TW201734038A - 靶向表皮生長因子受體變異體ｉｉｉ之嵌合型抗原受體 - Google Patents

靶向表皮生長因子受體變異體ｉｉｉ之嵌合型抗原受體 Download PDF

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Abstract

本發明提供特異性結合表皮生長因子受體變異體III(EGFRvIII)之嵌合型抗原受體(CAR)。本發明進一步關於包含該等CAR之經工程處理之免疫細胞、編碼CAR之核酸及製造該等CAR、經工程處理之免疫細胞和核酸之方法。本發明進一步關於使用該等CAR和經工程處理之免疫細胞以治療由EGFRvIII介導之病狀之治療方法，該等病狀包括癌症(諸如膠質母細胞瘤)。

Description

靶向表皮生長因子受體變異體III之嵌合型抗原受體
本發明關於嵌合型抗原受體(CAR)。CAR能夠利用配體結合結構域性質將免疫細胞特異性和反應性重新導向經選定之靶的。尤其是，本發明關於特異性結合表皮生長因子受體變異體III之CAR(EGFRvIII特異性CAR)。本發明進一步關於編碼EGFRvIII特異性CAR之多核苷酸及在其表面表現EGFRvIII特異性CAR之分離的細胞。本發明進一步關於用於工程處理在於表面表現EGFRvIII特異性CAR之免疫細胞的方法。本發明對治療實體腫瘤(諸如多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)、非小細胞肺癌、頭頸癌、乳癌、卵巢癌和前列腺癌)特別有用。本發明進一步關於包含EGFRvIII特異性CAR之免疫細胞(EGFRvIII特異性CAR-T細胞)、包含該EGFRvIII特異性CAR-T細胞之組成物及使用該EGFRvIII特異性CAR-T細胞治療由EGFRvIII介導之疾病的方法。
EGFR變異體III(EGFRvIII)(EGFR之腫瘤特異性變異體)為基因組重排產物，其通常與野生型EGFR基因擴增有關。EGFRvIII係藉由框內刪除外顯子2-7，導致267個胺基酸缺失並在連接處具有甘胺酸取代而形成。該經截短之受體喪失其結合配體之能力，但獲得組成型激酶活性。有趣的是，EGFRvIII總是與全長野生型EGFR共同表現在相同之腫瘤細胞中。此外，表現EGFRvIII之細胞顯現出增加之增殖、侵入、血管生成和對凋亡之抗性。
EGFRvIII最常在多形性膠質母細胞瘤(GBM)中找到。據估計，25-35%之GBM攜帶此經截短之受體。再者，其表現通常反映出更侵略性之表型和不良預後。除了GBM外，EGFRvIII亦被報導表現在其他實體瘤(諸如非小細胞肺癌、頭頸癌、乳癌、卵巢癌和前列腺癌)中。相反地，EGFRvIII不會表現在健康組織中。正常組織中缺乏EGFRvIII之表現使得EGFRvIII成為用於研發腫瘤特異性靶向治療之理想靶的。
過繼性轉移經遺傳工程修飾以識別與惡性腫瘤相關之抗原的T細胞顯示出有希望作為治療癌症之新方法(參見，例如Brenner et al.,Current Opinion in Immunology,22(2)：251-257(2010)；Rosenberg et al.,Nature Reviews Cancer,8(4)：299-308(2008))。T細胞可經遺傳工程修飾以表現嵌合型抗原受體(CAR)，此嵌合型抗原受體為由抗原識別部分和T細胞活化結構域所組成之融合蛋白(參見，例如Eshhar et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90(2)： 720-724(1993)及Sadelain et al.,Curr.Opin.Immunol,21(2)：215-223(2009))。因此，使用抗EGFRvIII拮抗劑(包括EGFRvIII特異性CAR及EGFRvIII特異性CAR-T細胞)治療實體瘤(諸如多形性膠質母細胞瘤)將會是有前途之治療劑。
本發明提供結合EGFRvIII之嵌合型抗原受體(CAR)。現已證明，某些EGFRvIII特異性CAR當表現在T細胞中時在與EGFRvIII接觸時能有效活化T細胞。有利的是，本發明提供之EGFRvIII特異性CAR結合人EGFRvIII。同樣有利的是，本發明提供之EGFRvIII特異性CAR-T細胞在與表現EGFRvIII之細胞接觸時顯現出脫粒活性、增加干擾素γ製造及/或細胞毒活性。
於一態樣中，本發明提供EGFRvIII特異性CAR，其包含胞外配體結合結構域、第一跨膜結構域及胞內信號傳導結構域，其中該胞外配體結合結構域包含(a)重鏈可變(VH)區，其包含(i)VH互補決定區一(CDR1)，其包含SEQ ID NO：62、63、64、74、75、76、80、81、82、88、89、90、109、110、111、115、116、117、121、122、123、137、138或139所示之序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO：70、71、77、78、83、84、86、87、91、92、112、113、118、119、124、125、127、128、140或141所示之序列；及iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO：73、79、85、114、120、126、129或142所示之序列，及/或(b)輕鏈可變(VL)區，其包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO：149、156、159、162、165、182、185、187或195所示之序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO：152、157、160、163、183、186、188或196所示之序列；及(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO：153、158、161、164、184、189或197所示之序列。
於另一態樣中，本發明提供EGFRvIII特異性CAR，其包含胞外配體結合結構域、第一跨膜結構域及胞內信號傳導結構域，其中該胞外配體結合結構域包含單鏈Fv片段(scFv)，該scFv含有重鏈可變(VH)區及/或輕鏈可變(VL)區，該重鏈可變(VH)區包含3個來自包含SEQ ID NO：5、9、11、13、15、37、39、41、43或48所示之序列之VH區的CDR；該輕鏈可變(VL)區包含3個來自包含SEQ ID NO：6、10、12、14、16、38、40、42或49所示之序列之VL區的CDR。於一些實施態樣中，該VH區可包含SEQ ID NO：5、9、11、13、15、37、39、41、43或48或彼等之變異體所示之序列，該變異體在非在CDR內之殘基具有一或數個保守性胺基酸取代及/或該VL區可包含SEQ ID NO：6、10、12、14、16、38、40、42、49中所示之胺基酸序列或彼等之變異體所示之序列，該變異體在非在CDR內之殘基具有一或數個胺基酸取代。例如，於一些實施態樣中，該scFv之VH或VL區可包含一上述之胺基酸序列或其變異體，該變異體在非在CDR內 之殘基具有不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個保守性取代。
於一些實施態樣中，本發明提供EGFRvIII特異性CAR，其包含胞外配體結合結構域、第一跨膜結構域及胞內信號傳導結構域，其中該胞外配體結合結構域包含單鏈Fv片段(scFv)，該scFv含有重鏈可變(VH)區及/或輕鏈可變(VL)區，該重鏈可變(VH)區包含SEQ ID NO：11、15、30、37或41所示之序列；該輕鏈可變(VL)區包含SEQ ID NO：12、16、31、38或42所示之序列。於一些實施態樣中，該VH包含SEQ ID NO：11所示之序列，而該VL包含SEQ ID NO：12所示之序列。於一些實施態樣中，該VH包含SEQ ID NO：15所示之序列，而該VL包含SEQ ID NO：16所示之序列。於一些實施態樣中，該VH包含SEQ ID NO：30所示之序列，而該VL包含SEQ ID NO：31所示之序列。於一些實施態樣中，該VH包含SEQ ID NO：37所示之序列，而該VL包含SEQ ID NO：38所示之序列。於一些實施態樣中，該VH包含SEQ ID NO：41所示之序列，而該VL包含SEQ ID NO：42所示之序列。
於一些實施態樣中，該胞內信號傳導結構域包含CD3ζ信號傳導結構域。於一些實施態樣中，該胞內信號傳導結構域包含4-1BB信號傳導結構域。於一些實施態樣中，該CAR可進一步包含第二胞內信號傳導結構域。於一些實施態樣中，該第二胞內信號傳導結構域可包含4-1BB信號傳導結構域。於一些實施態樣中，該第一胞內信 號傳導結構域包含CD3ζ信號傳導結構域，而該第二胞內信號傳導結構域包含4-1BB信號傳導結構域。
於一些實施態樣中，該CAR可包含介於該胞外配體結合結構域和第一跨膜結構域之間的莖結構域。於一些實施態樣中，該莖結構域可選自由下列所組成之群組：人CD8α鉸鏈、人CD28鉸鏈、IgG1鉸鏈及FcγRIIIα鉸鏈。
於一些實施態樣中，該第一跨膜結構域可包含CD8α鏈跨膜結構域。
於一些實施態樣中，該CAR可包含另一非特異於EGFRvIII之胞外配體結合結構域。
於一些CAR之實施態樣中，該胞外配體結合結構域、第一跨膜結構域和胞內信號傳導結構域係在單一多肽上。
於一些實施態樣中，該CAR可包含第二跨膜結構域，其中該第一跨膜結構域和胞外配體結合結構域係在第一多肽上，且其中該第二跨膜結構域和胞內信號傳導結構域係在第二多肽上，其中該第一跨膜結構域包含來自該高親和性IgE受體(FcεRI)之α鏈的跨膜結構域且該第二跨膜結構域包含來自FcεRI之γ或β鏈的跨膜結構域。於一些實施態樣中，該CAR可包含第三多肽，該第三多肽包含與來自共刺激分子之胞內信號傳導結構域融合之第三跨膜結構域，其中該第三跨膜結構域包含來自FcεRI之γ或β鏈的跨膜結構域。
於另一態樣中，本發明提供經分離之多核苷酸，其包 含編碼如本文所描述之EGFRvIII特異性CAR的核酸序列。
於另一態樣中，本發明提供表現載體，其包含編碼如本文所描述之EGFRvIII特異性CAR抗體的核酸序列。
於另一態樣中，本發明提供經工程處理之免疫細胞，該免疫細胞在其細胞膜表面表現如本文所描述之EGFRvIII特異性CAR。於一些實施態樣中，該經工程處理之免疫細胞可包含另一非特異於EGFRvIII之CAR。
於一些實施態樣中，該經工程處理之免疫細胞可包含編碼自殺多肽之多核苷酸。於一些實施態樣中，該自殺多肽為RQR8。於一些實施態樣中，該編碼自殺多肽之多核苷酸與該包含編碼EGFRvIII特異性CAR之核酸序列的多核苷酸係在不同之核酸分子中。於一些實施態樣中，該編碼該自殺多肽之多核苷酸與包含編碼該EGFRvIII特異性CAR之核酸序列的多核苷酸為同一核酸分子的一部分。
於一些實施態樣中，含有EGFRvIII特異性CAR之經工程處理之免疫細胞可在與該EGFRvIII特異性CAR之多肽鏈分開的多肽鏈中包含一自殺多肽。
於一些實施態樣中，如本文所描述之EGFRvIII特異性CAR亦在與CAR相同之多肽鏈中包含一自殺多肽。例如，該自殺多肽可介於CAR之scFv和鉸鏈序列之間。於一些實施態樣中，CAR中之自殺多肽可具有如本文所提供之R2樣式。於一些實施態樣中，該自殺多肽包含可被利妥昔單抗識別之抗原決定部位。
本發明亦提供編碼EGFRvIII特異性CAR之多核苷酸，其亦編碼CAR中之自殺多肽。
於一些實施態樣中，該免疫細胞可源自炎性T淋巴細胞、細胞毒性T淋巴細胞、調節性T-淋巴細胞、記憶性T淋巴細胞、輔助T淋巴細胞、天然殺手T淋巴細胞或天然殺手細胞。
於一些實施態樣中，該經工程處理之免疫細胞在一或多個內源性基因中可包含破壞，其中該內源性基因編碼TCRα、TCRβ、CD52、糖皮質激素受體(GR)、脫氧胞苷激酶(dCK)或免疫檢查點蛋白，諸如，例如程序性死亡-1(PD-1)。
於一些實施態樣中，該免疫細胞係得自健康供體。於一些實施態樣中，該免疫細胞係得自患者。
於另一態樣中，本發明提供在其細胞表面膜表現如本文所描述之EGFRvIII特異性CAR以作為藥物之經工程處理之免疫細胞。於一些實施態樣中，該藥物係用於治療選自由下列所組成之群組的與EGFRvIII相關之癌症(例如任何具EGFRvUI表現之癌症)：多形性膠質母細胞瘤、再生不良性星形細胞瘤、巨細胞膠質母細胞瘤、神經膠質肉瘤、再生不良性少突神經膠質瘤、再生不良性室管膜瘤、再生不良性少突星形細胞瘤、脈絡叢癌、再生不良性神經節神經膠質瘤、成松果體細胞瘤、松果體瘤、腦膜瘤、髓上皮瘤、腦室管膜母細胞瘤、髓母細胞瘤、幕上原始神經外胚層瘤、非典型畸胎樣/桿狀腫瘤、混合之神經膠質 瘤、頭頸癌、非小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌症、神經管胚細胞瘤(medullobastoma)、結腸直腸癌、肛門癌、子宮頸癌、腎癌、皮膚癌、胰臟癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、甲狀腺癌、間皮瘤、子宮癌、淋巴瘤和白血病。
於另一態樣中，本發明提供工程處理免疫細胞之方法，其包含：提供免疫細胞；及在細胞表面表現至少一種如本文所描述之EGFRvIII特異性CAR。
於一些實施態樣中，該方法包含：提供免疫細胞；在細胞中引入至少一種編碼該EGFRvIII特異性CAR之多核苷酸；及將該多核苷酸表現入細胞。
於一些實施態樣中，該方法包含提供免疫細胞；將至少一種編碼該EGFRvIII特異性CAR之多核苷酸引入該細胞；及引入至少一種非特異於EGFRvIII之其他CAR。
於另一態樣中，本發明提供治療罹患與惡性細胞相關之病症的個體之方法，該方法包含：提供在其表面表現如本文所描述之EGFRvIII特異性CAR的免疫細胞；及對該患者投予該免疫細胞。
於另一態樣中，本發明提供包含如本文所描述之經工程處理之免疫細胞之醫藥組成物。
於另一態樣中，本發明提供治療個體之與表現EGFRvIII之惡性細胞相關的病症之方法，其包含對有需要之患者投予有效量之申請專利的醫藥組成物，該醫藥組成物包含如本文所描述之經工程處理之免疫細胞。於一些 實施態樣中，該病症為癌症。於一些實施態樣中，該癌症為選自由下列所組成之群組的與EGFRvIII相關之癌症：多形性膠質母細胞瘤、再生不良性星形細胞瘤、巨細胞膠質母細胞瘤、神經膠質肉瘤、再生不良性少突神經膠質瘤、再生不良性室管膜瘤、再生不良性少突星形細胞瘤、脈絡叢癌、再生不良性神經節神經膠質瘤、成松果體細胞瘤、松果體瘤、腦膜瘤、髓上皮瘤、腦室管膜母細胞瘤、髓母細胞瘤、幕上原始神經外胚層瘤、非典型畸胎樣/桿狀腫瘤、混合之神經膠質瘤、頭頸癌、非小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌症、神經管胚細胞瘤、結腸直腸癌、肛門癌、腎癌、子宮頸癌、肝癌、胰臟癌、胃癌、甲狀腺癌、間皮瘤、子宮癌及膀胱癌。
於另一態樣中，本發明提供抑制具有表現EGFRvIII之惡性細胞之個體的腫瘤生長或進展之方法，其包含對有需要之個體投予有效量之包含如本文所描述之經工程處理之免疫細胞之醫藥組成物。
於另一態樣中，本發明提供抑制個體內表現EGFRvIII之惡性細胞轉移的方法，其包含對有需要之個體投予有效量之包含如本文所描述之經工程處理之免疫細胞之醫藥組成物。
於另一態樣中，本發明提供誘導具有表現EGFRvIII之惡性細胞之個體的腫瘤消退之方法，其包含對對有需要之個體投予有效量之包含如本文所描述之經工程處理之免疫細胞的醫藥組成物。
詳細說明
本文所揭示之本發明提供特異性結合EGFRvIII(例如人EGFRvIII)之嵌合型抗原受體(CAR)和包含CAR之免疫細胞(例如CAR-T細胞)。本發明亦提供編碼該等CAR之多核苷酸、包含該等CAR-T細胞之組成物及製備和使用該等CAR及CAR-T細胞之方法。本發明亦提供用於治療個體的與由EGFRvIII介導之病狀相關之病症(諸如癌症)的方法。
一般技術
除非另外指明，實行本發明將採用在本技藝之技術範圍內之分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學、免疫學、病毒學、單株抗體生成及工程處理的習知技術。該等技術在諸如下列文獻中有充分解釋：Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al.,1989)Cold Spring Harbor Press； Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)； Methods in Molecular Biology, Humana Press ； Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998)Academic Press；Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987)； Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998)Plenum Press； Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A.Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998)J. Wiley and Sons； Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)； Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)； Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P.Calos, eds., 1987)； Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987)； PCR； The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994)； Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)； Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)； Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)； Antibodies (P.Finch, 1997)； Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)； Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)； Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)； The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra,eds., Harwood Academic Publishers, 1995).
定義
如本文所使用之術語“胞外配體結合結構域”係指能夠結合配體之寡肽或多肽。較佳地，該結構域將能與細胞表面分子交互作用。例如，該胞外配體結合結構域可經選擇以識別作為與特定疾病狀態相關之靶細胞上的細胞表面 標記之配體。
本文中，術語“莖結構域”或“鉸鏈結構域”可互換使用以指用於連接跨膜結構域與胞外配體結合結構域之任何寡肽或多肽。尤其是，莖結構域係用於為該胞外配體結合結構域提供更多靈活性及可接近性。
術語“胞內信號傳導結構域”係指轉導該效應子功能信號並指導細胞執行專門功能之蛋白質的部分。
如本文所使用之“共刺激分子”係指在T細胞上之同源結合伴侶，其特異性結合共刺激配體，從而介導該細胞之共刺激反應(諸如，但不限於增殖)。共刺激分子包括，但不限於第I類MHC分子、BTLA和Toll配體受體。共刺激分子之實例包括CD27、CD28、CD8、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特異結合CD83之配體，等。
“共刺激配體”係指在抗原呈遞細胞上之分子，其特異結合T細胞上之同源共刺激信號分子從而提供除了由例如TCR/CD3複合物與裝載肽之MHC分子結合所提供的主信號外之介導T細胞反應(包括，但不限於增殖、活化、分化、細胞因子產製，等)的信號。共刺激配體可包括，但不限於CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可誘導之共刺激配體(ICOS-L)、細胞間黏附分子(ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴毒素β受體、 3/TR6、ILT3、ILT4、結合Toll配體受體之激動劑或抗體及特異結合B7-H3之配體。尤其是，共刺激配體亦包含特異結合呈現在T細胞上之共刺激分子(諸如，但不限於CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、特異結合CD83之配體)的抗體。
“抗體”為能夠透過至少一個位於免疫球蛋白分子之可變區中的抗原識別位點特異結合靶的(諸如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽，等)之免疫球蛋白分子。如本文所使用者，該術語不僅包含完整的多株或單株抗體，亦包含其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(scFv)和結構域抗體(包括，例如鯊魚和駱駝抗體)及包含抗體之融合蛋白，和任何其他經修飾之包含抗原識別位點的免疫球蛋白分子構形。抗體包括任何類別之抗體，諸如IgG、IgA或IgM抗體(或其子類別)，且該抗體不必為任何特定類別。根據免疫球蛋白之重鏈恆定區的抗體胺基酸序列，該免疫球蛋白可被歸入不同類別。免疫球蛋白有五種主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有幾種可進一步被分成子類別(同種型)，例如lgG1、lgG2、IgG3、IgG4、lgA1和lgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類別之免疫球蛋白的次單位結構和三維構形為眾所周知。
如本文所使用之術語抗體之“抗原結合片段”或“抗 原結合部分”係指完整抗體之一或多個保留特異結合指定抗原(例如EGFRvIII)之能力的片段。抗體之抗原結合功能可由完整抗體之片段執行。包含在術語抗體之“抗原結合片段”內的結合片段之實例包括：Fab；Fab'；F(ab')2；由VH和CH1結構域所組成之Fd片段；由抗體之單臂的VL和VH結構域所組成之Fv片段；單一結構域抗體(dAb)片段(Ward et al.,Nature 341：544-546，1989)及經分離之互補決定區(CDR)。
“優先結合”或“特異性結合”(本文中可互換使用)靶的(例如EGFRvIII蛋白)之抗體、抗體軛合物或多肽為本技藝所充分理解之術語，而用於測定該等特異性或優先結合之方法亦為本技藝所熟知。相較於分子與替代之細胞或物質反應或結合的持續時間及/或親和性，若該分子更頻繁、更迅速地以較長之持續時間及/或較高之親和性與特定之細胞或物質反應或結合，則該分子被說是顯示出“特異性結合”或“優先結合”。相較於抗體與其他物質之結合，若該抗體以較高之親和性、結合性，更容易及/或以較長之持續時間與靶的結合，則該抗體係“特異性結合”或“優先結合”靶的。例如，特異性或優先結合EGFRvIII抗原決定部位之抗體係指以大於與其他EGFRvIII抗原決定部位或非-EGFRvIII抗原決定部位結合之親和性、結合性、更容易及/或較長之持續時間來與此抗原決定部位結合之抗體。亦可理解的是，藉由閱讀此定義，例如“特異性結合”或“優先結合”第一靶的之抗體(或部分或抗原決定 部位)可能或可能不會特異性結合或優先結合第二靶的。因此，“特異性結合”或“優先結合”不一定需要(雖然其可包括)專一結合。一般而言，但不一定，提及結合意指優先結合。
抗體之“可變區”係指抗體輕鏈(VL)之可變區或抗體重鏈之可變區(VH)，無論是單獨或組合的。如本技藝中所已知，重鏈和輕鏈之可變區各自由四個藉由3個互補決定區(CDR)(亦稱為高度可變區)連接的框架區(FR)組成。在各鏈中之CDR係藉由FR保持緊接在一起，且藉由來自另一條鏈之CDR促成形成抗體之抗原結合位點。用於測定CDR之技術至少有二種：(1)基於跨物種序列變異性之方法(即，Kabat et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th ed.,1991,National Institutes of Health,Bethesda MD))；和(2)基於抗原-抗體複合物之晶體學研究的方法(A1-lazikani et al.,1997,J.Molec.Biol.273：927-948)。如本文所使用者，CDR可指藉由任一方法或藉由二種方法之組合所定義之CDR。
可變結構域之“CDR”為根據Kabat、Chothia之定義、Kabat和Chothia二者之累積、AbM、接觸及/或構形定義或本技藝中熟知之測定CDR之任何方法鑑別的在可變區內之胺基酸殘基。抗體CDR可被看作是最初由Kabat等人定義之高度可變區。參見，例如Kabat et al.,1992,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,NIH,Washington D.C。CDR之 位置亦可被看作是最初由Chothia和其他人描述之結構環結構。參見，例如Chothia et al.,Nature 342：877-883,1989。其他識別CDR之方式包括“AbM定義”(此為Kabat與Chothia之間的折衷定義且係使用Oxford Molecular AbM抗體建模軟體(現在為Accelrys®)推衍而來)或基於觀察到之抗原接觸的CDR“接觸定義”(闡述於MacCallum et al.,J.Mol.Biol.,262：732-745,1996中)。於另一方式中(本文中稱為CDR之“構形定義”)，該CDR之位置可被看作是使焓促成抗原結合的殘基。參見，例如Makabe et al.,Journal of Biological Chemistry,283：1156-1166,2008。還有其他CDR邊界定義可能未嚴格遵循上述方式其中之一，但仍將與至少一部分之Kabat CDR重疊，雖然它們可能鑑於預測或實驗發現特定之殘基或殘基群或甚至整個CDR並不會顯著影響抗原結合而被縮短或加長。如本文所使用之CDR可指藉由本技藝中已知之任何方式(包括方式之組合)定義的CDR。本文所使用之方法可利用根據這些方式之任一者定義的CDR。在任何含有一個以上之CDR的指定實施態樣方面，該CDR可根據Kabat、Chothia、延伸的、AbM、接觸及/或構象定義之任一者定義。
如本文所使用之“單株抗體”係指從基本上同質之抗體群取得之抗體，即，該群體所包含之個別抗體完全相同，除了可能少量存在之天然發生的突變。單株抗體為高特異性，針對單一抗原位點。此外，與多株抗體製劑(其通常 包括針對不同決定簇(抗原決定部位)之不同抗體)相反，各單株抗體係針對抗原上之單一決定簇。修飾語“單株”係指該抗體從基本上同質之抗體群取得的特徵，而不應被解釋為需要藉由任何特定方法來產生該抗體。例如，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由最先由Kohler and Milstein，Nature 256：495，1975描述之雜交瘤方法製造，或可藉由重組DNA方法(諸如美國專利案第4,816,567號中所描述者)製造。單株抗體亦可從，例如利用McCafferty et al.,Nature 348：552-554,1990中所描述之技術產生之噬菌體庫分離出。
如本文所使用之“人化”抗體係指為嵌合型免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其含有源自非人免疫球蛋白之最小序列的片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)的非人(例如鼠)抗體形式。較佳地，人化抗體為人免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自該接受者之互補性決定區(CDR)的殘基被來自具有所需之特異性、親和性和能力的非人物種(諸如小鼠、大鼠或兔)之CDR(供體抗體)的殘基所替代。於一些情況中，人免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基被對應之非人殘基所替代。此外，該人化抗體可包含既非在接受者抗體中亦非在該引入之CDR或框架序列中找到，但被包含在抗體中以進一步細化和優化抗體性能之殘基。一般而言，該人化抗體基本上將包含至少一個，且通常為二個可變結構域，其中全部或基本上全部之CDR區對應於非人免疫球蛋白之CDR區且全部或基本 上全部之FR區為人免疫球蛋白共有序列之FR。最理想地，該人化抗體亦將包含至少一部分之免疫球蛋白恆定區或結構域(Fc)，通常為人免疫球蛋白之恆定區或結構域。較佳為具有依WO 99/58572中之描述修飾的Fc區之抗體。人化抗體之其他形式具有一或多個相對於原始抗體修改之CDR(CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2或CDR H3)，亦被稱為一或多個“源自”一或多個來自原始抗體之CDR。
如本文所使用之“人抗體”意指具有對應於由人類製造之抗體的胺基酸序列之胺基酸序列的抗體及/或其為利用本技藝之技術人士已知或本文所揭示之製造人抗體的任何技術製造的抗體。此人抗體之定義包括包含至少一個人重鏈多肽或至少一個人輕鏈多肽的抗體。一種該等實例為包含小鼠輕鏈和人重鏈多肽的抗體。人抗體可利用本技藝已知之各種技術製造。於一實施態樣中，該人抗體係選自噬菌體庫，其中該噬菌體庫表現人抗體(Vaughan et al.,Nature Biotechnology,14：309-314,1996；Sheets et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：6157-6162,1998；Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227：381,1991；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222：581,1991)。人抗體亦可藉由將動物免疫化來製造，其中該動物已藉由轉基因引入人免疫球蛋白基因座來取代內源性基因座(例如其中該內源性免疫球蛋白基因已被部分或完全去活化的小鼠)。此方法描述於美國專利案第5,545,807；5,545,806； 5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016號中。或者，該人抗體可藉由永生化可產生針對靶的抗原之抗體的人B淋巴細胞來製備(該等B淋巴細胞可從個體或從cDNA之單細胞選殖回收，或可在體外免疫化)。參見，例如Cole et al.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77,1985；Boerner et al.,J.Immunol.,147(1)：86-95,1991；及美國專利案第5,750,373號。
術語“嵌合型抗體”意圖指其中該可變區序列係源自一物種而該恆定區序列係源自另一物種的抗體，諸如其中該可變區序列係源自小鼠抗體，而該恆定區序列係源自人抗體的抗體。
術語“多肽”、“寡肽”、肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用且係指任何長度之胺基酸鏈。例如，該鏈可為相對短的(例如10至100個胺基酸)或較長的。該鏈可為直鏈或支鏈型，其可包含經修飾之胺基酸及/或可能被非胺基酸中斷。該術語亦包含已經過天然修飾或藉由干預修飾(例如形成二硫鍵、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作或修飾，諸如與標記組分軛合)之胺基酸鏈。該定義亦包括，例如含有一或多個胺基酸之類似物(包括，例如非天然胺基酸，等)及本技藝中已知之其他修飾的多肽。應理解的是，該多肽可以單鏈或聯結之鏈的形式發生。
“單價抗體”包含每一分子(例如IgG或Fab)具有一個抗原結合位點。於某些情況中，單價抗體可具有一個以上 之抗原結合位點，但該結合位點係來自不同抗原。
“二價抗體”包含每一分子(例如IgG)具有二個抗原結合位點。於一些情況中，該二個結合位點具有相同的抗原特異性。然而，二價抗體可為雙特異性。
“雙特異性”或“雙重特異性”為具有二個不同抗原結合位點之雜交抗體。該雙特異性抗體之二個抗原結合位點結合二個不同的抗原決定部位，該二個不同的抗原決定部位可位在相同或不同之蛋白質靶的上。
“雙官能性”為在二個臂中具有完全相同之抗原結合位點(即，完全相同之胺基酸序列)，但各結合位點可識別二種不同抗原之抗體。
本發明之抗體可利用本技藝中熟知之技術，例如重組技術、噬菌體展示技術、合成技術、或該等技術之組合、或本技藝中已知之其他技術產生(參見，例如Jayasena,S.D.,Clin.Chem.,45：1628-50,1999 and Fellouse,F.A.,et al,J.MoI.Biol.,373(4)：924-40,2007)。
如本技藝中所已知，本文中可互換使用之“多核苷酸”或“核酸”係指任何長度之核苷酸鏈且包括DNA和RNA。該核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或其類似物，或任何可藉由DNA或RNA聚合酶被併入鏈中之受質。多核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化之核苷酸及彼等之類似物。若存在的話，對該核苷酸結構之修飾可在組裝該鏈之前或後賦予。核苷酸之序列可被非核苷酸組分中斷。多核苷酸可在聚合後被 進一步修飾，諸如藉由與標記組分軛合。其他類型之修飾包括，例如“帽”、以類似物替代一或多個天然存在之核苷酸、核苷酸間修飾，諸如，例如具有不帶電之鍵聯(例如膦酸甲基、磷酸三酯、磷醯胺酯、胺基甲酸酯，等)和具有帶電荷之鍵聯(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，等)的修飾者、含有突出部分者，諸如，例如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸，等)、具有嵌入劑者(例如吖啶、補骨脂素，等)、含有螯合劑者(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬，等)、含有烷化劑者、具有經修飾之鍵聯者(例如α異頭核酸，等)及該多核苷酸之未經修飾的形式。此外，任何通常存在於糖中之羥基可被，例如膦酸基團、磷酸基團取代、被標準保護基團保護、或經活化以製備額外連接核苷酸之鍵聯、或可與固體支持物軛合。該5'和3'端OH可經磷酸化或以胺或具有1至20個碳原子之有機加帽基團部分取代。其他羥基亦可衍生成標準之保護基團。多核苷酸亦可含有本技藝通常已知之核糖或脫氧核糖類的類似物形式，包括，例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮基核糖、碳環糖類似物、α-或β-異頭糖、差向異構糖，諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖(sedoheptulose)、無環類似物及無鹼基核苷類似物，諸如甲基核糖核苷。一或多個磷酸二酯鍵可被替代之連接基團替換。該等替代之連接基團包括，但不限於其中磷酸化物被下列群組所替代者：P(O)S(“硫酸酯”)、P(S)S(“二硫酸 酯”)、(O)NR2(“醯胺酸酯”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲縮醛”)所替代，其中各R或R'係獨立為H或經取代或未經取代之烷基(1至20個C)(其可選擇地含有醚(-O-)鍵聯、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。並非所有多核苷酸中之鍵聯都必須完全相同。先前之描述適用於本文中提及之所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
如本技藝中已知之抗體的“恆定區”係指抗體輕鏈之恆定區或抗體重鏈之恆定區，無論是單獨或組合的。
如本文中所使用之“基本上純質”係指為至少50%純質之物質(即，不含污染物)，較佳為至少90%純質，更佳為至少95%純質，再更佳為至少98%純質且最佳為至少99%純質。
“宿主細胞”包括可為或已成為載體之接受者以用於納入多核苷酸插入物的個別細胞或細胞培養物。宿主細胞包括單一宿主細胞之子代且由於天然、偶然或故意之突變，該子代不一定與原始親本細胞完全相同(在形態學或基因組DNA互補方面)。宿主細胞包括在體內以本發明之多核苷酸轉染的細胞。
如本文所使用之“免疫細胞”係指功能上涉及起始及/或執行先天性及/或適應性免疫反應之造血起源細胞。
如本技藝中所已知者，術語“Fc區”係用於定義免疫球蛋白重鏈之C-端區。“Fc區”可為天然序列Fc區或變體Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈之Fc區的邊界可能有變化，人IgG重鏈Fc區通常被定義為從位置Cys226或 Pro230之胺基酸殘基延伸至其羧基端。Fc區中之殘基的編號為如Kabat中之EU索引的編號。Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991。免疫球蛋白之Fc區一般包含二個恆定區，CH2和CH3。
如本技藝中所使用者，“Fc受體”和“FcR”係描述結合抗體之Fc區的受體。較佳之FcR為天然序列人FcR。再者，較佳之FcR為結合IgG抗體者(γ受體)且包括Fc γ RI、Fc γ R Ⅱ和Fc γ R Ⅲ亞類之受體，包括等位基因變體及該等受體之選擇性剪接(alternatively splicing)形式。Fc γ R Ⅱ受體包括Fc γ R Ⅱ A(“活化受體”)和Fc γ R Ⅱ B(“抑制受體”)，它們具有主要差別在於其胞質結構域之類似的胺基酸序列。FcR之檢閱參見Ravetch and Kinet,Ann.Rev.Immunol.,9：457-92,1991；Capel et al.,Immunomethods,4：25-34,1994；及de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.,126：330-41,1995。“FcR”亦包括新生兒受體，FcRn，其負責將母體IgG轉移給胎兒(Guyer et al.,J.Immunol.,117：587,1976；及Kim et al.,J.Immunol.,24：249,1994)。
本文中關於抗體所使用之術語“競爭”意指第一抗體或其抗原結合片段(或部分)以充分類似於第二抗體或其抗原結合部分結合之方式結合抗原決定部位，因而當第二抗體存在時，第一抗體與其同源抗原決定部位之結合結果將 較無第二抗體存在時之第一抗體與其同源抗原決定部位的結合結果可檢測地降低。替換之情況(其中在第一抗體之存在下，該第二抗體與其抗原決定部位之結合結果亦為可檢測地降低)亦有可能，但不必然是這種情況。即，第一抗體可抑制第二抗體與其抗原決定部位結合，但第二抗體不會抑制第一抗體與其各別抗原決定部位結合。然而，當各抗體可檢測地抑制另一抗體與其同源抗原決定部位或配體結合時(不論是否以相同、較大或較小之程度)，該抗體被稱為彼此“交叉競爭”與其各別抗原決定部位結合。競爭性和交叉競爭性抗體均包含在本發明中。不論該等競爭或交叉競爭係藉由何種機制發生(例如位阻、構形變化或與共同之抗原決定部位或其部分結合)，本技藝之技術熟習人士基於本文所提供之教示內容將理解該等競爭性及/或交叉競爭性抗體包含在本發明中且可用於本文所揭示之方法。
如本文所使用之“自體”意指用於治療患者之細胞、細胞株或細胞群係源自該患者或源自人類白血球抗原(HLA)相容供體。
如本文所使用之“同種異體(allogeneic)”意指用於治療患者之細胞或細胞群並非源自該患者，而是來自供體。
如本文所使用之“治療”為用於取得有利或期望之臨床結果的方式。在本發明之目的方面，有利或期望之臨床結果包括，但不限於下列之一或多項：減少腫瘤或癌細胞 增殖(或破壞之)、抑制腫瘤細胞轉移、縮小或降低EGFRvIII表現腫瘤之大小、緩解EGFRvIII相關疾病(例如癌症)、減少由EGFRvIII相關疾病(例如癌症)導致之症狀、增加罹患EGFRvIII相關疾病(例如癌症)者之生活品質、減少治療EGFRvIII相關疾病(例如癌症)所需之其他藥物的劑量、延遲EGFRvIII相關疾病(例如癌症)之進展、治癒EGFRvIII關疾病(例如癌症)及/或延長患有EGFRvIII相關疾病(例如癌症)之患者的生存。
“改善”意指與未投予EGFRvIII特異性CAR相比較，一或多種症狀減輕或改善。“改善”亦包括縮短或減少症狀之持續時間。
如本文所使用之藥物、化合物或醫藥組成物之“有效劑量”或“有效量”為足以使有利或期望之結果生效的量。在預防用途方面，有利或期望之結果包括排除或降低疾病之風險、減輕疾病之嚴重性或延遲疾病發作，包括該疾病之生化學、組織學及/或行為症狀、其併發症和疾病發展期間呈現之中間病理學表型。在治療用途方面，有利或期望之結果包括患者的臨床結果，諸如降低各種EGFRvIII相關疾病或病症(諸如，例如多發性骨髓瘤)之一或多種症狀的發生率或改善該症狀、減少治療該疾病所需之其他藥物的劑量、增強另一種藥物之效果及/或延緩患者之與EGFRvIII相關之疾病的進展。有效劑量可在一或多次投予中投予。在本發明之目的方面，藥物、化合物或醫藥組成物之有效劑量為足以直接或間接完成預防性或治 療性治療之量。如同在臨床背景下所理解者，藥物、化合物或醫藥組成物之有效劑量可能或可能不聯同另一藥物、化合物或醫藥組成物來達到。因此，在投予一或多種治療劑之背景下可考慮“有效劑量”，而單一藥劑若聯同一或多種其他藥劑一起投予可能或已取得期望之結果則可考慮以有效量投予。
“個人”或“個體”為哺乳動物，更佳為人。哺乳動物亦包括，但不限於靈長類、馬、狗、貓、小鼠和大鼠。
如本文所使用之“載體”意指能夠投遞，且較佳地，在宿主細胞中表現一或多種所欲基因或序列之構建體。載體之實例包括，但不限於病毒載體、裸出之DNA或RNA表現載體、質粒、黏粒或噬菌體載體、與陽離子縮合劑聯結之DNA或RNA表現載體、包封在脂質體中之DNA或RNA表現載體及某些真核細胞，諸如生產者細胞。
如本文所使用之“表現控制序列”意指指導核酸轉錄之核酸序列。表現控制序列可為啟動子，諸如組成型或誘導型啟動子或增強子。表現控制序列係以可操作之方式與欲轉錄之核酸序列連接。
如本文所使用之“醫藥上可接受之載體”或“醫藥上可接受之賦形劑”包括任何當與活性成分組合時可允許該成分保留生物活性且不與該個體之免疫系統反應的物質。實例包括，但不限於任何標準藥學載體，諸如磷酸鹽緩衝之鹽水溶液、水、乳劑(諸如油/水乳劑)和各種類型之潤濕劑。用於氣霧劑或胃腸道外投予之較佳稀釋劑為磷酸鹽緩 衝之鹽水(PBS)或生理(0.9%)鹽水。包含該等載體之組成物係藉由為人熟知之習知方法配製(參見，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,18th edition,A.Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；及Remington,The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed.Mack Publishing,2005)。
如本文所使用之術語“kon”或“Ka”係指抗體與抗原結合之速率常數。具體地說，速率常數(kon/Ka和koff/Kd)和平衡解離常數可使用，例如全長抗體及/或Fab抗體片段和對應抗原測量。
如本文所使用之術語“koff”或“Kd”係指抗體從抗體/抗原複合物解離之速率常數。
如本文所使用之術語“KD”係指抗體-抗原交互作用之平衡解離常數。
結合和解離速率常數kon和koff可分別使用基於表面等離子共振之生物傳感器測定以表徵在該分析物為單價(就經由捕捉試劑與以小容量被固定在傳感器表面上之配體結合方面)之條件下的分析物/配體交互作用。該分析係使用動力學滴定方法(依Karlsson et al.,Anal.Biochem 349,136-147,2006中之描述)進行。該用於指定分析所採用之傳感器芯片、捕捉試劑及分析緩衝劑係按照Myszka,J.Mol.Recognit 12,279-284,1999中之建議選擇以將配體穩定捕捉在傳感器表面上，使該分析物與表面之非特異性結合最少並產生適合動力學分析之分析物結合反應。依 Myszka & Morton et al.,Biophys.Chem 64,127-137(1997)中之描述，每一分析物/配體交互作用之分析物結合反應被引用二次並擬合至1：1 Langmuir“質量輸送限制模型(mass transport limited model)”，以ka、kd和Rmax作為全面參數。該平衡解離常數KD係從動力學速率常數KD=koff/kon之比推斷。這類測定較宜在25℃或37℃下進行。
本文中當數值或參數提及“約”時包括(且描述)針對該數值或參數本身之實施態樣。例如，關於“約X”之描述包括“X”之描述。數字範圍包括定義該範圍之數字。一般而言，術語“約”係指所指明之該變量的數值及在該所指明之數值的實驗誤差範圍內(例如在該平均值之95%信賴區間內)的所有變量之數值或在該所指明之數值的10%內(視何者較大而定)。當術語“約”係在時間期間(年、月、週、日，等)之背景下使用時，術語“約”係指一段時間加上或減去下一級別之時間期的量(例如，約1年意指11至13個月；約6個月意指6個月加上或減去1週，約1週係指6至8天；等)，或在所指明之數值之10%內(視何者較大而定)。
應理解的是，本文中以“包含”描述之每種實施態樣亦提供以術語“由…所組成”及/或“基本上由…所組成”描述的其他類似之實施態樣。
當本發明之態樣或實施態樣係就馬庫什群組或其他替代分組來描述時，本發明不僅涵蓋該整體列出的整個群組，亦個別包括群組之各成員和該主要群組之所有可能的 次群組，還包括缺少一或多個群組成員之主要群組。本發明亦設想明確排除本申請專利之發明中的任一群組成員的一或多者。
除非另有定義，本文所使用之所有技術和科學術語具有與本發明所屬之技藝中一般技術人士所通常理解者相同的意義。當有衝突時，將以本專利說明書(包括定義)為主。可理解的是，本專利說明書和申請專利範圍之全文中，“包含(comprise)”此字或諸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”等變化意味包含所陳述之整數或整數群組，但不排除任何其他整數或整數群組。除非上下文另有要求，單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。
本文中描述示例性方法和材料，但類似或等同於本文所描述的那些方法和材料亦可用於實踐或測試本發明。該材料、方法和實例僅用於說明，而非意圖限制。
EGFRvIII特異性CAR及製備彼等之方法
本發明提供結合EGFRvIII之CAR(例如人EGFRvIII(例如SEQ ID NO：201，登錄編號：P00533特徵標識符VAR_066493或GenBank登錄編號AJN69267))。本文所提供之EGFRvIII特異性CAR包括單鏈CAR和多鏈CAR。該CAR有能力利用單株抗體之抗原結合特性，以非MHC限制性方式將T細胞特異性和反應性重新朝EGFRvIII定向。非MHC限制性抗原識別賦予表現CAR之T細胞與抗 原加工無關之識別抗原的能力，從而繞過腫瘤逃逸的主要機制。
於一些實施態樣中，本發明所提供之CAR包含胞外配體結合結構域(例如單鏈可變片段(scFv))、跨膜結構域和胞內信號傳導結構域。於一些實施態樣中，該胞外配體結合結構域、跨膜結構域和胞內信號傳導結構域係在一個多肽中，即，在單鏈中。本發明亦提供多鏈CAR和多肽。於一些實施態樣中，該多鏈CAR包括：包含跨膜結構域和至少一個胞外配體結合結構域之第一多肽及包含跨膜結構域和至少一個胞內信號傳導結構域之第二多肽，其中該多肽組裝在一起以形成多鏈CAR。
於一些實施態樣中，EGFRvIII特異性多鏈CAR係基於IgE之高親和性受體(FcεRI)。該表現在肥大細胞和嗜鹼細胞上之FcεRI觸發過敏反應。FcεRI為由單一α次單位、單一β次單位及二個經二硫化物鍵聯之γ次單位所組成的四聚體複合物。該α次單位含有IgE結合結構域。該β和γ次單位含有介導信號轉導之ITAM。於一些實施態樣中，該FcRα鏈之胞外域缺失並被EGFRvIII特異性胞外配體結合結構域所替代。於一些實施態樣中，該多鏈EGFRvIII特異性CAR包含特異性結合EGFRvIII之scFv、該CD8α鉸鏈及FcRβ鏈之ITAM。於一些實施態樣中，該CAR可或可不包含FcRγ鏈。
於一些實施態樣中，該胞外配體結合結構域包含scFv，該scFv包含有藉由彈性連接子連接之靶抗原特異 性單株抗體的輕鏈可變(VL)區和重鏈可變(VH)區。單鏈可變區片段係使用短的連接肽藉由連接輕鏈及/或重鏈可變區製成(Bird et al.,Science 242：423-426,1988)。連接肽之實例為具有胺基酸序列(GGGGS)4(SEQ ID NO：202)之GS連接子，其橋聯介於一個可變區之羧基端和其他可變區之胺基端之間約3.5nm之距離。其他序列之連接子已有設計及使用(Bird等人，1988，同上)。一般而言，連接子可為短、有彈性之多肽且較佳為由約20個或更少之胺基酸殘基所組成。反過來，連接子可經修飾以用於另外之功能，諸如連接藥物或連接固體支持物。該單鏈變異體可經由重組或合成方式產生。在合成製造scFv方面，可使用自動合成儀。在重組產生scFv方面，可將合適之含有編碼該scFv之多核苷酸的的質粒引入合適之宿主細胞(或為真核細胞，諸如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細胞，或為原核細胞，諸如大腸桿菌)。編碼所欲scFv之多核苷酸可藉由常規操作(諸如連接多核苷酸)製造。所產生之scFv可使用本技藝已知之標準蛋白質純化技術分離出。
於一些實施態樣中，該胞外配體結合結構域包含(a)VH區，其包含：(i)VH互補決定區一(CDR1)，其包含SEQ ID NO：62、63、64、74、75、76、80、81、82、88、89、90、93、94、95、99、100、101、109、110、111、115、116、117、121、122、123、132、133、134、137、138、139、143、144或145所示之序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO：65、66、68、69、70、71、 77、78、83、84、86、87、91、92、96、97、98、102、103、105、106、112、113、118、119、124、125、127、128、130、131、135、136、140、141、146或147所示之序列；和iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO：67、72、73、79、85、104、107、108、114、120、126、129、142或148所示之序列；及/或VL區，其包含：(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO：149、154、156、159、162、165、166、168、169、170、171、173、174、176、178、181、182、185、187、190、192、195或198所示之序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO：150、152、155、157、160、163、172、175、179、183、186、188、191、193、196或199所示之序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO：151、153、158、161、164、167、177、180、184、189、194、197或200所示之序列。於一些實施態樣中，該VH和VL係藉由彈性連接子連接在一起。於一些實施態樣中，彈性連接子包含SEQ ID NO：202中所示之胺基酸序列。
於一些實施態樣中，該胞外配體結合結構域包含(a)VH區，其包含(i)VH互補決定區一(CDR1)，其包含SEQ ID NO：62、63、64、74、75、76、80、81、82、88、89、90、109、110、111、115、116、117、121、122、123、137、138或139所示之序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO：70、71、77、78、83、84、86、87、91、92、112、113、118、119、124、125、127、128、 140或141所示之序列；和iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO：73、79、85、114、120、126、129或142所示之序列，及/或(b)VL區，其包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO：149，156，159，162，165，182，185，187或195所示之序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO：152、157、160、163、183、186、188或196所示之序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO：153、158、161、164、184、189或197所示之序列。
於另一態樣中，提供特異性結合EGFRvIII之CAR，其中該CAR包含胞外配體結合結構域，該胞外配體結合結構域包含：VH區，其包含具有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、30、32、34、35、37、39、41、43、44、46、48或50中所示之VH序列的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3；及/或VL區，其包含具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、29、31、33、36、38、40、42、45、47、49或51中所示之VL序列的VLCDR1、VL CDR2及VL CDR3。於一些實施態樣中，該VH和VL係藉由彈性連接子連接在一起。於一些實施態樣中，該彈性連接子包含SEQ ID NO：202中所示之胺基酸序列。
於一些實施態樣中，該CAR包含胞外配體結合結構域，該胞外配體結合結構域包含：VH區，其包含具有SEQ ID NO：5、9、11、13、15、37、39、41、43或48 中所示之VH序列的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3；及/或VL區，其包含具有SEQ ID NO：6、10、12、14、16、38、40、42或49中所示之VL序列的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。於一些實施態樣中，該VH和VL係藉由彈性連接子連接在一起。於一些實施態樣中，該彈性連接子包含SEQ ID NO：202中所示之胺基酸序列。
於一些實施態樣中，本發明之CAR包含胞外配體結合結構域，該胞外配體結合結構域具有如表1中所列之任一部分輕鏈序列及/或如表1中所列之任一部分重鏈序列。表1中，下方劃線之序列為根據Kabat之CDR序列且粗體之序列為根據Chothia之CDR序列。表1之不同mAb在本文中亦可稱為不同之抗EGFRvIII抗體“選殖株”。
本文中亦提供結合EGFRvIII之CAR之胞外配體結合結構域的CDR部分(包括Chothia、Kabat CDR及CDR接觸區)。CDR區之測定完全在本技藝之技術範圍內。據了解，於一些實施態樣中，CDR可為Kabat和Chothia CDR之組合(亦稱為“組合之CR”或“延伸之CDR”)。於一些實施態樣中，該CDR為Kabat CDR。於其他實施態樣中，該CDR為Chothia CDR。換言之，於具有一個以上之CDR的實施態樣中，該CDR可為Kabat、Chothia、組合CDR或彼等之組合的其中任一者。表2提供本文所提供之CDR序列的實例。
本發明包含對表1中所示之本發明之CAR和多肽變異體的修飾，包括具有不會明顯影響其性能之修飾的功能相等之CAR和具有增強或降低之活性及/或親和性的變異體。例如，該胺基酸序列可經突變以取得具有所需之對EGFRvIII之結合親和性的抗體。修飾多肽為本技藝之例 行工作，不需要在本文中詳細描述。修飾之多肽的實例包括具有保守性胺基酸殘基取代之多肽、缺失或添加一或多個不會明顯有害地改變該多肽之功能活性或熟化(增強)該多肽對其配體之親和性之胺基酸的多肽，或使用化學類似物。
胺基酸序列插入子包括長度在一個殘基至包含上百或更多個殘基之多肽之範圍內的胺基及/或羧基端融合物，以及具有單一或多個胺基酸殘基之序列內插入子。終端插入子之實例包括具有N端甲硫胺醯殘基之抗體或與抗原決定部位標籤融合之抗體。該抗體分子之其他插入變異體包括在酶或多肽之抗體N端或C端的融合物，該融合物能增加抗體在血液循環中之半衰期。
取代變異體在抗體分子中至少有一個胺基酸殘基被移除且在其位置插入一個不同的殘基。取代誘變之最有利的位點包括高變區，但亦可考慮FR變化。保守性取代顯示於表3中之“保守性取代”標題下。若該等取代導致生物學活性之改變，則可引入更多實質改變(表3中命名為“示例性取代”或如進一步參考胺基酸類別描述於下文中者)並篩選產物。於一些實施態樣中，與參考親本抗體相比較，本文所提供之抗體的取代變異體在VH或VL區中具有不超過15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個保守性取代。於一些實施態樣中，該取代不在VH或VL區之CDR內。
於一些實施態樣中，本發明提供CAR，其包含結合EGFRvIII並與本文所描述之抗體或本文所描述之CAR(例如表5A)競爭結合EGFRvIII之胞外配體-結合結構域，包括m62G7、h62G7、h62G7-H14/L1-DV、h62G7-L6/EQ、42G9、32A10、20B9、14C11、21E11、49B11、46E10、12H6、19A9、21E7、11B11、12B2、11F10、17G11、29D5、30D8、20E12、26B9、32G8、34E7、20G5、C6和B5。
於一些實施態樣中，本發明提供CAR，其包含基於CDR接觸區之針對EGFRvIII抗體之抗體的CDR部分。CDR接觸區為賦予抗體對抗原之特異性的抗體區。一般而言，CDR接觸區包括CDR及游標區中之殘基位置，其受到限縮以維持適當之環結構、父供抗體結合特定抗原。參見，例如Makabe et al.,J.Biol.Chem.,283：1156-1166,2007。CDR接觸區域之測定完全在本技藝之技術範圍內。
如本文所描述之EGFRvIII特異性CAR對EGFRvIII(諸如人EGFRvIII(例如(SEQ ID NO：201))之結合親和力(KD)可為約0.001至約5000nM。於一些實施態樣中，該結合親和力為約下列群組中之任一者：5000nM、4500nM、4000nM、3500nM、3000nM、2500nM、2000nM、1789nM、1583nM、1540nM、1500nM、1490nM、1064nM、1000nM、933nM、894nM、750nM、705nM、678nM、532nM、500nM、494nM、400nM、349nM、340nM、353nM、300nM、250nM、244nM、231nM、225nM、207nM、200nM、186nM、172nM、136nM、113nM、104nM、101nM、100nM、90nM、83nM、79nM、74nM、54nM、50nM、45nM、42nM、40nM、35nM、32nM、30nM、25nM、24nM、22nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、12nM、10nM、9nM、8nM、7.5nM、7nM、6.5nM、6nM、5.5nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.3nM、0.1nM、0.01nM和0.001nM。於一些實施態樣中， 該結合親和力小於下列群組之任一者：約5000nM、4000nM、3000nM、2000nM、1000nM、900nM、800nM、250nM、200nM、100nM、50nM、30nM、20nM、10nM、7.5nM、7nM、6.5nM、6nM、5nM、4.5nM、4nM、3.5nM、3nM、2.5nM、2nM、1.5nM、1nM或0.5nM。
根據本發明之CAR的胞內信號傳導結構域在胞外配體-結合結構域與靶的結合後負責胞內信號傳導以造成免疫細胞活化和免疫反應。該胞內信號傳導結構域具有活化該表現CAR之免疫細胞中的正常效應子功能至少一者之能力。例如，T細胞之效應子功能可為細胞裂解活性或輔助子活性(包括分泌細胞因子)。
於一些實施態樣中，用於CAR之胞內信號傳導結構域可為(例如，但不限於)T細胞受體和該共同作用以在抗原受體結合後起始信號轉導之共受體的細胞質序列，以及該等序列之任何衍生物或變異體和具有相同作用能力之任何合成序列。胞內信號傳導結構域包含二種不同類別之細胞質信號傳導序列：那些起始抗原依賴性初級活化者及那些以抗原無關方式作用來提供二級或共刺激信號者。初級細胞質信號傳導序列可包含那些被稱為ITAM之免疫受體酪胺酸活化基序的信號傳導基序。ITAM為定義明確之信號傳導基序，其係在各種作為syk/zap70類別酪胺酸激酶之結合位點的受體之胞質內尾端發現。本發明中所使用之ITAM的實例可包括那些源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、 FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d之作為非限制性實例者。於一些實施態樣中，該CAR之胞內信號傳導結構域可包含CD3ζ(zeta)信號傳導結構域，該CD3ζ(zeta)信號傳導結構域之胺基酸序列與SEQ ID NO：205中所示之胺基酸序列具有至少約70%、較佳為至少80%，更佳為至少90%、95%、97%或99%之序列同一性。於一些實施態樣中，本發明之CAR的胞內信號傳導結構域包含共刺激分子之結構域。
於一些實施態樣中，本發明之CAR的胞內信號傳導結構域包含選自由下列群組所組成之共刺激分子的一部分：41BB(GenBank登錄編號：AAA53133)和CD28(NP_006130.1)之片段。於一些實施態樣中，本發明之CAR的胞內信號傳導結構域包含之胺基酸序列與SEQ ID NO：213(CD28信號傳導結構域)或SEQ ID NO：204(4-1BB信號傳導結構域)中所示之胺基酸序列具有至少70%、較佳為至少80%，更佳為至少90%、95%、97%或99%之序列同一性。
CAR表現在細胞之表面膜上。因此，該CAR可包含跨膜結構域。本文所揭示之CAR之合適的跨膜結構域能夠(a)表現在細胞(較佳為免疫細胞，諸如，例如，但不限於淋巴細胞或天然殺手(NK)細胞)表面，及(b)與配體-結合結構域和胞內信號傳導結構域交互作用以指導免疫細胞針對抗預先界定之靶細胞的細胞反應。跨膜結構域可源自天然或合成來源。跨膜結構域可源自任何膜結合或跨膜蛋 白。作為非限制性實例的有：該跨膜多肽可為T細胞受體之次單位，諸如α、β、γ或δ、多肽組成性CD3複合物、IL-2受體p55(α鏈)、p75(β鏈)或γ鏈、Fc受體之次單位鏈，尤其是Fcγ受體III或CD蛋白。或者，該跨膜結構域可為合成的且可主要包含疏水性殘基，諸如白胺酸和纈胺酸。於一些實施態樣中，該跨膜結構域源自人CD8α鏈(例如NP_001139345.1)。該CAR可進一步包含介於該胞外配體結合結構域和該跨膜結構域之間的莖結構域。莖結構域可包含至多300個胺基酸，較佳為10至100個胺基酸，最佳為25至50個胺基酸。莖區可源自所有或部分天然分子，諸如源自所有或部分之CD8、CD4或CD28之胞外區，或源自所有或部分之抗體恆定區。或者，該莖結構域可為對應於天然存在之莖序列的合成序列，或可為完全合成之莖序列。於一些實施態樣中，該莖結構域為人CD8α鏈(例如NP_001139345.1)之一部分。於另一特定之實施態樣中，該跨膜和鉸鏈結構域包含人CD8α鏈之一部分，較佳為分別與SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：208中所示之胺基酸序列具有至少70%(較佳為至少80%、更佳為至少90%、95%、97%或99%)之序列同一性。於一些實施態樣中，本發明所揭示之CAR可包含特異性結合EGFRvIII、CD8α人鉸鏈和跨膜結構域、CD3ζ信號傳導結構域及4-1BB信號傳導結構域之胞外配體結合結構域。
表4提供可用於本文所揭示之CAR中的示例性結構域。
表5A提供本發明之示例性EGFRvIII特異性CAR的胺基酸序列。表5A中，該信號/前導肽序列係以粗體表示，而GS連接子[(GGGGS)4(SEQ ID NO：202)]為下方劃線者。
表5B提供本發明之示例性EGFRvIII特異性CAR的scFv之核酸序列。表5B中，編碼CD8 α信號/前導肽之 序列為下方劃線者。
表5C提供本發明之示例性EGFRvIII特異性CAR的示例性核酸序列。
靶抗原之下調或突變在癌細胞經常見到，創建出抗原損失逃逸變異體。因此，為了抵消腫瘤逃逸並使免疫細胞更特異於靶的，該EGFRvIII特異性CAR可包含一或多個額外之胞外配體結合結構域以同時結合靶的中之不同元 件，藉此擴大免疫細胞活化和功能。於一實施態樣中，該胞外配體結合結構域可以串聯方式置於同一跨膜多肽上，且可藉由連接子而可選擇地分開。於一些實施態樣中，該不同胞外配體結合結構域可置於組成該CAR之不同跨膜多肽上。於一些實施態樣中，本發明關於CAR群，各CAR包含不同之胞外配體結合結構域。尤其是，本發明關於工程處理免疫細胞之方法，其包含提供免疫細胞並在細胞表面表現CAR群，各CAR包含不同之胞外配體結合結構域。於另一特定之實施態樣中，本發明關於工程處理免疫細胞之方法，其包含提供免疫細胞並將編碼構成CAR群(各CAR包含不同胞外配體結合結構域)之多肽的多核苷酸導入該細胞中。CAR群一詞係指至少二個、3個、四個、五個、六個或更多個CAR，其各自包含不同的胞外配體結合結構域。較佳地，根據本發明之不同胞外配體結合結構域可同時結合靶的中之不同元件，藉此擴大免疫細胞活化和功能。本發明亦關於包含CAR群(各CAR包含不同胞外配體結合結構域)之經分開的免疫細胞。
於另一態樣中，本發明提供編碼本文所描述之任何CAR和多肽之多核苷酸。多核苷酸可藉由本技藝已知之方法製備和表現。
於另一態樣中，本發明提供包含本發明之任何細胞的組成物(諸如醫藥組成物)。於一些實施態樣中，該組成物包含含有編碼本文所描述之任何CAR的多核苷酸之細胞。
本文中進一步描述表現載體及多核苷酸組成物之投予。
於另一態樣中，本發明提供製造本文所描述之任何多核苷酸之方法。
與任何該等序列互補之多核苷酸亦包含在本發明中。多核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股且可為DNA(基因組、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子(其含有內含子並以一對一之方式對應於DNA分子)和mRNA分子(其不含有內含子)。額外之編碼或非編碼序列可，但不一定，存在於本發明之多核苷酸內，且多核苷酸可，但不一定連接其他分子及/或支持材料。
多核苷酸可包含天然序列(即，編碼抗體或其部分之內源性序列)或可包含該等序列之變異體。多核苷酸變異體含有一或多個取代、添加、缺失及/或插入，從而使所編碼之多肽的免疫反應性相對於天然免疫反應性分子而言未被降低。對所編碼之多肽的免疫反應之影響通常可依本文中之描述評估。較佳地，變異體顯現出與編碼天然抗體或其部分之多核苷酸序列具有至少約70%之同一性，更佳為至少約80%之同一性，更佳地，至少約90%之同一性，且最佳地，至少約95%之同一性。
當依下述進行最大對應比對時，若二個多核苷酸或多肽序列中之核苷酸或胺基酸的序列相同，則該二個序列被說成是“同一的”。二個序列之間的比較通常係藉由在比較窗上比較序列來進行，以鑑定和比較具序列相似性之局部 區域。本文所使用之“比較窗”係指具有至少約20個，通常為30至約75個，或40至約50個連續位置的節段，其中可在二個序列進行最佳比對後，將序列與具相同數目之連續位置的參考序列進行比較。
用於比較之序列的最佳比對可利用Lasergene生物信息學軟體(DNASTAR公司，威斯康辛州麥迪遜市)套件中之Megalign程式，利用預設參數進行。該程式體現幾種描述於下列參考文獻中之比對方案：Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins -Matrices for detecting distant relationships。在Dayhoff, M.O.(ed.)，Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358； Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA； Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5：151-153； Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4：11-17； Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11：105； Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4：406-425； Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA； Wilbur, W.J. and Lipman, D.J.,1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730。
較佳地，“序列同一性之百分比”係藉由在具有至少20 個位置之比較窗上比較二個經最佳比對之序列來測定，相較於該用於二個序列之最佳比對的參考序列(其不包括添加或缺失)，其中該比較窗口中之多核苷酸或多肽序列部分可包含20%或更少，通常為5%至15%或10%至12%之添加或缺失(即，間隙)。該百分比係藉由下述方法計算：測定同時出現在二個序列中之完全相同的核酸鹼基或胺基酸殘基的位置數以產生經配對之位置數，將該經配對之位置數除以該參考序列中之位置的總數(即，窗口大小)並將結果乘以100以取得序列同一性之百分比。
或者，變異體亦可基本上與天然基因、或其一部分、或其補體同源。該等多核苷酸變異體能夠在中等嚴格條件下與編碼天然抗體之天然DNA序列(或互補序列)雜交。
合適之“中等嚴格條件”包括在5X SSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)之溶液中預洗；在50℃至65℃，5X SSC中雜交一整夜；接著在65℃下以各含有0.1%SDS之2X、0.5X和0.2X SSC清洗20分鐘，二次。
如本文所使用之“高度嚴格條件”或“高嚴格條件”係指下列群組：(1)採用低離子強度和高溫進行清洗，例如在50℃下，以0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉清洗；(2)在雜交期間採用變性劑，諸如甲醯胺，例如42℃之50%(v/v)甲醯胺，其帶有0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/50mM磷酸鈉緩衝液，pH 6.5(具有750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉)；或(3)採用42℃之50%甲醯胺、5×SSC(0.75M氯化鈉、 0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5x Denhardt氏溶液、經超音波處理之鮭魚精子DNA(50μg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚醣，在42℃，0.2×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中及在55℃，50%甲醯胺中清洗，接著以55℃，含有EDTA之0.1×SSC進行高嚴格性清洗。該技術熟習之人士將識別如何依需要調整溫度、離子強度，等以適應諸如探針長度，等因子。
本技藝之一般技術人士將察知由於遺傳密碼之簡併性，編碼如本文所描述之多肽的核苷酸序列有許多。該等多核苷酸中有些與任一天然基因之核苷酸序列僅具有最小同源性。儘管如此，由於密碼子用法之差異而有所變化之多核苷酸特別在本發明之考量中。此外，包含本文所提供之多核苷酸序列的基因之等位基因係在本發明之範圍內。等位基因為由於核苷酸之一或多個突變(諸如缺失、添加及/或取代)而被改變之內源基因。所產生之mRNA和蛋白質可能，但不一定具有改變之結構或功能。等位基因可使用標準技術(諸如雜交、擴增及/或數據庫序列比較)來鑑定。
本發明之多核苷酸可使用化學合成、重組方法或PCR來取得。化學多核苷酸合成方法為本技藝所熟知，不需要在此詳細地描述。本技藝之技術熟習人士可使用本文所提供之序列和市售之DNA合成儀來製造令人滿意之DNA序列。
為了使用重組方法製備多核苷酸，可將包含所欲序列 之多核苷酸插入合適之載體中，然後可將該載體引入如本文中進一步討論之用於複製和擴增之合適的宿主細胞。多核苷酸可藉由本技藝中已知之任何方式插入宿主細胞中。細胞係藉由直接攝入、內吞作用、轉染、F-交配或電穿孔方式引入外源性多核苷酸來轉形。一旦引入後，該外源性多核苷酸可以未經整合之載體(諸如質粒)形式保持在細胞內或被整合入宿主細胞基因組中。該以此方式擴增之多核苷酸可藉由本技藝中所熟知之方法從該宿主細胞中分離。參見，例如，Sambrook等人，1989。
或者，PCR允許DNA序列之複製。PCR技術為本技藝所熟知且描述於美國專利案第4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202號，以及PCR：The Polymerase Chain Reaction,Mullis et al.eds.,Birkauswer Press,Boston,1994中。
RNA可藉由使用在合適載體中之經分離的DNA並將其插入合適之宿主細胞中來取得。當細胞複製且該DNA被轉錄成RNA時，可使用本技藝之技術熟習人士所熟知之方法(例如Sambrook等人，1989(同上)中所提出者)將該RNA分離出。
合適之選殖載體可根據標準技術構建或可從本技藝中可用之大量選殖載體選擇。雖然所選擇之選殖載體根據所欲使用之宿主細胞而可能有所不同，有用之選殖載體將通常具有自我複製之能力，可能擁有用於特定限制性內切酶之單一靶的及/或可能攜帶可用於選擇含有該載體之選殖 株之標記物的基因。合適之實例包括質粒和細菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體，諸如pSA3和pAT28。該等及許多其他選殖載體可從商品供應商，諸如BioRad、Strategene和Invitrogen公司取得。
表現載體通常為含有根據本發明之多核苷酸的可複製之多核苷酸構建體。此暗示表現載體必須可以游離基因(episome)或染色體DNA之組成部分的形式在宿主細胞中複製。合適之表現載體包括，但不限於質粒、病毒載體(包括腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒)、黏粒和PCT刊物第WO 87/04462號中所揭示之表現載體。載體組分通常可包括，但不限於下列群組之一或多者：信號序列；複製起點；一或多個標記基因；合適之轉錄控制元件(諸如啟動子、增強子和終止子)。為了表現(即轉譯)，通常亦需要一或多個轉譯控制元件，諸如核糖體結合位點、轉譯起始位點及終止密碼子。
含有所欲之多核苷酸的載體可藉由多種適當方式中之任一者來引入宿主細胞，該適當方式包括電穿孔、轉染(採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚醣或其他物質)；基因槍(microprojectile bombardment)；脂質體轉染；及感染(例如其中該載體為感染劑，諸如牛痘病毒)。引入載體或多核苷酸之選擇常常取決於該宿主細胞之特性。
編碼本文所揭示之EGFRvIII特異性CAR的多核苷酸可存在於表現盒或表現載體(例如用於引入細菌宿主細胞之質粒或病毒載體，諸如用於轉染昆蟲宿主細胞之桿狀病毒載體，或用於轉染哺乳動物宿主細胞之質粒或病毒載體，諸如慢病毒(lentivirus))中。於一些實施態樣中，多核苷酸或載體可包括編碼核糖體跳過序列之核酸序列，諸如，例如，但不限於編碼2A肽之序列。2A肽類(其係在細小核糖核酸病毒(picornavirus)之口蹄疫病毒(Aphthovirus)亞群中鑑定出)導致核糖體“跳過”一個密碼子到下一個密碼子，而沒有在由該等密碼子編碼的二個胺基酸之間形成肽鍵(參見(Donnelly and Elliott 2001；Atkins,Wills et al.2007；Doronina,Wu et al.2008))。“密碼子”一詞係指在mRNA上(或DNA分子之意義股上)，由核糖體轉譯成一個胺基酸殘基的3個核苷酸。因此，當多肽被框架內之2A寡肽序列分開時可從在imRNA內之單一、連續開放閱讀框架合成二個多肽。該等核糖體跳過機制為本技藝所熟知且已知有數種載體使用此機制來表現由單一信使RNA編碼的數種蛋白質。
於一些實施態樣中，為了指導跨膜多肽進入宿主細胞之分泌途徑中，在多核苷酸序列或載體序列中提供分泌信號序列(亦稱為信號肽、前導序列、前原序列(prepro sequence)或前序列)。該分泌信號序列係可操作地連接跨膜核酸序列，即，該二個序列在正確的閱讀框架內接合並定位以指導新合成之多肽進入宿主細胞之分泌途徑。分泌 信號序列通常位於該編碼所欲多肽之核酸序列的5'，儘管某些分泌信號序列可能位於該所欲之核酸序列中的其他位置(參見，例如Welch et al.,美國專利案第5,037,743號；Holland et al.,美國專利案第5,143,830號)。於一些實施態樣中，該信號肽包含SEQ ID NO：206或214中所示之胺基酸序列。鑑於遺傳密碼之簡併性，本技藝之技術熟習人士將認可該等多核苷酸分子中可能存在有相當多之序列變化。於一些實施態樣中，本發明之核酸序列係經密碼子優化以在哺乳動物細胞中表現，較佳為用於在人類細胞中表現。密碼子優化係指在指定物種之高度表現的基因中之通常罕見的密碼子之所欲序列被該等物種之高度表現的基因中之通常頻繁的密碼子交換，該等密碼子編碼與該被交換之密碼子同一胺基酸。
工程處理免疫細胞之方法
本發明提供製備用於免疫療法之免疫細胞的方法。於一些實施態樣中，該方法包含將根據本發明之CAR引入免疫細胞並擴增該細胞。於一些實施態樣中，本發明關於工程處理免疫細胞之方法，其包含：提供細胞並在該細胞之表面表現至少一種如上述之CAR。用於工程處理免疫細胞之方法描述於，例如PCT專利申請刊物編號WO/2014/039523、WO/2014/184741、WO/2014/191128、WO/2014/184744及WO/2014/184143中，各篇之全部內容以引用方式併入本文。於一些實施態樣中，該方法包含： 以至少一個編碼如上述之CAR的多核苷酸將細胞轉形並在細胞中表現該多核苷酸。
於一些實施態樣中，該多核苷酸係存在於慢病毒載體中以在細胞中穩定表現。
於一些實施態樣中，該方法可進一步包含藉由將至少一個表現，例如，但不限於下列群組之基因去活化以遺傳上修飾細胞的步驟：TCR之組分、免疫抑制劑之靶的、HLA基因及/或免疫檢查點蛋白質，諸如，例如PDCD1或CTLA-4。將基因去活化一詞意指該所欲基因不以功能性蛋白之形式表現。於一些實施態樣中，該欲去活化之基因係選自由下列所組成之群組，例如，但不限於：TCR α、TCR β、dCK、CD52、GR、PD-1及CTLA-4。於一些實施態樣中，該方法包含將能選擇性地裂解DNA來將基因選擇性地去活化的罕見切割核酸內切酶引入細胞以將一或多個基因去活化。於一些實施態樣中，該罕見切割核酸內切酶可為，例如轉錄活化子樣效應子核酸酶(TALE核酸酶)或Cas9核酸內切酶。
於一些實施態樣中，將另外之催化結構域與罕見切割核酸內切酶一起使用來增強其將靶的基因去活化之能力。例如，另外之催化結構域可為DNA端加工酶。DNA末端加工酶之非限制性實例包括5-3'核酸外切酶、3-5'核酸外切酶、5-3'鹼性核酸外切酶、5'瓣狀核酸內切酶(flap endonuclease)、解旋酶(helicase)、磷酸酶、水解酶(hydrolase)及模板無關性DNA聚合酶。該等催化結構域 之非限制性實例包含選自由下列所組成之群組的蛋白質結構域或該蛋白質結構域之催化活性衍生物：hExol(EXO1_HUMAN)、酵母Exol(EXO1_YEAST)、大腸桿菌Exol、人TREX2、小鼠TREX1、人TREX1、牛TREX1、大鼠TREX1、TdT(終端脫氧核苷酸轉移酶)人DNA2、酵母DNA2(DNA2_YEAST)。於一些實施態樣中，另外之催化結構域可具有3'-5'-核酸外切酶活性且於一些實施態樣中，該另外之催化結構域為TREX，更佳為TREX2催化結構域(WO2012/058458)。於一些實施態樣中，該催化結構域係由單鏈TREX多肽編碼。該另外之催化結構域可與核酸酶融合蛋白或嵌合型蛋白融合。於一些實施態樣中，該另外之催化結構域係使用，例如肽連接子融合。
於一些實施態樣中，該方法進一步包含將包含至少一個與靶的核酸序列之一部分同源的序列之外源核酸引入細胞，從而使該靶的核酸序列和外源核酸之間發生同源重組的步驟。於一些實施態樣中，該外源核酸包含分別與該靶的核酸序列之5'和3'區同源的第一和第二部分。該外源核酸亦可包含位在第一和第二部分之間的第三部分，該第三部分不包含與該靶的核酸序列之5'和3'區同源之序列。該靶的核酸序列裂解後，該靶的核酸序列和外源核酸之間受刺激產生同源重組事件。於一些實施態樣中，該供體基質內可使用具有至少約50bp、大於約100bp或大於約200bp之同源序列。該外源核酸可為，例如，但不限於約200bp 至約6000bp，更佳為約1000bp至約2000bp。共有之核酸同源性係位於鄰接該斷裂位點之上游和下游區中，而該待引入之核酸序列係位於二個臂之間。
於一些實施態樣中，核酸依次包含下列各項：與該裂解位點上游之序列同源的第一區；用於將選自由下列所組成之群組的被靶向基因去活化之序列：TCR α、TCR β、CD52、糖皮質激素受體(GR)、脫氧胞苷激酶(dCK)及免疫檢查點蛋白質，諸如，例如程序性死亡-1(PD-1)；和與該裂解位點下游之序列同源的第二區。該多核苷酸引入步驟可在引入或表現該罕見切割核酸內切酶之同時、之前或之後進行。根據其中已發生斷裂事件之靶的核酸序列的位置，可使用該等外源性核酸來剔除基因(例如當外源核酸係位於該基因之開放閱讀框架內時)或用來引入所欲之新序列或基因。使用該等外源核酸來插入序列時可藉由校正或替換該基因(非限制性之實例為等位基因交換)來修改被靶向之現存基因，或用來上調或下調被靶向之基因的表現(非限制性之實例為啟動子交換)、校正或更換被靶向之基因。於一些實施態樣中，藉由特異性TALE核酸酶可在被靶向之精確的基因組位置將選自由下列所組成之群組的基因去活化：TCR α、TCR β、CD52、GR、dCK及免疫檢查點蛋白質，其中該特異性TALE核酸酶催化裂解且其中該外源核酸依次包含至少一個同源區及序列以將一個選自由下列所組成之群組的被靶向之基因(其係藉由同源重組整合)去活化：TCR α、TCR β、CD52、GR、dCK及免疫 檢查點蛋白質。於一些實施態樣中，藉由分別使用數種TALE-核酸酶並特異靶向一個限定基因及數個用於去活化特定基因之多核苷酸可依次或同時將數個基因去活化。
於一些實施態樣中，該方法包含將一或多個選自由下列所組成之群組之另外的基因去活化：TCR α、TCR β、CD52、GR、dCK及免疫檢查點蛋白質。於一些實施態樣中，基因去活化可藉由下列步驟完成：將至少一種罕見切割核酸內切酶引入細胞，從而使該罕見切割核酸內切酶特異地催化該細胞基因組之被靶向的序列裂解；及可選擇地，將依次包含下列群組之外源性核酸引入該細胞：與該裂解位點上游之序列同源的第一區、欲插入該細胞之基因組中的序列及與該裂解位點下游之序列同源的第二區；其中該經引入之外源性核酸將基因去活化並整合至少一個編碼至少一種所欲之重組蛋白的外源性多核苷酸序列。於一些實施態樣中，該外源性多核苷酸序列係整合在編碼選自由下列所組成之群組的蛋白質之基因內：TCR α、TCR β、CD52、GR、dCK及免疫檢查點蛋白質。
於另一態樣中，遺傳工程修飾細胞之步驟可包含：經由將至少一個表現免疫抑制劑之靶的之基因去活化來修改T細胞，及；可選擇地在免疫抑制劑之存在下擴增細胞。免疫抑制劑為一種藥劑，其藉由數種作用機制的其中一者來抑制免疫功能。免疫抑制劑可減少免疫反應之程度及/或強烈。免疫抑制劑之非限制性實例包括鈣調磷酸酶(calcineurin)抑制劑、雷帕黴素(rapamycin)之靶的、介白 素-2 α鏈阻斷劑、肌苷一磷酸脫氫酶抑制劑、二氫葉酸還原酶抑制劑、皮質類固醇及免疫抑制抗代謝物。一些細胞毒性免疫抑制劑係藉由抑制DNA合成來作用。其他可能係透過活化T細胞或抑制輔助細胞活化來作用。根據本發明之方法經由將T細胞中之免疫抑制劑靶的去活化來賦予T細胞對免疫療法之免疫抑制抗性。免疫抑制劑之靶的之非限制性實例可為免疫抑制劑之受體，諸如，例如，但不限於CD52、糖皮質激素受體(GR)、FKBP族基因成員及親環素族基因成員。
於一些實施態樣中，該方法之遺傳修飾涉及在所提供之欲工程處理的細胞中表現一種罕見切割核酸內切酶，從而使該罕見切割核酸內切酶特異地催化一個靶的基因中之裂解，藉此將該被靶向之基因去活化。於一些實施態樣中，工程處理細胞之方法包含至少一個下列步驟：提供T細胞(諸如來自細胞培養物或來自血液樣本)；在表現免疫抑制劑之靶的之T細胞中選擇基因；將罕見切割核酸內切酶引入T細胞以藉由DNA裂解(較佳地，藉由斷裂雙股)來選擇性地將編碼該免疫抑制劑之靶的之基因去活化並可選擇地在免疫抑制劑之存在下擴增該細胞。
於一些實施態樣中，該方法包含：提供T細胞(諸如來自細胞培養物或來自血液樣本)；在其中該基因表現用於免疫抑制劑之靶的之T細胞中選擇基因；以編碼罕見切割核酸內切酶之核酸將該T細胞轉形，該罕見切割核酸內切酶能夠藉由DNA裂解(較佳地，藉由斷裂雙股)來選擇 性地將編碼用於免疫抑制劑之靶的之基因去活化，並在T細胞中表現該罕見切割核酸內切酶；及可選擇地在免疫抑制劑之存在下擴增該細胞。
於一些實施態樣中，該罕見切割核酸內切酶特異性靶向CD52或GR。於一些實施態樣中，該被選定之去活化的基因係編碼CD52且該免疫抑制治療包含靶向CD52抗原之人化抗體。於一些實施態樣中，該被選定之去活化的基因係編碼GR，且該免疫抑制治療包含皮質類固醇，諸如地塞米松(dexamethasone)。於一些實施態樣中，該被選定之去活化的基因為FKBP族基因成員或其變體，且該免疫抑制治療包含FK506，亦稱為他克莫司(Tacrolimus)或藤黴素(fujimycin)。於一些實施態樣中，該FKBP族基因成員為FKBP12或其變體。於一些實施態樣中，該被選定之去活化的基因為親環素族基因成員或其變體且該免疫抑制治療包含環孢素(cyclosporine)。
於一些實施態樣中，該罕見切割核酸內切酶可為，例如大範圍核酸酶(meganuclease)、鋅指核酸酶或TALE核酸酶。於一些實施態樣中，該罕見切割核酸內切酶為TALE核酸酶。
本發明亦提供工程處理適合用於免疫療法之T細胞的方法，其中該方法包含：藉由去活化至少一種免疫檢查點蛋白質來遺傳修飾T細胞。於一些實施態樣中，該免疫檢查點蛋白質為，例如PD-1及/或CTLA-4。於一些實施態樣中，遺傳修飾細胞之方法包含：藉由去活化至少一個免 疫檢查點蛋白質來修飾T細胞；並擴增該細胞。免疫檢查點蛋白質包括，但不限於程序性死亡-1(PD-1，亦稱為PDCD1或CD279，登錄編號：NM_005018)、細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA-4，亦稱為CD152，GenBank登錄編號AF414120.1)、LAG3(亦稱為CD223，登錄編號：NM-002286.5)、Tim3(亦稱為HAVCR2，GenBank登錄編號：JX049979.1)、BTLA(亦稱為CD272，登錄編號：NM_181780.3)、BY55(亦稱為CD160，GenBank登錄編號：CR541888.1)、TIGIT(亦稱為VSTM3，登錄編號：NM_173799)、B7H5(亦稱為C10orf54，小鼠vista基因之同源物，登錄編號：NM_022153.1)、LAIR1(亦稱為CD305，GenBank登錄編號：CR542051.1)、SIGLEC10(GenBank登錄編號：AY358337.1)、2B4(亦稱為CD244，登錄編號：NM_001166664.1)，其直接抑制免疫細胞。例如，CTLA-4為表現在某些CD4和CD8 T細胞上之細胞表面蛋白；當與抗原呈遞細胞上之其配體(B7-1和B7-2)接合時，T細胞活化及效應子功能受抑制。
於一些實施態樣中，該工程處理細胞之方法包含下列步驟至少一者：提供T細胞(諸如來自細胞培養物或來自血液樣本)；將能夠藉由DNA裂解(較佳地，藉由雙股斷裂)來將一個編碼免疫檢查點蛋白質之基因選擇性地去活化的罕見切割核酸內切酶引入T細胞；並擴增該細胞。於一些實施態樣中，該方法包含：提供T細胞(諸如來自細胞培養物或來自血液樣本)；以編碼罕見切割核酸內切酶 之核酸轉染該T細胞，該罕見切割核酸內切酶能夠藉由DNA裂解(較佳地，藉由雙股斷裂)來將編碼免疫檢查點蛋白質之基因選擇性地去活化；在T細胞中表現該罕見切割核酸內切酶；擴增該細胞。於一些實施態樣中，該罕見切割核酸內切酶特異性靶向選自由下列所組成之群組的基因：PD-1、CTLA-4、LAG3、Tim3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLEC10、2B4、TCR α和TCR β。於一些實施態樣中，該罕見切割核酸內切酶可為大範圍核酸酶、鋅指核酸酶或TALE核酸酶。於一些實施態樣中，該罕見切割核酸內切酶為TALE核酸酶。
於一些實施態樣中，本發明可能特別適合用於同種異基因(allogeneic)免疫療法。於該等實施態樣中，細胞可藉由包含下列步驟之方法來修飾：將T細胞中至少一個編碼T細胞受體(TCR)組分之基因去活化；及擴增該T細胞。於一些實施態樣中，該方法之遺傳修飾係依賴在所提供之欲進行工程處理的細胞中表現一種罕見切割核酸內切酶，從而使該罕見切割核酸內切酶特異催化在一個被靶向之基因中的裂解，藉此將該被靶向之基因去活化。於一些實施態樣中，該工程處理細胞之方法包含下列步驟至少一者：提供T細胞(諸如來自細胞培養物或來自血液樣本)；將能夠藉由DNA裂解(較佳地，藉由雙股斷裂)來將至少一個編碼T細胞受體(TCR)組分之基因選擇性地去活化的罕見切割核酸內切酶引入T細胞；並擴增該細胞。
於一些實施態樣中，該方法包含：提供T細胞(諸如 來自細胞培養物或來自血液樣本)；以編碼罕見切割核酸內切酶之核酸轉染該T細胞，該罕見切割核酸內切酶能夠藉由DNA裂解(較佳地，藉由雙股斷裂)來將至少一個編碼T細胞受體(TCR)之組分的基因選擇性地去活化；在T細胞中表現該罕見切割核酸內切酶；分選出該經轉染之T細胞(此T細胞不會在其細胞表面上表現TCR)；並擴增該細胞。
於一些實施態樣中，該罕見切割核酸內切酶可為大範圍核酸酶、鋅指核酸酶或TALE核酸酶。於一些實施態樣中，該罕見切割核酸內切酶為TALE核酸酶。於一些實施態樣中，該TALE核酸酶識別並裂解編碼TCR α或TCR β之序列。於一些實施態樣中，TALE核酸酶包含選自SEQ ID NO：218、219、220、221、222、223、224或225中所示之胺基酸序列的多肽序列。
TALE核酸酶多肽序列：
重複子TRAC T01-L
(SEQ ID NO：218)
重複子TRAC T01-R
(SEQ ID NO：219)
重複子TRBC T01-L
(SEQ ID NO：220)
重複子TRBC T01-R
(SEQ ID NO：221)
重複子TRBC T02-L
(SEQ ID NO：222)
重複子TRBC T02-R
(SEQ ID NO：223)
重複子CD52_T02-L
(SEQ ID NO：224)
重複子CD52_T02-R
(SEQ ID NO：225)
於另一態樣中，遺傳修飾細胞之另一步驟可為擴增TCR α缺失之T細胞的方法，其包含將pT α(亦稱為preTCR α)或其功能性變體引入T細胞並擴增該細胞，此可選擇地透過刺激CD3複合物進行。於一些實施態樣中，該方法包含：a)以編碼至少一個pT α之片段的核酸將該細胞轉形以支持CD3表面表現；b)在細胞中表現該pT α；和c)擴增該細胞，此可選擇地透過刺激CD3複合物進行。
本發明亦提供製備用於免疫療法之T細胞的方法，其 包含本文所提供之用於擴增T細胞之方法的步驟。於一些實施態樣中，該pT α多核苷酸序列可隨機地或藉由同源重組而被引入細胞。於一些實施態樣中，插入可能與該TCR α基因去活化關聯。
可使用pT α之不同功能性變體。肽的“功能性變體”係指基本上類似於該整個肽或其片段之分子。pT α或其功能性變體之“片段”係指該分子之任何子集，亦即，較全長pT α短之肽。於一些實施態樣中，pT α或功能變體可為，例如全長pT α或C端截短之pT α版本。C端截短之pT α缺乏C端一或多個殘基。C端截短之pT α版本的非限制性實例缺乏來自該蛋白質之C端的18、48、62、78、92、110或114殘基。該肽之胺基酸序列變體可藉由在編碼該肽之DNA中的突變來製備。該等功能性變體包括，例如刪除、或插入或取代該胺基酸序列內之殘基。亦可製造任何缺失、插入和取代之組合以獲得最終之構建體，惟其該最終構建體具有所期望之活性，尤其是功能性CD3複合物回復。於較佳之實施態樣中，在如上述之不同pT α版本中引入至少一個突變以影響二聚體化。突變之殘基的非限制性實例可至少為人pT α蛋白之W46R、D22A、K24A、R102A或R117A或使用CLUSTALW法之在pT α族或同系成員上之經比對的位置。較佳地，如上述之pT α或其變體包含突變之殘基W46R或突變之殘基D22A、K24A、R102A和R117A。於一些實施態樣中，該pT α或變體亦與信號-轉導結構域融 合，其非限制性實例為諸如CD28、OX40、ICOS、CD27、CD137(4-1BB)和CD8。如上述之pT α或變體的胞外結構域可與TCR α蛋白之片段融合，尤其是TCR α之跨膜結構域和胞內結構域。pT α變體亦可與TCR α之胞內結構域融合。
於一些實施態樣中，pT α版本可與胞外配體結合結構域融合。於一些實施態樣中，pT α或其功能性變體係與單鏈抗體片段(scFv)融合，該單鏈抗體片段(scFv)包含藉由彈性連接子連結之靶的抗原特異性單株抗體的輕鏈和重鏈可變片段。
術語“TCR α缺失之T細胞”係指缺少功能性TCR α鏈之表現的經分離之T細胞。此可藉由不同方式完成，非限制性實例為藉由工程處理T細胞，從而使其細胞表面不會表現任何功能性TCR α，或藉由工程處理T細胞，從而使其表面產生極少之功能性TCR α鏈，或藉由工程處理T細胞以表現TCR α鏈之突變或截短形式。TCR α缺失之細胞無法再透過CD3複合物擴增。因此，為了克服此問題並允許TCR α缺失之細胞增殖，將pT α或其功能性變體引入細胞，從而回復功能性CD3複合物。於一些實施態樣中，該方法進一步包含將罕見切割核酸內切酶引入該T細胞，該罕見切割核酸內切酶能夠藉由DNA裂解來選擇性地將編碼T細胞受體(TCR)之一種組分的一個基因去活化。於一些實施態樣中，該罕見切割核酸內切酶為TALE核酸酶。
於另一態樣中，藉由本文所描述之方法取得之經工程處理的T細胞可與雙特異性抗體接觸。例如，該T細胞可在投予患者前先在活體外與雙特異性抗體接觸，或在投予患者後與雙特異性抗體在活體內接觸。雙特異性抗體包含二個具有不同抗原性質(其有助於將該經工程處理之細胞帶到接近靶的抗原處)之可變區。非限制性實例有雙特異性抗體，其可針對腫瘤標記及淋巴細胞抗原(諸如，例如，但不限於CD3)且具有重新定向和活化任何循環之T細胞對抗腫瘤的潛力者。
於一些實施態樣中，編碼根據本發明之多肽的多核苷酸可為mRNA，其可，例如藉由電穿孔直接被引入細胞。於一些實施態樣中，可使用細胞脈衝技術來瞬時通透活細胞以將物質遞送入細胞。參數可經修改以決定用於高轉染效率並具最小死亡率之條件。
本發明亦提供將T細胞轉形之方法。於一些實施態樣中，該方法包含：將T細胞與RNA接觸並在T細胞上施用由下列群組所組成之迅速脈衝順序：(a)每厘米之電壓範圍為約2250至3000V的電脈衝；(b)脈衝寬度為0.1ms；(c)介於步驟(a)和(b)之電脈衝之間的脈衝間隔為約0.2至10ms；(d)電壓範圍為約2250至3000V，脈衝寬度為約100ms之電脈衝且步驟(b)和步驟(c)之第1個電脈衝之間的脈衝間隔為約100ms；和(e)4個電壓為約325V，脈衝寬度為約0.2ms之電脈衝且4個電脈衝各自之間的脈衝間隔為2ms。於一些實施態樣中，將T細胞轉形之方法 包含將該T細胞與RNA接觸並在T細胞上施用包含下列群組之agile脈衝順序：(a)電壓為每厘米約2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V之電脈衝；(b)脈衝寬度為0.1ms；(c)介於步驟(a)和(b)之電脈衝之間的脈衝間隔為約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10ms；(d)一個電脈衝，其電壓範圍為約2250、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V，脈衝寬度為約100ms且步驟(b)之電脈衝和步驟(c)之第1個電脈衝之間的脈衝間隔為100ms；和(e)4個電壓為約325V，脈衝寬度為約0.2ms之電脈衝且4個電脈衝各自之間的脈衝間隔為2ms。包含在上述數值範圍內之任何數值揭示於本申請案中。電穿孔介質可為本技藝中已知之任何合適的介質。於一些實施態樣中，該電穿孔介質在橫跨約0.01至約1.0毫西門子(milliSiemens)之範圍內具有導電性。
於一些實施態樣中，非限制性實例有：RNA編碼罕見切割核酸內切酶、一種罕見切割核酸內切酶之單體，諸如半-TALE核酸酶、CAR、至少一個多鏈嵌合型抗原受體之組分、pT α或其功能性變體、外源核酸及/或一個另外之催化性結構域。
經工程處理之免疫細胞
本發明亦提供包含本文所描述之任一CAR多核苷酸 的經工程處理之免疫細胞。於一些實施態樣中，CAR可以轉基因形式經由質粒載體被引入免疫細胞。於一些實施態樣中，該質粒載體亦可含有，例如用於鑑別及/或選擇接收該載體之細胞的選擇標記。
將編碼該CAR多肽之多核苷酸引入細胞後，可在該細胞內原位合成CAR多肽。或者，可在細胞外產生CAR多肽，然後再引入細胞。用於將多核苷酸構建體引入細胞之方法為本技藝所已知。於一些實施態樣中，可使用穩定之轉染方法來將該多核苷酸構建體整合入細胞之基因組中。於其他實施態樣中，可使用瞬時轉染方法來瞬時表現該多核苷酸構建體，而該多核苷酸構建體並未整合入細胞之基因組中。於其他實施態樣中，可使用由病毒介導之方法。該多核苷酸可藉由任何合適之方式，諸如，例如重組病毒載體(例如逆轉錄病毒、腺病毒)、脂質體和類似物被引入細胞。瞬時轉染方法包括，例如，但不限於微注射、電穿孔或粒子轟擊(particle bombardment)。多核苷酸可被包含在載體中，諸如，例如質粒載體或病毒載體。
本發明亦提供藉由上述之工程處理本文提供之細胞的方法所取得之經分離的細胞和細胞株。於一些實施態樣中，經分離之細胞包含至少一個如上述之CAR。於一些實施態樣中，經分離之細胞包含CAR群，各CAR包含不同之胞外配體結合結構域。
本發明亦提供根據上述任一方法取得之經分離之免疫細胞。能夠表現異源DNA之任何免疫細胞均可用來表現 所欲之CAR。於一些實施態樣中，該免疫細胞為T細胞。於一些實施態樣中，免疫細胞可源自，例如，但不限於幹細胞。該幹細胞可為成體幹細胞、非人類胚胎幹細胞，更特別地，非人類幹細胞、臍帶血幹細胞、祖細胞、骨髓幹細胞、誘導性多功能幹細胞、全能性幹細胞或造血幹細胞。代表性人類細胞為CD34+細胞。該經分離之細胞亦可為樹突細胞、殺手樹突細胞、肥大細胞、NK細胞、B細胞或選自由下列所組成之群組的T細胞：炎性T淋巴細胞、細胞毒性T淋巴細胞、調節性T淋巴細胞、記憶性T淋巴細胞或輔助T淋巴細胞。於一些實施態樣中，該細胞可源自由下列所組成之群組：CD4+T淋巴細胞及CD8+T淋巴細胞。
在擴增和遺傳修飾之前，細胞的來源可透過各種非限制性方法得自個體。細胞可從多種非限制性來源取得，包括外周血單核細胞、骨髓、淋巴節組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位的組織、腹水、胸膜積液、脾臟組織和腫瘤。於一些實施態樣中，可使用本技藝之技術熟習人士所能取用且已知之任何數目的T細胞株。於一些實施態樣中，該細胞可源自健康供體、被診斷罹患癌症之患者或被診斷具有感染之患者。於一些實施態樣中，該細胞可為呈現出不同之表型特徵的混合細胞群之一部分。
本發明亦提供從根據上述任何方法轉染之T細胞取得之細胞株。本發明亦提供對免疫抑制治療具抗性之經修飾的細胞。於一些實施態樣中，根據本發明之經分離的細胞 包含編碼CAR之多核苷酸。
本發明之免疫細胞可在基因修飾T細胞之前或之後使用通常描述於(例如，但不限於)下列文獻中之方法活化及擴增：美國專利案第6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041號；和美國專利申請刊物第20060121005號中所揭示之方法。T細胞可在活體外或活體內擴增。一般而言，本發明之T細胞可，例如藉由將刺激CD3 TCR複合物之藥劑與該T細胞表面上之共刺激分子接觸來創建用於T細胞之活化信號來進行擴增。例如可使用化學物質，諸如鈣離子載體A23187、佛波醇12-肉登蔻酸酯13-醋酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate)(PMA)或促有絲分裂凝集素(lectine)樣植物血凝素(PHA)來創建用於T細胞之活化信號。
於一些實施態樣中，該T細胞群可經由在玻管內與，例如抗CD3抗體或其抗原結合片段、或固定在表面上之抗CD2抗體接觸或經由接觸與鈣離子載體軛合之蛋白激酶C活化劑(例如苔蘚抑素(bryostatin))而被刺激。為了共刺激在T細胞表面上之輔助分子，使用與該輔助分子結合之配體。例如，可將T細胞群在適合用於刺激T細胞增殖之條件下與抗CD3抗體和抗CD28抗體接觸。用於T細胞培養之適當條件包括可能含有增殖和存活之必要因子的適當培養基(例如最小必需培養基或RPMI培養基1640或X- vivo 5(Lonza))，該增殖和存活之必要因子包括血清(例如胎牛血清或人血清)、介白素-2(IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、IL-15、TGFp及TNF，或本技藝之技術熟習人士已知之用於細胞生長的任何其他添加劑。用於細胞生長之其他添加劑包括，但不限於界面活性劑、人血漿蛋白粉(plasmanate)及還原劑，諸如N-乙醯基-半胱胺酸和2-巰基乙醇。培養基可包括具有添加之胺基酸、丙酮酸鈉及維生素的RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 10及X-Vivo 20、Optimizer，其可不含血清或經補充適量之血清(或血漿)或限定之激素組，及/或足以用於長成和擴增T細胞之細胞因子量。抗生素(例如青黴素和鏈黴素)僅包含在實驗培養物中，不包含在那些欲注入個體之細胞培養物中。靶細胞係保持在支持生長之必要條件下，例如適當之溫度(例如37℃)和大氣(例如空氣加5% CO2)。已暴露於各種刺激時間的T細胞可顯現出不同的特徵。
於一些實施態樣中，本發明之細胞可藉由與組織或細胞共同培養來擴增。該細胞亦可在活體內擴增，例如在該細胞被投予入個體後在該個體之血液中擴增。
於一些實施態樣中，該根據本發明之經分離的細胞包含一個選自由下列所組成之群組的經去活化之基因：CD52、dCK、GR、PD-1、CTLA-4、LAG3、Tim3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLEC10、2B4、HLA、TCR α和TCR β及/或表現CAR、多鏈CAR 及/或pT α轉基因。於一些實施態樣中，經分離之細胞包含編碼包含多鏈CAR之多肽的多核苷酸。於一些實施態樣中，該根據本發明之經分離的細胞包含二個選自由下列所組成之群組的經去活化之基因：CD52和GR、CD52和TCR α、CDR52和TCR β、GR和TCR α、GR和TCR β、TCR α和TCR β、PD-1和TCR α、PD-1和TCR β、CTLA-4和TCR α、CTLA-4和TCR β、LAG3和TCR α、LAG3和TCR β、Tim3和TCR α、Tim3和TCR β、BTLA和TCR α、BTLA和TCR β、BY55和TCR α、BY55和TCR β、TIGIT和TCR α、TIGIT和TCR β、B7H5和TCR α、B7H5和TCR β、LAIR1和TCR α、LAIR1和TCR β、SIGLEC10和TCR α、SIGLEC10和TCR β、2B4和TCR α、2B4和TCR β及/或表現CAR、多鏈CAR和pT α轉基因。
於一些實施態樣中，藉由將TCR α基因及/或TCR β基因去活化來使得TCR無法在根據本發明之細胞中運作。於一些實施態樣中，提供用來取得源自個體之經修飾之細胞的方法，其中該細胞能夠獨立於主要組織相容性複合體(MHC)信號傳導通路而增殖。可獨立於MHC信號傳導通路而增殖，且可藉由本方法取得之經修飾的細胞係包含在本發明之範圍內。本文所所揭示之經修飾的細胞可用於治療有此需要之患者以對抗宿主抗移植物(HvG)排斥反應和移植物抗宿主病(GvHD)；因此，本發明之範圍包含用於治療有此需要之患者以對抗宿主抗移植物(HvG)排斥 和移植物抗宿主病(GvHD)的方法，該方法包含經由投予該患者有效量之包含經去活化的TCR α及/或TCR β基因的經修飾之細胞。
於一些實施態樣中，該免疫細胞係經工程處理成對一或多種化療藥物具有抗性。該化療藥物可為例如嘌呤核苷酸類似物(PNA)，從而使免疫細胞適合用於與過繼性免疫療法和化療組合之癌症治療。示例性PNA包括，例如單獨或組合之氯法拉濱(clofarabine)、氟達拉濱(fludarabine)和阿糖胞苷。PNA被脫氧胞苷激酶(dCK)代謝成單、二及三磷酸PNA。其三磷酸鹽形式與ATP競爭合成DNA，作為促凋亡劑且為核糖核苷酸還原酶(RNR)之強效抑制劑，該核糖核苷酸還原酶參與製造三核苷酸。本文提供包含經去活化之dCK基因的EGFRvIII特異性CAR-T細胞。於一些實施態樣中，該dCK剔除細胞係使用編碼針對dCK基因之特異性TAL核酸酶的多核苷酸，經由，例如電穿孔mRNA轉染T細胞來製造。該dCK剔除之EGFRvIII特異性CAR-T細胞對PNA(包括，例如氯法拉濱及/或氟達拉濱)具抗性並保持對EGFRvIII表現細胞之T細胞毒性活性。於另一實例中，該化療藥物可為，例如CD52靶向分子，諸如單株抗CD52抗體(例如阿崙單抗(alemtuzumab))。CD52為呈遞在淋巴細胞表面上之蛋白質，而抗CD52抗體可透過抗體和補體依賴性細胞毒性誘導免疫細胞凋亡和細胞裂解，從而導致淋巴細胞耗盡。本文提供包含經去活化之CD52基因的EGFRvIII特異性CAR-T細胞。於一些 實施態樣中，CD52剔除細胞係利用編碼針對CD52基因之特異性TAL核酸酶的多核苷酸，藉由，例如電穿孔mRNA轉染T細胞來製造。CD52剔除之EGFRvIII特異性CAR-T細胞對抗CD52分子(包括，例如阿崙單抗)具有抗性並在抗CD52分子之存在下維持對表現EGFRvIII之細胞的T細胞細胞毒活性。
於一些實施態樣中，本發明之經分離之細胞或細胞株可包含pT α或其功能性變體。於一些實施態樣中，經分離之細胞或細胞株可進一步藉由將該TCR α基因去活化來進行遺傳修飾。
於一些實施態樣中，該CAR-T細胞包含編碼自殺性多肽(諸如，例如RQR8)之多核苷酸。參見，例如WO2013153391 A(其全部內容以引用方式被併入本文作為參考)。在包含該多核苷酸之CAR-T細胞中，該自殺性多肽係表現在CAR-T細胞之表面上。於一些實施態樣中，該自殺性多肽包含SEQ ID NO：226所示之胺基酸序列。 (SEQ ID NO：226)。
於一些實施態樣中，該自殺性多肽亦可在胺基端包含信號肽。當該自殺性多肽表現在CAR-T細胞的表面上時，利妥昔單抗(rituximab)與該多肽之R抗原決定部位 [即，該被利妥昔單抗識別之抗原決定部位-CPYSNPSLC(SEQ ID NO：256)])結合造成細胞裂解。該多肽的導致細胞的裂解。每一表現在細胞表面上之多肽可與一個以上之利妥昔單抗分子結合。該多肽之各R抗原決定部位可與單獨之利妥昔單抗分子結合。刪除EGFRvIII特異性CAR-T細胞可，例如藉由投予患者利妥昔單抗而在活體內發生。刪除該轉移之細胞的決定可能來自於在患者中檢測到歸因於該轉移之細胞的不良影響，諸如，例如當檢測到不可接受之毒性水準時。
於一些實施態樣中，該自殺多肽可包含一、二、三或多個可被抗體(例如利妥昔單抗)識別之抗原決定部位。
於一些實施態樣中，自殺多肽可在與含有CAR之多肽分開之多肽中提供在EGFRvIII特異性CAR T細胞中。於一些實施態樣中，自殺多肽可在與CAR多肽相同之多肽鏈中提供在EGFRvIII特異性CAR T細胞中。在含有自殺多肽之CAR中，通常該自殺多肽係提供在CAR之胞外部分。
在含有自殺多肽之CAR中，自殺多肽可含有，例如一或多個可被利妥昔單抗識別之抗原決定部位的胺基酸序列[CPYSNPSLC(SEQ ID NO：256)]之副本。自殺多肽可定位在CAR上之不同位置。例如，該自殺多肽可在CAR中之scFv的N端或者其可在該scFv之C端。於一些實施態樣中，該自殺多肽可在CAR之scFv和鉸鏈區之間。於一些實施態樣中，CAR可含有一個以上之自殺多肽。例如， CAR可含有在scFv之N端的自殺多肽及在該scFv之C端的自殺多肽。該等多肽可各含有一或多個可被利妥昔單抗識別之抗原決定部位的副本。例如，CAR可在scFv之N端位置含有第一自殺多肽(其中該第一自殺多肽含有一個可被利妥昔單抗識別之抗原決定部位的副本)，且在該scFv之C端位置含有第二自殺多肽(其中該第二自殺多肽含有二個可被利妥昔單抗識別之抗原決定部位的副本)。
本文亦提供編碼EGFRvIII特異性CAR之核酸，該EGFRvIII特異性CAR在CAR中含有自殺多肽序列。
於一實例中，在與EGFRvIII特異性CAR相同之相同多肽鏈中之自殺多肽可具有如本文所描述之“R2自殺序列”的序列。該R2自殺序列含有的二個可被利妥昔單抗識別之抗原決定部位的副本[CPYSNPSLC(SEQ ID NO：256)]。該等EGFRvIII特異性CAR在本文中可稱為“EGFRvIII-R2 CAR”。表5D提供本發明之示例性EGFRvIII-R2 CAR的胺基酸序列。表5D中，該信號/前導肽序列以粗體表示，該GS連接子[(GGGGS)4(SEQ ID NO：202)]下方劃線，而該R2自殺序列以粗體表示且下方劃線。表5E提供編碼本發明之示例性EGFRvIII-R2 CAR的示例性核酸序列。
治療性應用
藉由上述方法取得之經分離的細胞或源自該等經分離之細胞的細胞株可用來作為藥物。於一些實施態樣中，該等藥物可用於治療癌症，包括實體瘤和液體瘤。於一些實施態樣中，該癌症為EGFRvIII相關癌症(例如，任何表現EGFRvIII之癌症)，包括，但不限於膠質母細胞瘤(例如多形性膠質母細胞瘤)、再生不良性星形細胞瘤、巨細胞膠質母細胞瘤、神經膠質肉瘤、再生不良性少突神經膠質瘤、再生不良性室管膜瘤、再生不良性少突星形細胞瘤、脈絡叢癌、再生不良性神經節神經膠質瘤、成松果體細胞瘤、松果體瘤、腦膜瘤、髓上皮瘤、腦室管膜母細胞瘤、髓母細胞瘤、幕上原始神經外胚層瘤、非典型畸胎樣/桿狀腫瘤、混合之神經膠質瘤、頭頸癌、非小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌症、神經管胚細胞癌、結腸直腸癌、肛門癌、子宮頸癌、腎癌、皮膚癌、胰臟癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、甲狀腺癌、間皮瘤、子宮癌、淋巴瘤或白血病。
於一些實施態樣中，如本文所描述之藥物可用於1)抑制具有表現EGFRvIII之惡性細胞的個體之腫瘤生長或進展；2)抑制個體內表現EGFRvIII之惡性細胞轉移；和3)誘導具有表現EGFRvIII之惡性細胞的個體之腫瘤消退。
於一些實施態樣中，根據本發明之經分離的細胞或源自該經分離之細胞的細胞株可用於製造藥物以用來治療有 此需要之患者的癌症。
本發明亦提供用於治療患者之方法。於一些實施態樣中，該方法包含提供本發明之免疫細胞給予有此需要之患者。於一些實施態樣中，該方法包含投予有此需要之患者本發明之經轉形的免疫細胞之步驟。
於一些實施態樣中，本發明之T細胞可在活體內經歷強烈的T細胞擴增並可持續一段延長之時間。
本發明之治療方法可為改善、治療或預防性。本發明之方法可為自體免疫療法之一部分或同種異體免疫療法治療之一部分。本發明特別適合用於同種異體免疫療法。來自供體之T細胞可使用標準方案轉形成非同種異體反應性細胞並依需要複製，從而產生可投予一或多個患者之CAR-T細胞。該等CAR-T細胞療法可以“現售”之治療產品形式供人使用。
可用於所揭示之方法的細胞描述於，例如先前之章節中。治療可用於治療被診斷罹患，例如癌症之患者。可治療之癌症包括，例如與EGFRvIII相關之癌症，包括任何上列癌症。欲以本發明之CAR及CAR-T細胞治療之癌症類型包括，但不限於某些液體和固體腫瘤，諸如多形性膠質母細胞瘤、頭頸癌、非小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌和前列腺癌。成人腫瘤/癌症和兒童腫瘤/癌症亦包括在內。
於一些實施態樣中，該治療可與一或多種針對癌症之選自下列群組的療法組合使用：抗體療法、抗體-藥物軛合物療法、化療、靶向療法、細胞因子療法、疫苗療法、 溶瘤病毒療法、樹突細胞療法、基因療法、奈米粒子療法、激素療法、手術切除、雷射光療法、腫瘤治療領域及放射療法。例如，本發明之CAR和CAR-T細胞可結合下列群組一起(例如之前、同時或之後)投予患者：1)標準護理，包括放射照射、外科手術切除、化療(例如替莫唑胺(temozolomide)、丙卡巴肼(procarbazine)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、長春新鹼(vincristine)，等)、抗體療法(諸如貝伐單抗(bevacizumab))、抗血管生成療法及/或腫瘤治療領域；2)疫苗，包括EGFRvIII疫苗；3)抗體-藥物軛合物療法，包括，但不限於靶向HER族受體(例如EGFR、HER2、HER3和HER4)之藥物軛合物；4)標靶療法，諸如激酶抑刻劑(例如依維莫司(everolimus)；和5)免疫療法，包括，但不限於：抗PD-1、抗PD-L1、抗PD-L2、抗41BB、抗TIM3、抗LAG3、抗TIGIT、抗OX40、抗-HVEM、抗BTLA、抗CD40、抗CD47、抗CSF1R、抗CSF1、抗MARCO、抗IL8、抗CXCR4和抗CTLA-4抗體。
於一些實施態樣中，治療可投予接受免疫抑制治療之患者。確實地，本發明較佳為依賴那些被處理成對至少一種免疫抑制劑(例如環孢菌素、硫唑嘌呤、甲胺喋呤、黴酚酸酯和FK506)具抗性的細胞或細胞群，該細胞或細胞群係由於編碼用於該等免疫抑制劑之受體的基因被去活化而對該等免疫抑制劑具抗性。於此態樣中，該免疫抑制治療應協助患者體內之根據本發明之T細胞的選擇及擴增。 根據本發明之細胞或細胞群可以任何常規方式投予，包括經由霧化吸入、注射、攝入、輸液、植入或移植投予。本文所描述之組成物可藉由靜脈內或淋巴內注射，經由皮下、皮內、瘤內、顱內、節內、髓內、肌肉內途徑，或經由腹膜內途徑投予患者。於一實施態樣中，本發明之細胞組成物較佳為藉由靜脈內注射投予。
於一些實施態樣中，治療可投予該接受淋巴細胞清除(lymphodepletion)方案之患者。以細胞毒性劑或全身放射照射耗盡免疫調控元件可增強本發明之CAR和CAR-T細胞之抗腫瘤活性。例如，淋巴細胞清除方案中之細胞毒性劑包括，但不限於氟達拉濱、環磷醯胺及/或阿崙單抗。
於一些實施態樣中，該細胞或細胞群之投予可包含，例如每kg體重投予約104至約109個細胞(包括在那些範圍內之所有整數值的細胞數)。於一些實施態樣中，該細胞或細胞群之投予可包含每kg體重投予約105至約106個細胞(包括在那些範圍內之所有整數值的細胞數)。該細胞或細胞群可在一或多個劑量中投予。於一些實施態樣中，該有效量之細胞可以單一劑量形式投予。於一些實施態樣中，該有效量之細胞可在一段時間內以一個以上之劑量形式投予。投予時點係由管理醫生判定並取決於患者之臨床病症。該細胞或細胞群可從任何來源取得，諸如血庫或供體。雖然個別需求不同，用於特定疾病或病症之指定細胞類型的有效量之最佳範圍的測定係在本技藝之技術範圍內。有效量意指能提供治療或預防益處之量。投予之劑量 將取決於該接受者之年齡、健康和體重、並行治療(若有的話)之種類、治療之頻率和所期望效果之性質。於一些實施態樣中，該有效量之細胞或包含那些細胞之組成物係經由腸胃道外投予。於一些實施態樣中，該投予可為靜脈內投予。於一些實施態樣中，該投予可藉由直接注射在腫瘤內完成。
套組
本發明亦提供用於本發明方法中之套組。本發明之套組包括一或多個容器及根據本文所描述之任一本發明方法使用之說明書，該一或多個容器中包含如本文所描述之編碼EGFRvIII特異性CAR之多核苷酸或經工程處理之包含編碼EGFRvIII特異性CAR之多核苷酸的免疫細胞。一般而言，這些說明書包含投予該經工程處理之免疫細胞以用於上述治療性治療的描述。
與如本文描述之經工程處理之免疫細胞的使用有關之說明書大致上包括與用於所欲治療之劑量、給藥時間表和投予途徑有關的信息。該容器可為單位劑量、散裝包裝(例如多劑量包裝)或次單位劑量。本發明之套組中所提供之說明書通常為書寫在標籤或包裝仿單(例如包括在套組中之紙片)上之書寫指示，但亦可接受機器可讀取之說明書(例如磁碟或光碟上所攜帶之說明書)。
本發明之套組係在合適之包裝中。合適之包裝包括，但不限於小瓶、瓶、罐、軟質包裝(例如密封之Mylar或 塑料袋)及類似物。亦考慮與特定裝置組合使用之包裝，諸如吸入劑、鼻腔投予裝置(例如霧化器)或輸液裝置，諸如微型泵。套組可具有無菌存取口(例如該容器可為靜脈注射溶液袋或具有可被皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。該容器亦可具有無菌存取口(例如該容器可為靜脈注射溶液袋或具有可被皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組成物中至少有一種活性劑為EGFRvIII抗體。該容器可進一步包含第二藥學活性劑。
套組可選擇性地提供額外之組分，諸如緩衝液和解釋性信息。通常，該套組包含容器和在該容器上或與該容器聯結之標籤或包裝仿單。
美國臨時專利申請案第62/281,533號(2016年1月21日提交)和62/431,758號(2016年12月8日提交)之內容以引用方式併入本文用於所有目的。
生物保藏
本發明之代表性保藏物在_____保藏於美國典型培養物保藏中心(10801大學大道，美國維吉尼亞州Manassas 20110-2209)。ATCC登錄編號為____之載體____為編碼該____輕鏈可變區之多核苷酸，而ATCC登錄編號為____之載體____為編碼該____重鏈可變區之多核苷酸。該保藏物係根據國際承認之用於專利程序之微生物保存及據此(布達佩斯條約)之條例製作。這確保該保藏物從保藏之日起30年維持可存活之培養。該保藏物將可在布達佩斯條約 的條款下從ATCC取得，並受制於輝瑞公司和ATCC之間的協議，這確保公眾可在相關之美國專利發佈或任何美國或外國專利申請案(不論誰先)公開揭露時能永久和無限制地取得該保藏物之培養後代，並保證由美國專利和商標專員根據35 U.S.C.章節122和據此之專員規則(包括37 C.F.R.章節1.14，特別參考886 OG 638)所決定之具有取用權利者能取用該培養後代。
本申請案之受讓人已同意當在合適之條件下培養時若保藏物之培養死亡或喪失或被破壞，該保藏物將在通知時被及時更換成另一相同者。該保藏物之可用性不能被解釋為允許在違反任何政府根據其專利法之權限所授予之權利下實施本發明。
下列實施例僅用於說明目的，並不意圖以任何方式限制本發明之範圍。實際上，除了本文所顯示和描述者以外，本技藝之技術熟習人士將可從前述說明清楚明白本發明之各種修飾且係在附屬之申請專利範圍內。
第1A、1B和1C圖顯示3種EGFRvIII抗體：mAb 42G9(第1A圖)、32A10(第1B圖)和32G8(第1C圖)與3種F98細胞株：F98(EGFR陰性)、F98-EGFRwt和F98-EGFRvIII之FACS結合直方圖的實例。該X軸為螢光強度；Y軸為最大百分比/對模式正常化。
第2A圖顯示之條形圖綜述含有不同EGFRvIII特異 性選殖株之CAR的EGFRvIII特異性CAR表現。
第2B圖顯示之條形圖綜述與重組EGFR-mFc和EGFRvIII-mFc結合之EGFRvIII特異性CAR T細胞的百分比。
第2C圖顯示之條形圖綜述含有10種不同EGFRvIII特異性選殖株之CAR在CAR T細胞中之表現。
第3圖顯示之條形圖綜述表現不同EGFRvIII特異性選殖株之EGFRvIII特異性CAR T細胞(單獨地或與各種細胞株共同培養時)的脫粒活性：不表現任何EGFR蛋白之細胞(NCI-H522和U87-KO)、表現高水準之野生型EGFR的細胞(U87-KO-EGFRwt)、或表現低水準之EGFRvIII的細胞(NCI-H522-EGFRvIII)和表現高水準之EGFRvIII的細胞(U87-KO-EGFRvIII)。
第4圖顯示之條形圖綜述由表現不同EGFRvIII特異性選殖株之EGFRvIII特異性CAR T細胞分泌的IFN γ(單獨地或與各種細胞株共同培養時)：不表現任何EGFR蛋白之細胞(NCI-H522和U87-KO)、表現高水準野生型EGFR之細胞(U87-KO-EGFRwt)、或表現低水準之EGFRvIII的細胞(NCI-H522-EGFRvIII)和表現高水準之EGFRvIII的細胞(U87-KO-EGFRvIII)。
第5圖顯示之條形圖比較表現不同之EGFRvIII特異性選殖株之EGFRvIII特異性CAR T細胞對表現野生型EGFR之細胞株的細胞毒性與表現高水準EGFRvIII之細胞(U87-KO-EGFRvIII)和表現低水準EGFRvIII之細胞 (NCI-H522-EGFRvIII)的細胞毒性。
第6圖顯示之圖形綜述表現不同EGFRvIII特異性選殖株之EGFRvIII特異性CAR T細胞在皮膚GBM異種移植模型中針對GBM細胞之抗腫瘤活性。
第7圖顯示之條形圖綜述表現CAR中之4種不同EGFRvIII特異性選殖株且在CAR中攜帶CAR內自殺序列R2之CAR T細胞在T細胞轉導後第4天、9/10天和14/15天之CAR表現。
第8圖顯示之條形圖綜述表現CAR中之4種不同EGFRvIII特異性選殖株並攜帶CAR內自殺序列R2之CAR T細胞在T細胞轉導後第4天和第14/15天之CAR表現。
第9圖顯示之條形圖綜述表現4種不同EGFRvIII特異性選殖株並攜帶CAR內自殺序列R2之CAR T細胞對抗高水準EGFRvIII(U87-KO-EGFRvIII)和低水準EGFRvIII(NCI-H522-EGFRvIII)表現細胞株之細胞毒性。
實施例1：重組抗EGFRvIII鼠-人嵌合型抗體及人化抗體之親和力測定
本實施例測定嵌合型和人化抗EGFRvIII抗體在25℃和37℃下之親和力。
測定從雜交瘤產生之抗-EGFRvIII小鼠(m)抗體m62G7之序列並分殖入用於表現為鼠-人嵌合型抗體之合 適載體中。將小鼠抗體m62G7之CDR移植在人框架上並以人IgG1重組抗體h62G7之形式表現。經由將突變引入重鏈和輕鏈之CDR來製造h62G7之親和力變異體。在配備與研究級抗人Fc耦合之CM4傳感器芯片的表面等離子體共振BiacoreTM T200生物傳感器上測量重組抗EGFRvIII嵌合型抗體m62G7和人化h62G7抗體之親和力(GE Healthcare公司，紐澤西州Piscataway)。然後藉由抗人Fc捕捉抗-EGFRvIII抗體。然後，注射作為分析物之經10倍系列稀釋之經單體8-組胺酸標記的人EGFRvIII胞外結構域，最高濃度為1000nM。在25℃和37℃下測量抗EGFRvIII抗體對人EGFRvIII之親和力(表6)。這些抗體在相同分析條件下無一顯示出與1000nM之經8-組胺酸標記的重組野生型蛋白質EGFRwt具有可檢測之結合。
表6中，先參考重鏈變化，再參考輕鏈變化來描述h62G7變異體。例如，抗體選殖株“h62G7-EQ/L6”係指該重鏈中含有“EQ”變異(本文中亦稱為“h62G7-EQ”)且輕鏈中含有“L6”變異(本文中亦稱為“h62G7-L6”)之h62G7選殖株。這些重鏈和輕鏈胺基酸序列提供於表2中。此外，本申請案中，h62G7變異體之名稱可先寫入重鏈或先寫入輕鏈-因此，例如“h62G7-EQ/L6”和“h62G7-L6/EQ”二者均指含有h62G7-EQ重鏈和h62G7-L6輕鏈之抗體。
實施例2：人抗EGFRvIII抗體之親和力測定
本實施例測定各種人抗EGFRvIII抗體在37℃下之親和力。
為了產生針對EGFRvIII之人抗體，以經多聚甲醛固定之表現EGFRvIII的大鼠腦膠質母細胞瘤細胞株F98-npEGFRvIII(美國菌種保藏中心，維吉尼亞州Manassas)和針對EGFRvIII中之交界區的肽類(SEQ ID NO：227：CGSGSGLEEKKGNYVVTDH)交替進行免疫化以將轉基因AlivaMab小鼠(Ablexis LLC，加州舊金山)免疫化。使用標準技術產生雜交瘤。為了測定這些雜交瘤對EGFRvIII之結合親和力和特異性，藉由抗小鼠Fc捕捉培養上清液中之抗體，使用配備與抗小鼠Fc耦合之CM4傳感器芯片的BiacoreTM T200生物傳感器(BiacoreTMAB，Uppsala，瑞典-現為GE醫療)測定。然後，注射作為分析物之經10倍系列稀釋之經單體8-組胺酸標記的人EGFRvIII胞外結構域，從最高濃度1000nM開始。在37℃下測量抗EGFRvIII抗體對人EGFRvIII之親和力(表7)。這些雜交瘤抗體在相同分析條件下無一顯示出與1000nM之經8-組胺酸標記的重組野生型蛋白質EGFRwt具有可檢測之結 合。
實施例3：藉由流式細胞術之抗EGFRvIII抗體對表現EGFRvIII之細胞株的結合特異性
本實施例證明抗EGFRvIII抗體對表現EGFRvIII之細胞的細胞結合特異性。
為了評估從AlivaMab小鼠產生之抗EGFRvIII抗體的細胞結合特異性，使用三種同基因大鼠膠質母細胞瘤細胞株及人類癌細胞株：F98(不表現任何形式之人EGFR)、F98-EGFRwt(表現野生型EGFR)、F98-npEGFRvIII(表現EGFRvIII)和A431(過度表現野生型EGFR之表皮樣癌細胞 株)，這些均係從美國典型培養物保藏中心(維吉尼亞州Manassas)取得。在細胞染色方面，將500,000個細胞與50μl之雜交瘤上清液在4℃下培育45分鐘，以結合緩衝液(PBS(磷酸鹽緩衝之鹽水)+0.5%BSA(牛血清白蛋白))清洗，然後與來自Jackson ImmunoResearch實驗室(West Grove，賓州)之與FITC軛合的山羊抗小鼠Fc特異性二級抗體一起培育。表8A和8B顯示出表現EGFRvIII之細胞株上的EGFRvIII抗體(除了選殖株20G5以外)的平均螢光強度(MFI)較非表現細胞株上之平均螢光強度至少高出10倍。第1A圖、第1B圖和第1C圖顯示出三種已選殖並以重組人IgG1抗體(42G9(第1A圖)，32A10(第1B圖)和32G8(第1C圖))表現之EGFRvIII特異性選殖株與3個F98細胞株的FACS結合直方圖之實例。
這些結果證明抗EGFRvIII抗體對表現EGFRvIII之細胞的結合特異性。
實施例4：來自噬菌體集合庫之全人抗EGFRvIII抗體的親和力測定
本實施例測定各種人抗EGFRvIII抗體在25℃下之親和力。
測定人抗EGFRvIII抗體之序列並分殖入合適之載體中以表現重組人IgG1抗體。在25℃下，在配備與抗人Fc耦合之CM4傳感器芯片之表面等離子體共振BiacoreTM T200生物傳感器(GE Healthcare公司，紐澤西州Piscataway)上測量抗體之親和力。藉由抗人Fc捕捉抗EGFRvIII抗體。然後，注射經10倍系列稀釋之經單體8-組胺酸標記的人EGFRvIII胞外結構域作為分析物，從最高濃度1000nM開始。二種抗體中，僅C6顯示出在25℃下與1000nM之經8-組胺酸標記的重組野生型蛋白質EGFRwt有非常弱但可檢測之結合。
實施例5：重組單鏈Fv格式化之抗EGFRvIII抗體的親和力測定
本實施例測定各種重組單鏈Fv格式化之抗EGFRvIII抗體在37℃下之親和力。
為了將常規抗體轉化成單鏈Fv(scFv)片段，將該重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域經由(GGGGS)4(SEQ ID NO：202)連接子接合在一起。然後，將scFv片段與人IgG1 Fc部分融合在一起以促進重組表現和純化。在37℃下，依上述在配備與抗人Fc耦合之CM4傳感器芯片之表面等離子體共振BiacoreTM T200生物傳感器(GE Healthcare公司，紐澤西州Piscataway)上測量該scFv-Fc融合蛋白之親和力。藉由抗人Fc捕捉scFv-Fc蛋白。然後，注射經10倍系列稀釋之經單體8-組胺酸標記的人EGFRvIII胞外結構域作為分析物，從1000nM開始。表10顯示出scFv重新格式化之融合蛋白保持與EGFRvIII結合且該scFV-Fc蛋白在HL(重鏈可變結構域在N端)和LH(輕鏈可變結構域在N端)二個方向中之親和力與表6、7和9中所列之其常規抗體對應物相當。亦在25℃下測試這些scFv-Fc蛋白與1000nM之經8-組胺酸標記的重組野生型蛋白質EGFRwt的結合，但它們無一顯示出具有顯著結合。
實施例6：EGFRvIII特異性嵌合型抗原受體(CAR)T細胞之產製及檢測
本實施例測定EGFRvIII特異性CAR T細胞之表現和抗原結合特異性。
根據供應商之說明書將由AllCells(Alameda，加州)提供之來自健康供體的PBMC解凍並在補充有5%人血清之X-VivoTM-15培養基(Lonza，Walkersville，MD)中培養一整夜。將T細胞在補充有20ng/ml之人IL-2、5%之人血清及Dynabeads人類T活化劑CD3/CD28(小珠：細胞比1：1)(Life Technologies公司，加州卡爾斯巴德)之X-VIVOTM-15培養基(Lonza)中活化3天。然後，以庇藏受EF1α啟動子控制之BFP-T2A-EGFRvIII特異性CAR表現盒的雙順反子(bicistronic)慢病毒載體轉導T細胞，感染 複數(MOI)為5。在此構建體中，該EGFRvIII特異性CAR與BFP(藍色螢光蛋白)共同表現以促進EGFRvIII特異性CAR之檢測。該EGFRvIII特異性CAR含有不同之抗EGRRvIII選殖株(h62G7-L6/EQ、14C11、20B9、32A10、42G9、C6、20E12、26B9、30D8和32G8；描述於本文他處)之VH和VL序列。轉導後將CAR T細胞保持在培養中長達14天。使用用於檢測之BFP(藍色螢光蛋白)，藉由流式細胞術隨著時間(在慢病毒轉導原代T細胞後之第4天、第9天和第14天)監測表現EGFRvIII特異性CAR之細胞的百分比(第2A圖)(藉由BFP陽性活細胞之百分比測定)。
為了測定CAR之靶的結合特異性，在HEK293細胞中產生重組蛋白EGFRvIII-mFc和EGFR-mFc，其分別包含與小鼠IgG1-Fc結構域融合之人EGFRvIII或人野生型EGFR的胞外結構域。該靶的結合特異性係藉由下述方法測定：將不同之EGFRvIII特異性CAR T細胞與EGFRvIII-mFC或EGFR-mFc蛋白一起培育，再與經PE標記之山羊抗小鼠Fc二級抗體(Jackson免疫研究)一起培育，並在以編碼CAR(包含不同之EGFRvIII特異性選殖株(h62G7-L6/EQ、14C11、20B9、32A10、42G9、C6、20E12、26B9、30D8和32G8)的載體轉導T細胞後第4天藉由流式細胞術分析。如第2B圖所示，包含選殖株h62G7-L6/EQ、14C11、20B9、32A10、42G9、20E12、26B9和30D8之VH和VL序列的CAR T細胞與 EGFRvIII-mFc結合，但不與EGFR-mFc顯著結合。轉導後第14天，測定藉由BFP所檢測之細胞上的CAR表現與重組EGFRvIII-mFc和細胞之結合間的相關性。代表性數據組顯示於第2C圖中，其顯示出在轉導後第14天，含有十種不同EGFRvIII特異性選殖株(h62G7-L6/EQ、14C11、20B9、32A10、42G9、C6、20E12、26B9、30D8和32G8)之CAR在CAR T細胞上之表現(藉由在細胞上檢測BFP及細胞與重組EGFRvIII-mFc之結合來測定)。
這些結果證明，含有包含選殖株h62G7-L6/EQ、14C11、20B9、32A10、42G9、20E12、26B9和30D8之CAR的CAR T細胞與EGFRvIII-mFc結合但不與EGFR-mFc顯著結合。
實施例7：EGFRvIII特異性CAR T細胞之靶的倚賴性和無關性脫粒
本實施例測定EGFRvIII特異性CAR T細胞在有或無靶的表現癌細胞株之存在下的脫粒活性。
使用五種細胞株來評估CAR T細胞之脫粒活性。從美國典型培養物保藏中心(維吉尼亞州Manassas)取得人肺癌細胞株NCI-H522和膠質母細胞瘤細胞株U87MG並將其培養在補充有10%經熱去活化之胎牛血清(Mediatech公司，維吉尼亞州Manassas)的RPMI 1640培養基中。由於大多數癌症細胞株不表現EGFRvIII，以編碼全長EGFRvIII基因(SEQ ID NO：201)之慢病毒載體轉導NCI- H522(其不表現可檢測水準之野生型EGFR或EGFRvIII)以產生“NCI-H522-EGFRvIII”，其表現低水準之EGFRvIII。為了產生表現各種EGFR蛋白之同基因型人膠質母細胞瘤細胞株，首先剔除U87MG之內源性野生型EGFR基因以產生EGFR無效細胞株“U87-KO”。然後以編碼全長野生型EGFR基因(登錄編號NP_005219)之慢病毒載體轉導U87-KO細胞，以取得EGFR過表現細胞株“U87-KO-EGFRwt”。類似地，以編碼全長EGFRvIII基因(SEQ ID NO：201)之慢病毒載體轉導U87-KO，以從U87-KO產生“U87-KO-EGFRvIII”(其過表現EGFRvIII)。
在脫粒分析方面，將100,000個表現各種EGFRvIII特異性CAR(含有選殖株h62G7-L6/EQ、14C11、20B9、32A10、42G9、C6、20E12、26B9、30D8和32G8)之T細胞培育在具有相等數目之表現各種EGFRvIII蛋白或EGFRwt蛋白水準之癌細胞的96孔盤中。將共同培養物保持在37℃，5%CO2，最終體積為100μl之X-VivoTM-15培養基(Lonza，馬利蘭州Walkersville)中6小時。在細胞刺激期間藉由在共同培養開始時加入螢光抗CD107a抗體(Miltenyi Biotec，加州聖地牙哥)及最終濃度為1μg/ml之抗CD49d(BD Pharmingen，加州聖地牙哥)、1μg/ml之抗CD28(Miltenyi Biotec)和1x莫能菌素(Monensin)(eBioscience公司，加州聖地牙哥)溶液來完成CD107a染色。在6小時之培育期後，以可固定細胞活力染料及與螢光染料軛合之抗CD8抗體(Miltenyi Biotec)將細胞染色並 藉由流式細胞術進行分析。脫粒活性係以存活/CD8+/BFP+/CD107a+細胞之%測定且係藉由CD8+/BFP+細胞之間的CD107a染色之平均螢光強度信號(MFI)測定。脫粒分析係在CAR轉導後14天進行。第3圖顯示來自二個PBMC供體之各EGFRvIII特異性CAR的結果。除了含有選殖株C6和32G8之CAR T細胞外，脫粒活性增加(超過單獨之CAR-T)僅在EGFRvIII特異性CAR T細胞與表現EGFRvIII之細胞株(諸如NCI-H522-EGFRvIII和U87-KO-EGFRvIII)共同培養時觀察到。
這些結果證明在表現EGFRvIII之腫瘤細胞的存在下，EGFRvIII特異性CAR T細胞顯現出脫粒活性，但在不表現EGFRvIII之腫瘤細胞的存在下，EGFRvIII特異性CAR T細胞不會顯現出脫粒活性。
實施例8：EGFRvIII特異性CAR T細胞之干擾素γ(IFNγ)分泌
本實施例顯示當將EGFRvIII特異性CAR T細胞與表現靶蛋白之細胞株共同培養時EGFRvIII特異性CAR T細胞之IFNγ分泌水準。
將表現含有不同EGFRvIII特異性選殖株(h62G7-L6/EQ、14C11、20B9、32A10、42G9、C6、20E12、26B9、30D8和32G8)之CAR的EGFRvIII特異性CAR T細胞連同相等數目之表現各種EGFRvIII蛋白或EGFRwt蛋白水準之細胞(細胞NCI-H522、NCI-H522-EGFRvIII、 U87-KO、U87-KO-EGFRwt和U87-KO-EGFRvIII；各自描述於上述實施例7中)在96孔盤中培育(100,000細胞/孔)。將共同培養物保持在37℃，5%CO2下最終體積為100μl的X-VivoTM-15培養基(Lonza)中18小時。然後收集上清液並冷凍之。根據製造者之說明書，以人IFN-γ Quantikine ELISA套組(R & D系統，明尼蘇達州，明尼阿波里市)測量上清液中之IFNγ。如第4圖中所示，在大多數CAR T細胞方面，IFNγ之分泌水準與該由共同培養之細胞所表現之EGFRvIII的量相關：低表現者NCI-H522-EGFRvIII誘導少量之IFNγ，高表現者U87-KO-EGFRvIII誘導大量之IFNγ。表現EGFRvIII特異性選殖株32G8 CAR之T細胞在所有測試條件下均未分泌顯著量之IFNγ。另一方面，當與U87-KO-EGFRwt或U87-KO-EGFRvIII細胞共同培養時，EGFRvIII特異性選殖株C6 CAR T細胞分泌高水準之IFNγ。
這些結果證明在大多數EGFRvIII特異性CAR T細胞方面，IFNγ分泌水準與該共同培養之細胞所表現的EGFRvIII量相關
實施例9：EGFRvIII特異性CAR T細胞之細胞毒性
本實施例測定當將EGFRvIII特異性CAR T細胞與表現靶蛋白之細胞株共同培養時，EGFRvIII特異性CAR T細胞之細胞毒性。
將表現含有不同EGFRvIII特異性選殖株(h62G7- L6/EQ、14C11、20B9、32A10、42G9、C6、20E12、26B9、30D8和32G8)之CAR的EGFRvIII特異性CAR T細胞連同20000個表現各種EGFRvIII蛋白水準之靶細胞一起接種在96孔盤(400,000細胞/孔)中。該靶細胞為：如上述之U87-KO-EGFRwt、NCI-H522-EGFRvIII和U87-KO-EGFRvIII。將靶細胞(EGFRvIII陽性：NCI-H522-EGFRvIII和U87-KO-EGFRvIII)和對照細胞(EGFRvIII陰性：U87-KO-EGFRwt)進行平皿接種並以螢光細胞內染料CFSE標記之，再將其與EGFRvIII特異性CAR T細胞共同培養。將共同培養物在37℃，5%CO2下培育4小時。在此培育期之後，以可固定存活染料來標記細胞並藉由流式細胞術分析。測定各細胞群(EGFRvIII陽性靶細胞或EGFRvIII陰性對照細胞)之存活力並計算特異性細胞裂解之百分比。在CAR轉導T細胞後14天進行細胞毒性分析。所有EGFRvIII特異性CAR T細胞(除32G8之外)均能將低水準靶的表現細胞(NCI-H522-EGFRvIII)及高水準靶的表現細胞(U87-KO-EGFRvIII)二者裂解至各種程度。此外，EGFRvIII特異性選殖株C6 CAR T細胞可同時裂解野生型EGFR和EGFRvIII表現細胞(第5圖)。
這些結果證明EGFRvIII特異性CAR T細胞能有效地殺死表現EGFRvIII之細胞。
實施例10：在U87-KO-EGFRvIII模型中之EGFRvIII特異性CAR T細胞的體內研究
本實施例顯示EGFRvIII特異性CAR T細胞在皮下U87-KO-EGFRvIII GBM異種移植模型中之抗腫瘤活性。
將三百萬個U87-KO-EGFRvIII GBM腫瘤細胞(如上述)經由皮下植入5至6週齡之NSG小鼠(傑克遜實驗室，加州Sacramento)中。藉由測徑器每週測量一次腫瘤體積並利用下列公式計算：腫瘤體積=(長×寬2)/2。在腫瘤移植後第8天，藉由腫瘤大小將動物隨機分組，每組五隻動物並透過大丸藥尾靜脈注射投予單劑量之6百萬個CAR陽性EGFRvIII特異性CAR T細胞(表現EGFRvIII特異性選殖株14C11、32A10或26B9；該選殖株描述於本文他處)或相等總數之未經轉導之T細胞。第6圖顯示該14C11、32A10和26B9 EGFRvIII特異性CAR T細胞(但該未經轉導之T細胞則不)抑制U87-KO-EGFRvIII異種移植之腫瘤在體內生長。
這些結果證明EGFRvIII特異性CAR T細胞能有效地抑制表現EGFRvIII之細胞在體內的腫瘤生長。
實施例11：含有R2自殺序列之EGFRvIII特異性CAR的表面表現
本實施例顯示含有R2自殺序列之EGFRvIII特異性CAR在T細胞中的表現。
該R2自殺序列為基於CD20抗原決定部位之自殺序列且含有二個串聯排列之利妥昔單抗識別抗原決定部位之副本。該R2序列係插在本文他處所描述之各種EGFRvIII 特異性CAR(14C11、32A10、30D8和26B9)的scFv和CD8 α鉸鏈序列之間以產生各種EGFRvIII-R2 CAR(本文中分別稱為“14C11-R2”、“32A10-R2”、“30D8-R2”和“26B9-R2”)。在EF1α啟動子之控制下，以庇有各種EGFRvIII-R2 CAR表現盒之慢病毒載體轉導T細胞，感染複數為5或25(MOI)(用於選殖株26B9-R2和30D8-R2)。在轉導後，將CAR T細胞保持在培養中長達14或15天。藉由流式細胞術，使用生物素化之重組蛋白：EGFRvIII-mFc或針對該細胞之利妥昔單抗(與EZ-Link TMSulfo-NHS-SS-生物素(ThermoFisher，麻薩諸塞州沃爾瑟姆)軛合)，接著使用PE軛合之鏈親和素(BD Biosciences公司，加州聖地牙哥)隨時間(在T細胞轉導後的第4天、9/10天和14/15天)監測CAR表現。以生物素化之EGFRvIII-mFc和生物素化之利妥昔單抗檢測之CAR陽性細胞的百分比分別顯示在第7和8圖中。與未經轉導之T細胞(NTD)的結合係提供作為對照組。
這些結果證明含有R2自殺序列之EGFRvIII特異性CAR在T細胞中之表現。
實施例12：EGFRvIII特異性R2 CAR T細胞之細胞毒性
本實施例顯示當與靶的表現細胞株共同培養時，EGFRvIII特異性R2 CAR T細胞之細胞毒性。
依實施例9中之描述使用EGFRvIII-R2 CAR 14C11-R2、32A10-R2、30D8-R2和26B9-R2(其描述於中實施例 11中)進行細胞毒性分析。所有測試之EGFRvIII特異性R2 CAR T細胞能夠裂解低水準靶的表現細胞(NCI-H522-EGFRvIII)和高水準靶的表現細胞(U87-KO-EGFRvIII)二者至不同程度(第9圖)。
這些結果證明EGFRvIII特異性R2 CAR T細胞能有效殺死表現EGFRvIII之細胞。
雖然所揭示之教示內容已參考各種申請案、方法、套組和組成物描述，須理解的是，在不偏離本文之教示內容及下列本發明之申請專利範圍下可對本發明進行各種變化和修改。前述實施例係用於將所揭示之教示內容說明得更好，而不意圖限制本發明所提出之教示範圍。雖然本教示內容已就這些示例性實施態樣描述，本技藝之技術熟習人士將可輕易地理解這些示例性實施態樣可能有許多變化和修改而無需過度實驗。所有該等變化和修改均在本教示內容之範圍內。
本文引用之所有參考資料，包括專利、專利申請案、論文、教科書，等及其中所引用之參考資料(包含彼等未完成者)的全部內容以引用方式併入本文。當該併入之文獻和類似材料中出現一或多項與本申請案不同或矛盾時(包括，但不限於定義之術語、術語用法、描述之技術，等)，以本申請案之主張為主。
前述說明和實施例詳細描述本發明之某些具體實施態樣並描述本發明者所設想之最佳模式。然而，應理解的是，無論前述文本中之描述有多麼詳細，本發明可以多種 方式實踐且本發明應根據所附之申請專利範圍及其任何同等物來解釋。
<110> 輝瑞股份有限公司(PFIZER INC.)
<120> 靶向表皮生長因子受體變異體III之嵌合型抗原受體
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Claims (39)

  1. 一種表皮生長因子受體變異體III(EGFRvIII)特異性嵌合型抗原受體(CAR)，其包含胞外配體結合結構域、第一跨膜結構域及胞內信號傳導結構域，其中該胞外配體結合結構域包含單鏈Fv片段(scFv)，該scFv包含重鏈可變(VH)區和輕鏈可變(VL)區，該重鏈可變(VH)區包含3個來自該VH區之CDR，該VH區包含SEQ ID NO：5、9、11、13、15、37、39、41、43或48所示之序列；該輕鏈可變(VL)區包含3個來自該VL區之CDR，該VL區包含SEQ ID NO：6、10、12、14、16、38、40、42或49所示之序列。
  2. 如申請專利範圍第1項之EGFRvIII特異性CAR，其中該VH區包含SEQ ID NO：5、9、11、13、15、37、39、41、43、48或彼等之變異體所示之序列，該變異體在非CDR內之殘基具有一或數個保守性胺基酸取代；及/或該VL區包含SEQ ID NO：6、10、12、14、16、38、40、42、49或彼等之變異體所示之胺基酸序列，該變異體在非CDR內之胺基酸具有一或數個胺基酸取代。
  3. 如申請專利範圍第1項之EGFRvIII特異性CAR，其中該胞內信號傳導結構域包含CD3ζ信號傳導結構域。
  4. 如申請專利範圍第1項之EGFRvIII特異性CAR，其中該胞內信號傳導結構域包含4-1BB信號傳導結構域。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之EGFRvIII特異性CAR，其中該胞內信號傳導結構域為第一胞內信號 傳導結構域且該CAR進一步包含第二胞內信號傳導結構域。
  6. 如申請專利範圍第5項之EGFRvIII特異性CAR，其中該第一胞內信號傳導結構域包含CD3 ζ信號傳導結構域且該第二胞內信號傳導結構域包含4-1BB信號傳導結構域。
  7. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之EGFRvIII特異性CAR，其在該胞外配體結合結構域和該第一跨膜結構域之間進一步包含莖結構域。
  8. 如申請專利範圍第7項之EGFRvIII特異性CAR，其中該莖結構域係選自由下列所組成之群組：人CD8α鉸鏈、人CD28鉸鏈、IgG1鉸鏈及FcγRIIIα鉸鏈。
  9. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之EGFRvIII特異性CAR，其中該第一跨膜結構域包含CD8α鏈跨膜結構域。
  10. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之EGFRvIII特異性CAR，其進一步包含第二胞外配體結合結構域，其中該第二胞外配體結合結構域非特異於EGFRvIII。
  11. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之EGFRvIII特異性CAR，其中該胞外配體結合結構域、第一跨膜結構域和胞內信號傳導結構域係在單一多肽上。
  12. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之EGFRvIII特異性CAR，其進一步包含第二跨膜結構域， 其中該第一跨膜結構域和該胞外配體結合結構域係在第一多肽上，且其中該第二跨膜結構域和該胞內信號傳導結構域係在第二多肽上，其中該第一跨膜結構域包含來自高親和性IgE受體(FcεRI)之α鏈的跨膜結構域且該第二跨膜結構域包含來自FcεRI之γ或β鏈的跨膜結構域。
  13. 如申請專利範圍第12項之EGFRvIII特異性CAR，其進一步包含第三多肽，該第三多肽包含與來自共刺激分子之胞內信號傳導結構域融合的第三跨膜結構域，其中該第三跨膜結構域包含來自FcεRI之γ或β鏈的跨膜結構域。
  14. 一種多核苷酸，其包含編碼如申請專利範圍第1至13項中任一項之EGFRvIII特異性CAR的核酸序列。
  15. 一種表現載體，其包含如申請專利範圍第14項之多核苷酸。
  16. 一種經工程處理之免疫細胞，其於細胞表面膜表現如申請專利範圍第1至13項中任一項之EGFRvIII特異性CAR。
  17. 如申請專利範圍第16項之經工程處理之免疫細胞，其進一步包含另一非特異於EGFRvIII之CAR。
  18. 如申請專利範圍第16項之經工程處理之免疫細胞，其進一步包含編碼自殺多肽之多核苷酸。
  19. 如申請專利範圍第18項之經工程處理之免疫細胞，其中該自殺多肽為RQR8。
  20. 如申請專利範圍第18項之經工程處理之免疫細 胞，其中該編碼自殺多肽之多核苷酸為與包含編碼該EGFRvIII特異性CAR之核酸序列的多核苷酸相同之核酸分子的一部分，且其中該自殺多肽係與該CAR在相同之多肽鏈中。
  21. 如申請專利範圍第20項之經工程處理之免疫細胞，其中該自殺多肽包含可被利妥昔單抗(rituximab)識別之抗原決定部位。
  22. 如申請專利範圍第16至21項中任一項之經工程處理之免疫細胞，其中該免疫細胞係源自炎性T淋巴細胞、細胞毒性T淋巴細胞、調節性T淋巴細胞、記憶性T淋巴細胞、輔助T淋巴細胞、天然殺手T淋巴細胞或天然殺手細胞。
  23. 如申請專利範圍第16至21項中任一項之經工程處理之免疫細胞，其進一步包含一或多個內源性基因之破壞，其中該內源性基因編碼TCRα、TCRβ、CD52、糖皮質激素受體(GR)、脫氧胞苷激酶(dCK)或程序性死亡-1(PD-1)。
  24. 如申請專利範圍第16至21項中任一項之經工程處理之免疫細胞，其中該免疫細胞係得自健康供體。
  25. 如申請專利範圍第16至21項中任一項之經工程處理之免疫細胞，其中該免疫細胞係得自患者。
  26. 如申請專利範圍第16至21項中任一項之經工程處理之免疫細胞，其係作為藥物。
  27. 如申請專利範圍第26項之經工程處理之免疫細 胞，其中該藥物係用於治療選自由下列所組成之群組的與EGFRvIII相關之癌症：多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiform)、再生不良性星形細胞瘤(anaplastic astrocytoma)、巨細胞膠質母細胞瘤(giant cell glioblastoma)、神經膠質肉瘤(gliosarcoma)、再生不良性少突神經膠質瘤(anaplastic oligodendroglioma)、再生不良性室管膜瘤(anaplastic ependymoma)、再生不良性少突星形細胞瘤(anaplastic oligoastrocytoma)、脈絡叢癌(choroid plexus carcinoma)、再生不良性神經節神經膠質瘤(anaplastic ganglioglioma)、成松果體細胞瘤(pineoblastoma)、松果體瘤(pineocytoma)、腦膜瘤(meningioma)、髓上皮瘤(medulloepithelioma)、腦室管膜母細胞瘤(ependymoblastoma)、髓母細胞瘤(medulloblastoma)、幕上原始神經外胚層瘤(supratentorial primitive neuroectodermal tumor)、非典型畸胎樣/桿狀腫瘤、混合之神經膠質瘤、頭頸癌、非小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌症、神經管胚細胞瘤(medullobastoma)、結腸直腸癌、肛門癌、子宮頸癌、腎癌、皮膚癌、胰臟癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、甲狀腺癌、間皮瘤、子宮癌、淋巴瘤及白血病。
  28. 如申請專利範圍第26項之經工程處理之免疫細胞，其中該癌症為多形性膠質母細胞瘤、頭頸癌、非小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌或前列腺癌。
  29. 一種工程處理免疫細胞之方法，其包含： a.提供免疫細胞；及b.在該細胞表面表現至少一種如申請專利範圍第1至13項中任一項之EGFRvIII特異性CAR。
  30. 如申請專利範圍第29項之方法，其包含：a.提供免疫細胞；b.將至少一種編碼該EGFRvIII特異性CAR之多核苷酸引入該細胞；及c.在該細胞中表現該多核苷酸。
  31. 如申請專利範圍第29項之方法，其包含：a.提供免疫細胞；b.將至少一種編碼該EGFRvIII特異性CAR之多核苷酸引入該細胞；及c.引入至少一種非特異於EGFRvIII之其他CAR。
  32. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第16至25項中任一項之經工程處理之免疫細胞。
  33. 一種如申請專利範圍第32項之醫藥組成物於製備藥物之用途，該藥物係用於治療個體的與表現EGFRvIII之惡性細胞相關之病症。
  34. 如申請專利範圍第33項之用途，其中該病症為癌症。
  35. 如申請專利範圍第34項之用途，其中該癌症為選自由下列所組成之群組的與EGFRvIII相關之癌症：多形性膠質母細胞瘤、再生不良性星形細胞瘤、巨細胞膠質母細胞瘤、神經膠質肉瘤、再生不良性少突神經膠質瘤、 再生不良性室管膜瘤、再生不良性少突星形細胞瘤、脈絡叢癌、再生不良性神經節神經膠質瘤、成松果體細胞瘤、松果體瘤、腦膜瘤、髓上皮瘤、腦室管膜母細胞瘤、髓母細胞瘤、幕上原始神經外胚層瘤、非典型畸胎樣/桿狀腫瘤、頭頸癌、非小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌症、神經管胚細胞瘤、結腸直腸癌、肛門癌、子宮頸癌、腎癌、皮膚癌、胰臟癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、甲狀腺癌、間皮瘤、子宮癌、淋巴瘤及白血病。
  36. 如申請專利範圍第35項之用途，其中該癌症為多形性膠質母細胞瘤、頭頸癌、非小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌或前列腺癌。
  37. 一種如申請專利範圍第32項之醫藥組成物於製備藥物之用途，該藥物係用於抑制具有表現EGFRvIII之惡性細胞的個體之腫瘤生長或進展。
  38. 一種如申請專利範圍第32項之醫藥組成物於製備藥物之用途，該藥物係用於抑制個體內表現EGFRvIII之惡性細胞的轉移。
  39. 一種如申請專利範圍第32項之醫藥組成物於製備藥物之用途，該藥物係用於在具有表現EGFRvIII之惡性細胞的個體內引起腫瘤消退。
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