TW201733593A - 用於治療禿髮症之維他命ｄ３及其類似物 - Google Patents

Abstract

本發明提供預防或治療禿髮症，諸如化學療法誘發之禿髮症(CIA)的方法及醫藥組合物。本發明之醫藥組合物於調配物中包含有效量之維他命D化合物，該調配物將維他命D化合物局部傳遞至表皮層，而實質上避免進入真皮層。在化學療法患者中，本發明之醫藥組合物可在化學治療藥物之前或同時投與。

Description

用於治療禿髮症之維他命D3及其類似物

本申請案主張2009年8月14日申請之美國臨時專利申請案第61/234,178號之優先權。上述申請案之內容藉此以全文引用的方式併入。

禿髮症為許多化學治療劑之常見且令人痛苦之副作用且目前對此具有極少有效預防措施。在新近研究中，46名接受化學療法之患者中有35名將禿髮症列為比嘔吐更令人苦惱之副作用(Tierney等人，B.J.Cancer,62：527-528,1990)。

目前，罹患禿髮症者僅可藉由反覆施用局部類固醇而試圖使脫髮再生，或可藉由局部施用敏樂定(minoxidil)而試圖維持毛髮生長。此外，目前尚無能夠預防在化學療法治療期間禿髮症以副作用形式出現之治療劑得到批准，但仍有一些具前景之研究。舉例而言，使用幼年大鼠模型，已證實一種由細菌黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)製備之生物反應調節劑ImuVert保護動物免於出現胞嘧啶阿拉伯糖或阿黴素(adriamycin)誘發之禿髮症(Hussein等人，Science 249：1564-1566,1990)。在後續研究中，觀測到重組介白素-1(IL-1)β進行類似保護以免於出現ARA-C誘發之禿髮症(Jimenez等人，FASEB J.1991)。儘管存在此等具前景之結果，但仍然需要一種在罹患禿髮症者中治療此病症且另外在接受癌症治療者中預防化學療法誘發之禿髮症的安全且有效 之治療劑。

本發明係關於使用諸如維他命D3或鈣化三醇(calcitriol)及其類似物或其代謝物之維他命D化合物、其劑量及調配物來預防或治療禿髮症(例如化學療法誘發之禿髮症(CIA))。

因此，在一態樣中，本發明提供藉由向個體局部投與包含治療有效量之維他命D化合物之醫藥組合物來預防或治療該個體之禿髮症的方法，該維他命D化合物經調配以傳遞至表皮，而實質上避免真皮傳遞。

在一些實施例中，醫藥組合物包含約40%(w/w)丙二醇及約60%(w/w)無水絕對乙醇(200酒精度(proof)，U.S.)；或約30%(w/w)丙二醇、約10%(w/w)乙氧基二乙二醇或二乙二醇單乙醚(transcutol)及約60%(w/w)無水絕對乙醇(200酒精度，U.S.)。

在其他實施例中，維他命D化合物係由式(I)表示： 其中：a及b各獨立地為單鍵或雙鍵；當a為雙鍵時，X為-CH₂；或當a為單鍵時，X為氫或經羥基取代之烷基；R¹為氫、羥基、烷氧基、三烷基矽烷基或烷基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代； R²為氫、羥基、-O-三烷基矽烷基或烷基、烷氧基或烯基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；當b為雙鍵時，R³不存在；或當b為單鍵時，R³為氫、羥基或烷基，或R³及R¹與其所連接之碳原子可連接形成5至7員碳環；當b為雙鍵時，R⁴不存在；或當b為單鍵時，R⁴為氫、鹵素或羥基；當a為雙鍵時，R⁵不存在；或當a為單鍵時，R⁵為氫、鹵素或羥基；R⁶為烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環基、烷基-O-烷基、烷基-CO₂-烷基，視情況經1至5個羥基、側氧基(oxo)、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR'R"部分基團取代；R⁷為烷基，視情況經1至3個羥基、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR'R"部分基團取代；及R'及R"各獨立地為氫、羥基、鹵素、烷基或烷氧基，及其醫藥學上可接受之鹽。

在一些其他實施例中，維他命D化合物係由式(II)表示： 其中：c為單鍵或雙鍵； R^1a為氫、三烷基矽烷基或烷基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；R^2a為氫、羥基、-O-三烷基矽烷基或烷基、烷氧基或烯基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；當c為雙鍵時，R^3a、R^4a不存在；或當c為單鍵時，R^3a、R^4a各獨立地為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，視情況經1至3個羥基或鹵素部分基團取代；R^3b、R^4b、R^5a、R^6a、R^7a及R^8a各獨立地為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，視情況經1至3個羥基或鹵素部分基團取代；或R^6a、R^7a及R^8a中之任兩者可連接形成3至7員碳環，及其醫藥學上可接受之鹽。

在其他實施例中，維他命D化合物為1,25-二羥基維他命D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇(cholecalciferol)、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維他命D3、1α,24-二羥基維他命D3或MC 903。

在其他實施例中，維他命D化合物不為1,25-二羥基維他命D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維他命D3、1α,24-二羥基維他命D3或MC 903。

在其他實施例中，維他命D化合物在正常角質細胞中展現與等量鈣化三醇類似或相同之基因調控概況。

在一些實施例中，維他命D化合物調節一或多種表現量由等量鈣化三醇調節之基因的表現。

在其他實施例中，維他命D化合物調節正常角質細胞中HSPA2或HSF4 mRNA、HSPB1或DNAJC6 mRNA之表現。

在另一實施例中，維他命D化合物調節正常角質細胞中SLC1A1、KCNB2、KCNN4或SLC1A3蛋白質之表現。

在其他實施例中，維他命D化合物調節表3-1及表3-2中一或多種 蛋白質之表現至少約2倍。

在另一實施例中，在正常角質細胞與維他命D化合物接觸約24小時之後，該維他命D化合物誘導表3-3、表3-4、表3-5或表3-6中之一或多種蛋白質過度表現。

在其他實施例中，維他命D化合物誘導正常角質細胞中以下一或多者過度表現：GST、角蛋白1、角蛋白17、半乳糖凝集素1、S100 A9(鈣衛蛋白(Calprotectin))或S100 A13。

在一些實施例中，禿髮症為斑禿(AA)、全禿(AT)、全身禿(AU)或化學療法誘發之禿髮症(CIA)。

在一些其他實施例中，斑禿包括彌漫性斑禿、單點斑禿(alopecia areata monolocularis)、多點斑禿(alopecia areata multilocularis)及鬚部斑禿(alopecia areata barbae)。

在另一實施例中，禿髮症不包括雄性型禿髮症(androgenetic alopecia/alopecia androgenetica)或化學療法後禿髮症(PCA)。

在一些實施例中，個體為靈長類動物。

在其他實施例中，個體為人類。

在其他實施例中，禿髮症在個體中尚未開始出現。

在另一實施例中，個體正在經歷或將要經歷化學療法。

在一些其他實施例中，醫藥組合物在化學療法之前或與化學療法同時投與個體。

在另一實施例中，醫藥組合物在化學療法開始之後、但在禿髮症開始出現之前投與個體。

在一些實施例中，醫藥組合物實質上不會降低化學療法之功效。

在其他實施例中，化學療法為全身性化學療法。

在一些實施例中，化學療法包括以下一或多者：蒽環黴素 (Anthracycline)(阿黴素/多柔比星(Doxorubicin)、道諾黴素(Daunorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、黃膽素(Idarubicin)、戊柔比星(Valrubicin))、5-FU、貝伐單抗(bevacizumab)、他莫昔芬(Tamoxifen)、伊立替康(Irinotecan)、太平洋紫杉醇(Paclitaxel)(紫杉醇(Taxol))、卡鉑(Carboplatin)、依託泊苷(Etoposide)、環磷醯胺(Cytoxan/Cyclophosphamide)、順鉑(Cisplatin)、埃羅替尼(Erlotinib)(得舒緩(Tarceva))、吉西他濱(Gemcitabine)、星形孢菌素(Staurosporin)、長春新鹼(Vincristine)、伊馬替尼(Imatinib)(基立克(Gleevec))、吉非替尼(Gefitinib)(艾瑞莎(Iressa))、索拉非尼(Sorafenib)、達沙替尼(Dasatinib)、放線菌素D(Dactinomycin)、六甲三聚氰胺(HMM、六甲密胺(altretamine))、異環磷醯胺(Ifosfamide)、博萊黴素(bleomycin)、甲胺喋呤(methotrexate)、多烯紫杉醇(Docetaxel)(紫杉德(Taxotere))、長春地辛(Vindesine)、長春瑞濱(Vinorelbine)、拓朴替康(Topotecan)、安吖啶(Amsacrine)、阿糖胞苷(Cytarabine)、白消安(Busulphan)、美法侖(Melphalan)、長春鹼(Vinblastine)、洛莫司汀(Lomustine，CCNU)、噻替派(Thiotepa)、吉西他濱、卡莫司汀(Carmustine，BCNU)、米托蒽醌(Mitroxantrone)、絲裂黴素C(Mitomycin C)、丙卡巴肼(Procarbazine)、6-巰基嘌呤、鏈佐黴素(Sreptozotocin)、氟達拉濱(Fludarabine)、雷替曲塞(Raltitrexate)(拓優得(Tomudex))、卡西他濱(Capecitabine)及其等效物。

在其他實施例中，將維他命D化合物以等效於約0.1μg鈣化三醇/cm²之劑量體積局部投與個體。

在其他實施例中，總劑量等效於約2-100微克鈣化三醇/75公斤體重。

在另一態樣中，本發明提供預防或治療個體之禿髮症的方法， 其包括向該個體局部投與包含治療有效量之維他命D化合物之醫藥組合物，該維他命D化合物係由式(I)表示： 其中：a及b各獨立地為單鍵或雙鍵；當a為雙鍵時，X為-CH₂；或當a為單鍵時，X為氫或經羥基取代之烷基；R¹為氫、羥基、烷氧基、三烷基矽烷基或烷基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；R²為氫、羥基、-O-三烷基矽烷基或烷基、烷氧基或烯基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；當b為雙鍵時，R³不存在；或當b為單鍵時，R³為氫、羥基或烷基，或R³及R¹與其所連接之碳原子可連接形成5至7員碳環；當b為雙鍵時，R⁴不存在；或當b為單鍵時，R⁴為氫、鹵素或羥基；當a為雙鍵時，R⁵不存在；或當a為單鍵時，R⁵為氫、鹵素或羥基；R⁶為烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環基、烷基-O-烷基、烷基-CO₂-烷基，視情況經1至5個羥基、側氧基、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR'R"部分基團取代；R⁷為烷基，視情況經1至3個羥基、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳 基、氰基、硝基或-NR'R"部分基團取代；及R'及R"各獨立地為氫、羥基、鹵素、烷基或烷氧基，及其醫藥學上可接受之鹽；其中該維他命D化合物不為1,25-二羥基維他命D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維他命D3、1α,24-二羥基維他命D3或MC 903。

在一些實施例中，維他命D化合物係由式(II)表示： 其中：c為單鍵或雙鍵；R^1a為氫、三烷基矽烷基或烷基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；R^2a為氫、羥基、-O-三烷基矽烷基或烷基、烷氧基或烯基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；當c為雙鍵時，R^3a、R^4a不存在；或當c為單鍵時，R^3a、R^4a各獨立地為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，視情況經1至3個羥基或鹵素部分基團取代；R^3b、R^4b、R^5a、R^6a、R^7a及R^8a各獨立地為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，視情況經1至3個羥基或鹵素部分基團取代；或R^6a、R^7a及 R^8a中之任兩者可連接形成3至7員碳環，及其醫藥學上可接受之鹽。

在另一態樣中，本發明提供預防或治療個體之禿髮症的方法，其包括向該個體局部投與包含治療有效量之維他命D化合物之醫藥組合物，其中該維他命D化合物當按以下有效濃度局部投與個體時：(1)約50μg/mL，在連續投與藥物至少約25天之後不會產生毒性；或(2)約100μg/mL，在連續投與藥物至少約7天之後不會產生毒性。

在另一態樣中，本發明提供預防或治療個體之禿髮症的方法，其包括向該個體局部投與包含治療有效量之維他命D化合物之醫藥組合物，該維他命D化合物用於預防或治療該個體之禿髮症，而實質上不會干擾共同投與之化學治療劑之功效。

在一態樣中，本發明提供預防或治療個體之禿髮症的方法，其包括向該個體局部投與包含治療有效量之維他命D化合物之醫藥組合物，該維他命D化合物：(1)在正常角質細胞中展現與等量鈣化三醇類似或相同之基因調控概況；(2)調節一或多種表現量由等量鈣化三醇調節之基因的表現；(3)調節正常角質細胞中HSPA2或HSF4 mRNA、HSPB1或DNAJC6 mRNA之表現；(4)調節正常角質細胞中SLC1A1、KCNB2、KCNN4、SLC1A3蛋白質之表現；(5)調節表3-1及表3-2中一或多種蛋白質之表現至少約2倍；(6)在正常角質細胞與該維他命D化合物接觸約24小時之後，誘導表3-3、表3-4、表3-5或表3-6中之一或多種蛋白質過度表現；或(7)誘導正常角質細胞中以下一或多者過度表現：GST、角蛋白1、角蛋白17、半乳糖凝集素1、S100 A9(鈣衛蛋白)或S100 A13；其中該維他命D化合物不為1,25-二羥基維他命D3、1,25-二羥基- 16-烯-23-炔-膽鈣化醇、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維他命D3、1α,24-二羥基維他命D3或MC 903。

在另一態樣中，本發明提供用於局部投與之醫藥組合物，其包含治療有效量之用於預防或治療禿髮症之維他命D化合物，其中該維他命D化合物經調配以傳遞至表皮，而實質上避免真皮傳遞。

在一些態樣中，醫藥組合物包含約40%(w/w)丙二醇及約60%(w/w)無水絕對乙醇(200酒精度，US，未變性)；或約30%(w/w)丙二醇、約10%(w/w)乙氧基二乙二醇或二乙二醇單乙醚及約60%(w/w)無水絕對乙醇(200酒精度，US，未變性)。

在一些態樣中，本發明提供用於局部投與之醫藥組合物，其包含治療有效量之用於預防或治療禿髮症之維他命D化合物，其中該維他命D化合物係由式(I)表示： 其中：a及b各獨立地為單鍵或雙鍵；當a為雙鍵時，X為-CH₂；或當a為單鍵時，X為氫或經羥基取代之烷基；R¹為氫、羥基、烷氧基、三烷基矽烷基或烷基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；R²為氫、羥基、-O-三烷基矽烷基或烷基、烷氧基或烯基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代； 當b為雙鍵時，R³不存在；或當b為單鍵時，R³為氫、羥基或烷基，或R³及R¹與其所連接之碳原子可連接形成5至7員碳環；當b為雙鍵時，R⁴不存在；或當b為單鍵時，R⁴為氫、鹵素或羥基；當a為雙鍵時，R⁵不存在；或當a為單鍵時，R⁵為氫、鹵素或羥基；R⁶為烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環基、烷基-O-烷基、烷基-CO₂-烷基，視情況經1至5個羥基、側氧基、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR'R"部分基團取代；R⁷為烷基，視情況經1至3個羥基、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR'R"部分基團取代；及R'及R"各獨立地為氫、羥基、鹵素、烷基或烷氧基，及其醫藥學上可接受之鹽；其中該維他命D化合物不為1,25-二羥基維他命D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維他命D3、1α,24-二羥基維他命D3或MC 903。

在一些實施例中，維他命D化合物係由式(II)表示： 其中：c為單鍵或雙鍵； R^1a為氫、三烷基矽烷基或烷基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；R^2a為氫、羥基、-O-三烷基矽烷基或烷基、烷氧基或烯基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；當c為雙鍵時，R^3a、R^4a不存在；或當c為單鍵時，R^3a、R^4a各獨立地為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，視情況經1至3個羥基或鹵素部分基團取代；R^3b、R^4b、R^5a、R^6a、R^7a及R^8a各獨立地為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，視情況經1至3個羥基或鹵素部分基團取代；或R^6a、R^7a及R^8a中之任兩者可連接形成3至7員碳環，及其醫藥學上可接受之鹽。

在一些其他態樣中，本發明提供用於局部投與之醫藥組合物，其包含治療有效量之用於預防或治療禿髮症之維他命D化合物，其中該維他命D化合物當按以下有效濃度局部投與個體時：(1)約50μg/mL，在連續投與藥物至少約25天之後不會產生毒性；或(2)約100μg/mL，在連續投與藥物至少約7天之後不會產生毒性。

在另一態樣中，本發明提供用於局部投與之醫藥組合物，其包含治療有效量之用於預防或治療禿髮症之維他命D化合物，其中該治療有效量之維他命D化合物當與化學治療劑共同投與時，實質上不會干擾該化學治療劑之功效。

在另一態樣中，本發明提供用於局部投與之醫藥組合物，其包含治療有效量之用於預防或治療禿髮症之維他命D化合物，其中該治療有效量之維他命D化合物：(1)在正常角質細胞中展現與等量鈣化三醇類似或相同之基因調控概況； (2)調節一或多種表現量由等量鈣化三醇促進之基因的表現；(3)調節正常角質細胞中HSPA2或HSF4 mRNA、HSPB1或DNAJC6 mRNA之表現；(4)調節正常角質細胞中SLC1A1、KCNB2、KCNN4或SLC1A3蛋白質之表現；(5)調節表3-1或表3-2中一或多種蛋白質之表現至少約2倍；(6)在正常角質細胞與該維他命D化合物接觸約24小時之後，誘導表3-3、表3-4、表3-5或表3-6中之一或多種蛋白質過度表現；或(7)誘導正常角質細胞中以下一或多者過度表現：GST、角蛋白1、角蛋白17、半乳糖凝集素1、S100 A9(鈣衛蛋白)或S100 A13；其中該維他命D化合物不為1,25-二羥基維他命D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維他命D3、1α,24-二羥基維他命D3或MC 903。

應注意，預期本文(上文及下文)所述之所有實施例在適當時能夠與任何其他實施例組合，該(該等)任何其他實施例包括僅在本發明之一個態樣中描述之實施例及在本發明之不同態樣中描述之實施例。

圖1展示三種皮膚供體上之總吸收及質量平衡結果，及在單次施用48小時內完整人類屍體皮膚之鈣化三醇分佈。結果以對數標度展示為平均值±SE作為總質量(ng/cm²)；圖2展示在生長培養基中存在之不同濃度之鈣化三醇下HEKa細胞之例示性生長曲線。指示鈣化三醇濃度之對數標度；圖3展示由胰臟癌細胞株PaCa2而得之例示性生長曲線，該生長曲線對0.1μg/mL鈣化三醇之存在不作出反應；圖4A及圖4B分別展示在遞增濃度之鈣化三醇存在下Hep-G2細胞及MCF-7細胞之生長； 圖5展示在不存在(◆)或存在(×)0.1μg/mL鈣化三醇下一種EGFR Tyr激酶抑制劑埃羅替尼(得舒緩)之給藥曲線；圖6展示在不存在(◆)或存在(×)0.1μg/mL鈣化三醇下另一種EGFR Tyr激酶抑制劑吉非替尼(艾瑞莎)之給藥曲線；圖7展示在不存在(◆)或存在(×)0.1μg/mL鈣化三醇下索拉非尼之給藥曲線。已知索拉非尼抑制若干激酶(Raf、VEGF-R2、c-kit、PDGR-R)；圖8展示在不存在(◆)或存在(×)0.1μg/mL鈣化三醇下達沙替尼之給藥曲線。達沙替尼抑制BCR/ABL Tyr激酶；圖9展示在不存在(◆)或存在(×)0.1μg/mL鈣化三醇下星形孢菌素之給藥曲線。星形孢菌素為相對非特異性之激酶抑制劑；圖10展示在不存在(◆)或存在(×)0.1μg/mL鈣化三醇下順鉑之給藥曲線。順鉑為DNA烷基化劑；圖11展示在不存在(◆)或存在(×)0.1μg/mL鈣化三醇下卡鉑之給藥曲線。卡鉑亦為DNA烷基化劑；圖12展示在不存在(◆)或存在(×)0.1μg/mL鈣化三醇下伊立替康之給藥曲線；圖13展示在不存在(◆)或存在(×)0.1μg/mL鈣化三醇下太平洋紫杉醇之給藥曲線；圖14展示在不存在(◆)或存在(×)0.1μg/mL鈣化三醇下5-FU之給藥曲線；圖15展示在不存在(◆)或存在(×)0.1μg/mL鈣化三醇下吉西他濱之給藥曲線；圖16展示在不存在(◆)或存在(×)0.1μg/mL鈣化三醇下多柔比星之給藥曲線；圖17展示在不存在(◆)或存在(×)0.1μg/mL鈣化三醇下他莫昔芬之 給藥曲線；圖18展示0.1μg/mL鈣化三醇保護正常角質細胞HEKa對抗5-FU，而不會明顯影響5-FU對抗癌細胞之ED₅₀值；圖19展示鈣化三醇不會明顯改變多柔比星對抗癌細胞株SkBr-3之細胞毒性作用；圖20A展示在接受依託泊苷之史泊格-多利大鼠中，鈣化三醇之局部調配物以劑量依賴性方式防範化學療法誘發之禿髮症(CIA)。左圖：僅接受依託泊苷之大鼠；中圖：接受依託泊苷及局部施用含0.1μg鈣化三醇之局部調配物的大鼠；右圖：接受依託泊苷及局部施用含0.3mg鈣化三醇之局部調配物的大鼠。圖20B展示塗佈顏色之龍-埃文斯大鼠中之類似結果；圖21展示鈣化三醇局部調配物(總劑量0.2μg)保護龍-埃文斯大鼠免於出現環磷醯胺(CTX)誘發之禿髮症；圖22A展示鈣化三醇局部調配物(總劑量0.2μg)保護龍-埃文斯大鼠免於出現CTX-多柔比星組合化學療法誘發之禿髮症，圖22B展示在由阿糖胞苷-多柔比星組合化學療法誘發之禿髮症處理之大鼠中鈣化三醇局部調配物中之鈣化三醇所得之類似保護結果。在由單獨阿糖胞苷處理之大鼠中鈣化三醇局部調配物之保護作用展示於圖22C中；圖23展示局部鈣化三醇局部調配物(總劑量0.2μg)保護注射有MIAC51(綠色白血病細胞)之龍-埃文斯大鼠免於出現CTX誘發之禿髮症；圖24展示在對注射有MIAC51(綠色白血病細胞)之龍-埃文斯大鼠進行之活體內實驗中，鈣化三醇局部調配物不會保護癌細胞免受化學療法作用；圖25A及圖25B展示自小種豬表皮之角質層及表皮其餘部分回收之鈣化三醇的估計含量(ng/mg)。該量以所回收鈣化三醇之平均值±SD 表示。nd=未偵測，na=不可用；圖26展示在3μg/mL至100μg/mL之鈣化三醇施用濃度範圍下，表皮中施用之鈣化三醇劑量與回收之鈣化三醇組織含量之間接近線性關係；圖27說明鈣化三醇對接受環磷醯胺之綠色白血病大鼠之第一毛髮生長過程的影響；圖27A描述接受單獨環磷醯胺之大鼠，圖27B描述接受環磷醯胺及媒劑之大鼠，而圖27C描述接受環磷醯胺及鈣化三醇之大鼠；圖28說明鈣化三醇對接受環磷醯胺之綠色白血病大鼠之第二毛髮生長過程的影響。由左至右為經單獨環磷醯胺處理之大鼠，經環磷醯胺及媒劑處理之大鼠，及經環磷醯胺及鈣化三醇處理之大鼠；圖29說明鈣化三醇對接受環磷醯胺與多柔比星之組合之綠色白血病大鼠之第一毛髮生長過程的影響。圖29A描述接受單獨環磷醯胺及多柔比星之大鼠，圖29B描述接受環磷醯胺、多柔比星及媒劑之大鼠，而圖29C描述接受環磷醯胺、多柔比星及鈣化三醇之大鼠；圖30說明鈣化三醇對接受環磷醯胺與多柔比星之組合之綠色白血病大鼠之第二毛髮生長過程的影響。由左至右為經單獨環磷醯胺及多柔比星處理之大鼠，經環磷醯胺、多柔比星及媒劑處理之大鼠，及經環磷醯胺、多柔比星及鈣化三醇處理之大鼠；圖31說明鈣化三醇對接受環磷醯胺與多柔比星及阿糖胞苷之組合之綠色白血病大鼠之第一毛髮生長過程的影響。圖31A描述接受單獨環磷醯胺、多柔比星及阿糖胞苷之大鼠，圖31B描述接受環磷醯胺、多柔比星、阿糖胞苷及媒劑之大鼠，而圖31C描述接受環磷醯胺、多柔比星、阿糖胞苷及鈣化三醇之大鼠；圖32說明鈣化三醇對接受環磷醯胺與多柔比星及阿糖胞苷之組合之綠色白血病大鼠之第二毛髮生長過程的影響。由左至右為經單獨 環磷醯胺、多柔比星及阿糖胞苷處理之大鼠，經環磷醯胺、多柔比星、阿糖胞苷及媒劑處理之大鼠，及經環磷醯胺、多柔比星、阿糖胞苷及鈣化三醇處理之大鼠；圖33說明鈣化三醇對接受環磷醯胺與太平洋紫杉醇及依託泊苷之組合之綠色白血病大鼠之第一毛髮生長過程的影響。圖33A描述接受單獨環磷醯胺、太平洋紫杉醇及依託泊苷之大鼠，圖33B描述接受環磷醯胺、太平洋紫杉醇、依託泊苷及媒劑之大鼠，而圖33C描述接受環磷醯胺、太平洋紫杉醇、依託泊苷及鈣化三醇之大鼠；圖34說明鈣化三醇對接受環磷醯胺與太平洋紫杉醇及依託泊苷之組合之綠色白血病大鼠之第二毛髮生長過程的影響。由左至右為經單獨環磷醯胺、太平洋紫杉醇及依託泊苷處理之大鼠，經環磷醯胺、太平洋紫杉醇、依託泊苷及媒劑處理之大鼠，及經環磷醯胺、太平洋紫杉醇、依託泊苷及鈣化三醇處理之大鼠；圖35說明鈣化三醇對接受多柔比星與太平洋紫杉醇及依託泊苷之組合之綠色白血病大鼠之第一毛髮生長過程的影響。圖35A描述接受單獨多柔比星、太平洋紫杉醇及依託泊苷之大鼠，圖35B描述接受多柔比星、太平洋紫杉醇、依託泊苷及媒劑之大鼠，而圖35C描述接受多柔比星、太平洋紫杉醇、依託泊苷及鈣化三醇之大鼠；及圖36說明鈣化三醇對接受多柔比星與太平洋紫杉醇及依託泊苷之組合之綠色白血病大鼠之第二毛髮生長過程的影響。由左至右為經單獨多柔比星、太平洋紫杉醇及依託泊苷處理之大鼠，經多柔比星、太平洋紫杉醇、依託泊苷及媒劑處理之大鼠，及經多柔比星、太平洋紫杉醇、依託泊苷及鈣化三醇處理之大鼠。

本文所述之發明內容係部分基於以下發現：可預防或治療禿髮症(例如化學療法誘發之禿髮症)之維他命D化合物之局部調配物可選 擇性地傳遞至或積累於皮膚之表皮層中，而實質上避免傳遞至及/或積累於較深真皮層中。在經歷化學療法治療之某些患者中此舉可能有利，其中維他命D化合物之較深層積累可能導致化學治療療程之功效下降。在患有可能受過量維他命D化合物之存在負面影響之醫學病狀的患者(諸如罹患腎結石之患者)及因某些維他命D化合物而發生鈣移動之後病狀可能惡化之患者中，該等局部調配物亦可能有利。因此，在該等患者中，維他命D化合物之理想傳遞應為將最低有效劑量局部傳遞至皮膚表皮層，而非傳遞至富含血管之真皮層。

本發明亦部分基於以下發現：維他命D化合物在相對較低之濃度/劑量下對正常角質細胞展現適度生長刺激作用，而在相對較高之濃度/劑量下對相同細胞展現生長抑制作用。因此，本發明提供展現最佳保護作用以對抗禿髮症，而不會產生不合需要之生長抑制作用的方法及醫藥組合物。

本發明另外基於以下發現：維他命D化合物活化或抑制正常角質細胞中多個標靶基因之表現，由此提供選擇用於特定治療性應用之最適合維他命D化合物及鑑別具有類似生物活性之其他維他命D類似物的依據。

在不欲受任何特定理論約束下，本發明之調配物在對化學療法試劑之藥物干擾降至最低方面可能有利。皮膚真皮層富含血管，且對此層之局部藥物穿透可能導致藥物干擾全身傳遞之化學治療試劑，從而使得對癌細胞之防護作用不利。

因此，在一態樣中，本發明提供一種預防或治療個體之禿髮症的方法，其包括向該個體局部投與包含治療有效量之維他命D化合物之醫藥組合物，該維他命D化合物經調配以傳遞至及/或積累於表皮中，而實質上避免真皮傳遞及/或積累。

語言「實質上避免真皮傳遞及/或積累」包括相比維他命D化合 物傳遞及/或積累至表皮，小於約25%之維他命D化合物傳遞及/或積累至真皮，例如相比傳遞至表皮之量，小於約20%、小於約15%、小於約10%、小於約5%、小於約1%或無維他命D化合物傳遞及/或積累至真皮。在一些實施例中，相比傳遞及/或積累至表皮，約1%至25%之維他命D化合物傳遞及/或積累至真皮，例如約1%至約20%、約1%至約15%、約1%至約10%或約1%至約5%。在一些實施例中，維他命D化合物不會傳遞及/或積累於真皮中。在一些實施例中，傳遞至或積累於真皮中之維他命D化合物之量小於約0.3ng/cm²、小於約0.2ng/cm²或小於約0.1ng/cm²。

術語「禿髮症」包括毛髮自個體頭部或身體非自主性地完全或部分脫落，且包括斑禿(AA)、全禿(AT)、全身禿(AU)或化學療法誘發之禿髮症(CIA)。斑禿可包括彌漫性斑禿、單點斑禿、多點斑禿及鬚部斑禿。在一些實施例中，禿髮症不包括雄性型禿髮症(或男性禿髮)或化學療法後禿髮症(PCA)。

禿髮症為毛髮自頭部或身體脫落，有時達到禿頂之程度的醫學描述。不同於身體毛髮之常見審美上脫毛，禿髮症趨於非自主性的且並不受歡迎，例如雄性型禿髮症。然而，其亦可由拔出自身毛髮之心理強迫(拔毛癖)或自主髮型設計途徑無法預料之後果(過緊馬尾辮或過緊編織所致之機械「牽拉性禿髮症」，或苛性直髮劑溶液或熱燙髮器灼傷頭皮)引起。在一些情況下，禿髮症為潛在醫學問題(諸如鐵缺乏)之適應症。

當僅在一個部分發生毛髮脫落時，將其稱為「斑禿」。在人類斑禿中，毛髮自一些或所有身體區域，通常自頭皮脫落。因為其在頭皮上產生禿點(尤其在初期)，故有時將其稱為點型禿髮。在1%-2%之情況下，病狀可擴散至整個頭皮(全禿)或擴散至整個表皮(全身禿)。

類似於AA且具有類似起因之病狀亦在其他物種中發生。最常見 之斑禿類型涉及頭皮上一或多個圓點處毛髮脫落。毛髮在整個頭皮上亦可更加彌漫性地脫落，在此情況下病狀稱為彌漫性斑禿。單點斑禿描述可在頭部任何地方發生之僅一點處禿髮。多點斑禿係指多個區域之毛髮脫落。該疾病可能僅限於鬍鬚，在此情況下稱為鬚部斑禿。若個體之頭皮上所有毛髮皆脫落，則該疾病稱為全禿。

「全身禿」為身體上毛髮完全脫落之情況，類似於與化學療法相關之毛髮脫落有時影響整個身體之程度。

「雄性型禿髮症」為雌性與雄性人類、黑猩猩及紅毛猩猩中常見之毛髮脫落形式。尤其在人類男性中，此病狀通常亦稱為男性型禿髮。毛髮自兩鬢上方開始以明確界定之型式脫落。發際線隨時間後退形成特徵性「M」形。頭頂之毛髮亦變稀疏。通常留下圍繞頭部側面及後面之邊緣毛髮，或病狀可進展至完全禿髮。女性之毛髮脫落型式不同於男性型禿髮。在女性中，遍及整個頭部之毛髮變得較稀疏，且髮際線不會後退。女性之雄性型禿髮症極少導致完全禿髮。

語言「預防禿髮症」包括在禿髮症發生之前，遏止或抑制與禿髮症相關之毛髮脫落。

語言「治療禿髮症」包括降低與禿髮症相關之毛髮脫落之嚴重度或降低與禿髮症相關之毛髮脫落程度。在一些實施例中，治療禿髮症包括改善禿髮症。

術語「投與」包括以有效預防或治療禿髮症之量向個體提供一或多劑維他命D化合物。投與維他命D化合物之既定療程之最佳投藥速率可由熟習此項技術者使用關於所利用之特定化合物、經調配之特定組合物、施用模式、特定投藥部位及其類似物進行之習知劑量測定測試來確定。

語言「局部投與」包括以有效治療或預防禿髮症之量將一或多劑維他命D化合物傳遞至個體之皮膚。

皮膚含有許多特定細胞及結構，且具有各種重要功能，諸如充當與環境相接之保護障壁、幫助維持適當體溫、自環境收集感覺資訊及在免疫系統中起積極作用。

皮膚具有三層：表皮、真皮及皮下組織。

表皮為皮膚外層。在不同類型之皮膚中其厚度不同。其在眼瞼處最薄，為約0.05mm；且在手掌及足底處最厚，為約1.5mm。自下而上，表皮含有五層：基底層、棘層、顆粒層、透明層(視情況存在於一些皮膚中)及角質層。

基底層為表皮中角質細胞之底層且負責不斷更新表皮細胞。此層僅含有一列分裂極頻繁之未分化柱狀幹細胞。一半細胞分化且移動至下一層以開始成熟過程。另一半留在基層中且反覆分裂以補充基層。移動至棘層(亦稱為棘細胞層)中之細胞自柱狀變成多角形。在此層中，細胞開始合成角蛋白。顆粒層中之細胞已失去其細胞核且特徵為細胞質物質之黑色凝塊。當產生角蛋白及防水脂質並將其組織在一起時，此層中具有大量活性。透明層僅存在於厚皮膚中，其中該透明層幫助降低角質層與顆粒層之間的摩擦力及剪切力。角質層中之細胞稱為角質細胞。此等細胞已變平且主要由為該層提供強度，而且允許吸收水之角蛋白構成。角質層之結構看似簡單，但此層負責維持皮膚之完整性及水合性-一種極為重要之功能。

真皮之厚度亦視皮膚位置而變。在眼瞼處為約0.3mm且在背部為約3.0mm。真皮由三種類型之存在遍佈整個真皮、而非以層形式存在之組織構成：膠原蛋白纖維、彈性組織纖維及網狀纖維。真皮之兩層為乳頭層及網狀層。上乳頭層含有薄膠原蛋白纖維排列。下網狀層較厚且由與皮膚表面平行排列之厚膠原蛋白纖維構成。真皮含有許多特定細胞及結構。舉例而言，血管及神經流經此層。毛囊及附著於各毛囊之豎毛肌亦位於此層中。一部分毛囊亦含有能夠使受損表皮再生 之幹細胞。幹細胞可存在於真皮-表皮接面(DEJ)處。皮脂腺(油腺)及頂泌腺(香腺)與毛囊相關聯。此層亦含有外分泌腺(汗腺)，但其不與毛囊相關聯。

皮下組織為容納較大血管及神經之脂肪及結締組織層。此層在調控皮膚本身及身體之溫度方面較重要。此層之尺寸遍佈整個身體有所不同且因人而異。

因此，本文中所用之「表皮」包括其全部五個層(若存在)，包括表皮與真皮之間的接面層(例如表皮-真皮接面或DEJ)；及使表皮層再生之幹細胞(例如毛囊幹細胞及表皮幹細胞)。

在一些實施例中，維他命D化合物局部傳遞至及/或積累於表皮中，而實質上避免傳遞及/或積累於真皮中。本文中所用之語言「實質上避免真皮傳遞及/或積累」包括不大於約20%、約15%、約10%、約5%或約0%之維他命D化合物傳遞至/積累於真皮中。在一較佳實施例中，未偵測到維他命D化合物傳遞/積累至真皮。

在某些實施例中，歷經約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約2週、約3週、約4週、約6週、約8週、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月或約一年之時段，將本發明之維他命D化合物投與個體。在一些實施例中，可在治療時段中每天、或隔天或每三天一次投與本發明之維他命D化合物。

在某些實施例中，在治療每一天中每天一次、每天兩次或每天三次投與本發明之維他命D化合物。

在某些實施例中，將本發明之維他命D化合物之每次投藥施用於個體之相同位置或若干不同位置。當施用於不同位置時，各位置之劑量可能相同，或基於諸如皮膚厚度及藥物穿透差異(若存在差異)之因 素作出調整。

在某些實施例中，在化學療法開始之前每天兩次將本發明之維他命D化合物局部投與頭皮，連續兩週，以預防或降低化學療法開始後可能發生之任何CIA的嚴重度。

術語「個體」包括能罹患禿髮症之彼等動物。在一實施例中，個體為哺乳動物，例如貓、犬、靈長類動物、小鼠、大鼠、兔、牛、馬、山羊、綿羊、豬等。在一些實施例中，哺乳動物為靈長類動物，例如黑猩猩、人類、大猩猩、倭黑猩猩、紅毛猩猩、猴等。在其他實施例中，哺乳動物為人類。

在一些實施例中，個體正在經歷或將要經歷化學療法治療。在一實施例中，在投藥之前個體尚未顯現禿髮症症狀或禿髮症尚未開始出現。在一些其他實施例中，個體罹患癌症。

在另一態樣中，本發明提供藉由向個體局部投與包含治療有效量之維他命D化合物之醫藥組合物來預防或治療該個體之禿髮症的方法，該維他命D化合物用於預防或治療該個體之禿髮症，而實質上不會干擾或降低共同投與之化學治療劑之功效。

在一些實施例中，本發明之方法及醫藥組合物實質上不會降低化學療法、尤其全身性化學療法之功效。在其他實施例中，本發明之方法及醫藥組合物增強化學療法之功效。語言「不會干擾共同投與之化學治療劑之功效」包括以下情形：維他命D化合物當與一或多種化學治療劑一起投與時不會中斷該一或多種化學治療劑之生物或治療活性，或不會阻止該一或多種化學治療劑執行其所要生物或治療活性。語言「不會降低共同投與之化學治療劑之功效」包括以下情形：維他命D化合物當與一或多種化學治療劑一起投與時不會降低該一或多種化學治療劑之生物或治療活性。

本發明之方法及醫藥組合物可與對毛囊或真皮乳頭具有細胞毒 性作用或能夠以其他方式誘發禿髮症之任何化學治療劑或化學治療劑組合一起使用。語言「化學治療劑」、「化學療法」及「化學治療療程」包括蒽環黴素(阿黴素/多柔比星、道諾黴素、表柔比星、黃膽素、戊柔比星)、5-FU、他莫昔芬、伊立替康、太平洋紫杉醇(紫杉醇)、卡鉑、依託泊苷、環磷醯胺、順鉑、埃羅替尼(得舒緩)、貝伐單抗、吉西他濱、星形孢菌素、長春新鹼、伊馬替尼(基立克)、吉非替尼(艾瑞莎)、索拉非尼、達沙替尼、放線菌素D、六甲三聚氰胺(HMM、六甲密胺)、異環磷醯胺、博萊黴素、甲胺喋呤、多烯紫杉醇(紫杉德)、長春地辛、長春瑞濱、拓朴替康、安吖啶、阿糖胞苷、白消安、美法侖、長春鹼、洛莫司汀(CCNU)、噻替派、吉西他濱、卡莫司汀(BCNU)、米托蒽醌、絲裂黴素C、丙卡巴肼、6-巰基嘌呤、鏈佐黴素、氟達拉濱、雷替曲塞(拓優得)、卡西他濱及其等效物。

在一些實施例中，化學療法為全身性化學療法。

本發明之方法及醫藥組合物較佳實質上不會降低化學療法、尤其全身性化學療法之功效。本發明之方法及醫藥組合物較佳增強化學療法之功效。

本發明之方法及醫藥組合物亦可與可導致毛髮稀疏之任何激素療法或生物療法一起使用。

在一些實施例中，維他命D化合物與化學治療劑共同投與。語言「與化學治療劑共同投與」包括維他命D化合物實質上與化學治療劑同時投與。舉例而言，可將維他命D化合物與化學治療劑共同投與；可首先投與維他命D化合物，隨後即刻投與化學治療劑，或可首先投與化學治療劑，隨後即刻投與維他命D化合物。

在一些其他實施例中，在禿髮症出現之前(例如在毛髮脫落之前)將維他命D化合物投與個體。在某些實施例中，在化學療法開始之後、但在禿髮症開始出現之前將維他命D化合物投與個體。在其他實 施例中，個體尚未顯現禿髮症症狀(例如禿髮症尚未開始出現)。可在化學療法之前或與化學療法同時將維他命D化合物投與個體。

語言「治療有效量」包括維他命D化合物預防或治療個體禿髮症所必需或足夠之量。有效量可視諸如個體體型及重量、疾病類型等因素而變。一般技術者將能夠研究前述因素且對維他命D化合物之有效量作出確定，而無需過度實驗。

可將本發明之維他命D化合物以等效於約0.001μg-5μg鈣化三醇/cm²之劑量體積局部投與有需要之個體。在某些實施例中，範圍為約0.01μg-0.5μg鈣化三醇/cm²或約0.1μg-0.5μg鈣化三醇/cm²。

語言「等效於鈣化三醇之劑量體積」包括維他命D化合物之生物及/或治療活性實質上與0.001μg-5μg鈣化三醇/cm²之生物及/或治療活性類似的量。

語言「有效濃度」包括局部調配物中維他命D化合物預防或治療個體禿髮症所必需或足夠之濃度。在某些實施例中，局部調配物中維他命D化合物之濃度為約0.1、0.2、0.5、1.0、2、3、5、10、20、30、50、75、100、150、200或400μg/mL。

在某些實施例中，維他命D化合物之總劑量等效於約0.025-400微克鈣化三醇/75公斤體重。在某些實施例中，範圍為約0.1-100微克鈣化三醇/75公斤體重；約0.4-25微克鈣化三醇/75公斤體重；或約1、2、3、5或10微克鈣化三醇/75公斤體重。在某些實施例中，總劑量之範圍下限等效於約0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1或2微克鈣化三醇/75公斤體重。在某些實施例中，總劑量之範圍上限等效於約400、200、100、50、25、10、5、2或1微克鈣化三醇/75公斤體重。

在另一態樣中，本發明提供藉由向個體局部投與包含治療有效量之維他命D化合物之醫藥組合物來預防或治療該個體之禿髮症的方法，其中該維他命D化合物按以下有效濃度局部投與個體時：(1)約50 μg/mL，在連續投與藥物至少約25天之後不會產生毒性；或(2)約100μg/mL，在連續投與藥物至少約7天之後不會產生毒性。

投與維他命D化合物可能引起之毒性副作用可包括例如高鈣血症，其症狀包括厭食、骨痛、疲勞、嘔吐、腹瀉、便秘、多尿、瘙癢、腎衰竭、口中金屬味、蛋白尿、尿圓柱、氮血或轉移性鈣化。

在一些實施例中，維他命D化合物經調配以傳遞至/積累於人類表皮、尤其頭皮或頸區之表皮中，而實質上避免傳遞至/積累於真皮中。熟習此項技術者將能夠使用實例1容易地測定傳遞至/積累於真皮及/或表皮中之維他命D化合物之量或其缺乏量。

語言「維他命D化合物」包括式I化合物： 其中：a及b各獨立地為單鍵或雙鍵；當a為雙鍵時，X為-CH₂；或當a為單鍵時，X為氫或經羥基取代之烷基；R¹為氫、羥基、烷氧基、三烷基矽烷基或烷基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；R²為氫、羥基、-O-三烷基矽烷基或烷基、烷氧基或烯基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；當b為雙鍵時，R³不存在；或當b為單鍵時，R³為氫、羥基或烷基，或R³及R¹與其所連接之碳原子可連接形成5至7員碳環； 當b為雙鍵時，R⁴不存在；或當b為單鍵時，R⁴為氫、鹵素或羥基；當a為雙鍵時，R⁵不存在；或當a為單鍵時，R⁵為氫、鹵素或羥基；R⁶為烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環基、烷基-O-烷基、烷基-CO₂-烷基，視情況經1至5個羥基、側氧基、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR'R"部分基團取代；R⁷為烷基，視情況經1至3個羥基、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR'R"部分基團取代；及R'及R"各獨立地為氫、羥基、鹵素、烷基或烷氧基，及其醫藥學上可接受之鹽。

在一些實施例中，R¹為羥基，R²為氫或羥基，a為雙鍵，R⁵不存在，X為-CH₂，b為雙鍵，R³及R⁴不存在，R⁶為烷基(例如甲基)，且R⁷為烷基(例如經取代或未經取代之烷基，例如經羥基取代之烷基或經環烷基取代之烷基，諸如-(CH₂)₃CH(CH₃)₂或-(CH₂)₃COH(CH₃)₂)或烯基(例如-CH=CHCH(CH₃)CH(CH₃)₂)。

在某些實施例中，維他命D化合物係由式(II)表示： 其中： c為單鍵或雙鍵；R^1a為氫、三烷基矽烷基或烷基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；R^2a為氫、羥基、-O-三烷基矽烷基或烷基、烷氧基或烯基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；當c為雙鍵時，R^3a及R^4a不存在；或當c為單鍵時，R^3a及R^4a各獨立地為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，視情況經1至3個羥基或鹵素部分基團取代；R^3b、R^4b、R^5a、R^6a、R^7a及R^8a各獨立地為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，視情況經1至3個羥基或鹵素部分基團取代；或R^6a、R^7a及R^8a中之任兩者可連接形成3至7員碳環，及其醫藥學上可接受之鹽。

在一實施例中，化合物係由式(II)表示，其中R^1a、R^3a及R^4a各為氫。

在另一實施例中，化合物係由式(II)表示，其中c表示單鍵。

在另一實施例中，化合物係由式(II)表示，其中R^6a與R^8a均為甲基。

在一實施例中，化合物係由式(II)表示，其中R^1a為氫。

在另一實施例中，化合物係由式(II)表示，其中R^2a為羥基。

在另一實施例中，化合物係由式(II)表示，其中R^7a為羥基。

在另一實施例中，化合物係由式(II)表示，其中R^5a為羥基。

在一實施例中，R^1a為氫，R^2a為氫或羥基，c為單鍵，R^3a、R^3b、R^4a、R^4b及R^5a各為氫，R^6a及R^7a各為烷基(例如甲基)，且R^8a為氫或羥基。

在另一實施例中，R^1a為氫，R^2a為氫或羥基，c為雙鍵，R^3a及R^4a不存在，R^3b及R^4b為氫，R^5a為烷基(例如甲基)，R^6a及R^7a各為烷基(例如甲基)，且R^8a為氫或羥基。

在一實施例中，維他命D化合物係選自以下結構，或其立體異構體或醫藥學上可接受之鹽：

在某些實施例中，維他命D化合物為1,25-二羥基維他命D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維他命D3、1α,24-二羥基維他命D3或MC 903。

在其他實施例中，維他命D化合物不為1,25-二羥基維他命D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維他命D3、1α,24-二羥基維他命D3或MC 903。

維他命D化合物之其他適合類似物、代謝物、衍生物及/或模擬物包括例如1,25-二羥基維他命D3(亦稱為鈣化三醇)、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇及其他維他命D類似物、同系物、模擬物，及維他命D化合物之衍生物，諸如以下專利中所述者，各專利以全文引用的方式併入：美國專利第4,391,802號(1α-羥基維他命D衍生物)；美國專利第4,717,721號(17側鏈之長度大於膽固醇或麥角固醇側鏈之1α-羥基 衍生物)；美國專利第4,851,401號(環戊并維他命D類似物)；美國專利第4,866,048號及第5,145,846號(具有炔基、烯基及烷基側鏈之維他命D3類似物)；美國專利第5,120,722號(三羥基鈣化醇)；美國專利第5,547,947號(氟膽鈣化醇化合物)；美國專利第5,446,035號(經甲基取代之維他命D)；美國專利第5,411,949號(23-氧雜衍生物)；美國專利第5,237,110號(19-降-維他命D化合物)；美國專利第4,857,518號(羥基化24-升-維他命D衍生物)。其他適合之實例包括ROCALTROL(Roche Laboratories)；CALCIJEX可注射鈣化三醇；來自Leo Phannaceuticals之研究性藥物，包括EB 1089(24a,26a,27a，三升-22,24-二烯-1α,25-(OH)2-D3)、KH 1060(20-表-22-氧雜-24a,26a,27a-三升-1α,25-(OH)2-D3)、MC 1288(1,25-(OH)2-20-表-D3)及MC 903(鈣泊三醇(calcipotriol)，1a,24s(OH)2-22-烯-26,27-去氫-D3)；Roche Phannaceutical之藥物，包括1,25-(OH)2-16-烯-D3、1,25-(OH)2-16-烯-23-炔-D3及25-(OH)2-16-烯-23-炔-D3；Chugai Pharmaceuticals之22-氧雜鈣化三醇(22-氧雜-1α,25-(OH)2-D3；來自University of Illinois之1α-(OH)-D5；及來自Institute of Medical Chemistry-Schering AG之藥物，包括ZK 161422(20-甲基-1,25-(OH)2-D3)及ZK 157202(20-甲基-23-烯-1,25-(OH)2-D3)；1α-(OH)-D2；1α-(OH)-D3；1α-(OH)-D4；25-(OH)-D2；25-(OH)-D3；及25-(OH)-D4。其他實例包括1α,25-(OH)2-26,27-d6-D3、1α,25-(OH)2-22-烯-D3、1α,25-(OH)2-D3、1α,25-(OH)2-D2、1α,25-(OH)2-D4、1α,24,25-(OH)3-D3、1α,24,25-(OH)3-D2、1α,24,25-(OH)3-D4、1α-(OH)-25-FD3、1α-(OH)-25-FD4、1α-(OH)-25-FD2、1α,24-(OH)2-D4、1α,24-(OH)2-D3、1α,24-(OH)2-D2、1α,24-(OH)2-25-FD4、1α,24-(OH)2-25-FD3、1α,24-(OH)2-25-FD2、1α,25-(OH)2-26,27-F6-22-烯-D3、1α,25(OH)2-26,27-F6-D3、1α,25S-(OH)2-26-F3-D3、1α,25-(OH)2-24-F2-D3、1α,25S,26-(OH)2-22-烯-D3、1α,25R,26- (OH)2-22-烯-D3、1α,25-(OH)2-D2、1α,25-(OH)2-24-表-D3、1α,25-(OH)2-23-炔-D3、1α,25-(OH)2-24R-F-D3、1α,25S,26-(OH)2-D3、1α,24R-(OH)2-25F-D3、1α,25-(OH)2-26,27-F6-23-炔-D3、1α,25R-(OH)2-26-F3-D3、1α,25,28-(OH)3-D2、1α,25-(OH)2-16-烯-23-炔-D3、1α,24R,25-(OH)3-D3、1α,25-(OH)2-26,27-F6-23-烯-D3、1α,25R-(OH)2-22-烯-26-F3-D3、1α,25S-(OH)2-22-烯-26-F3-D3、1α,25R-(OH)2-D3-26,26,26-d3、1α,25S-(OH)2-D3-26,26,26-d3及1α,25R-(OH)2-22-烯-D3-26,26,26-d3。其他實例可見於美國專利第6,521,608號中，該專利之全部揭示內容以引用的方式併入本文中。亦參見例如美國專利第6,503,893號、第6,482,812號、第6,441,207號、第6,410,523號、第6,399,797號、第6,392,071號、第6,376,480號、第6,372,926號、第6,372,731號、第6,359,152號、第6,329,357號、第6,326,503號、第6,310,226號、第6,288,249號、第6,281,249號、第6,277,837號、第6,218,430號、第6,207,656號、第6,197,982號、第6,127,559號、第6,103,709號、第6,080,878號、第6,075,015號、第6,072,062號、第6,043,385號、第6,017,908號、第6,017,907號、第6,013,814號、第5,994,332號、第5,976,784號、第5,972,917號、第5,945,410號、第5,939,406號、第5,936,105號、第5,932,565號、第5,929,056號、第5,919,986號、第5,905,074號、第5,883,271號、第5,880,113號、第5,877,168號、第5,872,140號、第5,847,173號、第5,843,927號、第5,840,938號、第5,830,885號、第5,824,811號、第5,811,562號、第5,786,347號、第5,767,111號、第5,756,733號、第5,716,945號、第5,710,142號、第5,700,791號、第5,665,716號、第5,663,157號、第5,637,742號、第5,612,325號、第5,589,471號、第5,585,368號、第5,583,125號、第5,565,589號、第5,565,442號、第5,554,599號、第5,545,633號、第5,532,228號、第5,508,392號、第 5,508,274號、第5,478,955號、第5,457,217號、第5,447,924號、第5,446,034號、第5,414,098號、第5,403,940號、第5,384,313號、第5,374,629號、第5,373,004號、第5,371,249號、第5,430,196號、第5,260,290號、第5,393,749號、第5,395,830號、第5,250,523號、第5,247,104號、第5,397,775號、第5,194,431號、第5,281,731號、第5,254,538號、第5,232,836號、第5,185,150號、第5,321,018號、第5,086,191號、第5,036,061號、第5,030,772號、第5,246,925號、第4,973,584號、第5,354,744號、第4,927,815號、第4,804,502號、第4,857,518號、第4,851,401號、第4,851,400號、第4,847,012號、第4,755,329號、第4,940,700號、第4,619,920號、第4,594,192號、第4,588,716號、第4,564,474號、第4,552,698號、第4,588,528號、第4,719,204號、第4,719,205號、第4,689,180號、第4,505,906號、第4,769,181號、第4,502,991號、第4,481,198號、第4,448,726號、第4,448,721號、第4,428,946號、第4,411,833號、第4,367,177號、第4,336,193號、第4,360,472號、第4,360,471號、第4,307,231號、第4,307,025號、第4,358,406號、第4,305,880號、第4,279,826號及第4,248,791號，各專利之全部揭示內容以引用的方式併入本文中。

可利用之其他化合物包括維他命D模擬物，諸如美國專利第6,218,430號及WO公開案2005/037755所揭示之雙芳基衍生物，各案之全部揭示內容以引用的方式併入本文中。適於本發明之非開環類固醇維他命D模擬化合物之其他實例可見於美國專利第6,831,106號、第6,706,725號、第6,689,922號、第6,548,715號、第6,288,249號、第6,184,422號、第6,017,907號、第6,858,595號及第6,358,939號中，各專利之全部揭示內容以引用的方式併入本文中。

可利用之其他適合維他命D3類似物、代謝物及/或衍生物包括美國專利申請公開案第2006/0177374號中所鑑別者，該案之全部揭示內 容以引用的方式併入本文中。

語言「維他命D類似物」包括結構及功能與維他命D類似之化合物。在一實施例中，維他命D類似物為維他命D3類似物(例如結構及功能與維他命D3類似之化合物)。

語言「維他命D代謝物」包括作為維他命D代謝中所涉及之中間物及產物的化合物。在一實施例中，維他命D代謝物為維他命D3代謝物(例如作為維他命D3代謝中所涉及之中間物或產物的化合物)。

語言「維他命D衍生物」包括藉由將母化合物(例如維他命D)之一個原子置換為另一個原子或原子團而產生之化合物。在一實施例中，維他命D衍生物為維他命D3衍生物(例如藉由將維他命D3之一個原子置換為另一個原子或原子團而產生之化合物)。

語言「維他命D模擬物」包括在生物過程中可在化學方面模擬維他命D之化合物。在一實施例中，維他命D模擬物為維他命D3模擬物(例如在生物過程中可在化學方面模擬維他命D3之化合物)。

在攝取魚肝油或照射酵母之後會吸收維他命D3。植物及動物來源僅含有非活性維他命D前驅體7-去氫膽固醇或麥角固醇。7-去氫膽固醇儲存於皮膚中且可經由日光轉化成維他命D3。然而，不論經攝取抑或在皮膚中藉由紫外線照射形成，維他命D皆必須轉化成活性代謝物。維他命D3經由肝酶轉化成25-羥基膽鈣化醇。接著，在腎中形成兩種化合物1,25-二羥基膽鈣化醇與24,25-二羥基膽鈣化醇。維他命D活性代謝物在自腸道吸收鈣、骨沈積及骨再吸收方面起重要作用。

本發明之維他命D化合物共有某些常見生物活性，諸如能夠部分經由其上調或下調例如正常角質細胞(例如HEKa)中某些標靶基因表現之能力而防止角質細胞凋亡。因此，在某些實施例中，本發明之維他命D化合物在例如正常角質細胞(例如HEKa)中可展現與等量鈣化三醇類似或相同之基因調控概況。

若實質上相同莫耳量之維他命D化合物具有實質上相同或相等之生物或治療活性，則本文中所用之「等量」包括相同莫耳量。然而，當不同維他命D化合物之生物或治療活性實質上不同或不等時，語言「等量」包括可以產生與參考維他命D化合物(例如鈣化三醇)實質上相同量之生物或治療活性時的維他命D化合物量。

語言「基因調控概況」包括與適當對照相比，出現統計上顯著(例如p<0.05)調節作用(例如上調或下調)之基因的列表或系列。舉例而言，在使細胞與維他命D化合物接觸預定時段(例如24小時)之後，與假處理/媒劑處理對照相比，標靶細胞可顯示一系列在mRNA或蛋白質表現量上得到調節(例如上調或下調)之基因。在偵測時受到調節(例如上調或下調)之基因列表即構成細胞在該特定時間點之基因表現概況之快速寫照。

語言「類似基因調控概況」包括以下情形：所檢查之標靶基因之總數中超過50%、60%、70%、80%、90%或90%以上展現實質上相同之基因表現方向(例如均上調或均下調，但各基因之上調或下調量值或程度可能不同)。

語言「相同基因調控概況」包括以下情形：幾乎所有所檢查之標靶基因展現相同基因表現方向(例如均上調或均下調，但各基因之上調或下調量值或程度可能不同)。

在一實施例中，本發明之維他命D化合物促進一或多種其表現量由等量參考維他命D化合物(例如鈣化三醇)促進之標靶基因的表現。在其他實施例中，本發明之維他命D化合物抑制一或多種其表現量受到等量參考維他命D化合物(例如鈣化三醇)抑制之基因的表現。

在某些實施例中，本發明之維他命D化合物可調節正常角質細胞中蛋白質之表現。語言「調節蛋白質之表現」包括上調及下調正常角質細胞中之蛋白質。在一些實施例中，維他命D化合物調節HSPA2、 HSF4 mRNA、HSPB1或DNAJC6 mRNA之表現。舉例而言，在一些實施例中，維他命D化合物在正常角質細胞(例如HEKa)中上調HSPA2或HSF4 mRNA之表現及/或下調HSPB1或DNAJC6 mRNA之表現。

在某些實施例中，本發明之維他命D化合物調節正常角質細胞中SLC1A1、KCNB2、KCNN4蛋白質或SLC1A3蛋白質之表現。在一些實施例中，維他命D化合物可在正常角質細胞(例如HEKa)中上調SLC1A1、KCNB2或KCNN4蛋白質之表現及/或下調SLC1A3蛋白質之表現。

在某些實施例中，本發明之維他命D化合物可調節表3-1及表3-2中之一或多種蛋白質。舉例而言，在一實施例中，維他命D化合物可在例如正常角質細胞(例如HEKa)中上調表3-1中一或多種蛋白質之表現至少約2倍及/或下調表3-2中一或多種蛋白質之表現至少約2倍。

在某些實施例中，在正常角質細胞(例如HEKa)與本發明之維他命D化合物接觸約24小時之後，該維他命D化合物可誘導表3-3、表3-4、表3-5或表3-6中之任一者中一或多種蛋白質過度表現。

在某些實施例中，本發明之維他命D化合物可誘導正常角質細胞(例如HEKa)中以下一或多者過度表現：GST、角蛋白1、角蛋白17、半乳糖凝集素1、S100 A9(鈣衛蛋白)或S100 A13。

本文中所用之術語「烷基」包括完全飽和之分支鏈或未分支鏈(例如直鏈)烴部分，其包含1至20個碳原子，例如1至7個碳原子或1至4個碳原子。烷基部分之代表性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基。

此外，術語「烷基」包括「未經取代之烷基」與「經取代之烷基」。烷基部分之取代基之代表性實例為羥基、鹵素、氰基、硝基、 環烷基、烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、鹵素或胺基(包括烷基胺基、二烷基胺基、芳基胺基、二芳基胺基)。

本文中所用之術語「烷氧基」包括烷基-O-，其中烷基如上文所定義。烷氧基部分之代表性實例包括(但不限於)甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、第三丁氧基、戊氧基、己氧基、環丙氧基、環己氧基及其類似基團。在一些實施例中，烷氧基具有約1至7個碳，例如1至4個碳。術語烷氧基包括經取代之烷氧基。經取代之烷氧基之實例包括鹵化烷氧基。經鹵素取代之烷氧基之實例為氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、氯甲氧基、二氯甲氧基及三氯甲氧基。

術語「烷氧基烷基」包括如上文所定義之烷基，其中該烷基經烷氧基取代。此外，術語「烷氧基烷基」包括「未經取代之烷氧基烷基」與「經取代之烷氧基烷基」。烷氧基烷基部分之取代基之代表性實例包括(但不限於)羥基、鹵素、氰基、硝基、烷基、環烷基、烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、鹵素或胺基(包括烷基胺基、二烷基胺基、芳基胺基、二芳基胺基)。

術語「烯基」包括具有至少一個碳碳雙鍵之分支鏈或未分支鏈烴。烯基部分之代表性實例包括(但不限於)乙烯基、丙-1-烯基、烯丙基、丁烯基、異丙烯基或異丁烯基。此外，術語「烯基」包括「未經取代之烯基」與「經取代之烯基」。烯基部分之取代基之代表性實例包括(但不限於)羥基、鹵素、氰基、硝基、烷基、環烷基、烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、鹵素或胺基(包括烷基胺基、二烷基胺基、芳基胺基、二芳基胺基)。

術語「炔基」包括具有至少一個碳碳參鍵之分支鏈或未分支鏈烴。炔基部分之代表性實例包括(但不限於)乙炔基、丙-1-炔基(炔丙基)、丁炔基、異丙炔基或異丁炔基。此外，術語「炔基」包括「未經取代之炔基」與「經取代之炔基」。炔基部分之取代基之代表性實 例包括(但不限於)羥基、鹵素、氰基、硝基、烷基、環烷基、烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、鹵素或胺基(包括烷基胺基、二烷基胺基、芳基胺基、二芳基胺基)。

本文中所用之術語「環烷基」包括具有3至12個碳原子，例如3至8個或3至7個碳原子之飽和或不飽和單環、雙環或三環烴基。例示性單環烴基包括例如環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基及環己烯基。例示性雙環烴基包括例如莰基(bornyl)、吲哚基、六氫吲哚基、四氫萘基、十氫萘基、雙環[2.1.1]己基、雙環[2.2.1]庚基、雙環[2.2.1]庚烯基、6,6-二甲基雙環[3.1.1]庚基及2,6,6-三甲基雙環[3.1.1]庚基、雙環[2.2.2]辛基。三環烴基之一實例包括例如金剛烷基。

術語「環烷基」包括「未經取代之環烷基」與「經取代之環烷基」。環烷基部分之取代基之代表性實例包括(但不限於)羥基、鹵素、氰基、硝基、烷基、環烷基、烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、鹵素或胺基(包括烷基胺基、二烷基胺基、芳基胺基、二芳基胺基)。

術語「芳基」包括環部分具有6至20個碳原子之單環或雙環芳族烴基。芳基部分之代表性實例包括(但不限於)苯基、萘基、蒽基、菲基或四氫萘基。此外，術語芳基包括「未經取代之芳基」與「經取代之芳基」。芳基部分之取代基之代表性實例包括(但不限於)羥基、鹵素、氰基、硝基、烷基、環烷基、烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、鹵素或胺基(包括烷基胺基、二烷基胺基、芳基胺基、二芳基胺基)。

術語「雜芳基」包括含有5至10個選自碳原子之環成員及1至5個選自O、N或S之雜原子的單環或雙環雜芳基部分。雜芳基之實例包括(但不限於)噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、異 噻唑基、噁-2,3-二唑基、噁-2,4-二唑基、噁-2,5-二唑基、噁-3,4-二唑基、噻-2,3-二唑基、噻-2,4-二唑基、噻-2,5-二唑基、噻-3,4-二唑基、3-異噻唑基、4-異噻唑基或5-異噻唑基、2-噁唑基、4-噁唑基或5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基或5-異噁唑基、3-1,2,4-三唑基或5-1,2,4-三唑基、4-1,2,3-三唑基或5-1,2,3-三唑基、四唑基、2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基、3-噠嗪基或4-噠嗪基、3-吡嗪基、4-吡嗪基或5-吡嗪基、2-吡嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基或5-嘧啶基。雜芳基可為單環、雙環、三環或多環。

術語「雜芳基」另外包括雜芳環與一或多個芳基環、環脂族環或雜環基環稠合之基團，其中連接基團或連接點在雜芳環上或稠合芳基環上。該等雜芳基部分之代表性實例包括(但不限於)吲哚基、異吲哚基、吲唑基、吲嗪基、嘌呤基、喹嗪基、喹啉基、異喹啉基、啉基、酞嗪基、啶基、喹唑啉基、喹喏啉基、啡啶基、啡啉基、啡嗪基、啡噻嗪基、啡噁嗪基、苯并異喹啉基、噻吩并[2,3-b]呋喃基、呋喃并[3,2-b]哌喃基、5H-吡啶并[2,3-d]鄰噁嗪基、1H-吡唑并[4,3-d]噁唑基、4H-咪唑并[4,5-d]噻唑基、吡嗪并[2,3-d]噠嗪基、咪唑并[2,1-b]噻唑基、咪唑并[1,2-b][1,2,4]三嗪基、7-苯并[b]噻吩基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并氧呯基、苯并噁嗪基、1H-吡咯并[1,2-b][2]苯并氮呯基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并三唑基、吡咯并[2,3-b]吡啶基、吡咯并[3,2-c]吡啶基、吡咯并[3,2-c]吡啶基、吡咯并[3,2-b]吡啶基、咪唑并[4,5-b]吡啶基、咪唑并[4,5-c]吡啶基、吡唑并[4,3-d]吡啶基、吡唑并[4,3-c]吡啶基、吡唑并[3,4-c]吡啶基、吡唑并[3,4-d]吡啶基、吡唑并[3,4-b]吡啶基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、吡唑并[1,5-a]吡啶基、吡咯并[1,2-b]噠嗪基、咪唑并[1,2-c]嘧啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[4,3-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡啶并[2,3-d]嘧啶基、吡啶并[2,3-b]吡嗪基、吡啶并[3,4-b]吡嗪基、嘧 啶并[5,4-d]嘧啶基、吡嗪并[2,3-b]吡嗪基或嘧啶并[4,5-d]嘧啶基。此外，術語「雜芳基」包括「未經取代之雜芳基」與「經取代之雜芳基」。

「芳基」或「雜芳基」之芳環可未經取代或在一或多個環位置處經取代基取代，該等取代基包括例如鹵素、羥基、氰基、硝基、烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環基、烷氧基、環烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳氧基、雜芳氧基、雜環氧基、芳基烷氧基、雜芳基烷氧基、雜環基烷氧基、酮基(包括烷基羰基、環烷基羰基、烯基羰基、炔基羰基、芳醯基、芳基烷基羰基、雜芳基羰基、雜環基羰基)、酯基(包括烷氧基羰基、環烷氧基羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、雜環氧基羰基、烷基羰氧基、環烷基羰氧基、芳基羰氧基、雜芳基羰氧基、雜環基羰氧基)、碳酸酯基(包括烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、雜芳氧基羰氧基)、胺基甲酸酯基(包括烷氧基羧基胺基、芳氧基羰基胺基、烯氧基羰基胺基、炔氧基羰基胺基、芳氧基羰基胺基、胺基羰氧基、烷基胺基羰氧基、二烷基胺基羰氧基、芳基胺基羰氧基)、胺甲醯基(包括烷基胺基羰基、二烷基胺基羰基、芳基胺基羰基、芳基烷基胺基羰基、烯基胺基羰基)、醯胺基(包括烷基羰基胺基、烷基羰基烷基胺基、芳基羰基胺基、雜芳基羰基胺基)、芳基烷基、雜芳基烷基、雜環烷基、胺基(包括烷基胺基、二烷基胺基、芳基胺基、二芳基胺基及烷基芳基胺基)、磺醯基(包括烷基磺醯基、芳基磺醯基、芳基烷基磺醯基、雜芳基磺醯基、烷氧基磺醯基、芳氧基磺醯基、雜芳氧基磺醯基、環烷基磺醯基、雜環基磺醯基)、胺磺醯基、磺醯胺基、磷酸酯基、膦酸基、亞膦酸基、硫醚基(包括烷硫基、芳硫基、雜芳硫基)、脲基、亞胺基、甲脒基、硫羧基(包括烷硫基羰基、芳硫基羰基)、亞磺醯基(包括烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基)、羧基，其中各前述烴基可視情況經一或多個烷基、烯基、炔 基、環烷基、鹵素、羥基或烷氧基取代。

本文中所用之術語「雜環基」或「雜環」包括未經取代或經取代之飽和或不飽和非芳族環或環系統，例如其為4員、5員、6員或7員單環，7員、8員、9員、10員、11員或12員雙環，或10員、11員、12員、13員、14員或15員三環系統，且含有至少一個選自O、S及N之雜原子，其中N及S亦可視情況氧化成各種氧化態。在一實施例中，雜環基部分表示含有5至7個環原子且視情況含有選自O、S或N之另一雜原子的飽和單環。雜環基可在雜原子或碳原子處連接。雜環基可包括稠環或橋環以及螺環。雜環基部分之實例包括例如二氫呋喃基、二氧戊環基、二噁烷基、二噻烷基、哌嗪基、吡咯啶基、二氫哌喃基、氧硫雜環戊烷基、二硫雜環戊烷基、氧硫雜環己烷基、硫代N-嗎啉基、環氧乙烷基、氮丙啶基、氧雜環丁烷基、氧雜環庚烷基、氮雜環丁烷基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、吡咯啶基、四氫哌喃基、哌啶基、N-嗎啉基、哌嗪基、氮呯基、氧呯基、氧氮雜環庚烷基、氧硫雜環己烷基、硫雜環庚烷基、氮雜環庚烷基、二氧雜環庚烷基及二氮雜環庚烷基。

術語「雜環基」包括如本文所定義之雜環基團，其可經1、2或3個以下取代基取代：諸如=O、=S、鹵素、羥基、氰基、硝基、烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環基、烷氧基、環烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳氧基、雜芳氧基、雜環氧基、芳基烷氧基、雜芳基烷氧基、雜環基烷氧基、酮基(包括烷基羰基、環烷基羰基、烯基羰基、炔基羰基、芳醯基、芳基烷基羰基、雜芳基羰基、雜環基羰基)、酯基(包括烷氧基羰基、環烷氧基羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、雜環氧基羰基、烷基羰氧基、環烷基羰氧基、芳基羰氧基、雜芳基羰氧基、雜環基羰氧基)、碳酸酯基(包括烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、雜芳氧基羰氧基)、胺基甲酸酯基(包括烷氧基羧基胺基、 芳氧基羰基胺基、烯氧基羰基胺基、炔氧基羰基胺基、芳氧基羰基胺基、胺基羰氧基、烷基胺基羰氧基、二烷基胺基羰氧基、芳基胺基羰氧基)、胺甲醯基(包括烷基胺基羰基、二烷基胺基羰基、芳基胺基羰基、芳基烷基胺基羰基、烯基胺基羰基)、醯胺基(包括烷基羰基胺基、烷基羰基烷基胺基、芳基羰基胺基、雜芳基羰基胺基)、芳基烷基、雜芳基烷基、雜環基烷基、胺基(包括烷基胺基、二烷基胺基、芳基胺基、二芳基胺基及烷基芳基胺基)、磺醯基(包括烷基磺醯基、芳基磺醯基、芳基烷基磺醯基、雜芳基磺醯基、烷氧基磺醯基、芳氧基磺醯基、雜芳氧基磺醯基、環烷基磺醯基、雜環基磺醯基)、胺磺醯基、磺醯胺基、磷酸酯基、膦酸基、亞膦酸基、硫醚基(包括烷硫基、芳硫基、雜芳硫基)、脲基、亞胺基、甲脒基、硫羧基(包括烷硫基羰基、芳硫基羰基)、亞磺醯基(包括烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基)、羧基，其中各前述烴基可視情況經一或多個烷基、烯基、炔基、環烷基、鹵素、羥基或烷氧基取代。

術語「雜環基烷基」為經雜環基取代之烷基。該術語包括未經取代及經取代之雜環基烷基部分，其可經一或多個烷基、烯基、炔基、環烷基、鹵素、羥基或烷氧基取代。

術語「羰基」或「羧基」包括含有經雙鍵與氧原子連接之碳(C=O)的化合物及部分。羰基可經使得本發明之化合物執行其預定功能之任何部分進一步取代。舉例而言，羰基部分可經烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、胺基等取代。含有羰基之部分之實例包括醛、酮、羧酸、醯胺、酯、脲、酐等。

術語「羥基」包括具有-OH或-O^-之基團。

術語「鹵素」包括氟、溴、氯、碘等。

術語「全鹵化」包括所有氫經鹵素原子置換之部分。

本發明之維他命D化合物或其醫藥學上可接受之鹽、其溶劑合物 或前藥可含有一或多個不對稱中心且由此可產生對映異構體、非對映異構體及可根據絕對立體化學而針對胺基酸定義為(R)-或(S)-或定義為(D)-或(L)-之其他立體異構形式。本發明欲包括所有該等可能存在之異構體以及其外消旋形式及光學純形式。光學活性(+)及(-)、(R)-及(S)-或(D)-及(L)-異構體可使用對掌性合成組元或對掌性試劑來製備，或使用習知技術，諸如使用對掌性管柱進行HPLC來解析。當本文所述之化合物含有烯屬雙鍵或其他幾何不對稱中心時，且除非另外說明，否則該等化合物欲包括E與Z幾何異構體。同樣地，所有互變異構形式亦欲包括在內。

術語「立體異構體」包括由經相同鍵鍵結之相同原子構成但具有不可互換之不同三維結構之化合物。本發明涵蓋各種立體異構體及其混合物，且包括對映異構體，其係指分子為彼此之不可重疊鏡像的兩種立體異構體。

本發明包括所有醫藥學上可接受之經同位素標記之維他命D化合物，其中一或多個原子經具有相同原子序數，但原子質量或質量數不同於通常天然所見之原子質量或質量數的原子置換。

適於包括在本發明化合物中之同位素之實例包含氫同位素，諸如²H及³H；碳同位素，諸如¹¹C、¹³C及¹⁴C；氯同位素，諸如³⁶Cl；氟同位素，諸如¹⁸F；碘同位素，諸如¹²³I及¹²⁵I；氮同位素，諸如¹³N及¹⁵N；氧同位素，諸如¹⁵O、¹⁷O及¹⁸O；磷同位素，諸如³²P；及硫同位素，諸如³⁵S。經諸如氘(亦即²H)之較重同位素取代可因較高代謝穩定性而提供某些治療優勢，例如活體內半衰期延長或劑量需求降低。經同位素標記之維他命D化合物一般可藉由熟習此項技術者已知之習知技術使用經同位素適當標記之試劑替代先前採用之未標記試劑來製備。

術語「前藥」包括可在生理條件下或藉由溶劑分解作用而轉化 成具生物活性之本發明化合物的化合物。因此，術語「前藥」係指本發明化合物之醫藥學上可接受之代謝前驅體。前藥在投與有需要之個體時可不具活性，但在活體內轉化成具活性之本發明化合物。前藥通常在活體內例如藉由在血液中水解或在腸或肝中轉化而快速轉化得到本發明之母化合物。前藥化合物在哺乳動物生物體中常常提供可溶性、組織相容性或延遲釋放之優勢(參見Bundgard,H.,Design of Prodrugs(1985)，第7-9頁，第21-24頁(Elsevier,Amsterdam))。

關於前藥之論述提供於Higuchi,T.等人「Pro-drugs as Novel Delivery Systems」,A.C.S.Symposium Series，第14卷中及Bioreversible Carriers in Drug Design,Edward B.Roche編Anglican Pharmaceutical Association arid Pergamon Press,1987中。

「醫藥學上可接受之鹽」包括酸加成鹽與鹼加成鹽。

「醫藥學上可接受之酸加成鹽」係指保留游離鹼之生物效用及特性之彼等鹽，其在生物學上或在其他方面不會不合需要且由無機酸及有機酸形成，該等無機酸為諸如(但不限於)鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及其類似酸，該等有機酸為諸如(但不限於)乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、褐藻酸、抗壞血酸、天冬胺酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙醯胺基苯甲酸、樟腦酸、樟腦-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、檸檬酸、環己胺磺酸(cyclamic acid)、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羥基乙烷磺酸、甲酸、反丁烯二酸、半乳糖二酸、龍膽酸、葡糖庚酸、葡糖酸、葡糖醛酸、麩胺酸、戊二酸、2-側氧基-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、馬尿酸、異丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、順丁烯二酸、蘋果酸、丙二酸、杏仁酸、甲烷磺酸、黏液酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羥基-2-萘甲酸、菸鹼酸、油酸、乳清酸、草酸、棕櫚酸、雙羥萘酸、丙酸、焦麩胺酸、丙酮酸、水楊酸、4-胺基水楊酸、癸二酸、硬脂酸、丁二酸、酒石酸、 硫氰酸、對甲苯磺酸、三氟乙酸、十一烯酸及其類似酸。

「醫藥學上可接受之鹼加成鹽」係指保留游離酸之生物效用及特性之彼等鹽，其在生物學上或在其他方面不會不合需要。此等鹽係藉由將無機鹼或有機鹼添加至游離酸中來製備。源自無機鹼之鹽包括(但不限於)鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、錳鹽、鋁鹽及其類似鹽。較佳無機鹽為銨鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及鎂鹽。源自有機鹼之鹽包括(但不限於)以下之鹽：一級胺、二級胺及三級胺、經取代之胺(包括天然存在之經取代之胺)、環胺及鹼離子交換樹脂，諸如氨、異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇(deanol)、2-二甲胺基乙醇、2-二乙胺基乙醇、二環己胺、離胺酸、精胺酸、組胺酸、咖啡鹼、普魯卡因(procaine)、海卓胺(hydrabamine)、膽鹼、甜菜鹼、苄苯乙胺(benethamine)、苄星(benzathine)、乙二胺、葡糖胺、甲基還原葡糖胺、可可豆鹼、三乙醇胺、緩血酸胺、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺樹脂及其類似物。

結晶常常產生本發明化合物之溶劑合物。本文中所用之術語「溶劑合物」係指包含一或多個本發明化合物分子與一或多個溶劑分子之聚集體。溶劑可為水，在此情況下溶劑合物可為水合物。或者，溶劑可為有機溶劑。因此，本發明化合物可以水合物形式存在，包括單水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物及其類似物；以及相應溶劑化形式存在。本發明化合物可為真溶劑合物；而在其他情況下，本發明化合物可僅保留外來水或為水與某種外來溶劑之混合物。

語言「醫藥組合物」包括本發明化合物(例如維他命D化合物)與此項技術中一般所接受之介質的調配物，其用於將維他命D化合物傳遞至個體。此類介質包括本發明化合物之所有醫藥學上可接受之載 劑、稀釋劑或賦形劑。

在一些實施例中，可將本發明組合物局部投與任何上皮表面。「上皮表面」包括覆蓋身體外表面或作為中空結構之內襯的組織區域，包括(但不限於)皮膚及黏膜表面。該等上皮表面包括口、咽、食道、肺、眼、耳、鼻、頰、舌、陰道、子宮頸、泌尿生殖器、消化道及肛門直腸之表面。

可將組合物調配成用於局部投藥之多種習知形式。此等形式包括例如半固體及液體劑型，諸如液體溶液或懸浮液、凝膠、乳膏、乳液、洗劑、漿料、散劑、噴霧、發泡體、糊劑、軟膏、油膏、香膏或滴劑。

供局部施用之習用載劑包括果膠、明膠及其衍生物、聚乳酸或聚乙醇酸聚合物或其共聚物、纖維素衍生物(諸如甲基纖維素、羧甲基纖維素或氧化纖維素)、瓜爾膠(guar gum)、阿拉伯膠(acacia gum)、刺梧桐膠、黃蓍膠、膨潤土、瓊脂、卡波姆(carbomer)、泡葉藻、長角豆、葡聚糖及其衍生物、哥地膠(ghatti gum)、鋰皂石、卵葉車前果殼、聚乙烯吡咯啶酮、矽石及其衍生物、三仙膠(xanthan gum)、高嶺土(kaolin)、滑石、澱粉及其衍生物、石蠟、水、植物油及動物油、聚乙烯、聚氧化乙烯、聚乙二醇、聚丙二醇、甘油、乙醇、丙醇、丙二醇(二醇類、醇類)、不揮發性油、鈉鹽、鉀鹽、鋁鹽、鎂鹽或鈣鹽(諸如氯化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽、檸檬酸鹽、葡糖酸鹽、乳酸鹽、乙酸鹽、葡庚糖酸鹽或酒石酸鹽)。

可將局部用藥劑之標準組成策略應用於維他命D化合物，以增強藥物之持久性及滯留時間且改良所達成之預防功效。

亦可使用局部經皮貼片。經皮貼片具有將本發明組合物受控傳遞至身體之額外優勢。該等劑型可藉由將藥劑溶解或分散於適當介質中而製成。

除維他命D化合物以外，散劑及噴霧亦可含有載劑，諸如乳糖、滑石、氫氧化鋁、矽酸鈣及聚醯胺粉末或此等物質之混合物。噴霧可另外含有習用推進劑，諸如氯氟烴及未經取代之揮發性烴，諸如丁烷及丙烷。

通常，水性氣霧劑係藉由將維他命D化合物之水溶液或懸浮液與醫藥學上可接受之習知載劑及穩定劑調配在一起而製成。載劑及穩定劑隨著特定化合物之需求而變，但通常包括非離子型界面活性劑(例如吐溫(Tween)、普朗尼克(Pluronic)、聚乙二醇及其類似物)、蛋白質(如血清白蛋白)、脫水山梨糖醇酯、油酸、卵磷脂、胺基酸(諸如甘胺酸)、緩衝劑、鹽、糖或糖醇。氣霧劑一般係由等張溶液製備。可由此項技術中已知之任一方法產生本發明之氣霧劑或任何其他傳遞用劑。舉例而言，在氣霧劑傳遞之情況下，化合物連同任何適合載劑與推進劑一起以細微粉碎形式提供。

液化推進劑在周圍條件下通常為氣體且在壓力下濃縮。推進劑可為此項技術中可接受且已知之任何推進劑，包括丙烷及丁烷或其他低碳烷烴，諸如至多5個碳之低碳烷烴。將組合物容納於具有適當推進劑及閥門之容器內，且維持於高壓下直至藉由閥門動作而釋放為止。

在一實施例中，可預防性地投與維他命D化合物。對於預防性施用，可在可能出現禿髮症之前施用維他命D化合物。可使施用時序最佳化以使維他命D化合物之預防效用最大。施用時序將視投藥模式、劑量、組合物之穩定性及效用、給藥頻率(例如單次施用或多次給藥)而變。熟習此項技術者將能夠確定使維他命D化合物之預防效用最大所需之最適當時間間隔。

維他命D化合物當存在於組合物中時，一般將以總重量之約0.000001%至約100%、更佳約0.001%至約50%且最佳約0.01%至約25% 之量存在。

對於包含載劑之本發明組合物，該組合物包含例如約1重量%至約99重量%、較佳約50重量%至約99重量%且最佳約75重量%至約99重量%之至少一種載劑。

又，可根據預定劑量將本發明組合物之各別組分預摻合或可將各組分各別地添加至同一環境中，以便達到治療組分所要之濃度水準且只要組分最終彼此均勻混合即可。此外，可連續或間歇式投與或傳遞本發明。

在一實施例中，調配物包括維他命D活性成份，視情況與醫藥學上可接受之其他微量賦形劑、載劑或稀釋劑(諸如約0.4%(w/v)多烯卵磷脂膽鹼90G(Phospholipon 90G))一起調配於約40%(w/w)丙二醇及約60%(w/w)無水絕對乙醇(200酒精度，US)中。在另一實施例中，調配物包括維他命D活性成份，視情況與醫藥學上可接受之其他微量賦形劑、載劑或稀釋劑(諸如約0.4%(w/v)多烯卵磷脂膽鹼90G))一起調配於約30%(w/w)丙二醇、約10%(w/w)乙氧基二乙二醇或二乙二醇單乙醚及約60%(w/w)無水絕對乙醇(200酒精度，US)中。在一些實施例中，乙醇為無水絕對200酒精度(U.S.)未變性乙醇(USP)。本文所述之調配物提供活性維他命D化合物對真皮一定程度的穿透及傳遞，且提供預防禿髮症或降低禿髮症、尤其化學療法誘發之禿髮症(CIA)之嚴重度的有效方式。

在某些實施例中，醫藥組合物包含約40%(w/w)丙二醇(USP級)及約60%(w/w)無水絕對乙醇(200酒精度，US，未變性USP)。

在一些實施例中，醫藥組合物包含約40%(w/w)丙二醇(例如USP級或更高級)及約60%(w/w)無水絕對乙醇(200酒精度，US，未變性)(例如USP級或更高級)。

在其他實施例中，醫藥組合物包含約30%(w/w)丙二醇、約10% (w/w)乙氧基二乙二醇或二乙二醇單乙醚及約60%(w/w)無水絕對乙醇(200酒精度，U.S.)。

在其他實施例中，醫藥組合物包含約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1%之多烯卵磷脂膽鹼，諸如多烯卵磷脂膽鹼90G。

在其他實施例中，丙二醇及/或無水絕對乙醇之精確百分比(w/w)可基於40%：60%之比率而變。舉例而言，丙二醇與無水絕對乙醇之比率%可為20：80、25：75、30：70、35：65、36：64、37：63、38：62、39：61、41：59、42：58、43：57、44：56、45：55等。該等其他調配物之效用可使用技術上公認之技術，諸如實例I中所述之程序來驗證。

在某些實施例中，調配物中之無水絕對乙醇可用95%乙醇、96%乙醇、97%乙醇、98%乙醇或99%乙醇替代。

在某些實施例中，醫藥組合物亦可包括痕量之其他非活性成分、賦形劑或組分。該等成分之存在實質上不會影響維他命D化合物之效用或其真皮穿透/積累行為。

本發明之維他命D化合物經調配以供傳遞至表皮，而實質上不會穿透真皮層。Roche Dermatology先前開發之不同調配物當以每次施用約500-1000μg之劑量使用時對防範CIA不太有效，且在I期研究中使大部分人類個體出現皮炎。相同Roche調配物亦未能在大鼠綠色白血病模型中起作用(下文)。

本發明之例示性調配物之一可根據以下(非限制性)程序製備：

配方I：1.2μg/g(1.2ppm)鈣化三醇

配方I如下製備：將鈣化三醇溶解於乙醇中；接著添加丙二醇且混合直至所得溶液外觀上澄清且均勻。上述調配物之比重為約0.875g/mL。以w/v表示之上述配方之目標濃度為1.05μg/mL。

配方II：3.6μg/g(3.6ppm)鈣化三醇

配方II如下製備：將鈣化三醇溶解於乙醇中；接著添加丙二醇且混合直至所得溶液外觀上澄清且均勻。上述調配物之比重為約0.875g/mL。以w/v表示之上述配方之目標濃度為3.15μg/mL。

所用試劑皆為USP級試劑(滿足美國藥典(U.S.Pharmacopeia)之要求)。

使用劑量為約0.2μg(以100μL 2μg/mL局部溶液形式投與)之本發明調配物保護新生大鼠免於出現CIA。基於此資訊，熟習此項技術者可基於待治療之哺乳動物之平均體重而容易地調整適當劑量。舉例而言，在人類個體中，可使用總劑量為約2.5μg、5μg、10μg、25μg、50μg、75μg或100μg之鈣化三醇(或其他等量維他命D化合物)。動物毒物學初步研究顯示約100μg之劑量不會對真皮產生刺激，且展現極佳表皮穿透，而無實質性真皮穿透(例如極少穿透至真皮)。參見上文關於其他劑量資訊之描述。

實例

以下實例說明本發明之某些態樣且在任何方面皆不具限制性。儘管出於清楚理解及說明之目的已相當詳細地描述實例，但熟習此項技術者應瞭解，可在不脫離本發明之真實範疇的情況下在形式及細節上作出各種改變。

實例1. 在活體外使用法蘭士(Franz)人類皮膚有限劑量模型評估鈣化三醇之經皮吸收

設計此實例以評估各種鈣化三醇調配物之經皮吸收藥物動力學。在活體外使用有限劑量技術及法蘭士擴散槽量測人類屍體皮膚中之吸收。

活體外人類屍體皮膚模型已證實為進行局部施用藥物之經皮吸收研究及藥物動力學測定之有價值工具。該模型使用安放於經特別設計之擴散槽中之人類屍體皮膚，該等擴散槽使皮膚維持於匹配典型活體內條件之溫度及濕度下。將有限劑量(例如4-7mg/cm²)之調配物施用於皮膚之外表面，且藉由監測其在浸泡皮膚內表面之受體溶液中之出現速率來量測藥物吸收。接著以此模型精確測定定義總吸收、吸收速率以及皮膚含量之數據。該方法具有精確預測活體內經皮吸收動力學之歷史先例。因此，人類皮膚之活體外有限劑量模型可對諸如鈣化三醇之維他命D化合物之經皮吸收藥物動力學進行表徵。

在此實驗中，在三個不同屍體皮膚供體中之每一者上測試六種含有鈣化三醇之調配物經48小時給藥時段鈣化三醇之經皮吸收，每一調配物採用三個平行實驗皮膚部分。在施用劑量之後的預選時間，移除全部真皮受體溶液，用新鮮受體溶液置換，且保存等分試樣以供後續分析。另外，回收角質層、表皮及真皮且評估藥物含量。藉由高效液相層析(HPLC)分析樣品之鈣化三醇含量。下文提供本文所用方案之簡要描述。

在此研究中使用死亡24-48小時內獲得之無明顯皮膚病徵象之人類屍體軀幹皮膚。將皮膚取皮，低溫保藏且密封於不透水塑膠袋中，且儲存於<-70℃下直至實驗當天。在使用前，將皮膚於約37℃水中解凍，接著用自來水沖洗以自表面移除任何黏著血液或其他物質。

將來自單一供體之皮膚切成多個足以安置於2.0cm²靜態法蘭士 擴散槽上之較小部分。對於各調配物測試每一供體之三個平行實驗部分。用磷酸鹽緩衝等張鹽水(PBS)之儲集溶液(pH 7.4±0.1)填充真皮腔室之容積，且使表皮腔室對周圍實驗室環境開放。可將一種已知增強水溶性較差之化合物之水溶性的非離子型界面活性劑Volpo(Oleth-20)添加至PBS中。含Volpo之儲集溶液確保經皮吸收期間之擴散漏槽條件，且已知不會影響測試皮膚之障壁特性。接著將槽置於擴散裝置中，在該擴散裝置中以約600RPM磁性攪拌真皮儲集溶液且維持其溫度以使皮膚表面溫度達到32.0±1.0℃。

為確保各皮膚部分之完整性，在施用測試產品之前測定其對氚化水之滲透性。在簡短(0.5-1小時)平衡時段之後，用滴管使³H₂O(NEN,Boston,MA；比活性為約0.5μCi/mL)在皮膚之上成層以便覆蓋整個暴露表面(約250-500μL)。5分鐘後，移除³H₂O水層。在30分鐘時，收集儲集溶液且藉由液體閃爍計數來分析放射性含量。³H₂O吸收小於1.56微升-當量/平方公分(μL-equ/cm²)之皮膚樣本視為可接受的。所用之所有皮膚樣品的³H₂O吸收皆小於約0.50微升-當量/平方公分(結果未圖示)。

劑量投與及樣品收集： 在臨給藥前，獲取預給藥樣品且用含0.2% Volpo(亦稱為Oleth-20，一種用以確保藥物於水溶液中之可混性的非離子型界面活性劑)之0.1×PBS之新鮮溶液置換儲集溶液。自法蘭士槽移除玻璃罩以使得完全接近皮膚之表皮表面。接著使用經設定以傳遞10μL調配物/cm²之正排量式吸液管將所有調配物施用於皮膚部分。用吸液管之鐵氟龍針尖(Teflon tip)使劑量散佈於整個表面上。施用後5至10分鐘，置換法蘭士槽之玻璃罩部分。在給藥後之預選時間(6、12、24及48小時)，移除全部儲集溶液，用新鮮儲集溶液置換，且保存預定體積之等分試樣以供後續分析。

將來自各供體之單一皮膚部分安放於未經給藥、但用以評估自 皮膚擴散出之物質出現的槽上，該等物質可表示內源鈣化三醇。收集最末樣品之後，用80：20乙醇：水洗滌皮膚表面兩次(每次1.0mL體積)以自皮膚表面收集未吸收之調配物。洗滌後，自腔室移除皮膚且分割成表皮及真皮。用80：20乙醇：水萃取各層隔夜。

藉由高效液相層析(HPLC)定量鈣化三醇。簡言之，在具有Agilent 1100系列LC/MSD之Hewlett-Packard 1100系列HPLC系統上進行HPLC。使由A)0.1%乙酸銨水溶液及B)0.1%乙酸銨之甲醇溶液組成之溶劑系統以0.550mL/min之流動速率穿過Phenomenex Luna C18(2)管柱(100A，3μ，100×4.6mm)。使用每天自純標準物制定之外標準曲線將峰面積定量為濃度。將收集當天未檢定之樣品儲存於-20℃或低於-20℃下。

在預備研究中，將來自群組之單一調配物給與6個腔室，單一供體上採用約5μL/cm²之劑量。在0、2、4、8、12、24、32及48小時收集受體溶液。在收集最末受體溶液樣品之後，如先前所述洗滌表面且收集皮膚以供分析。處理所有樣品且分析鈣化三醇含量。

關鍵性研究之最終設計係基於預備研究中所觀測之結果，詳言之，施用劑量、受體溶液取樣時程及樣品處理方法。進行此等修改以使關鍵性研究樣品中鈣化三醇之偵測及定量最佳化。舉例而言，儘管預備方案陳述在2、4、8、12、24、32及48小時獲取儲集樣品，但在預備研究之後確定將在6、12、24及48小時獲取儲集樣品以有助於達成儲集樣品中鈣化三醇之較佳偵測水準。另外，在預備研究之後，確定向2cm²給與20μL(給藥量則為10μL/cm²)將改良儲集溶液樣品中鈣化三醇之偵測。然而，未給藥腔保持於1cm²。

計算以下參數：a)總吸收(所有儲集溶液之和)；b)整個研究時段之穿透速率及程度；及c)施用劑量之質量平衡。對於數據評估，a)若任何樣品皆小於LLQ(定量下限)，則可將樣品處理成非數據值。對於 放射性樣品(例如水完整性測試)，空白樣品之預定平均背景值即定為LLQ。據研究者判斷，所有小於LLQ之值皆定為零值或為計算關鍵參數而量測之實際值；b)由是否大於剩餘平行實驗腔室組之相同值的平均值±3SD範圍或如Dean及Dixon離群值測試所測定來確認疑似離群值。據研究者判斷，自數據之總和移除定為離群值之值(但在正文或數據表中按原樣標註)；c)在腔室內，若既定時間點值已定為非數據值或因其他原因而缺失，則用內插值替代該時間點值以計算相關參數。如下在連接鄰近值之線上計算內插值：

￭給出3個點：(T1,A)、(T2,B)及(T3,C)，其中(B)缺失，

￭其中T=時間且A-C=所量測之數據值

￭估計B=A-[((A-C)/|T1-T3|)×(|T1-T2|)]

對於統計學評估，求取供體內平行實驗之平均值且計算各關鍵參數之標準差。接著整理供體內平均值，且計算整個供體群體中帶有標準誤差之平均值。使用司徒頓氏t檢驗(Student's t-test)評估測試物之間的差異。

使用此方案，評估以下測試調配物：

￭A(1ppm)：將0.2mL(1%(w/v))100ppm鈣化三醇濃縮物(以下批號H)溶解於19.8mL(99%(w/v))200酒精度乙醇(1μg/mL)中。

￭B(1ppm)：首先將0.2mL(1%(w/v))100ppm鈣化三醇濃縮物(以下批號H)溶解於11.8mL(59%(w/v)200酒精度乙醇中；接著添加8mL(40%(w/v))丙二醇，且混合直至澄清且均勻(1μg/mL)。

￭C(1ppm)：首先將0.2mL(1%(w/v))100ppm鈣化三醇濃縮物(以下批號H)溶解於11.8mL(59%(w/v)200酒精度乙醇中；接著添加6mL(30%(w/v))丙二醇及2mL(10%(w/v)乙氧基二乙二醇，且混合直至澄清且均勻(1μg/mL)。

￭D(3ppm)：首先將0.6mL(3%(w/v))100ppm鈣化三醇濃縮物(以下 批號H)溶解於11.4mL(57%(w/v))200酒精度乙醇中；接著添加6mL(30%(w/v))丙二醇且混合直至澄清且均勻；最後添加2mL(10%(w/v))乙氧基二乙二醇且混合直至澄清且均勻(3μg/mL)。

￭E(1ppm)：首先將0.2mL(1%(w/v))100ppm鈣化三醇濃縮物(以下批號H)溶解於11.72mL(58.6%(w/v))200酒精度乙醇(DP-04-099)中；接著添加6mL(30%(w/v))丙二醇且混合直至澄清且均勻；接著添加2mL(10%(w/v))二乙二醇單乙醚P且混合直至澄清且均勻；最後添加0.08mL(0.4%(w/v))多烯卵磷脂膽鹼90G濃縮物(以下批號G)且分散於溶液中，混合直至澄清且均勻(1μg/mL)。

￭F(3ppm)：首先將0.6mL(3%(w/v))100ppm鈣化三醇濃縮物(以下批號H)溶解於11.32mL(56.6%(w/v))200酒精度乙醇中；接著添加6mL(30%(w/v))丙二醇且混合直至澄清且均勻；接著添加2mL(10%(w/v))二乙二醇單乙醚P且混合直至澄清且均勻；最後添加0.08mL(0.4%(w/v))多烯卵磷脂膽鹼90G濃縮物(以下批號G)且分散於溶液中，混合直至澄清且均勻(31μg/mL)。

￭G：將50g(50%(w/v))200酒精度乙醇與50g(50%(w/v)多烯卵磷脂膽鹼90G混合，且混合直至澄清且均勻。

￭H：將0.01mg(0.01%(w/v)鈣化三醇完全溶解於100mL(99.99%(w/v)200酒精度乙醇中。

此研究中所用之所有試劑皆為分析級試劑或更高級。在最終報告文本內首次提及各化學品之後將標註獨特試劑之來源。

此研究之結果概述於以下匯總表中：匯總表：整個供體之表皮、真皮中鈣化三醇含量之平均結果，及使用人類屍體皮膚經單次施用48小時所得之鈣化三醇之總經皮吸收。平均值±SE作為總質量(ng)

數據指示，在活體外來自所評估之測試調配物之鈣化三醇穿透至、但未必穿過人類屍體皮膚。各供體之未給藥空白皮膚部分證實HPLC/MS共同溶離峰與內源鈣化三醇一致。在所有測試調配物中基本上相同且與未給藥皮膚部分類似之儲集溶液中存在之量最有可能為自皮膚部分釋放之內源鈣化三醇之擴散量。當在測試調配物及未給藥腔室中觀察到極少差異時，儲集溶液中觀察到之量不太可能表示來自局部施用之測試調配物之鈣化三醇。

當在圖1中觀察到用兩種調配物(A及B)給藥之彼等皮膚部分中之真皮含量時，觀測到鈣化三醇吸收之證據。當自未給藥皮膚部分未觀察到皮膚真皮層中可量測之含量時，由此將來自此兩種測試調配物之可量測真皮含量理解為表示自施用劑量之吸收。另外，用測試調配物給藥之所有表皮樣品皆證實鈣化三醇含量高於未給藥皮膚部分(約3倍至約17倍)。基於表皮鈣化三醇含量之等級排序將測試調配物排列為：D>F>E>C>B>A>>>未給藥皮膚

與此等級次序一致的是展示較高表皮含量之測試調配物含有較高濃度(3μg/mL相對於1μg/mL)之鈣化三醇(D及F)。在表面洗滌結果(自皮膚表面回收殘餘測試物)中觀測到極類似之等級次序。在未給藥空白皮膚部分之表面洗滌液中未發現鈣化三醇。

實例2. 鑑別對鈣化三醇之表皮細胞培養反應中所涉及之關鍵蛋白質-即時PCR(RTPCR)

此實例及以下若干實例提供關於鈣化三醇活化路徑中蛋白質或基因之一致性的額外資訊。此等實驗可鑑別表皮細胞對維他命D化合物之細胞反應中所涉及之作用機制及關鍵蛋白質/基因。

特定言之，發現使角質細胞株HEKa與鈣化三醇接觸會對細胞過程產生顯著影響。本文所述之實驗集中於鑑別鈣化三醇誘導之鈣通道轉運之變化及熱休克蛋白調控之變化中所涉及的關鍵蛋白質/基因。此實例中採用即時聚合酶鏈反應(RTPCR)方法鑑別離子通道、轉運蛋白及熱休克蛋白中所涉及之基因的mRNA含量變化。

使用PCR陣列作為篩選工具，評估一系列將潛在地提供對細胞內之鈣化三醇之生物作用模式之認知的分子標靶。使用即時PCR定量來評估mRNA含量之變化，以評估含有80個路徑特異性標靶之預選子組中mRNA之含量(參見附錄)。PCR陣列分析利用兩組基因-與熱休克蛋白(SABiosciences)相關之基因及與神經科學離子通道及轉運體(SABioscience)相關之基因。

細胞培養： 將初級人類表皮角質細胞(HEKa)以及人類角質細胞生長補充劑(Cascade Biologics,Inc.,Portland OR)維持於Epilife培養基(Cascade Biologics,Inc.,Portland OR)中。在37℃、5% CO₂下使細胞生長。

D3處理HEKa細胞： 用0.1μg/mL鈣化三醇或對照媒劑處理HEKa細胞。為得到0.1μg/mL之鈣化三醇最終濃度，將1mg鈣化三醇溶解於2mL乙醇中，且將1μL所得儲備液添加至5mL培養基中。用含有1μL乙醇之5mL培養基處理細胞之媒劑對照組。在處理開始後3、6、16、24、48或72小時收集細胞。

RNA分離： 遵循製造商之說明書，使用RNeasy Mini套組(Qiagen, Inc.,Valencia CA)在不同處理時間溶解細胞以分離RNA。藉由在260nm下量測光學密度來定量RNA。

第一股合成：根據製造商之推薦，使用RT2第一股合成套組(SABiosciences.,Frederick MD)由1μg總RNA合成第一股cDNA。

即時PCR： 用水稀釋第一股合成之產物，與SYBR綠色母體混合物(SABiosciences.,Frederick MD)混合且負載至PCR陣列上。在經Biorad CFX96上於PCR陣列(熱休克蛋白陣列及神經科學與離子通道陣列)(SABiosciences,Frederick MD)上運作即時PCR。使用可在SABiosciences網站上獲取之PCR陣列數據分析軟體進行數據分析。

下表2-1展示在熱休克蛋白基因陣列上經鈣化三醇處理之後HEKa細胞中得到調控之基因。結果僅展示在兩個獨立實驗中得到調控之彼等基因。

在HEKa細胞中藉由鈣化三醇處理而在mRNA含量方面得到調控之兩種基因為HSPB1及HSPA2。HSPB1為不僅在細胞膜中表現而且在細胞溶質、粒線體及高基氏體(golgi body)中表現之27kDa蛋白。HSPA2為存在於細胞膜及細胞核中且由HSF1調控之70kDa蛋白。HSPB1與HSPA2均牽涉於細胞凋亡中。HSF4係由視黃酸調控且涉及於細胞分化中。DNAJC6屬於蛋白質之HSP40組。其存在於網格蛋白包被小泡及細胞質中。

類似地，自神經科學與離子通道陣列獲得之三個獨立實驗一致之結果概述於下表2-2中。

始終觀測到麩胺酸轉運體及鉀通道之變化。已知SLC1A1(亦稱為EAAC1或EAAT3)主要負責轉運興奮性神經傳遞質麩胺酸通過膜。已在神經系統外諸如心臟及皮膚之組織中發現此溶質載體蛋白。在大鼠角質細胞中，有證據顯示創傷癒合中涉及麩胺酸信號傳導及SLC1A1(Genever等人，1999)。一種目前在臨床試驗中用於黑素瘤之藥物(Clinical Trials.gov,Mosby's Drug Consult，第13版)利魯唑(Riluzole)對SLC1A1之抑制指示SLC1A1在皮膚細胞中之生物作用。給定SLC1A1已牽涉於受損運動神經元之抗細胞凋亡機制中(Kiryu-Seo等人，2006)，則此實驗中在HEKa細胞中藉由D3處理上調SLC1A1之觀測結果表明潛在的保護機制路徑聯繫。

SLC1A3(亦稱為EAAT1或EA6)為可進行鈉依賴性麩胺酸及天冬胺酸轉運之另一溶質載體。在腦中神經膠質細胞中通常發現，此轉運體涉及於麩胺酸之突觸間隙清理中，藉此防止突觸後神經元之去極化時間較長。已知SLC1A3與神經膠質源性親神經因子(GDNF)及磷酸二酯酶6B(PDE6B)相互作用。SCL1A3可能涉及於降低細胞毒性中。

KCNN4為鉀中間物/小電導鈣活化通道，子族N，成員4。在其活化之後，使細胞膜超極化且流入細胞中之鈣增加。此鉀通道定位於神經系統外之許多組織中。

在鈣化三醇處理之後約24小時上調KCNB2(鉀電壓閘控通道，Shab相關子族，成員2)。此鉀通道在調控神經傳遞質釋放、胰島素分 泌及平滑肌收縮方面較重要。

儘管在此等實驗中使用鈣化三醇，但熟習此項技術者應易於瞭解，本發明之其他維他命D化合物(諸如上文所述者)在調控標靶基因表現方面亦可展現類似活性。在某些實施例中，預期本發明之維他命D化合物展現與此等實驗中之鈣化三醇類似或相同之基因調節概況，例如上調一或多種由鈣化三醇類似上調之標靶基因的表現(mRNA及/或蛋白質)，或下調一或多種由鈣化三醇類似下調之標靶基因的表現(mRNA及/或蛋白質)。

實例3. 鑑別對鈣化三醇之表皮細胞培養反應中所涉及之關鍵蛋白質-抗體陣列

亦經由利用抗體微陣列來評估鈣化三醇刺激後之蛋白質變化，該等抗體微陣列能夠針對超過700種潛在標靶蛋白之變化進行篩選。

在此實驗中，利用涵蓋針對超過700種標靶蛋白之抗體的抗體微陣列(Panorama XP725抗體陣列，Sigma)分別評估用鈣化三醇處理約3、6或24小時之HEKa細胞中蛋白質濃度/含量之變化。簡言之，首先收集經處理之HEKa細胞，接著萃取以獲得可溶性蛋白質上清液。將自各樣品(1mg/mL)萃取之蛋白質樣品(總共約1mg)之兩個部分各用螢光染料(分別為Cy3及Cy5)標記。自蛋白質樣品移除過量染料，且將所得經標記之蛋白質樣品用於微陣列培育。

為測定較晚時間點(例如在6或24小時)相對於較早時間點(例如在3小時)之特定標靶蛋白之表現量，由不同標記物(例如經Cy3標記之3小時萃取液、經Cy5標記之6小時或24小時萃取液)標記樣品。接著混合兩個含有等量總蛋白質之經標記樣品(例如將經Cy3標記之3小時樣品分別與經Cy5標記之6小時樣品或24小時樣品混合)。用微陣列晶片(根據製造商推薦之方案)培育之後，將晶片洗滌並乾燥。接著用螢光雷射掃描器掃描微陣列以量測Cy3及Cy5染料之相對螢光強度。

若特定類型之標靶蛋白之量隨時間增加(或減少)，則微陣列將保留較多(或較少)的與較晚時間點相關之染料(例如Cy5)。舉例而言，在此實驗中，將最早時間點(例如3小時)用作基線以測定兩個較晚時間點(例如6小時相對於24小時)之相對蛋白質表現量。若在6小時至24小時之間陣列保留較多Cy5，則在該時段中標靶蛋白之表現量增加。反之，若在6小時與24小時之間所保留之Cy5減少，則標靶蛋白之表現量降低。

使用此方法之初始分析集中於展現相對表現量變化>2倍(增加或降低)之彼等標靶蛋白。總之，使用經鈣化三醇處理(24小時)之HEKa細胞的抗體陣列實驗鑑別以下對維他命鈣化三醇作出反應而使表現量顯著改變之標靶蛋白(表3-1及表3-2中)：

用相同蛋白質抗體陣列方法在24小時對經鈣化三醇處理之HEKa細胞的評估鑑別約50種顯著上調之蛋白質。此等蛋白質一般屬於四個類別：(i)轉錄及細胞週期控制(表3-3)；(ii)結構、細胞骨架及黏著蛋白(表3-4)；(iii)細胞凋亡調控蛋白(表3-5)；及(iv)神經細胞分化及阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)(表3-6)。

實例4. 鑑別對鈣化三醇之表皮細胞培養反應中所涉及之關鍵蛋白質-蛋白質組分析

用鈣化三醇處理一系列HEKa培養物，且在與鈣化三醇3接觸之後3、6及24小時收集細胞小球。接著使用諸如2-D凝膠及西方墨點分析之蛋白質組方法分析細胞小球。在下文所述之實驗中，用0.1μg/mL鈣化三醇處理HEKa細胞，且藉由2-D凝膠電泳及相關比較分析來處理3、6及24小時獲得之樣品(結果未圖示)。

在比較研究中總共進行約458個蛋白質點之分析，將對照樣品與3、6及24小時處理樣品相比較。鑑別6個顯示統計上顯著微變之點。移出此等點，且藉由胰蛋白酶消化及質譜法表徵對其蛋白質內含物進 行序列鑑別。

結果(表4-1)展示該組6個來自HEKa角質細胞樣品之點含有純的內源角蛋白，與通常作為常見污染物所觀測到的角蛋白成對比。兩種S100蛋白質以及麩胱甘肽S-轉移酶及半乳糖凝集素1經鑑別得到強烈調控。有證據顯示半乳糖凝集素1經糖基化。

兩種S100蛋白質(A9及A13)屬於蛋白質之鈣衛蛋白家族。在該家族中存在21種不同類型之此等低分子量蛋白質。此等S100蛋白質結合鈣(EF手型基元)，且各類型以細胞特異性方式且以依賴於環境因素之量表現。多種疾病與S100蛋白質含量改變相關聯(心肌病、神經退化性病症及發炎性病症及癌症)。注意，在抗體陣列結果中亦鑑別到S100蛋白質在接觸鈣化三醇後上調。

實例5. 鈣化三醇對角質細胞生長之影響

用不同濃度之鈣化三醇處理一系列HEKa培養物，且在預定生長時段之後分析HEKa細胞之生長行為。以96孔板格局進行所有實驗。各孔在約100μL培養基中含有相同量之HEKa細胞(通常在2,000-5,000個細胞/孔之間)。將鈣化三醇溶解於乙醇中以製成儲備溶液。用生長培養基以1：2連續稀釋儲備溶液，範圍覆蓋4.0μg/mL至約15.5ng/mL(9個測試濃度)。將約100μL各測試濃度之鈣化三醇添加至相應測試孔 中，得到約200微升/孔之最終體積。所測試之鈣化三醇濃度在2.0-0.008μg/mL之範圍內(例如對應於96孔板中第2行至第10行)。將第11行用作陰性對照(無鈣化三醇)。一式兩份進行所有實驗。

如圖2所示，將濃度範圍為約0.008-2.0μg/mL之鈣化三醇滴定至HEKa細胞中。最低含量之鈣化三醇在HEKa細胞中耐受性良好，且鈣化三醇似乎適度刺激HEKa細胞生長(約10%-20%)。然而，在約1.0μg/mL或1.0μg/mL以上之鈣化三醇濃度下，細胞生長受到抑制。在約6週時段內在一系列19個獨立實驗中HEKa細胞對鈣化三醇之總劑量反應一致(數據未圖示)。

實例6. 鈣化三醇對癌細胞生長之影響

不同於正常角質細胞HEKa中所觀測之情況，對於所測試之多數癌細胞株或永生化細胞株未觀測到顯著生長促進作用或生長抑制作用，該等細胞株包括SkBr-3(過度表現Her2之乳腺癌)、SKMEL-28(黑素瘤)、PaCa2(胰臟癌)、NCI-ES-0808及NIH-3T3(永生化纖維母細胞)。對於胰臟癌細胞株PaCa2，由該等癌細胞株/永生細胞株展現之一個例示性生長曲線展示於圖3中。注意，在多種鈣化三醇濃度下PaCa2之生長不受影響。

兩種測試癌細胞株MCF-7(具有p53突變之乳癌)及HepG2(肝癌)對低維他命D3濃度(0.05-0.25μg/mL)下之鈣化三醇刺激及高鈣化三醇濃度(>0.5μg/mL)下之鈣化三醇抑制作出類似反應。參見圖4。

此等數據表明，本發明維他命D化合物當施用於正常角質細胞(諸如HEKa)至某一濃度限時，能夠促進此等正常角質細胞生長，同時促進癌細胞生長。超過該濃度限，維他命D化合物實際上可抑制正常角質細胞生長。

實例7. 鈣化三醇保護HEKa細胞對抗各種化學治療藥物之作用

此實例證實，本發明之維他命D化合物可保護正常角質細胞(諸 如HEKa)對抗大多數類型之一線化學治療藥物的細胞毒性作用，極少有例外。特定言之，測試17種抗癌藥物以評估鈣化三醇對此等藥物之細胞毒性作用的影響。藥物名稱及其各別作用機制列於下表中。

在第一系列實驗中，將許多基於激酶抑制劑之藥物用於經設計以評估0.1μg/mL鈣化三醇對HEKa細胞提供保護作用之能力的檢定中。此等藥物包括：埃羅替尼(得舒緩)，一種EGFR Tyr激酶抑制劑；吉非替尼(艾瑞莎)，一種EGFR Tyr激酶抑制劑；索拉非尼，若干Tyr激酶(Raf、VEGF-R2、c-kit、PDGR-R)之抑制劑；達沙替尼，一種BCR/ABL Tyr激酶抑制劑；及星形孢菌素，一種相對非特異性之激酶抑制劑。

此等實驗中獲得之給藥曲線展示以下一般趨勢：在低藥物劑量下(與影響經歷全身傳遞之化學療法之患者皮膚的藥物劑量相同)，鈣化三醇提供一定生長刺激且保護HEKa細胞(參見圖5-9)。另外，似乎鈣化三醇對抗更具特異性之激酶抑制劑的保護作用比更具非特異性之 激酶抑制劑更加顯著。

類似地，鈣化三醇亦展現對抗低劑量之烷基化劑(諸如順鉑及卡鉑)的中等程度保護(參見圖10及圖11)。

據推測，伊立替康經由與拓撲異構酶I相互作用而抑制細胞生長。在鈣化三醇存在下亦觀測到對抗伊立替康之陽性保護作用(圖12)。

太平洋紫杉醇為有絲分裂抑制劑。存在0.1μg/mL鈣化三醇會提供一些對抗太平洋紫杉醇之保護作用(圖13)。

基於嘧啶抗代謝物之藥物(諸如5-氟尿嘧啶(5-FU))以若干方式起作用，但主要充當胸苷酸合成酶抑制劑。5-FU阻斷DNA複製所需之胸苷合成。因此，已局部使用5-氟尿嘧啶來處理光化性(日光性)角化症及一些類型之皮膚基底細胞癌。當存在0.1μg/mL鈣化三醇時，觀察到至少微量的對抗5-FU之保護作用(圖14)。

吉西他濱為去氧胞苷之2'碳上之氫原子經氟原子置換之核苷類似物。類似於氟尿嘧啶及其他嘧啶類似物，在DNA複製期間吉西他濱置換核酸(在此情況下為胞苷)之構築嵌段之一。吉西他濱用於治療各種癌瘤：非小細胞肺癌、胰臟癌、膀胱癌及乳癌。圖15展示當存在0.1μg/mL鈣化三醇時，觀察到至少微量的對抗吉西他濱之保護作用。

另一方面，鈣化三醇似乎不會提供對抗多柔比星之細胞毒性作用的顯著保護作用(圖16)。另外，對抗他莫昔芬之任何保護作用較弱(圖17)。他莫昔芬競爭性地結合於腫瘤及其他組織標靶上之雌激素受體，產生減少DNA合成且抑制雌激素作用之核複合物。

與上述資料一致，圖18中之數據顯示HEKa角質細胞由鈣化三醇刺激生長，且在HEKa細胞中觀測到一定程度的對抗5-FU之保護。令人關注的是，在三種測試癌細胞株Hep-G2、PaCa-2及SKMEL-28中，5-FU處理之ED₅₀曲線與亦具有0.1μg/mL鈣化三醇補充劑之彼等ED₅₀ 曲線並無顯著不同。注意，Hep-G2細胞受鈣化三醇處理輕微刺激，但甚至在鈣化三醇存在下其5-FU之ED₅₀曲線仍無實質性變化。

類似地，接觸以下4種測試癌細胞株：Hep-G2、MCF-7、PC-3及PaCa；2至0.1μg/mL鈣化三醇對於兩個繼代而言不會改變此等細胞對其他藥物(例如多柔比星、順鉑及埃羅替尼)之反應。

上述此等結果表明，在化學療法(例如使用5-FU)期間鈣化三醇可保護正常角質細胞(諸如HEKa)，而不會拮抗化學療法對抗癌細胞之效用。

與HEKa細胞中所觀測之情況極為相似，鈣化三醇似乎不會明顯改變多柔比星對抗諸如SkBr-3、SKMEL-28、PaCa-2、MCF-7、NCI-ES-0808、Hep-G2及NIH-3T3之癌細胞/永生細胞之細胞毒性作用(參見圖19)。

另外，亦探究商業用藥與鈣化三醇之可能協同效應。在此等實驗中，以高於細胞培育所要之最終濃度4倍之濃度起始，連續稀釋所選商業用藥。與此同時，製備0.4μg/mL鈣化三醇之儲備液，接著與經連續稀釋之藥物混合(比率1：1)。接著培育藥物/鈣化三醇混合物至少15分鐘，且添加至細胞培養基中(比率為100μL：100μL)。因此，最終鈣化三醇濃度為0.1μg/mL。

藥物處理時段通常為三天。在三天結束時，在280nm下讀取96孔板之背景OD，隨後將20μL「Substrate Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent」(Promega)添加至各孔中。使板返回37℃培育箱中，且每小時在490nm下讀取其OD直至OD達到約1.5為止。藉由扣除受質前OD讀數來計算淨OD增加。

藉由相對於對照孔(無藥物)之OD比較不同濃度下之OD來計算藥物對細胞之影響。對隨著藥物濃度而變之淨OD之結果繪圖且用以測定ED₅₀值。

HEKa細胞結果之分析指示，在鈣化三醇與包括5-FU、多柔比星、他莫昔芬、伊立替康、太平洋紫杉醇、卡鉑、星形孢菌素、長春新鹼、順鉑、埃羅替尼、吉西他濱、伊馬替尼、吉非替尼、索拉非尼及達沙替尼之多數測試藥物之間不存在相互作用。當對其他細胞測試藥物組合時，亦獲得相同結果。因此，在不欲受任何特定理論約束下，鈣化三醇與上述藥物之作用機制似乎不同。

實例8. 用鈣化三醇預處理細胞：在存在及不存在化學治療藥物下鈣化三醇之基於細胞之檢定測試

將評估細胞生存力之上述基於細胞之檢定用於實例中以評估鈣化三醇對抗所選化學治療藥物之作用的潛在保護作用。對於兩個細胞繼代，在0.1μg/mL鈣化三醇存在下可使各細胞株生長。接著利用此等預處理細胞設定基於細胞之檢定。另外，使用未處理細胞在雙份藥物/鈣化三醇濃度下建立平行實驗。此舉可並行比較在投與化學治療藥物之前長期接觸鈣化三醇之潛在作用。

在0.1μg/mL鈣化三醇存在下使5種細胞株中之每一者生長兩個細胞繼代之後，僅HEKa細胞之總體生長及形態受到顯著影響。四種癌細胞株繼續生長且其一般形態外觀未改變。然而，HEKa細胞在長期接觸鈣化三醇之後停止生長，且其形態變成在一個方向上伸長，與在鈣化三醇處理之前較多分支之外觀成對比。對於此細胞株，開始使用一批新的細胞且在鈣化三醇存在下僅接觸單一繼代，隨後在化學治療藥物存在下進行測試。

選擇三種常用化學治療藥物(多柔比星、順鉑及埃羅替尼)以評估經鈣化三醇處理之細胞。探究商業用藥與鈣化三醇之可能協同效應或保護作用。在此等實驗中，以高於細胞培育所要之最終濃度4倍之濃度起始，連續稀釋商業用藥。製備0.4μg/mL鈣化三醇之儲備液，且添加至經連續稀釋之藥物中(比率1：1)。培育藥物與鈣化三醇之混合物 至少15分鐘，且添加至細胞中(比率為100μL：100μL)。因此，最終鈣化三醇濃度為0.1μg/mL。

根據先前所述之方法進行檢定以提供一致性且允許直接比較。結果係基於活細胞總數之量測。結果(未圖示)指示，鈣化三醇預處理對細胞培養物之化學保護作用並非必需。在預處理組與同步處理組之間結果幾乎相同。因此，可將鈣化三醇之局部施用與化學療法之全身傳遞同時應用。不需要分階段施用。

實例9. 由新穎鈣化三醇調配物防範化學療法誘發之禿髮症(CIA)

禿髮症為最令人痛苦之化學療法副作用之一，對此當前尚無治療性干預。新生大鼠已證實為研究化學療法誘發之禿髮症(CIA)之極佳模型，因為毛髮生長期之毛囊型式類似於人類。

在本研究中，按劑量依賴性及時間依賴性方式，以局部調配物(40%(w/w)丙二醇，USP；及60%(w/w)脫水乙醇，200酒精度，未變性USP)傳遞開環類固醇鈣化三醇(USP級)以治療/預防CIA。

特定言之，龍-埃文斯(Long Evans)及史泊格-多利(Sprague Dawley)大鼠與幼仔購自Harlan Laboratories,Inc。根據適用動物處置規範與條例將其圈養並餵食。在實驗起始之前使幼仔適應48小時。將開環類固醇鈣化三醇調配物(上述)或媒劑對照(無鈣化三醇)每天局部施用於頭部及頸部區域上，在第5天開始，持續連續6天。使大鼠與其同窩出生幼仔及母鼠隔離6小時。隨後，用肥皂及水清潔處理區域且使幼仔返回其同窩仔中。第13天，大鼠接受依託泊苷(每天1.5mg/kg，持續3天)或環磷醯胺(CTX)(37.5mg/kg，一次)或環磷醯胺(35mg/kg，一次)與多柔比星(每天2.5mg/kg，持續3天)之組合。所有化學治療劑皆購自Sigma且以0.1mL之總體積腹膜內(i.p.)給與。在最後一次給與化學治療劑之後記錄禿髮症，持續10天。

對於大鼠移植有綠色白血病之實驗，在出生後第5天，將大鼠隨 機分成三組，每組45隻。所有大鼠接受含1×10⁵個綠色白血病細胞株MIAC51(腹膜內)之0.1mL無血清(SF)RPMI。在37℃下，於5% CO₂、100%濕度之培育箱中在補充有L-麩醯胺酸及10%胎牛血清之RPMI 1640中培養MIAC51。使細胞生長至50%匯合(1.5×10⁶/mL)，收集於50mL錐形管中，在室溫下以600g離心10分鐘且以1×10⁶/mL之濃度再懸浮於SF-RPMI中。第1組大鼠未接受進一步處理。第13天，第2組大鼠接受局部媒劑及CTX。第13天，第3組大鼠接受局部鈣化三醇調配物(0.1μg)及CTX。如上所述進行局部施用。

在出生後第23天，自所有大鼠獲取血液樣品且進行區分。處死白血病大鼠，保留無白血病之大鼠且在第31天進行二次區分，只要偵測到白血病，即藉由CO2窒息處死動物。

結果證實，在接受依託泊苷之組中觀測到全身禿髮症。相比之下，在經0.1μg鈣化三醇處理6小時之大鼠中，在所有動物中皆觀測到部分區域化保護。在接受0.3μg鈣化三醇之組中，達成整個身體保護。參見圖20A及圖20B。

在接受環磷醯胺之組中，對照大鼠變成全禿，而接受0.1μg鈣化三醇之大鼠達成與依託泊苷所觀測之情況類似之保護。同樣地，在經環磷醯胺處理之大鼠中，投與0.3μg鈣化三醇產生全身保護。參見圖21。使用其他化學療法或組合化學治療療程之類似結果展示於圖22A、圖22B、圖22C及圖23中。

在大鼠移植有綠色白血病之各別實驗中，初步結果尚未顯示局部施用鈣化三醇保護癌細胞不受環磷醯胺作用。參見圖24。

總之，用含鈣化三醇之本發明調配物預處理會防範CIA，而不會保護癌細胞。局部鈣化三醇預防CIA，以劑量依賴性方式預防單一化學療法以及組合化學療法誘發CIA。另外，局部鈣化三醇預防CIA，而不會保護癌細胞免受化學療法之細胞毒性作用。

實例10. 在接受多個化學治療療程之綠色白血病大鼠中由局部鈣化三醇防範CIA

此研究驗證在多程化學療法誘發之禿髮症的動物模型中局部鈣化三醇溶液之保護作用。研究所用之大鼠帶有MIAC51，一種藉由胃內滴注20-甲基秋蓖酮，隨後將綠色白血病細胞注射至大鼠新生仔中而研發之大鼠綠色白血病細胞株。MIAC51細胞株產生具有人類綠色白血病特徵(白血病、白血病腹水及形成綠色瘤)之惡性骨髓性白血病。參見Jimenez等人，Science 238：1278-1280(1987)。

迄今為止，尚無測試化學療法誘發之禿髮症(CIA)之有效活體外模型或非脊椎動物模型。在最常用模型中，Jimenez等人研發之新生大鼠已證實與人類直接相關(Int J Cancer 1996；65：97-103，以引用的方式併入)。隨後，研發出可藉由剪短毛髮誘導第二毛髮生長期且藉此允許測試多個化學治療過程之大鼠模型。此模型可用以測試頻繁使用之禿髮症化學治療劑，包括環磷醯胺、多柔比星、太平洋紫杉醇、依託泊苷及阿糖胞苷及其組合。

當測試用於化學療法誘發之禿髮症之防護劑時，最重要的是測定測試物是否將保護毛囊以及保護癌細胞免受化學療法作用及/或干擾療法。Jimenez等人研發之白血病新生大鼠模型提供一種同時測試維他命D化合物對白血病發生、白血病治療之任何作用、與化學治療劑之潛在相互作用及維他命D化合物對預防化學誘發之禿髮症之作用的可能性。此模型亦回答了在相同動物中測試藥劑之多個週期是否將產生多次毛囊保護之問題。另外，藉由使用著色之龍-埃文斯大鼠，研究亦可判定測試劑是否保護毛髮顏色。

鈣化三醇調配物為USP級鈣化三醇於含有USP級丙二醇(40% w/w)及無水絕對乙醇(200酒精度，60% w/w)之媒劑中的澄清無水液體。此等研究中鈣化三醇之濃度為約0.2μg/100μL(2μg/mL)。在冰上 接收測試物，且到達後即刻儲存於4-5℃下。接著將批料細分至4.5mL管中，同時維持於冰上。因為每個變數之動物組數不少於40，所以在4-5℃下將測試物之各4.5mL單元封裝於具有批號之聚丙烯試管中。將測試物之4.5mL試管保持於暗箱中且僅自冰箱取出每次實驗所需之量。以規律時間間隔檢定封裝於4.5mL試管中之測試物之樣品，以測定鈣化三醇含量。在進行實驗時，在處理大鼠時，將試管保持於冰上。

媒劑包含USP級丙二醇(40% w/w)及USP級無水且未變性之絕對乙醇(200酒精度，60% w/w)。在進行實驗時，完全如同測試物之處理法來處理對照媒劑。

測試物及媒劑本身均進行測試。各測試組由40隻動物組成，其對於此研究而言具統計顯著性。此數目包括模型損耗且考慮到任何可能減少動物數目之不測事件。當所有動物之年齡為5天時，用MIAC51注射。測試五(5)種化學治療療程：環磷醯胺、環磷醯胺/多柔比星、環磷醯胺/多柔比星/阿糖胞苷、環磷醯胺/太平洋紫杉醇/依託泊苷及多柔比星/太平洋紫杉醇/依託泊苷。測試組為無化學治療劑、單獨化學治療劑、化學治療劑+媒劑、化學治療劑+測試物=每種化學治療療程160隻動物。因此，所用動物之最終估計數目如下：5種組合化學治療療程×160隻動物=800隻幼仔/大鼠。對於使用第二毛髮生長期成年大鼠模型之實驗，僅使用無癌症之動物(例如曾經接受過化學治療劑而存活之動物)，但顯現早期白血病徵象之動物則接受安樂死。

培養謝氏綠色白血病(Shay's Chloroleukemia)MIAC51細胞株：如先前所述(Science 1987；238：1278-80)，在37℃下於濕度100%之5% CO₂培育箱中培養MIAC51。使細胞在有補充有L-麩醯胺酸及10%胎牛血清(Gibco Invitrogen,Carlsbad,CA)之RPMI 1640培養基(Gibco Invitrogen,Carlsbad,CA)之非組織培養物處理之燒瓶(Falcon)中生 長。在將細胞注射至動物中之前，使其生長至50%匯合且收集於錐形管中。接著在室溫下使細胞以600g離心10分鐘，且以1×10⁶之濃度再懸浮於不含胎牛血清之RPMI 1640中。接著在無菌條件下將細胞懸浮液轉移至29標準尺寸(gauge，ga)之1/2cc胰島素注射器中。

注射MIAC51：在注射MIAC51時所有幼仔年齡皆為5天，且進行人工束縛。輕輕拉伸右腿且用酒精棉簽清潔該區域。接著腹膜內注射MIAC51。注射器中之針、通道及槽為無菌的且每次注射使用新注射器。通常在第21天至第33天觀測到早期白血病徵象出現。因此，在第23天及第31天進行血液塗片。第31天僅將無癌症之動物剃毛，而使其餘動物安樂死。

在新生大鼠中在第一毛髮生長期投與測試物及對照物：向各同窩仔之頭部及頸部約2cm²之區域局部投與媒劑或測試物。對於年齡為5天及6天之大鼠，考慮到其體型較小，將100μL以4個25μL等分試樣之形式施用4次。用經校準之微量吸液管使用200μL無菌針尖施用測試物或媒劑。一旦測試物或媒劑處於頭部表面上，即用戴手套之手指用力擦拭直至完全吸收。隨後即刻將另一等分試樣施用於頭部且重複該過程直至施用100μL總測試物或媒劑為止。對於年齡為7天、8天、9天及10天之動物，施用50μL等分試樣兩次。在年齡較大之動物中，可以一次劑量施用100μL。將測試物施用於頭部及頸部，且戴有抗溶劑之腈手套的右手食指用力擦拭10秒。此施用療程之基本原理為在不同年齡，飽和率可能不同且測試物或媒劑之傳遞亦可能不同。一旦溶液已完全穿透皮膚，即在籠中用特別設計之隔離區室使幼仔保持隔離6小時。接著用溫和的實驗室手用肥皂(Soft-Cide EC,VWR international)洗滌幼仔且用紙巾小心地弄乾。

在新生大鼠中在第一毛髮生長期投與化學治療劑：40隻幼仔接受各化學治療療程，40隻接受各化學治療療程及測試物，且40隻接受 各化學治療療程及媒劑。作為對照，40隻動物不接受化學治療劑。獲得各同窩仔之平均重量且用以制定化學治療劑之適合濃度。根據動物重量使用29ga. 1/2cc胰島素注射器腹膜內注射體積約100μL之化學治療劑。注射時，輕輕拉伸各幼仔之右腿且用酒精棉簽清潔該區域。

在成年大鼠之第二毛髮生長期投與測試物及對照物：將第31天根據血液塗片之血液學分析已證實無癌症之存活者進行人工束縛且在頭部及頸部區域(2-3cm²)剃毛。9天後，當大鼠年齡為40天(包括40天)至45天(包括45天)時，將媒劑或測試物施用於頭部及頸部區域。將100μL之量以一次劑量施用於頭部及頸部，且用戴有抗溶劑之腈手套的右手食指用力擦拭10秒。一旦溶液已完全穿透皮膚，即在籠中使單個大鼠保持隔離。接著用溫和的實驗室手用肥皂(Soft-Cide EC,VWR international)洗滌大鼠且用紙巾小心地弄乾。

向第二毛髮生長期成年大鼠投與化學治療劑：各組接受5種不同化學治療療程之一，對於接受組合阿糖胞苷者，在第47天開始且在第53天結束。獲得平均重量且用以制定化學治療劑之適合濃度。根據動物重量使用29ga. 1/2cc胰島素注射器腹膜內注射體積約100μL之化學治療劑。對於投與化學治療劑，在不使用麻醉下對大鼠進行人工束縛。用酒精棉簽清潔注射區域。

投藥途徑：真皮施用測試物及媒劑。腹膜內注射化學治療劑。

投藥頻率與持續時間及劑量與體積：對於第一毛髮生長週期與第二毛髮生長週期，每天投與測試物及媒劑，持續6天。測試物含有於丙二醇/乙醇中之濃度為2μg/mL之鈣化三醇，且媒劑僅含有丙二醇/乙醇媒劑。基於重量，腹膜內給與體積約100μL之化學治療劑。

禿髮症之目測及分級：使用以下量表對全禿(頭部及頸部)或全身禿進行分級：0=無禿髮症；1+=0-25%禿髮症；2+=25-50%禿髮症；3+=50-75%禿髮症；4+=75-100%禿髮症。每天使用目測量表對禿髮症 進行分級，同時進行常規籠觀測。另外，一旦全部同窩仔或成年大鼠之毛髮已脫落，此量表即補充照相文件。

實例11. 真皮吸收研究：將鈣化三醇溶液局部施用於Gottingen Minipigs ^® 且定量離體豬皮膚中之鈣化三醇

豬頻繁用於涉及真皮傳遞途徑之毒性研究中，因為豬皮極其類似於人類。因此，此研究中使用豬以在真皮投藥7天之後評估Gottingen minipigs^®中鈣化三醇局部調配物之真皮耐受性及真皮穿透。

向具有三隻雄性及三隻雌性Gottingen minipigs^®之一個處理組的五個各別投藥部位處經真皮投與劑量濃度為0(安慰劑)、1、3、10及30μg/mL之測試物或安慰劑。向具有一隻雄性小種豬之另一處理組的兩個各別投藥部位處分別經真皮投與劑量濃度為0(安慰劑)及100μg/mL之測試物或安慰劑。在研究期間，向兩組之每一施用部位每天兩次(間隔約6小時)投與施用率為4mg/cm²(等效於6cm×6cm測試區域中之144mg，或含有多種濃度之活性成份、及媒劑之166μL測試溶液)之安慰劑或測試物，持續7天。

每天兩次觀測所有動物之發病率、死亡率、損傷及食物與水之獲取量。每天進行臨床觀測。測試前、及給藥前每天進行皮膚反應評估。在測試前及終點(第7天)量測體重並記錄。測試前進行身體檢查。在研究結束時，進行屍檢，且收集經處理及未經處理之皮膚部分並保存。進行各皮膚部位以及處理部位附近之未處理皮膚部位的微觀檢查。

結果顯示向Gottingen minipigs^®經真皮投與濃度為0、1、3、10、30及100μg/mL之鈣化三醇局部調配物耐受性良好。在存活率、臨床發現、真皮刺激、體重、任一處理部位處皮膚之宏觀或微觀檢查方面未觀察到處理效果(數據未圖示)。組織分佈研究之數據指示可在多數 角質層及表皮樣品之其他部分中量測到鈣化三醇，而在真皮樣品中量測不到(唯一例外為100μg/mL劑量施用於單一雄性小種豬)。在此組之實驗中，雄性之鈣化三醇組織含量似乎大於雌性。在表皮中觀測到最清晰的施用劑量與組織含量之關係，其中自3μg/mL至100μg/mL之漸增鈣化三醇濃度下接近線性增加。

特定言之，使用預調配濃度為1、3、10、30及100μg/g之安慰劑(丙二醇(USP)與無水乙醇(未變性，200酒精度

-U.S.，USP)之40/60混合物(w/w))及鈣化三醇局部調配物。投與純測試物(未經稀釋)。針對每天使用一次之各所需濃度分配安慰劑及測試物的調配物且儲存於室溫下。

自Marshall BioResources(North Rose,New York)接收總共三隻雄性及三隻雌性未經實驗處理之Gottingen minipigs^®(年齡約4個月至5個月)。稍後自儲備群落轉移另一隻雄性(接收時年齡約4.5個月)。使用簡單隨機化程序，將四隻雄性及三隻雌性動物(分別隨機稱重11.75至15.55kg及14.50至16.65kg)分為安慰劑組及處理組。

在研究期間每天兩次(間隔約6小時)經真皮投與安慰劑及測試物，持續7天。劑量濃度為0、1、3、10、30及100μg/mL，且以4mg/cm²之施用率投與(等效於144mg或166μL測試溶液)。在開始投藥(對於第1組及第2組分別為第4天及第5天)之前，使用電動剪毛機自施用部位剪短毛髮。小心謹慎以免磨損皮膚。將各動物之背面分成5個施用部位(第1組)及2個施用部位(第2組)。各施用部位為約6×6cm，各部位之間間隔至少2cm。用玻璃攪拌棒或適當儀器將安慰劑及測試物調配物均勻施用於指定施用部位。在給藥之前，使用經自來水濕潤之柔軟紙巾(亦即WyPall®)輕輕移除先前給藥之殘餘測試物。

在研究結束時，由腹部中線切口反映皮膚，且收集經處理及未經處理之皮膚部分並保存。首先將各6×6cm給藥部位之部分用溫和的 肥皂與水之混合物(例如1%象牙皂水溶液或等效物)充分進行表面洗滌以移除任何殘餘表面測試調配物。接著用酒精擦淨經洗滌之皮膚部分，且向下切至脂肪層且包括脂肪層。若待切區域大於給藥區域，則用不褪色墨水劃分給藥區域以描繪出給藥之皮膚區域。將1.5cm×1.5cm部分放平，裹於兩層賽綸包裹(Saran wrap)(或等效物)中且急驟冷凍於液氮中。將樣品儲存於-70℃下且在乾冰上經由隔夜快遞運輸以供分析。適當時鑑別各皮膚部分(例如動物識別、研究編號、日期等)。

到達分析場所之後，將皮膚部分置於水密性塑膠袋中且藉由浸於溫水(約30℃-35℃)中而解凍。用蒸餾去離子水輕輕沖洗各皮膚部分以移除任何殘餘測試物及血液。藉由手動解剖刀切除來移除所有皮下組織(例如脂肪)。在給藥區域之中心區內，劃分四個個別1cm²圓圈(平行實驗)，隨後鑑別各部位且記錄實際面積。接著使用1cm²衝壓機自皮膚薄片切除平行實驗之測試部位。稱重皮膚部分且記錄重量。對各平行實驗之劃分區域進行膠帶剝離(Transpore^TM，3M)足夠次數(約10-約20次)直至區域表面約10%-25%展示反光。此處理移除角質層及任何殘餘表面劑量。

在膠帶剝離之後，藉由熱暴露於60℃約1-1.5分鐘將皮膚分成表皮(無角質層，下文簡稱為「表皮」)及真皮。接著使用精細尖鉗子或解剖刀梳理開皮膚層。稱重表皮及真皮且記錄重量。

對於萃取，用1mL絕對乙醇(Sigma-Aldrich，USP/NF級)萃取所有皮膚樣品。用5mL乙腈(EMD，HPLC級)萃取膠帶剝離物。在室溫下進行所有萃取約24小時。藉由真空離心乾燥500μL量之膠帶剝離物萃取液且用100μL絕對乙腈復原。亦乾燥表皮萃取液且用100μL 80：20乙醇：水復原。

藉由逆相高效液相層析(HPLC)用紫外線及質譜分析偵測器定量 鈣化三醇。探測下限據估計為0.4ng/mL。

自角質層(膠帶剝離物)、表皮及真皮定量鈣化三醇之結果概述於表11-1至表11-4中。圖25A及圖25B分別說明角質層及表皮中之含量，且圖26僅說明雄性動物中之表皮含量。提供兩個不同單位之角質層數據(ng/cm²)，反映隨樣品面積而變的經膠帶剝離之樣品中所回收之鈣化三醇之量，及每毫克組織所估計之微克數。然而，以μg/mg報導之濃度係由層分離之前的差異總樣品重量減去彼樣品之表皮及真皮重量來確定(而非由實際重量確定，因為其黏著於膠帶剝離物)。使用自樣品量測之量除以皮膚層之實際濕重而以組織濃度(ng/mg)報導表皮及真皮樣品。

數據指示可在多數角質層及表皮樣品中量測到鈣化三醇，而在真皮樣品中量測不到(唯一例外為100μg/mL劑量施用於單一雄性小種豬)。此與上述實例1中所述之法蘭士人類皮膚有限劑量模型所獲得之結果一致。

在所評估之組織樣品中，雄性小種豬之鈣化三醇組織含量似乎大於雌性小種豬。

在角質層中觀測到鈣化三醇之最高濃度。儘管角質層含量為估計值，但其較高濃度可反映在皮膚毛孔深處存在鈣化三醇，其不會藉由表面洗滌過程移除，或可歸因於鈣化三醇在角質層之極具親脂性基質中之可溶性。

然而，在表皮中觀測到最清晰的施用劑量與組織含量之關係，其中自3μg/mL至100μg/mL之鈣化三醇施用濃度下接近線性增加。

實例12. 接受多程化學療法之綠色白血病大鼠中之局部溶液研究

龍-埃文斯大鼠(Harlan Laboratories,Inc)到達後年齡為3天。在到達後及每天使用電子秤(American Scientific Products TL 410s)獲得動物重量直至實驗結束。在實驗開始之前將大鼠圈養兩天。接著將動物隨機分成四組。所有大鼠如下所述接受MIAC51。

￭第1組(n=27)未接受進一步處理。

￭第2組(n=40)僅接受化學治療劑。

￭第3組(n=40)如下所述接受化學治療劑及局部媒劑。

￭第4組(n=40)接受化學治療劑及局部鈣化三醇。

出生後第6天開始處理。將0.1mL量之局部鈣化三醇局部施用於大鼠之頭部及頸部之上。對於第一毛髮生長週期，第6天及第7天，施用體積為25μl之媒劑或鈣化三醇4次以避免飽和。第8天、第9天、第10天及第11天，施用50μl體積兩次。對於第二毛髮生長週期，第40天至第45天每天用0.1mL媒劑或鈣化三醇處理大鼠。每次施用需要用帶有腈檢查手套之右手食指擦拭2cm²之區域10秒。處理完成之後，個別分離各大鼠6小時。隨後用溫和的手用肥皂(Soft CIDE-EC，來自VWR International)及蒸餾水洗滌各大鼠之頭部及背部。接著將幼仔放回其母鼠左右且返回動物室中。對於第二毛髮生長週期，將成年大鼠放回其籠中同窩出生幼仔左右且返回動物室中。

在出生後第5天，所有大鼠腹膜內接受含1×10⁵個MIAC51之0.1ml無血清(SF)RPMI。在37℃下，於5% CO₂、100%濕度培育箱中在補充有L-麩醯胺酸及10%胎牛血清之RPMI 1640中培養MIAC51。使細胞生長至50%匯合(1.5×10⁶/mL)，收集於50mL錐形管中，在室溫下以600g離心10分鐘且在注射之前以1×10⁶/ml之濃度再懸浮於SF-RPMI中。

在出生後第23天，自所有大鼠獲取血液樣品且進行區分。處死白血病大鼠，而將無白血病之大鼠用於進一步實驗。第31天進行二次區分，且處死白血病動物。在投與第二組媒劑或鈣化三醇處理之前將存活動物之2cm²區域剃毛，且15天後給與第二化學治療過程。在第二毛髮生長期與第一毛髮生長期中，在化學治療劑處理之後10天記錄禿髮症。

由以下量表確定各大鼠之禿髮症程度：0=無禿髮症

1+=0-25%禿髮症

2+=25-50%禿髮症

3+=50-75%禿髮症

4+=75-100%禿髮症

實驗化合物

用媒劑(40重量%丙二醇及60重量%無水200酒精度乙醇)稀釋2.3μg/g鈣化三醇調配物至最終濃度為2μg/ml。將其細分於1mL小瓶中且保存於4℃下之冰箱中。對於各實驗，在實驗程序中取出一個含2.3μg/g鈣化三醇及媒劑之小瓶且置於冰上。處理不用之製劑。

A. 單獨環磷醯胺 投與化學治療劑

幼年大鼠： 第13天，所有大鼠使用½cc胰島素注射器29G 1/2"(B-D)腹膜內接受含37.5mg/kg環磷醯胺(CTX)(Sigma Aldrich，批號068k1131)且總體積為0.1mL之H₂O/甘露糖醇混合物。

成年大鼠： 對於第二化學治療過程，使用½cc胰島素注射器29G 1/2"(B-D)將含150mg/kg環磷醯胺且總體積為0.1mL之H₂O/甘露糖醇混合物腹膜內投與年齡47天之經麻醉(50mg/kg氯胺酮/5mg/kg甲苯噻嗪)大鼠。

結果見表12-1及表12-2。特定言之，在第一輪化學治療(表12-1及圖27)之後，接受單獨環磷醯胺或環磷醯胺與媒劑之組合的所有大鼠皆患有嚴重禿髮症(+4)。相比之下，接受環磷醯胺與鈣化三醇之組合的所有大鼠不會展現任何禿髮症徵象，與對照組類似。如表12-2中所示，在第二輪化學治療之後獲得類似結果(亦參見圖28)。

此外，此實驗指示，接受鈣化三醇局部調配物之大鼠的存活率實質上與接受單獨化學治療劑或與媒劑之組合的彼等大鼠類似。如表12-3中所示，經環磷醯胺及鈣化三醇局部調配物處理之彼等動物之存活率(25%)與經單獨環磷醯胺處理之彼等大鼠(20%)及經環磷醯胺及媒劑處理之彼等大鼠(23%)類似。

總之，在環磷醯胺組中，鈣化三醇在兩個週期中提供對CIA之100%防護且不會干擾治癒率，該治癒率在20-25%之範圍內。

B. 環磷醯胺及多柔比星 投與化學治療劑

幼年大鼠：第13天，所有大鼠使用½cc胰島素注射器29G 1/2"(B-D)腹膜內接受含37.5mg/kg環磷醯胺(CTX)(Sigma Aldrich，批號068k1131)且總體積為0.1mL之H₂O/甘露糖醇混合物。第13天、第14天及第15天，大鼠腹膜內接受含2.5mg/kg鹽酸多柔比星(Sigma Aldrich，批號038k1349)(ADM)之0.1ml蒸餾水。

成年大鼠：對於第二化學治療過程，第47天，使用1/2cc胰島素注射器29G 1/2"(B-D)將含150mg/kg環磷醯胺且總體積為0.1mL之H₂O/甘露糖醇混合物腹膜內投與經麻醉大鼠(50mg/kg氯胺酮/5mg/kg甲苯噻嗪)。對於第二化學治療過程，如上所述大鼠在第47至49天接受20mg/kg ADM。

結果見表12-4及表12-5。特定言之，在第一輪化學治療(表12-4及圖29)之後，接受單獨環磷醯胺及多柔比星或與媒劑之組合的所有大鼠皆患有嚴重禿髮症(+4)。相比之下，接受環磷醯胺及多柔比星與鈣化三醇之組合的所有大鼠不會展現任何禿髮症徵象，與對照組類似。如表12-5中所示，在第二輪化學治療之後獲得類似結果(亦參見圖30)。

此外，此實驗指示，接受鈣化三醇局部調配物之大鼠的存活率實質上與接受單獨化學治療劑或與媒劑之組合的彼等大鼠類似。如表12-6中所示，經環磷醯胺及多柔比星與鈣化三醇局部調配物之組合處理之彼等動物的存活率(50%)與經單獨化學治療劑處理之彼等大鼠(53%)及經化學治療劑及媒劑處理之彼等大鼠(55%)類似。

總之，在環磷醯胺及多柔比星組中，鈣化三醇在兩個週期中提供對CIA之100%防護且不會干擾治癒率，該治癒率在50-55%之範圍內。

C. 環磷醯胺，多柔比星及阿糖胞苷 投與化學治療劑

幼年大鼠：第13天，所有大鼠使用½cc胰島素注射器29G 1/2"(B-D)腹膜內接受含30mg/kg環磷醯胺(CTX)(Sigma Aldrich，批號068k1131)且總體積為0.1mL之H₂O/甘露糖醇混合物。第13天、第14 天及第15天，大鼠腹膜內接受含2.0mg/kg鹽酸多柔比星(Sigma Aldrich，批號038k1349)(ADM)之0.1ml蒸餾水，且第13天-第19天，大鼠接受50mg/kg阿糖胞苷。

成年大鼠：對於第二化學治療過程，向經麻醉大鼠(50mg/kg氯胺酮/5mg/kg甲苯噻嗪)投與100mg/kg環磷醯胺，持續一天；投與20mg/kg多柔比星，持續三天；且投與100mg/kg阿糖胞苷，持續七天。

結果見表12-7及表12-8。特定言之，在第一輪化學治療(表12-7及圖31)之後，接受單獨環磷醯胺、多柔比星及阿糖胞苷或環磷醯胺、多柔比星及阿糖胞苷與媒劑之組合的所有大鼠皆患有嚴重禿髮症(+4)。相比之下，接受環磷醯胺、多柔比星及阿糖胞苷與鈣化三醇之組合的所有大鼠不會展現任何禿髮症徵象，與對照組類似。如表12-8中所示，在第二輪化學治療之後獲得類似結果(參見圖32)。

此外，此實驗指示，接受鈣化三醇局部調配物之大鼠的存活率 實質上與接受單獨化學治療劑或與媒劑之組合的彼等大鼠類似。如表12-9中所示，經環磷醯胺、多柔比星及阿糖胞苷與鈣化三醇局部調配物之組合處理之彼等動物的存活率(78%)與經單獨化學治療劑處理之彼等大鼠(80%)及經化學治療劑及媒劑處理之彼等大鼠(75%)類似。

總之，在環磷醯胺、多柔比星及阿糖胞苷組中，鈣化三醇在兩個週期中提供對CIA之100%防護且不會干擾治癒率，該治癒率在75-80%之範圍內。

D. 環磷醯胺、太平洋紫杉醇及依託泊苷 投與化學治療劑

幼年大鼠：在第13天，所有大鼠使用½cc胰島素注射器29G 1/2"(B-D)腹膜內接受含37.5mg/kg環磷醯胺(CTX)(Sigma Aldrich，批號068k1131)且總體積為0.1mL之H₂O/甘露糖醇混合物。第11天至第13天，大鼠同時接受含2.5mg/kg太平洋紫杉醇(紫杉醇)之0.1mL二甲亞碸(Sigma Aldrich，批號078K1428)及用特定溶劑(參見標準作業程序)及HBSS稀釋之1.5mg/kg依託泊苷(VP-16)(Sigma Aldrich，批號047K1162)。

成年大鼠：對於第二化學治療過程，第47天，使用½cc胰島素注射器29G 1/2"(B-D)將含150mg/kg環磷醯胺且總體積為0.1mL之H₂O/ 甘露糖醇混合物投與經麻醉大鼠(50mg/kg氯胺酮/5mg/kg甲苯噻嗪)。對於第二化學治療過程，如上所述，大鼠在第45天至第48天接受10mg/kg紫杉醇及15mg/kg VP-16。

結果見表12-10及表12-11。特定言之，在第一輪化學治療(表12-10及圖33)之後，接受單獨環磷醯胺、太平洋紫杉醇及依託泊苷或環磷醯胺、太平洋紫杉醇及依託泊苷與媒劑之組合的所有大鼠皆患有嚴重禿髮症(+4)。相比之下，接受環磷醯胺、太平洋紫杉醇及依託泊苷與鈣化三醇之組合的所有大鼠不會展現任何禿髮症徵象，與對照組類似。如表12-11中所示，在第二輪化學治療之後獲得類似結果(亦參見圖34)。

此外，此實驗指示，接受鈣化三醇局部調配物之大鼠的存活率實質上與接受單獨化學治療劑或與媒劑之組合的彼等大鼠類似。如表12-12中所示，經環磷醯胺、太平洋紫杉醇及依託泊苷與鈣化三醇局部調配物之組合處理之彼等動物的存活率(83%)與經單獨化學治療劑處理之彼等大鼠(83%)及經化學治療劑及媒劑處理之彼等大鼠(78%)類 似。

總之，在環磷醯胺、太平洋紫杉醇及依託泊苷組中，鈣化三醇在兩個週期中提供對CIA之100%防護且不會干擾治癒率，該治癒率在78-83%之範圍內。

E. 多柔比星、太平洋紫杉醇及依託泊苷 投與化學治療劑

幼年大鼠：第13天至第15天，所有大鼠使用½cc胰島素注射器29G 1/2"(B-D)腹膜內接受含2.5mg/kg鹽酸多柔比星(Sigma Aldrich，批號038k1349)(ADM)之0.1ml蒸餾水。同時，大鼠接受2.5mg/kg太平洋紫杉醇(紫杉醇)(Sigma Aldrich，批號078k1428)及1.5mg/kg依託泊苷(VP-16)(Sigma Aldrich，批號047k1162)。

成年大鼠：對於第二化學治療過程，第47天至第49天，使用½cc胰島素注射器29G 1/2"(B-D)以0.1mL之總體積對經麻醉大鼠(50mg/kg氯胺酮/5mg/kg甲苯噻嗪)開始上述化學治療。第二過程之劑量如下：20mg/kg ADM、10mg/kg紫杉醇及15mg/kg VP-16。

結果見表12-12及表12-14。特定言之，在第一輪化學治療(表12-13及圖35)之後，接受單獨多柔比星、太平洋紫杉醇及依託泊苷或多柔比星、太平洋紫杉醇及依託泊苷與媒劑之組合的所有大鼠皆患有嚴重禿髮症(+4)。相比之下，接受多柔比星、太平洋紫杉醇及依託泊苷 與鈣化三醇之組合的所有大鼠不會展現任何禿髮症徵象，與對照組類似。如表12-14中所示，在第二輪化學治療之後獲得類似結果(亦參見圖36)。

此外，此實驗指示，接受鈣化三醇局部調配物之大鼠的存活率實質上與接受單獨化學治療劑或與媒劑之組合的彼等大鼠類似。如表12-15中所示，經多柔比星、太平洋紫杉醇及依託泊苷與鈣化三醇局部調配物之組合處理之彼等動物的存活率(80%)與經單獨化學治療劑處理之彼等大鼠(80%)及經化學治療劑及媒劑處理之彼等大鼠(83%)類似。

總之，在多柔比星、太平洋紫杉醇及依託泊苷組中，鈣化三醇在兩個週期中提供對CIA之100%防護且不會干擾治癒率，該治癒率在80-83%之範圍內。

實例13. Gottingen Minipigs ^® 中局部鈣化三醇之4週真皮毒性研究

對照、媒劑及測試物製備： 新鮮對照物(0.9%注射用氯化鈉，USP)經分配以用於每週研究，且冷藏儲存。將媒劑丙二醇(USP)與乙醇(未變性，無水，200酒精度USP)之40/60混合物(以重量計，w/w)及含有鈣化三醇(USP，比重為0.875)之測試物按原樣使用且不對純度進行調整。接受濃度為5.07、10.31及55.34μg/mL之測試物。投與純測試物(未經稀釋)。媒劑及測試物經分配以用於每週研究，且冷藏儲存。必要時，在研究過程中按需要分配其他測試物質。

投藥： 在投藥之前，剪短動物背部之毛髮。對照動物具有兩個測試部位；部位1經媒劑處理且部位2經鹽水處理。各部位為450cm²，由脊柱沿兩側分開且在拐角用不褪色標記作標記。將對照組之兩個測試部位均勻分開。視需要反覆剪短毛髮。小心謹慎以免磨損皮膚。在研究期間，每天兩次(間隔約6小時)經真皮投與對照物、媒劑及測試物，持續4週(連續29天)。用玻璃攪拌棒或適當儀器將調配物均勻施用於施用部位。在下一次給藥之前用經自來水濕潤之Wypall輕輕移除任何殘餘測試物質。必要時，用清潔的乾Wypall將部位弄乾。投與所有動物之劑量為1800mg適當調配物。劑量濃度為5.07、10.31及55.34μg/mL且以2.1mL之劑量體積投與。以與處理組相同之方式向對照組投與對照物及媒劑。對照動物之給藥體積為1.0mL媒劑及0.9mL鹽水。由於所觀測之臨床徵象之嚴重度，故在第23天不向所有動物給與55.34μg/mL。第24天對所有動物恢復給藥。

結果： 進行此研究以評估當經由真皮施用每天投與兩次持續4週時，鈣化三醇局部溶液之潛在亞慢性毒性。以5.07、10.31及55.34 μg/mL之各別劑量濃度將鈣化三醇局部溶液投與三個具有四隻Gottingen Minipig^®動物/性別/組之處理組。另一個具有四隻動物/性別之組充當對照且接受媒劑丙二醇(USP)與乙醇(未變性，無水，200酒精度，USP)之40/60混合物(以重量計，w/w))及對照物0.9%注射用氯化鈉(USP)。將鈣化三醇局部溶液或媒劑以4mg/cm²之劑量體積經由真皮施用投與所有組之450cm²測試部位，每天兩次，連續29天。

每天兩次觀測所有動物之發病率、死亡率、損傷及食物與水之獲取量。每週進行臨床觀測。每週量測並記錄體重。在第1週期間在每次給藥之後，接著在第2週至第4週期間每週兩次(在第二次給藥之後)針對施用部位之變化進行真皮刺激評分。測試前進行檢眼鏡檢查，且在最終屍檢之前對所有存活動物進行檢眼鏡檢查。測試前進行身體檢查。測試前、給藥前及在第1天第一次給藥之後1至2小時及在最後一週給藥期間進行心電圖檢查。在測試前及在最終屍檢之前自所有動物收集用於臨床病理學評估之血液及尿液樣品。第1天及第27天在指定時間點自所有存活動物收集用於測定測試物之血漿濃度的血液樣品。在測試物種中由濃度-時間數據測定測試物之毒物動力學(TK)參數。在研究結束時，進行屍檢，記錄器官重量，且用顯微鏡檢查所選組織。

在研究第28天，處死一隻處於55.34μg/mL濃度下瀕死之雄性動物。在安樂死之前，觀測到此動物之活動減少、食慾不振及顫抖。認為此動物之發病原因為接近於致死含量之高鈣血含量。在研究第30天，所有剩餘小種豬存活至其預定終點。在研究第3週及第4週期間，在處於55.34μg/mL濃度下之多數小種豬中觀測到活動減少、食慾不振、嘔吐及顫抖。在研究最後一週或兩週期間，在處於55.34μg/mL濃度下之雄性及雌性動物中觀測到適度刺激。處於5.07及10.31μg/mL下之經處理雄性及雌性動物之平均體重及體重增加與對照相當。在研 究最後兩週期間，處於55.34μg/mL濃度下之所有雄性及雌性動物之體重顯著下降，且在此時段中雄性及雌性動物之平均體重顯著降低。

在測試前及最終檢眼鏡檢查時，在任一動物中未觀測到檢眼鏡異常。鈣化三醇局部溶液不會產生定性心電圖異常，但在最終給藥前及給藥後時間間隔下存在組平均心率適度增加。在研究期間，此等小種豬中此心率增加無疑與鈣含量顯著增加相關。鈣化三醇局部溶液對定量心電圖參數無其他劑量相關作用。在最終評估時，在雄性或雌性動物中未觀測到鈣化三醇局部溶液相關之血液學、凝聚或尿分析變化。在55.34μg/mL濃度下觀察到一些臨床化學變化，最顯著的是觀測到接近致死含量之高鈣含量。觀察到的其他變化為較低氯化物值及較高膽固醇、葡萄糖、脲氮及三酸甘油酯值。

鈣化三醇局部溶液相關之宏觀病理學發現限於一隻處於55.34μg/mL濃度下之雌性動物的由輕微不規則表面組成之胃黏膜。在處於55.34μg/mL濃度下之兩種性別中均觀察到與對照相比腎重量之絕對及相對增加及胸腺重量之降低。鈣化三醇局部溶液直接相關之微觀發現存在於骨、腎臟、心臟、經處理皮膚、胸腺及甲狀腺中。另外，鈣化三醇局部溶液直接相關之發現包括多中心血管變化及多中心黏膜礦化。測試物間接相關之微觀發現存在於胰臟中。此等微觀變化存在於兩種性別中且限於以55.34μg/mL濃度給藥之動物。

股骨、胸骨及肋骨之微觀變化限於骨幹皮層骨及骨腔。其特徵在於骨營養不良及嗜鹼基質之沈積。腎臟微觀觀測結果之特徵在於礦化、管狀退化/再生及亞急性炎症。心肌之微觀觀測結果為肌纖維礦化、亞急性炎症及血管變化。另外，一隻雄性動物及一隻雌性動物具有心內膜礦化。在胃黏膜、肺、喉、氣管、前列腺、唾液頜下腺內及膀胱內觀測到降序式多中心黏膜/上皮礦化。鈣化三醇局部溶液相關之血管變化普遍存在且主要影響小型至中型血管。其主要在心臟及骨 腔內觀測到且偶發於不同器官/系統中。經處理皮膚之微觀變化的特徵在於表皮增生及過度角化以及表觀真皮內之維管周圍混合型細胞炎症。胸腺、甲狀腺及胰臟之微觀變化的特徵分別在於淋巴消耗、毛囊細胞肥大與增生及單細胞壞死。

以此研究之結果為基礎，基於55.34μg/mL濃度下所觀察之臨床化學及微觀變化，認為無明顯不良作用含量(no-observed-adverse-effect-level，NOAEL)為10.31μg/mL。

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本文中所引用之所有參考文獻皆以引用的方式併入。

Claims (42)

1. 一種包含治療有效量之維他命D化合物之醫藥組合物於製備用於預防或治療個體之禿髮症之藥劑的用途，其中該藥劑係局部投與至該個體，該維他命D化合物係經調配以傳遞至表皮，而實質上避免真皮傳遞。
2. 如請求項1之用途，其中該醫藥組合物包含約40%(w/w)丙二醇及約60%(w/w)無水絕對乙醇(200酒精度，U.S.)；或約30%(w/w)丙二醇、約10%(w/w)乙氧基二乙二醇或二乙二醇單乙醚(transcutol)及約60%(w/w)無水絕對乙醇(200酒精度，U.S.)。
3. 如請求項1之用途，其中該維他命D化合物係由式(I)表示： 其中：a及b各獨立地為單鍵或雙鍵；當a為雙鍵時，X為-CH₂；或當a為單鍵時，X為氫或經羥基取代之烷基；R¹為氫、羥基、烷氧基、三烷基矽烷基或烷基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；R²為氫、羥基、-O-三烷基矽烷基、或烷基、烷氧基或烯基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；當b為雙鍵時，R³不存在；或當b為單鍵時，R³為氫、羥基或 烷基，或R³及R¹與其所連接之碳原子可連接形成5至7員碳環；當b為雙鍵時，R⁴不存在；或當b為單鍵時，R⁴為氫、鹵素或羥基；當a為雙鍵時，R⁵不存在；或當a為單鍵時，R⁵為氫、鹵素或羥基；R⁶為烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環基、烷基-O-烷基、烷基-CO₂-烷基，視情況經1至5個羥基、側氧基、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR'R"部分基團取代；R⁷為烷基，視情況經1至3個羥基、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR'R"部分基團取代；及R'及R"各獨立地為氫、經基、鹵素、烷基或烷氧基，及其醫藥學上可接受之鹽。
4. 如請求項1之用途，其中該維他命D化合物係由式(II)表示： 其中：c為單鍵或雙鍵；R^1a為氫、三烷基矽烷基或烷基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；R^2a為氫、羥基、-O-三烷基矽烷基或烷基、烷氧基或烯基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代； 當c為雙鍵時，R^3a、R^4a不存在；或當c為單鍵時，R^3a、R^4a各獨立地為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，視情況經1至3個羥基或鹵素部分基團取代；R^3b、R^4b、R^5a、R^6a、R^7a及R^8a各獨立地為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，視情況經1至3個羥基或鹵素部分基團取代；或R^6a、R^7a及R^8a中之任兩者可連接形成3至7員碳環，及其醫藥學上可接受之鹽。
5. 如請求項1之用途，其中該維他命D化合物為1,25-二羥基維他命D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇(cholecalciferol)、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維他命D3、1α,24-二羥基維他命D3或MC 903。
6. 如請求項1之用途，其中該維他命D化合物不為1,25-二羥基維他命D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維他命D3、1α,24-二羥基維他命D3或MC 903。
7. 如請求項1之用途，其中該維他命D化合物在正常角質細胞中展現與等量鈣化三醇類似或相同之基因調控概況。
8. 如請求項1之用途，其中該維他命D化合物促進一或多種其表現量由等量鈣化三醇促進之基因的表現。
9. 如請求項1之用途，其中該維他命D化合物抑制一或多種其表現量受等量鈣化三醇抑制之基因的表現。
10. 如請求項1之用途，其中該維他命D化合物調節正常角質細胞中HSPA2或HSF4 mRNA、HSPB1或DNAJC6 mRNA之表現。
11. 如請求項1之用途，其中該維他命D化合物調節正常角質細胞中SLC1A1、KCNB2、KCNN4蛋白質或SLC1A3蛋白質之表現。
12. 如請求項1之用途，其中該維他命D化合物調節選自由類澱粉前 驅蛋白、ARTS、ASAP1矢車菊苷b4、BACH1、Bclx、BclxL、BID、Bmf、CENPE、cMyc、切絲蛋白、連接蛋白32、Csk、CtBP1、DcR2、二甲基組蛋白H3 diMeLys4、二甲基組蛋白H3 diMeLys9、肌縮蛋白、ERK5 BIG MAPKBMK1、雌激素受體、FKHRL1 FOXO3a、局部黏著斑激酶pp125FAK、FOXP2、麩胺酸去羧酶65、麩胺酸去羧酶GAD65 67、g微管蛋白、HDAC2、HDAC6、ILK、MAP激酶活化蛋白激酶2 MAPKAPK2、MAP激酶ERK1、黑皮素3受體、肌凝蛋白IX Myr5、神經絲200、氧化氮合成酶bNOS、p120ctn、PAD14、Par4前列腺細胞凋亡反應蛋白4、早老素1、增殖細胞蛋白Ki67、蛋白激酶Ba、PUMA bbc3、ROCK1、S100、SHPTP2、Sin3A、物質P受體、突觸極蛋白、腫瘤壞死因子a、泛素C端水解酶L1、桑椹胚黏著蛋白E鈣黏附蛋白、玻璃連結蛋白、Crk II、獨立生長因子1、絲胺酸蘇胺酸蛋白磷酸酶1b、組織蛋白酶D、轉型生長因子b pan、WAVE、蛋白質酪胺酸磷酸酶PEST及CD40所組成群組之一或多種蛋白質之表現至少約2倍。
13. 如請求項1之用途，其中在正常角質細胞與該維他命D化合物接觸約24小時之後，該維他命D化合物誘導選自由BACH1、CENPE、cMyc、C-src酪胺酸激酶(Csk)、CtBP1、二甲基組蛋白H3 diMeLys4、二甲基組蛋白H3 diMeLys9、雌激素受體、FKHRL1 FOXO3a、FOXP2、HDAC2、MAP激酶活化蛋白激酶2 MAPKAPK2、MAP激酶ERK1、黑皮素3受體、增殖細胞蛋白Ki67、S100、SHPTP2、Sin3A、ARTS、ASAP1矢車菊苷b4、切絲蛋白、連接蛋白32、肌縮蛋白、局部黏著斑激酶pp125FAK、g微管蛋白、肌凝蛋白IX Myr5、神經絲200、p120ctn、PAD14、ROCK1、桑椹胚黏著蛋白E鈣黏附蛋白、玻璃連結蛋白、Bclx、 BclxL、BID、Bmf、DcR2、ERK5 BIG MAPKBMK1、整合素連接激酶(ILK)、蛋白激酶Ba、PUMA bbc3、類澱粉前驅蛋白、BACH1、早老素1、麩胺酸去羧酶65、麩胺酸去羧酶GAD65 67、神經絲200、氧化氮合成酶bNOS、物質P受體、突觸極蛋白、連接蛋白32、腫瘤壞死因子a及泛素C端水解酶L1所組成群組之一或多種蛋白質過度表現。
14. 如請求項1之用途，其中該維他命D化合物誘導正常角質細胞中以下一或多者過度表現：GST、角蛋白1、角蛋白17、半乳糖凝集素1、S100 A9(鈣衛蛋白(Calprotectin))或S100 A13。
15. 如請求項1之用途，其中該禿髮症為斑禿(AA)、全禿(AT)、全身禿(AU)或化學療法誘發之禿髮症(CIA)。
16. 如請求項15之用途，其中斑禿包括彌漫性斑禿、單點斑禿(alopecia areata monolocularis)、多點斑禿(alopecia areata multilocularis)及鬚部斑禿(alopecia areata barbae)。
17. 如請求項1之用途，其中該禿髮症不包括雄性型禿髮症(androgenetic alopecia/alopecia androgenetica)或化學療法後禿髮症(PCA)。
18. 如請求項1之用途，其中該個體為靈長類動物。
19. 如請求項1之用途，其中該個體為人類。
20. 如請求項1之用途，其中禿髮症在該個體中尚未開始出現。
21. 如請求項1之用途，其中該個體正在經歷或將要經歷化學療法。
22. 如請求項21之用途，其中該醫藥組合物係在化學療法之前或與化學療法同時投與該個體。
23. 如請求項21之用途，其中該醫藥組合物係在化學療法開始之後、但在禿髮症開始出現之前投與該個體。
24. 如請求項21之用途，其中該醫藥組合物實質上不會降低化學療 法之功效。
25. 如請求項21之用途，其中化學療法為全身性化學療法。
26. 如請求項21之用途，其中化學療法包括以下一或多者：蒽環黴素(Anthracycline)、5-FU、他莫昔芬(Tamoxifen)、伊立替康(Irinotecan)、太平洋紫杉醇(Paclitaxel)(紫杉醇(Taxol))、卡鉑(Carboplatin)、依託泊苷(Etoposide)、環磷醯胺(Cytoxan/Cyclophosphamide)、順鉑(Cisplatin)、埃羅替尼(Erlotinib)(得舒緩(Tarceva))、吉西他濱(Gemcitabine)、星形孢菌素(Staurosporin)、長春新鹼(Vincristine)、伊馬替尼(Imatinib)(基立克(Gleevec))、吉非替尼(Gefitinib)(艾瑞莎(Iressa))、索拉非尼(Sorafenib)、達沙替尼(Dasatinib)、放線菌素D(Dactinomycin)、六甲三聚氰胺(HMM、六甲密胺(altretamine))、異環磷醯胺(Ifosfamide)、博萊黴素(bleomycin)、甲胺喋呤(methotrexate)、多烯紫杉醇(Docetaxel)(紫杉德(Taxotere))、長春地辛(Vindesine)、長春瑞濱(Vinorelbine)、拓朴替康(Topotecan)、安吖啶(Amsacrine)、阿糖胞苷(Cytarabine)、白消安(Busulphan)、美法侖(Melphalan)、長春鹼(Vinblastine)、洛莫司汀(Lomustine，CCNU)、噻替派(Thiotepa)、吉西他濱、卡莫司汀(Carmustine，BCNU)、米托蒽醌(Mitroxantrone)、絲裂黴素C(Mitomycin C)、丙卡巴肼(Procarbazine)、6-巰基嘌呤、鏈佐黴素(Sreptozotocin)、氟達拉濱(Fludarabine)、雷替曲塞(Raltitrexate)(拓優得(Tomudex))、卡西他濱(Capecitabine)及其等效物。
27. 如請求項26之用途，其中該蒽環黴素(Anthracycline)係選自由阿黴素(Adriamycin)/多柔比星(Doxorubicin)、道諾黴素(Daunorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、黃膽素(Idarubicin)及戊 柔比星(Valrubicin)所組成群組。
28. 如請求項1之用途，其中該維他命D化合物係以等效於約0.1μg鈣化三醇/cm²之劑量體積局部投與該個體。
29. 如請求項28之用途，其中總劑量等效於約2-100微克鈣化三醇/75公斤體重。
30. 一種包含治療有效量之維他命D化合物之醫藥組合物於製備用於預防或治療個體之禿髮症之藥劑的用途，其中該藥劑係局部投與至該個體，該維他命D化合物係由式(I)表示： 其中：a及b各獨立地為單鍵或雙鍵；當a為雙鍵時，X為-CH₂；或當a為單鍵時，X為氫或經羥基取代之烷基；R¹為氫、羥基、烷氧基、三烷基矽烷基或烷基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；R²為氫、羥基、-O-三烷基矽烷基或烷基、烷氧基或烯基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；當b為雙鍵時，R³不存在；或當b為單鍵時，R³為氫、羥基或烷基，或R³及R¹與其所連接之碳原子可連接形成5至7員碳環；當b為雙鍵時，R⁴不存在；或當b為單鍵時，R⁴為氫、鹵素或羥基； 當a為雙鍵時，R⁵不存在；或當a為單鍵時，R⁵為氫、鹵素或羥基；R⁶為烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環基、烷基-O-烷基、烷基-CO₂-烷基，視情況經1至5個羥基、側氧基、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR'R"部分基團取代；R⁷為烷基，視情況經1至3個羥基、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR'R"部分基團取代；及R'及R"各獨立地為氫、羥基、鹵素、烷基或烷氧基，及其醫藥學上可接受之鹽；其中該維他命D化合物不為1,25-二羥基維他命D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維他命D3、1α,24-二羥基維他命D3或MC 903。
31. 如請求項30之用途，其中該維他命D化合物係由式(II)表示： 其中：c為單鍵或雙鍵；R^1a為氫、三烷基矽烷基或烷基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；R^2a為氫、羥基、-O-三烷基矽烷基或烷基、烷氧基或烯基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代； 當c為雙鍵時，R^3a、R^4a不存在；或當c為單鍵時，R^3a、R^4a各獨立地為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，視情況經1至3個羥基或鹵素部分基團取代；R^3b、R^4b、R^5a、R^6a、R^7a及R^8a各獨立地為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，視情況經1至3個羥基或鹵素部分基團取代；或R^6a、R^7a及R^8a中之任兩者可連接形成3至7員碳環，及其醫藥學上可接受之鹽。
32. 一種包含治療有效量之維他命D化合物之醫藥組合物於製備用於預防或治療個體之禿髮症之藥劑的用途，其中該藥劑係局部投與至該個體，其中該維他命D化合物當按以下有效濃度局部投與該個體時：(1)約50μg/mL，在連續投與藥物至少約25天之後不會產生毒性；或(2)約100μg/mL，在連續投與藥物至少約7天之後不會產生毒性。
33. 一種包含治療有效量之維他命D化合物之醫藥組合物於製備用於預防或治療個體之禿髮症之藥劑的用途，其中該藥劑係局部投與至該個體，該維他命D化合物用於預防或治療該個體之禿髮症，而實質上不會干擾共同投與之化學治療劑之功效。
34. 一種包含治療有效量之維他命D化合物之醫藥組合物於製備用於預防或治療個體之禿髮症之藥劑的用途，其中該藥劑係局部投與至該個體，該維他命D化合物：(1)在正常角質細胞中展現與等量鈣化三醇類似或相同之基因調控概況；(2)調節一或多種其表現量由等量鈣化三醇調節之基因的表現； (3)調節正常角質細胞中HSPA2或HSF4 mRNA、HSPB1或DNAJC6 mRNA之表現；(4)調節正常角質細胞中SLC1A1、KCNB2或KCNN4蛋白質或SLC1A3蛋白質之表現；(5)調節選自由類澱粉前驅蛋白、ARTS、ASAP1矢車菊苷b4、BACH1、Bclx、BclxL、BID、Bmf、CENPE、cMyc、切絲蛋白、連接蛋白32、Csk、CtBP1、DcR2、二甲基組蛋白H3 diMeLys4、二甲基組蛋白H3 diMeLys9、肌縮蛋白、ERK5 BIG MAPKBMK1、雌激素受體、FKHRL1 FOXO3a、局部黏著斑激酶pp125FAK、FOXP2、麩胺酸去羧酶65、麩胺酸去羧酶GAD65 67、g微管蛋白、HDAC2、HDAC6、ILK、MAP激酶活化蛋白激酶2 MAPKAPK2、MAP激酶ERK1、黑皮素3受體、肌凝蛋白IX Myr5、神經絲200、氧化氮合成酶bNOS、p120ctn、PAD14、Par4前列腺細胞凋亡反應蛋白4、早老素1、增殖細胞蛋白Ki67、蛋白激酶Ba、PUMA bbc3、ROCK1、S100、SHPTP2、Sin3A、物質P受體、突觸極蛋白、腫瘤壞死因子a、泛素C端水解酶L1、桑椹胚黏著蛋白E鈣黏附蛋白、玻璃連結蛋白、Crk II、獨立生長因子1、絲胺酸蘇胺酸蛋白磷酸酶1b、組織蛋白酶D、轉型生長因子b pan、WAVE、蛋白質酪胺酸磷酸酶PEST及CD40所組成群組之一或多種蛋白質之表現至少約2倍；(6)在正常角質細胞與該維他命D化合物接觸約24小時之後，誘導選自由BACH1、CENPE、cMyc、C-src酪胺酸激酶(Csk)、CtBP1、二甲基組蛋白H3 diMeLys4、二甲基組蛋白H3 diMeLys9、雌激素受體、FKHRL1 FOXO3a、FOXP2、HDAC2、MAP激酶活化蛋白激酶2 MAPKAPK2、MAP激酶ERK1、黑皮素3受體、增殖細胞蛋白Ki67、S100、SHPTP2、Sin3A、ARTS、 ASAP1矢車菊苷b4、切絲蛋白、連接蛋白32、肌縮蛋白、局部黏著斑激酶pp125FAK、g微管蛋白、肌凝蛋白IX Myr5、神經絲200、p120ctn、PAD14、ROCK1、桑椹胚黏著蛋白E鈣黏附蛋白、玻璃連結蛋白、Bclx、BclxL、BID、Bmf、DcR2、ERK5 BIG MAPKBMK1、整合素連接激酶(ILK)、蛋白激酶Ba、PUMA bbc3、類澱粉前驅蛋白、BACH1、早老素1、麩胺酸去羧酶65、麩胺酸去羧酶GAD65 67、神經絲200、氧化氮合成酶bNOS、物質P受體、突觸極蛋白、連接蛋白32、腫瘤壞死因子a及泛素C端水解酶L1所組成群組之一或多種蛋白質過度表現；或(7)誘導正常角質細胞中以下一或多者過度表現：GST、角蛋白1、角蛋白17、半乳糖凝集素1、S100 A9(鈣衛蛋白)或S100 A13；其中該維他命D化合物不為1,25-二羥基維他命D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維他命D3、1α,24-二羥基維他命D3或MC 903。
35. 一種用於局部投與之醫藥組合物，其包含治療有效量之用於預防或治療禿髮症之維他命D化合物，其中該維他命D化合物經調配以傳遞至表皮，而實質上避免真皮傳遞。
36. 如請求項35之醫藥組合物，其包含約40%(w/w)丙二醇及約60%(w/w)無水絕對乙醇(200酒精度，US，未變性)。
37. 如請求項36之醫藥組合物，其包含約30%(w/w)丙二醇、約10%(w/w)乙氧基二乙二醇或二乙二醇單乙醚及約60%(w/w)無水絕對乙醇(200酒精度，US，未變性)。
38. 一種用於局部投與之醫藥組合物，其包含治療有效量之用於預防或治療禿髮症之維他命D化合物，其中該維他命D化合物係由式(I)表示： 其中：a及b各獨立地為單鍵或雙鍵；當a為雙鍵時，X為-CH₂；或當a為單鍵時，X為氫或經羥基取代之烷基；R¹為氫、羥基、烷氧基、三烷基矽烷基或烷基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；R²為氫、羥基、-O-三烷基矽烷基或烷基、烷氧基或烯基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；當b為雙鍵時，R³不存在；或當b為單鍵時，R³為氫、羥基或烷基，或R³及R¹與其所連接之碳原子可連接形成5至7員碳環；當b為雙鍵時，R⁴不存在；或當b為單鍵時，R⁴為氫、鹵素或羥基；當a為雙鍵時，R⁵不存在；或當a為單鍵時，R⁵為氫、鹵素或羥基；R⁶為烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環基、烷基-O-烷基、烷基-CO₂-烷基，視情況經1至5個羥基、側氧基、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR'R"部分基團取代；R⁷為烷基，視情況經1至3個羥基、鹵素、烷氧基、芳基、雜芳基、氰基、硝基或-NR'R"部分基團取代；及R'及R"各獨立地為氫、羥基、鹵素、烷基或烷氧基，及其醫 藥學上可接受之鹽；其中該維他命D化合物不為1,25-二羥基維他命D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維他命D3、1α,24-二羥基維他命D3或MC 903。
39. 如請求項38之醫藥組合物，其中該維他命D化合物係由式(II)表示： 其中：c為單鍵或雙鍵；R^1a為氫、三烷基矽烷基或烷基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；R^2a為氫、羥基、-O-三烷基矽烷基或烷基、烷氧基或烯基，視情況經1至3個鹵素、羥基、氰基或-NR'R"部分基團取代；當c為雙鍵時，R^3a、R^4a不存在；或當c為單鍵時，R^3a、R^4a各獨立地為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，視情況經1至3個羥基或鹵素部分基團取代；R^3b、R^4b、R^5a、R^6a、R^7a及R^8a各獨立地為氫、羥基、鹵素、烷氧基或烷基，視情況經1至3個羥基或鹵素部分基團取代；或R^6a、R^7a及R^8a中之任兩者可連接形成3至7員碳環，及其醫藥學上可接受之鹽。
40. 一種用於局部投與之醫藥組合物，其包含治療有效量之用於預 防或治療禿髮症之維他命D化合物，其中該維他命D化合物當按以下有效濃度局部投與該個體時：(1)約50μg/mL，在連續投與藥物至少約25天之後不會產生毒性；或(2)約100μg/mL，在連續投與藥物至少約7天之後不會產生毒性。
41. 一種用於局部投與之醫藥組合物，其包含治療有效量之用於預防或治療禿髮症之維他命D化合物，其中該治療有效量之該維他命D化合物當與化學治療劑共同投與時，實質上不會干擾該化學治療劑之功效。
42. 一種用於局部投與之醫藥組合物，其包含治療有效量之用於預防或治療禿髮症之維他命D化合物，其中該治療有效量之該維他命D化合物：(1)在正常角質細胞中展現與等量鈣化三醇類似或相同之基因調控概況；(2)調節一或多種其表現量由等量鈣化三醇調節之基因的表現；(3)調節正常角質細胞中HSPA2或HSF4 mRNA、HSPB1或DNAJC6 mRNA之表現；(4)調節正常角質細胞中SLC1A1、KCNB2或KCNN4蛋白質、SLC1A3蛋白質之表現；(5)調節選自由類澱粉前驅蛋白、ARTS、ASAP1矢車菊苷b4、BACH1、Bclx、Bc1xL、BID、Bmf、CENPE、cMyc、切絲蛋白、連接蛋白32、Csk、CtBP1、DcR2、二甲基組蛋白H3 diMeLys4、二甲基組蛋白H3 diMeLys9、肌縮蛋白、ERK5 BIG MAPKBMK1、雌激素受體、FKHRL1 FOXO3a、局部黏著斑激 酶pp125FAK、FOXP2、麩胺酸去羧酶65、麩胺酸去羧酶GAD65 67、g微管蛋白、HDAC2、HDAC6、ILK、MAP激酶活化蛋白激酶2 MAPKAPK2、MAP激酶ERK1、黑皮素3受體、肌凝蛋白IX Myr5、神經絲200、氧化氮合成酶bNOS、p120ctn、PAD14、Par4前列腺細胞凋亡反應蛋白4、早老素1、增殖細胞蛋白Ki67、蛋白激酶Ba、PUMA bbc3、ROCK1、S100、SHPTP2、Sin3A、物質P受體、突觸極蛋白、腫瘤壞死因子a、泛素C端水解酶L1、桑椹胚黏著蛋白E鈣黏附蛋白、玻璃連結蛋白、Crk II、獨立生長因子1、絲胺酸蘇胺酸蛋白磷酸酶1b、組織蛋白酶D、轉型生長因子b pan、WAVE、蛋白質酪胺酸磷酸酶PEST及CD40所組成群組之一或多種蛋白質之表現至少約2倍；(6)在正常角質細胞與該維他命D化合物接觸約24小時之後，誘導選自由BACH1、CENPE、cMyc、C-src酪胺酸激酶(Csk)、CtBP1、二甲基組蛋白H3 diMeLys4、二甲基組蛋白H3 diMeLys9、雌激素受體、FKHRL1 FOXO3a、FOXP2、HDAC2、MAP激酶活化蛋白激酶2 MAPKAPK2、MAP激酶ERK1、黑皮素3受體、增殖細胞蛋白Ki67、S100、SHPTP2、Sin3A、ARTS、ASAP1矢車菊苷b4、切絲蛋白、連接蛋白32、肌縮蛋白、局部黏著斑激酶pp125FAK、g微管蛋白、肌凝蛋白IX Myr5、神經絲200、p120ctn、PAD14、ROCK1、桑椹胚黏著蛋白E鈣黏附蛋白、玻璃連結蛋白、Bclx、BclxL、BID、Bmf、DcR2、ERK5 BIG MAPKBMK1、整合素連接激酶(ILK)、蛋白激酶Ba、PUMA bbc3、類澱粉前驅蛋白、BACH1、早老素1、麩胺酸去羧酶65、麩胺酸去羧酶GAD65 67、神經絲200、氧化氮合成酶bNOS、物質P受體、突觸極蛋白、連接蛋白32、腫瘤壞死因子a及泛素C端水解酶L1所組成群組之一或多種蛋白質過度表現；或 (7)誘導正常角質細胞中以下一或多者過度表現：GST、角蛋白1、角蛋白17、半乳糖凝集素1、S100 A9(鈣衛蛋白)或S100 A13；其中該維他命D化合物不為1,25-二羥基維他命D3、1,25-二羥基-16-烯-23-炔-膽鈣化醇、1,25-二羥基-16-烯-炔-膽鈣化醇、1α-羥基維他命D3、1α,24-二羥基維他命D3或MC 903。