TW201609807A - Ｉｌ－１５異源二聚體蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種IL-15異源二聚體蛋白及其用途，還涉及一種IL-15/IL-15R α異源二聚體蛋白。IL-15異源二聚體蛋白包含蛋白(I)和蛋白(II)，蛋白(I)由IL-15或其變體和第一Fc變體重組而成；蛋白(II)是第二Fc變體，或由IL-15 R α或其變體和第二Fc變體重組而成，第一Fc變體和第二Fc變體間以Knob-into-Hole形式連接。本發明的IL-15異源二聚體具有明顯的抑瘤活性，比IL-15單一分子具有更好的生物活性及延長的體內半衰期。

Description

IL-15異源二聚體蛋白及其用途
本發明涉及一種IL-15異源二聚體蛋白及其用途，進一步涉及一種IL-15/IL-15R α異源二聚體蛋白複合物，以及其作為治療劑特別是作為癌症和自身免疫疾病治療劑的用途。
白細胞介素15(IL-15)是Grabstein等人於1994年發現的一種約為12-14kD的細胞因子，可在機體正常的免疫應答中發揮作用，如促進T細胞、B細胞、自然殺傷(NK)細胞的增殖。
IL-15屬於四個小α螺旋束細胞因子家族(Small four α-helix bundle family of cytokines)中的成員。IL-15需藉由與其受體結合發揮生物學活性。IL-15受體由三個受體亞基組成：IL-15受體α(IL-15R α)、IL-2受體β(IL-2R β，也稱IL-15R β或CD122)和γ c(也稱CD132)。IL-15R α內含一個Sushi結構域，能與IL-15結合，並且是使結合後的IL-15發揮生物學功能所必需的。
近年發現，IL-15與其受體IL-15R α形成複合物後， 可顯著增強IL-15的生物學活性。研究顯示，IL-15和其可溶性受體IL-15R α所形成的複合物在刺激記憶性CD8+T淋巴細胞和NT/NKT細胞增殖作用明顯地優於IL-15單獨作用。IL-15/IL-15R α複合物刺激記憶性CD8+ T細胞增殖和維持其存活的能力較單獨的IL-15強10倍以上，其機理可能和順式遞呈相關。
由於IL-15在腫瘤免疫治療領域的良好預期，NIH最先進行了IL-15治療腫瘤方面的研究，並嘗試將其推入臨床一期研究。但是IL-15分子量小、體內半衰期段，重複給藥劑量不好控制，且容易造成全身性免疫副反應等。所以迫切需要一種提高IL-15體內半衰期、促進或者增強其體內生物學活性發揮的途徑。國內外有不少公司或研究機構在從事IL-15免疫治療方面的相關研究，比如CN100334112C(上海海欣生物技術有限公司)專利所涉及的IL-15-hIgG4Fc同源二聚體蛋白用於抗微生物感染的治療；如CN1942481A(瑞士豪夫邁-羅氏公司)專利所涉及的IL-15-Fc融合表達系統及其用途；如CN101360827B(法國國立醫學與健康研究所)專利所涉及的IL-15Ra(sushi+結構域，即sushi(77))-IL-15融合蛋白及其在腫瘤治療方面的應用。本申請的異源二聚體分子藉由增加分子內部相互作用，具有更好的穩定性、延長的體內半衰期及提高的生物學活性。藉由本領域內熟知的方法手段可以在本申請的分子設計基礎上藉由融合或者插入功能多肽的方式產生靶向性免疫細胞因子以及靶向性免疫細胞因子在腫瘤及自身免 疫疾病治療領域的應用。
本發明藉由基因工程的方法設計並製備具有體內半衰期延長的，體外活性提高的並有明顯抑瘤活性的蛋白分子。
本發明提供一種IL-15異源二聚體蛋白，其包括：蛋白(I)和蛋白(II)；其中蛋白(I)由IL-15或其變體和第一Fc變體重組而成；蛋白(II)是第二Fc變體，或者由IL-15 R α或其變體和第二Fc變體重組而成；蛋白(I)和蛋白(II)藉由第一Fc變體和第二Fc變體之間的相互作用形成穩定的異源二聚體蛋白。
以上所述的”重組而成”指藉由基因工程的方法由不同蛋白間重組後表達得到。
在本發明一個較佳的實施方案中，第一Fc變體和第二Fc變體連接在蛋白IL-15和IL-15 R α的C端。
在本發明一個實施方案中，提供一種IL-15異源二聚體蛋白，其中該IL-15序列為SEQ ID NO：1。
在本發明一個較佳的實施方案中，提供一種IL-15異源二聚體蛋白，其中該蛋白(II)是第二Fc變體。
在本發明一個實施方案中，提供一種IL-15異源二聚體蛋白，其中該蛋白(II)由IL-15 R α或其變體和第二Fc變體重組而成。
在本發明一個實施方案中，提供一種IL-15異源二聚體蛋白，其中該IL-15R α變體為IL-15R α胞外域部分或其功能性片段，該功能性片段較佳為IL-15R α胞外域部分65-120個胺基酸的縮短形式，更佳為65-102個胺基酸的縮短形式。
在本發明一個實施方案中，提供一種IL-15異源二聚體蛋白，其中該IL-15R α變體的序列選自SEQ ID NO：2-7。
在本發明一個實施方案中，提供一種IL-15異源二聚體蛋白，其中該IL-15R α變體序列選自SEQ ID NO：3-7。
在本發明一個實施方案中，提供一種IL-15異源二聚體蛋白，其中該第一Fc變體和第二Fc變體分別為Knob修飾的Fc和Hole修飾的Fc，或所述的該第一Fc變體和第二Fc變體分別為Hole修飾的Fc和Knob修飾的Fc。修飾後的第一Fc變體和第二Fc變體藉由“Knob/Hole”的作用方式有助於形成異源二聚體蛋白。當第一Fc變體是Knob修飾的Fc時，第二Fc變體是Hole修飾的Fc；或者當第二Fc變體是Knob修飾的Fc時，第一Fc變體是Hole修飾的Fc。
在本發明一個實施方案中，提供一種IL-15異源二聚體蛋白，其中該第一Fc變體的序列選自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，和其中該第二Fc變體的序列選自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29。蛋白(I)和蛋白(II)藉由如SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27或SEQ ID NO： 28和SEQ ID NO：29所示的Fc變體以“Knob/Hole”的作用方式形成異源二聚體。如當第一Fc變體序列為SEQ ID NO：26時，第二Fc變體序列為SEQ ID NO：27；或者當第二Fc變體序列為SEQ ID NO：26時，第一Fc變體序列為SEQ ID NO：27。
在本發明一個實施方案中，提供一種IL-15異源二聚體蛋白，其中該蛋白(I)的序列選自SEQ ID NO：14-17，較佳是SEQ ID NO：14。
在本發明二個實施方案中，提供一種IL-15異源二聚體蛋白，其中該蛋白(II)的序列選自SEQ ID NO：18-25、34-37，較佳選自SEQ ID NO：23、34-37，更佳選自SEQ ID NO：34-37。
在本發明一個實施方案中，提供一種IL-15異源二聚體蛋白，其中該蛋白(I)的序列選自SEQ ID NO：30-31；該蛋白(II)的序列選自SEQ ID NO：32-33。
本發明的IL-15異源二聚體蛋白，選自如下的二聚體蛋白3-17，其中該二聚體蛋白3-17分別由相對應的蛋白(I)和蛋白(II)重組而成：
本發明還涉及一種核酸，其編碼如上所述的IL-15異源二聚體蛋白。
本發明還涉及一種DNA載體，其包括如上所述的核 酸。
本發明還涉及一種宿主細胞，其轉染有本發明所述的DNA載體。
本發明還涉及一種製備如上所述的IL-15異源二聚體蛋白的方法，該方法包括：在足以表達如上所述的IL-15異源二聚體蛋白的條件下，培養本發明所述的宿主細胞；表達並純化該IL-15異源二聚體蛋白。
本發明還涉及一種醫藥組成物，其含有本發明所述的IL-15的異源二聚體蛋白和可藥用的賦形劑、稀釋或載體。
本發明還涉及一種靶向性蛋白分子，其含有根據本發明所述的IL-15異源二聚體蛋白結構。
本發明還涉及一種用於刺激或抑制哺乳動物免疫應答的方法，包括：向該哺乳動物給予有效量的根據本發明所述的IL-15異源二聚體蛋白，或根據本發明所述的醫藥組成物，或根據本發明所述的靶向性蛋白分子。
本發明還涉及使用根據本發明所述的IL-15異源二聚體蛋白、根據本發明所述的醫藥組成物，或根據本發明所述的靶向性蛋白分子，在製備用於治療IL-15介導的疾病或病症的藥物的用途；其中該疾病為傳染病、癌症、血液病和自身免疫性疾病。該癌症選自黑色素瘤、結直腸癌、皮膚癌、淋巴瘤、腎細胞癌、實體瘤、肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌；該傳染病選自天花病毒感染、HIV感染、細菌感染、真菌感染、HBV感染；該血液病選自貧血、急性髓系白血病、骨髓增生異常綜合症、T-細胞大顆粒淋巴細胞性 白血病；該自身免疫性疾病選自多發性硬化症、銀屑病、風濕性關節炎、炎性疾病、胃炎、黏膜炎。其中該藥物為根據本發明所述的IL-15異源二聚體蛋白、或本發明所述的醫藥組成物與小分子抑制劑或抗體類藥物的聯合使用；該小分子抑制劑較佳烷化劑；該抗體類藥物較佳為單克隆抗體藥物，更佳為抗CD20、PD1、PDL1、Her2抗體。進一步地，根據本發明所述的藥物與治療有效劑量的選自下列的藥物聯合應用：替莫唑胺、阿黴素、紫杉醇、順鉑、卡鉑、達卡巴嗪、拓撲替康、伊立替康、吉西他濱和貝伐單抗。
本發明還涉及使用根據本發明所述的IL-15異源二聚體蛋白、根據本發明所述的醫藥組成物，或根據本發明所述的靶向性蛋白分子，在細胞免疫治療中的用途，尤其是在DC、CIK、DC-CIK、ECIK、NK、CAS-T、BiAb-T、TCR-T、CAR-T腫瘤免疫細胞治療中的用途。
腫瘤免疫治療是腫瘤治療領域一個熱點，是繼手術、化療和放療之後的第四種腫瘤治療模式。腫瘤免疫學治療的目的是激發或調動機體的免疫系統，增強腫瘤微環境抗腫瘤免疫力，從而控制和殺傷腫瘤細胞。它可能是最有效的也是最安全的治療腫瘤的途徑。
腫瘤的免疫逃逸機制，是利用腫瘤自身對免疫系統的抑制作用維持或促進腫瘤的生長。腫瘤免疫治療是為了最大限度的提高患者自身對腫瘤的免疫系統反應，它不但要在體內啟動原有的免疫系統反應，更要維持免疫系統反應 的持續時間和反應強度，這才是免疫治療腫瘤的關鍵。
細胞因子免疫療法是隨著高純度或重組細胞因子的生產而發展起來的。其原理是利用某些細胞因子注射體內後可調節、增強一種或多種免疫細胞的功能，發揮更強的抗腫瘤免疫作用。
本發明還涉及一種治療或預防疾病的方法，在該疾病中，細胞表達疾病相關抗原，該方法包括：向患者施予如本發明所述的IL-15異源二聚體蛋白、或如本發明所述的醫藥組成物，或如本發明所述的靶向性蛋白分子；在表達疾病相關抗原的細胞與表達IL-15R α的免疫細胞之間形成足以活化該免疫細胞的特異性結合複合物；以及藉由該免疫細胞殺死該表達疾病相關抗原的細胞。其中該表達疾病相關抗原的細胞較佳為腫瘤細胞或病毒感染細胞。其中該免疫細胞較佳為T-細胞、LAK細胞或NK細胞。其中該疾病為傳染病、癌症、血液病和自身免疫性疾病。該癌症選自黑色素瘤、結直腸癌、皮膚癌、淋巴瘤、腎細胞癌、實體瘤；該傳染病選自天花病毒感染、HIV感染、細菌感染、真菌感染；該血液病選自貧血、急性髓系白血病、骨髓增生異常綜合症、T-細胞大顆粒淋巴細胞性白血病；該自身免疫性疾病選自多發性硬化症、銀屑病、風濕性關節炎、炎性疾病、胃炎、黏膜炎。
本發明還涉及一種治療或預防疾病的方法，包括向患者施予如本發明所述的IL-15異源二聚體蛋白、或如本發明所述的醫藥組成物，或如本發明所述的靶向性蛋白分 子，以及聯合施用其他藥物，如小分子抑制劑或抗體類藥物；該小分子抑制劑較佳烷化劑；該抗體類藥物較佳單克隆抗體藥物，更佳為抗CD20、PD1、PDL1、Her2抗體。
為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本檔中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其他技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
一、術語
本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
本發明所述的“異源二聚體蛋白”是指兩個不同的單體蛋白質結合而成的蛋白。在本發明中，兩個不同的單體蛋白質各自含有Fc片段或Fc變體片段，並藉由Fc片段或Fc變體片段相互作用形成異源二聚體蛋白。
本發明中第一Fc變體和第二Fc變體之間的“相互作用”指的是Fc變體間作用。“Fc變體”指藉由在Fc上合適的位點處存在一個或者多個胺基酸替換、插入或缺失突變引起Fc結構或功能的變化。“Fc變體間作用”指的是經突變設計的Fc變體之間，可以形成空間填充效應、靜電導引、氫鍵作用、疏水作用等。Fc變體間相互作用有助於形成穩定的異源二聚體蛋白。較佳的突變設計為“Knob-into-Hole”形式的突變設計。
本發明中組成異源二聚體蛋白的“單體蛋白質”(即蛋白(I)、蛋白(II))可以是融合蛋白或非融合蛋白。
本發明所述的“融合蛋白”是指，藉由用基因重組方法、化學方法或其他適當方法將兩個或多個基因的編碼區連接，在同一調控序列控制下表達基因重組所得的蛋白質產物。在本發明的一些實施方案中，蛋白(I)為IL-15或其變體與Fc變體基因重組表達得到的融合蛋白；蛋白(II)可為IL-15R α與Fc變體基因重組表達得到的融合蛋白。本發明的融合蛋白中，兩個或多個基因的編碼區之間可由編碼肽接頭的序列於一個或數個位置融合。肽接頭也可用於構建本發明的融合蛋白。
本發明所述的“IL-15”或“IL-15肽段”可以是任何IL-15(白介素15)或其突變體，如人IL-15或非人哺乳動物IL-15或非哺乳動物IL-15。示例性非人哺乳動物如豬、兔、猴、猩猩、鼠等，非哺乳動物如雞等。較佳為人的白介素15成熟分子，見資料庫UniProtKB，登錄號P40933，49-162aa。術語“IL-15變體”指藉由一個或多個胺基酸替換、增加或者缺失突變獲得的對IL-15與其受體間親合力提高或者降低，或其刺激T細胞或者NK細胞活性增加或者降低的突變體分子。
本發明中所述的“IL-15R α”可以是任何物種的IL-15Ra或者其功能性片段，如人IL-15Ra或非人哺乳動物IL-15Ra或非哺乳動物IL-15Ra。示例性非人哺乳動物如豬、兔、猴、猩猩、鼠等，非哺乳動物如雞等。較佳為人的IL-15Ra，；更佳為人的白介素15受體α胞外域片段，簡稱IL-15R α ECD(SEQ ID NO：2)，見資料庫UniProtKB， 登錄號Q13261，31-205aa。術語“IL-15R α變體”指在IL-15Ra上藉由一個或者多個胺基酸缺失、插入或替換突變形成的具有與其配體分子如IL15結合能力的功能性突變體，較佳為人的IL15Ra分子，更佳為人的IL-15R α胞外域片段的縮短形式，即從胞外域片段C端開始藉由一個或多個胺基酸缺失突變所得的具有人白介素15受體α活性的分子，較佳保留65-120個胺基酸的缺失突變形式，更佳保留65-102個胺基酸的缺失突變縮短形式，比如IL-15R α-sushi(77)(SEQ ID NO：3)、IL-15R α-sushi(65)(SEQ ID NO：4)。
術語“免疫球蛋白Fc區”指的是免疫球蛋白鏈恒定區，特別是免疫球蛋白重鏈恒定區的羧基端或其中的一部分，無抗原結合活性，是抗體分子與效應分子和細胞相互作用的部位。例如，免疫球蛋白Fc區可包括重鏈CH1、CH2、CH3、CH4的兩個或更多結構域與免疫球蛋白鉸鏈區的組合。Fc可以來源於不同的種屬，較佳為人的免疫球蛋白。根據重鏈恒定區的胺基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的種類，主要有5類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中一些還可進一步分成亞類(同種型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-4；IgA-1和IgA-2。
“Fc區”較佳包括至少一個免疫球蛋白絞鏈區，以及IgG的CH2和CH3區。更佳包括IgG1的一個CH2結構域，一個CH3結構域和一個免疫球蛋白絞鏈區，鉸鏈區起始胺基酸位置可以變動。
Fc變體的突變設計技術在本領域內已經較為廣泛的應用於製備雙特異性抗體或者異源二聚的Fc融合蛋白形式。代表性的有Cater等人(Protein Engineering vol.9 no.7 pp.617-621,1996)提出的“Knob-into-Hole”形式；Amgen公司技術人員利用靜電導引(Electrostatic Steering)形成含Fc的異源二聚體形式(US 20100286374 A1)；Jonathan H.Davis等人(Protein Engineering,Design & Selection pp.1-8,2010)提出的藉由IgG/IgA鏈交換形成的異源二聚體形式(SEEDbodies)；Genmab公司DuoBody(Science,2007.317(5844))平臺技術形成的雙特異性分子；Xencor公司的技術人員綜合結構計算及Fc胺基酸突變，綜合不同作用方式形成異源二聚體蛋白形式(mAbs 3：6,546-557；November/December 2011)；蘇州康寧傑瑞公司的基於電荷網路的Fc改造方法(CN201110459100.7)得到異源二聚體蛋白形式；以及其他基於Fc胺基酸變化或者功能改造手段，達到形成異源二聚體功能蛋白的基因工程方法。本發明所述的Fc變體片段上的Knob/Hole結構指兩條Fc片段各自突變，突變後可以藉由“Knob-into-Hole”形式進行結合。較佳用Cater等人的“knob-into-hole”模型在Fc區上進行位點突變的改造，以使得到的第一Fc變體和第二Fc變體能以“knob-into-hole”的形式結合在一起形成異源二聚體。從特定的免疫球蛋白類別和亞類中選擇特定的免疫球蛋白Fc區在本領域技術人員所掌握的範圍之內。較佳為人類抗體IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc區，更佳為人抗體IgG1 的Fc區。隨機視需要第一Fc變體或第二Fc變體中一個做knob的突變，另一個做hole的突變。在實施例中，所述的第一Fc變體做knob的突變，如序列SEQ ID NO 26；所述的第二Fc變體做hole的突變，如序列SEQ ID NO 27。
術語“連接肽(Linker)”在本發明中用於連接IL-15或IL-15R α與Fc變體，以保證蛋白的正確折疊和穩定性的肽。本發明的“連接肽”較佳為(GGGGS)n，其中n可以為0、1、2、3、4、5或者更多，較佳n為2-4。如果連接肽序列太短，可能影響兩蛋白高級結構的折疊，從而相互干擾；如果連接肽序列太長，又涉及免疫原性的問題，因為連接肽序列本身就是新的抗原。
本發明所述的“異源二聚體蛋白”較佳為基因共表達的產物。如在原核細胞在腸桿菌中共表達；或在真核細胞，如293、CHO中共表達。
本發明中所述的“共表達”(coexpression)指在一個細胞中多個基因一起表達，同時出現它們的產物。這些基因可以是同時存在而分別或共同地受控表達。在本發明中，較佳在一個真核細胞中共表達兩種基因。共表達得到的基因表達產物有利於高效、簡單地形成複合物；在本發明中，有利於形成異源二聚體蛋白。
本發明所述的免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恒定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為 免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恒定區的不同分為κ或λ鏈。
靶向性蛋白分子，指一類蛋白分子，其中含有某個片段或者區域能夠和其他蛋白分子相互作用，藉由在免疫細胞因子如IL5、IL2等或者含有這類細胞因子的獨特分子設計比如本申請的分子設計基礎上引入靶向性肽段如抗體片段、ScFv或某類細胞表面分子的結合肽等。例如抗體與抗原相互作用，或者配體與受體相互作用，使得分子進入體內後能夠優先藉由靶向作用富集於特定的組織、器官或身體部位發揮其生物功能。藉由如在本申請分子的游離末端融合某類多肽形成一個新的分子，這種方式在本領域內可以合理的進行衍生設計產生一系列分子。
“給予”和“處理”，當應用於動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”，當應用於人、動物或受試者時，是 指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。“處理”、在應用於人、動物或受試者、或者細胞、組織或器官時，包括IL-15激動劑或IL-15拮抗劑與人或動物、受試者、細胞、組織、生理區室或生理流體的接觸。“細胞的處理”還包括IL-15激動劑或IL-15拮抗劑例如在流體相或膠體相中接觸IL-15受體的情況，而且包括激動劑或拮抗劑不接觸細胞或受體的情況。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，諸如包含本發明的IL-15異源二聚體蛋白的組成物。該患者具有一種或多種疾病或症狀。已知該治療劑對這些疾病或症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病或症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類疾病或症狀退化還是抑制這類疾病或症狀發展到任何臨床可測量的程度。有效緩解任何具體疾病或症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。
“免疫病症”或“免疫障礙”包括例如病理性炎症、炎性病症和自身免疫性疾病症或疾病。“免疫病症”還指感染、持續感染和增生性病症，例如癌症、腫瘤和血管發生。“癌性病症”包括例如癌症、癌細胞、腫瘤、血管發生和癌變前病症，例如發育異常。
本文使用的“聚合酶鏈式反應”或“PCR”是指例如美國專利號4,683,195中所述的擴增程式或技術。一般來 說，需要獲得來自目標區域末端或之外的序列資訊，使得可以設計寡核苷酸引子。這些引子的序列與待擴增範本的對應鏈相同或相似。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著抗體重鏈可變區可以但不必須存在；存在時，可以是1個，2個或3個。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
本發明中所述的用重組DNA轉化宿主細胞的步驟可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。獲得的轉化子可以用常規方法培養，以及表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。宿主細胞在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。
第1圖為給藥時間與血清中樣本的莫耳濃度的關係圖。
第2圖為測試例3.肺轉移模型中，給藥的小鼠肺部轉移腫瘤塊數量圖。圖中*表示：p<0.05,vsPBS；**表示：p<0.01, vsPBS；##表示：p<0.01,vs IL-15。
第3圖為測試例3.肺轉移模型中，給藥的小鼠相對肺重量(肺重量/體重)圖，圖中**表示：p<0.01,vs PBS；#表示：p<0.05,vs IL-15。
第4圖為不同給藥蛋白對HCT-116裸小鼠移植瘤的療效圖。
第5圖5為不同給藥蛋白對HCT-116裸小鼠移植瘤的療效，第27天的腫瘤重量圖。圖中*表示：p<0.05，vs blank(空白對照)。
第6圖為不同給藥蛋白對HCT-116+PBMC SCID鼠移植瘤的療效圖。
第7圖為不同給藥蛋白對HCT-116+PBMC SCID鼠移植瘤的療效，第28天的腫瘤重量圖。圖中*表示：p<0.05，vs PBMC。
第8圖為小鼠給藥二聚體蛋白17、陽性對照(IL-15)和陰性對照(PBS)後小鼠的肺部轉移腫瘤斑點數量比較圖，圖中*：p<0.05，**：p<0.01，vs PBS。
第9圖為向小鼠給藥二聚體蛋白17、陽性對照(IL-15)和陰性對照(PBS)後小鼠的相對肺重量(肺重量/體重)比較圖。
第10圖為向小鼠給藥二聚體蛋白17、陽性對照(IL-15)和陰性對照(PBS)後小鼠的小鼠體重比較圖。
以下結合實施例用於進一步描述本發明，但這些實施 例並非限制本發明的範圍。
本發明實施例或測試例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。參見Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室；當代分子生物學方法，Ausubel等著，Greene出版協會，Wiley Interscience，NY。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1. IL-15異源二聚體蛋白的獲得
本發明提供的異源二聚體蛋白由蛋白(I)和蛋白(II)結合形成，該蛋白(I)是由IL-15或其變體和第一Fc變體重組而成的融合蛋白；該蛋白(II)，可以是第二Fc變體，或者是由IL-15 R α ECD或其變體和第二Fc變體重組而成的融合蛋白；該結合較佳為第一Fc變體與第二Fc變體以Knob/Hole形式結合。
本發明實施例中所用的IL-15指的是人白介素15成熟分子(SEQ ID NO：1)或其變體。本發明實施例中所用的IL-15R α ECD指人的白介素15受體α胞外域片段(SEQ ID NO：2)；其變體較佳為其縮短形式，如IL-15R α-sushi(77)(SEQ ID NO：3)、IL-15R α-sushi(65)(SEQ ID NO：4)。本發明實施例中所用的Fc片段部分可以為人類抗體IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段，較佳為人IgG1的Fc片段。本發明中第一Fc變體或第二Fc變體，較佳進行Knob形式的突變(SEQ ID NO：26)，或Hole形式的突變(SEQ ID NO：27)。本發明的異源二聚體蛋白中，蛋白(I)和蛋白(II)之間 藉由第一Fc變體與第二Fc變體之間的Knob/Hole結構形成二聚體，較佳藉由第一Fc變體與第二Fc變體之間“Knob-into-Hole”作用方式形成異二聚體。僅含單個IL-15效應分子的二聚體，也可以藉由IL-15與第一Fc變體融合，且該第一Fc變體與相對應第二Fc變體以Knob-into-Hole的作用方式形成，如本發明的異源二聚體蛋白3。
本發明將IL-15或其變體藉由一個連接肽與第一Fc片段或第一Fc變體融合形成融合蛋白，以及本發明將IL-15R α ECD或其變體藉由一個連接肽與第二Fc片段或第二Fc變體融合形成融合蛋白，其中各蛋白組分的連接順序不限；連接肽可以是領域內常用的軟性連接肽，較佳為(GGGGS)n，其中n選自1-10，較佳選自1-5，最佳為2。
相關的蛋白序列如下：
IL-15(蛋白序列1)：(人白介素15的胺基酸序列，同時也是對照品IL-15序列) SEQ ID NO：1。
IL-15R α ECD(蛋白序列2)：(人白介素15受體alpha的胞外域胺基酸序列，同時也用來和Fc融合形成分子H中的IL-15Ra所指部分) SEQ ID NO：2。
IL-15R α-sushi(77)(蛋白序列3)：(人白介素15受體alpha胞外域中能夠保持90%以上結合活性的一個結構域，稱為sushi結構域加一小段連接肽，屬於縮短形式的IL-15R α) SEQ ID NO：3。
IL-15R α-sushi(65)(蛋白序列4)：(人白介素15受體alpha胞外域中能夠保持90%以上結合活性的一個結構域，稱為sushi結構域屬於縮短形式的IL-15Ra) SEQ ID NO：4。
IL15Ra-sushi(73)(蛋白序列5)： SEQ ID NO：5
IL15Ra-sushi(86)(蛋白序列6)： SEQ ID NO：6
IL15Ra-sushi(102)(蛋白序列7)： SEQ ID NO：7
IL-15-Fc(蛋白序列8)：(人白介素15分子藉由一個連接肽與人IgG1-Fc序列連接形成的融合蛋白，表達出來為雙價的同源二聚體，其中IL-15分子處在蛋白的N端) SEQ ID NO：8。
Fc-IL-15(蛋白序列9)：(人白介素15分子藉由一個連接肽與人IgG1-Fc序列連接形成的融合蛋白，表達出來為雙價的同源二聚體，其中IL-15分子處在蛋白的C端) SEQ ID NO：9。
IL-15R α ECD-Fc(蛋白序列10)：(人白介素15受體alpha胞外域藉由一個連接肽與人IgG1-Fc序列連接形成的融合蛋白，表達出來為雙價的同源二聚體，其中IL-15R α-ECD分子處在蛋白的N端) SEQ ID NO：10。
Fc-IL-15R α ECD(蛋白序列11)：(人白介素15受體alpha胞外域藉由一個連接肽與人IgG1-Fc序列連接形成的融合蛋白，表達出來為雙價的同源二聚體，其中IL-15R α ECD分子處在蛋白的C端) SEQ ID NO：11。
IL-15R α-sushi(77)-Fc(蛋白序列12)：(人白介素15受體alpha胞外域中的sushi結構域加一段連接肽組成的sushi(77)片段藉由一個連接肽與人IgG1-Fc序列連接形成的融合蛋白，sushi(77)片段位於N端) SEQ ID NO：12。
Fc-IL-15R α-sushi(77)(蛋白序列13)：(人白介素15受體alpha胞外域中的sushi結構域加一段連接肽組成的sushi (77)片段藉由一個連接肽與人IgG1-Fc序列連接形成的融合蛋白，sushi(77)片段位於C端) SEQ ID NO：13。
IL-15-Fc-Knob(蛋白序列14)：(上述序列8中的Fc部分進行了胺基酸突變成Knob形式，可以和另外一個融合分子的Hole形式進行配對) SEQ ID NO：14。
IL-15-Fc-Hole(蛋白序列15)：(上述序列8中的Fc部分進行了胺基酸突變成Hole形式，可以和另外一個融合分子 的Knob形式進行配對) SEQ ID NO：15。
Fc-Knob-IL-15(蛋白序列16)：(上述序列9中的Fc部分進行了胺基酸突變成Knob形式，可以和另外一個融合分子的Hole形式進行配對) SEQ ID NO：16。
Fc-Hole-IL-15(蛋白序列17)：(上述序列9中的Fc部分進行了胺基酸突變成Hole形式，可以和另外一個融合分子 的Knob形式進行配對) SEQ ID NO：17。
IL-15R α ECD-Fc-Knob(蛋白序列18)：(上述序列10中的Fc部分進行了胺基酸突變成Knob形式，可以和另外一個融合分子的Hole形式進行配對) SEQ ID NO：18。
IL-15R α ECD-Fc-Hole(蛋白序列19)：(上述序列10中的Fc部分進行了胺基酸突變成Hole形式，可以和另外一個融合分子的Knob形式進行配對) SEQ ID NO：19.
Fc-Knob-IL-15R α ECD(蛋白序列20)：(上述序列11中的Fc部分進行了胺基酸突變成Knob形式，可以和另外一個融合分子的Hole形式進行配對) SEQ ID NO：20。
Fc-Hole-IL-15R α ECD(蛋白序列21)：(上述序列11中的Fc部分進行了胺基酸突變成Hole形式，可以和另外一個融合分子的Knob形式進行配對) SEQ ID NO：21。
IL-15R α-sushi(77)-Fc-Knob(蛋白序列22)：(蛋白序列12中的Fc部分進行了胺基酸突變成Knob形式，可以和另外一個融合分子的Hole形式進行配對) SEQ ID NO：22。
IL-15R α-sushi(77)-Fc-Hole(蛋白序列23)：(蛋白序列12中的Fc部分進行了胺基酸突變成Hole形式，可以和另外一個融合分子的Knob形式進行配對) SEQ ID NO：23。
Fc-Knob-IL-15R α-sushi(77)(蛋白序列24)：(蛋白序列13中的Fc部分進行了胺基酸突變成Knob形式，可以和另外一個融合分子的Hole形式進行配對) SEQ ID NO：24。
Fc-Hole-IL-15R α-sushi(77)(蛋白序列25)：(蛋白序列13中的Fc部分進行了胺基酸突變成Hole形式，可以和另外一個融合分子的Knob形式進行配對) SEQ ID NO：25。
Fc-Knob(蛋白序列26)：(人IgG1-Fc部分的Knob突變形式，可以與IL-15-Fc-Hole/Fc-IL-15-Hole配對) SEQ ID NO：26。
Fc-Hole(蛋白序列27)：(人IgG1-Fc部分的Hole突變形式，可以與IL-15-Fc-Knob/Fc-IL-15-Knob配對 SEQ ID NO：27。
Fc-Knob(M)(蛋白序列28)：另一種方式的Fc突變，可以和Fc-Hole(M)配對形成異源二聚體。
SEQ ID NO：28
Fc-Hole(M)(蛋白序列29)：另一種方式的Fc突變，可以和Fc-Knob(M)配對形成異源二聚體。
SEQ ID NO：29
Fc-Knob(M)-IL-15(蛋白序列30)(相比Knob突變位點不同，另外一種異源二聚體突變方式) SEQ ID NO：30
IL-15-Fc-Knob(M)(蛋白序列31)(相比Knob突變位點不同，另外一種異源二聚體突變方式) SEQ ID NO：31
Fc-Hole(M)-IL-15R α-sushi(65)(蛋白序列32)(相比Hole突變位點不同，另外一種異源二聚體突變方式) SEQ ID NO：32
IL-15R α-sushi(65)-Fc-Hole(M)(蛋白序列33)(相比Hole突變位點不同，另外一種異源二聚體突變方式) SEQ ID NO：33
IL-15R α-sushi(73)-Fc-Hole(蛋白序列34)：(sushi(73)指長度為73個胺基酸的含sushi結構域的縮短形式的IL15R α) SEQ ID NO：34
IL-15R α-sushi(65)-Fc-Hole(蛋白序列35)：(sushi(65)指65個胺基酸長度的sushi結構域) SEQ ID NO：35
IL-15R α-sushi(86)-Fc-Hole(蛋白序列36)：(sushi(86)指長度為86個胺基酸的含sushi結構域的縮短形式的IL-15R α) SEQ ID NO：36
IL-15R α-sushi(102)-Fc-Hole(蛋白序列37)：(sushi(102)指長度為102個胺基酸的含sushi結構域的縮短形式的IL-15R α) SEQ ID NO：37
實施例2 相關載體的構建 一、實驗材料：
真核表達載體pcDNA3.1(+)(Life technologies，貨號V790-20)； IL-15(DNA序列1)、IL-15R α ECD(DNA序列2)及IgG1 Fc(DNA序列3)DNA片段：由基因合成公司合成(金唯智，蘇州)； 引子DNA片段：由基因合成公司合成(金唯智，蘇州)。
二、實驗方法：
用常規的PCR方法，進行片段拼接。
1.片段拼接
IL-15-Fc片段：以IL-15，連接肽，Fc的順序，進行overlap PCR，將三個DNA片段拼接成IL-15-Fc片段(DNA序列4，SEQ ID NO：42)。
IL-15R α ECD-Fc片段：以IL-15R α ECD，連接肽，Fc的順序，進行overlap PCR，將三個DNA片段拼接成IL-15R α ECD-Fc片段(DNA序列5，SEQ ID NO：43)。
Fc-IL-15片段：以Fc，連接肽，IL-15的順序，進行overlap PCR，將三個DNA片段拼接成Fc-IL-15片段(DNA序列6，SEQ ID NO：44)。
Fc-IL-15R α ECD片段：以Fc，連接肽，IL-15R α ECD的順序，進行overlap PCR，將三個DNA片段拼接成Fc-IL-15R α ECD片段(DNA序列7，SEQ ID NO：45)。
IL-15-Fc-Knob片段：以IL-15，連接肽，Fc-Knob的順序，進行overlap PCR，將三個DNA片段拼接成IL-15-Fc-Knob片段(DNA序列8，SEQ ID NO：46)。
IL-15-Fc-Hole片段：以IL-15，連接肽，Fc-Hole的順序，進行overlap PCR，將三個DNA片段拼接成IL-15-Fc-Hole片段(DNA序列9，SEQ ID NO：47)。
Fc-Knob-IL-15片段：以Fc-Knob，連接肽，IL-15的順序，進行overlap PCR，將三個DNA片段拼接成 Fc-Knob-IL-15片段(DNA序列10，SEQ ID NO：48)。
Fc-Hole-IL-15片段：以Fc-Hole，連接肽，IL-15的順序，進行overlap PCR，將三個DNA片段拼接成Fc-Hole-IL-15片段(DNA序列11，SEQ ID NO：49)。
IL-15R α ECD-Fc-Knob片段：以IL-15R α ECD，連接肽，Fc-Knob的順序，進行overlap PCR，將三個DNA片段拼接成IL-15R α ECD-Fc-Knob片段(DNA序列12，SEQ ID NO：50)。
IL-15R α ECD-Fc-Hole片段：以IL-15R α ECD，連接肽，Fc-Hole的順序，進行overlap PCR，將三個DNA片段拼接成IL-15R α ECD-Fc-Hole片段(DNA序列13，SEQ ID NO：51)。
Fc-Knob-IL-15R α ECD片段：以Fc-Knob，連接肽，IL-15R α ECD的順序，進行overlap PCR，將三個DNA片段拼接成Fc-Knob-IL-15R α ECD片段(DNA序列14，SEQ ID NO：52)。
Fc-Hole-IL-15R α ECD片段：以Fc-Hole，連接肽，IL-15R α ECD的順序，進行overlap PCR，將三個DNA片段拼接成Fc-Hole-IL-15R α ECD片段(DNA序列15，SEQ ID NO：53)。
Fc-Knob片段，DNA序列16，SEQ ID NO：54。
Fc-Hole片段，DNA序列17，SEQ ID NO：55。
Fc-Knob(M)-IL-15，DNA序列18，編碼蛋白序列30前體的核苷酸序列，SEQ ID NO：56。
IL-15-Fc-Knob(M)，DNA序列19，編碼蛋白序列31前體的核苷酸序列， SEQ ID NO：57。
Fc-Hole(M)-IL-15R α-sushi(65)，DNA序列20，編碼蛋白序列32前體的核苷酸序列，SEQ ID NO：58。
IL15R α-sushi(65)-Fc-Hole(M)，DNA序列21，編碼蛋白序列33前體的核苷酸序列，SEQ ID NO：59。
IL-15R α-sushi(73)-Fc-Hole，DNA序列22，編碼蛋白序列34前體的核苷酸序列，SEQ ID NO：60。
IL-15R α-sushi(65)-Fc-Hole，DNA序列23，編碼蛋白序列35前體的核苷酸序列，SEQ ID NO：61。
IL-15R α-sushi(86)-Fc-Hole，DNA序列24，編碼蛋白序列36前體的核苷酸序列，SEQ ID NO：62。
IL-15R α-sushi(102)-Fc-Hole，DNA序列25，編碼蛋白序列37前體的核苷酸序列，SEQ ID NO：63。
2.引入酶切位點及信號肽序列：
利用PCR方法在基因片段的5’端引入限制性內切酶KpnI位點，Kozak序列，信號肽序列。KpnI位點至基因片段之間的序列為(SEQ ID NO：38)： (下劃線為KpnI酶切位點，斜線部分為信號肽序列)；在這三個片段的3’端分別引入終止密碼子TGA和NotI限制性內切酶位點。
3.構建表達載體
利用KpnI和NotI限制酶位點將上述基因片段分別插入載體pcDNA3.1(+)，構建成表達載體如pcDNA3.1-IL-15-Fc，pcDNA3.1-IL-15R α ECD-Fc，pcDNA3.1-Fc，pcDNA3.1-Fc-IL-15，pcDNA3.1-Fc-IL-15R α ECD等，得到相應的表達質體。
4.基因定點突變
定點突變過程採用KOD試劑盒(TOYOBO Cat.KOD-201)25μL體系：2.5μL 10×KOD buffer，2.5μL 2mM dNTPs，1μL引子1(10μM)，1μL引子2(10μM)，0.5μL KOD plus，1μL 25mM MgSO4，16μL ddH2O。合成程式為94℃ 2分鐘，94℃ 30秒鐘，55℃ 30秒鐘，68℃ 11分鐘，擴增25循環後，再68℃ 11分鐘以結束PCR擴增程式。在PCR產物中直接加入DpnI(NEB Cat.R0176L)1μL消化5小時後，用DH5a感受態細胞轉化，挑單克隆測序，得到目的質體。本發明實施例涉及的蛋白3由含DNA序列8(SEQ ID NO：46)和DNA序列17(SEQ ID NO：55)的表達載體表達所得；蛋白7由含DNA序列8(SEQ ID NO：46)和DNA序列13(SEQ ID NO：51)的表達載體表達所得。其他實施例的表達由組成蛋白的DNA序列的表達載體共表達所得。
三、構建表達質體的核苷酸序列
以下序列為構建載體所用的DNA序列，下劃單橫線部分為信號肽DNA序列，下劃虛線部分為肽接頭DNA序列，下劃雙橫線部分為Fc進行Knob/Hole突變的DNA序列。
DNA序列1：(IL-15，人白介素15的核苷酸序列) SEQ ID NO：39。
DNA序列2：(IL-15R α ECD，人白介素15受體alpha的胞外域核苷酸序列) SEQ ID NO：40。
DNA序列3：(Fc，人IgG的Fc核苷酸序列) SEQ ID NO：41。
DNA序列4：(IL-15-Fc，編碼蛋白序列5前體的核苷酸序列) SEQ ID NO：42。
DNA序列5：(IL-15R α ECD-Fc，編碼蛋白序列7前 體的核苷酸序列) SEQ ID NO：43。
DNA序列6：(Fc-IL-15，編碼蛋白序列6前體的核苷酸序列) SEQ ID NO：44。
DNA序列7：(Fc-IL-15R α ECD，編碼蛋白序列8前體的核苷酸序列) SEQ ID NO：45。
DNA序列8：(IL-15-Fc-Knob，編碼蛋白序列11前體的核苷酸序列) SEQ ID NO：46。
DNA序列9：(IL-15-Fc-Hole，編碼蛋白序列12前體 的核苷酸序列) SEQ ID NO：47。
DNA序列10：(Fc-Knob-IL-15，編碼蛋白序列13前體的核苷酸序列) SEQ ID NO：48。
DNA序列11：(Fc-Hole-IL-15，編碼蛋白序列14前體的核苷酸序列) SEQ ID NO：49。
DNA序列12：(IL-15R α ECD-Fc-Knob，編碼蛋白序列15前體的核苷酸序列) SEQ ID NO：50。
DNA序列13：(IL-15R α ECD-Fc-Hole，編碼蛋白序列16前體的核苷酸序列) SEQ ID NO：51。
DNA序列14：(Fc-Knob-IL-15R α ECD，編碼蛋白序列17前體的核苷酸序列) SEQ ID NO：52。
DNA序列15：(Fc-Hole-IL-15R α ECD，編碼蛋白序列18前體的核苷酸序列) SEQ ID NO：53。
DNA序列16：(Fc-Knob，編碼蛋白序列23前體的核苷酸序列) SEQ ID NO：54。
DNA序列17：(Fc-Hole，編碼蛋白序列24前體的核苷酸序列) SEQ ID NO：55。
DNA序列18：(Fc-Knob(M)-IL-15，編碼蛋白序列30前體的核苷酸序列)： SEQ ID NO：56
DNA序列19：(IL-15-Fc-Knob(M)，編碼蛋白序列31前體的核苷酸序列)： SEQ ID NO：57
DNA序列20：(Fc-Hole(M)-IL-15R α-sushi(65)，編碼蛋白序列32前體的核苷酸序列)： SEQ ID NO：58
DNA序列21：(IL15R α-sushi(65)-Fc-Hole(M)，編碼蛋白序列33前體的核苷酸序列)： SEQ ID NO：59
DNA序列22：(IL-15R α-sushi(73)-Fc-Hole，編碼蛋白序列34前體的核苷酸序列)： SEQ ID NO：60
DNA序列23：(IL-15R α-sushi(65)-Fc-Hole，編碼蛋白序列35前體的核苷酸序列)： SEQ ID NO：61
DNA序列24：(IL-15R α-sushi(86)-Fc-Hole，編碼蛋白序列36前體的核苷酸序列)： SEQ ID NO：62
DNA序列25：(IL-15R α-sushi(102)-Fc-Hole，編碼蛋白序列37前體的核苷酸序列)： SEQ ID NO：63
實施例3、蛋白的表達
使用FreeStyle 293細胞(GIBCO,Cat#R79007)瞬時轉染表達IL-15蛋白。FreeStyle 293細胞懸浮培養在Freestyle 293 expression medium(GIBCO,Cat#12338018)，添加終濃度為1%的Ultra Low IgG Fetal Bovine Serum(超低免疫球蛋白胎牛血清，GIBCO,Cat#16250078)。準備實施例1中相關的表達質體和轉染試劑PEI(Polyscienees,Cat#239662)，質體量為100ug/100ml細胞，質體和PEI的品質比為1：2。轉染當天細胞密度為1×106/ml。1L的FreeStyle 293待轉染細胞，取50ml Opti-MEM(GIBCO,Cat#11058021)培養基與質粒混勻，靜置5min，過濾；另取50ml Opti-MEM培養基與PEI混勻，靜置5min，過濾。將質體和PEI進行混勻，靜置15min。將質體和PEI混合物緩慢加入細胞中，置入37℃，8% CO2，130rpm搖床培養箱中培養。5天后離心收集上清進行蛋白純化。
實施例4、蛋白的純化 (1)IL-15異源二聚體蛋白親和層析法：
細胞培養液經過高速離心後取上清，利用GE的Protein A層析柱進行親和層析。層析使用平衡緩衝液為1×PBS(pH7.4)，細胞上清上樣結合後利用PBS洗滌至紫外線 回到基線，然後利用洗脫緩衝液0.1M甘胺酸(pH3.0)洗脫目的蛋白，利用Tris調節pH至中性保存；
(2)IL-15異源二聚體蛋白離子交換層析：
將親和層析所得產物調節pH至低於或者高於pI 1-2個pH單位，適當稀釋以控制樣本電導在5ms/cm以下。利用合適的對應pH緩衝液如磷酸緩衝液、醋酸緩衝液等條件，利用本領域內常規的離子交換層析方法如陰離子交換或者陽離子交換進行對應pH條件下NaCl梯度洗脫，根據SDS-PAGE選擇目的蛋白所在的收集管合併保存。
(3)IL-15異源二聚體蛋白體積排阻層析：
將離子交換所得產物超濾濃縮後進行體積排阻層析，如利用GE的Superdex200凝膠進行分離，以去除可能的聚體及其它成分，獲得高純度的目的產物。所得蛋白純度分析可以藉由SDS-PAGE及SEC-HPLC檢測進行分析。蛋白濃度藉由紫外分光光度法測定。
所得的蛋白序列如實施例1中所述，具體各異源二聚體蛋白由1個或2個選自上述序列的蛋白序列組成，較佳經Knob/Hole形式進行配對形成的異源二聚體，經細胞共表達後，分子純化而得；也可以由未經突變的Fc鏈區組成雙價蛋白。較佳實施例如分子3藉由融合蛋白IL-15-Fc-Knob和Fc-Hole配對形成(共表達後分子純化所得)，實施例中的分子7藉由融合蛋白IL-15-Fc-Knob和IL-15R α ECD-Fc-Hole配對形成(共表達後分子純化所得)。本發明的非限制性二聚體蛋白的實施如下表1：
表1顯示了本發明中涉及的具體的17種二聚體蛋白，分別為二聚體蛋白1-17，其分別由表中相應的蛋白(I)和蛋白(II)重組而成。
測試例 測試例1. 體外增殖實驗檢測
新鮮人外周血單個核細胞(PBMC)在IL-15、本發明的二聚體蛋白1-17作用下的增殖試驗。
新鮮PBMC培養在含有10% FBS的RPMI1640培養基中，實驗時離心重懸後調整細胞的密度為5×105個/ml，96孔板中每孔加入90ul，樣本用PBS按一定倍數稀釋成不同濃度梯度，96孔板中每孔加入10μl，37℃,5% CO2培養箱中培養48小時，取50μl用CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay試劑盒檢測細胞增殖。結果見表2：
實施例實驗結果：人PBMC增殖實驗，結果顯示本發明的異源二聚體蛋白蛋白藥物3、7、11及14-17增殖效果要明顯優於IL-15對照，其增殖效果也明顯優於同源二聚體1和2。並且Fc變體在融合蛋白C端的效果好於Fc變體在融合蛋白N端的效果。另外形式的變體分子異源二聚體蛋白12和13增殖效果也優於IL-15對照。
測試例2. IL-15異源二聚體體內PK檢測 一、實驗目的
評價IL-15異源二聚體蛋白3和7在小鼠體內的藥物代謝動力學變化。
二、材料與實驗方法 1、受試化合物即加樣樣本
IL-15，IL-15的異源二聚體蛋白3和7。
2、受試動物
C57BL/6小鼠，SPF，15-16g，♂，購自上海西普爾.必凱實驗動物有限責任公司。
3、動物試驗方法
27隻C57BL/6小鼠，分為3組，每組9隻，每籠3隻，每個時間點採3隻，循環採血。腹腔注射2μg IL-15、10μg二聚體蛋白3和20μg二聚體蛋白7(IL-15、二聚體蛋白3和二聚體蛋白7等莫耳，均為0.15nmol)。給藥後30min、1、2、4、8、24、48、72、120h取血，每個點眼眶取血50-100μl。取血清進行人IL-15 ELISA檢測。
三、實驗結果與討論
IL-15、二聚體蛋白3和二聚體蛋白7等莫耳給藥後，IL-15在30分鐘內達到最大值，然後隨時間被快速代謝，到24小時被全部代謝。二聚體蛋白3在給藥後2小時達到最大值，隨後隨著時間被緩慢代謝，直到120小時被全部代謝。二聚體蛋白7也是在給藥後2小時達到最大值，隨後隨時間被緩慢代謝，到120小時仍能檢測到較大濃度的蛋白。
PK實驗(第1圖)顯示，二聚體蛋白3和二聚體蛋白7給藥後血清中最大蛋白莫耳濃度小於IL-15，但在血清中的保留時間超過IL-15，具有明顯的長效作用。
IL-15體內藥效檢測
本實施例在肺轉移模型、裸鼠荷瘤模型和重度聯合免疫缺陷NOD-SCID鼠三種模型中，檢測IL-15二聚體蛋白3和二聚體蛋白7的藥效結果。結果見以下測試例。
測試例3. 肺轉移模型 一、實驗目的
利用B16F10細胞建立小鼠肺轉移模型，評價IL-15藥物給藥後對腫瘤轉移和生長的影響。
二、材料與實驗方法 1、受試蛋白
IL-15二聚體蛋白3和二聚體蛋白7。
2、受試動物
C57BL/6小鼠，SPF，10-16g，♂，購自上海西普爾．必凱實驗動物有限責任公司。
3、動物試驗方法
給藥方案：32隻C57BL/6小鼠，分為4組，每組8隻。藉由尾靜脈注射1.5×105個B16F10細胞，在第1、2、10天腹腔注射PBS、2μg IL-15、11μg二聚體蛋白3和14μg二聚體蛋白7(IL-15、二聚體蛋白3和二聚體蛋白7等莫耳，均為0.16nmol)。
在第21天處死小鼠，取出肺部，稱重，觀察肺部黑色腫瘤塊，拍照，固定在中性甲醛中，計數黑色腫瘤塊數量。
三、實驗結果
給藥方案中，PBS組小鼠肺部有大量轉移生長的黑色素瘤(175±23)；IL-15組肺部有大量的黑色素瘤塊(157±20)，約為PBS組的90%；二聚體蛋白3給藥組肺部可見少量轉移的黑色素瘤塊(26±6)，約為PBS組的15%；二聚體蛋白7給藥組肺部可見較多轉移的黑色素瘤塊(83±28)，約為PBS組的49%，PBS組肺部腫瘤塊數量明顯高於二聚體蛋白3和二聚體蛋白7組，與IL-15組相比沒有顯著差別。IL-15組肺部腫瘤塊數量明顯高於二聚體蛋白3組。二聚體蛋白7組的肺部腫瘤塊數量明顯高於二聚體蛋白3組，如第2圖所示。PBS組肺部相對重量明顯高於二聚體蛋白3和二聚體蛋白7給藥組，但與IL-15組相比沒有顯著差別。IL-15組肺部相對重量明顯高於二聚體蛋白3和二聚體蛋白7組，如第3圖所示。
綜上所述，在B16F10小鼠模型中，3種蛋白的藥效為二聚體蛋白3>二聚體蛋白7>IL-15。
測試例4. 裸鼠荷瘤模型 一、實驗目的
利用HCT-116(人結腸癌)細胞建立裸鼠荷瘤模型，評價IL-15藥物給藥後對腫瘤生長的影響。
二、材料與實驗方法 1、受試蛋白
IL-15二聚體蛋白3和二聚體蛋白7。
2、受試動物
BALB/cA-nude裸小鼠，SPF，16-20g，♀，購自上海西普爾．必凱實驗動物有限責任公司。
3、動物試驗方法
(1)裸小鼠實驗室環境適應10天。
(2)腫瘤細胞移植
裸小鼠右肋部皮下接種HCT-116細胞(5×106/隻)，腫瘤生長20天，長至100±15mm3後將動物隨機分組(d0)，每組6隻。
(3)給藥劑量及方法
腹腔注射給藥，每2天給藥一次，每週給藥3次，IL-15為2μg/隻，二聚體蛋白3為10μg/隻，二聚體蛋白7為20μg/隻(IL-15、二聚體蛋白3和二聚體蛋白7為等莫耳，均為0.15nmol)。
(4)移植瘤體積及裸小鼠體重測定
每週測2-3次瘤體積(第4圖)，稱體重，記錄資料。第27天處死，取瘤。
(5)資料統計
使用Excel統計軟體：平均值以avg計算；SD值以STDEV計算；SEM值以STDEV/SQRT計算；組間差異P值以TTEST計算。
腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×L長×L短 2
相對體積(RTV)=VT/V0
抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)
其中V0、VT分別為實驗開始時及實驗結束時的腫瘤體積。CRTV、TRTV分別為實驗結束時的空白對照組(Blank)及實驗組的相對腫瘤體積。
三、實驗結果
IL-15蛋白對HCT-116腫瘤的生長抑制作用如表3和第4圖所示，IL-15、3和7等莫耳連續給藥27天，每2天給藥一次後，IL-15、二聚體蛋白3、二聚體蛋白7組均能抑制HCT-16細胞移植瘤生長，抑制率分別為32%、45%、20%，但由於個體差異較大，與空白對照組相比沒有顯著性。給藥過程中沒有出現小鼠死亡，各組小鼠給藥期間體重沒有明顯下降，提示目前給藥劑量沒有明顯的毒副作用。
給藥第27天剝離各組小鼠腫瘤稱取重量，如第5圖所示，圖中*表示：與空白結照Blank相比p<0.05，即二聚體蛋白3組與Blank組相比腫瘤重量顯著降低，IL-15和二聚體蛋白7組腫瘤重量與Blank組相當。
綜上所述，在HCT-116裸鼠模型中，3種蛋白的抑瘤效果為二聚體蛋白3>IL-15>二聚體蛋白7。
測試例5. 重度聯合免疫缺陷NOD-SCID鼠 一、實驗目的
採用HCT-116細胞和人外周血單核細胞(PBMC)在體外混合，接種重度聯合免疫缺陷NOD-SCID鼠，評價IL-15給藥後對腫瘤生長的影響。Nod-SCID小鼠理論上自身缺乏T細胞和NK細胞，所以用IL-15給藥後可以啟動人的PBMC細胞(包括T和NK細胞)殺死腫瘤細胞，抑制腫瘤細胞生長。Nod-SCID小鼠模型更接近人的免疫系統殺死腫瘤細胞。
二、材料與實驗方法 1、受試蛋白
IL-15購自近岸蛋白質科技有限公司； IL-15二聚體蛋白3和7。
2、受試動物
NOD SCID雌性小鼠購自北京維通利華(批號：11400700006527)，6-8週齡，體重20g左右，每個藥物組5隻。
3、動物試驗方法
(1)SCID鼠實驗室環境適應10天。
(2)PBMC細胞分離
無菌轉移6ml淋巴細胞分離液(Lymphocyte Separation Medium，LSM)到15ml離心管中(之前輕輕顛倒瓶子使LSM充分混合)； 將用肝素抗凝處理的靜脈血4m1與同體積生理鹽水混合，仔細將稀釋血液8ml加入離心管中的LSM(室溫，緩慢加入，在血液和LSM中形成一個明顯的分層，不要將稀釋血液混合入LSM中)； 室溫下400g離心15-30分鐘，離心可以沉澱紅細胞和多核白細胞同時可以在LSM上形成一層單核淋巴細胞； 吸出淋巴細胞上方4-6cm的血漿； 吸取淋巴細胞層以及它下面一半的LSM轉移到另外的一個離心管。加入等體積的平衡鹽緩衝液PBS，室溫1000rpm離心10分鐘； 用PBS緩衝液或RPMI-1640培養基清洗細胞，用RPMI-1640培養基重懸細胞； 37℃培養3-4小時，收集懸浮細胞，計數。
(3)腫瘤細胞移植
將HCT-116細胞和PBMC細胞按照4：1比例混合均 勻，SCID鼠右肋部皮下接種混合細胞細胞(HCT-116細胞：5×106/隻，PBMC：1.25×106/隻)，腫瘤生長28天。
(4)給藥劑量及方法
接種HCT-116+PBMC細胞後第二天開始腹腔注射給藥，每2天給藥一次，連續給藥10次，IL-15為2μg/隻，3為10μg/隻，7為20μg/隻(IL-15、3和7為等莫耳，均為0.15nmol)。
(5)移植瘤體積及裸小鼠體重測定
從第12天開始每2-3天瘤體積，稱體重，記錄資料。第28天處死，取瘤。
(6)資料統計
使用Excel統計軟體：平均值以avg計算；SD值以STDEV計算；SEM值以STDEV/SQRT計算；組間差異P值以TTEST計算。
腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×L長×L短 2
抑瘤率(%)=(VT-V0)/VT(%)
其中V0、VT分別為實驗開始時及實驗結束時的腫瘤體積。
三、實驗結果
接種細胞後第二天開始IL-15、二聚體蛋白3和二聚體蛋白7等莫耳連續給藥20天，每2天給藥1次。IL-15蛋白對HCT-116+PBMC腫瘤生長的抑制作用如表4和第6圖所示，第1周各組均沒有發現腫瘤。從第12天(D12)開始，各組均出現腫瘤，且IL-15、二聚體蛋白3、二聚體蛋白7 組腫瘤體積小於PBMC組。到第28天(D28)，IL-15、二聚體蛋白3組能明顯抑制HCT-16細胞移植瘤生長，抑制率分別為42%、41%；二聚體蛋白7組抑制率為27%，但與PBMC組相比沒有顯著性。給藥過程中沒有出現小鼠死亡，各組小鼠給藥期間體重沒有明顯下降，提示目前給藥劑量沒有明顯的毒副作用。
給藥第28天剝離各組小鼠腫瘤稱取重量，如第7圖所示，二聚體蛋白3組與PBMC組相比腫瘤重量顯著降低；IL-15組腫瘤重量比PBMC組降低，但沒有顯著性；二聚體蛋白7組腫瘤重量與PBMC組相當。
綜上所述，在HCT-116+PBMC SCID鼠模型中，3種蛋白的抑瘤效果為3IL-15>7。
測試例6體外Mo7e細胞增殖實驗 1.主要實驗材料
Mo7e(人巨核細胞白血病細胞株)購自於協和醫學院； IL-15購自Novoprotein，貨號C016，IL-15類似物(二聚體蛋白11-17)來自內部製備； Cell Counting Kit-8(CCK-8)，購自WST，貨號EX660； GM-CSF購自NOVOProtein，貨號CC79。
2.實驗方法
1)Mo7e用改良型RPMI-1640培養基(含2.05mM L-穀胺醯胺，10% FBS和15ng/ml GM-CSF)在37℃(5% CO2)細胞培養箱中培養；2)將培養狀態良好的Mo7e細胞150×g，室溫離心5min，棄上清；3)細胞沉澱用無GM-CSF的培養基洗滌兩遍後計數；4)調整細胞濃度鋪96孔板，細胞數量2×104/孔，體積90μl(無GM-CSF)，置於細胞培養箱中靜置培養；5)IL-15及其類似物(二聚體蛋白11-17)分別用PBS作四倍倍比稀釋，在96孔板細胞培養2小時後加入細胞培養體系中，10μl/孔，每個受試物濃度做三重複並設空白對照孔(只加PBS)；6)細胞培養板在培養箱中繼續培養3天；7)所有檢測孔中加入10ul CCK-8，培養箱中孵育3h；8)檢測450nm下的吸光度(OD450)。
在Mo7e增殖實驗中待測分子二聚體蛋白11-17均明顯優於IL15對照分子。
測試例7小鼠肺轉移模型 1.動物試驗方法
32隻C57BL/6小鼠(SPF，上海西普爾．必凱實驗動物有限責任公司)，藉由尾靜脈注射1.5×105個B16F10細胞(中科院上海生命科學研究院細胞資源中心，貨號TCM36)，分為4組，每組8隻。在第1天腹腔注射PBS、2μg IL-15，4.2μg、12.5μg二聚體蛋白17，每2-3天稱重一次，在第14天每組各處死1隻，觀察肺轉移情況。在第16天處死全部小鼠，取出肺部，稱重，觀察肺部黑色腫瘤斑點，拍照，固定在甲醇中，計數黑色腫瘤斑點數量。
2.實驗結果
PBS組小鼠肺部有大量轉移生長的黑色素瘤(73±43)。 IL-15給藥組肺部可見大量轉移的黑色素瘤斑點(65±29)，為PBS組的90%。二聚體蛋白17-4.2μg給藥組肺部可見部分轉移的黑色素瘤斑點(32±24)，為PBS組的44%；二聚體蛋白17-12.5μg給藥組肺部可見少數轉移的黑色素瘤斑點(14±14)，為PBS組的19%。
在本次的B16F10小鼠模型中，二聚體蛋白17的藥效明顯優於IL-15，如第8圖表示各組試驗小鼠的肺部轉移腫瘤斑點數量，與PBS組相比，*表示p<0.05，**表示p<0.01。
PBS組肺部相對重量高於二聚體蛋白17給藥組，如第9圖所示。
二聚體蛋白17-12.5ug劑量組小鼠在給藥後第5天體重略有降低，然後逐漸恢復，如第10圖所示。
綜上，二聚體蛋白17能夠抑制B16F10細胞在小鼠體內的肺部轉移，並且具有劑量效應。
<110> 上海恆瑞醫藥有限公司、江蘇恆瑞醫藥股份有限公司
<120> IL-15異源二聚體蛋白及其用途
<130> 740046CPCT
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<210> 1
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<212> PRT
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<400> 1
<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15R α-ECD
<400> 2
<210> 3
<211> 77
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15R α-sushi(77)
<400> 3
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<211> 65
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
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<400> 4
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<211> 73
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IL15Ra-sushi(73)
<400> 5
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<211> 86
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IL15Ra-sushi(86)
<400> 6
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<211> 102
<212> PRT
<213> 人工的
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<223> IL15Ra-sushi(102)
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
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<212> PRT
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<223> Fc-IL-15R α-sushi(77)
<400> 13
<210> 14
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15-Fc-Knob
<400> 14
<210> 15
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15-Fc-Hole
<400> 15
<210> 16
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-Knob-IL-15
<400> 16
<210> 17
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-Hole-IL-15
<400> 17
<210> 18
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15R α-ECD-Fc-Knob
<400> 18
<210> 19
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15R α-ECD-Fc-Hole
<400> 19
<210> 20
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-Knob-IL-15R α ECD
<400> 20
<210> 21
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-Hole-IL-15R α ECD
<400> 21
<210> 22
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15R α-sushi(77)-Fc-Knob
<400> 22
<210> 23
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15R α-sushi(77)-Fc-Hole
<400> 23
<210> 24
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-Knob-IL-15R α-sushi(77)
<400> 24
<210> 25
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-Hole-IL-15R α-sushi(77)
<400> 25
<210> 26
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-Knob
<400> 26
<210> 27
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-Hole
<400> 27
<210> 28
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-Knob(M)(蛋白序列28)：另一種方式的Fc突變，可以和Fc-Hole(M)配對形成異源二聚體。
<400> 28
<210> 29
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-Hole(M)(蛋白序列29)：另一種方式的Fc突變，可以和Fc-Knob(M)配對形成異源二聚體。
<400> 29
<210> 30
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-Knob(M)-IL-15(蛋白序列30)(相比Knob突變位點不同，另外一種異源二聚體突變方式)
<400> 30
<210> 31
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15-Fc-Knob(M)(蛋白序列31)(相比Knob突變位點不同，另外一種異源二聚體突變方式)
<400> 31
<210> 32
<211> 317
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-Hole(M)-IL-15Ra-sushi(65)(蛋白序列32)(相比Hole突變位點不同，另外一種異源二聚體突變方式)
<400> 32
<210> 33
<211> 317
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15Ra-sushi(65)-Hole(M)(蛋白序列33)(相比Hole突變位點不同，另外一種異源二聚體突變方式)
<400> 33
<210> 34
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15Ra-sushi(73)-Fc-Hole(蛋白序列34)：((sushi(73)指長度為73個胺基酸的含sushi結構域的縮短形式的IL15Ra)
<400> 34
<210> 35
<211> 317
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15Ra-sushi(65)-Fc-Hole(蛋白序列35)：(sushi(65)指65個胺基酸長度的sushi結構域)
<400> 35
<210> 36
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15Ra-sushi(86)-Fc-Hole(蛋白序列36)：(sushi(86)指長度為86個胺基酸的含sushi結構域的縮短形式的IL-15Ra)
<400> 36
<210> 37
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15Ra-sushi(102)-Fc-Hole(蛋白序列37)：(sushi(102)指長度為102個胺基酸的含sushi結構域的縮短形式的IL-15Ra)
<400> 37
<210> 38
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 載體構建序列包括限制性內切酶KpnI位點序列，Kozak序列，信號肽序列。
<400> 38
<210> 39
<211> 408
<212> DNA
<213> IL-15 Human
<400> 39
<210> 40
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15R α
<400> 40
<210> 41
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> FC
<400> 41
<210> 42
<211> 1134
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15-Fc
<400> 42
<210> 43
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15Ra-Fc
<400> 43
<210> 44
<211> 1134
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-IL-15
<400> 44
<210> 45
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-IL15R α
<400> 45
<210> 46
<211> 1134
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> IL15-Fc-Knob
<400> 46
<210> 47
<211> 1134
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> IL15-Fc-Hole
<400> 47
<210> 48
<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-IL15-Knob
<400> 48
<210> 49
<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-IL15-Hole
<400> 49
<210> 50
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> IL15Ra-Fc-Knob
<400> 50
<210> 51
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> IL15Ra-Fc-Hole
<400> 51
<210> 52
<211> 1287
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-IL15R α-Knob
<400> 52
<210> 53
<211> 1287
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-IL15R α-Hole
<400> 53
<210> 54
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-Knob
<400> 54
<210> 55
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-Hole
<400> 55
<210> 56
<211> 1155
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-Knob(M)-IL-15，編碼蛋白序列45前體的核苷酸序列
<400> 56
<210> 57
<211> 1134
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15-Fc-Knob(M)，編碼蛋白序列46前體的核苷酸序列
<400> 57
<210> 58
<211> 1008
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> Fc-Hole(M)-IL-15Ra-sushi(65)，編碼蛋白序列47前體的核苷酸序列
<400> 58
<210> 59
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> IL15Ra-sushi(65)-Fc-Hole(M)，編碼蛋白序列48前體的核苷酸序列
<400> 59
<210> 60
<211> 1041
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15Ra-sushi(73)-Fc-Hole，編碼蛋白序列49前體的核苷酸序列
<400> 60
<210> 61
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15Ra-sushi(65)-Fc-Hole，編碼蛋白序列50前體的核苷酸序列
<400> 61
<210> 62
<211> 1080
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15Ra-sushi(86)-Fc-Hole，編碼蛋白序列51前體的核苷酸序列
<400> 62
<210> 63
<211> 1098
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> IL-15Ra-sushi(102)-Fc-Hole，編碼蛋白序列52前體的核苷酸序列
<400> 63
由於本案的圖為實驗數據，並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。

Claims (31)

  1. 一種IL-15異源二聚體蛋白，其包括：蛋白(I)，和蛋白(II)；其中蛋白(I)由IL-15或其變體和第一Fc變體重組而成；蛋白(II)是第二Fc變體，或者蛋白(II)由IL-15 R α或其變體和第二Fc變體重組而成；蛋白(I)和蛋白(II)藉由第一Fc變體和第二Fc變體之間的相互作用形成穩定的異源二聚體蛋白。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的IL-15異源二聚體蛋白，其中該IL-15序列為SEQ ID NO：1。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的IL-15異源二聚體蛋白，其中該蛋白(II)是第二Fc變體。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的IL-15異源二聚體蛋白，其中該蛋白(II)由IL-15 R α或其變體和第二Fc變體重組而成。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的IL-15異源二聚體蛋白，其中該IL-15R α變體為IL-15R α胞外域部分或其功能性片段。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的的IL-15異源二聚體蛋白，其中該功能性片段為IL-15R α胞外域部分65-120個胺基酸的縮短形式。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的IL-15異源二聚體蛋白，其中該功能性片段為IL-15R α胞外域部分65-102個胺 基酸的縮短形式。
  8. 如申請專利範圍第1項所述的IL-15異源二聚體蛋白，其中該IL-15R α變體的序列選自SEQ ID NO：2-7。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的IL-15異源二聚體蛋白，其中該IL-15R α變體的序列選自SEQ ID NO：3-7。
  10. 如申請專利範圍第1項所述的IL-15異源二聚體蛋白，其中：該第一Fc變體選自Knob修飾的Fc和Hole修飾的Fc；而該第二Fc變體選自Hole修飾的Fc和Knob修飾的Fc；當第一Fc變體是Knob修飾的Fc時，第二Fc變體是Hole修飾的Fc；而當第二Fc變體是Knob修飾的Fc時，第一Fc變體是Hole修飾的Fc。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的IL-15異源二聚體蛋白，其中：該第一Fc變體和第二Fc變體連接在蛋白IL-15和IL-15 R α的C端。
  12. 如申請專利範圍第1項所述的IL-15異源二聚體蛋白，其中該第一Fc變體的序列選自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29；和其中該第二Fc變體的序列選自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29。
  13. 如申請專利範圍第1項所述的IL-15異源二聚體蛋白， 其中該蛋白(I)的序列選自SEQ ID NO：14-17；該蛋白(II)的序列選自SEQ ID NO：18-25、34-37。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的IL-15異源二聚體蛋白，其中該蛋白(I)的序列選自SEQ ID NO：14。
  15. 如申請專利範圍第13項所述的IL-15異源二聚體蛋白，其中該該蛋白(II)的序列選自SEQ ID NO：23、34-37。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的IL-15異源二聚體蛋白，其中該該蛋白(II)的序列選自SEQ ID NO：34-37。
  17. 如申請專利範圍第1項所述的IL-15異源二聚體蛋白，其中該蛋白(I)的序列選自SEQ ID NO：30-31；該蛋白(II)的序列選自SEQ ID NO：32-33。
  18. 如申請專利範圍第1項所述的IL-15異源二聚體蛋白，其選自如下的二聚體蛋白3-17，其中該二聚體蛋白3-17分別由相對應的蛋白(I)和蛋白(II)重組而成：
  19. 一種核酸，其編碼如申請專利範圍第1至18項中任一項所述的IL-15異源二聚體蛋白。
  20. 一種DNA載體，其包括如申請專利範圍第19項所述的核酸。
  21. 一種宿主細胞，其轉染有如申請專利範圍第20項所述的DNA載體。
  22. 一種製備如申請專利範圍第1至18項中任一項所述的IL-15異源二聚體蛋白的方法，該方法包括：在足以表達如申請專利範圍第1至18項所述的IL-15異源二聚體蛋白的條件下，培養如申請專利範圍第21項所述的宿主細胞；表達並純化該IL-15異源二聚體蛋白。
  23. 一種醫藥組成物，其含有：如申請專利範圍第1至18項中任一項所述的IL-15異源二聚體蛋白、和可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
  24. 一種靶向性蛋白分子，其含有如申請專利範圍第1至18項中任一項所述的IL-15異源二聚體蛋白結構。
  25. 一種用於刺激或抑制哺乳動物免疫應答的方法，該方法包括：向該哺乳動物給予有效量的如申請專利範圍第1至18項中任一項所述的IL-15異源二聚體蛋白，或如申請專利範圍第23項所述的醫藥組成物，或如申請專利範圍第24項所述的靶向性蛋白分子。
  26. 一種使用如申請專利範圍第1至18項中任一項所述的IL-15異源二聚體蛋白、如申請專利範圍第23項所述的醫藥組成物、或如申請專利範圍第24項所述的靶向性蛋白分子在製備用於治療IL-15介導的疾病或病症的藥物的用途。
  27. 如申請專利範圍第26項所述的用途，其中：該疾病或病症選自傳染病、癌症、血液病、炎性疾 病和自身免疫性疾病；該癌症選自黑色素瘤、結直腸癌、皮膚癌、淋巴瘤、腎細胞癌、肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌；該傳染病選自天花病毒感染、HIV感染、細菌感染、真菌感染、HBV感染；該血液病選自貧血、急性髓系白血病、骨髓增生異常綜合症、T-細胞大顆粒淋巴細胞性白血病；該自身免疫性疾病選自多發性硬化症、銀屑病、風濕性關節炎、胃炎、黏膜炎。
  28. 如申請專利範圍第26項所述的用途，其中該IL-15異源二聚體蛋白、該醫藥組成物，或該靶向性蛋白分子與小分子抑制劑或抗體類藥物聯合施用；該小分子抑制劑選自烷化劑；該抗體類藥物選自單克隆抗體藥物。
  29. 如申請專利範圍第28項所述的用途，其中該抗體類藥物為抗CD20、PD1、PDL1、或Her2抗體。
  30. 一種使用如申請專利範圍第1至18項中任一項所述的IL-15異源二聚體蛋白、如申請專利範圍第23項所述的醫藥組成物、或如申請專利範圍第24項所述的靶向性蛋白分子在製備用於細胞免疫治療的藥物的用途，尤其是在製備。
  31. 如申請專利範圍第30項所述的用途，該藥物為用於DC、CIK、DC-CIK、ECIK、NK、CAS-T、BiAb-T、TCR-T、CAR-T腫瘤免疫細胞治療的藥物。
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