TW201623629A - 癌症檢測套組 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一引子組或探針，及一含有前揭引子組或探針的套組。前述套組係用以供分析一個體之MLH1的DNA序列、一MLH1的mRNA序列、及/或一cDNA序列(其係衍生自前述MLH1的mRNA)，以標定一MLH1編碼之蛋白質的V384突變。本發明之引子組、探針、及套組提供了較習用技術於前述標定需求上更好的專一性及敏感度。

Description

癌症檢測套組
本發明關於一種用於癌症檢測的套組；更明確地，是關於一種具有一引子組或一探針以標定V384D突變的套組。
在人類的歷史上，癌症很長一段時間被列為主要死亡原因。已有無數的研究聚焦於癌症的檢測與治療。可惜的是，絕大多數現今於臨床上使用的癌症治療方法仍不足以消除癌症的威脅。儘管如此，研究及臨床上的經驗已顯示越早期治療，越可提高癌症患者的存活率。這些證據支持了癌症檢測的重要性，尤其是在癌變的早期階段。
一般來說，癌變的檢測是藉由測定特定存在於癌症患者體內的生物標誌(biomarker)。該些生物標記物可能是特定由癌細胞釋出的物質、特定由癌細胞表現的細胞表面標誌(cell surface marker)、特定於癌細胞中沉默或過度表現的基因、或特定存在於癌細胞中的基因突變。
在最近的報導中提到，DNA錯配修復基因(hMLH1)的錯義突變於多種癌症中可作為生物標誌。hMLH1的V384D錯義突變最早是在大腸直腸癌中被觀察到，且經比對德國患者與華人患者，該錯義突變係特定出現於華人患者(Yaping Wang,et al,1997)。後續的研究已證實前述發現，而由張等人於西元2004年進行的研 究中更明確指出hMLH1的V384D錯義突變發生於四種癌症，包括大腸直腸癌、胃癌、乳癌、及食道癌。另一個由Xianzhe Shi等人於2003年的研究則顯示V384D錯義突變發生於肺癌。
前揭研究指出hMLH1的V384D錯義突變有潛力成為癌症檢測的候選標的。此外，本發明團隊所做研究亦進一步證實hMLH1的V384D錯義突變與肺癌的EGFR-TKIs療法的抗藥性相關(該實驗數據記載於後續段落)。
有鑑於此，經完善設計以供標定前述V384D突變的檢測工具對於醫藥產業及臨床上使用而言將有很大的幫助與價值。雖然目前已有部分研究揭露一些用於前揭目的的引子及探針，本發明的目標是提供專一性及敏感度更勝習知技術的引子組及/或探針。
爰是，本發明的一個目的為提供一種癌症檢測套組，其使用一可信賴的生物標誌。
本發明的另一個目的是提供一種套組，其用於評估EGFR-TKIs療法的效果及/或一個體經該療法後的無惡化期存活率(progression-free survival)，從而可於進行EGFR-TKIs療法後盡早規畫後續的治療。
為了達到上述目的，本發明提供一種用於檢測一個體之MLH1基因編碼蛋白質之V384突變的套組，其包含：一第一引子，其包含SEQ ID NO 06所示序列；及一第二引子，其包含SEQ ID NO 07所示序列。
較佳地，前述套組進一步包含一第三引子，其中前述第三引子包含SEQ ID NO 05所示序列。
較佳地，前述套組進一步包含一DNA聚合酶。
較佳地，前述套組進一步包含一雙股DNA結合染劑。
較佳地，前述雙股DNA結合染劑為SYBR® Green I、SYBR® Green II、SYBR® Gold、Oxazole Yellow、Thiazole Orange、或PicoGreen。
本發明又提供一種用於檢測一個體之MLH1基因編碼蛋白質之V384突變的套組，其包含：一第一引子，其包含SEQ ID NO 08所示序列；及一第二引子，其包含SEQ ID NO 09所示序列。
較佳地，前述套組進一步包含一DNA聚合酶。
較佳地，前述套組進一步包含一雙股DNA結合染劑。
較佳地，前述雙股DNA結合染劑為EvaGreen®。
本發明另提供一種用於檢測一個體之MLH1基因編碼蛋白質之V384突變的套組，其包含：至少一突變探針，其包含CAGATGGATC之序列(SEQ ID NO 10)；其中該探針係與一螢光體共軛；及/或至少一野生型探針，其包含CAGATGGTTC之序列(SEQ ID NO 11)；其中該探針係與一螢光體共軛。
較佳地，前述至少一突變探針及/或前述至少一野生型探針係進一步與一淬滅體(quencher)共軛。
較佳地，前述螢光體係共軛於前述探針的5’端，且前述淬滅體係共軛於前述探針的3’端。
較佳地，前述至少一突變探針包含SEQ ID NO 17所示序列。
較佳地，前述至少一野生型探針包含SEQ ID NO 16所示序列。
較佳地，前述至少一突變探針及/或前述至少一野生型探針中的至少一個核苷酸係經修飾以於其2’位置的氧原子及4’位置的碳原子之間形成橋接。
較佳地，前述突變探針包含SEQ ID NO 19所示序列：5’-CACCAGATGGATCGTACA-3’。
較佳地，前述突變探針自5’端數至3’端的第5、第8、第11、及第14個核苷酸係經修飾以於其2’位置的氧原子及4’位置的碳原子之間形成橋接。
較佳地，前述野生型探針包含SEQ ID NO 18所示序列：5’-CACCAGATGGTTCGTACA-3’。
較佳地，前述野生型探針自5’端數至3’端的第5、第8、第11、及第14個核苷酸係經修飾以於其2’位置的氧原子及4’位置的碳原子之間形成橋接。
較佳地，前述套組進一步包含一錨探針，其中該錨探針係與一螢光體供體共軛。
較佳地，前述至少一突變探針包含SEQ ID NO 21所示序列，且係與一螢光體受體共軛。
較佳地，前述至少一野生型探針包含SEQ ID NO 20所示序列，且係與一螢光體受體共軛。
較佳地，前述錨探針包含SEQ ID NO 22所示序列。
較佳地，前述套組進一步包含一引子組，其中前述引子組用於放大前述MLH1基因的至少一部分以取得一複製體；其中前述複製體包含一相應於前述V384突變的位置。
較佳地，前述引子組為：一順向引子，其包含SEQ ID NO 12所示序列，及一逆向引子，其包含SEQ ID NO 13所示序列；及/或一順向引子，其包含SEQ ID NO 14所示序列，及一逆向引子，其包含SEQ ID NO 15所示序列。
較佳地，前述套組進一步包含一DNA聚合酶。
總結來說，本發明提供一新穎的引子組或探針，以供檢測一MLH1基因的V384突變。本發明亦提供包含該引子組或探針的套組。透過使用本發明的套組，對於V384突變的檢測可以較習用技術更具專一性及敏感度。
第一圖顯示實施例一之即時同步聚合酶連鎖反應的實驗結果(n=2)；其中SEQ ID NO 07/SEQ ID NO 05引子組的實驗結果係標示為曲線(1)，SEQ ID NO 05/SEQ ID NO 06引子組的實驗結果係標示為曲線(2)，及負向控制組的實驗結果係標示為曲線(3)。(A)不具有V384D突變之個體的基因組DNA。(B)具有V384D突變之個體的基因組DNA(異型合子)。(C)人造質體，其經建立有野生型MLH1基因的部分序列(同型合子)。(D)人造質體，其經建立有帶T1151A突變的MLH1基因的部分序列(同型合子)。
第二圖顯示實施例二之HRM試驗法的實驗結果(n=2)。(A)標準階段；(B)熔離曲線階段。曲線1：人造質體，其經建立有野生型MLH1基因的部分序列(同型合子)。曲線2：人造質體，其經建立有帶T1151A突變的MLH1基因的部分序列(同型合子)。
第三圖顯示實施例三之TaqMan試驗法的實驗結果(n=2)。(A)人造質體，其經建立有野生型MLH1基因的部分序列(同型合子)。(B)人造質體，其經建立有帶T1151A突變的MLH1基因的部分序列(同型合子)。曲線(1)：野生型探針(負探針，ML-TP-Wt，SEQ ID NO 16)；曲線(2)：突變探針(正探針，ML-TP-Mt，SEQ ID NO 17)；曲線(3)：控制組(未使用探針)。
第四圖顯示實施例四之LNA試驗法的實驗結果(n=3)。(A)：人造質體，其經建立有野生型MLH1基因的部分序列(同型合子)。(B)人造質體，其經建立有帶T1151A突變的MLH1基因的部分序列(同型合子)。曲線(1)：野生型探針(負探針，ML-TP-Wt，SEQ ID NO 18)；曲線(2)：突變探針(正探針，ML-TP-Mt，SEQ ID NO 19)；曲線(3)：控制組(未使用探針)。
第五圖顯示實施例五之FRET試驗法的實驗結果(n=2)。(A) (B)：使用ML-sensor-Wt(SEQ ID NO 20)探針及ML-anchor(SEQ ID NO 22)探針。(C)(D)：使用ML-sensor-Mt(SEQ ID NO 21)探針及ML-anchor(SEQ ID NO 22)探針。曲線(1)：人造質體，其經建立有野生型MLH1基因的部分序列(同型合子)。曲線(2)：人造質體，其經建立有帶T1151A突變的MLH1基因的部分序列(同型合子)。曲線(3)：控制組(未添加模板)。曲線(4)：VP13_0052(異型合子)。曲線(5)：VP13_0055(野生型；同型合子)。
本研究提供合適於分析MLH1的DNA序列、MLH1的mRNA序列、及/或MLH1的cDNA序列(其係衍生自前述MLH1的mRNA序列)的引子組及/或探針，以測定一個體之MLH1基因編碼之蛋白質是否帶有V384突變。
前述突變的測定可以提供可信的該經檢測的個體已患有癌症的可能性，如大腸直腸癌、胃癌、乳癌、食道癌、肺癌、或其組合。此外，在肺癌的治療中，於一個體中測定出前述突變可提供資訊以供評估EGFR-TKIs療法的效果及/或評估該個體經EGFR-TKIs療法治療後的無惡化期存活率。
本文中所述「EGFR-TKI療法」係指一種標靶治療，其係基於許多非小細胞肺癌患者的腫瘤細胞之表皮生長因子受體的酪氨酸激酶結構域皆帶有一體突變。更明確的說，「EGFR-TKI療法」係藉由使用一EGFR酪氨酸激酶抑制劑以標靶於腫瘤細胞之表皮生長因子受體的酪氨酸激酶結構域的體突變來進行。
本文中所述「EGFR-TKI療法的效果」係指EGFR-TKI療法對於腫瘤之惡化的影響。如果在一EGFR-TKI療法開始後的3個月內腫瘤仍持續惡化，該療法則被視為在臨床上是沒有效果的。反過來說，如果該腫瘤至少在尺寸上有30%的縮小，該療法則被認定對於該個體有效果。
本文中所述「無惡化期存活率」係指從一治療的起始日起算至觀察中的腫瘤又開始惡化之時間點之間的時期。換句話說，該名詞係指腫瘤沒有惡化或尺寸縮小的該時期的歷時長度。
本文中所述「分析」係指以至少一技術手段評估或檢視一個體的性質。所述技術手段包括但不限於聚合酶連鎖反應、南方墨點法、或西方墨點法。
本文中所述「MLH1基因編碼之蛋白質的V384突變」係指，一存在於MLH1基因序列中的突變，其導致一MLH1基因編碼之蛋白質的V384位置胺基酸產生突變。在本發明的一個可行實施態樣中，前述V384突變係指一MLH1基因編碼之蛋白質的V384D突變。在一可行實施態樣中，前述V384D突變可被辨識於前述MLH1基因之cDNA的T1151A突變或前述MLH1基因之mRNA的T1349A突變。本文中所述「野生型」係為一相對性的詞彙，意指沒有前述突變的基因及/或蛋白質。
本文中所述「V384」係指一MLH1蛋白質(即，一MLH1基因編碼之蛋白質)的胺基酸序列中的第384個胺基酸；其中「V」係纈胺酸(Valine；Val)的縮寫。本文中所述「V384突變」係指該位於第384個胺基酸的纈胺酸經改變為另一個非纈胺酸的胺基酸。本文中所述「V384D突變」係指該位於第384個胺基酸的纈胺酸經改變為天門冬胺酸；其中「D」係天門冬胺酸(Aspartic acid；Asp)的縮寫。請參考SEQ ID NO 01所示具有前述突變的胺基酸序列，以及SEQ ID NO 02所示具有前述突變的DNA序列。
本文中所述「T1349」係指一編碼為一MLH1蛋白質之mRNA的核苷酸序列的第1349個核苷酸；其中「T」係胸腺嘧啶的縮寫。本文中所述「T1349突變」係指該位於第1349個核苷酸的胸腺嘧啶係突變為另一個非胸腺嘧啶的核苷酸。本文中所述「T1349A突變」係指該位於第1349個核苷酸的胸腺嘧啶係突變為腺嘌呤；其中「A」係腺嘌呤的縮寫。請參考SEQ ID NO 03所示具有前述突變的mRNA序列。
本文中所述「T1151」係指一編碼為一cDNA的核苷酸序列的第1151個核苷酸；其中該cDNA係源自前述MLH1基因的mRNA；「T」係胸腺嘧啶的縮寫。本文中所述「T1151突變」係指該位於第1151個核苷酸的胸腺嘧啶係突變為另一個非胸腺嘧啶的核苷酸。本文中所述「T1151A突變」係指該位於第1151個核苷酸的胸腺嘧啶係突變為腺嘌呤；其中「A」係腺嘌呤的縮寫。請參考SEQ ID NO 04所示具有前述突變的cDNA序列。
引子組、探針、及使用該引子組、探針的套組 第一面向
在本發明的第一個面向中，使用一引子組檢測一MLH1基因編碼之蛋白質的V384突變。前述「一MLH1基因編碼之蛋白質的V384突變」係如前述段落中所定義者。較佳地，前述檢測係藉由使用前述引子組之即時同步聚合酶連鎖反應(real-time PCR)來進行。
在本發明的第一個面向中，提供一用於測定一MLH1基因編碼之蛋白質的V384突變的套組。前述套組包含一引子組，而前述引子組係經設計以供分析MLH1的DNA序列、MLH1的mRNA序列、及/或MLH1的cDNA序列(其係衍生自前述MLH1的mRNA序列)，以測定一個體之MLH1基因編碼之蛋白質是否帶有V384突變。
在一較佳實施態樣中，前述引子組包含一第一引子及一第二引子。前述第一引子係經設計以包含一序列，該序列可與一帶有前述V384突變的MLH1基因於V384位置雜合。前述第二引子係經設計以包含一序列，該序列可與一MLH1基因的序列保留區域(conserved region)雜合。若檢測到前述第一引子與前述第二引子之聚合酶連鎖反應產物的存在，即代表存在前述V384突變。
本文中所述「可與一帶有前述V384突變的MLH1基因於V384 位置雜合」意指前述序列可與前述MLH1基因中編碼為前述V384突變之密碼子的至少一個核苷酸形成鹼基配對(base-pairing)。領域中習知一密碼子包含三個核苷酸。在一較佳實施態樣中，前述序列可與前述MLH1基因中編碼為前述V384突變之密碼子的至少兩個核苷酸形成鹼基配對。
本文中所述「MLH1基因的序列保留區域」意指前述MLH1基因的一段序列，其係於野生型MLH1基因與帶有前述V384突變之MLH1基因之間保留或沒有改變者。本文中所述「野生型」係為一相對性的詞彙，意指沒有前述突變的基因及/或蛋白質。
在一可行實施態樣中，前述套組進一步包含一第三引子。前述第三引子係經設計以包含一序列，該序列可與一野生型MLH1基因於V384位置雜合。所述「可與...雜合.」係如前揭段落中所定義的。
在一較佳實施態樣中，前述套組包含一如SEQ ID NO 06所示的第一引子，一如SEQ ID NO 07所示的第二引子，以及一如SEQ ID NO 05所示的第三引子。此實施態樣係供SYBR-green試驗法使用。檢測到前述第一引子及前述第二引子之聚合酶連鎖反應產物的存在即表示存在前述V384突變，而在這個實施態樣中，前述第三引子與前述第二引子的產物係為控制組。
在另一實際的實施態樣中，前述套組包含一如SEQ ID NO 08所示的第一引子，以及一如SEQ ID NO 09所示的第二引子。此實施態樣係供一高解析熔離試驗法(High Resolution Melting；HRM)使用。在一HRM試驗法中，當處於標準階段時，所使用的DNA結合染劑會結合至所取得的聚合酶連鎖反應產物，從而偵測到螢光。當處於熔離曲線階段，該聚合酶連鎖反應產物將被熔離(melted)從而可偵測到該DNA結合染劑之螢光的衰退。藉由比較一野生型控制組或一突變型控制組之樣本的衰退型態，即可辨識出該V384突變。
在一較佳實施態樣中，前述套組進一步包含一DNA聚合酶及/或一DNA結合染劑。較佳地，前述DNA聚合酶係為，但不限於，Pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、或其組合。較佳地，前述DNA結合染劑係為，但不限於，SYBR® Green I、SYBR® Green II、SYBR® Gold、Oxazole Yellow、Thiazole Orange、PicoGreen、EvaGreen®、或其組合。
第二面向
在本發明的第二面向中，使用一探針檢測一MLH1基因編碼之蛋白質的V384突變。前述「一MLH1基因編碼之蛋白質的V384突變」係如前述段落中所定義者。
在本發明的第一個面向中，提供一用於測定一MLH1基因編碼之蛋白質的V384突變的套組。
在一較佳實施態樣中，前述套組包含一探針，其係經設計以供分析MLH1的DNA序列、MLH1的mRNA序列、及/或MLH1的cDNA序列(其係衍生自前述MLH1的mRNA序列)，以正向測定或負向測定一個體之MLH1基因編碼之蛋白質是否帶有V384突變。
在以正向測定的情況下測定V384突變時，前述探針(即，突變探針)係經設計以雜合於前述MLH1基因之體DNA、mRNA、及/或cDNA的一片段；其中前述片段含有一相應於一MLH1基因編碼之蛋白質的前述V384突變的序列。舉例來說，前述片段可含有前述mRNA之T1349A突變，或前述cDNA的T1151A突變。透過檢視雜合的結果，可測定前述V384突變的存在。在此正向測定的情況中，檢測到前述探針與該標的位置的雜合訊號即表示存在V384突變。在一較佳實施態樣中，前述突變探針包含CAGATGGATC之序列(SEQ ID NO 10)。
在以負向測定的情況下測定V384突變時，前述探針(即，野 生型探針)係經設計以雜合於一野生型MLH1基因之體DNA、mRNA、及/或cDNA的一片段。在此負向測定的情況下，無法檢測到前述探針與該標的位置的雜合訊號即表示不存在野生型MLH1基因，即表示可能存在V384突變。在一較佳實施態樣中，前述野生型探針包含CAGATGGTTC之序列(SEQ ID NO 11)。
儘管如此，該所屬領域具有通常知識者可理解受測個體可能帶有異型合子之MLH1基因型。也就是說該個體之MLH1基因的其中一個對偶基因(allele)為野生型，而另一對偶基因則具有V384突變。在這樣的情況下，最好是使用突變探針，或一併使用突變探針及野生型探針以進行檢測。
較佳地，前述探針(突變探針或野生型探針)係經修飾以達成前述標的前述MLH1基因之V384突變的目的。在本發明的一個實施態樣中，前述探針係與一螢光體及/或一同位素共軛。在一較佳實施態樣中，前述探針係與一螢光體及一淬滅體共軛(TaqMan方法)。在一較佳實施態樣中，前述探針係進一步經修飾以於其2’位置的氧原子及4’位置的碳原子之間形成橋接(此法為LNA方法)。在一較佳實施態樣中，前述套組包含一突變探針及/或一野生型探針，及一錨探針(anchor probe)(此法為FRET方法)。
較佳地，前述螢光體係共軛於前述探針的5’端，且前述淬滅體係共軛於前述探針的3’端。前述螢光體包括但不限於：6-羧基螢光體、四氯螢光體(tetrachlorofluorescein)、FAM、VIC、LC640、或其組合。前述淬滅體包括但不限於：四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine)、BHQ1、或其組合。
在本發明的一個較佳實施態樣中，前述套組係經設計以供用於一以聚合酶連鎖反應技術為基礎的TaqMan試驗法。前述套組包含一突變探針，其包含SEQ ID NO.17所示序列，及/或一野生型探針，其包含SEQ ID NO.16所示序列。前揭兩種探針分別皆於其兩端與一螢光體及一淬滅體共軛。
在一較佳實施態樣中，前述套組係經設計以供用於一以聚合酶連鎖反應技術為基礎的LNA(locked nucleic acid)試驗法。前述套組包含一突變探針，其包含SEQ ID NO.19所示序列，及/或一野生型探針，其包含SEQ ID NO.18所示序列。前揭兩種探針皆於其兩端分別與一螢光體及一淬滅體共軛。
較佳地，包含SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.18所示序列之前述探針具有至少一核苷酸係經修飾以於其2’位置的氧原子及4’位置的碳原子之間形成橋接，從而形成一閉鎖核酸(locked nucleic acid)。舉例來說，前述探針的第5、8、11、及14個核苷酸(從5’端起算至3’端)係經修飾以於其2’位置的氧原子及4’位置的碳原子之間形成橋接。
在一較佳實施態樣中，前述套組係經設計以供用於一以聚合酶連鎖反應技術為基礎的FRET(Fluorescence resonance energy transfer)試驗法。在一實際的實施態樣中，前述套組包含一突變探針及/或一野生型探針，及一錨探針(anchor probe)。前述突變探針或野生型探針係與一第一螢光體共軛以作為受體，且前述錨探針係與一第二螢光體共軛以作為供體。較佳地，前述突變探針包含SEQ ID NO.21所示序列，前述野生型探針包含SEQ ID NO.20所示序列，且前述錨探針包含SEQ ID NO.22所示序列。在一較佳實施態樣中，前述套組包含前述突變探針、前述野生型探針、及前述錨探針。
在一較佳實施態樣中，前述第一螢光體係FAM、HEX、LC Red 640、Cy5、或其組合。在一較佳實施態樣中，前述第二螢光體係螢光素(fluorescein)。
在一可行實施態樣中，前述套組進一步包含一DNA聚合酶。較佳地，前述DNA聚合酶具有核酸外切酶的活性。
在一較佳實施態樣中，前述套組進一步包含一引子組以供放大前述MLH1基因的至少一部份，從而取得一複製體(amplicon)； 其中前述複製體包含一相應於前述V384的位置。前述引子組可為：- 一順向引子，其包含SEQ ID NO 12所示序列，及一逆向引子，其包含SEQ ID NO 13所示序列；及/或- 一順向引子，其包含SEQ ID NO 14所示序列，及一逆向引子，其包含SEQ ID NO 15所示序列。
下表1係列出前揭段落中所提到的本發明的引子組及探針，並一併列出其所應用的技術。
實施例一：驗證本發明所設計的引子組(SYBR Green試驗法)。
在此實施例中，使用引子SB-MT-sF3(SEQ ID NO 06)、SB-sR3(SEQ ID NO 07)、及SB-WT-sF3(SEQ ID NO 05)進行即時同步聚合酶連鎖反應，以驗證前述引子用於標定V384D突變的能力。
這些實驗中使用了4種模板(template)，包括：一純化自不帶有V384D突變之個體的總DNA、一純化自帶有V384D突變之個體的總DNA(異型合子)、一人造質體，其經建立有野生型MLH1基因的部分序列(同型合子)、及一人造質體，其經建立有帶T1151A突變的MLH1基因的部分序列(同型合子)。本實施例中所用模板及引子組係列於下表二中。
該些實驗係參考EZtimeTM Real Time PCR premix(Yeastern Biotech Co.,Ltd.)的產品說明書來進行。實驗中所準備的聚合酶連鎖反應反應混合物包含：1.0μl的模板(若使用總DNA作為模 板，則添加2.5μg/μl之濃度；若使用質體模板，則添加1μg/μl之濃度)、12.5μl之2X EZtime Real-time PCR Premix、1.0μl之順向引子(5μM)、1.0μl之逆向引子(5μM)、及9.5μl之ddH2O。反應條件為：95℃下變性10分鐘、95℃下變性20秒、66℃下黏合/延伸1分鐘、並重複40個循環；接著，在熔離曲線階段：95℃下15秒、60℃下1分鐘、95℃下30秒、60℃下15秒。本實驗中所使用的即時同步聚合酶連鎖反應設備為7500 Fast(Applied Biosystem)，並搭載Open 7500 Software v2.0.6。
實驗結果係顯示於第一圖(A)至(D)；其中引子組SEQ ID NO 07/SEQ ID NO 06的實驗結果標示為曲線(1)、引子組SEQ ID NO 05/SEQ ID NO 06的實驗結果是示為曲線(2)、負向控制組的實驗結果標示為曲線(3)。
根據該些實驗結果，該野生型引子組(SEQ ID NO 05/SEQ ID NO 07)僅能放大野生型MLH1的序列(第一圖A、B、及C)，而該突變型引子組(SEQ ID NO 06/SEQ ID NO 07)僅能放大帶有V384D突變之MLH1的序列(第一圖B及D)。
第一圖A中所示放大圖譜僅有顯示曲線(1)，代表實驗中的樣本確實為同型合子的野生型樣本。另一方面，第一圖B中所示放大圖譜顯示有曲線(1)及曲線(2)，代表實驗中的樣本確實為異型合子。使用人造質體的第一圖C及第一圖D則分別僅有顯示曲線(1)及曲線(2)，表示該二圖式之實驗中的樣本確實為同型合子。
這些實驗數據顯示本發明之突變型引子組可以專一地標定MLH1基因的V384D突變，且本發明之野生型可以專一地標定不帶有V384D突變之MLH1基因。這樣的結果證實本發明之引子組可清楚地標定出一樣本的V384D突變，並具有優異的專一性及敏感度。
實施例二：驗證本發明所設計的引子組(HRM試驗法)。
在此實施例中，使用引子HR-1-F(SEQ ID NO 08)及HR-1-R(SEQ ID NO 09)進行即時同步聚合酶連鎖反應，以驗證前述引子用於標定V384D突變的能力。
這些實驗中使用了2種模板，包括：一人造質體，其經建立有野生型MLH1基因的部分序列(同型合子)、及一人造質體，其經建立有帶T1151A突變的MLH1基因的部分序列(同型合子)。
該些實驗係參考產品說明書來進行。簡單地說，實驗中所準備的聚合酶連鎖反應反應混合物包含：20ng的模板、Brilliant HRM Ultra-Fast Loci Master Mix、0.5μM的順向引子(HR-1-F)、0.5μM的逆向引子(HR-1-R)。反應條件為：95℃下預反應3分鐘、95℃下變性5秒鐘60℃下黏合/延伸10秒鐘、並重複40個循環；接著，在熔離曲線階段：95℃下30秒、65℃下30秒、95℃下30秒。本實驗中所使用的即時同步聚合酶連鎖反應設備為Agilent Mx3000p(Applied Biosystem)，搭載Open Applied Biosystem Software，並依據前揭所記載的條件設定各項參數。
第二圖顯示本實施例之HRM試驗法的實驗結果。值得注意的是引子組(HR-1-F/HR-1-R)能放大野生型MLH1基因序列及帶有V384D突變之MLH1基因(第二圖A)。在熔離階段，由於突變型具有核苷酸的錯誤配對，因此其具有不同於野生型的分離曲線(dissociated curve)。曲線(2)之訊號的衰退型態顯示突變的存在(第二圖B)，這樣的結果證實了本發明的引子組的確可以辨識出V384突變。
實施例三：驗證本發明所設計的探針(TaqMan試驗法)。
在此實施例中，使用引子TP-2-F(SEQ ID NO 12)及TP-1-R(SEQ ID NO 13)進行即時同步聚合酶連鎖反應。並且，使用一突變探針(ML-TP-Mt；SEQ ID NO 17；經VIC及TAMRA標籤) 及一野生型探針(ML-TP-Wt；SEQ ID NO 16；經FAM及TAMRA標籤)以驗證其辨識該V384D突變的能力。
這些實驗中使用了2種模板，包括：一人造質體，其經建立有野生型MLH1基因的部分序列(同型合子)、及一人造質體，其經建立有帶T1151A突變的MLH1基因的部分序列(同型合子)。
該些實驗係參考產品說明書來進行。簡單地說，實驗中所準備的聚合酶連鎖反應反應混合物包含：2.0μl(25ng/μl)的模板、10μl的2X Brilliant III Ultra-Fast QPCR Master Mix(其含有Low ROX)、1.0μl的順向引子(10μM)、1.0μl的逆向引子(10μM)、0.5μl的ML-TP-Wt(10μM)、0.5μl的ML-TP-Mt(10μM)、5.0μl的ddH2O。反應條件為：95℃下變性3分鐘、95℃下變性12秒、55℃下黏合30秒、72℃下延伸1分鐘，並重複40個循環。本實驗中所使用的即時同步聚合酶連鎖反應設備為7500 Fast(Applied Biosystem)，搭載Open 7500 Software v2.0.6，並依據前揭所記載的條件設定各項參數。
實驗結果係顯示於第三圖。ML-TP-Wt探針可專一地檢測出野生型MLH1基因序列(第三圖A)，而ML-TP-Mt探針可專一地檢測出突變型MLH1基因序列(第三圖B)。這些實驗結果驗證了本發明的探針於偵測該V384突變上具有優異的專一性。
實施例四：驗證本發明所設計的探針(LNA試驗法)。
在此實施例中，使用引子TP-2-F(SEQ ID NO 12)及TP-2-R(SEQ ID NO 13)進行即時同步聚合酶連鎖反應。並且，使用一突變探針(ML-LNA-Mt；SEQ ID NO 19；經VIC及BHQ1標籤)及一野生型探針(ML-LNS-Wt；SEQ ID NO 18；經FAM及BHQ1標籤)以驗證其辨識該V384D突變的能力。
這些實驗中使用了2種模板，包括：一人造質體，其經建立有野生型MLH1基因的部分序列(同型合子)、及一人造質體，其 經建立有帶T1151A突變的MLH1基因的部分序列(同型合子)。
該些實驗係參考產品說明書來進行。簡單地說，實驗中所準備的聚合酶連鎖反應反應混合物包含：5.0μl(2.5ng/μl)的模板或做為控制組的質體DNA、12.5μl的2X EZtime Real-time PCR Premix、1.0μl的順向引子(10μM)、1.0μl的逆向引子(10μM)、0.5μl的ML-LNA-Wt(10μM)、0.5μl的ML-LNA-Mt(10μM)、4.5μl的ddH2O。反應條件為：95℃下變性10分鐘、95℃下變性15秒、50℃下黏合、72℃下延伸1分鐘，並重複40個循環；且於熔離曲線階段下：95℃下15秒、60℃下1分鐘、95℃下30秒、60℃下15秒。本實驗中所使用的即時同步聚合酶連鎖反應設備為7500 Fast(Applied Biosystem)，搭載Open 7500 Software v2.0.6，並依據前揭所記載的條件設定各項參數。
實驗結果係顯示於第四圖。ML-LNA-Wt探針可專一地檢測出野生型MLH1基因序列(第四圖A)，而ML-LNA-Mt探針可專一地檢測出突變型MLH1基因序列(第四圖B)。這些實驗結果驗證了本發明的探針於偵測該V384突變上具有優異的專一性。
實施例五：驗證本發明所設計的探針(FRET試驗法)。
在此實施例中，使用引子FR-1-F(SEQ ID NO 14)及FR-1-R(SEQ ID NO 15)進行即時同步聚合酶連鎖反應。並且，使用一突變探針(ML-sensor-Mt；SEQ ID NO 21；經LC640標籤)、一野生型探針(ML-sensor-Wt；SEQ ID NO 20；經LC640標籤)、及一錨探針(ML-anchor；SEQ ID NO 22；經螢光素標籤)以驗證其辨識該V384D突變的能力。
這些實驗中使用了2種模板，包括：一人造質體，其經建立有野生型MLH1基因的部分序列(同型合子)、及一人造質體，其經建立有帶T1151A突變的MLH1基因的部分序列(同型合子)。此外，於本實驗中並使用兩個臨床採集的樣本(VP13_0055及 VP13_0052)。VP13_0055是一野生型的同型合子，而VP13_0052是一突變的異型合子(此係經本研究先前採用次世代定序法(Ion PGM System)的實驗驗證，但此數據並未揭露於此)。
該些實驗係參考產品說明書來進行。簡單地說，實驗中所準備的聚合酶連鎖反應反應混合物包含：5.0μl(2.5ng/μl)的模板、2.0μl的10X LightCycler FastStart DNA Master HybProbe、1.0μl的順向引子(10μM；SEQ ID NO 14)、1.0μl的逆向引子(10μM；SEQ ID NO 15)、0.4μl的ML-sensor-Wt(10μM)、0.4μl的ML-sensor-Mt(10μM)、0.4μl的ML-anchor(10μM)、8.6μl的ddH2O。反應條件為：95℃下變性10分鐘、95℃下變性10秒、55℃下黏合10秒、72℃下延伸30秒，並重複45個循環；且於熔離曲線階段下：95℃下1分鐘、40℃下2分鐘、95℃下1分鐘。本實驗中所使用的即時同步聚合酶連鎖反應設備為LightCycler 480 Real-Time PCR System(Roche)，搭載Open LightCycler 480 software 1.5，並依據前揭所記載的條件設定各項參數。
實驗結果係顯示於第五圖。ML-sensor-Wt探針及ML-anchor探針可專一地檢測出野生型MLH1基因序列，而ML-sensor-Mt探針及ML-anchor探針可專一地檢測出突變型MLH1基因序列。當使用ML-sensor-Wt探針及ML-anchor探針時，可觀察到野生型質體(曲線1)及VP13_0055(曲線5)皆表現出熔離曲線(第五圖A及B)。當使用ML-sensor-Mt探針及ML-anchor探針時，可觀察到突變型質體(曲線2)表現出熔離曲線(第五圖C及D)。此外，VP13_0052(曲線4)由於是異型合子，所以不論使用ML-sensor-Wt探針及ML-anchor探針、或ML-sensor-Mt探針及ML-anchor探針，皆表現出融離曲線(第五圖A及C)。這些實驗結果驗證了本發明的探針於偵測該V384突變上具有優異的專一性。

Claims (26)

  1. 一種用於檢測一個體之MLH1基因編碼蛋白質之V384突變的套組，其包含：一第一引子，其包含SEQ ID NO 06所示序列；及一第二引子，其包含SEQ ID NO 07所示序列。
  2. 如請求項第1項所述套組，其進一步包含一第三引子，其中前述第三引子包含SEQ ID NO 05所示序列。
  3. 如請求項第1項所述套組，其進一步包含一DNA聚合酶。
  4. 如請求項第1項所述套組，其進一步包含一雙股DNA結合染劑。
  5. 如請求項第4項所述套組，其中前述雙股DNA結合染劑為SYBR® Green I、SYBR® Green II、SYBR® Gold、Oxazole Yellow、Thiazole Orange、或PicoGreen。
  6. 一種用於檢測一個體之MLH1基因編碼蛋白質之V384突變的套組，其包含：一第一引子，其包含SEQ ID NO 08所示序列；及一第二引子，其包含SEQ ID NO 09所示序列。
  7. 如請求項第6項所述套組，其進一步包含一DNA聚合酶。
  8. 如請求項第6項所述套組，其進一步包含一雙股DNA結合染劑。
  9. 如請求項第8項所述套組，其中前述雙股DNA結合染劑為EvaGreen®。
  10. 一種用於檢測一個體之MLH1基因編碼蛋白質之V384突變的套組，其包含：至少一突變探針，其包含CAGATGGATC之序列(SEQ ID NO 10)；其中該探針係與一螢光體共軛；及/或至少一野生型探針，其包含CAGATGGTTC之序列(SEQ ID NO 11)；其中該探針係與一螢光體共軛。
  11. 如請求項第10項所述套組，其中前述至少一突變探針及/或前述至少一野生型探針係進一步與一淬滅體共軛。
  12. 如請求項第11項所述套組，其中前述螢光體係共軛於前述探針的5’端，且前述淬滅體係共軛於前述探針的3’端。
  13. 如請求項第11項所述套組，其中前述至少一突變探針包含SEQ ID NO 17所示序列。
  14. 如請求項第11項所述套組，其中前述至少一野生型探針包含SEQ ID NO 16所示序列。
  15. 如請求項第10項所述套組，其中前述至少一突變探針及/或前述至少一野生型探針中的至少一個核苷酸係經修飾以於其2’位置的氧原子及4’位置的碳原子之間形成橋接。
  16. 如請求項第15項所述套組，其中前述突變探針包含SEQ ID NO 19所示序列：5’-CACCAGATGGATCGTACA-3’。
  17. 如請求項第16項所述套組，其中前述突變探針自5’端數至3’端的第5、第8、第11、及第14個核苷酸係經修飾以於其2’位置的氧原子及4’位置的碳原子之間形成橋接。
  18. 如請求項第15項所述套組，其中前述野生型探針包含SEQ ID NO 18所示序列：5’-CACCAGATGGTTCGTACA-3’。
  19. 如請求項第18項所述套組，其中前述野生型探針自5’端數至3’端的第5、第8、第11、及第14個核苷酸係經修飾以於其2’位置的氧原子及4’位置的碳原子之間形成橋接。
  20. 如請求項第10項所述套組，其進一步包含一錨探針，其中該錨探針係與一螢光體供體共軛。
  21. 如請求項第20項所述套組，其中前述至少一突變探針包含SEQ ID NO 21所示序列，且係與一螢光體受體共軛。
  22. 如請求項第20項所述套組，其中前述至少一野生型探針包含SEQ ID NO 20所示序列，且係與一螢光體受體共軛。
  23. 如請求項第20項所述套組，其中前述錨探針包含SEQ ID NO 22所示序列。
  24. 如請求項第10項所述套組，其進一步包含一引子組，其中前述引子組用於放大前述MLH1基因的至少一部分以取得一複製體；其中前述複製體包含一相應於前述V384突變的位置。
  25. 如請求項第24項所述套組，其中前述引子組為：一順向引子，其包含SEQ ID NO 12所示序列，及一逆向引子，其包含SEQ ID NO 13所示序列；及/或一順向引子，其包含SEQ ID NO 14所示序列，及一逆向引子，其包含SEQ ID NO 15所示序列。
  26. 如請求項第10項所述套組，其進一步包含一DNA聚合酶。
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