠口13之集合體作為完成前之細胞培養容器並記載為基底體10'。
於將第1容器壁11載置於載置台73之後，如圖20(b)所示，於第2容器壁12之中央部12c敞開之狀態(未經按壓之狀態)下，利用約束構件72按壓並約束第2容器壁12之周緣部12a。如此，約束構件72係與載置台73相對向地配置，具有約束載置於該載置台73之第2容器壁12之周邊的功能。
再者，只要能夠約束上述周緣部12a，約束構件72之形狀並無特別限制，較佳為既不會過度又不會不足地約束第2容器壁12之周緣之形狀，進而較理想為約束亦包含相當於R1之區域之所有周緣4邊之形狀。又，於本實施形態中，係使用約束構件72進行約束，但只要能確保第1容器壁11之平坦性，亦可適當省略約束構件72。
於利用約束構件72約束第2容器壁12之周緣部12a之後，如圖20(c)所示，於利用約束構件72按壓上述周緣部之狀態下，使用流 體導入裝置75向第1容器壁11及第2容器壁12之間導入流體。再者，於本實施形態中，係經由埠口13向基底體10'之內部(第1容器壁11與第2容器壁12之間之空間)導入流體。如此，於本實施形態中，係一面利用約束構件72約束第2容器壁12，一面利用流體導入裝置75向第1容器壁11與第2容器壁12之間之空間導入流體。
於本實施形態中藉由流體導入裝置75導入之流體為液體或氣體。作為流體，可例示純水等，作為氣體，可例示清潔空氣或氮氣等惰性氣體。其中，就操作或處理之容易性之觀點而言，於本實施形態中應用清潔空氣。
於向基底體10'之內部導入流體後，如圖20(d)所示，使按壓構件71下降至與載置台73相隔特定距離之位置，一面利用按壓構件71按壓第2容器壁12之中央部12c，一面藉由加熱裝置74至少對該按壓構件71加熱。此時，上述特定距離成為細胞培養容器10之鼓出形狀12z之大小(高度)。如此，按壓構件71配置成能夠相對於載置台73進退，具有對「在第1容器壁11與第2容器壁12之間之空間導入有流體之第2容器壁12」加壓之功能。
再者，作為本實施形態之加熱裝置74，例如可列舉鎳鉻合金線等公知之電阻加熱手段等，典型地，可於按壓構件71之內部設置該加熱裝置74。又，亦可設為於載置台73之內部設置加熱裝置74之態樣，亦可為加熱裝置74對載置台73及按壓構件71中之至少一者加熱之態樣。
又，關於加熱裝置74對按壓構件71加熱之溫度，係考慮用於第1容器壁等之膜之耐熱溫度而決定，較佳為使該膜軟化之程度之加熱 (例如80℃左右)。藉由使用該按壓構件71之加熱，形成上述鼓出形狀12z。再者，當利用按壓構件71進行加熱時，亦可於該按壓構件71中之特定之區域(避開與第2容器壁12之中央部12c相對向之區域並且與第2容器壁12之周緣部12b相對向之區域)配置加熱手段(例如鎳鉻合金線等電阻加熱裝置)。藉此，能抑制硬化至第2容器壁12中之未必需要形成鼓出形狀12z之區域。
又，當利用加熱至所欲之溫度之按壓構件71按壓第2容器壁12時，較佳為以使基底體10'之內部(後來成為培養空間S)之內壓成為固定之方式，藉由流體導入裝置75調整導入至基底體10'之內部之流體之供給壓。藉此，抑制對基底體10'之內部施加過度之壓力，從而防止膜之延展或密封之破壞等。
再者，除了按壓構件71等，亦可進而具備冷卻裝置，於對按壓構件71加熱後且正按壓第2容器壁12時，使用該冷卻裝置使按壓構件71冷卻。
於利用加熱至所欲之溫度之按壓構件71按壓第2容器壁12而經過特定時間之後，如圖20(e)所示，藉由使按壓構件71及約束構件72相對於載置台73退避，並且取出完成之細胞培養容器10而結束。再者，較佳為於使按壓構件71及約束構件72相對於載置台73而退避之前，對細胞培養容器10之埠口13進行密封。藉此，抑制異物等不慎侵入至培養空間S。
<平面狀之底面及鼓出形狀所具有之意義>
先前之細胞培養容器亦經常見到僅成為細胞培養面之底面之一部分平坦的形狀，但絲毫沒有最大限度地確保細胞培養面之思想，進而，亦完全沒有提及確保培養空間中之培養液之均質擴散性這一課題或該構成之教 示。更具體而言，如圖21(b)所示之藉由先前之方法而製造之細胞培養容器於平面方向(XY平面)上無法使培養液均勻地擴展，培養液未遍及容器之角落部分，故而無法成為良好之培養空間。又，於高度方向(Z方向)上亦有翹曲，故而於整個面發生培養液之濃淡不均。
與此相對，顯然，圖21(a)所示之本實施形態之細胞培養容器無論於上述平面方向上，或是於高度方向上，培養液皆均勻且均質地擴展。如此，藉由本實施形態而製造之細胞培養容器10即便於只能使用相對少量之培養液之情形時，亦能夠使培養液對於成為培養面之第1容器壁11之中央部11b均一地遍及各個角落。因此，根據本實施形態，能夠最大限度效率良好地使用昂貴之培養液，進而能夠抑制污染風險並且更確實地培養珍貴之細胞。
而且，使用此種本實施形態之細胞培養容器之細胞培養方法係使用上述細胞培養容器10之細胞培養方法，其特徵在於：以使第1容器壁11相對於第2容器壁12成為下方之方式載置第1容器壁，並經由埠口13注入細胞及培養液。此時，細胞培養容器10較佳為載置於調整為適當之溫度(例如37℃)、二氧化碳濃度(例如5~10%CO2濃度)、及濕度(例如約95%)之細胞培養裝置(CO2培養箱)內之載置面。
藉此，藉由成為底面之第1容器壁能夠確保廣範圍且平坦之培養面，並且即便為少量之培養液，亦能夠藉由具有鼓出形狀之第2容器壁而遍及培養面之各個角落。
再者，於上述實施形態中，係以iPS細胞等黏著細胞為例進行了說明，但本發明並不限於該例。即，本發明亦可應用於適合造血細胞或腹水細胞 等懸浮細胞之培養容器或其製造方法及製造裝置、以及細胞培養方法。其原因在於：實際上，於懸浮細胞之靜置培養中，亦存在欲使細胞廣範圍且均一地分佈之需求，黏著細胞於播種後至沈澱且黏著於底面之前，亦呈與懸浮細胞大致相同之態樣。
上述第5實施形態可於不脫離本發明之主旨之範圍內進行各種變形。以下，對可適當應用於第5實施形態之變形例進行說明。
<變形例4>
圖22係於第5實施形態中說明之埠口13之變形例。
上文所說明之第5實施形態之埠口13與第2容器壁12相接之面(上表面)為曲面，但本發明並不限於該態樣，可採用各種埠口之形狀。
例如亦可如圖22(a)所示之埠口14般，使與第2容器壁12相接之面(該例中係上表面14a1及側面14a2)為平面。換言之，埠口14亦可成為如下構造：於在Y方向延伸之長方體狀之本體14a附加有注入取出口14b。
又，亦可如圖22(b)所示之埠口15般，使與第2容器壁12相接之面(該例中係斜面15a1及斜面15a2)為平面。換言之，埠口15亦可成為如下構造：於在Y方向延伸之三角柱狀之本體15a附加有注入取出口15b。
<變形例5>
圖23係於第5實施形態中說明之埠口13之另一變形例。
即，於上述第5實施形態及變形例4中說明之埠口之底面均成為平面狀，第1容器壁11中之與埠口接觸之區域(與埠口接觸之周緣部11a)之 外表面係和與該埠口接觸之區域以外之外表面為同一平面。
然而，本發明並不限於該態樣，如圖23所示，第1容器壁11只要至少於與埠口接觸之區域以外成為平面狀即可。
即，於本變形例5中，係使用具有普通舟形之形狀(剖面如杏仁般之形狀)之埠口13，該埠口13之底面並非平面狀，而成為朝下呈凸狀之曲面。於使用此種形狀之埠口13之情形時，如圖23所示，第1容器壁11中之與埠口13接觸之區域沿埠口13之形狀而成為朝下呈凸狀之曲面。
此種情形時，第1容器壁11於與埠口13接觸之區域以外亦成為平面狀，故而能夠發揮上述本發明之效果。
再者，於上文中係以細胞培養之用途而進行了說明，但本發明之容器亦可用於例如欲以儘可能平坦之面為底面而儲存液體等之情形時等細胞培養用途以外之其他用途。
又，於上述變形例4及變形例5中說明之埠口13~15亦可適當應用於上述第1實施形態~第4實施形態或第1變形例~第3變形例中。
<其他變形例>
於上述第1實施形態~第4實施形態或變形例1~變形例3中，係對將設置於載置台T之凹部23a(或凹部22a)之排列設為錯位狀或格子狀之例進行了說明，但並不限定於此。
即，亦能以使最終製造之細胞培養容器1中之多個凹陷4規則地排列而形成特定之圖案(裝飾圖樣或幾何圖案、或者文字、圖形、記號等)之方式，於載置台T形成多個凹部。
又，於上述各實施形態或各變形例中，係將袋狀膜容器1' 用作培養細胞之容器，但並不限定於此。即，自本發明之袋狀膜容器1'製造之附有凹陷之容器亦可用於例如保存食品或藥品之容器等其他用途。而且，只要該凹陷呈上述特定之圖案，便能夠實現具有設計性較高之價值之容器。
進而，於上述各實施形態或各變形例中，細胞培養容器之製造裝置亦可包含相機(攝像元件)等觀察裝置(未圖示)。例如，於第3實施形態中，亦可將觀察是否形成了袋狀膜容器1'之凹陷之觀察裝置設置於載置台T。
如此，只要將CCD元件等配置於設在載置台T上之多個孔，便能夠觀察利用按壓構件21對袋狀膜容器1'加壓時之情況。此時，只要於載置台T之至少1個孔內配置CCD元件即可，無需設置於所有孔。
如此，基於利用上述觀察裝置之觀察結果，能夠控制按壓構件21或流體導入裝置26之動作。藉此，能夠藉由按壓構件21，不會過度亦不會不足地對袋狀膜容器1'加壓。或者是，藉此，能夠藉由流體導入裝置26，不會過度亦不會不足地以適當之供給壓向袋狀膜容器1'內導入流體。進而，亦能夠基於上述觀察裝置之觀察結果，調節形成於袋狀膜容器1'之凹陷之大小。
再者，上述觀察裝置並非必須配置於載置台T側，例如若利用玻璃或耐熱性塑膠等透明材料形成按壓構件21，則亦可設置於按壓構件21側。
進而，若利用上述透明材料形成載置台T，則能夠自載置台T之外側觀察該載置台T之內部(凹部之情況)，故而亦能夠將上述觀察裝置配置於 載置台T或按壓構件21之側方或斜方。
又，例如於第5實施形態中，亦可將觀察是否形成了第2容器壁12之鼓出形狀12z之觀察裝置設置於按壓構件71。藉此，能夠藉由按壓構件71形成適當之鼓出形狀12z。
再者，該第5實施形態中之觀察裝置之設置部位並不限於按壓構件71側，例如亦可設置於載置台73之側方或斜方等其他部位。
[產業上之可利用性]
本發明能夠用作效率良好地培養各種細胞之技術、或製造保存性較佳且具有設計性較高之價值之容器之技術。
1‧‧‧細胞培養容器
1'‧‧‧袋狀膜容器
21‧‧‧按壓構件
22‧‧‧載置台本體
23‧‧‧容器支持部
23a‧‧‧凹部
24‧‧‧加熱裝置
f1、f3‧‧‧供給壓
F‧‧‧加壓力
Y‧‧‧Y方向
Z‧‧‧Z方向

Claims (20)

  1. 一種容器之製造方法，其包含如下步驟：將袋狀膜容器載置於形成有凹部之載置台；向所載置之上述袋狀膜容器之內部導入流體；及一面對上述載置台及與載置於上述載置台之上述袋狀膜容器相對向之按壓構件中之至少一者加熱，一面利用上述按壓構件對所載置之上述袋狀膜容器加壓。
  2. 如申請專利範圍第1項之容器之製造方法，其中，利用約束構件約束上述袋狀膜容器之周邊，並向載置於上述載置台之上述袋狀膜容器之內部導入流體。
  3. 如申請專利範圍第2項之容器之製造方法，其中，於上述載置台中之與上述約束構件相對向之部位，形成有隔熱區域。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之容器之製造方法，其中，藉由使上述按壓構件與上述載置台相隔特定距離，並且向上述袋狀膜容器之內部導入流體，從而於上述袋狀膜容器形成頂面突出之鼓出形狀。
  5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之容器之製造方法，其進而具有如下步驟：當已向載置於上述載置台之上述袋狀膜容器之內部導入上述流體時，經由形成於上述載置台之上述凹部而抽吸。
  6. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之容器之製造方法，其進而具有如下步驟：於對上述袋狀膜容器加熱後，使上述載置台及上述按壓構件中之至少一者冷卻。
  7. 一種容器之製造裝置，其包含： 載置台，其於載置袋狀膜容器之載置面形成有凹部；流體導入裝置，其向載置於上述載置面之上述袋狀膜容器之內部導入流體；按壓構件，其配置成能夠相對於上述載置面進退，對導入有上述流體之上述袋狀膜容器加壓；及加熱裝置，其對上述載置台及上述按壓構件中之至少一者加熱。
  8. 如申請專利範圍第7項之容器之製造裝置，其進而具備約束構件，該約束構件與上述載置面相對向地配置，約束載置於該載置面之上述袋狀膜容器之周邊，且一面利用上述約束構件約束上述袋狀膜容器之周邊部，一面利用上述流體導入裝置向上述袋狀膜容器之內部導入流體。
  9. 如申請專利範圍第7項之容器之製造裝置，其進而具備抽吸裝置，該抽吸裝置於已向載置於上述載置台之上述袋狀膜容器之內部導入上述流體時，經由形成於上述載置台之上述凹部而抽吸。
  10. 如申請專利範圍第7至9項中任一項之容器之製造裝置，其進而具備冷卻裝置，該冷卻裝置於利用上述加熱裝置進行加熱之後，使上述載置台及上述按壓構件中之至少一者冷卻。
  11. 一種細胞培養容器，其包含：第1容器壁，其具有透氣性且為底面；第2容器壁，其具有鼓出形狀，該鼓出形狀接觸於上述第1容器壁之周緣部並且於較上述周緣部更內側處相對於上述第1容器壁而突出；及 埠口，其與由上述第1容器壁及上述第2容器壁之鼓出形狀包圍之培養空間連通；且上述第1容器壁至少於與上述埠口接觸之區域以外呈平面狀。
  12. 如申請專利範圍第11項之細胞培養容器，其中，上述第2容器壁中之形成上述培養空間之頂面為平面狀。
  13. 如申請專利範圍第11項之細胞培養容器，其中，上述第1容器壁與上述第2容器壁之厚度比實質上為1。
  14. 如申請專利範圍第11項之細胞培養容器，其中，上述第2容器壁係具有透氣性之膜，且上述第1容器壁之透氣性與上述第2容器壁之透氣性實質上相等。
  15. 如申請專利範圍第14項之細胞培養容器，其中，上述第1容器壁與2容器壁係由相同材料構成。
  16. 如申請專利範圍第11至15項中任一項之細胞培養容器，其中，上述第1容器壁之表面與上述第2容器壁之頂面相互平行。
  17. 如申請專利範圍第11至15項中任一項之細胞培養容器，其中，上述埠口中之與上述第1容器壁接觸之接觸面與上述第1容器壁之表面為同一平面。
  18. 一種細胞培養方法，其使用申請專利範圍第11項之細胞培養容器，且：以使上述第1容器壁相對於上述第2容器壁成為下方之方式載置上述第1容器壁，並經由上述埠口注入細胞及培養液。
  19. 一種細胞培養容器之製造方法，其具有如下步驟：於使由具有透氣性之膜構成之第1容器壁及與上述第1容器壁相對 向地配置之第2容器壁重疊之狀態下，將上述第1容器壁載置於載置台；於上述第2容器壁之中央部敞開之狀態下，利用約束構件按壓上述第1容器壁及上述第2容器壁之周緣部；於利用上述約束構件按壓上述周緣部之狀態下，向上述第1容器壁與上述第2容器壁之間導入流體；及一面利用按壓構件按壓上述第2容器壁之中央部，一面至少對上述按壓構件加熱。
  20. 一種細胞培養容器之製造裝置，其包含由平面狀之膜構成之第1容器壁、及具有接觸於上述第1容器壁之周緣部並且相對於上述第1容器壁而突出之鼓出形狀之第2容器壁，其特徵在於包含：載置台，其載置上述第1容器壁；流體導入裝置，其向載置於上述載置台之上述第1容器壁與上述第2容器壁之間之空間導入流體；按壓構件，其配置成能夠相對於上述載置台進退，對在上述空間導入有上述流體之上述第2容器壁加壓；加熱裝置，其對上述按壓構件加熱；及約束構件，其與上述載置台相對向地配置，約束載置於該載置台之上述第2容器壁之周邊；且一面利用上述約束構件約束上述第2容器壁，一面利用上述加熱裝置對上述按壓構件加熱，並且利用上述流體導入裝置向上述第1容器壁與上述第2容器壁之間之空間導入上述流體。
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