TW201518730A - 偵測生物樣本中Ａβ抗體的方法 - Google Patents

Abstract

本發明揭示一種偵測生物樣本中Aβ抗體的方法，係包含以下步驟：使該樣本接觸Aβ變體沉積物或具有類Aβ變體沉積物表面之粒子，使該Aβ特異性抗體與該Aβ變體沉積物結合；及以一單一粒子偵測技術，較佳為以螢光活化細胞分類技術〔fluorescence activated cell sorting，簡稱FACS〕偵測結合於該Aβ變體沉積物之Aβ特異性抗體。

Description

偵測生物樣本中Aβ抗體的方法

本發明係關於偵測生物樣本中Aβ抗體的方法，特別是用以診斷阿茲海默症〔Alzheimer’s disease，簡稱AD〕或與阿茲海默症之診斷有關的方法。

阿茲海默症係一種包含錯綜複雜的病理機制的漸進式疾病，其中包含：大腦內部的澱粉樣蛋白β〔amyloid β〕沉積作用及斑塊〔plaque〕生成、tau蛋白的過度磷酸化〔hyperphosphorylation〕及神經內糾結〔intraneuronal tangle〕的生成，伴隨著該些腦部蛋白的沉積作用、過度磷酸化的發炎反應，導致神經突觸的損傷及漸進式的神經性退化。

當澱粉樣蛋白β胜肽〔Aβ或A-beta〕自以α螺旋〔alpha-helix〕或無規螺旋〔random coil〕之二級結構為主的水溶態，轉變為以交叉β摺疊〔cross β sheet〕之二級結構為主的沉積態，導致大腦內出現纖維〔fibril〕及澱粉樣蛋白的斑塊〔plaque〕，顯現阿茲海默症的第一個病徵之一。數種形式的Aβ中，不論是C端或N端的缺失或修飾的胜肽，都與大腦中的Aβ斑塊的生成息息相關。三種常見的Aβ之C端變體包含Aβ1-40〔由最後一個胺基酸是纈胺酸-40(Val-40)的40個胺基酸組成〕、Aβ1-42、Aβ1-43等胜肽，除前述三種常見的C端缺失胜肽，另有其他較不常見的缺失態存在，即Aβ1-37、Aβ1-38、Aβ1-39。而Aβ之N端變體中則包含有以谷胺酸作為第一個胺基酸的Aβ3-40/42/43及Aβ11-40/42/43，由於 谷胺酸結構較不安定，容易轉變生成焦谷胺酸〔pyroglutamate，簡稱pE〕，進而轉變成Aβp(E)3-40/42、Aβp(E)11-40/42等變體。

Aβ胜肽之位置掃描實驗〔Positional scanning experiment〕中，以中性的胺基酸〔丙胺酸或脯胺酸〕置換每一個單一胺基酸，定義了於Aβ胜肽中一段對於纖維及沉積作用生成過程具重要性的區域；於Aβ中的點突變定義了第16~20個胺基酸殘基〔residue〕〔KLVFF；賴胺酸-白胺酸-纈胺酸-苯丙胺酸-苯丙胺酸〕是纖維形成的核心序列〔Moss et al.,Mol Pharmacol 64(2003)：1160-1168〕。其他實驗中，係生成跨越整段Aβ1-40序列的三胜肽至十胜肽的一資料庫，並篩選其與整段胜肽結合的能力，同樣地發現該KLVFF五胜肽是與Aβ1-40結合的所需之最小序列，再次代表此五胜肽是組成澱粉樣蛋白生成的核心序列，並且此五個胺基酸的長度即足以導致並支持纖維的生成。此外，以丙胺酸置換此核心序列的實驗中顯示賴胺酸16〔Lys16〕、白胺酸17〔Leu17〕及苯丙胺酸20〔Phe20〕是此交互作用的關鍵〔Moss et al.,2003〕。KLVFF立體特異性地與Aβ中一致的序列結合於之後被證實，並顯示此為特異性的疏水性與靜電性交互作用所產生的結果〔Moss et al.,2003〕。

以丙胺酸置換鄰近於KLVFF核心序列的第15及21~36個胺基酸殘基會導致纖維生成過程不穩定〔Williams et al.,J.Mol.Biol.335(2004)：833-842〕。此外，澱粉樣蛋白結構中位置15~21、24~28及31~36以脯胺酸進行置換容易生成主鏈混亂效果〔main-chain disrupting effect〕，而澱粉樣蛋白結構中位置18~21、25~26及32~33更是特別敏感〔Williams et al.,J.Mol.Biol.357(2006)：1283-1294〕，證實了除了該核心序列KLVFF之外，在Aβ胜肽中還有位於靠近該核心序列的C端之一官能基會參與纖維的生成。在上述由其他研究所得的資料結果之脈絡中，顯示於Aβ1-40中名為Aβ25-35的一C端片段，具有自行生成澱粉樣蛋白纖 維的能力。而Aβ25-35的N端區域具親水性，C端區域則是具高度疏水性，被認為是形成穩定該Aβ澱粉樣蛋白纖維的中央核心。因為此相似性，常使用Aβ25-35為一個Aβ1-40的模型，研究纖維的形成與細胞毒性〔Ban et al.,2004〕。

根據近來依據固態核磁共振〔solid-NMR〕所提出的Aβ結構，第12~24個及第30~40個胺基酸殘基係藉由疏水作用而彼此結合的β螺旋〔β-strand〕結構，而第25~29個胺基酸殘基則被認定為一段彎曲，使兩β螺旋能藉由疏水性側鏈交互作用而接觸〔Ban et al.,J.Mol.Biol.344(2004)：757-767〕。另一方面，同上所述，藉由掃描式的脯胺酸點突變去劃定澱粉樣蛋白纖維的二級結構，顯示第15~21個、第31~36個及第24~28個胺基酸殘基係為β螺旋結構。

在Aβ1-40中進行半胱胺酸置換突變，以觀察澱粉樣蛋白纖維結構及穩定性的研究，再一次鑑別出第16~19個及第31~34個胺基酸殘基為形成澱粉樣蛋白纖維的核心序列。相較於丙胺酸及脯胺酸突變實驗中鑑別出第21個胺基酸殘基對於Aβ纖維的生成很重要，半胱胺酸在位置21的置換則不會干擾此沉積作用過程〔Shivaprasad et al.,JBC Vol.281 No.2(2006)：993-1000〕。此外，在此研究中，將Aβ1-40中複數的胺基酸進行置換，顯示出可以置換一個以上的胺基酸〔不置換該核心序列〕而不會對Aβ纖維或沉積的生成造成主要的干擾。

重要的是，第1~14個及第37~40/42個胺基酸殘基對於胺基酸的置換較不敏感，因此較可能係存在於該富含β螺旋的澱粉樣蛋白核心外之非結構性且較具彈性的片段中。另一群對於胺基酸置換較不敏感的胺基酸，包含第22、23、29及30個胺基酸殘基。該些胺基酸殘基較可能佔據著Aβ纖維中形成交叉β螺旋的序列間轉彎的位置〔Williams et al.,2004〕。因此該些胺基酸似乎扮演著對於澱粉樣蛋白纖維生成較不重要的 角色。

到目前為止，阿茲海默症的診斷方法依然為一單純的臨床方法，仍以病患逐漸發生的認知障礙中至少兩項〔例如認知或功能〕作為基準，負面地影響患者的日常生活，而沒有其他可識別的根據〔例如血管的〕；習用臨床的阿茲海默症診斷方法之限制係為誤診率高〔專家的診斷特異性為80%〕，且事實上只有在疾病晚期，已造成實質上的神經損傷導致功能性障礙時，該診斷才能夠進行。

根據近20年來的知識累積，阿茲海默症的診斷方式正在快速地改變，在巴黎的B.Dubois為主的研究團隊首先將阿茲海默症的病理學研究資料整合為診斷的運算法則〔Dubois et al.,Lancet Neurol.9(2010)：1118-1127〕，根據該些作者，阿茲海默症的診斷係基於一特異性的認知障礙〔一情節記憶的改變〕的發生並伴隨著疾病特異性生物標記〔以結構性MRI(structural MRI)所觀察到的海馬區萎縮、腦脊髓液的異常指標(A42表現量低、tau表現總量高、磷酸化之Tau表現量高)、澱粉樣蛋白影像呈陽性反應、遺傳風險性(defined genetic risk)〕等的一改變；而近年來，NIH-NINCDS工作團隊採納了大部分上述診斷方法〔McKhann et al.,Alzheimer’s & Dementia 7(2011)：263-269〕，並以上述診斷方法來作為早期阿茲海默症一輕度知能障礙〔mild cognitive impairment，簡稱MCI〕的診斷方法。

以反映該疾病病程之生物標記方式強化臨床診斷的概念，也已被美國國家老齡化研究所〔National Institute of Aging〕及阿茲海默症協會〔The Alzheimer’s Association〕所認可，據此，阿茲海默症的診斷並不再是消極的排除法而發展為積極的界定法。然而美國國家老齡化研究所及阿茲海默症協會並沒有完全參照Dubois的研究團隊所提出的生物標記運算法則〔biomarker-driven algorithm〕，反映出此當時可用的生物標記之極 限；以腦脊髓液的指標為例，阿茲海默症患者的腦脊髓液之典型態樣，即，Aβ1-42含量降低、總Tau〔tTau〕及磷酸化Tau〔pTau〕含量增高，然而，此典型態樣雖存在於阿茲海默症患者中，卻不能偵測到其隨著時間的變化。事實上，在具有阿茲海默症罹患風險的病人群集〔即輕度知能障礙患者〕中，該特徵可鑑定出繼續發展出臨床症狀的患者，然而已處於完全成熟階段的阿茲海默症患者中，該腦脊髓液顯示出相同的表現形態與改變量，亦即，在無法界定正常範圍之Aβ1-42、總Tau及磷酸化Tau含量的情況下，則無法定義變化時機點，即該病患的Aβ生理狀態自正常轉變為異常的時間點；對於其他目前尚未確認的生物標記也是如此，其中最重要的原因，是因為實驗的風險及花費，使重複性地檢測腦脊髓液、MRI檢測及澱粉樣蛋白影像無法輕易地達成，所以只有少數表淺的研究涉及該議題。

因此，迄今尚還沒有一個具有高度可信度、可輕易重複實驗、低危險性，且不需花費大量實驗經費的生物標記。過去投入大量人力物力進行之阿茲海默症的血液中生物標記的研究已宣告失敗〔Hampel et al.,Nat.Rev.Drug Discov.9(2010)560-574〕，然而生物標記的研究發展對於發展治療方法卻是極為重要的一環，對患者及早進行診斷，以便能夠及早對患者投入治療，對於患者而言也會有較佳的癒後效果；並且，藉由一個特異性生物標記的幫助，可限制資源用於真正的阿茲海默症患者。

迄今，Aβ〔包含所測試之多種Aβ類型及沉積態〕已於阿茲海默症、輕度知能障礙〔MCI〕及阿之海默症的前癡呆期〔pre-dementia stage〕中被估測，而近年來也發現阿茲海默症患者及健康個體的血清及腦脊髓液中含有抗澱粉樣蛋白之活性的IgG及IgM〔O’Nuallain et al.,J.Clin.Immunol.30(2010)Suppl.1：S37-S42；Marcello et el.,J.Neural.Transm.116(2009)：913-920〕，以ELISA或免疫沉澱法測量對各種Aβ類型/沉積態具有特異性的IgG及/或IgM，發現阿茲海默症及輕度知能障礙患者血清中的Aβ 自體免疫抗體水平較健康對照組為低；雖然該些實驗顯示在自體免疫抗體濃度上的差異性，過去缺乏靈敏性及特異性的方法必須要使用這些方法，以高選擇性及特異性地去鑑別阿茲海默症及輕度知能障礙患者。目前使用最多的方法係以ELISA技術為基礎，為了增加該些分析的靈敏度，某些手段中改採放射性同位標記之Aβ1-42胜肽，而Brettschneider等人的ROC〔receiver operating characteristic〕分析法，係以免疫沉澱法搭配氯胺T〔chloramine T〕標記之Aβ1-42胜肽，以測量阿茲海默症患者與健康對照組的差異，該法達到46.7%的特異性及81.3%的靈敏性〔Brettschneider et al.,Biol.Psychiatry 57(2005)：813-817〕；相較之下，Bayer等人使用以ELISA為基礎之一技術，係於試盤上塗佈含有一焦谷胺酸Aβ片段；在此技術中，以抗IgM-HRP抗體進行對於健康對照組及阿茲海默症患者中抗Aβ特異性IgM自體免疫抗體的偵測，顯示當設定靈敏性為80%時，其特異性為60%〔WO 2010/128139 A1；Marcello et al.,J.Neural.Transm.116(2009)：913-920〕。到目前為止，上述方法均未使其具有作為阿茲海默症預測型生物標記〔>80%特異性〕之資格，而滿足其標準。

該兩病患群組中Aβ特異性抗體的血清濃度下降之原因目前仍不清楚，兩種一般性但互不相斥之解釋為：產量減少〔疾病特異性相對於一般性免疫衰老〕；及重新配位〔抗體沉澱在澱粉樣蛋白沉積物中，如大腦中的澱粉樣蛋白沉積物〕。近來的研究支持該些Aβ特異性〔自體免疫〕抗體具有一潛在性功能，該些研究證實市售血液製品，即萃取自健康捐贈者血漿中IgG的分群〔fraction〕，含有對Aβ胜肽具有特異性的抗體。分別由兩間公司推出的二種靜脈注射免疫球蛋白〔intravenous immunoglobulin，簡稱IVIG〕製品，均已進入臨床試驗階段，以評估該二種製品干擾或防止阿茲海默症之病理機制的可能性。

另一個未解的問題則是，帕金森氏癡呆症〔Parkinsor’s dementia，簡稱PDD〕、路易體痴呆病〔Dementia with Lewy Bodies，簡稱DLB〕、澱粉樣腦血管病變〔Cerebral Amyloid Angiopathy，簡稱CAA〕及例如拳擊所造成之慢性頭部外傷〔chronic head trauma〕等在病理生理學中有涉及Aβ特異性抗體的疾病中，是否其Aβ特異性抗體水平都有減少的趨勢；研究該些疾病中的Aβ沉積物特異性抗體的水平，有助於了解阿茲海默症患者的血清中Aβ沉積物特異性抗體的含量會減少之發展流程。對該些疾病患者的血清所進行之研究係有助於釐清阿茲海默症是否為一種特殊的免疫性缺陷所造成〔Aβ特異性抗體的力價(titer)僅在阿茲海默症病患的血清中減少，而沒有在其他罹患具有Aβ病理特徵的疾病之病患血清中觀察到此一現象〕，或Aβ特異性抗體水平的減少是否係由多種Aβ病理特徵所致之重新配位而造成；於第一種情況中，該測試係為一高度疾病特異性的生物標記，並且其結果在於區分阿茲海默症與前述其他疾病本質上有所幫助；而於第二種情況中，該測試有助於鑑定哪些患者之疾病係由此類Aβ病理特徵導致。

在歐洲專利WO 2010/128139 A1中，揭示了用以診斷阿茲海默症的生物標記及方法，特別為抗pGlu Aβ之抗體；Funke等人討論體液中Aβ沉積物的偵測是否為一合適的阿茲海默症早期診斷方法〔Curr.Alz Res.,6(3)(2009)：285-289〕；Maetzler等人發現在路易體痴呆病〔Lewy body-associated dementias〕患者的血清及腦脊髓液中，抗澱粉樣蛋白及抗神經膠質衍生抗原〔glial-derived antigen〕之自體免疫抗體的含量均有上升〔J.Alz.Dis.26(1)(2011)：171-179〕；Funke等人揭示一偵測Aβ沉積物的單一粒子偵測技術〔Rejuv.Res.13(2-3)(2010)：206-209〕；Fukumoto等人則揭示於阿茲海默症患者的腦脊髓液中，高分子量β-澱粉樣蛋白寡聚物的含量上升〔Faseb J.,1(24)(2010)：2716-2726〕。使用Aβ沉積物偵測Aβ特異性抗體的方法於PCT/EP2012/068494中揭示。

WO 2013/050248 A1中揭示在人類血液中Aβ沉積物抗體的檢測；WO 2010/011947 A2揭示Aβ寡聚球體〔Aβ globulomer〕用以偵測Aβ寡聚球體特異性自體免疫抗體及用以產生此抗體之用途。Aβ沉積物與Aβ寡聚球體在結構上及其結構形成方式上皆有明顯的差異；事實上，Aβ寡聚球體係以與形成澱粉樣蛋白纖維無關的路徑生成〔相較於Aβ沉積物是經由原纖維及纖維所生成〕；Aβ寡聚球體〔基於其結構〕具有新抗原決定基〔neo-epitope〕，又稱寡聚球體抗原決定基〔globulomer epitope〕，該些新抗原決定基不存在於Aβ沉積物中。該些新抗原決定基存在於患者〔阿茲海默症患者〕中，並且是具免疫性的，且可以引發寡聚球體抗原決定基特異性抗體的生成，該些抗體〝定義上〞可以被Aβ寡聚球體而非Aβ沉積物所檢測。如同已闡明的部分，Aβ寡聚球體在結構與尺寸上都與Aβ沉積物〔例如纖維〕有所不同，Aβ寡聚球體結構被一至數個內部擬肽物共價鍵〔intra-peptidomimetic covalent bond〕所穩定，而該現象不會發生在纖維中；Aβ寡聚球體包含4到16條胜肽，而纖維包含至少100條胜肽，該差異造成Aβ寡聚球體因為太小而無法被FACS分析法所偵測，惟剛好可被SDS PAGE和ELISA所偵測，而造成偵測的靈敏度遠低於以FACS為基礎的技術〔FACS-based technique〕。最後，根據WO 2010/011947 A2，抗Aβ寡聚球體自體免疫抗體即代表阿茲海默症，然而Aβ沉積物抗體則會存在於健康的個體之中。

Spells等人報告了有關藉由塗佈HLA抗原之聚苯乙烯微珠偵測HLA抗體的特異性〔Abstract of the 29th annual meeting of the American Society for Histocompatibility and Immunogenetics：S113〕；Li等人〔BMC Neuroscience 8(2007)：22〕揭示對於血液循環中抗Aβ抗體的ELISA檢測中，低酸鹼值抗原-抗體解離過程的改良。WO 97/14028 A2揭示使用標記有特異性生物標記的〝微珠〔beadset〕〞和使用FACS的多重分析系統。

EP 2 143 447 A1揭示具有β澱粉樣蛋白抗原的一支架。Funke等人〔Rejuvenation Res.13(2010)：203-209〕揭示運用雷射掃描顯微鏡分析表面螢光強度分布的Aβ沉積物之一單一粒子檢測系統。

雖然阿茲海默症被認為是一種退化性大腦疾病，免疫系統也在疾病推進的過程中扮演了重要的角色。近年來，亦有研究提出可以免疫療法去除大腦中的澱粉樣蛋白β胜肽，且此類的免疫療法在動物實驗中獲得極佳的療效，然而，阿茲海默症患者的活性澱粉樣蛋白β的免疫注射療法卻在某些患者發展成腦膜腦炎〔Meningoencephalitis〕後被迫中斷；目前主要是以透過體液免疫法或細胞免疫之免疫療法來治療或預防阿茲海默症及其他相關疾病，但是在治療過程及疾病發展過程中，仍然需要一個足以用來監控患者的免疫反應，以證明治療的療效，並且也需要鑑定在進行疫苗療法的患者中，象徵達到疫苗療法目標意義的抗體。

本發明之目的係提供提升阿茲海默症診斷方法的手段，特別是追蹤該疾病之早期病程和觀察治療阿茲海默症患者的藥物在臨床試驗中的發展；本發明之另一目的係提供可信賴的工具，以偵測在生物樣本中的抗Aβ抗體，特別是在人類阿茲海默症患者或是被懷疑具有或有風險具有發展中的阿茲海默症之樣本中。

因此，本發明係提供一種偵測一生物樣本中Aβ特異性抗體的方法，係包含以下步驟：使該樣本接觸Aβ變體沉積物〔Aβ-variant aggregate〕或具有類Aβ變體沉積物表面之粒子，使該Aβ特異性抗體與該Aβ變體沉積物結合；及以一單一粒子偵測技術，較佳為以螢光活化細胞分類技術〔fluorescence activated cell sorting，簡稱FACS〕偵測結合於該Aβ變體沉積物之Aβ特異性抗體；其中，該Aβ變體係選自由下列(a)、(b)、(c)及(d)所組成之群組：(a)該Aβ-1-40或該Aβ-1-42胜肽之一突變 態，該突變態包含至少一胺基酸位置的突變，且該突變係位於第16至20、第25至28個及第31至35個胺基酸位置之外；(b)自然存在之一Aβ胜肽，該Aβ胜肽不為Aβ-1-40、Aβ-1-42、Aβ-1-43、Aβ-3-42或Aβ-p(E)3-42；(c)該Aβ-1-40或該Aβ-1-42胜肽之一缺失態，該缺失係位在第16至35個胺基酸位置之外，且該缺失係至少為一個胺基酸及至多為20個胺基酸；或(d)綜合上述之組合，特別是結合該Aβ-1-40胜肽或該Aβ-1-42胜肽中至少一突變及至少一缺失之組合。

本發明係揭示偵測Aβ特異性自體免疫抗體之一新方法，可以用於作為診斷阿茲海默症及監控阿茲海默症發展上極有幫助的診斷工具；本發明之方法被證明特別適合用以監控臨床試驗之發展，該臨床試驗係為以免疫療法治療阿茲海默症；本發明之方法並非僅採用單一Aβ胜肽作為抓取Aβ特異性抗體的工具，反而是以Aβ變體沉積物作為抓取Aβ特異性抗體的工具，因此產生之抗體一Aβ變體沉積物之複合物可以被單一粒子偵測技術所偵測。

根據本發明，該Aβ變體係選自由下列(a)、(b)、(c)及(d)所組成之群組：(a)該Aβ-1-40或該Aβ-1-42胜肽之一突變態，該突變態包含至少一胺基酸位置的突變，且該突變係位於第16至20、第25至28個及第31至35個胺基酸位置之外；(b)自然存在之一Aβ胜肽，該Aβ胜肽不為Aβ-1-40、Aβ-1-42、Aβ-1-43、Aβ-3-42或Aβ-p(E)3-42；(c)該Aβ-1-40或該Aβ-1-42胜肽之一缺失態，該缺失係位在第16至35個胺基酸位置之外，且該缺失係至少為一個胺基酸及至多為20個胺基酸；或(d)綜合上述之組合，特別是結合該Aβ-1-40胜肽或該Aβ-1-42胜肽中至少一突變及至少一缺失之組合。

根據本發明，較佳之胜肽變體係包含Aβ-1-40/42的缺失及/或修飾〔即包含胺基酸置換的胜肽；該置換數目可以超過10，惟，較佳的 變體具有10到1個置換，更佳為5到1個置換，又更佳為是4、3特別是單一個置換〕。

該胺基酸的編號以已確立的Aβ胜肽編號為準：Aβ-1-42(SEQ ID NO.1)：

Aβ-1-40(SEQ ID NO.2)：

Aβ-1-43(SEQ ID NO.3)：

Aβ-3-42(SEQ ID NO.4)：

Aβ-p(E)3-42(SEQ ID NO.5)：,

下列Aβ變體的群組特別適合於Aβ變體沉積物中〔群組4最適合，其次是群組3，之後則是群組2和群組1〕：

Aβ變體的群組1：包含該核心序列Aβ-16-20或該第二核心序列Aβ-25-35的胜肽，該些胜肽會自行形成澱粉樣蛋白纖維，由該些核心序列開始，胜肽可以由Aβ胜肽上的胺基酸或是由形成缺失的天然Aβ胜肽或經修飾的缺失Aβ胜肽的替代胺基酸來延伸。

Aβ變體的群組2：包含該序列Aβ16-20-X_21-23-24-28-X_29-30-31-36的胜肽〔代表存在胺基酸16至20、24至28及31至36，並且由一3個及一2個之胺基酸連接物所連接(具有任意的一級序列)〕，由該些核心序列開始，胜肽可以由Aβ胜肽上的胺基酸或是由形成缺失的天然Aβ胜肽或經修飾的缺失Aβ胜肽的替代胺基酸來延伸。

Aβ變體的群組3：包含該序列Aβ16-36的胜肽，由該些核心序列開始，胜肽可以由Aβ胜肽上的胺基酸或是由形成缺失的天然Aβ胜肽或經修飾的缺失Aβ胜肽的替代胺基酸來延伸。

Aβ變體的群組4：包含該序列Aβ11-36或Aβp(E)11-36的胜肽，由該些核心序列開始，胜肽可以由Aβ胜肽上的胺基酸或是由形成缺失的天然Aβ胜肽或經修飾的缺失Aβ胜肽的替代胺基酸來延伸。

突變以保守性的〔conservative〕突變為佳，即在胺基酸殘基的突變具有相似的側鏈；一保守性的突變以相同或相似種類定義之一胺基酸置換聚胜肽中之一胺基酸，例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸皆可以保守性地突變為其他脂肪族胺基酸殘基或是非極性胺基酸殘基；保守性的胺基酸置換可以在一聚胜肽中頻繁地發生，不會改變該聚胜肽的結構或功能；置換的選擇可以根據其可能發生的效果於：〔a〕鄰近於置換的位置的骨架結構，例如摺疊〔sheet〕或螺旋〔helical〕的結構；〔b〕目標 區域之分子的電荷或疏水性；或〔c〕側鏈的尺寸或分枝。一般而言，胺基酸殘基可以依據其側鏈的性質而分類：〔1〕脂肪族〔aliphatic〕：丙胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；〔2〕小脂肪族〔small aliphatic〕：丙胺酸及纈胺酸；〔3〕大脂肪族〔large aliphatic〕：甲硫胺酸、白胺酸及異白胺酸；〔4〕中性親水性〔neutral hydrophilic〕：絲胺酸、蘇胺酸、天門冬醯胺及穀胺醯胺；〔5〕酸性〔acidic〕：天門冬胺酸及穀胺酸；〔6〕鹼性〔basic〕：組胺酸、賴胺酸及精胺酸；〔7〕帶電荷性〔charged〕：精胺酸、天門冬胺酸、穀胺酸、組胺酸及賴胺酸；〔8〕改變骨架結構的胺基酸殘基：甘胺酸及脯胺酸；〔9〕芳香族〔aromatic〕：色胺酸、酪胺酸及苯丙胺酸。非保守性的突變則將該些種類之一的一成員置換成一不同種類的一成員，而本發明的保守性突變，則將該些種類之一的一成員置換成同種類的另一成員〔除了分類〔8〕〕，通常突變不改變為半胱胺酸、甘胺酸及脯胺酸來進行。

根據本發明，較佳的突變位置係介於第11至16個胺基酸間及第36個胺基酸至C端間〔例如第40個或第42個胺基酸〕，在此處即使是非保守性的置換〔較佳係置換為小型中性或脂肪族胺基酸〕也是可行的；而在第21至23和29至30個胺基酸殘基等環狀區域〔loop region〕，較佳係僅提供〔保守性〕的突變；在N端區域〔例如第1~10個胺基酸殘基〕，事實上所有的突變及缺失皆為可能〔保守性的及非保守性的〕，且該區域通常都不會影響根據本發明所述之沉積物生成。

如此，本發明之眾多Aβ變體已具體地揭示，然而亦提供其他變體，如同上述定義並可以應用於本發明過程中，具有形成沉積物的能力。任何突變/缺失的變體〔或是上述之結合；在揭示於此之教示內容之內〕皆可以藉由測試該變體是否可使沉積物生成，以輕易地測試其沉積物形成能力〔aggregate-forming capability〕，方式如下所述： 簡言之，進行Aβ變體沉積物〔源自不同的缺失及修飾版本之Aβ〕之製備，例如透過跨夜靜置進行，特別是揭示於實施方式之章節；隨後，Aβ變體沉積物與源自健康捐贈者〔HD〕或阿茲海默症患者的血清樣本進行共置，特別是阿茲海默症患者或可能罹患阿茲海默症的患者的血清樣本，讓其中的抗體〔IgG和IgM〕得以結合。該與Aβ變體沉積物結合的抗體，可以為任何本發明所屬領域中具有通常知識者可用之任何合適之方式偵測，像是使用經標記並可以辨認與Aβ沉積物結合的Aβ特異性抗體的二級抗體，例如使用標記有藻紅素〔phycoerythrin，簡稱PE〕的二級抗體；其後，包含有與Aβ變體沉積物結合的Aβ特異性抗體〔以及選擇性的一到多個偵測因子，例如二級抗體〕的免疫複合物，使用一單一粒子偵測技術進行檢測，例如螢光活化細胞分類技術〔fluorescence activated cell sorting，簡稱FACS〕，也被稱為流式細胞分析技術〔flow cytometry〕；本發明所提供之方法，指出相較於健康個體，阿茲海默症患者包含較少針對Aβ變體沉積物作用的Aβ特異性免疫球蛋白〔游離的Aβ特異性免疫球蛋白〕；此外，解蔽步驟〔demasking，從自體免疫抗體上去除可能結合的Aβ抗原〕可以增加本發明所提供之方法指出源自阿茲海默症患者的Aβ特異性免疫球蛋白反應性〔對於本發明所提供的Aβ沉積物〕，相較之下，健康個體中的Aβ特異性免疫球蛋白反應性，這樣一個針對Aβ變體沉積物的反應性增加不會在以一特殊方式處理該些血清後被偵測到；另一方面，在阿茲海默症患者中，IgM抗體的反應性在經過解蔽步驟〔=將血清中已結合的Aβ解離〕後獲得一上升之IgM水平，並且，IgG的水平在經過解蔽步驟前後也有所差異〔delta(△)值〕，相較於健康對照組，在阿茲海默症患者中此參數也被提高，顯示在疾病病理狀態中的抗體有較高的被Aβ佔據的現象；此外，本發明所提供的數據顯示本實驗所提供之方法有一明顯較高的能力以偵測Aβ特異性抗體，並因此相較於近來發表的方法，具有 較強的能力去診斷例阿茲海默症；據此，本發明所提供之方法實現具有可預測性的診斷工具理論上的必要條件，以供鑑定阿茲海默症，並且可追蹤給予病人之治療的後續臨床反應。

本發明之沉積物也可以由超過一種片段種類所組成，即由本發明所述之Aβ變體彼此間相互結合，或與自然生成的Aβ胜肽結合，特別是Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-43、Aβ1-37、Aβ1-38、Aβ1-39、Aβ3-40/42/43、Aβ11-40/42/43、Aβp(E)3-40/42及Aβp(E)11-40/42；本發明之較佳實施例中，本發明之沉積物包含至少二不同的本發明之Aβ變體，或至少一本發明之Aβ變體與Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-43、Aβ1-37、Aβ1-38、Aβ1-39、Aβ3-40/42/43、Aβ11-40/42/43、Aβp(E)3-40/42及Aβp(E)11-40/42之至少一所結合；本發明之其他實施例包含本發明之至少三Aβ變體，及/或選自Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-43、Aβ1-37、Aβ1-38、Aβ1-39、Aβ3-40/42/43、Aβ11-40/42/43、Aβp(E)3-40/42及Aβp(E)11-40/42，特別是Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ3-42及Aβp(E)3-40/42之至少二不同的Aβ胜肽；對於特定的混合沉積物，可以簡單地改變及優化該些沉積物中的該些變體之莫耳比例〔molar ratio〕，較佳地，二不同種類之一混合物的莫耳比例介於1：100到100：1之間，更佳為介於1：10到10：1之間，特別是1：5到1：5之間，並可以依照此基本規則，提供具有多於二不同種類之混合物；另一方面，本發明另提供混合沉積物，由Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-43、Aβ1-37、Aβ1-38、Aβ1-39、Aβ3-40/42/43、Aβ11-40/42/43、Aβp(E)3-40/42及Aβp(E)11-40/42之至少二所組成，較佳地為包含Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ3-42、Aβp(E)3-40/42之混合沉積物，特別是包含Aβ1-42的混合沉積物。

本發明之包含Aβ變體的沉積物之另一較佳實施例係關於沉積物，該沉積物除包含揭示於此之至少一Aβ變體外，另包含一不同的沉積物形成聚胜肽種類的一沉積物成分〔此處提及之名詞〝聚胜肽〞，包含名 詞〝蛋白〞，而通常等同地使用此二名詞；因而此處之名詞〝蛋白〞亦適用於少於100或少於50胺基酸殘基的聚胜肽〕，較佳地，該沉積物形成聚胜肽種類係選自Tau蛋白或其一沉積物形成變體、alpha共核蛋白〔aSyn〕或其一沉積物形成變體、島嶼澱粉樣蛋白聚胜肽〔islet amyloid polypeptide，簡稱IAPP〕及其一沉積物形成變體，特別是IAPP-Npro、TAR-DNA結合蛋白43〔TAR-DNA binding protein 43，簡稱TDP43〕或其一沉積物形成變體，和超氧化岐化酶1〔Superoxide-Dismutase 1，簡稱SOD1〕或其一沉積物形成變體。

較佳的aSyn沉積物形成變體〔〝aSyn變體〞〕為aSyn-126〔缺少第41~54個胺基酸；缺少外顯子4〕、aSyn112〔缺少第103~130個胺基酸；缺少外顯子5〕、aSyn98〔缺少外顯子3和5〕、磷酸化的aSyn、aSyn-126、aSyn-98及aSyn-112，特別是絲胺酸129磷酸化的aSyn、亞硝化/硝化、乙醯化及單泛素化、雙泛素化及三泛素化的aSyn、aSyn-126及aSyn-112，或C端缺失態的aSyn、aSyn-126及aSyn-112，較佳為缺少C端20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸的aSyn。

較佳的Tau沉積物形成變體〔〝Tau變體〞〕為高磷酸化Tau、不正常磷酸化Tau〔於Shahani et al.J.Neurosci.26(2006),6103-6114中被提及及定義〕、具有疾病標記功能的Tau蛋白變體〔共六個自然形成的異構物(Tau441、Tau412、Tau410、Tau383、Tau381及Tau352)之異構物〕或其突變態〔例如P301L、P301S、V337M等〕，例如：較佳變體型態為同時於第181個、第202個、第205個、第212個、第214個、第231個及第396個胺基酸上磷酸化以及選擇地於Tau的額外的殘基上磷酸化，該額外的殘基例如Tau441、Tau412、Tau410、Tau383、Tau381及Tau352上的第18個、第153個、第175個、第189個、第235個、第262個、第394個、第404個及第422個胺基酸殘基〔Tau磷酸化更詳細的分析已被揭示，例 如Hanger et al.,Trends in Mol.Med.15(2009),112-119〕。

本發明之方法係用以偵測人類樣本中之Aβ特異性抗體，因此一較佳實施例係用以偵測人類Aβ特異性抗體，較佳為人類IgG或IgM抗體，特別是人類IgG抗體。如前述，偵測人類Aβ特異性抗體係本發明所屬技術領域中具有通常知識者之通常知識，然而，迄今尚未提出其作為生物標記之角色，於本發明中亦揭示這是由於所屬技術領域中的偵測方法的分析效力不足的結果所致。因本發明之方法所帶來的優勢，使用人類樣本中的抗體作為生物標記是可行的，因此本發明之方法特別適合偵測生物樣本中的自體免疫抗體，據此，本發明之較佳實施例中，被偵測及定量的該Aβ特異性抗體即為該自體免疫抗體。

相較於習知之方法，本方法係使用Aβ變體沉積物作為探針〔probe〕，以供與樣本中的Aβ特異性抗體結合；雖然該沉積物為所屬技術領域中之通常知識，但目前尚不清楚將該沉積物應用於分析Aβ特異性抗體的用途，特別是人類樣本中的Aβ特異性抗體，且該用途可以顯著提升該方法，以及該用途可以結合單一粒子偵測技術，特別是FACS。因為該沉積物之用途，單一粒子偵測技術〔係為在各種領域及為不同問題所建立的習知技術〕才能夠被用來分析過去很難處裡的人類樣本〔例如血液〕中的Aβ特異性抗體。

較佳地，本發明之該沉積物之尺寸係經標準化以供後續分析使用，該標準化作業程序可以於製造該沉積物時使用並遵照特定之參數來建立，依據不同的沉積物生成的環境，也可以調整沉積物的顆粒尺寸，其中本發明該Aβ變體沉積物之適合的顆粒尺寸範圍為50nm至15μm，較佳的顆粒尺寸範圍為100nm至10μm，特別是200nm至5μm〔以該沉積物之長定義之，即該最長範圍〕。

用以提供適合本發明之沉積物之一較佳方法包含本發明之 Aβ變體靜置步驟，係於pH 2至9之環境下靜置至少20分鐘，較佳為至少1小時，特別是至少4小時；該靜置的時間係為決定該沉積物顆粒尺寸的要素之一：該靜置的時間越長，生成之該沉積物的顆粒就越大，典型的靜置時間係為10分鐘至24小時，較短的靜置時間通常只會生成較小顆粒且較少量的沉積物，於本方法中，不建議超過48小時等明顯過長的靜置時間。當然，必要時沉積物亦能夠以經過分類及篩選以獲取適合的顆粒尺寸，例如可以分層離心〔fractionated centrifugtion〕或是相似技術。

根據本方法，具有被偵測之Aβ特異性抗體的樣本係與Aβ變體沉積物接觸，使該樣本中之可能存在的Aβ特異性抗體〔及面對面反應的Aβ變體沉積物〕得以結合，而因此調整該Aβ變體沉積物的濃度以提供該抗體足夠的結合位置；據此，用以結合該樣本中之抗體的Aβ變體沉積物的濃度較佳係為0.001至1μM，更佳為0.01至0.1μM。理想的濃度也會依據結合抗體之性質、樣品之性質、預定接觸時間及沉積物尺寸而定。

本發明之方法主要係用於人類樣本上的應用，因此該生物樣本較佳係指人類血液，或來源為人類血液之一樣本，更佳為人類血清或人類血漿；人類腦脊髓液或人類淋巴液。有了上述之樣本來源，亦可能建立系列性及常規化的測試〔特別是對於源自血液之樣本〕。

供該樣本中之抗體與該沉積物進行適當之結合的較佳接觸時間至少為10分鐘〔例如10分鐘至48小時〕，更佳為15分鐘至24小時，特別是30分鐘至2小時。

如果該生物樣本並未經過特異性地前處理，具有與該Aβ變體沉積物結合之能力的該Aβ特異性抗體會在與該Aβ變體沉積物接觸時被結合；在該樣本中被遮蔽〔masking〕的該Aβ特異性抗體〔即，該些抗體已經與一配位體結合，例如與一Aβ包含結構或內生性的Aβ胜肽結合〕，並不會被本發明之方法〔缺少特異性的樣本前處理〕所偵測；然而，在許 多情況下，僅識別及偵測可反應的抗體是足夠且被需要的，當該樣本中Aβ特異性抗體的總量〔包括可反應或不反應的抗體〕或全部可反應、不可反應〔〝被遮蔽的〞〕及所有Aβ特異性抗體的數量應該被偵測時，可能有狀況或診斷上的問題。

因此，本發明之另一較佳實施例中，使用被解蔽的樣本，即於本發明之Aβ變體沉積物接觸前，該樣本中之Aβ特異性抗體從與之結合的配位體中〝被釋放〞，這使得該樣本中的所有Aβ特異性抗體都被偵測到，而不僅止於偵測到那些沒有與樣本中之配位體結合的抗體〔〝游離〞或〝可反應〞的抗體〕；在本發明的過程中確定了阿茲海默症的診斷及發展之關鍵標記係為可反應的Aβ特異性抗體之總量，特別是可反應的Aβ特異性IgG；如前所述，本發明亦適合用以決定該樣本中Aβ特異性抗體的全體數量，即，該樣本中，該自由〔或〝可反應〞〕的抗體及那些已經被結合〔例如被Aβ結構結合〕的抗體，可以用以幫助建立一樣本中，可反應與不可反應抗體的差異性〔△〕，該差異性係為對於阿茲海默症的診斷具實質重要性的一參數；在對於阿茲海默症為〝健康狀態〞的人中，此差異性將會呈現不存在〔或很低〕，這樣的差異性具有決定性的阿茲海默症標記功能，無論是對於Aβ特異性IgG和Aβ特異性IgM皆然。為了以IgM作為阿茲海默症診斷的參數，在本發明之方法操作之前先經過一解蔽〔demasking〕步驟是特別適合的，並因此於該樣本中將定義可反應與不可反應抗體的差異性〔△〕並作為有意義的參數。

本發明之方法係使用單一粒子偵測技術，該技術係能夠鑑定並量化〔〝計數〞〕該Aβ特異性抗體結合該Aβ變體沉積物之〝陽性〞結合結果的數量；本技術之較佳實施例為FACS分析法，該分析法為本領域已建立之一技術，其他用於偵測與該Aβ變體沉積物結合之該抗體的方法為如Luminex或質譜分析〔Mass cytometry〕。

根據該Luminex技術，樣本的準備可以如本發明材料及方法所述之方法製備；於樣品製備之後，Aβ變體沉積物被特異性的Aβ特異性抗體所辨認，並能夠以結合有螢光染劑並能夠以多重檢測系統〔如Luminex reader〕偵測之二級抗體進行偵測〔Binder et al.,Lupus15(2005)：412-421〕。

若是以質譜分析〔mass cytometry〕作為單一粒子偵測技術，樣本的處理也可使用材料及方法中之描述進行；當樣本準備完成後，被特異性抗體所辨認的Aβ變體沉積物則可以被結合具過渡元素穩定放射性同位素之二級抗體所辨識，並以原子質譜分析〔atomic mass spectrometry〕進行偵測。該樣本係可以被噴出並穿過一充滿氬電漿，且加溫至大於5500K的感應線圈，該樣本被汽化及被離子化成其原子成分，而使被放射性同位素標定的抗體數量則被飛行時間質譜分析〔time-of-flight mass spectrometry〕所定量〔Janes et al.,Nat.Biotechnol.29(2011)：602-604〕。

此外，也可以應用一結合配位體〔Aβ變體沉積物或抗體/血清〕被固定之單一粒子偵測技術，惟其結合係以流體狀態下偵測，例如圓柱型微陣列晶片技術〔Hybcelltechnology〕及表面電漿共振〔surface plasmon resonance〕技術。於本發明中以圓柱型微陣列晶片技術進行偵測時，血清樣本可以被點在該圓柱型微陣列晶片〔Hybcell，一旋轉的圓筒〕的表面，並與經預先共置處理、直接標記螢光的Aβ變體沉積物，或螢光標記之一單株Aβ特異性二級抗體進行共置，與Aβ變體沉積物結合之抗體則以一雷射光進行偵測〔Ronacher,Anagnostics Technical Note ANA-TN-005(2010)〕；而當本發明之方法使用表面電漿共振〔surface plasmon resonance〕時，可以使用一相反的設置：該預先共置處理的Aβ變體沉積物可以被固定於一晶片表面，而血清中的Aβ特異性抗體與晶片上之該些Aβ變體沉積物的結合，則可以透過該晶片表面的重量增加測得，因此不需要標記的結合配位體；為提高偵測之靈敏度或是測量IgG之次類型，更可以連續注射抗IgG 抗體〔Cannon et al.,Anal.Biochem.328(2004)：67-75〕；除了直接固定Aβ變體沉積物於該晶片表面，也可以使用一捕捉抗體；此設置係將一Aβ特異性抗體固定於晶片表面，再將事先共置之Aβ變體沉積物注入，而該沉積物被捕捉後，係注入血清，及透過重量的增加而偵測其反應性。

本發明中，係可以藉由任何適用之習知方法，以偵測Aβ特異性抗體與該Aβ變體沉積物的結合，例如，利用螢光光譜分析〔fluorescence spectroscopy〕，藉由一二級抗體〔如經標定的抗IgG或抗IgM二級抗體〕偵測與該些Aβ變體沉積物結合之該些Aβ特異性抗體〔Missailidis et al.,Methods in Molecular Biology 248(2003)：431-441〕。

亦可以利用對抗體具有結合特異性之受質〔如：蛋白A或蛋白G〕偵測與沉積物結合之自體免疫抗體，另外，也可以利用該Aβ變體沉積物沉澱對Aβ變體沉積物具特異性之自體免疫抗體，清洗該複合物，及將該抗體進行生物素標記〔biotinylate〕，之後再以卵白素〔streptavidin〕作為第二步驟之反應物。

本發明之一實施例中，該具有類Aβ變體沉積物表面之粒子係表面固定有Aβ變體沉積物之微珠，特別是磁珠。然而，本發明較佳係提供不具這樣表面的沉積物，而是提供由不具任何支架或表面輔助物〔像是奈米粒子、奈米或微米微珠等〕所組成的沉積物，如此，係較結合微米或奈米微珠，更類似於自然的情況，特別像是在人類血液中。

本方法特別適合結合阿茲海默症診斷使用，藉由本發明，在人類患者中的Aβ特異性自體免疫抗體係作為阿茲海默症狀態的標記；血液中Aβ特異性抗體水平〝正常〞的人對於阿茲海默症被認為是〝健康〞狀態，如果該水平在阿茲海默症患者、具有發展為阿茲海默症之風險者，或懷疑具有阿茲海默症者中變化，該變化水平係與阿茲海默症有關。一個〝變化〞的水平可能為該Aβ特異性抗體絕對值的變化，或是該Aβ特異性 抗體總量之反應性的變化〔例如，Aβ特異性抗體的一子集(IgG、IgM等)的變化〕，舉例而言，可反應Aβ特異性IgG的減少即與阿茲海默症有關並可以作為阿茲海默症的一標記。另一方面，不反應的〔即被結合或被遮蔽的〕Aβ特異性IgM水平往其他方向之改變具有阿茲海默症標記的功能；當該可反應之Aβ特異性IgG的〝健康〞水平被設為100%，可反應之Aβ特異性IgG顯著的減少〔例如減少到70%或更低、減少到50%或更低或減少到30%或更低〕皆表示阿茲海默症的發展；另外，當該之Aβ特異性IgM的〝健康〞水平被設為100%，在該血液樣本中總IgM的增加〔可反應+不可反應〕到至少30%以上〔又例如到至少50%以上或到至少100%以上〕皆表示阿茲海默症的發展。

據此，本發明較佳之應用領域係為用以診斷阿茲海默症〔AD〕。然而本發明可以應用於所有與Aβ有關的病症〔〝Aβ病症〞〕，特別是Aβ僅在疾病過程之中出現的病症，這樣的病症例如帕金森氏癡呆症〔Parkinson’s dementia；PDD〕、路易體痴呆病〔Dementia with Lewy Bodies；DLB〕、澱粉樣腦血管病變〔Cerebral Amyloid Angiopathy；CAA〕、包涵體肌炎〔Inclusion Body Myositis；IBM，特別是偶發性包涵體肌炎(sporadic IBM；sIBM)〕及例如拳擊所造成之慢性頭部外傷〔chronic head trauma〕。

本發明提供了在阿茲海默症中和阿茲海默症的發展中抗Aβ與抗Aβ變體抗體水平的一標記，可能使用此方法於觀察該疾病的發展及可能治療方法的效果，特別是該治療的方法是否可建立Aβ特異性抗體〔特別是IgG或IgM〕〝健康〞或〝較健康〞的水平。

因此，本方法較佳為用於監控阿茲海默症患者，特別是接受治癒或改善阿茲海默症藥物治療的阿茲海默症患者。本方法可以成功地應用於觀察阿茲海默症疫苗〔例如阿茲海默症模擬表位(mimotope)，請參照WO 2004/062556 A、WO 2006/005707 A、WO 2009/149486 A及WO 2009/149485 A；或Aβ來源疫苗，請參照WO 99/27944 A〕或Aβ標記疾病修飾藥物等臨床測試的患者。

本發明之方法亦可以用於評估發展為阿茲海默症的風險或用以偵測早期的阿茲海默症；根據本發明，原則上可能使得在實際上早於發生認知衰退的時間點上，能夠偵測患者Aβ特異性自體免疫抗體之免疫構成改變，而建立成常規的檢測形式，將使更大部分的人口在阿茲海默症的早期診斷上得到實質的增進，並可以讓病人符合早期養生治療法及/或阿茲海默症的預防性〔或延遲〕策略，特別是疫苗療法。

另一方面，本發明係關於可用以進行本發明之方法的一套組，係包含：Aβ變體沉積物及一樣本容器〔特別是供容置如全血、血漿或血清等人類樣本之樣本容器〕。

較佳地，本發明之套組可以進一步地包含用以偵測與Aβ特異性抗體結合之Aβ變體沉積物的工具，較佳為二級抗體，特別是經標記的二級抗體，〔如抗IgG或抗IgM之二級抗體〕；進階的內容物可以為標準品、陽性及/或陰性控制組、使用說明書及適宜的包裝〔如包裝盒、彩色瓶等〕。

本發明進一步藉由但不限於以下實施例及圖式闡明。

第1圖：以FACS分析法量測硫代黃素T陽性Aβ變體沉積物之顆粒尺寸。〔A〕源自SEQ ID NO：10的沉積物、及〔B〕Aβ1-42沉積物的散點圖〔dot plot〕分析；不同的沉積物在散點圖〔A+B〕中的SSC-A〔對數值〕及FSC-A〔對數值〕通道〔channel〕中被描述成同質群體；〔C〕如FSC-A柱狀圖所示，該沉積物的尺寸分布〔由FSC-A所定義〕使用市售尺寸被校準的微珠〔1、2、4、6、10及15μm〕偵測；〔D〕以FSC-A偵測由不同Aβ 變體及Aβ1-42所生成的沉積物於經過1、2及4天後之尺寸(以μm描述之)；〔E〕在FL-1通道中偵測的硫代黃素T〔Thioflavin，ThT〕的增加，該硫代黃素T係為沉積形成的指示劑，該未被染色的沉積物作為對照組〔左圖〕，而在硫代黃素染色後偵測到FI中位數的增加〔右圖〕，此染色實驗以源自SEQ ID NO：10的沉積物為代表。

第2圖：單株抗體與Aβ1-42沉積物及一代表性Aβ變體之沉積物〔SEQ ID NO：8〕的結合。〔A〕該Aβ1-6特異性單株抗體3A5與Aβ1-42沉積物的特異性結合，且不與Aβ變體沉積物作用；〔B〕相較之下，因Aβ1-42及Aβ變體沉積物皆具有該抗原決定基〔epitope〕而可以被該Aβ17-21特異性抗體4G8結合，使用標定有藻紅素〔PE〕之抗免疫球蛋白二級抗體於FL2-PE通道中偵測其反應性；而單獨使用二級抗體與Aβ1-42及Aβ變體沉積物作用的陰性對照組則如〔C〕中所述；〔D〕該Aβ1-6特異性單株抗體、該澱粉樣蛋白特異性抗體A11及IVIG對於Aβ1-42沉積物及源自SEQ ID NO：7~10之Aβ變體沉積物的反應性〔數值為對照單獨以二級抗體染色之個別沉積物在PE通道中背景螢光強度中位數(MFI)訊息的倍率〕。

第3圖：藉由測試該單株抗體4G8〔上二圖〕及IVIG〔下二圖〕對於Aβ1-42沉積物〔A、C〕及Aβ變體沉積物〔SEQ ID NO：10〕〔B、D〕的反應性，比較分析的靈敏度。請注意所有的結果皆以背景訊息之倍數為數值。

第4圖：藉由探測經過序列稀釋的該單株抗體4G8〔右二圖〕及IVIG〔左二圖〕對於Aβ1-42沉積物〔A、B〕及Aβ變體沉積物〔SEQ ID NO：10〕〔C、D〕的反應性，比較分析的線性關係。該Aβ17-21特異性抗體4G8對於Aβ1-42沉積物的線性範圍介於4G8稀釋係數〔dilution factor〕1：6250至1：3906250之間〔超過3個對數個數〕〔A〕，而對於Aβ變體沉積物則介於4G8稀釋係數1：1250至1：781250之間〔也超過3個對數個數〕〔C〕；探 測IVIG對於Aβ1-42沉積物的線性範圍介於5000μg/ml至8μg/ml〔超過2個對數個數〕〔B〕，而對於Aβ變體沉積物也介於5000μg/ml至8μg/ml〔超過3個對數個數〕〔D〕；該黑線係表示以Excel計算用以象徵範圍的趨勢線，並對於各滴定標示皮爾森相關係數〔R²〕。

第5圖：源自阿茲海默症患者的人類血漿中IgG〔A〕及IgM〔B〕自體免疫抗體的反應性。血漿樣本〔1：300稀釋〕以前述之FACS分析法進行分析，於FL2-PE通道中估測與Aβ變體沉積物〔SEQ ID NO：10〕結合的螢光強度，並以螢光強度中位數〔MFI〕表示。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下： 材料及方法

本發明之Aβ變體沉積物，其胺基酸序列如下： 第1組胜肽〔SEQ ID NO：6〕：

第2組胜肽〔SEQ ID NO：7；Xaa=羧甲基半胱胺酸(carboxymethyl-Cys)〕：

第3組胜肽〔SEQ ID NO；8〕：

第3組胜肽〔SEQ ID NO：9〕：

第4組胜肽〔SEQ ID NO：10〕：

第4組胜肽〔SEQ ID NO：11〕：

以FACS分析法偵測Aβ特異性抗體

在分析之前，以一崩解過程〔disaggregation procedure〕處理該凍乾之β-澱粉樣蛋白胜肽，為達此目的，該凍乾之Aβ種類回溶於1% NH₄OH〔pH 11〕使濃度為400μM；分裝溶解後的Aβ胜肽接著，並儲存於-20℃；以40μM〔pH 5〕之水溶態將該不同的Aβ種類置於含有微量離心管中，於37℃以350rpm之轉速過夜震盪，以促進沉積物的生成，Aβ變體沉積物的生成能夠以FACS〔FSC/FL1〕搭配硫代黃素T〔Thioflavin T，簡稱ThT〕染色進行確認，沉積的Aβ種類以無菌過濾的0.5% BSA稀釋至 0.3μM，並取最後體積為95μl之Aβ沉積物預置於96孔盤30分鐘後，加入5μl預先稀釋〔於0.5% BSA/PBS中〕的人類血漿或抗體於95μl的Aβ變體沉積物溶液，使最後血漿之稀釋倍數係為1：100至1：10000；使用的單株抗體係為序列稀釋倍率1：250至1：3906250的4G8抗體〔Covance Cat.# SIG-39200，原樣本濃度未知〕，使用的靜脈注射免疫球蛋白〔IVIG〕濃度範圍係為5000至0.32μg/ml，之後使用該抗澱粉酶蛋白多株抗體A11〔Merck Cat.No.9234〕偵測沉積物，及如參考文獻，使用該抗Aβ1-6的單株抗體3A5偵測Aβ1-42沉積物，於室溫〔RT〕下以震盪器以轉速350rpm震盪45至60分鐘後，96孔盤中每孔加入200μl 0.5% BSA/PBS，並且以轉速3000rpm離心5分鐘〔使用96孔盤離心機〕，去除上清液後，再以200μl 0.5% BSA/PBS清洗二次，去除上清液，最後將沉澱物〔pellet〕回溶於100μl 0.5% BSA/PBS〔內含1：1000稀釋之標記藻紅素之IgG(H+L)二級抗體或1：500稀釋之IgM特異性抗體，Fc5μ抗體，均購自Jackson Immuno Research〕，樣本於室溫下以震盪器〔350rpm〕震盪45或60分鐘後，以配有高效率採樣器〔HTS〕之FACS Canto進行分析，沉積物係通過FSC/SSC，搭配使用FACS Diva軟體，於FL2-PE通道中測量及估算代表各別的螢光強度中位數〔median fluorescence intensity，簡稱MFI〕，而在FL1-FITC通道中則測量及估算ThT與Aβ沉積物的反應性。

結果

Aβ變體沉積物：寡聚作用〔oligomerization〕及纖維的生成〔fibril formation〕

近年來，Aβ變體沉積物〔包含寡聚物、纖維及纖維沉積物〕自單體Aβ在多種情況下的生成已經被密集地研究，發現Aβ胜肽的沉積作用與pH值、溫度、緩衝溶液的組成及蛋白濃度有極高的關聯性。沉積作用始於由單體〔monomer〕形成β髮夾〔β-hairpin〕而成為水溶性的寡聚 物，轉變為同向排列之β摺疊的結構改變隨後造成纖維及纖維性沉積物的生成，並可以被離心沉澱。近年來的研究發現，於pH值為7.4製備之Aβ沉積物包含徑向寬度為5nm的蛋白絲〔filament〕，該蛋白絲具有微弱的傾向可以側向地聚集成徑向寬度為15~25nm的蛋白束〔bundle〕，在穿透式電子顯微鏡下，單一的纖維的長度在亞微米〔sub-micrometer〕〔50~100nm〕的範圍內，最高達10~15μm，該些Aβ纖維之特徵是特異性地與一螢光染料硫代黃素T〔Thioflavin T，簡稱ThT〕嵌合。代表的一範例示於第1E圖，使用SEQ ID NO：10之Aβ變體沉積物。

本發明中，製備了四種不同Aβ胜肽變體〔其中包含：第1組胜肽：DA-Aβ25-35-AG；第2組胜肽：Aβ16-20-羧甲基半胱胺酸-AA-Aβ24-28-AA-Aβ31-36；第3組胜肽：Aβ16-36和HKQ-Aβ16-36-GI；第4組胜肽：Aβ11-36和DYKDDDKGY-Aβ11-36〕的Aβ變體沉積物，並與ThT嵌合；接著可以使用FACS分析法偵測該形成沉積之Aβ變體；如材料及方法中所述，為了此目的，將40μM無種之水溶性Aβ變體胜肽及20μM的Aβ1-42於37℃放置20小時，隨後根據本發明之FACS分析法分析於試管內〔in vitro〕生成之Aβ變體沉積物。Aβ變體沉積物〔第1A圖〕及Aβ1-42沉積物作為參考〔第1B圖〕的尺寸分布以正前方散射〔forward scatter，FSC-A〕計算，並使用尺寸被校準範圍在1到15μm的微珠〔流式細胞技術分析尺寸校準套組(Molecular probes Cat.# F-13838)〕進行分析〔第1C圖〕，此方法可得知製備之Aβ變體沉積物的顆粒尺寸自亞微米的範圍至最高達10μm，且主要範圍分佈於約500nm至3μm。

單株抗體與Aβ變體沉積物的反應性

為了定義是否Aβ變體沉積物可以供Aβ特異性抗體結合，及是否此一交互作用可以藉由於此描述之FACS為基礎的分析法〔FACS-based assay〕加以監控，進行了另一個實驗設置，為此一目的，製備 本發明之Aβ變體沉積物〔SEQ ID NOs：7到11〕，並與該Aβ1-42特異性單株抗體(3A5)或可以辨認所有Aβ變體沉積物的抗體進行共置，該可以辨認所有Aβ變體沉積物的抗體為Aβ17-21特異性抗體4G8或是抗澱粉樣蛋白的多株抗體A11；如可以被展示於FACS柱狀圖中，所述之FACS為基礎的分析法可供Aβ特異性抗體以一特異性的方式偵測，如第2A圖之FACS柱狀圖所示，該Aβ1-6特異性單株抗體3A5係專一地與Aβ1-42沉積物結合，而抗Aβ17-21單株抗體4G8則可以與Aβ1-42沉積物及Aβ變體沉積物結合〔第2B圖〕，該些抗體針對源自SEQ ID NO：8的Aβ變體沉積物之反應性被作為一代表範例，而與標定PE之抗體共置的沉積物則作為背景值對照組〔第2C圖〕；此外另一個針對澱粉樣蛋白結構的特異性抗體〔A11〕及靜脈注射免疫球蛋白〔intravenous immunoglobulin，簡稱IVIG，係為可立即使用的市售血液產品〕則用以探測包含Aβ1-42沉積物的不同Aβ沉積物變體。此實驗也證實前述之FACS為基礎的分析法的確可以用於根據所使用之沉積物，以一高度特異性的方式偵測不同的Aβ特異性抗體；此外此資料說明了從人類血漿中直接純化出的IgG抗體裡，具有可以與Aβ沉積物結合的分群〔fraction〕。

藉由靜脈注射免疫球蛋白〔IVIG〕及Aβ1-42特異性抗體4G8定義本發明之方法中人類自體免疫抗體與沉積物結合的靈敏度

靜脈注射免疫球蛋白〔IVIG〕包含由健康捐贈者〔至少來自1000人〕的血漿中萃取出之IgG分群，其中包含自然生成且具Aβ胜肽特異性的抗體〔自體免疫抗體〕。

此實驗的目標是定義靜脈注射免疫球蛋白〔IVIG-Subcuvia，購買自Baxter，奧地利〕及該抗Aβ17-21抗體4G8對Aβ沉積物的反應性之偵測極限及線性範圍；製備供FACS分析法檢測的Aβ沉積物後，投予不同稀釋倍率之IVIG或4G8抗體，及定義螢光強度〔MFI值〕；為進行比較， 所有的結果均先計算訊噪比〔signal to noise ratio〕，並以為背景值的倍數〔xBG〕表示。當使用該單株抗體4G8探測該些不同的沉積物時，1：156,250的抗體稀釋對於Aβ1-42沉積物具有高於背景值約10倍的訊號結果〔第3A圖〕，並且對於探測Aβ變體沉積物仍增加約2倍的訊號結果〔第3B圖〕〔SEQ ID NO：10〕；與40μg/ml的IVIG共置後即達到靈敏度限制，在與Aβ1-42沉積物共置後具有高於背景值4.5倍的訊號結果〔第3C圖〕，而與Aβ變體沉積物共置則具有高於背景值2.7倍的訊號結果〔第3D圖〕；而8μg/ml的IVIG並沒有比背景值高的訊號結果〔第3D圖〕。

如第4圖中所示，使用該Aβ17-21特異性單株抗體4G8及IVIG定義FACS分析法的線性關係，因為該4G8抗體的原液濃度未知，僅使用抗體的稀釋係數表示；該4G8抗體對於Aβ1-42沉積物反應性的範圍介於稀釋係數1：6250至1：3906250之間〔超過3個對數個數〕〔第4A圖〕，而該4G8抗體對於Aβ變體沉積物反應性的範圍介於稀釋係數1：1250至1：781250之間〔也超過3個對數個數〕〔第4C圖〕；探測IVIG對於Aβ1-42沉積物的結果為一線性範圍介於5000μg/ml至8μg/ml〔超過2個對數個數〕〔第4B圖〕，而IVIG對於Aβ變體沉積物也介於5000μg/ml至8μg/ml〔超過3個對數個數〕〔第4D圖〕。

定義來自阿茲海默症患者的人類血液中之抗Aβ澱粉樣蛋白抗體

a. IgG與Aβ變體沉積物的反應性

使用前述之Aβ變體沉積物與FACS分析法分析來自阿茲海默症患者〔組數=30，年齡介於60~80歲〕的血清樣本中之自然存在的特異性抗體含量，可以在所有樣本中偵測到對Aβ變體具有特異性之自然存在抗體，雖然各患者個體中的自體免疫抗體水平上有差異〔第5A圖〕。

b. IgM與Aβ變體沉積物的反應性

另一組實驗中，使用前述之血清以定義Aβ變體沉積物特異性IgM的反應性；於所有樣本中偵測到對於Aβ變體沉積物〔SEQ ID NO：8〕之自然生成的IgM抗體同種型，而相較於IgG抗體的反應性，來自這群阿茲海默症患者中的自體免疫抗體水平亦有所不同。

結論

本發明之方法使用的以FACS為基礎的分析法，顯示Aβ變體沉積物被專一地誘導，且被用以偵測於IVIG及人類血液樣本中的Aβ特異性抗體〔IgG及IgM〕，此較大的分子提供多個抗體結合部位；而結果所呈現的抗體親抗原性效應〔avidigy effect，多個協同的低親合抗體抗原作用總和〕可以說明此方法之高度敏感性及達到在血液及IVIG分群中低親合抗體的偵測；自血漿或IVIG的抗體與Aβ變體沉積物結合的反應性也可以被只存在於Aβ沉積態的抗原決定基〔epitope〕所解釋。

本發明之實施例明確地指出本發明之方法相較於目前本領域其他方法之優勢，特別是關於例如特異性及選擇性等分析的效能上。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

<110> 奧地利商亞佛瑞斯股份有限公司(Affiris AG)

<120> 偵測生物樣本中Aβ抗體的方法

<130> R 65738

<140> TW 103112520

<141> 2014-04-03

<150> EP 13162106.2

<151> 2013-03-04

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 源自Aβ的人造聚胜肽

<400> 1

<210> 2

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 源自Aβ的人造聚胜肽

<400> 2

<210> 3

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 源自Aβ的人造聚胜肽

<400> 3

<210> 4

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 源自Aβ的人造聚胜肽

<400> 4

<210> 5

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 源自Aβ的人造聚胜肽

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)...(1)

<223> 焦谷胺酸

<400> 5

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 源自Aβ的人造聚胜肽

<400> 6

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 源自Aβ的人造聚胜肽

<220>

<221> VARIANT

<222> (5)...(5)

<223> 羧甲基半胱胺酸

<400> 7

<210> 8

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 源自Aβ的人造聚胜肽

<400> 8

<210> 9

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 源自Aβ的人造聚胜肽

<400> 9

<210> 10

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 源自Aβ的人造聚胜肽

<400> 10

<210> 11

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人造聚胜肽

<400> 11

Claims (15)

1. 一種偵測生物樣本中Aβ抗體的方法，係包含以下步驟：使該樣本接觸Aβ變體沉積物或具有類Aβ變體沉積物表面之粒子，使該Aβ特異性抗體與該Aβ變體沉積物結合；及以一單一粒子偵測技術，較佳為以螢光活化細胞分類技術〔fluorescence activated cell sorting，簡稱FACS〕偵測結合於該Aβ變體沉積物之Aβ特異性抗體；其中，該Aβ變體係選自由下列(a)、(b)、(c)及(d)所組成之群組：(a)該Aβ-1-40或該Aβ-1-42胜肽之一突變態，該突變態包含至少一胺基酸位置的突變，且該突變係位於第16至20、第25至28個及第31至35個胺基酸位置之外；(b)自然存在之一Aβ胜肽，該Aβ胜肽不為Aβ-1-40、Aβ-1-42、Aβ-1-43、Aβ-3-42或Aβ-p(E)3-42；(c)該Aβ-1-40或該Aβ-1-42胜肽之一缺失態，該缺失係位在第16至35個胺基酸位置之外，且該缺失係至少為一個胺基酸及至多為20個胺基酸；或(d)綜合上述之組合，特別是結合該Aβ-1-40胜肽或該Aβ-1-42胜肽中至少一突變及至少一缺失之組合。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其特徵在於，該Aβ特異性抗體係為人類抗體，較佳為人類IgG或IgM抗體，特別是人類IgG抗體。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其特徵在於，該Aβ特異性抗體係為自體免疫性抗體。
4. 如申請專利範圍第1至3中任一項所述之方法，其特徵在於，該 Aβ變體沉積物之顆粒尺寸係為50nm至15μm，較佳為100nm至10μm，特別是200nm至5μm。
5. 如申請專利範圍第1至4中任一項所述之方法，其特徵在於，該Aβ變體沉積物係以將該Aβ變體胜肽於pH 2至pH 9的環境下靜置至少20分鐘製得，較佳為靜置至少1小時，特別是靜置至少4小時。
6. 如申請專利範圍第1至5中任一項所述之方法，其特徵在於，用於該樣本及該Aβ變體沉積物接觸之Aβ變體沉積物之濃度係0.001至1μM，較佳為0.01至0.1μM。
7. 如申請專利範圍第1至6中任一項所述之方法，其特徵在於，該生物樣本係指人類血液，或來源為人類血液之一樣本，較佳為人類血清或人類血漿；人類腦脊髓液或人類淋巴液。
8. 如申請專利範圍第1至7中任一項所述之方法，其特徵在於，該Aβ變體沉積物與該生物樣本之接觸時間至少為10分鐘，較佳為10分鐘至24小時，特別是20分鐘至2小時。
9. 如申請專利範圍第1至8中任一項所述之方法，其特徵在於，於使該樣本接觸Aβ變體沉積物前，對該樣本中之Aβ特異性抗體進行一解蔽步驟，特別是當偵測之Aβ特異性抗體為IgM抗體時。
10. 如申請專利範圍第1至9中任一項所述之方法，其特徵在於，具有類Aβ變體沉積物表面之粒子係為表面固定有Aβ變體沉積物之微珠，特別是磁珠。
11. 如申請專利範圍第1至10中任一項所述之方法用以診斷阿茲海默症之用途。
12. 如申請專利範圍第1至10中任一項所述之方法用以監控阿茲海默症患者之用途，特別是監控正施以治療或改善阿茲海默症之藥 劑的阿茲海默症患者。
13. 如申請專利範圍第1至10中任一項所述之方法用以評估阿茲海默症發展的風險及偵測早期的阿茲海默症之用途。
14. 如申請專利範圍第1至10中任一項所述之方法用以診斷帕金森氏癡呆症〔PDD〕、路易體痴呆病〔DLB〕、澱粉樣腦血管病變〔CAA〕、包涵體肌炎〔IBM〕或慢性頭部外傷之用途。
15. 用以執行如申請專利範圍第1至10中任一項所述方法之套組，係包含：Aβ變體沉積物；及一樣本容器。