TW201604279A

TW201604279A - 培養細胞內的ｅｒｋ或ａｋｔ的磷酸化亢進方法、細胞的培養方法及磷酸化亢進劑

Info

Publication number: TW201604279A
Application number: TW104120468A
Authority: TW
Inventors: Naoya Ichimura; Takaaki Hirano
Original assignee: Zeon Corp
Priority date: 2014-06-26
Filing date: 2015-06-25
Publication date: 2016-02-01
Also published as: JP5958658B2; JP2016146819A; WO2015199118A1; JPWO2015199118A1

Abstract

本發明係培養細胞內的ERK(細胞外訊息調控激酶，Extracellular signal-Regulated Kinase)或AKT的磷酸化亢進方法、利用此磷酸化亢進方法之細胞培養方法、及適合使用在該等方法之磷酸化亢進劑。藉由使含脂環結構之聚合物成形體接觸培養的細胞，培養細胞內的ERK或AKT之磷酸化會亢進。

Description

培養細胞內的ERK或AKT的磷酸化亢進方法、細胞的培養方法及磷酸化亢進劑

本發明係關於培養細胞內之ERK(細胞外訊息調控激酶，Extracellular signal-Regulated Kinase)或AKT的磷酸化亢進方法、利用此磷酸化亢進方法之細胞的培養方法、及適合使用在該等方法之磷酸化亢進劑。

當使用培養皿、燒瓶等培養容器培養貼附型細胞時，若細胞增殖成為培養容器的底面全部被細胞覆蓋的狀態，則因細胞分裂新產生的細胞無法黏著於培養容器之底面，因而發生細胞凋亡(apoptosis)。其結果，活細胞數減少且同時會有來自發生細胞凋亡之細胞的內容物漏洩。

從發生細胞凋亡的細胞漏洩的內容物(漏洩夾雜物)可能會對於使用細胞之分析造成影響。又，當使用細胞生產醫藥品等物質時，會有漏洩夾雜物造成生產物分解、或為了將其除去而增加作業步驟數這些問題。

所以，希望在細胞培養時以良好效率抑制細胞凋亡。

細胞凋亡已知係由於稱為凋亡蛋白酶(caspase)的細胞內的複數種類之蛋白質分解酵素的作用引起。又，已知造成此凋亡蛋白酶之發動是由於來自粒線體之細胞色素等的漏洩。

非專利文獻1中記載，若為貼附型細胞黏著在細胞外基質的狀態，會因為經由稱為整聯蛋白(integrin)之涉及細胞表面之黏著的蛋白質的資訊傳遞作用而有防止來自粒線體之內容物之漏洩的作用，結果會防止細胞凋亡。

關於黏著狀態之細胞中之細胞凋亡抑制之作用機轉，已知為，經由整聯蛋白之細胞內的稱為ERK或AKT之細胞內信號傳遞系蛋白質的磷酸化受亢進，利用此磷酸化亢進之ERK或AKT之作用，獲致破壞粒線體之因子成為無破壞作用之狀態的效果。

專利文獻1揭示來自人之CAP18之部分胜肽、防禦素(defensin)等抗菌胜肽會防止細胞死滅(細胞凋亡)。具體而言，記載，若在已添加來自人之CAP18之部分胜肽、防禦素之細胞培養培養基培養為浮游細胞之嗜中性球細胞，可觀察到凋亡蛋白酶之活性降低、ERK之磷酸化亢進，此等部分胜肽有抑制細胞凋亡之效果。此文獻中也記載，此效果係藉由CAP18之部分胜肽對於在嗜中性球細胞之細胞表面表現之FPRL-1受體結合作用，防禦素藉由經由趨化介素受體CCR6受體而作用而獲得。但是若為如此的作用機轉，細胞凋亡防止效果必須有實施和此成分對應之專一性結合的受體在細胞表面表現，當然效果會因細胞種類而受限。

再者，專利文獻2中揭示具有噠嗪酮(pyridazinone)結構的化合物對於血液細胞中之來自T細胞之Jurkat細胞等浮游細胞在活體內有凋亡蛋白酶抑制活性。

又，作為細胞的培養器具，考量輕、透明，市售製品係廣泛使用聚苯乙烯製品。此外，作為使用聚苯乙烯以外之材料之培養容器，已知使用聚乙烯等的氟取代體(專利文獻3)、環烯烴樹脂(專利文獻4)等而得之培養容器，在培養基不會有異物、溶出，培養性能優異。

該等培養器具通常以γ射線照射等處理進行滅菌處理。又，有時會利用電漿處理、紫外線照射處理等以對於培養容器之表面施行親水化處理，以使貼附型細胞不會剝離而死滅。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本特開2007-169260號公報

[專利文獻2]特表2009-545585號公報(US2009/0291959)

[專利文獻3]日本特開2005-218444號公報(US2005/0153438)

[專利文獻4]日本特開2009-027944號公報

[非專利文獻]

[非專利文獻1]Journal of Cell Science. 115, 3729-3738 (2002)

如上述，迄今已有各種防止培養細胞之細胞凋亡的技術被提出，但現狀為需要能更泛用地防止細胞凋亡之方法。

本發明有鑑於該習知技術之實際情況，目的為提供培養細胞內之ERK或AKT的磷酸化亢進方法、利用此磷酸化亢進方法之細胞的培養方法、及適合在該等方法使用之磷酸化亢進劑。

本案發明人等為了解決上述課題而努力研究，結果發現，藉由使含脂環結構之聚合物成形體接觸培養細胞，能促進ERK、AKT之磷酸化亢進，乃完成本發明。

依照本發明，提供下列(1)~(3)之磷酸化亢進方法、(4)之細胞的培養方法、及(5)、(6)之磷酸化亢進劑。

(1)一種培養細胞內之ERK(細胞外訊息調控激酶，Extracellular signal-Regulated Kinase)的磷酸化亢進方法，其特徵為：使含脂環結構之聚合物成形體接觸培養的細胞。

(2)一種培養細胞內之AKT的磷酸化亢進方法，其特徵為：使含脂環結構之聚合物成形體接觸培養之細胞。

(3)如(1)或(2)之磷酸化亢進方法，其中，培養之細胞為貼附型細胞。

(4)一種細胞的培養方法，其特徵為：使含脂環結構之聚合物成形體接觸培養的細胞，使培養細胞內的ERK(細胞外訊息調控激酶，Extracellular signal-Regulated Kinase)之磷酸化及/或AKT之磷酸化亢進。

(5)一種培養細胞中之細胞內ERK的磷酸化亢進劑，係由含脂環結構之聚合物成形體構成。

(6)一種培養細胞中之細胞內AKT的磷酸化亢進劑，係由含脂環結構之聚合物成形體構成。

依照本發明，提供培養細胞內之ERK或AKT的磷酸化亢進方法、利用此磷酸化亢進方法之細胞的培養方法、及適合使用在該等方法之磷酸化亢進劑。

第1圖係顯示，CHO細胞之ERK-1之磷酸化之相對值的圖表。

第2圖係顯示，CHO細胞之ERK-2之磷酸化之相對值的圖表。

第3圖係顯示，VERO細胞之ERK-1之磷酸化之相對值的圖表。

第4圖係顯示，VERO細胞之ERK-2之磷酸化之相對值的圖表。

第5圖係顯示，CHO細胞之AKT之磷酸化之相對值的圖表。

第6圖係顯示，培養CHO細胞3週時之活細胞數的圖表。

第7圖係顯示，培養VERO細胞3週時之活細胞數的圖表。

第8圖係顯示，培養CHO細胞3週時之培養液中之LDH值之相對值的圖表。

第9圖係顯示，培養VERO細胞3週時之培養液中之LDH值之相對值的圖表。

第10圖係顯示，改變培養容器之滅菌方法時之CHO細胞之p44 ERK之磷酸化之相對值的圖表。

第11圖係顯示，改變培養容器之滅菌方法時之CHO細胞之p42 ERK之磷酸化之相對值的圖表。

本發明使用之細胞不特別限定，可因應目的任意選擇。其中，考量容易獲得本發明之效果之觀點，貼附型細胞為較佳。本發明中，貼附型細胞可為貼附型細胞本身，也可為來自貼附型細胞之細胞。貼附型細胞本身，係指在通常的培養條件可藉由黏附於細胞外基質而生存及增殖的細胞，是也稱為錨定依賴性細胞的細胞。來自貼附型細胞的細胞，係將貼附型細胞馴化培養且在浮游狀態也能生存並增殖的細胞等可藉由對於貼附型細胞供給某些外在要因而即使不黏附於細胞外基質仍能生存‧增殖的細胞。作為貼附型細胞可以列舉CHO細胞、VERO細胞、NIH3T3細胞、HEK293細胞等為代表的基因操作的寄主細胞、有病毒感受性的細胞等。

培養細胞時通常使用液體培養基。

液體培養基通常使用有pH緩衝作用，且滲透壓適合細胞，包括細胞的營養成分且對於細胞沒有毒性者。

作為顯示pH緩衝作用的成分，可以列舉三(羥甲基)胺基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、各種磷酸鹽、各種碳酸鹽等。

液體培養基之滲透壓調整，通常係使用已調整了鉀離子、鈉離子、鈣離子、葡萄糖等之濃度的水溶液，使和細胞之滲透壓大致相同。該水溶液具體而言可以列舉磷酸緩衝生理食鹽水、三(羥甲基)胺基甲烷緩衝生理食鹽水、HEPES緩衝生理食鹽水等生理食鹽水；乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、重碳酸林格氏液等林格氏液；等。

作為細胞的營養成分可列舉胺基酸、核酸、維生素類、礦物質類等。

作為液體培養基可以利用RPMI-1640、HAM、α-MEM、DMEM、EMEM、F-12、F-10、M-199等各種市售品。

液體培養基中也可以摻合添加劑。作為添加劑可以列舉蛋白質等分化誘導因子、有分化誘導活性之低分子化合物、礦物質、金屬、維生素成分等。

作為分化誘導因子可以列舉，作用於細胞表面之受體的配體、致效劑、及拮抗劑；核內受體之配體、致效劑、及拮抗劑；膠原蛋白及纖網蛋白(fibronectin)等細胞外基質；模擬細胞外基質之一部分或細胞外基質的化合物；作用於涉及細胞內之資訊傳遞路徑的蛋白質的成分；作用於細胞內之1次代謝或2次代謝之酵素的成分；對細胞內之核內或粒線體內之基因表現給予影響的成分；編碼為類胰導素增殖因子等細胞增殖因子之基因的DNA、設計成對於蛋白酶等細胞內控制因子有干涉RNA作用的微小RNA等RNA且能利用微注射法、流體動力學(hydrodynamics)法、電穿孔法、脂轉染法等方法和病毒載體等組合並導入到細胞內的DNA、RNA；等。

該等添加劑可單獨使用一種、或組合使用二種以上。

細胞的培養條件不特別限定，可以因應使用的細胞、目的等適當決定。

例如可使用固定維持二氧化碳濃度為約5%、溫度為20℃~37℃之範圍內並加濕的恆溫器進行細胞培養。

本發明使用之含脂環結構之聚合物成形體係將含脂環結構之聚合物成形為任意形狀而成者。

含脂環結構之聚合物是於主鏈及/或側鏈具脂環結構之樹脂，考量機械強度、耐熱性等觀點，宜為主鏈含有脂環結構者較佳。

前述脂環結構可以列舉飽和環狀烴(環烷)結構、不飽和環狀烴(環烯)結構等，考量機械強度、耐熱性等觀點，宜為環烷結構、環烯結構等，其中，有環烷結構者最理想。

構成脂環結構之碳原子數無特殊限制，通常為4~30個，較佳為5~20個，更佳為5~15個。當構成脂環結構之碳原子數為此範圍內時，機械強度、耐熱性、及成形性之特性能高度地取得均衡性，為較理想。

含脂環結構之聚合物中之具脂環結構之重複單元之比例可因應使用目的適當選擇，通常為30重量%以上，較佳為50重量%以上，更佳為70重量%。含脂環結構之聚合物中之具脂環結構之重複單元之比例若過少，則耐熱性差，不理想。含脂環結構之聚合物中之具脂環結構之重複單元以外的其餘部分無特殊限定，可以因應使用目的適當選擇。

含脂環結構之聚合物，就具體例可列舉(1)降冰片烯(norbornene)系聚合物、(2)單環之環狀烯烴系聚合物、(3)環狀共軛二烯系聚合物、(4)乙烯基脂環族烴系聚合物、及(1)~(4)之氫化物等。該等之中，考量耐熱性、機械強度等觀點，降冰片烯系聚合物及其氫化物為較佳。

(1)降冰片烯系聚合物

降冰片烯系聚合物係將具有降冰片烯骨架之單體即降冰片烯系單體聚合而成者，可大致分成，利用開環聚合而得者，以及利用加成聚合而得者。

作為利用開環聚合而得者，可以列舉，降冰片烯系單體之開環聚合物及降冰片烯系單體和能與其進行開環共聚合之其他單體的開環聚合物、及該等之氫化物等。作為利用加成聚合而得者，可以列舉，降冰片烯系單體之加成聚合物及降冰片烯系單體和能與其進行共聚合之其他單體的加成聚合物等。該等之中，考量耐熱性、機械強度等觀點，降冰片烯系單體之開環聚合物氫化物較理想。

作為降冰片烯系單體，可列舉雙環[2.2.1]庚-2-烯(慣用名降冰片烯)、5-甲基-雙環[2.2.1]庚-2-烯、5,5-二甲基-雙環[2.2.1]庚-2-烯、5-乙基-雙環[2.2.1]庚-2-烯、5-亞乙基-雙環[2.2.1]庚-2-烯、5-乙烯基-雙環[2.2.1]庚-2-烯、5-丙烯基雙環[2.2.1]庚-2-烯、5-甲氧基羰基-雙環[2.2.1]庚-2-烯、5-氰基雙環[2.2.1]庚-2-烯、5-甲基-5-甲氧基羰基-雙環[2.2.1]庚-2-烯等2環族單體；三環[4.3.0^1,6.1^2,5]癸-3,7-二烯(慣用名二環戊二烯)、2-甲基二環戊二烯、2,3-二甲基二環戊二烯、2,3-二羥基二環戊二烯等3環族單體；四環[4.4.0.1^2,5.1^7,10]-3-十二烯(四環十二烯)、四環[4.4.0.1^2,5.1^7,10]-3-十二烯、8-甲基四環[4.4.0.1^2,5.1^7,10]-3-十二烯、8-乙基四環[4.4.0.1^2,5.1^7,10]-3-十二烯、8-亞乙基四環[4.4.0.1^2,5.1^7,10]-3-十二烯、8，9-二甲基四環[4.4.0.1^2,5.1^7,10]-3-十二烯、8-乙基-9-甲基四環[4.4.0.1^2,5.1^7,10]-3-十二烯、8-亞乙基-9-甲基四環[4.4.0.1^2,5.1^7,10]-3-十二烯、8-甲基-8-羧基甲基四環[4.4.0.1^2,5.1^7,10]-3-十二烯、7，8-苯并三環[4.3.0.1^2,5]癸-3-烯(慣用名甲橋四氫茀：也稱為1,4-甲橋-1,4,4a,9a-四氫茀)、1,4-甲橋-8-甲基-1,4,4a,9a-四氫茀、1,4-甲橋-8-氯-1,4,4a,9a-四氫茀、1,4-甲橋-8-溴-1,4,4a,9a-四氫茀等4環族單體；等。

作為能和降冰片烯系單體進行開環共聚合之其他單體，可列舉環己烯、環庚烯、環辛烯、1,4-環己二烯、1,5-環辛二烯、1,5-環癸二烯、1,5,9-環十二碳三烯、1,5,9,13-環十六碳四烯等單環之環烯烴系單體。

該等單體也可有1種或2種以上取代基。作為取代基可列舉烷基、伸烷基、芳基、矽烷基、烷氧基羰基、亞烷基等。

作為能和降冰片烯系單體進行加成共聚合之其他單體，可以列舉乙烯、丙烯、1-丁烯、1-戊烯、1-己烯等碳數2~20之α-烯烴系單體；環丁烯、環戊烯、環己烯、環辛烯、四環[9.2.1.0^2,10.0^3,8]十四碳-3,5,7,12-四烯(也稱為3a,5,6,7a-四氫-4,7-甲橋-1H-茚)等環烯烴系單體；1,4-己二烯、4-甲基-1,4-己二烯、5-甲基-1,4-己二烯、1,7-辛二烯等非共軛二烯系單體；等。

該等之中，就能和降冰片烯系單體進行加成共聚合之其他單體而言，宜為α-烯烴系單體較理想，乙烯更理想。

該等單體也可以有1種或2種以上取代基。作為取代基可列舉烷基、伸烷基、芳基、矽烷基、烷氧基羰基、亞烷基等。

降冰片烯系單體之開環聚合物、或降冰片烯系單體與能和其進行開環共聚合之其他單體之開環聚合物，可利用使單體成分於公知之開環聚合觸媒之存在下聚合而得。作為開環聚合觸媒，可使用例如，由釕、鋨等金屬之鹵化物、硝酸鹽或乙醯基丙酮化合物、與還原劑構成之觸媒，或由鈦、鋯、鎢、鉬等金屬之鹵化物或乙醯基丙酮化合物、與有機鋁化合物構成的觸媒。

降冰片烯系單體之開環聚合物氫化物，通常可藉由在上述開環聚合物之聚合溶液添加包括鎳、鈀等過渡金屬之公知之氫化觸媒，並將碳-碳不飽和鍵予以氫化而得。

降冰片烯系單體之加成聚合物、或降冰片烯系單體和能與其進行共聚合之其他單體之加成聚合物，可藉由使單體成分於公知之加成聚合觸媒之存在下聚合而得。加成聚合觸媒可使用例如由鈦、鋯或釩化合物與有機鋁化合物構成的觸媒。

(2)單環之環狀烯烴系聚合物

作為單環之環狀烯烴系聚合物可使用例如，環己烯、環庚烯、環辛烯等單環之環狀烯烴系單體之加成聚合物。

(3)環狀共軛二烯系聚合物

作為環狀共軛二烯系聚合物，例如可使用將環戊二烯、環己二烯等環狀共軛二烯系單體進行1,2-或1,4-加成聚合而得之聚合物及其氫化物等。

(4)乙烯基脂環族烴聚合物

作為乙烯基脂環族烴聚合物，可列舉例如，乙烯基環己烯、乙烯基環己烷等乙烯基脂環族烴系單體之聚合物及其氫化物；苯乙烯、α-甲基苯乙烯等乙烯基芳香族系單體之聚合物之芳香環部分之氫化物；等。乙烯基脂環族烴聚合物也可為和能與該等單體共聚合之其他單體之共聚物。

含脂環結構之聚合物之分子量無特殊限制，以環己烷溶液(聚合物不溶解時，則採用甲苯溶液)之凝膠滲透層析測得之以聚苯乙烯換算之重量平均分子量通常為5,000以上，較佳為5,000~500,000，更佳為8,000~200,000，尤佳為10,000~100,000。重量平均分子量若為此範圍內，則機械強度與成形加工性達成高度的均衡性，為較理想。

含脂環結構之聚合物之玻璃轉移溫度可因應使用目的適當選擇，通常為50~300℃，較佳為100~280℃，尤佳為115~250℃，又更佳為130~200℃。玻璃轉移溫度為此範圍內時，耐熱性與成形加工性達成高度的均衡性，為較理想。

本發明中，玻璃轉移溫度係依據JIS K 7121進行測定。

該等含脂環結構之聚合物可以分別單獨使用，或組合使用2種以上。

又，含脂環結構之聚合物中也可以通常採用的量添加熱塑性樹脂材料通常使用的摻合劑、例如，軟質聚合物、抗氧化劑、紫外線吸收劑、光安定劑、近紅外線吸收劑、脫模劑、染料、顏料等著色劑、塑化劑、抗靜電劑、螢光增白劑等摻合劑。

又，含脂環結構之聚合物中也可以混合軟質聚合物以外的其他聚合物(以下簡稱為「其他聚合物」)。在含脂環結構之聚合物混合的其他聚合物的量，相對於含脂環結構之聚合物100重量份通常為200重量份以下，較佳為150重量份以下，更佳為100重量份以下。

對於含脂環結構之聚合物摻合之各種摻合劑、其他聚合物之比例若過多，則細胞內信號傳遞系蛋白質之磷酸化亢進能力降低，所以皆宜於無損含脂環結構之聚合物之性質的範圍內摻合較佳。

和摻合劑、其他聚合物混合的方法，只要是能將摻合劑充分分散在聚合物之方法即可，無特殊限定。又，摻合順序無特殊限制。摻合方法，可列舉例如，使用混合機、單軸混練機、雙軸混練機、輥、塑譜儀(brabender)、擠壓機等將樹脂於熔融狀態混練之方法、溶於適當溶劑使其分散後再利用凝固法、鑄塑法、或直接乾燥法去除溶劑之方法等。

使用雙軸混練機時，常於混練後，通常以熔融狀態擠製成棒狀，並以股線裁切器切成適當長度並造粒後使用。

含脂環結構之聚合物之成形方法，可因應和細胞接觸時使用之含脂環結構之聚合物成形體之形狀而任意選擇。成形方法，例如，射出成形法、擠壓成形法、鑄塑成形法、膨發成形法、吹塑成形法、真空成形法、壓製成形法、壓縮成形法、旋轉成形法、壓延成形法、壓延成形法、切削成形法、紡紗等，也可組合該等成形法、或於成形後視需要實施延伸等後處理。

如此獲得之成形體係本發明之ERK或AKT之磷酸化亢進劑。

含脂環結構之聚合物成形體之形狀無特殊限制，可以為板狀、粉狀、粒狀、帶狀、片狀、其他各種形狀。又，其表面可為平坦也可以有凹凸形狀，也可以為中空狀之成形體。又，也可以將不同形狀的成形體介由或不介由黏著劑等組合成為其他的成形體。

又，只是要能和細胞接觸，可以為構成培養皿、板、袋、管、支架、杯、缸式發酵槽等培養容器；攪拌葉、攪拌子、擋板、連結管等培養裝置的零件；移液管、攪拌元件、濾器、細胞刮棒等培養操作使用之培養器具；等的一部分或全部的構件。

本發明中，當使成形體和培養細胞接觸時，宜將成形體進行滅菌處理較佳。滅菌處理之方法無特殊限制，可以因應成形體之形狀、使用之細胞從高壓蒸氣法、乾熱法等加熱法；照射γ射線、電子束等放射線之放射線法、照射高頻波之照射法等；使和環氧乙烷氣體(EOG)等氣體接觸之氣體法；等在醫療領域一般採用的方法中選擇。從磷酸化亢進活性之高度的觀點，宜為和環氧乙烷氣體等氣體接觸的氣體法為較佳。

又，也可對於該等成形體表面實施電漿處理、電暈放電處理、臭氧處理、紫外線照射處理等對於培養容器一般實施之滅菌目的以外之處理，但考慮ERK、AKT等之磷酸化亢進速度之觀點，宜不實施該等處理而使用較佳。

使培養細胞和為本發明之ERK或AKT之磷酸化亢進劑之含脂環結構之聚合物成形體接觸之方法，可以因應ERK或AKT之磷酸化亢進劑之形狀而採用任意方法。例如，在已混合為ERK或AKT之磷酸化亢進劑之含脂環結構之聚合物成形體之培養基中培養細胞之方法；在使用含脂環結構之聚合物成形之培養容器內培養細胞之方法；採用使用含脂環結構之聚合物成形之培養器具進行培養操作之方法；等，也可組合此等方法。

又，細胞有資訊傳達能力，所以不須使培養中的全部培養細胞接觸含脂環結構之聚合物成形體，而且無須在培養的整個期間使兩者接觸。惟接觸的效果會隨時間降低，所以接觸時間宜長為較佳。

培養細胞與含脂環結構之聚合物成形體之接觸溫度只要是細胞能增殖之溫度即可，無特殊限制。

【實施例】

以下舉實施例對於本發明具體說明，但是本發明不限定於該等實施例。

[製造例1]

使用Zeonex(註冊商標)790R(日本Zeon公司製，降冰片烯系開環聚合物氫化物；以下簡稱為「790R」)作為含脂環結構之聚合物，利用射出形成法獲得直徑35mm的培養皿狀的培養容器，然後實施環氧乙烷滅菌處理。以下稱此培養容器為「790R製容器」。

[製造例2]

將製造例1中的790R換成使用Zeonor(註冊商標)1430R(日本Zeon公司製，降冰片烯系開環聚合物氫化物；以下簡稱「1430R」)，除此以外和製造例1同樣進行而獲得培養容器。以下稱此培養容器為「1430R製容器」。

[製造例3]

將製造例1之790R換成使用Zeonor(註冊商標)1060R(日本Zeon公司製，降冰片烯系開環聚合物氫化物；以下簡稱「1060R」)，除此以外和製造例1同樣進行而獲得培養容器。以下稱此培養容器為「1060R製容器」。

[製造例4]

依以下方式進行電漿照射，製成已施行表面之親水化處理的培養容器，以使貼附型細胞容易黏著。

首先，使用790R利用射出形成法獲得直徑35mm之培養皿狀之培養容器後，實施電漿照射，對於容器表面施以親水化處理。然後，對其進行環氧乙烷滅菌處理。以下稱此培養容器為「表面親水化790R製容器」。

[製造例5]

將製造例4中的790R換成使用1430R，除此以外和製造例4同樣進行而獲得培養容器。以下稱此培養容器為「表面親水化1430R製容器」。

[實施例1]

於裝有培養基2ml之790R製容器以細胞密度1.25×10⁴細胞/cm²接種CHO細胞，放入設為溫度37℃、CO₂濃度5%的CO₂培養箱，培養5日後，依後述方法實施ERK之磷酸化之分析。

[實施例2]

將實施例1中之790R製容器換成使用1430R製容器，除此以外和實施例1同樣實施培養，並進行ERK之磷酸化之分析。

[實施例3]

將實施例1中之790R製容器換成使用表面親水化790R製容器，除此以外和實施例1同樣進行培養，並進行ERK之磷酸化之分析。

[實施例4]

將實施例1中之790R製容器換成使用表面親水化1430R製容器，除此以外和實施例1同樣進行培養並進行ERK之磷酸化之分析。

[比較例1]

將實施例1中之790R製容器換成使用市售的經過親水化處理的聚苯乙烯製培養皿[Falcon(註冊商標)培養皿(Becton Dickinson公司製，型號353001)](以下稱為「聚苯乙烯製容器」)，除此以外和實施例1同樣進行培養並進行ERK之磷酸化之分析。

(ERK之磷酸化之分析)

對於從790R製容器回收的細胞試樣添加含有具有蛋白質變性作用的SDS(十二基硫酸鈉)的電泳用緩衝液，於100℃進行5分鐘加溫處理使細胞試樣溶解。將其於4℃靜置5分鐘，然後進行離心處理，將不溶物沉澱除去，製備成電泳用試樣。

同樣，使用以1430R製容器、表面親水化790R製容器、表面親水化1430R製容器、及聚苯乙烯製容器培養的細胞，分別製備電泳用試樣。

電泳用試樣各準備2份。

將獲得的各電泳用試樣通入預鑄膠片(Nacalai tesque公司製)之電泳樣本齒梳，施加電壓進行SDS-聚丙烯醯胺電泳。

其次，取出經電泳操作的丙烯醯胺凝膠，使用西方點墨用轉印裝置(Nihon Eido公司製)，將在丙烯醯胺凝膠中已泳動展開的蛋白質轉印到硝基纖維素膜(CST公司製)。

藉由將轉印後之硝基纖維素膜浸於在含有最終濃度0.05%之Tween(註冊商標)20之Tris磷酸緩衝液(以下稱為「緩衝液TBS-T」)中含有脫脂奶的阻斷溶液，於室溫搖動1小時，以進行硝基纖維素膜面之阻斷處理。然後，浸於緩衝液TBS-T中5分鐘並洗滌硝基纖維素膜，重複此洗滌操作3次。

調製於含有5%BSA之緩衝液TBS-T中添加了作為1次抗體之無論是否磷酸化均能專一性地檢測ERK1及ERK2之抗體即抗ERK抗體(CST公司製)而得的溶液，並將硝基纖維素膜浸於此溶液中16小時。

同樣，調製於含有5%BSA之緩衝液TBS-T中添加了作為1次抗體之專一性地檢測磷酸化ERK1及磷酸化ERK2之抗體即抗磷酸化ERK抗體(CST公司製)而得之溶液，並將硝基纖維素膜浸於此溶液16小時。

將已浸於抗ERK抗體溶液之硝基纖維素膜、及已浸於抗磷酸化ERK抗體溶液之硝基纖維素膜，分別以緩衝液TBS-T浸泡5分鐘並洗滌，重複3次此洗滌操作。然後，將已浸於抗ERK抗體溶液並已洗滌的硝基纖維素膜、及已浸於抗磷酸化ERK抗體溶液並已洗滌的硝基纖維素膜浸入到含有用以檢測硝基纖維素膜面上之1次抗體之2次抗體的含5%BSA之緩衝液TBS-T，並於室溫進行1小時搖動處理。

搖動處理後，浸於緩衝液TBS-T內5分鐘並洗滌，重複此洗滌操作3次。

將上述膜浸於檢測呈色試藥1-Step-Ultra TMB Blotting Solution(Pierce公司製)，藉由於膜上使其進行呈色反應，檢測ERK或磷酸化ERK之免疫反應信號。

使用數位相機(Riccoh公司製)拍攝已經將免疫反應信號進行呈色處理的硝基纖維素膜，將獲得之圖像作為對象，使用ImageJ將免疫反應之信號強度轉換成數值。

為了比較ERK之磷酸化效果，針對各容器，求出抗磷酸化ERK抗體之反應信號值除以抗ERK抗體之反應信號值(全ERK)而得之值後，再求出將比較對照之聚苯乙烯製容器中的數值作為基準(亦即1)時，790R製容器、表面親水化790R製容器、1430R製容器、表面親水化1430R製容器中的各別的數值。

如第1圖，在790R製容器及1430R製容器培養的CHO細胞內的ERK-1之磷酸化活化顯示為在聚苯乙烯製容器培養的CHO細胞的4倍以上，：且細胞由於和含脂環結構之聚合物接觸，ERK-1之磷酸化亢進。

即使在使用將790R製的表面予以親水化而得之表面親水化790R製容器與將1430R製容器予以親水化之表面親水化1430R製容器進行的培養中，也見到相對於使用聚苯乙烯製容器之培養為2倍之磷酸化亢進。

針對ERK-2之磷酸化，如第2圖所示，確認使用 790R製容器時相對於聚苯乙烯製容器時有約4倍之磷酸化亢進，並確認使用1430R製容器時有約5倍程度之磷酸化亢進。

又，使用表面親水化790R製容器、及表面親水化1430R製容器時，也觀察到相對於使用聚苯乙烯製容器有2倍的ERK-2之磷酸化亢進。

[實施例5]

將實施例1中之CHO細胞換成使用VERO細胞，除此以外和實施例1同樣進行，使用790R製容器進行培養並進行ERK之磷酸化之分析。

[實施例6]

將實施例5中的790R製容器換成1430R製容器，除此以外和實施例5同樣進行培養，並進行ERK之磷酸化之分析。

[比較例2]

將實施例5之790R製容器換成使用聚苯乙烯製容器，除此以外和實施例5同樣進行培養並進行ERK之磷酸化之分析。

如第3圖所示，確認在790R製容器培養的VERO細胞中，相對於使用聚苯乙烯製容器時有約2倍之ERK-1之磷酸化亢進，使用1430R製容器時，有約2倍以上之ERK-1之磷酸化亢進。

如第4圖所示，關於ERK-2之磷酸化，當使用790R製容器或1430R製容器時，均觀察到相對於使用聚苯乙烯製容器時有約1.5倍之亢進。

如上，顯示VERO細胞也和CHO細胞同樣藉由和含脂環結構之聚合物接觸會獲致ERK之磷酸化之亢進效果。

[實施例7]

以和實施例1同樣的條件培養細胞後，依後述方法實施AKT之磷酸化之分析。

[實施例8]

將實施例7中的790R製容器換成使用1060R製容器，除此以外和實施例7同樣進行培養並實施AKT之磷酸化之分析。

[比較例3]

將實施例7中之790R製容器換成使用聚苯乙烯製容器，除此以外和實施例7同樣進行培養並實施AKT之磷酸化之分析。

(AKT之磷酸化之分析)

將前面記載的ERK之磷酸化之分析方法中的抗ERK抗體，換成使用抗AKT抗體，並將抗磷酸化ERK抗體換成使用抗磷酸化AKT抗體，除此以外依和ERK之磷酸化之分析方法為同樣的方法分析細胞內的AKT之磷酸化。

如第5圖所示，關於CHO細胞之AKT之磷酸化，使用790R製容器或1060R製容器時，均相對於使用聚苯乙烯製容器時觀察到有約1.5倍之亢進。

[製造例6]

在內徑20mm、厚度1mm、長度18mm之Pyrex(註冊商標)製玻璃筒的底面加熱黏著1430R製薄膜，對其施以γ射線滅菌處理，獲得培養杯。稱此杯為「1430R製杯」。

[製造例7]

對於製造例6中的1430R薄膜預先施以電漿處理，除此以外和製造例6同樣進行，獲得表面親水的杯。稱此杯為「表面親水化1430R製杯」。

[實施例9]

於1430R製杯添加培養基[在Ham培養基(Nacalai公司製)添加了終濃度10%之胎牛血清(Fetal Bovine Serum(FBS))之物]，以細胞密度1.25×10⁴細胞/cm²接種CHO細胞，放入設為溫度37℃、CO₂濃度5%之CO₂培養箱，培養3週(重複試樣數N=3)。

培養3週後，利用胰蛋白酶處理回收細胞，添加錐蟲藍(trypan blue)(DS Pharma公司製)將死細胞染色，使用Thoma型血球計算板(Eruma公司製，登記號13B1X90004000005)計數活細胞數。

[比較例4]

在實施例9中，使用在聚苯乙烯製之12井板之各井內裝有內徑20mm、厚度1mm、長度18mm之Pyrex(註冊商標)製玻璃筒(和1430R製杯的尺寸相同的玻璃筒)者(稱為「聚苯乙烯製板」)作為培養容器，除此以外和實施例9同樣進行培養並計數活細胞數。

如第6圖所示，可知相較於聚苯乙烯製板，1430R製杯有約1.7倍之維持活細胞之效果。

[實施例10]

將實施例9中之CHO細胞換成使用VERO細胞，並將培養基改為使用於MEM培養基(Nacalai公司製)添加了終濃度10%之牛血清(Calf Serum(CS))者，除此以外和實施例9同樣進行，使用1430R製杯培養並計數活細胞數。

[比較例5]

將實施例10中的1430R製杯換成使用聚苯乙烯製板，除此以外和實施例10同樣進行培養並計數活細胞數。

如第7圖所示，可知1430R製杯，對於VERO細胞也和對於CHO細胞同樣，相較於聚苯乙烯製板有約1.7倍之維持活細胞之效果。

[實施例11]

和實施例9同樣使用1430R製杯培養CHO細胞3週，之後藉由使用LDH測定套組(Takarabio公司製)測定培養液中之乳酸去氫酶的酵素活性(LDH活性)，以探討來自細胞內之漏洩。

[實施例12]

將實施例11中之1430R製杯改為使用表面親水化1430R製杯，除此以外和實施例11同樣進行細胞培養，並測定LDH活性。

[比較例6]

將實施例11中之1430R製杯換成使用聚苯乙烯製板，除此以外和實施例11同樣進行細胞培養，並測定LDH活性。

計算令以聚苯乙烯製板培養3週時培養液中之LDH活性為1時，以1430R製杯、及表面親水化1430R製杯分別培養3週時培養液中之LDH活性。

如第8圖所示，使用表面親水化1430R製杯時比起使用聚苯乙烯製板時的漏洩物少約40%，使用1430R製杯時比起使用聚苯乙烯製板時的漏洩物少約60%。

[實施例13]

和實施例10同樣使用1430R製杯培養VERO細胞3週，之後使用LDH測定套組(Takarabio公司製)測定培養液中之LDH之酵素活性，以探討來自細胞內之漏洩。

[實施例14]

將實施例13中之1430R製杯換成使用表面親水化1430R製杯，除此以外和實施例13同樣進行而培養細胞，並測定LDH活性。

[比較例7]

將實施例13中之1430R製杯換成使用聚苯乙烯製板，除此以外和實施例13同樣進行而培養細胞，並測定LDH活性。

計算令於聚苯乙烯製板培養3週時培養液中之LDH活性為1時，於1430R製杯、及表面親水化1430R製杯分別培養3週時培養液中之LDH活性。

如第9圖所示，於VERO細胞中，使用表面親水化1430R製杯時比起使用聚苯乙烯製板時的漏洩物少約20%，使用1430R製杯時比起使用聚苯乙烯製板時的漏洩物少約50%。

如上述，可確認，不論細胞之種類，含脂環結構之聚合物成形體有抑制細胞內容物漏洩之效果。

[實施例15]

將實施例2之培養期間改為2週，除此以外和實施例2同樣進行而進行培養，並進行ERK之磷酸化之分析。

[實施例16]

將製造例2之EOG滅菌處理換為實施γ射線滅菌處理，除此以外和製造例2同樣進行，獲得培養容器。

使用此培養容器，除此以外和實施例15同樣進行培養，並進行ERK之磷酸化之分析。

[實施例17]

將製造例2之EOG滅菌處理換成施行蒸氣滅菌處理，除此以外和製造例2同樣進行，獲得培養容器。

使用此培養容器，除此以外和實施例15同樣進行培養並進行ERK之磷酸化之分析。

[比較例8]

實施例15中使用Becton Dickinson製FALCON容器(經γ射線滅菌)，除此以外和實施例15同樣進行培養並進行ERK之磷酸化之分析。

ERK之磷酸化之分析和上述同樣進行。

令使用比較對照之FALCON容器時之p44 ERK、及p42 ERK之值為100，分別求出使用EOG滅菌處理容器、γ射線滅菌處理容器、及蒸氣滅菌處理容器之值作為相對值，將p44之活化之比較示於第10圖，p42之活化之比較示於第11圖。

針對p44 ERK之活化，1430製容器比FALCON容器還高。又，若比較滅菌方法，可知EOG滅菌處理得到活性最高的結果(第10圖)。

針對p42 ERK之活化，1430製容器比FALCON容器還高。又，若比較滅菌方法，可知EOG滅菌處理得到活性最高的結果(第11圖)。

[產業利用性]

依照本發明，即使沒有特別的添加因子也能使細胞內信號傳遞系蛋白質ERK或AKT之磷酸化所致之活化亢進。所以，能夠抑制培養細胞之死滅並維持活細胞，並且藉由減少死滅細胞而抑制來自細胞內之漏洩物。

藉由利用本發明，據認為當在重組醫藥品生產等利用細胞培養時，能夠長期間維持細胞並使生產持續。再者，細胞內成分之漏洩少，所以能減少重組醫藥品精製步驟的負荷，就結果而言，生產效率良好，有助於經濟性改善。

於重組醫藥品之製造，能使來自細胞內之漏洩物更減少，能減少從醫藥品製品混入未知成分的風險，也能期待副作用風險減小。

也能期待因ERK等活化使細胞之分化效率變好，故對於再生醫療等，能以良好效率、短期間分化誘導成目的細胞。

Claims

一種培養細胞內之ERK(細胞外訊息調控激酶，Extracellular signal-Regulated Kinase)的磷酸化亢進方法，其特徵為：使含脂環結構之聚合物成形體接觸培養的細胞。
一種培養細胞內之AKT的磷酸化亢進方法，其特徵為：使含脂環結構之聚合物成形體接觸培養之細胞。
如申請專利範圍第1或2項之磷酸化亢進方法，其中，培養之細胞為貼附型細胞。
一種細胞的培養方法，其特徵為：使含脂環結構之聚合物成形體接觸培養的細胞，使培養細胞內的ERK(細胞外訊息調控激酶，Extracellular signal-Regulated Kinase)之磷酸化及/或AKT之磷酸化亢進。
一種培養細胞中之細胞內ERK的磷酸化亢進劑，係由含脂環結構之聚合物成形體構成。
一種培養細胞中之細胞內AKT的磷酸化亢進劑，係由含脂環結構之聚合物成形體構成。