TW201514496A - 偵測生物樣本中ａＳｙｎ抗體的方法 - Google Patents

Abstract

揭示一種偵測生物樣本中aSyn抗體的方法，係包含下列步驟：使該樣本接觸包含aSyn之沉積物，使該aSyn特異性抗體與該包含aSyn之沉積物結合；及以一單一粒子偵測技術，較佳為以螢光活化細胞分類技術〔fluorescence activated cell sorting，簡稱FACS〕偵測結合於該包含aSyn之沉積物之aSyn特異性抗體。

Description

偵測生物樣本中aSyn抗體的方法

本發明係關於一種偵測生物樣本中α共核蛋白〔alpha synuclein，簡稱aSyn〕抗體的方法，特別是用以診斷包括帕金森氏症〔Parkinson’s Disease，簡稱PD〕、路易體症〔Lewy Body disease，簡稱LBD〕、路易體癡呆症〔Dementia with Lewy Body，簡稱DLB〕、帕金森癡呆症〔Parkinson’s Disease Dementia，簡稱PDD〕、多發性系統退化症〔Multiple System Atrophy，簡稱MSA〕、單純自主神經衰竭症〔Pure Autonomic Failure，簡稱PAF〕、快速動眼睡眠行為障礙〔REM Sleep Behavior Disorder，簡稱RBD〕、第一型腦內鐵沉積性神經系統退化症〔Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation type I，簡稱NBIA Type I〕及包涵體肌炎〔Inclusion Body Myositis，簡稱IBM〕等共核蛋白症〔Synucleinopathies〕的方法。本發明係關於一種偵測生物樣本中aSyn抗體的方法，特別是用以診斷具有aSyn堆積及/或沉積作用的疾病，包括阿茲海默症〔Alzheimer’s disease，簡稱AD〕、唐氏症〔Down Syndrome，簡稱DS〕、進行性上眼神經核麻痺症〔Progressive Supranuclear Palsy，簡稱PSP〕、皮質基底退化症〔Corticobasal Degeneration，簡稱CBD〕及額顳葉癡呆症/皮克氏症〔Frontotemporal Dementia/Pick’s Disease，簡稱FTD/PiD〕。

共核蛋白症係為神經退化性失調的一個變化的疾病群體，具 有一共通的病理特徵：在選擇之神經細胞與神經膠細胞〔glia cell〕中的神經病理檢驗中，會檢測到具有α共核蛋白〔aSyn〕異常沉積物的特徵性損傷。

aSyn〔剛開始被定義為PARK1和PARK4〕係為一全長140 個胺基酸的蛋白質，廣泛表現於該大腦新皮質〔neocortex〕、海馬迴〔hippocampus〕、齒狀迴〔dentate gyrus〕、嗅球〔olfactory bulb〕、紋狀體〔striatum〕、視丘〔thalamus〕、小腦〔cerebellum〕及周邊神經與神經節，例如結腸或肌肉組織中；該蛋白質之主要型態為完整140個胺基酸長的副本，而其他異構物為缺失外顯子〔exon〕3及5的aSyn-98〔alpha-synuclein-98〕、缺失外顯子3及第41個~第54個胺基酸殘基的aSyn-126〔alpha-synuclein-126〕和因為缺失外顯子5而缺少第103個~第130個胺基酸殘基的aSyn-112〔alpha-synuclein-112〕；aSyn也於造血細胞中高度表現，包括B細胞、T細胞、自然殺手細胞、單核細胞及血小板，在該些細胞當中所扮演的角色仍不明確，但已知涉及巨核細胞〔megakaryocyte，血小板前驅物〕的分化。

最常見的共核蛋白症包含帕金森氏症、路異體症、路異體癡 呆症、帕金森癡呆症、多發性系統退化症、單純自主神經衰竭症、快速動眼睡眠行為障礙、第一型腦內鐵沉積性神經系統退化症及包涵體肌炎。

目前該些病症的治療選項，包括使用針對症狀的藥物治療， 例如L-多巴〔L-dopa〕、多巴胺〔dopamine〕的促效劑〔agonist〕、抗膽鹼藥物或是單胺氧化酶〔monoamine oxidase〕的抑制劑；但是，目前存在之藥物都只能緩解症狀，而無法在患者中達到永久性的病症改善效果。

路易體症是漸進式的神經退化病症，特徵是顫震 〔tremor〕、僵化〔rigidity〕、運動遲緩〔bradykinesia〕以及腦內多巴胺神經的損失，而在路易體癡呆症及帕金森癡呆症的特徵中，更包括認知功 能的衰退。西方國家60歲以上的人口中，會有高達2%會發展出帕金森氏症/路易體症的標準癥候，而目前只有針對症狀的治療是可行的，不幸的是，該些治療只對於早期的症狀提供暫時的緩解，且無法阻止病程的發展；帕金森氏症/路易體症的致病機轉仍未完全瞭解，但是目前已知基因感受性以及環境因子皆會影響病程的發展；儘管現今基因研究的進步，帕金森氏症/路易體症主要仍以未知原因的偶發性病症為主〔又稱為特發性帕金森氏症/路易體症(idiopathic PD/LBD)〕。

罹患該些疾病的患者，其大腦皮質及皮質下區域發展出特殊 的泛素化細胞內容物，稱為路易體〔Lewy bodies，簡稱LBs〕，而周邊神經元及神經節，例如結腸神經節〔colonic ganglia〕也具有此現象，特別是在高密度的多巴胺神經元〔dopaminergic neurons〕或神經突出部〔neuronal projections〕具有此標準病理特徵。近期數個研究中指出突觸蛋白aSyn在路易體症的致病機轉中扮演關鍵角色，在路易體症的患者中，aSyn聚集於路易體中，該些路易體遍佈受影響的腦域或周邊神經元及神經節。此外，已證實罕見的家族性帕金森氏症與aSyn的單點突變或基因劑量改變〔例如aSyn基因中的兩倍複製或數倍複製〕有關；並且重要地，來自模擬數個帕金森氏症/路易體症/路易體癡呆症特徵的基因轉殖小鼠及果蠅等動物模式之過量表現研究再次強調aSyn在帕金森氏症/路易體症致病機轉的關鍵角色。

另一個非常重要的共核蛋白症係為多發性系統退化症 〔MSA〕，為一具有L-多巴耐受性帕金森症狀〔L-DOPA-resistant parkinsonism〕、小腦失調〔cerebellar ataxia〕和自律神經失調〔dysautonomia〕等特徵之偶發性的神經退化性病症，多發性系統神經的損失之患者，影響及於多個腦區，包括紋狀體、黑質〔substantia nigra〕、小腦、腦橋〔pons〕、下橄欖體〔inferior olives〕及脊髓；多發性系統退 化症的特徵在於遍佈於中央神經系統中aSyn陽性〔aSyn-positive〕的神經膠細胞胞漿包涵體〔glial cytoplasmic inclusion；GCI〕及罕見的神經元包涵體，該些包涵體與紋狀體黑質變性退化〔striato-nigral degeneration〕、橄欖體腦橋小腦萎縮〔olivo-ponto-cerebellar atrophy〕有關，且涉及大腦髓質和脊髓中自律神經核。對於多發性系統退化症的致病機轉而言，神經膠細胞胞漿包涵體的重要性已為普遍認知，並且該重要性被強調在近年來以基因轉殖小鼠模式分析aSyn過量表現對於寡突膠細胞〔oligodendroglia〕的影響結果中：在過量表現人類aSyn的基因轉殖小鼠中，同時觀察到類神經膠細胞胞漿包涵體沉積物〔GCI-like aggregate〕和多發性系統退化症的生化標記。

雖然共核蛋白症中aSyn的聚集導致神經退化標準病癥的確 切機制尚未完全瞭解，但近來的研究中暗示aSyn不正常的生成與聚積涉及共核蛋白症中的退化過程。近來，路易體中不同型態的aSyn被鑑識，除了全長型態的蛋白外，包括磷酸化、亞硝化/硝化、乙醯化及單泛素化、雙泛素化及三泛素化的aSyn；此外，該蛋白質的C端缺失型態，例如aSyn 1-119、aSyn 1-122及aSyn 1-123等，皆在基因轉殖小鼠及帕金森氏症/多發性系統退化症患者的大腦組織中被偵測到。

目前相信在路易體及路易神經突〔Lewy neurite〕或神經膠 細胞胞漿包涵體中偵測到的aSyn有高達15%皆為缺失態的，而先前使用缺失態aSyn在試管內〔in vitro〕的實驗證實在路易神經突及路易體中，C端缺少20~30個胺基酸的aSyn具有增加沉積及形成纖維的傾向；此外，堆積在路易體中有將近90%的aSyn皆在絲胺酸129〔Serine 129〕被磷酸化，而相較之下，正常大腦中全部的aSyn只有4%被磷酸化，顯示絲胺酸129磷酸化aSyn的累積可能對帕金森氏症致病機轉很重要。因此，該aSyn的缺失及/或修飾態被認為是形成aSyn寡聚物/纖維的種子分子，全長及缺 失及/或修飾態的aSyn被相信會聚積導致沉積物生成；而基於最近的研究中，相信此沉積物的生成〔即寡聚物及纖維〕，例如在突觸末端和軸突中，對於帕金森氏症/路易體症/共核蛋白症的發展扮演著重要的角色，並且可因缺失/修飾態的aSyn存在而增強。

共核蛋白症的診斷，特別是路易體症/帕金森氏症及多發性 系統退化症，只能單純臨床的基於運動遲緩的逐漸發生及至少一項下列徵狀：肌肉僵化、4~6赫茲頻率的靜止顫震及/或不因主要視覺、前庭、小腦及本體感受失常所造成的姿勢不穩定〔Jankovic J.et al.J.Neurol.Neurosury.Psychiatr.(2008)79(4)：368-76.criteria：United Kingdom Parkinson’s Didease Society Brain Bank Diagnostic Criteria for Parkinson’s Disease and Criteria of diagnosis of Parkinson disease(Gelb et al.,1999)commissioned and supported by the Advisory Council of the National Institure of Neurological Disorders and Stroke,US National Institutes of Health〕。此外帕金森氏症/路易體症的診斷關鍵地藉由滿足額外輔助臨床表徵和排除其他可以間接造成一類帕金森氏症狀之阿茲海默症〔parkinsonian syndrome like Alzheimer's disease〕、多發性腦梗塞〔Multiple Cerebral Infarction〕及藥物引發帕金森氏症狀〔Drug-induced Parkinsonism〕的原因，而像是進行性上眼神經核麻痺症及多發性系統退化症等帕金森附加症〔Parkinson Plus Syndrome〕也必須被排除以建立一個可靠的帕金森氏症/路易體症診斷方式。

對多發性系統退化症的而言，可能的多發性系統退化症之診 斷需要一個偶發的、漸進性成人發病的失調，包括嚴格定義的自主神經衰退及低L-dopa反應性的帕金森症狀或小腦失調〔Gilman et al.Neurology.(2008)Aug 26；71(9)：670-6.Second consensus statement on the diagnosis of multiple system atrophy.〕。

帕金森氏症/路易體症/多發性系統衰退症的臨床診斷限制在 於其高誤診率〔具有最高的診斷率的專家，例如神經學家，其以解剖評估的診斷特異性為75~90%；Jankovic J J.Neurol.Neurosurg.Psychiatr.(2008)79(4)：368-76〕，及該診斷只可以於疾病的後期因為大幅的神經損失而產生功能性缺失時才能進行的事實。

除了臨床診斷外，顯像技術目前也被使用於實行共核蛋白症 的診斷上；患者經計算的斷層攝影和核磁共振〔magnetic resonance imaging；MRI〕腦部掃描通常呈現正常狀態，但可以藉此分析排除其他間接導致帕金森症狀的原因，例如基底核腫瘤〔basal ganglia tumor〕、心血管疾病以及水腦症〔Brooks DJ et al.J.Nucl.Med.(2010)51(4)：596-609〕。然而，藉由特化的核磁共振技術〔例如：擴散張量成像，diffusion tensor imaging(DTI)〕探索基底核的修飾及中腦核的結構，得到更一致且更可信的結果；單光子電腦斷層攝影〔single-photon emission computed tomography，SPECT〕或正子放色斷層掃描〔PET〕等多巴胺能性顯影〔dopaminergic imaging〕技術進一步用於區別多巴胺能性神經退化〔例如帕金森氏症/路易體症〕的型態，並與其他不會影響多巴胺能性系統的疾病進行區別，例如在診斷上不確定是退化性帕金森症狀或是非退化性的顫震障礙的患者，以多巴胺轉送配體〔dopamine transporter ligand〕[123I]碘氟潘〔ioflupane〕(DaTscan^TM)進行的基礎顯影參照三年的臨床診斷，具有78%的靈敏性及97%的特異性，相較之下，基礎臨床診斷則具有93%的靈敏性及46%的特異性〔Cummings JL et al.,Brain.(2011)；134(11)：3146-3166〕。

目前對於診斷共核蛋白症的法則苦於缺乏對於疾病前期可 靠的診斷靈敏性及特異性，而為了增強診斷能力，臨床和顯像資料被用以結合疾病特異性生物標記中病理生理上有意義的改變。該些改變如同例示 於阿茲海默症中以結構核磁共振〔structural MRI〕檢測的海馬迴退化、阿茲海默症標準小腦脊髓液的特徵〔AD-typical cerebrospinal fluid signature，低Aβ42、高tau總量、高磷酸化Tau〕、陽性澱粉樣蛋白顯影〔positive amiloid imaging〕、被定義的基因風險；作為阿茲海默症診斷過程中具一根本性改變的一依據〔Dubois et al.,Lancet Neurol.9(2010)：1118-1127〕，即如美國國家老齡化研究所〔National Institute of Aging，簡稱NIA〕、NIH NINCDS團隊及阿茲海默症協會〔The Alzheimer’s Association〕等國際監管機構和利益團體所建議。

不幸的是，直到現在都缺乏有效的生物標記資料以供帕金森 氏症/路易體症/多發性系統退化症使用，然而，一個由麥可J法克斯基金會〔Michael J Fox Foundation，為帕金森氏症而成立〕所領導的臨床及生醫研究者國際協會，最近開啟了帕金森氏症漸進性標記行動〔Parkinson’s disease progressive Markers Initiative，PPMI〕，進行一個重大的臨床觀察研究，使用先進顯影技術、生物樣本、臨床與行為的檢測，概括式地審視近期診斷的帕金森氏症患者及健康樣本，藉以鑑識出帕金森氏症病程進展的生物標記，其中主要的目標之一是把aSyn視為一個共核蛋白症可能的生物標記，檢測aSyn的水平在不同體液中的改變；該目標是基於aSyn對於疾病發展扮演中心角色的可能性以及aSyn在不同體組織及體液中的鑑定。由Lebouvier等人及Shannon等人證實了aSyn在帕金森氏症患者周邊組織的病理機制〔Lebouvier et al.,PLoS ONE(2010)5(9)：e12728；Shannon et al.,Mov.Disord.(2012)27：709-715〕；aSyn也於共核蛋白症患者及健康對照個體的腦脊髓液〔CSF〕及血漿中被鑑識出〔Borghi et al.Neuroscience Letters,(2000)287：1,pp65-67；Journal of Neural Transmission(2006),113,10 pp 1435-1439；Lee et al.,Experimental Neurology,(2007)204：2,pp583-588〕。有趣的是，有一個矛盾的證據存在於近期Qiao-Xin Li等 人關於健康個體與患者aSyn水平的研究中，指出帕金森氏症患者血漿中的aSyn水平顯著地低於同年齡的對照組(p=0.001)，並且在早發性的帕金森氏症患者中的aSyn水平低於晚發性的帕金森氏症患者及對照組，而在Lee等人的研究中則顯示帕金森氏症及多發性系統退化症患者血漿中的aSyn水平確實高於對照組；El-Agnaf及其同事可以證實在人類血漿中有聚集態〔寡聚態〕的aSyn存在，並且在從34位帕金森氏症患者血漿中的寡聚態aSyn水平高於27位對照組〔p=0.002〕〔El-Agnaf et al.,FASEB J.(2006)20,419-425〕；Smith及其同事則顯示了帕金森氏症與非帕金森氏症患者間，偵測不到顯著差異〔Smith et al.,PLoS ONE(2012)7(12)：e52285及其參考文獻〕；這些矛盾證實了於確認關鍵生物標記中出現的該些問題，及支持鑑定早期診斷之關鍵且經確認的生物標記之必須性。此外Wang等人也證實了腦脊髓液中後轉譯修飾的aSyn〔pS129〕的水平與帕金森氏症的病症嚴重程度不太有關，並且當與總aSyn濃度一起評估時，可以用以區分帕金森氏症及第二常見的共核蛋白症(多發性系統退化症)，以及第三常見之神經退化性疾病(進行性上眼神經核麻痺症，具有包含其他共核蛋白之蛋白病變損傷)〔Wang et al.,Sci Transl Med.(2012)Feb 15；4(121)〕。

除了僅僅偵測不同組織中aSyn的不同型態〔即全長、缺 失、磷酸化(最主要在S129)、亞硝化及泛酸化的aSyn及其寡聚物與沉積物〕之外，數個研究團隊可以從健康個體及特發性或遺傳性共核蛋白症患者的血清/血漿或血漿產物〔例如靜脈注射免疫球蛋白，IVIG〕中鑑別出直接抗aSyn的自體免疫抗體；Woulfe等人於2002年時已可以偵測帕金森氏症患者中抗aSyn抗體〔Neurology 58：(2002)1435-1436〕；Papachroni等人運用西方墨點呈色法檢驗了帕金森氏症患者與對照個體內周邊血清中抗共核蛋白家族成員的抗體存在，而抗單體β或γ共核蛋白的存在與帕金森氏症無關，然而在65%的檢測患者中卻可以檢測到抗單體aSyn的多抗原表 位抗體〔multi-epitopic Ab〕，與此疾病的遺傳性模式有強烈的關聯；在特發性的帕金森氏症患者中，該抗體的存在比例與對照組無明顯差異，但在家族性帕金森氏症患者中卻有非常高的比例〔90%〕〔Papachroni et al.,Journal of Neurochemistry,(2007)101：749-756〕。據此，Patrias等人也能夠從健康對照組獲得的三組靜脈注射免疫球蛋白製劑〔Gamunex(Talecris Biotherapeutics)、Gammagard(Baxter Healthcare)及Flebogamma(Grifols Biologicals)〕中，鑒定出特異性對抗aSyn單體及水溶性寡聚物〔包含單體及未定義的aSyn沉積物〕的抗體，該抗體在天然的靜脈注射免疫球蛋白製劑中被測量，並且在抗體-抗原複合物解構後，係以ELISA及西方墨點呈色法檢測反應性。

不同的報告中再一次提及關於在健康對照組與疾病患者中 抗aSyn的抗體水平，主要是基於習知ELISA及免疫染色技術所進行的分析；於2002年Woulfe等人無法藉由ELISA檢測出帕金森氏症患者與對照組間的差異，相較之下Gruden等人〔2011,2012〕和Yanamandra等人〔2011〕證實相較於對照組，帕金森氏症患者中抗aSyn抗體相對增加，特別是在病症的早期〔相較於對照組，帕金森氏症早期(Hoehn及Yahr 1-2期)及晚期(Hoehn及Yahr 2.5-4期)增加最多〕，而晚期帕金森氏症患者中相較於對照組則只可以偵測到較少的增加情形；Yanamandra等人使用抗單體aSyn抗體反應性的ELISA及免疫染色分析，能夠證實在早期帕金森式症患者之組別中63%的個體展現出高度的反應〔相較於對照組，平均水平增加5倍而水平中位數增加10倍〕。在帕金森氏症後期的組別中免疫反應下降，相較於對照組表現出大約4及6倍於平均數及中位數的增加〔各自P值為0.007〕，且大約58%的患者顯示高抗體水平；此報告中也統計上地估測該ELISA及西方墨點呈色分析法之診斷潛力〔接受者操作特徵(receiver operating characteristic，簡稱ROC)分析〕。相較於對照組，早 期及晚期帕金森氏症患者中，以ELISA檢測之針對自體免疫反應性的該接受者操作特徵曲線的下方區域〔area under the ROC curve，簡稱AUC〕分別為0.884〔95%信賴區間為0.79至0.97〕及0.779〔0.6~0.95〕，計算西方墨點呈色法數據相關的該接受者操作特徵，相較於對照組，該接受者操作特徵曲線的下方區域之價值，對於早期及晚期帕金森氏症分別為0.85〔0.74~0.95〕及0.817〔0.67~0.95〕，上述表明在早期及晚期帕金森氏症患者中，對於單體aSyn的該自體免疫反應具有一診斷的價值，然而，理想設定只可以供鑑定大約60%的患者；對於寡聚合的aSyn種類偵測不到有意義的結合，及對於纖維的aSyn的反應性分析也顯示對於早期帕金森氏症、晚期帕金森氏症或對照組，觀察不到有意義的差異。在早期/晚期帕金森氏症患者中相較於對照組，對於纖維的該免疫反應之接受者操作特徵分析給予該接受者操作特徵曲線的下方區域價值不大於0.5，且接受者操作特徵曲線接近斜線，表示沒有或非常少〔very limited〕的診斷價值；在帕金森氏症患者及同齡同性別的對照組中，針對aSyn纖維之該免疫反應沒有有意義的關聯〔Gruden et al.,J Neuroimmunol 233(2011)：221-227.；Yanamandra et al.,PLoS One 6(2011)：e18513.；Gruden et al.,Neuroimmunomodulation 19(2012)：334-342〕。

相較之下，Besong-Agbo等人指出在帕金森氏症患者中的抗 體水平較對照組及阿茲海默症患者低，而Smith及其同事則指出共核蛋白症患者與健康對照組間並無顯著差異〔Neurology.2013 Jan 8；80(2)：169-75.Naturally occurring a-synuclein autoantibody levels are lower in patients with Parkinson disease，Besong-Agbo et al.,PLoS ONE 7(12)(2012)：e52285 and references therein〕。

WO 2010/069603 A1及EP 2 366 714 A1等專利案揭示一種用以偵測帕金森氏症患者血清或血漿中aSyn特異性抗體的方法，其包含以 覆蓋有aSyn的粒子偵測該抗體；Papachroni等人報告了有關在遺傳性帕金森氏症患者中的抗aSyn自體免疫抗體〔J.Neurochem.101(2007)：749-756〕；Apetri等人以拉曼原子力顯微鏡〔Raman and atomic force microscopy〕分析aSyn寡聚物的二級結構〔J.Mol.Biol.255(2006)：63-71〕；而尚未揭示偵測用以捕獲血液中抗aSyn抗體之aSyn沉積物。

WO 97/14028 A2專利案揭示使用標記有特定標記的〝微珠 (beadsets)〞及使用螢光活化細胞分類技術〔FACS〕的多重分析系統；Spells等人報告有關以塗佈有人類白血球抗原〔HLA〕的聚苯乙烯微珠偵測人類白血球抗原〔HLA〕抗體的特異性〔Abstract of the 29^th annual meeting of the American Society for Histocompatibility and Immunogenetics：S113〕；Li等人指出血液循環中抗Aβ抗體的ELISA檢測法中，增進低酸鹼值抗原-抗體分離的方法〔BMC Neuroscience 8(2007)：22〕。

簡言之，到目前為止，這些方法〔使用Biacore(免標定生 物分子交互作用分析技術)、ELISA或西方墨點呈色法特異性地偵測全長、缺失、修飾或沉積態aSyn或偵測抗體〕當中尚無可以滿足成為針對帕金森氏症/路易體症/多發性系統退化症或其他共核蛋白症的可預測性生物標記〔>80%的特異性〕這種標準的方法。

因此，迄今尚還沒有一個具有高度可信度、可以輕易重複實 驗、低危險性，且不需花費大量實驗經費的生物標記。過去投入大量人力物力進行之阿茲海默症、帕金森氏症及多發性系統退化症的血液中生物標記的研究已宣告失敗〔Hampel et al.,Nat.Rev.Drug Discov.9(2010)：560-574〕。一個可用的生物標記對於疾病修正治療〔disease-modifying therapies〕的發展是至關重要的，該治療施行越早成功的機會就越大，並且，藉由一特異性生物標記的幫助，可限制資源用於真正的帕金森氏症及多發性系統退化症患者上。

本發明之目的係提供一種診斷包括帕金森氏症/路易體症、 路易體癡呆症、帕金森癡呆症、單純自主神經衰竭症、快速動眼睡眠行為障礙、多發性系統退化症、第一型腦內鐵沉積性神經系統退化症的共核蛋白症的方法，特別是一種追蹤該疾病之早期病程和觀察治療共核蛋白症的藥物在臨床試驗中的發展。本發明之另一目的係提供一種可信賴的工具，用以偵測生物樣本中的抗aSyn抗體，特別是在人類共核蛋白症患者的生物樣本中，或可能發展出包括帕金森氏症/路易體症、路易體癡呆症、帕金森癡呆症、單純自主神經衰竭症、快速動眼睡眠行為障礙、多發性系統退化症、第一型腦內鐵沉積性神經系統退化症及包涵體肌炎等共核蛋白症的高風險族群的人類個體的生物樣本中。

因此，本發明係提供一種生物樣本中偵測aSyn特異性抗體 的方法，係包含下列步驟：使該樣本與包含aSyn之沉積物〔aSyn-comprising-aggregate〕接觸，特別是與由aSyn組成之沉積物〔aSyn-consisting-aggregate〕接觸，並讓該aSyn特異性抗體結合該包含aSyn之沉積物；及以單一粒子偵測技術，特別是以螢光活化細胞分類技術〔fluorescence activated cell sorting，簡稱FACS〕偵測結合於該包含aSyn之沉積物之該aSyn特異性抗體。

本發明係揭露一種偵測aSyn特異性抗體的新方法，特別是 一種偵測aSyn特異性自體免疫抗體的新方法，可以作為診斷工具，以有效地幫助診斷共核蛋白症，包括帕金森氏症/路易體症、路易體癡呆症、帕金森癡呆症、單純自主神經衰竭症、快速動眼睡眠行為障礙、多發性系統退化症及第一型腦內鐵沉積性神經系統退化症，及監控該些疾病，及用於阿茲海默症〔AD〕、唐氏症〔DS〕、進行性上眼神經核麻痺症〔PSP〕、皮質基底退化症及額顳葉癡呆症/皮克氏症等疾病之發展〔FTD；PiD〕；本方法並 非僅以單一aSyn胜肽作為捕獲aSyn特異性抗體的工具，反而是以由aSyn所組成的沉積物〔〝aSyn-consisting-aggregate〞〕或包含(特別是)aSyn的沉積物〔〝aSyn-comprising-aggregate〞〕作為捕獲aSyn特異性抗體的工具，因此產生之抗體-aSyn沉積物之複合物能夠以一單一粒子偵測技術所偵測；除了此處所提及的包含aSyn之沉積物及由aSyn組成之沉積物，本發明中另使用〝aSyn沉積物〞之詞彙，以表示〝包含aSyn之沉積物，特別是由aSyn組成之沉積物〞，其係由於本發明中，後者為該aSyn沉積物之一較佳實施例。

簡言之，由aSyn組成之沉積物是由全長的aSyn蛋白所組成 〔如前述揭示之該140個胺基酸長的蛋白〕，而包含aSyn之沉積物係包含aSyn蛋白與其他組成分，特別是其他澱粉樣蛋白生成性〔amyloidogenic〕聚胜肽，例如Aβ1-42、Aβp(E)3-42〔或其他Aβ型態〕、島嶼澱粉樣聚胜肽、Tau蛋白〔包括磷酸化態的Tau〕及TAR-DNA結合蛋白43〔TDP43〕；為符合本發明之目的，〝包含aSyn之沉積物〞之詞彙包含置換或除了aSyn〔全長140胺基酸的aSyn蛋白〕外，也包含缺失或修飾的aSyn聚胜肽的沉積物，特別是包含自然生成的aSyn聚胜肽，例如aSyn-98〔缺少外顯子3和5〕、aSyn-126〔缺少胺基酸41~54和外顯子4〕及aSyn-112〔缺少胺基酸103~130和外顯子5〕、磷酸化態〔特別是在絲胺酸129，Ser129〕、亞硝化/硝化態、乙醯化態及單泛素化、雙泛素化及三泛素化的aSyn，或是aSyn的C端缺失態，例如缺少C端20個胺基酸，更佳的是缺少C端25個胺基酸，特別是缺少C端30個胺基酸的aSyn；這些沉積物組成分，特別是上述之該aSyn變體，其必要條件是該些組成分可以形成沉積物〔即，具有本發明所揭示的情況下形成沉積物的能力，特別是於實施方式中所揭示〕。

本發明之aSyn沉積物，係以如將該沉積物形成蛋白跨夜靜 置之方式所製備，例如aSyn或aSyn及其他沉積蛋白/聚胜肽，像是Aβ聚胜肽〔特別是Aβ1-42、Aβp(E)3-42(或其他Aβ型態)〕、島嶼澱粉樣聚胜肽、Tau蛋白、TDP43及/或缺失或修飾態的aSyn聚胜肽；隨後aSyn沉積物〔由aSyn組成的沉積物或包含aSyn的沉積物〕與源自健康捐贈者〔HD〕或患者的血清樣本進行共置，特別是帕金森氏症患者及多發性系統退化症患者或可能罹患帕金森氏症及多發性系統退化症的患者的血清樣本，使其中的抗體〔IgG和IgM〕得以結合；與該包含aSyn之沉積物結合的抗體，尤其是與該由aSyn組成之沉積物結合的抗體，可以藉由任何本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以取用，且適當之方法進行偵測，例如使用經標記並可以辨認與該aSyn沉積物結合的aSyn特異性抗體的二級抗體，如可以使用標記有藻紅素〔phycoerythrin，簡稱PE〕的二級抗體；其後，包含與該aSyn沉積物結合的該aSyn特異性抗體〔以及任意一到多個偵測試劑，例如二級抗體〕的該免疫複合物，係可以藉由一單一粒子偵測技術進行檢測，例如螢光活化細胞分類技術〔fluorescence activated cell sorting，簡稱FACS〕也稱為流式細胞分析技術，由一給予的樣本中所獲得的aSyn特異性抗體之水平，係可以與一健康樣本之水平或其他已知病況的病患樣本之水平，例如帕金森氏症和多發性系統退化症患者的樣本之水平進行比較；藉由本發明之方法可以指出，相較於健康個體，帕金森氏症及多發性系統退化症患者包含不同水平之aSyn特異性免疫球蛋白，其係對本發明所提供之aSyn沉積物〔游離的aSyn特異性免疫球蛋白〕為可反應的；此外，藉由本發明之方法顯示，解蔽步驟〔demasking，從自體免疫抗體上去除可能結合的aSyn抗原〕可以增加源自帕金森氏症及多發性系統退化症患者中aSyn特異性免疫球蛋白的反應性〔對於本發明所提供的aSyn沉積物〕，相較之下，健康樣本中的aSyn特異性免疫球蛋白之反應性，在血清經過一特別方式處理後不會偵測到反應性的增加；另一方面，在帕金森氏症及多發 性系統退化症患者中，IgM抗體的反應性在經過解蔽步驟〔=將血清中已結合的aSyn解離〕後，顯示出IgM水平的上升，並且，IgG的水平在經過解蔽步驟前後也有所差異〔delta(△)值〕；相較於健康對照組，在帕金森氏症及多發性系統退化症患者中此參數也被提高，顯示在疾病病理狀態中的抗體有較高的被aSyn佔據之現象；此外，本發明所提供的數據顯示本方法有明顯較高的能力以偵測aSyn特異性抗體，並因此相較於近來發表的方法，具有明顯較高的能力去診斷例如帕金森氏症及多發性系統退化症等疾病；據此，本發明之方法實現具有可預測性的診斷工具理論上的必要條件，可以供鑑定共核蛋白症，特別是帕金森氏症及多發性系統退化症，並且可以用於追蹤給予患者治療後續的臨床反應。

本發明係用以偵測人類樣本中之aSyn特異性抗體，因此一 較佳實施例係用以偵測人類aSyn特異性抗體，較佳為人類IgG或IgM抗體，特別是人類IgG抗體；如前述，偵測人類aSyn特異性抗體係本發明所屬技術領域中具有通常知識者之通常知識，然而，迄今尚未提出其作為一可能之生物標記之角色，於本發明中亦揭示這是由於所屬技術領域中可以使用的偵測方法的分析效力不足的結果所致；藉由本發明之方法所帶來的優勢，使用人類樣本中的抗體作為生物標記是可行的，因此本方法特別適合偵測生物樣本中的自體免疫抗體，據此，本方法之一較佳實施例中，被偵測及定量的該aSyn特異性抗體即為該自體免疫抗體。

相較於習知方法，本方法係使用aSyn沉積物作為探針〔probe 〕，以供與該樣本中的aSyn特異性抗體結合；雖然該沉積物為所屬技術領域中之通常知識，但目前尚不清楚將該沉積物應用於分析aSyn特異性抗體的用途，特別是人類樣本中的aSyn特異性抗體，且該用途可以顯著提升該方法，以及結合單一粒子偵測技術，特別是FACS。因為該沉積物之用途，單一粒子偵測技術〔係為在各種領域及為不同問題所建立的習知技術〕才 能夠被用來分析過去很難處理的人類樣本〔例如血液〕中的aSyn特異性抗體。

較佳地，本發明所使用之沉積物之尺寸係經標準化以供後續 分析使用，該標準化作業程序可以於製造該沉積物時使用並遵照特定之參數來建立，依據不同的沉積物生成的環境，也可以調整沉積物的顆粒尺寸，其中本發明該aSyn沉積物之適合的顆粒尺寸範圍為50nm至15μm，較佳的顆粒尺寸範圍為100nm至10μm，特別是500nm至5μm〔以該沉積物之長定義之，即該最長範圍〕。

用以提供適合本發明之沉積物之一較佳方法包含將全長 aSyn〔1-140〕、天然生成的接合態變體包括aSyn-98、aSyn-112、aSyn-126或經修飾的全長aSyn包括磷酸化〔特別是在絲胺酸129-Ser129〕、亞硝化/硝化、乙醯化及單泛素化、雙泛素化或三泛素化的aSyn，或例如缺少C端20~30個胺基酸的C端缺失態aSyn，或更短且具有形成沉積物能力的aSyn蛋白，於pH 2至9之環境下靜置至少20分鐘的步驟，較佳為至少1小時，特別是至少4小時；該靜置的時間係為決定該沉積物顆粒尺寸的要素之一：該靜置的時間係為決定該沉積物顆粒尺寸的要素之一：該靜置的時間越長，生成之該沉積物的顆粒就越大，典型的靜置時間係為10分鐘至24小時，較短的靜置時間通常只會生成較小顆粒且較少量的沉積物，於本方法中，不建議超過48小時等明顯過長的靜置時間。當然，必要時沉積物亦能夠以經過分類及篩選以獲取適合的顆粒尺寸，例如可以分層離心〔fractionated centrifugtion〕或是相似技術。

本發明之該包含aSyn之沉積物之一較佳實施例係關於沉積 物，該沉積物除aSyn或一aSyn聚胜肽外，包含Aβ或其一變體；對於aSyn，只有變體被用以供沉積物生成；以下Aβ變體的群組因此特別適合於包含aSyn之沉積物中〔最佳為群組4，其次為群組3，其後為群組2及群組1〕。

Aβ變體的群組1：包含該核心序列Aβ-16-20或該第二核心 序列Aβ-25-35的胜肽，該些胜肽會自行形成澱粉樣蛋白纖維，由該些核心序列開始，胜肽可以由Aβ胜肽上的胺基酸或是由形成缺失的天然Aβ胜肽或經修飾的缺失Aβ胜肽的替代胺基酸來延伸。

Aβ變體的群組2：包含該序列 Aβ16-20-X_21-23-24-28-X_29-30-31-36的胜肽〔代表存在胺基酸16至20、24至28及31至36，並且由一3個及一2個之胺基酸連接物所連接(具有任意的一級序列)〕，由該些核心序列開始，胜肽可以由Aβ胜肽上的胺基酸或是由形成缺失的天然Aβ胜肽或經修飾的缺失Aβ胜肽的替代胺基酸來延伸。

Aβ變體的群組3：包含該序列Aβ16-36的胜肽，由該些核 心序列開始，胜肽可以由Aβ胜肽上的胺基酸或是由形成缺失的天然Aβ胜肽或經修飾的缺失Aβ胜肽的替代胺基酸來延伸。

Aβ變體的群組4：包含該序列Aβ11-36或Aβp(E)11-36的胜 肽，由該些核心序列開始，胜肽可以由Aβ胜肽上的胺基酸或是由形成缺失的天然Aβ胜肽或經修飾的缺失Aβ胜肽的替代胺基酸來延伸。

本發明之該包含aSyn之沉積物之另一較佳實施例係關於沉 積物，該沉積物除aSyn或一aSyn聚胜肽外，另包含Tau蛋白或其一變體；對於aSyn〔及Aβ〕，只有變體被用以供沉積物生成；最佳為Tau的沉積物，然而，其他包含aSyn之沉積物可以包含修飾態或缺失態的Tau〔例如Tau441加上過量磷酸化的Tau441及/或Tau的較短版本(例如：Tau412、Tau410、Tau383、Tau381及Tau352)〕，特別是該些於健康中自然存在或〔特別是〕對於一疾病具有標記功能的Tau蛋白變體〔共六個自然形成的異構物之任一異構物或其突變態(例如P301L、P301S及V337M等)之異構物，例如：較佳為同時於第181個、第202個、第205個、第212個、第214個、第 231個及第396個胺基酸上磷酸化以及選擇地於Tau的額外的殘基上磷酸化，例如第18個、第153個、第175個、第189個、第235個、第262個、第394個、第404個及第422個殘基〕。

本發明之該包含aSyn之沉積物之另一較佳實施例係關於沉 積物，該沉積物除aSyn或一aSyn聚胜肽外，另包含島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽〔islet amyloid polypeptide，簡稱IAPP〕或其一變體；島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽係生合成為89個胺基酸殘基的一前激素原〔pre-prohormone〕，而一訊號序列的分割，導致形成具有67個胺基酸的一島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽原〔pro-IAPP〕，其後進一步加工成為37個殘基的該成熟IAPP。正常的島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽原加工為具兩步驟之一過程，藉由切割於其COOH端〔可能藉由反式高基氏網中的激素原裂解酶1/3〕接著藉由切割於其NH₂端〔藉由囊泡中的激素原裂解酶2〕，形成該島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽的成熟態；島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽在哺乳類物種中是極度保守的，但是介於第20個至第29個胺基酸之間存在值得注意的變化性，此區域的差異決定島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽沉積及形成澱粉樣蛋白的能力，事實上，在此區域具有一或更多脯胺酸殘基的物種〔貓除外〕不形成島嶼澱粉樣蛋白；島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽藉由其沉積成為胰島澱粉樣沉積物的能力而被發現，該胰島澱粉樣沉積物牽涉於第二型糖尿病〔Diabetes mellitus Type 2或type 2 diabetes，簡稱T2D〕患者中β細胞的機能不全及死亡，及其他像是猴子和貓等哺乳類物種中β細胞的機能不全及死亡。澱粉樣蛋白係為非水溶性、纖維性且具有β摺板〔β-pleated sheet〕結構的蛋白質沉積物，經過剛果紅或硫代黃素S〔thioflavin S〕染色後具有特殊的光學性質，並可以光學顯微鏡分析；然而，澱粉樣蛋白的發展始於纖維或沉積物〔直徑為7~10nm及長度為數百nm〕生成，其可以在經光學顯微鏡觀察到澱粉樣蛋白證據前，藉由電子顯微鏡偵測。在第二型糖尿病患者中，胰臟組織的組織學分析證 實島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽沉積物的累積導致β細胞胞質的取代，造成漸進式的β細胞機能不全及高血糖症狀，除此之外，島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽纖維具有對胰島直接傷害的效果；超過95%的第二型糖尿病患者中發現胰腺的澱粉樣蛋白之沉積，並且其係與疾病的發展極為相關。一般而言，澱粉樣蛋白可以由在其非沉積態中折疊成緊密三級結構之蛋白形成，或是可源於本質失調而無法在其自然水溶態時折疊成緊密三級結構的聚胜肽；島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽是一個在體內形成澱粉樣蛋白之本質失調聚胜肽的重要實例；雖然島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽是第二型糖尿病患者的胰腺中該胰島澱粉樣蛋白的主要組成分，但該些堆積物中確認了至少有兩個額外的元件：脂蛋白E〔apoE〕及該硫酸肝素蛋白多醣珍珠素〔heparin sulfate proteoglycan perlecan，簡稱HSPGs〕；該澱粉樣蛋白生成的動力學為複雜的，並呈現一S型的函數外形〔sigmoidal profile〕，其特徵為水溶性胜肽等同於澱粉樣蛋白纖維的一最終穩定態〔steady state〕；藉由小量預先形成的纖維之加入可以加速澱粉樣蛋白的生成，此方式稱為〝播種〔seeding〕〞；分泌於第二型糖尿病患者中的該島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽之一分群〔fraction〕是不完全加工的，該島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽原上減弱的NH₂端加工，導致澱粉樣蛋白的生成和β細胞死亡；該NH₂端被延長的人類島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽原中間體〔IAPP-Npro〕可能為澱粉樣蛋白生成之一關鍵起始步驟，事實上，雖然相較於成熟的島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽，在溶液中發現NH₂端被延長的人類島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽原中間體較不具澱粉樣蛋白生成性〔amyloidogenic〕，卻更有效地與糖胺聚糖〔glycosaminoglycans，簡稱GAGs〕交互作用，該糖胺聚糖係為一硫酸肝素蛋白多醣的組成分；據此，島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽以減弱的NH₂端加工的型態為本發明之包含aSyn之沉積物中較佳的型態，特別是NH₂端被延長的人類島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽原中間體。

本發明之該包含aSyn之沉積物之另一較佳實施例係關於沉 積物，該沉積物除aSyn或一aSyn聚胜肽外，另包含除aSyn或一aSyn聚胜肽之外至少兩種進一步的沉積物組成分，特別是一至多個Aβ或其一變體及/或一至多個Tau蛋白或其一變體及/或一至多個島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽或其一變體。

本發明該包含aSyn之沉積物之另一較佳實施例係關於沉積 物，該沉積物除包含揭示於此之aSyn或一aSyn聚胜肽外，另包含一不同的沉積物形成聚胜肽種類〔在此使用的詞彙〝聚胜肽〞係包含詞彙〝蛋白〞，並且通常此兩詞彙被使用為同義詞；因此也在此應用該詞彙〝蛋白〞於少於100個或少於50個胺基酸殘基的聚胜肽〕之一沉積物組成分；該進一步的沉積物形成聚胜肽種類較佳係選自一群組，該群組由Tau蛋白或其一沉積物形成變體、Aβ1-42胜肽或其一沉積物形成變體；島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽及其一沉積物形成變體，特別是N端延長人類島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽原中間體〔IAPP-Npro〕、TAR-DNA結合蛋白43〔TDP43〕或其一沉積物形成變體；及超氧化岐化酶1〔SOD1〕或其一沉積物形成變體所組成。

如前述，較佳的Tau沉積物形成變體〔〝Tau變體〞〕為高磷 酸化Tau、不正常磷酸化Tau〔於Shahani et al.J.Neurosci.26(2006),6103-6114中被提及及定義〕、對於一疾病具有標記功能的Tau蛋白變體〔共六個自然形成的異構物(Tau441、Tau412、Tau410、Tau383、Tau381及Tau352)之任一異構物或其突變態(例如P301L、P301S、V337M等)之異構物〕，例如：較佳變體型態為同時於第181個、第202個、第205個、第212個、第214個、第231個及第396個胺基酸上磷酸化以及選擇地於Tau的額外的殘基上磷酸化，該額外的殘基例如Tau441、Tau412、Tau410、Tau383、Tau381及Tau352上的第18個、第153個、第175個、第189個、第235個、第262個、第394個、第404個及第422個胺基酸殘基〔Tau 磷酸化更詳細的分析已被揭示，例如Hanger et al.,Trends in Mol.Med.15(2009),112-119〕。

本方法中，具有被偵測之aSyn特異性抗體的樣本係與aSyn 沉積物接觸，使該樣本中之可能存在的aSyn特異性抗體〔及面對面可反應的aSyn沉積物〕得以結合，而因此調整該aSyn沉積物的濃度以提供該抗體足夠的結合位置；據此，用以結合該樣本中之抗體的aSyn沉積物的濃度較佳係為0.01至10μM，更佳為0.1至1μM。理想的濃度也會依據結合之抗體之性質、該樣本之性質、預定接觸時間及沉積物尺寸而定。

本方法主要係應用於人類樣本，因此該生物樣本較佳係指人 類血液，或來源為人類血液之一樣本，更佳為人類血清或人類血漿；人類腦脊髓液或人類淋巴液。有了上述之樣本來源，亦可能建立系列性及常規化的測試〔特別是對於源自血液之樣本〕。

供該樣本中之抗體與該沉積物進行適當之結合的較佳接觸 時間至少為10分鐘〔例如10分鐘至48小時〕，更佳為15分鐘至24小時，特別是30分鐘至2小時。

如果該生物樣本並未經過特異性地前處理，具有與該aSyn 沉積物結合之能力的該aSyn特異性抗體會在與該aSyn沉積物接觸時被結合；在該樣本中被遮蔽〔masking〕的該aSyn特異性抗體〔即，該些抗體已經與一配位體結合，例如與一aSyn包含結構或內生性的aSyn胜肽結合〕，並不會被本發明之方法〔缺少特異性的樣本前處理〕所偵測；然而，在許多情況下，僅識別及偵測可反應的抗體是足夠且被需要的，當該樣本中aSyn特異性抗體的總量〔包括可反應或不反應的抗體〕或全部可反應、不可反應〔〝被遮蔽的〞〕及所有aSyn特異性抗體的數量應該被偵測時，可能有狀況或診斷上的問題。

因此，本發明之另一較佳實施例中，使用被解蔽的樣本，即 於本發明之aSyn沉積物接觸前，該樣本中之aSyn特異性抗體從與之結合的配位體中〝被釋放〞，這使得該樣本中的所有aSyn特異性抗體都被偵測到，而不僅止於偵測到那些沒有與樣本中之配位體結合的抗體〔〝游離〞或〝可反應〞的抗體〕；在本發明的過程中確定了帕金森氏症及多發性系統退化症的診斷及發展之關鍵標記係為可反應的aSyn特異性抗體之總量，特別是可反應的aSyn特異性IgG；如前所述，本方法亦適合用以決定該樣本中aSyn特異性抗體的全體數量，即，該樣本中，該自由〔或〝可反應〞〕的抗體及那些已經被結合〔例如被aSyn結構結合〕的抗體，可以用以幫助建立一樣本中，可反應與不可反應抗體的差異性〔△〕，該差異性係為對於帕金森氏症及多發性系統退化症的診斷具實質重要性的一參數；在對於帕金森氏症及多發性系統退化症為〝健康狀態〞的人中，此差異性將會呈現不存在〔或很低〕，這樣的差異性具有決定性的帕金森氏症及多發性系統退化症標記功能，無論是對於aSyn特異性IgG和Aβ特異性IgM皆然。

本發明之方法係使用單一粒子偵測技術，該技術係能夠鑑定 並量化〔〝計數〞〕該aSyn特異性抗體結合該aSyn沉積物之〝陽性〞結合結果的數量；本技術之較佳實施例為FACS分析法，該分析法為本領域已建立之一技術，其他用於偵測與該aSyn沉積物結合之該抗體的方法為如Luminex或質譜分析〔Mass cytometry〕。

根據該Luminex技術，樣本的準備可以如本發明實施方式所 述之方法製備；於樣本製備之後，aSyn沉積物被特異性的aSyn特異性抗體所辨認，並能夠以結合有螢光染劑並能夠以多重檢測系統〔如Luminex reader〕偵測之二級抗體進行偵測〔Binder et al.,Lupus15(2005)：412-421〕。

若是以質譜分析〔mass cytometry〕作為單一粒子偵測技術， 樣本的處理也可以實施方式中之描述進行；當樣本準備完成後，被特異性抗體所辨認的aSyn沉積物則可以被結合具過渡元素的穩定放射性同位素 之二級抗體所辨識，並以原子質譜分析〔atomic mass spectrometry〕進行偵測。該樣本係可以被噴出並穿過一充滿氬電漿，且加溫至大於5500K的感應線圈，該樣本被汽化及被離子化成其原子成分，而使被放射性同位素標定的抗體數量則被飛行時間質譜分析〔time-of-flight mass spectrometry〕所定量〔Janes et al.,Nat.Biotechnol.29(2011)：602-604〕。

此外，也可以應用固定有一結合配位體〔aSyn沉積物或抗 體/血清〕之單一粒子偵測技術，惟其結合係以流體狀態下偵測，例如圓柱型微陣列晶片技術〔Hybcelltechnology〕及表面電漿共振〔surface plasmon resonance〕技術。於本發明中以圓柱型微陣列晶片技術進行偵測時，血清樣本可以被點在該圓柱型微陣列晶片〔Hybcell，一旋轉的圓筒〕的表面，並與經預先共置處理、直接標記螢光的aSyn沉積物，或螢光標記之一單株aSyn特異性二級抗體進行共置，與aSyn沉積物結合之抗體則以一雷射光進行偵測〔Ronacher,Anagnostics Technical Note ANA-TN-005(2010)〕；如本發明之方法使用表面電漿共振〔surface plasmon resonance〕時，可以使用一相反的設置：該預先共置處理的aSyn沉積物可以被固定於一晶片表面，而血清中的aSyn特異性抗體與晶片上之該些aSyn沉積物的結合，則可以透過該晶片表面的重量增加測得，因此不需要標記的結合配位體；為提高偵測之靈敏度或是測量IgG之次類型，更可以連續注射抗IgG抗體〔Cannon et al.,Anal.Biochem.328(2004)：67-75〕；除了直接固定aSyn沉積物於該晶片表面，也可以使用一捕捉抗體；此設置係將一aSyn特異性抗體固定於晶片表面，再將事先共置之aSyn沉積物注入，而該沉積物被捕捉後，係注入血清，及透過重量的增加而偵測其反應性。

本發明中，係可以藉由任何適用之習知方法，以偵測aSyn 特異性抗體與該aSyn沉積物的結合，例如，利用螢光光譜分析〔fluorescence spectroscopy〕，藉由一二級抗體〔如經標定的抗IgG或抗IgM二級抗體〕 偵測與該些aSyn沉積物結合之該些aSyn特異性抗體〔Missailidis et al.,Methods in Molecular Biology 248(2003)：431-441〕。

亦可以利用對抗體具有結合特異性之受質〔如：蛋白A或蛋 白G〕偵測與沉積物結合之自體免疫抗體，另外，也可以利用該aSyn沉積物沉澱對aSyn沉積物具特異性之自體免疫抗體，清洗該複合物，及將該抗體進行生物素標記〔biotinylate〕，之後再以卵白素〔streptavidin〕作為第二步驟之反應物。

相較於習知技術〔例如於WO 2010/099199 A1、WO 2010/069603 A1及EP 2 366 714 A1所揭示內容〕，aSyn、Tau、Aβ及其變體等蛋白係固定於粒子〔像是奈米粒子、奈米或微米微珠等〕上，本發明提供之沉積物係為不具這樣表面，但由不具任何支架或表面輔助物〔像是奈米粒子、奈米或微米微珠等〕的該沉積物所組成的該沉積物，如此，係較結合微米或奈米微珠，更類似於自然的情況，特別像是在人類血液中。

本發明較佳之應用領域係為用以診斷共核蛋白症，包含帕金 森氏症〔PD〕、路易體症〔LBD〕、路易體癡呆症〔DLB〕、帕金森癡呆症〔PDD〕、多發性系統退化症〔MSA〕、單純自主神經衰竭症〔PAF〕、快速動眼睡眠行為障礙〔RBD〕、第一型腦內鐵沉積性神經系統退化症〔NBIA Type I〕及包涵體肌炎〔IBM〕；及其他疾病，例如阿茲海默症〔AD〕、唐氏症〔DS〕、進行性上眼神經核麻痺症〔PSP〕、皮質基底退化症〔CBD〕及額顳葉癡呆症/皮克氏症〔FTD/PiD〕。

本發明之一較佳實施例係為蛋白病〔proteinopathy〕的診斷 方法，而藉由本發明可以顯著提升該診斷方法；蛋白病是疾病，特別是藉由異常形成的蛋白所造成的神經退化性疾病，根據本發明，被診斷的蛋白病較佳為阿茲海默症〔AD〕、唐氏癡呆症、帕金森氏症〔PD〕、路易體症〔LBD〕、路易體癡呆症〔DLB〕、帕金森癡呆症〔PDD〕、多發性系 統退化症〔MSA〕、單純自主神經衰竭症〔PAF〕、快速動眼睡眠行為障礙〔RBD〕、第一型腦內鐵沉積性神經系統退化症〔NBIA Type I〕及包涵體肌炎〔IBM〕、皮質基底退化症〔CBD〕、進行性上眼神經核麻痺症〔PSP〕、皮克氏症〔PiD〕、拳擊手癡呆症〔Dementia pugilistica，簡稱DP，又稱為慢性創傷性腦症(chronic traumatic encephalopathy)〕、額顳葉癡呆症〔FTD〕、肌肉僵直萎縮症〔Lytico-Bodig disease，簡稱LD〕、亨丁頓舞蹈症〔Huntington’s disease，簡稱HD〕及脊髓性小腦萎縮症〔Spinocerebellar ataxias，第1型、第2型、第3型及第7型〕及肌萎縮性脊髓側索硬化症〔Amyotrophic lateral sclerosis，簡稱ALS〕、普利昂蛋白沉積〔prionosis〕及第二型糖尿病；及具有α共核蛋白堆積及/或聚集的疾病，特別是阿茲海默症〔AD〕、唐氏症〔DS〕、進行性上眼神經核麻痺症〔PSP〕、皮質基底退化症〔CBD〕、額顳葉癡呆症/皮克氏症〔FTD/PiD〕；特別是追蹤該蛋白病之早期病程和觀察治療蛋白病的藥物在臨床試驗中的發展。

本方法特別適合結合帕金森氏症及多發性系統退化症診斷 使用，藉由本發明，在人類患者中的aSyn特異性自體免疫抗體係作為帕金森氏症及多發性系統退化症狀態的標記；血液中aSyn特異性抗體水平〝正常〞的人對於帕金森氏症及多發性系統退化症被認為是〝健康〞狀態，如果在帕金森氏症及多發性系統退化症患者、具有發展為帕金森氏症及多發性系統退化症之風險者，或懷疑具有帕金森氏症及多發性系統退化症者中，該水平發生變化，則該水平的變化係與帕金森氏症及多發性系統退化症有關。一個〝變化〞的水平可能為該aSyn特異性抗體絕對值的變化，或是該aSyn特異性抗體總量之反應性的變化〔例如，aSyn特異性抗體的一子集(IgG、IgM等)的變化〕，舉例而言，可反應的aSyn特異性IgG的減少即與帕金森氏症及多發性系統退化症有關，及可以作為帕金森氏症及多 發性系統退化症的一標記。根據本方法，當該可反應的aSyn特異性IgG的〝健康〞水平被設為100%，一血液樣本中可反應的aSyn特異性IgG顯著的變化，例如減少到70%或更低、減少到50%或更低或減少到30%或更低，或增加到至少30%以上，例如到至少50%以上或到至少100%以上皆表示帕金森氏症及多發性系統退化症的發展。

本發明提供了帕金森氏症及多發性系統退化症和帕金森氏 症及多發性系統退化症發展的一標記，可能使用此方法於觀察該疾病的發展及可能治療方法的效果，特別是該治療的方法是否可以建立aSyn特異性抗體〔特別是IgG或IgM〕〝健康〞或〝較健康〞的水平。

因此，本方法較佳為用於監控帕金森氏症及多發性系統退化 症患者，特別是接受治癒或改善帕金森氏症及多發性系統退化症藥物治療的帕金森氏症及多發性系統退化症患者。本方法可以成功地應用於觀察帕金森氏症及多發性系統退化症疫苗〔例如PD01A、Trial AFF008、NCT 01568099〕或以aSyn為標的之疾病修飾藥物等臨床測試的患者。

本發明之方法亦可以用於評估發展為一蛋白病，較佳為一共 核蛋白症，特別是帕金森氏症及多發性系統退化症的風險，或用以偵測一蛋白病的早期階段，較佳為一共核蛋白症的早期階段，特別是帕金森氏症及多發性系統退化症的早期階段；根據本發明，原則上可能使得在明顯早於發生認知及/或功能衰退的時間點上，能夠偵測患者aSyn特異性自體免疫抗體之免疫構成改變，而建立成常規的檢測形式，將使更大部分的人口在蛋白病，較佳為共核蛋白症，特別是帕金森氏症及多發性系統退化症的早期診斷上得到實質的增進，並可以讓病人符合早期養生治療法及/或蛋白病，較佳為共核蛋白症，特別是帕金森氏症及多發性系統退化症的預防性〔或延遲〕策略，特別是免疫療法〔包含疫苗療法〕。

另一方面，本發明係關於可用以進行本發明之方法的一套 組，係包含：包含aSyn之沉積物及一樣本容器〔特別是供容置如全血、血漿或血清等人類樣本之樣本容器〕。

較佳地，本發明之套組可以進一步地包含用以偵測與aSyn 特異性抗體結合之包含aSyn之沉積物的工具，較佳為二級抗體，特別是經標記的二級抗體〔如抗IgG或抗IgM之二級抗體〕；進階的組成物可以為標準品、陽性及/或陰性控制組、使用說明書及適宜的包裝〔如包裝盒、彩色瓶等〕。

本發明進一步藉由但不限於以下實施例及圖式闡明。

第1圖：以FACS分析法量測aSyn沉積物的尺寸。aSyn沉積物可以被流式細胞分析技術偵測，並於該SSC-A〔對數值〕及FSC-A〔對數值〕通道〔channel〕中被視為同類族群，以點狀圖表示〔A〕。如FSC-A色譜曲線圖所示，該aSyn沉積物的尺寸分布〔藉由FSC-A訊號定義〕使用市售且尺寸被校準的微珠〔1、2、4、6、10及15μm〕偵測〔B〕。

第2圖：以FACS分析法偵測單株抗體對aSyn沉積物的反應性〔A、B、C〕及對Aβ1-42沉積物的反應性〔D、E、F〕。該aSyn特異性單株抗體LB509特異性地結合aSyn沉積物〔A〕但不與Aβ1-42相互作用〔D〕，相較之下，該Aβ1-42特異性抗體3A5結合Aβ1-42〔E〕而非aSyn沉積物〔B〕；反應性係使用標定有藻紅素〔PE〕之一抗免疫球蛋白二級抗體於FL2-PE通道中進行檢測。

一無相關的對照組單株抗體D129既不與aSyn相互作用〔C〕也不與Aβ1-42沉積物交互作用〔F〕，證實不同的沉積物特異性地結合各別的單株抗體〔E〕；顯示於〔C〕及〔F〕的螢光強度可以與單獨以藻紅素〔PE〕標定之二級抗體靜置的背景染色比較。

第3圖：對於不同之兩方法，FACS分析法〔A、C〕及ELISA〔B、D〕的分析靈敏性〔A、B〕及線性關係〔C、D〕。〔A〕aSyn沉積物與單株抗體LB509的一稀釋序列共置，及使用流式細胞分析技術於FL-2通道中量測反應性；〔B〕單株抗體LB509滴定於塗佈aSyn的Maxisorp ELISA試盤上。請注意所有結果皆以背景值倍率表示以供比較。

下側圖表顯示描述於此之FACS沉積分析〔C〕及ELISA〔D〕的線性範圍。該線性範圍係以該aSyn特異性單株抗體量測於該FACS沉積分析，範圍自80ng/ml至0.128ng/ml〔超過3個對數個數〕，及於該ELISA之範圍自15625ng/ml至0.498ng/ml〔超過2個對數個數〕。該黑線係表示以Excel計算用以象徵範圍的趨勢線，並標示皮爾森相關係數〔R²〕。

第4圖：使用源自接種aSyn特異性疫苗的個別單株之不同稀釋倍率的血清〔A、B、C〕或源自20隻接種aSyn特異性疫苗的個別單株且稀釋倍率為1：100的腦脊髓液〔CSF〕〔D〕，所得使用aSyn FACS沉積分析〔黑條〕及aSyn ELISA〔灰條〕的訊號。

如可見的，以該FACS沉積分析偵測aSyn特異性抗體，具有較例如一ELISA的標準方法高出高達30倍的靈敏度。

小鼠2〔B〕及3〔C〕的血清於一1：125000稀釋倍率展現高於背景值兩倍〔2x BG〕的一螢光強度中間值〔MFI〕訊號，而小鼠1的血清〔A〕於一1：25000稀釋倍率具有大於背景值兩倍〔2x BG〕的螢光強度中間值，然而在該稀釋倍率下沒有訊號可以於ELISA中被偵測。

使用1：500稀釋倍率的血清，該螢光強度中間值訊號達到背景值的400倍〔C〕，然而在該ELISA系統中，同樣血清的稀釋倍率只有20倍背景值的增加結果。

以一1：100的腦脊髓液樣本的稀釋倍率進行兩方法的比較，於ELISA中，20個樣本中只有一個樣本達到一有意義的訊號結果；當以FACS沉積 分析測量時，20個樣本中有17個樣本顯示超過兩倍背景值的一螢光強度中間值訊號。

第5圖：檢測於自健康捐贈者中萃取之一人類IgG分群的備品〔preparation〕〔靜脈注射免疫球蛋白，簡稱IVIG〕中，aSyn特異性IgG自體免疫抗體的反應性。以前述之該FACS分析法分析靜脈注射免疫球蛋白，於FL2-PE通道中檢測aSyn沉積物的螢光強度並以螢光強度中位數〔MFI〕表示。

第6圖：針對aSyn與Aβ1-42、aSyn與p(E)Aβ3-42或Aβ1-42與p(E)Aβ3-42等莫耳量混合沉積物的單株抗體之反應性。沉積物分別與對Aβ1-42〔3A5〕、p(E)Aβ3-42〔D129〕及aSyn〔LB509〕具特異性之單株抗體共置，並檢測該些混合沉積物之單株抗體結合形式。

FACS PE色譜曲線圖顯示該單株抗體3A5唯獨地與包含Aβ1-42沉積物的混合物〔6A+B〕結合，但對於該p(E)Aβ3-42/aSyn沉積物之混合物沒有反應性〔6C〕；該抗p(E)Aβ3-42單株抗體D129只與包含p(E)Aβ3-42的沉積物〔6E+F〕結合，但對Aβ1-42/aSyn沒有反應性〔6D〕；該aSyn特異性單株抗體LB509只與包含aSyn的沉積物混合物反應〔6G+I〕，但不與該Aβ1-42/p(E)Aβ3-42沉積物混合物反應〔6H〕。

第7圖：以FACS分析法分析不同螢光標記的Aβ1-42及aSyn胜肽之等莫耳量混合物，該Aβ1-42及aSyn胜肽為Aβ1-42-Hilyte-555〔PE〕及aSyn-Hilyte-488〔FITC〕。於該FSC-A/SSC-A中將所需之0.5~10μm尺寸範圍的沉積物圈選〔gate〕於P1內〔A〕，並且隨後以該PE/FITC散點圖〔dot plot〕分析P1，檢測Aβ1-42-Hilyte-555〔PE〕及aSyn-Hilyte-488〔FITC〕的貢獻〔C〕；使用無標記的混合沉積物作為陰性對照組〔B〕。

第8圖：針對由不同濃度的aSyn及Aβ1-42所產生的沉積物之單株抗體反應性。Aβ1-42及aSyn胜肽之混合如表1所示。

第9圖：Aβ1-42特異性單株抗體〔3A5〕、p(E)Aβ3-42特異性單株抗體〔D129〕及aSyn特異性單株抗體〔LB509〕，對由等莫耳量之Aβ1-42、p(E)Aβ3-42及aSyn胜肽所組成之莫耳混合物的反應性。

第10圖：人類帕金森氏症患者的血漿中IgG〔A〕及IgM〔B〕自體免疫抗體之反應性。以前述FACS分析分析測血漿樣本〔1：300稀釋〕，於FL2-PE通道中檢測結合至aSyn沉積物的螢光強度，並以螢光強度中位數〔MFI〕表示。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：材料及方法

使用ELISA偵測aSyn特異性抗體

aSyn胜肽〔購自Anaspec〕係以100mM之NaHCO₃〔pH9.2〕稀釋至濃度為5μg/ml，並跨夜固定於Maxisorp試盤，為了避免非特異性結合，使用1% BSA/PBS於37℃經1小時而阻斷〔blocking〕試盤；將在結合溶液〔binding buffer，PBS、0.1% BSA及0.1% Tween 20〕中的單株抗體之一序列稀釋〔始於已指出的濃度〕，置於37℃中1小時以進行該ELISA，再經以PBS、0.1% Tween 20重複〔3次〕的清洗步驟後，加入該偵測抗人類Ig HRP〔0.5μg/ml〕的二級抗體，並於37℃經1小時，樣本再清洗3次，並加入ABST〔0.68mM、0.1M檸檬酸，pH 4.3〕經30分鐘以供分析發展，再於試盤讀取機〔Biotek-Gen5 Program〕以波長405nm的OD測量檢測。

以FACS分析法偵測aSyn特異性抗體

500μg之凍乾aSyn係以100μl無菌過濾的MonoQ水進行回溶並經短暫震盪〔vortexing〕直到溶液澄清，之後此溶液於一超音波震盪 水槽〔sonication water bath〕中以超音波震盪〔sonicating〕30秒，並以5μl分裝非急速冷凍地儲存於-20℃；為導致沉積物的生成，將分裝回溫並且該aSyn溶液的全部體積溶解於1% NH₄OH〔pH 4.5〕使濃度為35μM，並於一微量離心管〔Eppendorf tube〕中以37℃跨夜置於搖盪器〔shaker〕〔350rpm〕上；aSyn沉積物只供一次實驗使用，丟棄剩餘部分。

此外，於每個實驗的樣本準備前，檢測沉積物的數量以保證可比較的aSyn沉積物密度。

在樣本準備前，於該FSC/SSC通道中檢測經過跨夜放置產生的沉積物數量，被標準化地使用為一受質〔substrate〕的該沉積物之數量，詳細地，稀釋3μl跨夜產生的aSyn沉積物於如上述之97μl的0.5% BSA/PBS中，3μl代表該受質使用於每個樣本的標準濃度；使用該FACS Canto II以高流動速率〔2μl/s〕測量70μl的該aSyn溶液使獲得結果的時間為35秒，檢測該沉積物的數量，定義在該些情況條件下獲得將近10000個粒子為標準。如果偵測到更多或更少的沉積物，會調整被使用為受質以供接下來的樣本準備之aSyn沉積物溶液，以保證不同實驗的樣本中相對的沉積物濃度，這代表例如只有獲得5000個結果，用於樣本準備的該受質之體積會增加至每孔〔well〕6μl，如上述，使用約10000個粒子為每一樣本準備的起始材料。

為了偵測aSyn特異性抗體，將3μl的該aSyn沉積物懸浮液與92μl的0.2μm經過濾的0.5% BSA/PBS混合，接著轉移至一96孔V型底試盤中的一孔以供接下來的樣本準備，靜置該些懸浮液於室溫中60分鐘以進行阻斷〔blocking〕。

新鮮地回溫自-80℃取出之分裝的鼠科〔murine〕或人類血清樣本以供每一次測量，使用0.5% BSA/PBS以1：50稀釋鼠科血清樣本或以1：5稀釋人類血清樣本，並且接著該些樣本透過0.22μm的96孔過 濾試盤於96孔試盤離心機中進行0.2μm離心過濾〔3000rpm離心3分鐘〕，腦脊髓液〔CSF〕樣本經0.5% BSA/PBS以1：5預先稀釋且未無菌過濾，加入5μl預先稀釋的血清或腦脊髓液樣本至95μl的該aSyn沉積物懸浮液，使最終的鼠科血清稀釋為1：1000及一人類血清或腦脊髓液稀釋為1：100，放置在一搖盪器〔450rpm〕上經過室溫下60分鐘後，加入150μl的0.5% BSA/PBS於各孔內，該試盤以3000rpm離心5分鐘〔96孔試盤離心機〕並藉由徹底地將上清液〔supernatent，簡稱SN〕倒入水槽中加以去除，之後，加入200μl的0.5% BSA/PBS並重複此清洗步驟3次，為了鼠科血清及腦脊髓液樣本的偵測，在第4次清洗步驟後，再度丟棄該上清液並將沉澱物〔pellet〕回溶於100μl的0.5% BSA/PBS，其中包含一1：10000稀釋、(H+L)F(ab’)₂片段標記有藻紅素〔PE〕之抗鼠科IgG〔Jackson Immuno Research〕，為了偵測IVIG，使用一1：1000稀釋、(H+L)F(ab’)₂片段標記有藻紅素〔PE〕之抗人類IgG〔Jackson Immuno Research〕，再次於常溫下將樣本放置於一搖盪器〔600rpm〕上60分鐘，隨後在沒有額外清洗步驟下以配有高效率採樣器之FACS Canto〔HTS〕進行分析，aSyn沉積物基於其FSC/SSC特徵被鑑識出，結合該些沉積物的抗體之訊號於FL2-PE通道中被測量並使用FACS Diva軟體基於其螢光強度中位數估測。

混合沉積物的產生及偵測

為測試不同胜肽〔例如aSyn及Aβ1-42〕是否會形成包含各胜肽的混合沉積物，使用N端螢光標記的Aβ1-42及C端螢光標記的aSyn胜肽，如Anderson及Webb所述〔BMC Biotechnology 2011,11：125〕，Aβ及aSyn胜肽的標記不會阻礙澱粉樣蛋白沉積物的生成，因此，Aβ1-42-Hilyte-555〔可以於PE通道中偵測〕及aSyn-Hilyte-488〔可以於FITC通道中偵測〕以等莫耳量比率〔20μm〕被混合，且溶於1% NH₄OH〔pH 4.5〕中於室溫下放置在搖盪器〔350rpm〕上20小時，於放置後使用 FACS Canto II分析該些沉積物，於該FSC-A/SSC-A中以P1中的尺寸〔約0.5μm~10μm〕圈選〔gate〕獲得的沉積物，且進一步於該PE/FITC散點圖中分析P1，藉以檢測Aβ1-42-Hilyte-555〔PE〕及aSyn-Hilyte-488〔FITC〕的分布。

藉由使用產生自單體aSyn、Aβ1-42及p(E)Aβ3-42蛋白的混合溶液之沉積物為一受質的FACS分析法偵測特異性抗體的反應性

以回溶及短暫震盪〔vortexing〕直到溶液澄清的方式，溶解500μg凍乾的aSyn於100μl無菌過濾的MonoQ水中或溶解100μg的Aβ1-42或p(E)Aβ3-42於100μl無菌過濾的1% NH₄OH(pH 11)中，隨後該些溶液於一超音波震盪水槽中以超音波震盪30秒，並以5μl分裝非急速冷凍地儲存於-20℃，為導致沉積物的生成，將源自個別蛋白的分裝回溫，且以1% NH₄OH〔pH 4.5〕稀釋該三個個別蛋白溶液的全部體積至約35μM之一等莫耳量濃度，該些蛋白溶液以全部三種可能的結合方式被混合，之後在微量離心管中，於37℃中放置於一搖盪器〔350rpm〕上20小時，該些結合方式如下：Aβ1-42及aSyn、Aβ1-42及p(E)Aβ3-42、及p(E)Aβ3-42及aSyn；此外，不只等莫耳量比率〔=50：50〕，還進行一滴定實驗以測試不同比率的沉積物混合物。實驗中表明該沉積物混合的比率〔例如1：100=1μl aSyn(20μm)+99μl的Aβ1-42(20μm)溶液〕；使用混合的沉積物作為接下來樣本準備的受質，且如同前段所述對於aSyn沉積物之處理。

解蔽步驟

為瓦解該些aSyn特異性自體免疫抗體與可能存在於病人血清中之aSyn的結合，及防止藉由抗原基礎之方法〔例如ELISA或FACS〕偵測到該些與aSyn結合的自體免疫抗體，以10mM甘胺酸〔pH 2.6〕預先稀釋血清至一1：16.7的稀釋5分鐘，該被酸化的〔acidified〕血清隨 後再被與3μl的aSyn共置5分鐘，然後該混合物藉由加入92μl的0.5% BSA/PBS而被中和且靜置20到60分鐘；清洗步驟及與二級抗體的共置如同前述對於非解蔽血清之操作。

結果

aSyn沉積物：寡聚作用〔oligomerization〕及纖維的生成〔fibril formation〕

近年來，aSyn沉積物自單體aSyn在多種情況下的生成已經被密集地研究，發現aSyn胜肽的沉積作用〔aggregation〕與pH值、溫度、緩衝溶液的組成及蛋白濃度有極高的關聯性。沉積作用始於由單體〔monomer〕生成β髮夾〔β-hairpin〕而成為水溶性的寡聚物，轉變為同向排列之β摺疊的結構改變隨後造成纖維及纖維性沉積物的生成，並可以被離心沉澱。

本發明係製備aSyn沉積物〔全長的人類aSyn 1-140〕，該些aSyn沉積物可以使用FACS分析法偵測，如於材料及方法中所述，為此一目的，於37℃中以35μm之濃度將無種的〔seedless〕水溶性aSyn胜肽靜置20小時；如第1A圖〔上圖〕所示，一群清楚且同質的aSyn沉積物可以被FACS分析法所偵測，該些aSyn沉積物的尺寸分布〔藉由正前方散射(forward scatter，FSC-A)定義〕使用尺寸被校準範圍在1到15μm的微珠〔流式細胞分析技術尺寸校準套組(Molecular probes Cat.# F-13838)〕進行分析〔第1圖下圖〕，此方法可以得知製備之aSyn沉積物的尺寸如預期地自亞微米的範圍至最高達10μm，且主要範圍分佈於約500nm至2μm。

單株抗體對於aSyn沉積物的反應性

為了定義是否aSyn沉積物可以供aSyn特異性抗體結合，及是否此一交互作用可以藉由於此描述之FACS為基礎的分析法〔FACS-based assay〕加以監控，進行了另一個實驗設置，為此一目的，製備 aSyn沉積物及Aβ1-42沉積物〔根據國際申請專利PCT/EP2012/068494中之揭示內容製作〕及將該些沉積物與針對aSyn的特異性單株抗體〔LB509〕或針對Aβ1-42的特異性單株抗體〔3A5〕共置，此外，兩種型態的沉積物皆與非特異性對照組的單株抗體D129共置，如第2圖所示之FACS色譜曲線圖，該單株抗體LB509單獨地與aSyn沉積物結合，而單株抗體3A5只與Aβ1-42沉積物交互作用，此外，使用該無關聯的單株抗體D129為一同種型對照組，並不與aSyn或Aβ沉積物反應；上述結果顯示所述FACS為基礎的分析法能夠以一高度特異性之方式偵測aSyn抗體。

定義FACS分析法及ELISA系統中針對aSyn的抗體反應性之線性範圍〔linear range〕

為定義該線性分析測量範圍之較高及較低極限，使用單株抗體LB509進行滴定實驗〔第3圖〕。

於Excel中使用檢測的該皮爾森係數〔Pearson’s coefficient〕進行計算以估測該線性範圍，在FACS分析法中對於LB509之產生R²值〔R²-value〕>0.9966的結果，其濃度範圍在80~0.128ng/ml間，因此超過三個對數個數；於ELISA中線性關係的檢測結果為介於15.625ng/ml及0.489ng/ml間之一線性範圍，因此只超過兩個對數個數；一R²值為1代表100%的線性關係。

定義以FACS沉積作用分析及ELISA分析特異性自體免疫抗體對於aSyn的結合的靈敏度，該特異性自體免疫抗體係來自以aSyn特異性疫苗處理之動物之血清及腦脊髓液中

該實驗之目的係為定義及比較兩種獨立的偵測方法〔ELISA及該FACS為基礎之分析法〕之偵測極限，該些方法係偵測動物的血清及腦脊髓液之aSyn反應性，該些動物係為注射一aSyn特異性疫苗的動物。aSyn因此被固定於Maxisorp微滴定試盤〔Maxisorp microtiter plate〕上以 供ELISA測量；或者，製備aSyn沉積物以供FACS分析法分析，隨後應用三種不同血清的一稀釋序列或20種不同鼠科腦脊髓液樣本的一1：100稀釋至個別的系統，且定義ELISA中波長405nm之數值或FACS分析法中的螢光強度〔MFI值〕；為了進行比較，估測對於不同血清〔第4A、4B及4C圖〕及腦脊髓液〔第4D圖〕測量的訊噪比〔signal to noise ratio〕且訊號以背景值倍率〔xBG〕表示。

藉由經免疫化〔immulized〕的小鼠血清之滴定，確認了該 FACS沉積作用分析的高靈敏度，來自小鼠2〔B〕及小鼠3〔C〕的血清顯示即使在一1：125,000的稀釋也具有出高於2倍背景值的一螢光強度中位數訊號，該稀釋各自對於小鼠2具有兩倍背景值而對於小鼠3具有3.11倍背景值，然而在此血清稀釋下，沒有訊號可以於ELISA中被偵測到。

此外，也以此二分析法分析源自20隻小鼠的腦脊髓液樣 本；使用該些腦脊髓液樣本一1：100的稀釋比較該兩種方法，結果在ELISA中20個樣本只有一個達到一有意義的訊號偵測〔對於小鼠8具有2.02倍背景值〕，而以FACS沉積作用分析法測量時，20個樣本有17個顯示出一大於兩倍背景值的螢光強度中位數訊號，分析源自小鼠2的腦脊髓液樣本，結果具有一幾乎30倍背景值的螢光強度中位數訊號，而該腦脊髓液在該ELISA測量中沒有釋放出一陽性訊號。

上述顯示該新發展的FACS為基礎之分析法偵測aSyn特異性自體免疫抗體較例如ELISA的習知分析系統靈敏達30倍。

使用靜脈注射免疫球蛋白〔IVIG〕定義人類自體免疫抗體之aSyn反應性

靜脈注射免疫球蛋白〔intravenous immunoglobulin，簡稱IVIG〕係為一可以立即使用的市售血液產品，包含由健康捐贈者〔至少來自1000人〕的血漿中萃取出之IgG分群，其中包含自然生成且具aSyn胜 肽特異性的抗體〔自體免疫抗體〕。

此實驗的目標是定義是否在此所述之技術能夠以一有效的 方式提供偵測靜脈注射免疫球蛋白〔IVIG-Subcuvia，購買自Baxter，奧地利〕中aSyn特異性自體免疫抗體的可能性。

為此一目的，製備aSyn沉積物以供FACS分析法分析，隨 後，應用不同的靜脈注射免疫球蛋白稀釋液〔範圍為200μg~64ng/ml〕於該些沉積物，且定義螢光強度〔MFI值〕；如第5圖中所示，該FACS為基礎的分析法提供強烈的螢光訊號，顯示該新發展的FACS為基礎之分析法，用以偵測aSyn特異性自體免疫抗體時，對aSyn自體免疫抗體具有高度靈敏度。

單株抗體與混合沉積物的反應性

為定義是否混合沉積物可以供aSyn、Aβ1-42、p(E)Aβ3-42特異性抗體結合及其範圍，且判定是否此一交互作用可以使用此處所述之FACS為基礎的分析法加以監控，進行了另一個實驗設置，為此一目的，除了單純的aSyn沉積物、Aβ1-42沉積物及p(E)Aβ3-42沉積物外，也如材料及方法中所述地製備等莫耳量的混合物或不同比率的個別蛋白之沉積物混合物，該些沉積物隨後與aSyn特異性〔LB509〕或Aβ1-42特異性〔3A5〕及p(E)Aβ3-42特異性〔D129〕的單株抗體共置，且檢測該些混合沉積物與單株抗體的結合形式。

第6圖中描述該些單株抗體對於三種不同的沉積物受質〔藉由混合等莫耳數量已表明之胜肽建立〕之反應性，如同所示之FACS PE色譜曲線圖，該單株抗體3A5單獨地結合包含有Aβ1-42沉積物的混合物〔6A+B〕，然而對於p(E)Aβ3-42/aSyn沉積物的混合物沒有反應性〔6C〕；該抗p(E)Aβ3-42單株抗體D129只與包含p(E)Aβ3-42的混合物結合〔6E+F〕，但對於Aβ1-42/aSyn沒有反應性〔6D〕；此外，該aSyn特異性單株 抗體LB509只與包含aSyn的沉積物混合物反應〔6G+I〕，但不與該Aβ1-42/p(E)Aβ3-42沉積物混合物反應〔6H〕；上述首先顯示能夠以包含不同胜肽的方式製備混合沉積物，及其次該些沉積物特異性地與各自的單株抗體反應。

具有不同經標記的胜肽之混合沉積物之生成

如材料及方法中所述製備等莫耳量混合沉積物，該混合沉積 物帶有不同經螢光標記的Aβ1-42及α共核蛋白；因此，混合等莫耳量比率的Aβ1-42-Hilyte-555〔可以於該PE通道中偵測〕及aSyn-Hilyte-488〔可以於該FITC通道中偵測〕且藉由跨夜靜置製備沉積物，靜置後該混合沉積物使用該FACS Canto II分析，在FSC-A/SSC-A中圈選P1內所得具有尺寸範圍於0.5~10μm的沉積物，且進一步地於PE/FITC散點圖中估測P1，以檢測Aβ1-42-Hilyte-555〔PE〕及aSyn-Hilyte-488〔FITC〕的分布；Aβ1-42-Hilyte-555及aSyn-Hilyte-488的共置的結果，於混合沉積物中有約90%雙重陽性反應，表明Aβ1-42及aSyn在沉積物群集中有一同質性的分布。

於一進一步的實驗中，檢驗該特異性α-Aβ1-42單株抗體及 aSyn單株抗體針對帶有不同胜肽的混合沉積物之反應性，及使用該p(E)Aβ3-42特異性抗體為陰性對照組，因此，於樣本準備前，係以單體Aβ1-42及aSyn的一定量且對稱性的序列滴定製備不同的混合沉積物受質〔mixed-aggregates-substrate〕，詳細而言，35μM的Aβ1-42及aSyn單體溶液以示於表1之比率混合，且於樣本準備後檢測該PE-MFI。

如預期地，使用該非特異性對照抗體D129沒有反應性且當 100%的Aβ1-42為受質時，該aSyn特異性抗體LB509沒有反應性，但該滴定序列顯示0.1%/1%的aSyn一經與99.9/99%的Aβ1-42混合，即足夠引起一強烈的該aSyn特異性抗體LB509之反應性，該反應性甚至比LB509與100%的aSyn沉積物共置所達到的反應性更強烈；此現象的一個理由可能為aSyn單獨形成的沉積物具有非常緊密擁擠的抗原決定基〔epitope〕，該抗原決定基會因為空間阻礙而抑制單株抗體使用所有可用的抗原決定基；另一方面，於該混合沉積物中，aSyn以所有抗原決定基皆可以被單株抗體使用而不會被其阻擋的方式合併，因此該PE-MFI訊號相較於使用100%的aSyn沉積物為受質之測量為高。

定義源自帕金森氏症患者的人體血液中之aSyn澱粉樣蛋白抗體

a. IgG對於aSyn的反應性

使用前述之aSyn沉積物與FACS分析法分析來自帕金森氏症患者〔組數=30，年齡約介於60~80歲〕的血清樣本中之自然存在的特異性抗體含量，雖然各患者個體中的自體免疫抗體水平上有明顯差異，但結果顯示在所有樣本中都可以偵測到對aSyn沉積物具有特異性之自然存在的抗體〔第10A圖〕。

b. IgM對於不同的aSyn沉積物之反應性

另一組實驗中，使用前述之血清以定義aSyn沉積物特異性IgM的反應性；於所有測試的樣本中偵測到對於aSyn沉積物具有特異性之自然生成的IgM抗體同種型，而相較於IgG抗體的反應性，來自這群帕金森氏症患者中的自體免疫抗體水平亦有所不同〔第10B圖〕。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (14)

1. 一種偵測生物樣本中α共核蛋白〔aSyn〕抗體的方法，係包含以下步驟：使該樣本接觸包含aSyn之沉積物，特別是由aSyn組成之沉積物，使該aSyn特異性抗體與該包含aSyn之沉積物結合；及以一單一粒子偵測技術，較佳為以螢光活化細胞分類技術〔fluorescence activated cell sorting，簡稱FACS〕偵測結合於該包含aSyn之沉積物之aSyn特異性抗體。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其特徵在於，該aSyn特異性抗體係為人類抗體，較佳為人類IgG或IgM抗體，特別是人類IgG抗體。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其特徵在於，該aSyn特異性抗體係為自體免疫性抗體。
4. 如申請專利範圍第1至3中任一項所述之方法，其特徵在於，該包含aSyn之沉積物之顆粒尺寸係為50nm至15μm，較佳為100nm至10μm，特別是200nm至5μm。
5. 如申請專利範圍第1至4中任一項所述之方法，其特徵在於，該包含aSyn之沉積物係以將aSyn於pH 2至pH 9的環境下靜置至少20分鐘製得，較佳為靜置至少1小時，特別是靜置至少4小時。
6. 如申請專利範圍第1至5中任一項所述之方法，其特徵在於，用於該樣本及該包含aSyn之沉積物接觸中，該包含aSyn之沉積物之濃度係0.01至10μM，較佳為0.1至1μM。
7. 如申請專利範圍第1至6中任一項所述之方法，其特徵在於，該生物樣本係指人類血液，或來源為人類血液之一樣本，較佳為人 類血清或人類血漿；人類腦脊髓液或人類淋巴液。
8. 如申請專利範圍第1至7中任一項所述之方法，其特徵在於，該包含aSyn之沉積物與該樣本之接觸時間至少為10分鐘，較佳為10分鐘至24小時，特別是20分鐘至2小時。
9. 如申請專利範圍第1至8中任一項所述之方法，其特徵在於，於使該樣本接觸包含aSyn之沉積物前，對該樣本中之aSyn特異性抗體進行一解蔽步驟，特別是當偵測之aSyn特異性抗體為IgM抗體時。
10. 如申請專利範圍第1至9中任一項所述之方法，其中，該生物樣本係為正接受或預設要接受一aSyn免疫療法的一患者之一樣本，且其中測得的aSyn特異性抗體之數量，係關於一蛋白病相關的診斷結果，特別是關於一共核蛋白症相關的診斷結果，該診斷結果係源自同一患者於同時間內之樣本。
11. 如申請專利範圍第1至10中任一項所述之方法，其中，該方法於同患者於不同時間內取得的樣本中進行至少兩次，且其中所測得aSyn特異性抗體的該數量，較佳係關於一蛋白病相關的診斷結果，特別是關於一共核蛋白症相關的診斷結果，該診斷結果係源自同一患者於同時間內之樣本。
12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該方法為每六個月至少進行一次，較佳為每三個月至少進行一次，特別是每個月至少進行一次。
13. 如申請專利範圍第1至12中任一項所述方法之用途，係用以診斷蛋白病，特別是用以診斷共核蛋白症，其中該蛋白病較佳係選自帕金森氏症〔PD〕、路易體症〔LBD〕、路易體癡呆症〔DLB〕、帕金森癡呆症〔PDD〕、多發性系統退化症 〔MSA〕、單純自主神經衰竭症〔PAF〕、快速動眼睡眠行為障礙〔RBD〕、第一型腦內鐵沉積性神經系統退化症〔NBIA Type I〕及包涵體肌炎〔IBM〕、皮質基底退化症〔CBD〕、進行性上眼神經核麻痺症〔PSP〕、皮克氏症〔PiD〕、拳擊手癡呆症〔慢性創傷性腦症，簡稱DP〕、額顳葉癡呆症〔FTD〕、肌肉僵直萎縮症〔LD〕、亨丁頓舞蹈症〔HD〕及脊髓性小腦萎縮症〔第1型、第2型、第3型及第7型〕及肌萎縮性脊髓側索硬化症〔ALS〕、普利昂蛋白沉積及第二型糖尿病；及選自具有α共核蛋白堆積及/或聚集的疾病，特別是選自阿茲海默症〔AD〕、唐氏症〔DS〕、進行性上眼神經核麻痺症〔PSP〕、皮質基底退化症〔CBD〕、額顳葉癡呆症/皮克氏症〔FTD/PiD〕；特別是追蹤該蛋白病早期階段及觀察治療蛋白病的藥物在臨床試驗中的發展。
14. 用以執行如申請專利範圍第1至12中任一項所述方法之套組，係包含：包含aSyn之沉積物；及一樣本容器。