TW201732258A - 蛋白質聚集體之全像特性化技術 - Google Patents

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Abstract

用於蛋白質聚集體全像特性化技術之系統及方法。個別聚集體在溶液中的大小與折射率可以測定。關於形態及孔隙率之資訊可以從全像數據中設法得到。

Description

蛋白質聚集體之全像特性化技術
本發明係有關於蛋白質聚集體之全像特性化技術。
發明背景 蛋白質與蛋白質聚集體對於商業應用係越來越重要。蛋白質聚集體之特性化提供一挑戰，特別是對於大規模實施及關於實時或幾乎實時的特性化。蛋白質聚集成簇的趨勢在製造基於蛋白質之生物藥劑與評估其安全性中係為一主要關注。除了降低治療功效，蛋白質聚集體引起免疫反應，引致具有損害受影響個體健康之潛能的臨床不良事件。偵測、計數及特性化蛋白質聚集體為必需的，以理解蛋白質聚集作用之原由的關鍵途徑。已建立的粒子特性化技術，諸如動態光散射，對於次微米級聚集體的原位特性化工作良好地。其它，諸如微流成像(microflow imaging)，對大於5微米左右的可見聚集體工作最好地。比較少的已建立技術探測從100 nm至10 µm的微可見範圍。在要求於其天然環境中實時監測子微可見聚集體的應用中，對增強的特性化技術之需要係特別急性的。
蛋白質成簇之趨勢及偵測並特性化此者的能力係為一重要考量。對於準確與快速地特性化蛋白質之系統及方法係存在一需要。
發明概要        一實施例涉及一種特性化複數個蛋白質聚集體之樣品的方法。該方法包括使樣品流過一全像顯微鏡的觀察容積(observation volume)。在第一時間基於該觀察容積內的一第一組蛋白質聚集體的全像視頻顯微鏡生成第一組全像圖。將該第一組蛋白質聚集體的每一蛋白質聚集體模型化成一球體。對於該第一組蛋白質聚集體之每一蛋白質聚集體，折射率及半徑係測定的。在第二時間基於該觀察容積內的一第二組蛋白質聚集體的全像視頻顯微鏡生成第二組全像圖。將該第二組蛋白質聚集體的每一蛋白質聚集體模型化成一球體。對於該第二組蛋白質聚集體之每一蛋白質聚集體，折射率及半徑係測定的。
另一實施例涉及特性化複數個蛋白質聚集體的方法。該複數個蛋白質聚集體之蛋白質聚集體全像圖係生成的，每一全像圖基於該複數個蛋白質聚集體之蛋白質聚集體PN 於時間TN 的全像視頻顯微鏡。該蛋白質聚集體PN 之折射率及半徑係於時間TN 時測定。基於該粒子所測定之折射率及半徑，隨時間在該複數個蛋白質聚集體中的改變係被特性化。
另一實施例涉及一種用於特性化複數個蛋白質聚集體的電腦實施機器，其包含：一處理器；一全像顯微鏡，其包含一同調光、具有一觀察容積的試樣台、物鏡及一影像收集裝置。該全像顯微鏡係與該處理器通訊。該系統進一步包含一可操作地連接到該處理器並包括電腦程式的有形電腦可讀取媒體。該電腦程式係配置以：控制該樣品通過該全像顯微鏡之觀察容積的流動；在第一時間基於該觀察容積內之第一組蛋白質聚集體的全像視頻顯微鏡接收一第一組全像圖； 將該第一組蛋白質聚集體之每一蛋白質聚集體模型化成一球體；測定該第一組蛋白質聚集體之每一蛋白質聚集體球體的折射率及半徑；在第二時間基於該觀察容積內之第二組蛋白質聚集體的全像視頻顯微鏡接收一第二組全像圖；將該第二組蛋白質聚集體之每一蛋白質聚集體模型化成一球體；並測定該第二組蛋白質聚集體之每一蛋白質聚集體球體的折射率及半徑。
前述概要僅為例示性的，而非意欲以任何方式限制。除了上文描述之該等例示性層面、實施例及特徵之外，進一步之層面、實施例及特徵將藉由參照至下列圖式與該詳細說明而變得顯而易見。
較佳實施例之詳細說明 在下面詳細說明中，係對形成本文一部分之該等伴隨圖式作參照。在該等圖式中，相似的符號典型地識別相似的組份，除非上下文另有規定。於詳細說明、圖式及請求項中描述的該等例示實施例係非意欲限制。其它實施例可能被利用，並且可以作其它改變，而不背離本文提出之專利標的的精神或發明範圍。其將為容易理解的是，如在本文一般性描述並在圖中例示之本揭露內容的層面，可以在各式各樣不同的配置中來排列、替換、組合及設計，這些所有係明確地預期，並且構成此揭露內容的一部分。
碎形蛋白質聚集體之全像特性化技術對溶液中個別聚集體的大小與折射率產生了洞察。單一聚集體特性化數據可以針對在一聚集體分散液中之大小與折射率組合成聯合分佈，而無需關於該分佈本質的先驗假設。就碎形聚集體散射的有效介質模式對於一蛋白質聚集體整體解釋該所測量的大小-指數聯合分佈，產生對該聚集體之平均碎形維度的估計，且所以其形態。當這種解釋應用於聚集的牛血清白蛋白的分散液時，該設法得到之碎形維度D=1.2與基於諸如電子顯微鏡及原子力顯微鏡的異位測量技術的先前報導相符。這種族群平均尺度分析的成功為其所基於的單一聚集體特性化數據增添了信心，且從而對該全像特性化技術可以用於分析微米級蛋白質聚集體之大小、結構及形態的新穎主張增添了信心。
蛋白質聚集成簇的趨勢牽連到疾病過程，並且亦影響基於蛋白質之藥劑的功效。本文中，一種基於全像視頻顯微鏡的方法係引入，用於偵測、計數及特性化個別蛋白質聚集體，該方法於其自然狀態下在溶液中微可見聚集體上快速建立族群統計，而無需稀釋或特殊的溶劑條件，且不需要化學或光學標記。全像視頻顯微鏡的使用，包括洛倫茲米氏分析，已知用於特性化球形的均質粒子。蛋白質聚集體存在一獨特的挑戰，因為它們既非均質也不是球形。蛋白質聚集體傾向於不規則形狀，且可以為高度支化的紡錘狀結構。本文描述的係為利用一有效球體之性質測定的系統與方法，該有效球體包括該聚集體及該周圍與空隙的流體介質。此經界定球體的半徑與折射率的估計值然後係透過模型化的使用，諸如該碎形模型化，調整為該實際蛋白質聚集體的半徑與折射率估計值。在一應用中，該系統與方法係利用，而不需特性化該物質，而是在一個實施例中以幾乎實時的方式提供關於蛋白質聚集體在其天然環境中的「計數」資訊。
此方法之概念實例係透過在300 nm至10 µm半徑範圍內對牛血清白蛋白(BSA)及牛胰島素(BI)之聚集體上進行測量而作論證。累積粒子解析測量成聚集體大小與折射率之聯合分佈對生長條件在蛋白質聚集作用機制上的影響提供了洞察。這種聯合分佈的尺度分析對該聚集體之碎形維度產生了與先前異位測量一致的估計值，且因此對該聚集體形態給予了洞察。此種尺度分析的成功表明，對單一簇之大小與折射率的結果準確地反映了該個別聚集體的性質。
測量技術，諸如圖2之實施例，係基於同軸(in-line)全像視頻顯微鏡技術，該技術創建在該顯微鏡視野中之個別物體的全像。一全像顯微鏡以一準直的雷射光束照射其樣品，而不是常規的非同調光源。由諸如蛋白質聚集體的小物體散射的光所以在一光學顯微鏡的焦平面中干擾該光束的剩餘部分。該顯微鏡放大該干涉圖案並將其投影至一攝像機的正面上，該攝像機記錄空間變化的強度圖案I (r)。在該得到的視頻流中的每一影像係為通過該雷射光束之散射體的全像快照，且可以用基於洛倫茲米氏光散射學說的預測來分析，以測量每一聚集體的半徑a p 、折射率n p 及三維位置r p 。全像特性化技術最初係為了分析球形粒子而開發的(參閱，例如Lee SH、Roichman Y、Yi GR、Kim SH、Yang SM、van Blaaderen A等人之”Characterizing  and  tracking  single colloidal particles with video holographic microscopy. Opt Express. 2007；15:18275–18282”)，該者係併入本文以作為參考。因為分析的複雜性及相關的運算負擔，嚴格歸納分析以解釋非球形及非均質物體的詳細結構係過分地緩慢。理想化的球體模型係使用以特性化蛋白質聚集體，其應理解的是，該等結果應被解釋為意指包含蛋白質聚集體與填充該有效球體之流體介質兩者的一有效球體。
圖2例示了蛋白質聚集體在其通過一雷射光束時向下流過一微流體通道型全像。一典型的實驗全像在該圖中係以一灰階影像再現的。每一全像係由攝像機記錄，並與洛倫茲米氏學說的預測比較，以測量每一聚集體的半徑a p 及折射率np 。該散佈圖顯示了針對牛胰島素之3000個微可見聚集體的實驗數據，每一數據點代表一單一聚集體的性質，而顏色表示在該(a p ,np )平面中觀察的相對概率密度ρ (a p , np )。
在一實施例中，該全像特性化技術系統與方法提供用於偵測具有可接受之大小範圍之半徑的蛋白質聚集體，諸如在200 nm(300 nm、400 nm、500 nm)至20 μm (10 μm、1 μm、900 nm、800 nm)該範圍內。進一步，實施例使得計數在該大小範圍內的蛋白質聚集體成為可能，允許測定該蛋白質聚集體(在該大小範圍內)的數目密度。此外，該系統與方法允許識別在該可接受大小範圍之次範圍內的蛋白質聚集體。一些技術，諸如動態光散射(DLS)涵蓋相同大小範圍的下端，且可以探測更小的粒子。其它技術，諸如微流成像(MFI)在相同大小範圍的上端操作，且可以探測還更大的粒子。本全像特性化技術方法橋接了這些其它技術的操作域。該特定的範圍反映了當前的實施，且可以透過光學硬體的抉擇及透過用於分析全像圖之軟體的修改而擴展。該範圍的下端亦受到光波長的限制。該範圍的上端基本上不在這種方式中限制，但是在實踐中可以由運算複雜度的考量而限制。
為了實現該全像特性化技術，在一實施例中，該系統與方法特性化在可接受大小範圍內的蛋白質聚集體。特性化包括：a)以洛倫茲米氏分析測量該半徑； b)以洛倫茲米氏分析測量該聚集體的有效折射率； c)基於其有效折射率相對於該蛋白質自身值來估計個別聚集體的孔隙率；d)基於該單一粒子特性化數據的分佈形狀來估計一整體聚集體的平均孔隙率(使用方程式(1)(如下文闡述)，假設該聚集體可能模型化成具有一碎形幾何)；e)基於該聚集體之全像圖的後推法(back-propagation)來測量個別聚集體的形態。在一進一步實施例中，該後推法步驟係為用於分析相同數據的一區別且平行之路徑，且可能包括1)菲涅耳後推法(Fresnel back-propagation)，2)瑞立-索末菲後推法及/或3)瑞立-索末菲反摺積法(Rayleigh-Sommerfeld deconvolution)。該術語有效折射率意指在一球形體積內之物質的折射率，該者併入了所研究的粒子及還有插入在該粒子內的介質兩者。此「有效球體」具有反映該感興趣粒子之對應性質的大小及折射率。這種粒子可以為一膠體球、一非球形膠體粒子、一膠體粒子之聚集體、或諸如蛋白質聚集體的一分子聚集體。該經測量的有效折射率既不是該介質的折射率，也不是純蛋白質簇的折射率，而是該聚集體之所有組分的混成。當有更多的溶劑併入於該聚集體中時，該有效折射率將更靠近於該溶劑的折射率，而當有較少溶劑時，其將距該溶劑折射率更遠。該有效折射率提供了關於該以介質填充的有效球形體積之比例的資訊，且所以提供對該粒子形態的有用洞察。
藉由參照至圖2之實施例，該全像特性化技術儀器使用一常規的顯微鏡物鏡(Nikon Plan Apo，100x，數值孔徑1.45，油浸)，該物鏡係與一標準鏡筒透鏡組合，在該單色攝像機(NEC TI-324AII)正面上產生135 nm/像素的系統放大率。該樣品係以來自固態雷射儀(Coherent Verdi)的準直光束照射，該固態雷射儀輸送10 mW的532nm真空波長光至樣品。在此實例中，該光係擴散在3 mm直徑之光束上，產生1.5 mW/mm2 的峰值照度。對於微米級膠體球，此儀器可以以奈米精度測量個別粒子的半徑，其折射率至千分之一內，且可以追踪其位置在該平面中至奈米內，並且沿著該光軸在3奈米內。每一擬合可以使用自動特徵偵測及影像識別演算法在幾分之一秒中執行，舉例而言幾十毫秒中。一單一擬合足以特性化一單一蛋白質聚集體。
為了特性化在蛋白質分散液中的聚集體族群，該樣品係在一微流體通道中流過顯微鏡的觀察容積。給定相機的曝光時間為0.1 ms，結果係免於高達100 μm/s流速的運動模糊(motion blurring)。在典型條件下，不超過10個蛋白質聚集體一次通過該86 μm x 65 μm的視野。這些條件藉由最小化個別粒子散射圖案間的重疊而簡化該全像分析。每一粒子典型地係聚集體，典型地在其移動通過該視野時被記錄在多個視訊框(video frames)中。此等序列測量係使用最大概度演算法(maximum-likelihood algorithm)連結成軌跡線(trajectory)，且對於每一軌跡，中位數值係記錄的。這些考量對可存取的聚集體濃度範圍建立了108 聚集體/ml之上限。在另一極端，10分鐘的數據足以偵測、計數並特性化濃度低至104 聚集體/ml的聚集體。此靈敏度相較於動態光散射與奈米粒子追踪分析兩者為有利的。在一實施例中，由5000個粒子組成的數據組可以在約5分鐘中獲取。
嵌入圖2之該散佈圖顯示了牛胰島素之微可見聚集體的典型結果。每一點代表一單一聚集體的性質，且大小係可比擬在該半徑與折射率中的估計誤差。顏色代表在該(a p , np )平面中記錄之數據點的局部密度ρ(a p , np )，以一核密度估計式(kernel density  estimator)運算，其中紅色指出最有可能的值。
全像特性化技術可以歸納以適應非球形與非均質的粒子。然而，相關的光散射計算在運算上為繁重的。蛋白質聚集體係使用光散射學說對等向及均質的球體特性化，在該聚集體可能背離這種理想化模型的理解下。然而，圖1中之該典型實例證明，該球形模型對系統中觀察到的單一粒子散射圖案解釋良好。 校準該全像特性化技術儀器
全像特性化技術依賴四種儀器校準參數：該雷射照射的真空波長、該光學元件串(optical train)的放大率、該照相機的暗計數(dark count)、及於該操作照射層級的該單一像素訊號雜訊比。所有這些都可以測量一次，且然後用於所有後續分析。
該雷射之真空波長係由製造商指定，且使用一光纖光譜儀(Ocean Optics，HR4000)獨立地驗證為四位有效數字。使用一精度千分尺(Ted Pella，目錄號2285-16)，該顯微鏡的系統放大率係測量為四位有效數字。該照相機之暗計數係藉由阻斷雷射照射並於每一像素處運算該平均影像值而測量。影像雜訊係從全像影像以中位數絕對偏差(MAD)度量估計的。
除了這些儀器校準之外，獲得準確結果亦要求在該雷射波長及該樣品溫度下介質之折射率的準確值。對於本研究中之該水性緩衝液，藉由阿貝(Abbe)折射計(Edmund Optics)，此值係以四位有效數字獲得。以純水於21±1℃測量溫度時的折射率，nm =1.335，近似該值，在該估計的半徑及折射率中產生不超過0.1%的系統誤差。 全像特性化技術的操作範圍
該全像特性化技術儀器的操作範圍係藉由在意欲用作粒子大小標準品的膠體球之水性分散液上測量而建立。在每一粒子之全像圖中的干涉條紋必須由該顯微鏡焦平面中之至少一像素分開。藉由將焦平面設定在該樣品池中之玻璃-水界面下方5 µm處，此要求係適應的。該最大可存取的軸向位移係藉由將多個同心條紋適配置該相機之視野中，及藉由降低影像對比至該相機的雜訊底下兩者之需要而設定。此儀器之上限大概為100 µm。在一較佳實施例中，該樣品係通過具30 µm光徑長的微流體通道，以確保對所有聚集體的良好成像條件，而不管其在該通道中的高度如何。
可偵測粒子大小之範圍下限端係受限於在該介質中的半光波長。小於此的粒子產生可偵測的全像，該者可以藉由洛倫茲米氏學說擬合。然而，這些擬合不能從折射率完全地分開該粒子大小。假若該粒子的折射率為先驗已知的，這些測量再次可以產生粒子半徑的可靠估計。對於該示例實施例，該實際下限係由該相機的8位元動態範圍設定為a p ＞ 200 nm。較小粒子的光散射圖案缺乏對於可靠偵測及特性化所需要的對比度。
對於該示例實施例，大小上限係藉由該通道的深度設定為a p ＜10 µm。該所描述的實例設定不能預期能夠可靠地觀察並正確地識別遠大於10 µm的不規則形狀蛋白質聚集體。大的瞬時聚集體可能藉由在該通道內之泊蘇葉流(Poiseuille flow)的流體動力學剪切而破裂。藉由針對球體的自動化全像特性化技術開發的特徵識別演算法，實質上大於光波長的高度不對稱聚集體可能被誤識別為兩個或更多個區別的特徵。儘管其存在係藉由將來自全像特性化技術的結果與藉由使用來自下一節的方法重新分析用於微流成像的相同數據而獲得的結果比較而確認，但是對此偽影沒有努力修正。 全像形態測量
透過洛倫茲米氏分析用於全像特性化技術的相同全像圖亦可以用於透過以體積反摺積法的瑞立-索末菲後推法來可視化個別聚集體的三維形態。此技術使用瑞立-索末菲繞射積分以重建為該所觀察之強度分佈原由的體積光場(volumetric light field)。為該散射圖案原由的物體以其在該光場中創造的焦散(caustics)形式出現在該重建中。對於具有在大小上與光波長可比擬之特徵的物體，這些焦散已經顯示在三維中準確地追踪那些特徵的位置及方向。以用於瑞立-索末菲繞射核的點擴散函數反摺積所得到的體積數據組，其消除了孿生像偽影並產生該散射體的一三維表現。
蛋白質聚集體的體積重建可以投影到該成像平面中，以獲得在該最佳聚焦平面中之明視野影像的等效物。相較於常規的明視野顯微鏡，這獲得了全像顯微鏡非常大的有效聚焦深度的益處。該所得到的影像對於微流成像分析為有用的，包括蛋白質聚集體的形態分析。此資訊轉而可以用於評估洛倫茲米氏分析中的假特徵識別比率，且從而較大聚集體被誤識別為較小聚集體簇的比率。
以全像反摺積顯微鏡(deconvolution microscopy)調查聚集體形態係為透過洛倫茲米氏分析之全像特性化技術的有用補充。鑒於洛倫茲米氏擬合在幾毫秒內發生，然而，瑞立-索末菲後推法慢了幾百倍。所以，本研究聚焦於可以快速透過洛倫茲米氏特性化獲得的資訊。 實例 材料製備
牛胰胰島素樣品(Mw：5733.49Da，Sigma-Aldrich，CAS號：11070-73-8)係根據先前公開的方法製備，伴隨針對由單單攪拌所誘發的胰島素聚集作用之調查的修飾。胰島素係以5 mg/ml的濃度溶解在用37%鹽酸(Sigma Aldrich，CAS號：7647-01-0)調整至pH7.4的10 mM Tris-HCl緩衝液(Life Technologies，CAS號77-86-1)中。該溶液然後係於250 rpm下離心1 h以誘發聚集作用，在此時樣品實質上仍看似透明的。
牛血清白蛋白(BSA)(Mw：66500Da，Sigma Aldrich，CAS號：9048-46-8)溶液係藉由與聚(烯丙胺鹽酸鹽)(PAH)(Mw：17,500 g/mol，CAS號：71550-12-4，平均聚合度：1207)[33,34]複合而聚集。BSA與PAH係溶解在10 mM Tris緩衝液(Life Technologies，CAS號：77-86-1)中，分別達到1.22 mg/ml及0.03 mg/ml的濃度。該等試劑係藉由渦旋混合以確保溶解，且聚集體係在使該樣品平衡1小時後形成。
在可比擬的條件下伴隨0.1 M NaCl(Sigma Aldrich，CAS號7647-14-5)的加入製備額外的樣品，以促進複合作用且從而促使聚集作用。
膠體球樣品之標準化學計量混合物係為四種單分散膠體球族群的混合物，其中每一族群具有區別的平均大小及組成物。該等單分散球體係以10%固體的水性分散液購自Bangs Laboratories。原料懸浮液係以去離子水稀釋一千倍，然後以等體積合併，以創造一異質混合物。在此混合物中之該四個族群係為直徑2a p =0.71±0.09 µm(目錄代碼PS03N，批號9402)與2a p =1.58±0.14 µm(目錄代碼PS04N，批號9258)的聚苯乙烯球體，及直徑2a p =0.69±0.07 µm(目錄代碼SS03N，批號8933)與2a p =1.54±0.16 µm(目錄代碼SS04N，批號5305)的矽球體。該粒子大小的引述範圍係由製造商對較小球體使用動態光散射來估計，而對於較大球體由庫爾特(Coulter)原理估計。
由聚二甲基矽氧烷(PDMS)組成之矽球體係藉由雙官能二乙氧基二甲基矽烷(DEDMS)(Sigma-Aldrich，CAS號78-62-6，3vol%)與三官能三乙氧基甲基矽烷(TEMS)(Sigma-Aldrich，CAS號2031-67-6，2 vol%)的鹼催化水解及共聚合作用而合成，遵照一標準方案[Obey等人之”J. Colloid Interface Sci. 1994, 163： 454-463”；Goller等人之” Colloids Surfaces, 1997； 123-124： 183-193”]。以60：40化學計量的DEDMS與TEMS之混合物係於(28-30) wt%下加入去離子水(Millipore MilliQ，93 vol%)及氫氧化銨溶液(ACROS Organics 2 vol%)中，以獲得10 ml的總體積。該樣品係於室溫下以渦旋振盪器劇烈振動4分鐘以引發成核作用，然後留在一旋轉框架(rotating frame)上以10 rpm聚合3小時。該完全生長的矽球體然後係於10-4 的體積分率(volume fraction)下與蛋白質聚集體懸浮液混合，以獲得4×106 /ml的球體有效濃度。
這些聚合的球體與未聚合的矽油液滴共享大多數性質。它們1.388±0.002的平均折射率超過DEDMS的1.381，及TEMS的1.383，如以阿貝折射計(Edmund Optics)及全像特性化技術測定。 精度與確度驗證
圖3中之數據係藉由由四種區別類型之單分散膠體球的化學計量混合物組成的一模型膠體分散液的全像特性化技術而獲得。圖3A中之該四個峰的每一者代表那些族群之一的性質。在每一事例中，該全像性測量的性質分佈係與該製造商的規格一致。此相符性，連同在先前出版物中的補充測試，建立了粒子解析全像特性化技術的精度與確度。
此數據組亦例示了全像特性化技術特性化異質膠體分散液的獨特能力。其它技術可以個別地解析該單分散膠體組分任一者的大小分佈。然而，沒有其它技術可以在此混合物中解析該四種族群。
圖4A-D提供了全像特性化技術產生有用結果之粒子大小範圍的一實驗證明。本文呈現之該3個全像圖係針對分散在水中的3種不同聚苯乙烯球體記錄的，其中一者具半徑ap =0.237 mm，在該技術之有效範圍的小端，一者具半徑ap =0.800 mm，而該第三者具半徑ap =10.47 mm。這些測量的全像圖(圖4A)係與對應的逐像素擬合(圖4B) 的光散射學說預測並排呈現，其由每一粒子的3維位置、半徑及折射率而參數化。擬合的品質可以藉由繪製該常態化影像強度b(r)的徑向剖面(圖4C)而評估。此係藉由圍繞該散射圖案中心隨角度對2維強度圖案求平均而獲得。從該測量數據獲得的曲線係繪製在圖4D中代表測量不確定性的陰影區域內。從擬合獲得的曲線係覆蓋在該實驗數據上用於比較。在粒子大小之整個範圍上，該擬合非常良好地追踪該實驗數據。 微可見胰島素聚集體之特性化
雖然牛胰島素樣品在目視檢查下看似清澈，圖2中之數據顯露出每毫升(3.9±0.5)×107 微可見牛胰島素聚集體之一濃度，該者大概對應於10-3 之體積分率。此值的不測定性起因於該最大粒子的特徵識別誤差及流速的不確定性。半徑小於200奈米的聚集體不能由該全像特性化技術系統偵測，且所以不計入這些總數中。粒子特性之分佈係於1.6 µm半徑處達到峰值，並且為寬及多峰的。半徑超過4.2 µm的聚集體係沒有記錄到，這表明此種大尺度聚集體係以低於104 /ml的濃度存在。
該聚集體之折射率在一廣範圍內變化，從剛好高於緩衝液的nm ==1.335，到稍大於1.42。此範圍係顯著小於對完全緻密的蛋白質晶體所預期之大約1.54的值。然而，此觀察到的上限係與蛋白質聚集體折射率之近日的折射率匹配(index-matching)測量為一致的。這些後面的測量係藉由以折射率匹配流體灌注蛋白質聚集體而執行，且所以產生該蛋白質質本身之折射率的估計。相反的，全像特性化技術分析了由較高折射率蛋白質及填充該球體之較低折射率緩衝液構成的一有效散射體。其係已經顯示的是，這種有效球體具有介於該兩種介質之間的一有效折射率，其比率取決於該實際粒子的孔隙率。更多孔狀或更開放的結構具有一較小的有效折射率。更進一步，孔隙率對有效折射率的影響，係發現對於具較大半徑的粒子為更大比例地。
在該蛋白質聚集體具有開放的不規則結構的假設下，該有效球體模型解釋了該全像特性化技術數據中的一般趨勢。這個主張與先前已經證明牛胰島素形成絲狀聚集體的異位研究一致。
全像特性化技術記錄個別膠體粒子大小與折射率兩者的特別能力所以原位地提供了對蛋白質聚集體形態的洞察，且無需稀釋，也無需任何其它特殊的製備。這種能力亦使得全像特性化技術能夠將蛋白質聚集體與諸如矽油液滴與橡膠粒子之常見的污染物區分開來，該等對其它分析技術構成了問題。 微可見BSA聚集體的特性化
圖5顯示了對兩種牛血清白蛋白樣品的可比擬全像特性化技術結果。圖5(a)中之數據係從沒有額外鹽而製備之該樣品獲得的。對於胰島素樣品，該BSA樣品之全像特性化技術顯露在從300 nm至2.5µm不斷的半徑範圍內之±0.5×106 聚集體/ml，且峰半徑為0.5 µm。半徑超過2.8 µm的聚集體係沒有觀察到，這表明較大的聚集體係以低於104 /ml的濃度存在。
圖5(a)中之上部(upper panel)係為聯合分佈ρ(ap ,np )至該聚集體大小ρ(ap )分佈中的一投影。此投影更接近類似於由其它大小測量技術所提供的結果，諸如動態光散射。雖然該觀察到的微可見蛋白質聚集體之濃度低於DLS的偵測閾值，DLS測量顯露大概109 個聚集體/ml之一濃度，這些半徑係小於100 nm，且從而對於全像特性化技術係太小的。對於BI樣品，圖5A-F中ap 與np 之間明顯的反相關表明BSA-PAH複合物具有一開放性結構。這與先前證明BSA聚集體變成虛弱支化結構的異位研究一致。
添加鹽增強了複合作用並提高平均聚集體大小幾乎二分之一，並且實質上亦拓寬了該聚集體大小之分佈。這些趨勢可以於圖5(b)中看到。圖5A-F亦包括相對概率密度ρ(ap )的投影，該者強調聚集體大小分佈如何隨生長條件而改變。這些投影省略的是來自圖5(a)至圖5(b)聚集體半徑與折射率之聯合分佈中的驚人變化。此偏移表明在添加鹽的存在下生長的較大聚集體實質上為更多孔的。這種對聚集體形態的洞察將不會僅僅由大小分佈提供。 聚集體形態的作用 微流成像
圖4A-D呈現全像特性化技術與MFI之間對於6種BSA-PAH複合物之代表性樣品的直接比較，該等複合物的形態範圍從幾乎球形緊湊簇到擴展的紡錘形結構。每一聚集體的全像圖係與洛倫茲米氏學說預測的非線性最小平方擬合比較。對於這些擬合，該降低的X2 統計量係用於排列該等結果從最佳擬合於頂部到最差擬合於底部。該等測量的全像圖每一者亦使用以透過瑞立-索末菲反摺積顯微鏡重建個別聚集體的體積影像。該重建簇的大小然後可以與從全像特性化技術獲得的有效半徑比較。
即使是圖4A中兩個最緊湊的簇看起來實質上為非球形的。不過，其等之全像圖係由該非線性擬合良好地再現。這些擬合的X2 度量接近統一，表明該模型適當地描述了光散射過程，且該單一像素雜訊係良好地估計。聚集體半徑之值係與從瑞立-索末菲重建估計的大小一致。具全像測定半徑的圓圈係疊加在圖4D中之該數值性重聚焦明視野影像上用於比較。此成功與先前洛倫茲米氏及瑞立-索末菲分析對膠體球與膠體棒的比較一致。
當聚集體變得越來越高度結構化與不對稱時，誤差增加。即使如此，對於該特性大小的估計係與該明視野重建的表觀大小在一合理相符中，即使是最差的事例。這種穩固性(robustness)出現是因為該散射體的有效大小強烈影響該中央散射峰的大小及對比度，及該緊接周圍的強度最小值。所以，在該干涉圖案之此區域中的忠實擬合對於散射體的大小產生合理的值。該圖案之總體對比度整個編碼該散射體的折射率，且從而對於這種開放結構簇係非常低的。
這些代表性實例係一致於全像特性化技術對於不完美球體與非球形粒子產生有用之特性化數據的早期證明。特別是對於較大的聚集體，該折射率估計值描述了一有效球體。然而，該估計半徑對該聚集體的大小係為一相當穩固的度量。
獨立於全像特性化技術提供形態洞察的能力，這些結果證明全像顯微鏡有用地偵測並計數溶液中的微可見蛋白質聚集體。這些偵測本身原位提供了對特性化蛋白質溶液之聚集作用狀態為有用的資訊，而不需大量的樣品製備。全像顯微鏡之大的有效景深然後作用以提高該分析速率，相對於常規的粒子成像分析。
如同全像特性化技術，MFI產生了粒子解析的半徑測量，該者可以使用以計算在特定大小箱中的粒子濃度。這些結果可能與藉由全像特性化技術產生的投影大小分佈直接比較。圖8A-B中的數據顯示了對於在圖5C-D中表徵之該等具及不具添加鹽的BSA-PAH複合物的這種比較。結果係呈現為圍繞在ap 中之每一箱中心大小範圍±100nm內的每毫升之聚集體數目N(ap )。來自圖5B與5D之該全像特性化技術數據係於此圖中重新縮放以用於比較。獨立研究證明，MFI分析對於半徑大於1 nm的聚集體產生可靠的大小估計。對於較小的粒子，繞射造成重大的測量誤差。所以，我們收集較小粒子的MFI結果成圖8A與8B中的600-nm寬的箱中，伴隨對應的常態化。此箱範圍的下端對應於全像特性化技術所報告的最小半徑。全像特性化技術與MFI之間的相符性在該繪製的粒子大小之整個範圍內係相當良好的。兩種技術對於107 個聚集體/mL的總體濃度產生一致的值。MFI系統地在該大小範圍的大端上報告較大數量的聚集體，而在小端上報告較少數量的聚集體。這種差異可以歸因於該最細長與不規則的聚集體，諸如圖4A-D中的最後一個實例，其大小係被全像特性化技術低估。形態在全像大小特性化上的這種影響先前已經討論過了。即使在這些事例中，全像特性化技術正確地偵測粒子的存在，並將其識別為微米級物體。MFI與全像特性化技術對聚集體的總數目密度產生一致的結果。
對於在該大小範圍較小端的粒子，MFI提供了粒子計數，但是沒有有用的特性化數據。相反的，全像特性化技術在此制度中提供可靠的大小估計。在所考量的整個大小範圍中，全像特性化技術亦提供了粒子折射率的估計。 動態光散射
為了驗證在我們樣本中微可見蛋白質聚集體的存在，我們亦執行了DLS測量。儘管全像特性化技術與MFI產生粒子解析測量，DLS係為一種大批的特性化技術。由DLS報告的值反映可能歸因於一給定流體動力學半徑ah 之物體的散射光百分比P(ah )。所以，該所得到之大小分佈係由物體的光散射特性加權。假若該粒子小於光的波長並且它們都具有相同的折射率，散射強度可以至少近似地轉譯為粒子濃度。當粒子的折射率隨大小變化時，如蛋白質聚集體的事例，直接比較係不可能的。在此種事例中，DLS對於確認在一大小範圍內之散射體的存在係為有用的。圖6呈現對於存在於圖3中之相同的BSA-PAH複合物樣品的DLS數據。對於兩種樣品，DLS顯露半徑小於100 nm之散射體的大量存在。DLS對於此大小之散射體的偵測閾值大概為108 聚集體/mL，如由獨立研究所測定。我們得出結論，兩種樣品具有至少這個濃度的次微米直徑聚集體。此等物體係小於我們全像視頻顯微鏡實施的偵測極限，且因此在圖3中係沒有解析的。
在添加鹽的樣品中，該分布偏移至較大的大小，一致於全像特性化技術的結果。兩種樣品對於流體動力半徑為2.8nm的微可見物體都顯示一非常小的訊號，由圖9中的箭頭所指出。這確認了此種散射體在我們的樣品中以剛好高於DLS對該大小物體之檢測閾值的一濃度存在。
具添加鹽的樣品在全像特性化技術偵測範圍內，於大約ah =400±20nm處亦具有一清楚的峰。圖5C中的對應峰出現在實質上較大的半徑處，ap =770±20nm。 此種分歧的一個可能來源為全像特性化技術報告了有效邊界球體的半徑，而DLS報告了流體動力學半徑，對於開放性結構，後者實質上可以更小。另一個促成因素係為較大的聚集體具有較低的有效折射率，且從而較諸較小的聚集體，散射光成比例地較不強烈。這種效應亦使DLS測量中的表觀大小分佈向下偏移。然而，其不影響全像特性化技術，該者獨立地報告每一物體的大小與折射率兩者。 全像分化開矽球體與蛋白質聚集體
DLS不能區分蛋白質聚集體與懸浮液中的其它粒子族群。MFI可以藉由形態分化一些這樣的污染物：舉例而言，矽液滴傾向於為球形的，而蛋白質聚集體傾向於具有不規則的形狀。形態分化對於實質上大於光波長的粒子工作最有效，該者的結構特徵不藉由繞射而遮蔽。透過其在個別粒子折射率上提供的資訊，全像特性化技術提供了一個額外藉由組成物來區分微米級物體的途徑。我們藉由在有意摻雜矽球體的BSA樣品上執行全像特性化技術測量而證明此能力。 矽球體之全像特性化技術
圖10A-B顯示分散在去離子水中之矽球體的全像特性化技術數據。圖10A中的樣品係比較單分散的，其具0.75±0.09 nm之一樣品平均半徑。圖10B中的粒子係從一較寬的大小分佈繪製，其具0.87±0.28 nm之一平均半徑。兩種球形樣品具有一致於先前針對具40%交聯之聚二甲基矽氧烷報導的折射率，np =1.388±0.005。此範圍在圖10A-B中係以一陰影區域指出。
不像蛋白質聚集體，這些粒子的折射率與其大小不相關。這在圖10B中的多分散樣品中最容易看出，並且一致於具有均勻密度且沒有孔隙的液滴。當這些矽球與蛋白質聚集體共分散時，我們預期見到單一粒子性質的相同分佈。 矽球體的分化偵測
圖11A中之數據係從如圖5A相同的條件下但加入4×106 個粒子/ml濃度之單分散矽球體而製備的BSA樣品獲得的。該所得到的粒子性質分佈係清楚地為雙峰的，其中一族群類似於從單單蛋白質聚集體獲得的，而另一族群具有一致於矽球體的折射率，np = 1.388±0.005。圖11B中的樣品相似地係在可比擬圖5C的條件下伴隨加入來自圖10B中之樣品的多分散矽球體而製備。關聯於圖5A-D與圖11A-B蛋白質聚集體特徵之間的一致性證明，無論是樣品製備方案，或是全像特性化技術，兩者在樣品與樣品間皆產生可再現的結果，且蛋白質聚集體之全像特性化技術不受外來雜質粒子的存在而影響。
有趣的是，兩個分佈在ap =2.8nm附近特別載有對應於來自圖9之DLS數據中之峰的一小峰。此特徵不存在於圖3A-F中。其係可能的是，此非常小的較大聚集體族群存在於那些樣品中，但濃度恰好低於在一10分鐘測量中的偵測閾值。
關聯於圖11A-B中矽液滴的特徵分佈亦與來自圖10A-B之單單液滴上的全像特性化技術數據良好地相符。這些結果證明，來自全像特性化技術的折射率數據對於區分蛋白質聚集體與矽油液滴可以為有用的。如從圖11A-D中該投影數據可以看出的，這種分化不可能單單基於該大小分佈。
全像特性化技術不能分化矽液滴及折射率相同於矽的蛋白質簇。對於在圖11A-D中分析的最小粒子，這種含糊性出現。在這些使用透過相同全像圖之反摺積分析獲得的形態數據條件下，球形矽液滴有時可以與不規則形狀的蛋白質聚集體區分開。在這些事例中，該區別仍然不如以共振質量測量(RMM)可以獲得的清楚，後者藉由其相對浮力的信號區分開矽與蛋白質。在特定粒子不能不含糊區分的事例中，矽液滴的存在仍然可以從全像特性化技術數據推斷出，因為此種粒子在折射率與大小無關之該(a p ,n p )平面中創造出一簇。該兩族群的相對豐度然後可以被推斷，舉例而言藉由統計集群法(statistical clustering methods)。 實例結果之討論
作為蛋白質聚集體性質的一光學探針，全像特性化技術與諸如庫爾特原理或共振質量測量(RMM)的非光學技術係互不相關的(orthogonal)。作為一成像技術，其涉及微流成像(MFI)與奈米粒子追踪分析(NTA)。然而，全像特性化技術受益於其大的有效景深及其監測折射率與大小的能力。因為MFI與全像特性化技術可以以單一快照分析單一粒子，兩者都固有地比依賴於時間序列分析的NTA快。
全像特性化技術亦涉及諸如動態光散射(DLS)與光遮蔽(light obscuration, LO)的光散射技術。較諸於動態光散射，其對微米級物體提供更大的計數靈敏度，且較諸於光遮蔽，存取更小的粒子而無需稀釋。不像其它散射技術，全像特性化技術不要求粒子的折射率作為輸入，而是提供折射率作為輸出。
這些技術之間的比較係於表I中總結，該者係為用於微可見蛋白質聚集體的高通量特性化技術的比較。該大小範圍意指由每一方法偵測到的有效球體的半徑。第四欄指出該技術是否能夠測量聚集體形態。參考文獻描述技術對於特性化蛋白質聚集體之能力的獨立評估。 表I.
於此呈現之該等測量證明全像視頻顯微鏡連同洛倫茲米氏分析一起可以偵測、計數並特性化微可見蛋白質聚集體。數據採集係迅速的，典型地不耗費超過15分鐘，並且不要求特殊的樣品製備。一種實施方式對於範圍在從300 nm至10 µm的半徑內並於從104 聚集體/ml至108 聚集體/ml之濃度內的聚集體為有效的。用於特性化測量的相同全像圖亦可以被解釋，以透過數值後推法(numerical back-propagation)估計個別蛋白質聚集體的形態。校準為易做的，僅要求該雷射波長、該顯微鏡之放大率及該介質的折射率。係為相信的是，此種蛋白質聚集體的全像特性化技術對於評估生物藥劑配方的安定性、對於製造期間的製程控制、及對於在銷售點與潛在地還有使用點兩者時的品質保證為有用的。 聚集體大小與折射率之間的反相關性(anticorrelation)
如上文所提到，在圖5A、5C與5E中顯露的聚集體大小與折射率之間係有一觀察到的強烈反相關性。這種情況不會由任何先前技藝的粒子特性化技術偵測到。再者，該單一粒子折射率的值實質上係小於在成像波長處蛋白質粒子所預期的大概1.45之值。更確切地，該最大粒子的估計折射率不比水之折射率1.335大。
大小與折射率之間的反相關性連同低的折射率值一起被識別為粒子孔隙度的特點。然而，不是均質多孔的，係為相信的是該蛋白質聚集體將具有透過聚集作用生長而天然出現的碎形結構(fractal structure)。
為了測試這個想法，蛋白質聚集體係模型化成碎形維度D之碎形簇(fractal cluster)。分形模型係被選擇用於預測密度，由於其與隨機聚集體之幾何的已知關係，且由於歸因於在單一參數(碎形維度D)上之依賴的簡化。熟習該項技藝者將理解的是，其它合適的模型可以使用，以預測該蛋白質聚集體的性質，包括密度。所以，在半徑之聚集體中，半徑之蛋白質的體積分率為(1)
該簇之此比例係由具有折射率的物質構成。該體積的剩餘部分推測係填充以該流體介質，該者具有一較低的折射率。該粒子整體之表觀折射率係藉由有效介質學說給定(2) 其中該洛倫茲洛倫茲(Lorenz-Lorentz)因子係為(3) 由此，(4)
即使與不是獨立地知道，這種尺度關係提供了一種手段，以藉由估計該整體平均(ensemble-averaged)碎形維度而特性化一聚集體族群的形態。
圖6A-B中之數據顯示了此一分析的結果。圖6(a)編譯了來自圖5A、5C與5E的所有數據，在所有三組生長條件下相同形態都會出現的假設之下。這假設在圖6(b)中得到證實，其顯示根據方程式(4)中該尺度關係繪製的相同數據。特別地，圖6(b)中的線性趨勢支持潛藏於方程式(4)的假設，包括該三個聚集體族群具有一致的生長習性的假設。
在圖6(b)之數據上疊加的虛線指出與D=1、1.2及1.4一致的斜率，而最佳相符係針對1.2獲得的。這結果表明，BSA聚集體為絲狀的，具很少的分支。該碎形模型可能使用於緻密團塊(D=3)、線性鏈(D=1)、以及在其間的結構(典型地3＞D＞1)。所以，該全像圖之表觀球形對稱性表明該聚集體係由絲狀簇構成。這與在可比擬條件下BSA聚集作用的電子顯微鏡研究一致。透過全像特性化技術估計該碎形維度改善了電子顯微鏡，因為其可以原位執行，且不承擔樣品製備中固有的任何結構轉變。全像特性化技術亦提供優於常規光散射的優點，因為其不要求對單體折射率估計。測量所要求的所有校準數據均可從單一粒子特性化數據及該儀器的總體校準中獲得。
此尺度分析的成功提供額外的證據，即對於個別蛋白質聚集體的半徑與折射率之全像估計值準確地反映該聚集體的實際性質。考慮到單一聚集體全像圖所觀察到的對稱性，諸如圖1(a)中之該實例，及其以該洛倫茲米氏結果對理想球體擬合的順從性，這個結果不是不合理的。這些觀察然後表明全像特性化技術對於分析個別蛋白質聚集體的性質可以為有效地，且所以用於評估蛋白質聚集體之分散液的性質。除了在蛋白質聚集體的大小分佈上提供資訊，全像特性化技術亦透過折射率提供了組成物與形態的洞察。
由全像特性化技術提供的資訊應對配製蛋白質分散液提供有用的反饋，特別是在聚集體大小必需被監測與限制的應用中。全像特性化技術的實時實施相似地對此種應用中的製程控制與品質保證應為有用的。 分化
圖5A、5C與5E例示在一實施例中本文所描述之系統與方法提供分化的能力。在此上下文中，「分化」係為將所欲物質，諸如蛋白質聚集體，與懸浮液中之其它物質區分開的能力。由全像特性化技術所提供之該折射率數據可以使用，以區分蛋白質聚集體與諸如矽液滴的污染物。此係為重要的，因為污染物，包括矽液滴與橡膠粒子，經常找到它們進入蛋白質溶液的方式，且可以被其它特性化技術誤認為蛋白質聚集體。這種誤識別可以表明該產品係有一問題，當沒有問題存在時，或不能識別污染的產品批次。
進一步，圖12A-C例示人類IgG、矽油、及然後組合在一樣品中之該二者。可以看出，該蛋白質聚集體(圖12A)與該矽油(圖12B)具有非常不同的特質(signature)，且當它們在相同樣品中時係為清楚可區分的(圖12C)。該矽油特質係為油乳液的一個教科書實例全像特性化技術，而該蛋白質可以很容易地區分。
使用本文描述之系統與方法，人們可以藉由其折射率分化物體，此係為一獨特的能力。從而，該分化係藉由與該折射率直接相關的實際組成物，而不是諸如形態(對於不同物質其可能為相同的，從而給出假結果，假陽性或假陰性兩者任一)的一些其它層面。舉例而言，一種流行的技術使用形態來區分矽與蛋白質，在矽液滴為球形，而蛋白質聚集體不是的假設下。然而，這種假設在許多重要的情況中失敗，包括對於大小低於該技術將其與球體分化開之能力的小蛋白質聚集體。 電腦實施
如圖7中所顯示，例如，一電腦可存取媒體120(例如，如本文所述的儲存裝置，諸如硬碟、軟碟、記憶棒、CD-ROM、RAM、ROM……等等，或其集合)可以提供的(例如，與該處理裝置110通訊)。該電腦可存取媒體120可能為一非暫時性電腦可存取媒體。該電腦可存取媒體120可以在其上含有可執行指令130。額外或替代地，一儲存裝置140可以與該電腦可存取媒體120分開提供地，其可以提供指令給該處理裝置110，以便配置該處理裝置以執行如本文所述的某些示範性程序、過程及方法，舉例而言。該等指令可能包括複數個指令組。舉例而言，在一些實施中，該等指令可能包括用於施加在複數個序列塊(sequence blocks)中之射頻能量(radio frequency energy)到一體積的指令，其中該等序列塊每一者包括至少一第一階段。該等指令可能進一步包括用於繼續重複該第一階段，直到於該序列塊之每一開始處的磁化為穩定的指令，用於將對應於該複數個序列塊之複數個成像段串連成單一連續成像段的指令，及用於將至少一鬆弛參數(relaxation parameter)編碼成該單一連續成像段的指令。
系統100亦可能包括一顯示器或輸出裝置；一輸入設備，諸如鍵盤、滑鼠、觸碰螢幕或其它輸入設備；並且可能經由一邏輯網路連接至額外的系統。本文描述的該等實施例許多可能使用邏輯連接至具有處理器的一或多個遠端電腦，在一網路化環境中實踐。邏輯連接可能包括一區域網路(LAN)及一廣域網路(WAN)，其等在本文呈現係作為實例而非限制。這種網路環境在遍及辦公室或遍及企業的電腦網路、網內網路及網際網路中為普通的，且可能使用各式各樣不同的通訊協定。熟習該項技藝者可以理解的是，此種網路運算環境典型地可以含括許多類型的電腦系統配置，包括個人電腦、手持裝置、多處理器系統、基於微處理器的或可編程的消費性電子產品、網路PC、迷你電腦、主機電腦、及之類。本發明之實施例亦可能在分散式運算環境中實踐，其中任務係藉由透過一通訊網路連結(藉由固線式連結、無線連結、或藉由固線式或無線連結之一組合)的本機及遠端處理裝置執行。在一分散式運算環境中，程式模組可能位於本機及遠端記憶儲存裝置兩者中。
各種實施例係於方法步驟之一般上下文中描述了，在一實施例中，其可能藉由包括電腦可執行指令(諸如程序代碼)的一程式產品來實施，藉由電腦在一網路環境中執行。一般來說，程式模組包括執行特定任務或實施特定抽像數據類型的例程、程式、物體、組件、數據結構……等等。電腦可執行指令、相關聯的數據結構、及程式模組代表用於執行本文所揭露方法之步驟的程式代碼的實例。此種可執行指令或相關聯數據結構的特別序列代表用於實施此等步驟中所描述之功能的對應動作的實例。
本發明之軟體及網路實施可以藉由具基於規則的邏輯與其它邏輯的標準編程技術而完成，以完成各種數據庫搜尋步驟、相關步驟、比較步驟及決定步驟。其亦應注意的是，本文及請求項中所使用的字詞「組件」與「模組」，係意欲涵蓋使用一或多行軟體碼的實施，及/或硬體實施，及/或用於接收手動輸入的設備。
關於本文中實質上任何復數及/或單數術語的使用，熟習該項技藝者可以根據上下文及/或應用適當地從複數轉換為單數及/或從單數轉換為複數。為了清楚起見，各種單數/複數置換可以於本文中明確闡述。
前述例示性實施例之描述為了例示及說明的目的已呈現了。該者並非意欲窮舉或限制於所揭露的準確形式，且鑒於上述教示，或可能從該等揭露實施例之實踐中獲得，修飾與變異係為可能的。所以，上文實施例不應視為本發明的發明範圍限制。
100‧‧‧系統
110‧‧‧處理裝置
120‧‧‧電腦可存取媒體
130‧‧‧指令
140‧‧‧儲存裝置
150‧‧‧埠
160‧‧‧記憶體
本揭示內容之前述與其它特徵從下列的說明及所附請求項結合伴隨圖式，將變得更充分顯而易見。理解這些圖式僅描寫了根據本揭露內容的幾個實施例，且所以不應被視為是對其發明範圍的限制，本揭示內容將透過使用該等伴隨圖式，藉由額外的特異性及細節而描述。
圖1A例示了一個1微米直徑BSA聚集體的測量全像。圖1B例示了基於光散射之洛倫茲米氏學說(Lorenz-Mie theory)的擬合。
圖2顯示了蛋白質聚集體在其通過一雷射光束時向下流過一微流體通道(microfluidic channel)型全像。一典型的實驗全像在該圖中係以一灰階影像再現的。每一全像係由攝像機記錄，並與洛倫茲米氏學說的預測比較，以測量每一聚集體的半徑a p 及折射率np 。 該嵌入的散佈圖顯示了針對牛胰島素之3000個微可見(subvisible)聚集體的實驗數據，每一數據點代表一單一聚集體的性質，而顏色表示在該(a p ,n p )平面中觀察的相對概率密度ρ(a p ,n p )。
圖3A為由四種不同類型粒子之混合物構成的異質膠體分散液以全像特性化技術獲得的半徑a p 與折射率n p 的散佈圖。針對20,000個粒子之結果係繪製。疊加的十字形指出製造商對該四個族群中每一者的規格。這些結果建立了全像特性化技術藉由組成物以及大小來判別粒子的能力。圖3B為膠體聚苯乙烯球體在水中的測量全像連同擬合，證明順從於全像特性化技術的粒子大小範圍。這些典型的實例係針對具半徑ap=0.237 mm(224像素×224像素感興趣區域)、0.800 mm(356像素×356像素)、及10.47 mm(608像素×608像素)之球體獲得的。對每一全像的擬合產生該粒子之半徑a p 及折射率n p 的值。徑向剖面(Radial profiles) b(r)係從這些全像及其擬合獲得，藉由對圍繞每一特徵中心的角度上的常態化強度進行平均，並且將其繪製為距該特徵中心之距離r的函數。實驗數據係繪製為陰影區域內較暗的(藍色)曲線，代表在該半徑處的測量不確定性。擬合以較淡的(橙色)曲線疊加，並緊密追隨該實驗數據。
圖4A-D顯示了聚集體形態在全像特性化技術上的影響。典型聚集體的全像按照測量與擬合全像之間提高的分歧順序排列。圖4A顯示了來自顯微鏡視野的160像素×160像素感興趣區域，集中於自動識別為BSA-PAH複合物候選的特徵上。圖4B顯示了對於由球體形成之全像的洛倫茲米氏學說擬合。圖4C顯示了以該擬合之徑向剖面(紅色曲線)覆蓋的該實驗全像之徑向剖面(黑色曲線)。陰影區域代表估計的實驗不確定性。圖4D顯示了從該實驗全像獲得之聚集體三維結構的瑞立-索末菲(Rayleigh-Sommerfeld)重建。灰階影像為該重建的投影，其在最佳焦點處類似於等效物(equivalent)明視野影像。疊加的圓圈指出對該粒子大小的擬合估計。
圖5A-F例示了污染物在BSA-PAH複合物之半徑a p 與折射率n p 之測量分佈上的衝擊。圖5A(折射率)與圖5B(大小分佈)例示與PAH複合之BSA在Tris緩衝液中的結果(1100聚集體)。圖5C(折射率)與圖5D(大小分佈)例示了與圖5A及5B相同樣品但具0.1 M NaCl者的結果(1200聚集體)；圖5E(折射率)與圖5F(大小分佈)例示了在如圖5C及5D相同條件下、伴隨加入矽球體而製備之樣品的結果(1600個特徵)。在該等散佈圖(圖5A、5C及5E)中的每一點代表一單一聚集體的性質，且藉由觀察的相對密度ρ(a p ,n p )上色。圖5B、5D與5F呈現在一陰影區域內的相關大小分佈ρ(ap)，代表儀器及統計誤差。
圖6A顯示對所有三種BSA樣品的組合數據。圖6B顯示根據方程式4重新縮放的數據。
圖7例示用於某些實施的電腦系統。
圖8A-8B顯示以微流成像及全像特性化技術測量之大小分佈的比較。每一箱(bin)代表約於該箱之中心半徑±100 nm範圍內的每毫升溶液之粒子數目。圖8A顯示不具添加鹽的樣品(圖5A-B之樣品)。圖8B顯示具添加NaCL的樣品(圖5C-D之樣品)。
圖9為藉由動態光散射(DLS)的BSA-PAH複合物之特性化。數值代表起因於一給定流體動力半徑ah 之散射體的散射光強度百分比P(ah )。箭頭指出在兩個分佈中ah =2.8mm附近的一小峰。
圖10A與10B顯示分散在去離子水中之矽球體的全像特性化技術數據。該灰色陰影區域表示基於其組成物對於這些粒子所預期的折射率範圍。圖10A顯示一單分散樣品(600個球體)。圖10B顯示一多分散樣品(600個球體)。
圖11A-11D顯示對於摻入添加矽球體的BSA-PAH複合物懸浮液，粒子半徑與折射率之相對概率密度r(a p ,n p )的全像測量。圖11A顯示在與圖5A-5B相同條件下製備，摻入來自圖10A之單分散球體(2000個特徵)的一樣品。圖11B顯示在與圖5C-5D相同條件下製備，摻入來自圖10B之多分散球體(1600個特徵)的一樣品。圖11C與11D分別地顯示對於來自圖11A與圖11B中之數據的粒子半徑的投影相對概率密度r(ap )。
圖12A-C例示了顯示蛋白質與矽油分開之區分的結果：圖12A顯示在PBS緩衝液中之1 mg/mL人類IgG，圖12B顯示在PBS緩衝液中之3 mg/mL矽油。如圖12C所顯示，這些樣品係一起混合在PBS緩衝液中，以0.5 mg/mL之人類IgG及1.5 mg/mL矽油的終濃度。所有測量係使用40X物鏡(Nikon 0.75NA)及100 µm深度微流體通道(µ-Slide VI 0.1 Uncoated)進行。
(無)

Claims (21)

  1. 一種用於特性化複數個蛋白質聚集體樣品的方法，其包含： 使樣品流過一全像顯微鏡的一觀察容積(observation volume)； 在一第一時間基於該觀察容積內的一第一組蛋白質聚集體的全像視頻顯微鏡來生成一第一組全像圖； 將該第一組蛋白質聚集體的每一蛋白質聚集體特性化成一球體；及 測定該第一組蛋白質聚集體之特性化球體的折射率及半徑。
  2. 如請求項1之方法，進一步包含： 在一第二時間基於該觀察容積內的一第二組蛋白質聚集體的全像視頻顯微鏡來生成一第二組全像圖； 將該第二組蛋白質聚集體的每一蛋白質聚集體特性化成一球體；及 測定該第二組蛋白質聚集體之每一蛋白質聚集體的折射率及半徑。
  3. 如請求項2之方法，其中該第一組與第二組之每一蛋白質聚集體的特性化進一步包含將該第一組與第二組之每一蛋白質聚集體模型化成一碎形維度(fractal dimension)D之碎形簇(fractal cluster)，其中：，Ф 為蛋白質之體積分率(volume fraction)，a0 為蛋白質半徑，而ap 為該蛋白質聚集體半徑。
  4. 如請求項2之方法，其中該蛋白質之體積分率具有一折射率n0 ，且剩餘體積係一具有折射率為nm 的流體介質，其產生該蛋白質聚集體之表觀折射率np 。
  5. 如請求項3之方法，進一步包含基於估計一整體平均(ensemble-averaged)的碎形維度來特性化該第一組蛋白質聚集體與該第二組蛋白質聚集體的形態。
  6. 如請求項4之方法，其中估計該整體平均的碎形維度包含：，其中，且。
  7. 如請求項1之方法，進一步包含基於該第一粒子折射率及半徑與該第二粒子折射率及半徑的比較，監測該複數個粒子的合成。
  8. 如請求項1之方法，其中流動該樣品係以高達100 μm s-1 之一速率。
  9. 如請求項1之方法，進一步包含在生成該第一組全像圖之前，加鹽。
  10. 如請求項1之方法，其中測定該折射率與半徑包含洛倫茲米氏學說(Lorenz-Mie theory)之應用。
  11. 如請求項1之方法，進一步包含測定該複數個粒子之合成是否已經結束。
  12. 如請求項1之方法，其中測定該第一組蛋白質聚集體之蛋白質聚集體的折射率與半徑，及測定該第二組蛋白質聚集體之蛋白質聚集體的折射率與半徑，包含：分別地測定對於該第一組蛋白質聚集體之蛋白質聚集體的折射率與半徑的概率密度(probability density)，及測定對於該第二組蛋白質聚集體之蛋白質聚集體的折射率與半徑的概率密度。
  13. 如請求項1之方法，其中至少一種蛋白質聚集體係存在於該第一組蛋白質聚集體與該第二組蛋白質聚集體兩者中，且其中該至少一種蛋白質聚集體的軌跡線(trajectory)係經測定的。
  14. 一種用於特性化複數個蛋白質聚集體的方法，其包含 生成該複數個蛋白質聚集體之蛋白質聚集體的全像圖，每一全像圖基於該複數個蛋白質聚集體之一蛋白質聚集體PN 在時間TN 的全像視頻顯微鏡；以及將該蛋白質聚集體特性化成球體； 測定該蛋白質聚集體PN 於時間TN 時的折射率及半徑； 基於該所測定的粒子折射率及半徑，特性化隨時間在該複數個蛋白質聚集體中的改變。
  15. 如請求項14之方法，進一步包含基於該所測定的折射率與半徑的比較，監測該複數個蛋白質聚集體的聚集作用。
  16. 如請求項14之方法，其中測定該折射率與該半徑包含洛倫茲米氏學說(Lorenz-Mie theory)之應用。
  17. 如請求項14之方法，進一步包含將該複數個蛋白質聚集體流過一全像視頻顯微鏡系統。
  18. 如請求項14之方法，其中該模型化進一步包含將該第一組與第二組之每一蛋白質聚集體模型化成碎形維度D之碎形簇，其中：，Ф 為蛋白質之體積分率，a0 為蛋白質半徑，而ap 為該蛋白質聚集體半徑。
  19. 如請求項18之方法，其中該蛋白質之體積分率具有一折射率n0 ，且剩餘體積係一具有折射率為nm 的流體介質，其產生蛋白質聚集體之表觀折射率np ， 且該方法進一步包含基於估計一整體平均的碎形維度來特性化該第一組蛋白質聚集體與該第二組蛋白質聚集體的形態。
  20. 如請求項19之方法，其中估計該整體平均的碎形維度包含：, 其中(2) 其中該洛倫茲洛倫茲(Lorenz-Lorentz)因子係為。
  21. 一種以電腦實施的機器，用於特性化複數個蛋白質聚集體，該機器包含： 一處理器； 一全像顯微鏡，其包含一同調光、一具有一觀察容積的試樣台、一物鏡及一影像收集裝置，該全像顯微鏡係與該處理器通訊；及 一有形的電腦可讀取媒體，可操作地連接到該處理器並且包括配置成進行下者的電腦代碼： 控制該樣品通過該全像顯微鏡之觀察容積的流動； 在第一時間基於該觀察容積內之第一組蛋白質聚集體的全像視頻顯微鏡來接收一第一組全像圖； 將該第一組蛋白質聚集體之每一蛋白質聚集體模型化成一球體； 測定該第一組蛋白質聚集體之每一蛋白質聚集體球體的折射率及半徑； 在第二時間基於該觀察容積內之第二組蛋白質聚集體的全像視頻顯微鏡來接收一第二組全像圖； 將該第二組蛋白質聚集體之每一蛋白質聚集體模型化成一球體；以及 測定該第二組蛋白質聚集體之每一蛋白質聚集體球體的折射率及半徑。
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