CN105247368B

CN105247368B - 用于检测生物样品中αSyn特异性抗体的方法

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Publication number: CN105247368B
Application number: CN201480029965.1A
Authority: CN
Inventors: G.斯塔夫勒; M.曼德勒; A.梅罗弗; A.冯博宁
Original assignee: Affiris AG
Current assignee: Affiris AG
Priority date: 2013-04-03
Filing date: 2014-04-02
Publication date: 2018-04-27
Anticipated expiration: 2034-04-02
Also published as: CA2908607A1; AR095994A1; US9964547B2; EP2787348A1; JP2016514842A; JP6416871B2; ES2657093T3; CN105247368A; WO2014161879A1; BR112015025208A2; KR20150137114A; EP2981824A1; US20160054333A1; TW201514496A; EP2981824B1; PL2981824T3; DK2981824T3; AU2014247129A1

Abstract

公开的是一种用于检测生物样品中的αSyn特异性抗体的方法，包括以下步骤：‑使所述样品与包含αSyn的聚集物接触并允许所述αSyn特异性抗体结合所述包含αSyn的聚集物，和‑通过单颗粒检测技术，优选通过荧光激活的细胞分选(FACS)检测结合到所述包含αSyn的聚集物的所述αSyn特异性抗体。

Description

用于检测生物样品中αSyn特异性抗体的方法

本发明涉及用于检测生物样品中α突触核蛋白(αSyn)特异性抗体的方法，特别是与突触核蛋白病相关，或用于突触核蛋白病的诊断，包括帕金森病(Parkinson’s diseas,PD)，路易体病(Lewy Body Disease，LBD)，路易体痴呆(Dementia with Lewy Bodies，DLB)，帕金森病痴呆(Parkinson’s Disease Dementia，PDD)，多系统萎缩(MultipleSystem Atrophy，MSA)，单纯性自主神经衰竭(Pure Autonomic Failure，PAF)，REM睡眠行为障碍(REM Sleep Behavior Disorder，RBD)，脑铁沉积型神经退行性病变I型(Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation type I，NBIA Type I)以及包涵体肌炎(inclusion body myositis，IBM)。本发明进一步涉及用于在生物样品中检测α突触核蛋白(αSyn)特异性抗体的方法，特别是与α突触核蛋白沉积和/或聚集疾病相关，或用于这些疾病的诊断，包括阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)，唐氏综合症(DownSyndrome，DS)，进行性核上性麻痹(Progressive Supranuclear Palsy，PSP)，皮质基底节变性(Corticobasal Degeneration，CBD)，额颞叶痴呆(Frontotemporal Dementia)/匹克氏病(Pick’s Disease)(FTD/PiD)。

突触核蛋白病是神经退行性疾病的一个多元化组，其共有共同的病理特征：在神经病理学检查中，在选定的神经元和神经胶质细胞群体中，可以检测到含有α突触核蛋白(αSyn)蛋白异常聚集的特征性病变。

αSyn(最初鉴定为PARK1和PARK4)是一种140个氨基酸的蛋白，其广泛表达在新皮质，海马，齿状回，嗅球，纹状体，丘脑和小脑以及外周神经元和神经节中，例如，在结肠或肌肉组织中。该蛋白的主要形式是140个氨基酸长的转录物。其它亚型为α-突触核蛋白-98，缺少外显子3和5，α-突触核蛋白-126，其中外显子3缺失并缺少残基41-54；以及α-突触核蛋白-112，其由于外显子5的缺失，缺少残基103-130。αSyn也高表达于造血细胞中包括B-,T-,和NK细胞以及单核细胞和血小板。在这些细胞中的确切作用未知，但其涉及巨核细胞(血小板前体)的分化。

最常见的突触核蛋白病包括帕金森病(PD)，路易体病(LBD)，路易体痴呆(DLB)，帕金森病痴呆(PDD)，多系统萎缩(MSA)，单纯性自主神经衰竭(PAF)，REM睡眠行为障碍(RBD)，脑铁沉积型神经退行性病变I型(NBIA Type I)以及包涵体肌炎(IBM)。

目前用于这些疾病的治疗选择包括对症药物例如左旋多巴，多巴胺激动剂，抗胆碱能药物以及单胺氧化酶的抑制物。然而，目前存在的所有治疗机会仅引起症状的减轻，但不在患者中诱导持久的疾病改善效果。

路易体病(LBD)是进行性神经退行性疾病，其特征为震颤，强直，运动迟缓以及大脑中多巴胺能神经元的缺失。在DLB和PDD的情况下，征兆还包括认知障碍。西方国家中高达2％的60岁以上人群形成PD/LBD的典型征兆。目前只有对症治疗可用。不幸的是，这些疗法仅提供早期症状的暂时减轻，而不阻止疾病进展。对PD/LBD发病机理的理解仍然不完全，但似乎遗传易感性和环境因素参与该疾病的发展。尽管有所有的遗传进展，PD/LBD主要是一种没有已知原因的偶发性病患(也称为特发性PD/LBD)。

患有这种疾病的患者在脑部的皮层区和皮层下区以及外周神经元或神经节例如结肠神经节形成特有的泛素化的细胞内内含物，称为路易体(LBs)。特别是具有高含量多巴胺能神经元或神经元投射的区域表现出这种典型的病理特征。最近，几个研究可以表明突触蛋白αSyn在LBD病理发生中发挥中心作用。在LBD中，αSyn在全部受影响的脑区域或外周神经元或神经节的LBs积累。另外，可以证明αSyn单个点突变以及基因剂量的改变(例如，αSyn基因的二倍化或多倍化)与罕见的家族形式的帕金森病相关。重要的是，基于在转基因(tg)小鼠以及黑腹果蝇中过表达研究的结果，强调了其在PD/LBD病理发生中的关键作用，因为这些动物模型模拟了PD/LBD/DLB的几个特征。

另外一种非常重要的突触核蛋白病是多系统萎缩(MSA)。MSA是一种偶发性神经退行性疾病，其特征为左旋多巴抗性帕金森病，小脑共济失调，和自主神经功能异常症状。患者患有影响多个脑部区域的多系统神经元缺失，包括纹状体，黑质体(substantia nigra)，小脑，脑桥，以及下橄榄体(inferior olives)和脊髓。MSA特征为在全部中枢神经系统中，αSyn阳性的神经胶质细胞胞浆(GCI)和罕见的神经元内含物。这些内含物与纹状体-黑质体退化，橄榄体-脑桥-小脑萎缩，以及延髓和脊髓自主神经核受累相关。GCIs对于MSA发病机理的重要性通过最近对转基因小鼠模型的分析，分析αSyn在少突胶质细胞中过表达而通常被公认和强调。在过表达人αSyn的tg小鼠中，观察到了GCI样聚集物和MSA的生化标志物。

虽然αSyn的积累通过哪些具体机制导致突触核蛋白病中的神经退行的典型特征尚未完全理解，最近的研究暗示，αSyn积累的异常形成参与突触核蛋白病潜在的退化过程。最近，在LBs中已鉴定了不同形式的αSyn。除了全长形式的蛋白，已鉴定了不同形式的修饰的αSyn，包括磷酸化的，亚硝基化的/硝化的，乙酰化的和单-，二-，或三泛素化的αSyn。另外，该蛋白的C端截短形式，如αSyn 1-119，αSyn 1-122和αSyn 1-123，已经在来自转基因小鼠和PD/MSA病理的脑组织中检测到。

目前认为在LBs和路易轴突(lewy neurites)或GCI中检测到的15％的αSyn是截短的。使用截短的αSyn的早先体外研究可以证明，缺少C端20-30个氨基酸的αSyn表现出增加的聚集和形成路易轴突和LBs中发现的纤维的倾向。另外，大约90％的在LBs中沉积的αSyn丝氨酸129(Ser129)是磷酸化的。相反，在正常脑中，仅4％的全部αSyn是磷酸化的，提示Ser129磷酸化的αSyn的累积在PD的发病机理中可能是至关重要的。因此，这些截短和/或修饰形式的αSyn被认为对于αSyn寡聚物/纤丝的形成充当种子分子。因此随后认为全长的αSyn以及截短和/或修饰形式的αSyn累积，其导致聚集形成。基于最近的研究，认为例如在突出末梢和轴突中这种聚集形成(例如，寡聚物和纤丝)，对于PD/LBD/突触核蛋白病的发展发挥重要作用，并因此可以通过截短/修饰形式的αSyn的存在而增强。

突触核蛋白病，特别是LBD/PD和MSA的诊断，是基于逐步发生的动作迟缓和至少一个以下失常的纯粹临床诊断：肌肉强直，4-6Hz静止性震颤和/或不是由初级视觉，前庭，小脑或本体感受障碍引起的姿势不稳定(Jankovic J.等，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatr.(2008)79(4):368–76.标准:United Kingdom Parkinson's Disease Society Brain BankDiagnostic Criteria for Parkinson’s Disease and Criteria of diagnosis ofParkinson disease(Gelb等，1999)由神经障碍和中风国立研究院的咨询委员会，美国国立卫生研究院(Advisory Council of the National Institute of NeurologicalDisorders and Stroke,US National Institutes of Health)委托和支持)。PD/LBD另外的诊断主要依赖于另外的支持性临床征兆的实现和排除可以继发性产生帕金森病综合症，像是阿尔兹海默病，多发性脑梗塞和药物引起的帕金森病的其它原因。还必须排除帕金森叠加综合症例如进行性核上性麻痹，以及多系统萎缩以建立可能的PD/LBD诊断。

对于MSA，可能的MSA的诊断要求一种偶发的，进行性成人发病病症，包括严格定义的自主神经衰竭和左旋多巴反应不良性帕金森病或小脑共济失调(Gilman等，Neurology.(2008)Aug 26；71(9):670-6.Second consensus statement on the diagnosis ofmultiple system atrophy)。

PD/LBD/MSA的临床诊断的局限性是高误诊率(尸检评价的诊断特异性为75-90％，其中专家例如神经学家具有最高的比率；Jankovic J J.Neurol.Neurosurg.Psychiatr.(2008)79(4):368–76.)，以及诊断在当疾病已经造成了导致功能缺陷的大量神经元缺失时的很晚的时间点才能完成的事实。

除了临床诊断外，最先进的成像技术目前被用于证实突触核蛋白病的诊断。患者的计算机断层扫描和磁性共振成像(MRI)脑部扫描经常显得正常，但使用分析来排除帕金森病的其它次要原因，例如基底神经节肿瘤，血管病变和脑积水(Brooks DJ等，J.Nucl.Med.(2010)51(4):596–609)。然而，专业的MRI技术(例如，弥散张量成像(DTI))已经通过探索基底神经节和中脑结构的改变显示了更一致和有希望的结果。进一步开发了多巴胺能成像来将多巴胺能神经退行的形式与其它不影响多巴胺能系统的疾病区分(例如，PD/LBD)。该成像可以使用单光子发射计算机断层扫描(SPECT)或PET进行。例如，在具有退行性帕金森病和非退行性震颤病患之间诊断不确定性的患者中，使用多巴胺转运蛋白配体[123I]碘氟潘(DaTscan^TM)的基准成像已经表现出78％的灵敏度和97％的特异性，参照3年的临床诊断，对于基准临床诊断分别为93％和46％(Cummings JL等，Brain.(2011)；134(11):3146-3166.)。

目前用于诊断突触核蛋白病的算法苦于缺乏对于疾病早期的安全诊断的灵敏度和特异性。为了提高诊断能力，临床以及成像数据必须与疾病特异性生物标志物的病理-生理上有意义的变化联合使用。这种变化如示例于通过结构MRI评估的伴随海马萎缩的阿尔斯海默病；AD-典型的脑脊液特征(低Aβ42，高总tau蛋白，高磷酸化Tau蛋白)；阳性淀粉样蛋白成像；确定的遗传风险；如通过国际监管机构和利益集团，包括美国国家衰老研究所(NIA,NIH,USA)，NIG NINCDS工作组，以及阿尔兹海默病协会(Alzheimer Association)所建议的，已经作为AD的诊断步骤中根本变化的基础(Dubois等，Lancet Neurol.9(2010):1118-1127)。

不幸的是，对于PD/LBD/MSA，目前没有这种经过验证的标志物数据可用。然而，在帕金森病Michael J Fox基金会带领下的临床和生物医学研究者的国际联盟最近已经发起了帕金森病渐进性标记物(PPMI)倡议，一个具有里程碑意义的观察性临床研究，使用先进的成像，生物取样和临床以及行为评估来综合评价一群最近诊断的PD患者和监控受试者，以鉴定帕金森病进展的生物标记物。一个主要的目标是评价在不同体液中，作为突触核蛋白病疾病进展的潜在生物标志物的αSyn水平的变化。这一目标基于αSyn对于疾病进展潜在的中心作用，以及在不同机体组织和体液中αSyn的鉴定。由Lebouvier等和Shannon等进行的研究揭示了在PD患者的外周组织中的αSyn病理学(Lebouvier等，PLoS ONE(2010)5(9):e12728；Shannon等，Mov.Disord.(2012)27:709–715)。已经在突触核蛋白病患者和健康对照的CSF和血浆中鉴定了αSyn(Borghi等，Neuroscience Letters,(2000)287:1,pp65-67；Journal of Neural Transmission(2006),113,10,pp 1435-1439；Lee等，ExperimentalNeurology,(2007)204:2,pp583–588)。有趣的是，如Qiao-Xin Li等最近的研究，对于健康的和患病的受试者中αSyn水平存在相互矛盾的证据(Experimental Neurology,(2007)204:2,pp 583–588)，表明在来自PD受试者的血浆中的αSyn水平比年龄匹配的对照中显著降低(p＝0.001)，并且患有早发型PD的患者中的αSyn的水平比晚发型PD和对照中都低，而Lee等表明与对照相比，血浆αSyn水平确实在PD和MSA患者中增加。El-Agnaf和同事能够证明聚集的(低聚化的)αSyn在人血清中存在，并且报道了与27名对照相比，从34名PD患者获得的血浆样品中存在显著升高的低聚形式水平(P＝0.002)(El-Agnaf等，FASEB J.(2006)20,419–425)。Smith和同事(PLoS ONE(2012)7(12):e52285及其参考文献)表明PD和非PD患者不能检测到显著的不同。这些差异证明了在验证新的生物标志物中产生的问题，并加强了鉴定新的经过验证的生物标志物用于早期诊断的必要性。另外，Wang等也证明了翻译后修饰的αSyn(pS129)的CFS水平与PD疾病严重性弱相关，且当与总αSyn浓度联合时，有助于将PD从第二突出的突触核蛋白病MSA以及含有其它突触核蛋白的蛋白病病变的第三神经退行性疾病，进行性核上性麻痹(PSP)区分(Wang等，Sci Transl Med.(2012)Feb 15；4(121))。

除了仅仅在不同组织中检测不同形式的αSyn外(例如，全长的，截短的，磷酸化的(主要在S129)，亚硝基化的和泛素化的αSyn；以及这些形式的低聚物和聚集物)，几个研究组能够在来自健康人和患有特发性或遗传性突触核蛋白病患者的血清/血浆或血浆制品(例如，IVIG)中，鉴定直接针对αSyn的自身抗体。Woulfe等在2002年已经能够在PD患者中检测抗αSyn Abs(Neurology 58:(2002)1435–1436)。Papachroni等通过Western Blot分析检测了PD患者和对照个体的外周血中针对突触核蛋白家族成员的Abs的存在。针对单体β-或γ-突触核蛋白的Abs的存在没有显出PD相关性。然而，针对单体αSyn的多表位Ab在65％的所有测试的患者中都可检测到，与这种疾病的遗传模式密切相关。在患有特发形式的PD患者中，Ab存在的频率与对照组没有显著差异，但是非常高比例(90％)的患有家族形式的PD患者针对αSyn的Abs为阳性(Papachroni等，Journal of Neurochemistry,(2007)101:749–756)。相应地，Patrias等也能够在从健康对照获得的三种静脉内免疫球蛋白(IVIG)制备物Gamunex(Talecris Biotherapeutics),Gammagard(Baxter Healthcare)和Flebogamma(Grifols Biologicals)中鉴定出特异性针对αSyn单体和可溶性低聚物(含有单体以及未鉴定的αSyn聚合物)的Abs。在天然的IVIG制备物中和抗体抗原复合物解离后检测抗体，并通过ELISA和Western blot评估反应性(reactivity)。

此外已经发表了关于健康对照和患病患者中抗αSyn Abs水平的不同报道，主要基于通过传统ELISA和免疫印迹技术的分析。2002年，Woulfe等人通过ELISA不能检测到PD和对照之间的变化。与此相反，Gruden等人(2011,2012)和Yanamandra等人(2011)证明了与对照相比，PD患者中抗αSyn Abs增加，特别是在疾病的早期阶段(与对照相比，早期PD(Hoehn和Yahr分级1-2)和晚期PD(Hoehn和Yahr分级2.5-4)增加最高)。在较晚阶段，与对照相比PD患者中可检测到的增加较少。通过对抗单体αSyn反应性的ELISA和免疫印迹分析，Yamandra等人可以证明在早期PD患者组，63％的个体展现出高响应(以对照相比，平均数5x增加，中位数10x增加)。在晚期PD组，免疫响应下降，与对照相比平均数和中位数分别表现出约4倍和6倍增加(P＝0.007)，且约58％的患者表现出高水平的抗体。在该报道中，还统计评估了ELISA和Western blot分析的诊断潜力(受试者工作特征(ROC)分析)。与对照相比，在早期和晚期PD患者中，通过ELISA确定的自身免疫反应性ROC曲线(AUC)下的面积分别为0.884(95％的置信区间为0.79至0.97)和0.779(0.6-0.95)。从Western blot数据的对应ROC曲线计算的AUC值分别为对于早期PD vs对照为0.85(0.74-0.95)而对于晚期PD vs对照为0.817(0.67-0.95)。这表明针对单体αSyn的自身免疫反应在早期和晚期PD患者中都具有诊断价值，然而，最佳设置仅允许约60％患者的鉴定。对低聚种类的αSyn无法检测到显著的结合，并且对纤丝αSyn的反应性分析也表明没有观察到早期PD，晚期PD或对照的显著差异。在早期/晚期PD患者vs对照中，对针对纤丝的免疫反应的ROC分析给出不大于0.5的AUC值和接近对角线的ROC曲线，表明没有或非常有限的诊断价值。在PD患者和对照中，在针对αSyn纤丝的免疫反应和他(她)们的年龄或性别之间没有显著的相关性(Gruden等，J Neuroimmunol233(2011):221–227.；Yanamandra等，PLoS One 6(2011):e18513.；Gruden等，Neuroimmunomodulation 19(2012):334–342)。

与此相反，Besong-Agbo等人表明，与健康对照和患有阿尔兹海默病的患者相比，PD患者中Ab水平较低，而Smith和同事表明，突触核蛋白病患者和健康对照相比没有显著的变化(Neurology.2013Jan 8；80(2):169-75)。在患有帕金森病的患者中自然发生的α-突触核蛋白自身抗体水平较低(Besong-Agbo等，PLoS ONE 7(12)(2012):e52285及其参考文献)。

WO 2010/069603 A1和EP 2 366 714 A1公开了用于在患有PD的患者的血清或血浆中检测αSyn特异性抗体的方法，包括用αSyn包被的颗粒检测抗体。Papachroni等(J.Neurochem.101(2007):749-756)报道了有关遗传的PD中针对αSyn的自身抗体。Apetri等人(J.Mol.Biol.255(2006):63-71)通过Raman和原子力显微镜分析了αSyn低聚物的二级结构。没有公开αSyn聚集物的检测用于捕获血液中的抗αSyn抗体。

WO 97/14028 A2公开了使用以特异性标志物标记的“珠组(beadsets)”和使用FACS的多重分析系统。Spells等人(American Society for Histocompatibility andImmunogenetics第29届年度会议摘要：S113)报道了关于使用HLA抗原包被的聚苯乙烯珠检测的HLA抗体的特异性。Li等人(BMC Neuroscience 8(2007):22)展示了对用于循环抗-Abeta抗体的ELISA测量的低pH抗原-抗体解离步骤的改进。

综上所述，目前，这些方法(对于αSyn，包括全长，截短或修饰以及聚集形式的检测或者对抗体的检测，特别是通过Biacore，ELISA或Western Blot特异性检测它们)没有一个符合标准使得它们有资格作为PD/LBD/MSA或任意其它突触核蛋白病的预测生物标志物(>80％特异性)。

因此，依然缺乏可重复、低风险和低成本应用的可靠生物标志物。特别是因为迄今为止开发基于血液的AD，PD和MSA生物标记物的所有努力都失败了(Hampel等，Nat.Rev.Drug Discov.9(2010):560-574)。这样的生物标志物的可用性对于疾病改进疗法的开发将是极为重要的。这种疗法越早施用，成功的可能性就越大。并且，人们可以将这种努力限制到在特异性生物标志物的帮助下鉴定的真正的PD和MSA病例。

本发明的一个目标是提供用于改进突触核蛋白病，包括PD/LBD，DLB，PDD，PAF，RBD，MSA，NBIA 1型的诊断的方法，特别是用于追踪疾病的早期阶段，用于观察用于突触核蛋白病治疗的药物的临床试验开发。进一步的目标是提供可靠的工具用于在生物样品中，特别是突触核蛋白病人类患者，或者怀疑患有或有风险形成突触核蛋白病，包括PD/LBD，DLB，PDD，PAF，RBD，MSA，NBIA 1，IBM的人类个体的样品中检测抗αSyn抗体。

因此，本发明提供一种用于在生物样品中检测αSyn特异性抗体的方法，包含以下步骤：

-使所述样品与包含αSyn的聚集物，特别是αSyn组成的聚集物接触，并允许αSyn特异性抗体结合所述包含αSyn的聚集物，和

-通过单颗粒检测技术，优选地通过荧光激活细胞分选(FACS)检测结合到所述包含αSyn的聚集物的αSyn特异性抗体。

本发明中，公开了一种检测αSyn特异性抗体，特别是αSyn特异性自身抗体的新方法，其可以用作诊断工具，在突触核蛋白病包括PD/LBD，DLB，PDD，PAF，RBD，MSA，NBIA 1型的诊断，和监控这些疾病的发展中，以及对于其他疾病像是阿尔兹海默病(AD)，唐氏综合症(DS)，PSP，CBD，FTD/PiD非常有帮助。本方法基于的发明不使用仅单个αSyn肽用作αSyn特异性抗体的捕获工具，而使用由αSyn组成的聚集物(αSyn组成的聚集物)或包含αSyn的聚集物(包含αSyn的聚集物)，并且使用单颗粒检测技术检测因此产生的抗体-αSyn聚集物复合物。如果本文中指代包含αSyn的聚集物和αSyn组成的聚集物的两者，也使用术语“αSyn聚集物”，其表示“包含αSyn的聚集物，尤其是αSyn组成的聚集物”，因为根据本发明，后者是αSyn聚集物的优选实施方案。

简单的说，αSyn组成的聚集物是由全长αSyn蛋白组成的聚集物(如上文公开的140aa长的蛋白)。αSyn组成的聚集物是由全长αSyn蛋白组成的聚集物(如上文公开的140aa长的蛋白)。包含αSyn的聚集物含有除αSyn蛋白之外的其它组分，特别是其他淀粉样蛋白多肽，例如Aβ1-42,Aβp(E)3-42(或其它Aβ形式)，胰岛淀粉样多肽，Tau蛋白(包括磷酸化的Tau)，TAR-DNA结合蛋白43(TDP43)。对于本发明的目的，术语“包含αSyn的聚集物”也包含含有-代替αSyn或除αSyn之外(全长的αSyn 140aa蛋白)-截短或修饰的αSyn多肽，特别是自然存在的αSyn形式的αSyn多肽，例如αSyn-98(缺少外显子3和5)，αSyn-126(缺少aa 41-54；外显子4缺失)以及αSyn-112(缺少aa 103-130；外显子5缺失)，磷酸化的(特别是在丝氨酸129-Ser129)，亚硝基化的/硝化的，乙酰化的和单，二，或三泛素化的αSyn，或C端截短形式的αSyn，例如缺少C端20个氨基酸，优选缺少C端25个氨基酸，特别优选缺少C端30个氨基酸的αSyn。这些聚集物组分，特别是上文公开的αSyn变体的先决条件是这些组分能够形成聚集物(例如，能够在根据本发明公开内容，特别是实施例部分的应用条件下形成聚集物)。

根据本发明的αSyn聚集物例如通过聚集物形成蛋白，例如αSyn或αSyn和其它聚集物蛋白/多肽，如Aβ多肽(特别是Aβ1-42,Aβp(E)3-42(或其它Aβ形式))，胰岛淀粉样多肽，tau蛋白，TDP43；和/或截短或修饰的αSyn多肽的过夜孵育而产生。接着，αSyn组成的或包含αSyn的聚集物与源自健康供体(HD)或患者，尤其是PD和MSA患者或怀疑患有PD和MSA的患者的血清样品孵育，以允许现有抗体的结合(IgG和IgM两者)。结合含有αSyn的聚集物，特别是αSyn组成的聚集物的抗体可以通过本领域技术人员可用的任意适合的方法检测，例如，通过使用识别结合到αSyn聚集物的αSyn特异性抗体的标记二抗。例如，可以使用藻红蛋白(PE)标记的二抗。其后，使用单颗粒检测技术例如也称为流式细胞术的FACS(荧光激活细胞分选)-分析测量包含结合到αSyn聚集物的αSyn特异性抗体(以及可选的一种或多种检测试剂，例如二抗)的免疫复合物。接着，所给样品得到的αSyn特异性抗体水平可以与健康样品的水平或具有已知疾病状态的患者样品中的水平，例如与PD和MSA患者的样品中的水平相比较。使用根据本发明的方法，可以表明与健康的受试者相比，PD和MSA患者含有不同水平的αSyn特异性免疫球蛋白，其对于根据本发明提供的αSyn聚集物(游离的αSyn特异性免疫球蛋白)具有反应性。此外，使用根据本发明的方法，可以表明源自PD和MSA患者的αSyn特异性免疫球蛋白(针对根据本发明提供的αSyn聚集物)的反应性可以通过称为解蔽(demasking)(从自身抗体移除潜在结合的αSyn抗原)的步骤而增加。这与来自健康受试者的αSyn特异性免疫球蛋白的反应性相反，其中在使用特殊的方法处理这些血清后，无法检测到针对αSyn聚集物的反应性的增加。另一方面，解蔽(血清中已经结合的αSyn的解离)后IgM抗体的反应性显示PD和MSA患者中IgM水平的增加。另外，也确定了解蔽和不解蔽的IgG水平之间的差异(delta(Δ)值)。与健康对照相比，这一参数在PD和MSA患者中也升高，表明在所述疾病的病理状态中，抗体较高的αSyn抗体占有率。此外，本发明提供的数据表明与迄今为止发表的方法相比，本方法具有高得多的检测αSyn特异性抗体能力，并因此具有高得多的能力以诊断例如PD和MSA。考虑到这些事实，本发明的方法符合鉴定突触核蛋白病，特别是PD和MSA，以及跟踪给定患者对治疗的临床反应的预测性诊断工具的理论先决条件。

开发本发明用于在人样品中分析αSyn特异性抗体。因此，优选的实施方案检测人αSyn特异性抗体，优选人IgG或IgM抗体，特别是人IgG抗体。正如已经提及的，在人中对αSyn特异性抗体的检测的原理是本领域已知的；然而，作为一种可能的生物标志物的作用无法验证。如本发明所示，这是由于本领域中可用的检测方法的分析功能不足。由于本发明方法的优越性，使得人样品中这些抗体作为生物标志物是可用的。因此，本方法特别适合检测生物样品中的自身抗体。因此，在本方法的优选实施方案中，待检测和定量的αSyn特异性抗体是自身抗体。

与现有技术的方法形成对比，本发明使用αSyn聚集物作为探针用于结合来自于样品的αSyn特异性抗体。虽然这种聚集物的原理在本领域中是已知的，但是没有意识到这种聚集物在特别是人样品中αSyn特异性抗体的分析中的使用，可以显著改进这些方法，其也与单颗粒检测技术，例如FACS联合。由于这种聚集物的使用，使用单颗粒检测技术(其为多个不同领域中建立的技术并用于不同问题)的检测可能用于分析通常非常复杂和难以处理的人样品(例如血液)中的αSyn特异性抗体。

优选地，根据本发明待使用的聚集物的尺寸经过标准化用于分析用途。这可以通过在聚集物的产生期间，建立特定的参数来完成。根据聚集物产生期间应用的条件，可以调节所述聚集物的尺寸。根据本发明的αSyn聚集物的优选尺寸为从50nm至15μm，优选从100nm至10μm，特别优选从500nm至5μm(通过所述聚集物的长度确定(例如最长范围))。

提供适合用于本发明的聚集物的优选方法包含将全长αSyn(1-140)，自然存在的剪接变体包括αSyn-98，αSyn-112和αSyn-126或修饰的全长αSyn包括磷酸化的(特别是在丝氨酸129-Ser129)，亚硝基化的/硝化的，乙酰化的和单，二，或三泛素化的αSyn，或C端截短形式的αSyn例如缺少C端20-30个氨基酸或甚至更短的αSyn蛋白，其能够形成聚集物，在pH2至9孵育至少20分钟，优选1小时，特别是至少4小时的步骤。孵育的持续时间是调整所述聚集物尺寸的一个参数：孵育的时间越长，聚集物越大。典型的孵育时间从10分钟至24小时，较短的孵育时间通常导致仅非常小的聚集物和少量的聚集物；在本发明法中通常不优选比48小时显著更长的孵育时间产生的聚集物。当然，如果需要，也可以分选和“筛分(sieved)”聚集物来达到所需的尺寸，例如，通过分级离心和类似的技术。

根据本发明的包含αSyn的聚集物的优选实施方案涉及除了αSyn或αSyn多肽之外，含有Aβ或其变体的聚集物。对于αSyn，仅使用允许聚集物形成的变体。因此，在包含αSyn的聚集物中，优选下组的Aβ变体(最优选组4，接着组3，接着组2和组1)。

Aβ变体组1：含有核心序列Aβ16-20或第二核心序列Aβ25-35的肽。已经表明这些肽自身形成淀粉样纤丝。从这些核心序列起始，可以通过Aβ肽中存在的氨基酸或通过形成截短的天然Aβ肽或截短的修饰Aβ肽的替换氨基酸延伸肽。

Aβ变体组2：含有序列Aβ16-20-X_21-23-24-28-X_29-30-31-36的肽(表示存在aa 16至20，24至28和31至36并通过3个或2个aa连接物连接(任意的一级序列))。从这一序列起始，可以通过Aβ肽中存在的氨基酸或通过形成截短的天然Aβ肽或截短的修饰Aβ肽的替换氨基酸延伸肽。

Aβ变体组3：含有序列Aβ16-36的肽。从这一序列起始，可以通过Aβ肽中存在的氨基酸或通过形成截短的天然Aβ肽或截短的修饰Aβ肽的替换氨基酸延伸肽。

Aβ变体组4：含有序列Aβ11-36或Aβp(E)11-36的肽。从这一序列起始，可以通过Aβ肽中存在的氨基酸或通过形成截短的天然Aβ肽或截短的修饰Aβ肽的替换氨基酸延伸肽。

根据本发明的包含αSyn的聚集物的另一个优选实施方案涉及聚集物，其除了αSyn或αSyn多肽以外，含有Tau蛋白或其变体。对于αSyn(和Aβ)，仅使用允许聚集物形成的变体。最优选的是Tau的聚集物，然而，其它的包含αSyn的聚集物可以包含具有修饰或截短形式的Tau(例如，Tau441加上过度磷酸化的Tau441和/或较短版本的Tau(例如，Tau412，410,383,381,352)，特别是那些在健康个体的中自然存在的或特别是对于疾病具有标志物功能的Tau蛋白(所有6种自然存在的同种型的任一种同种型或其变体形式(例如P301L,P301S,V337M等)，例如，优选在氨基酸181,202,205,212,214,231,396以及任选在Tau中存在的另外的残基像是18,153,175,199,235,262,394,404和422同时磷酸化的)。

根据本发明的包含αSyn的聚集物的另一个优选实施方案涉及聚集物，其除了αSyn或αSyn多肽以外，含有胰岛淀粉样多肽(IAPP)或其变体。IAPP作为89个氨基酸的前激素原合成。信号肽的剪切导致含有67个氨基酸的pro-IAPP。后者进一步处理为37个残基的成熟IAPP。已经表明pro-IAPP的正常处理是两步的过程，通过在其COOH端剪切起始(可能是通过反式高尔基体网络中的激素原转化酶1/3)，接着在其NH2端剪切(通过颗粒中的激素原转化酶2)以形成成熟形式的IAPP。在哺乳动物物种之间，IAPP高度保守，但在氨基酸20和29之间展现出显著的变异。该区域的差异决定IAPP聚集并形成淀粉样蛋白的能力。实际上，在该区域具有一个或多个脯氨酸残基的种类(除了猫之外)不形成胰岛淀粉样蛋白。IAPP通过其在胰岛淀粉样蛋白沉积物中聚集发现，所述沉积物与2型糖尿病患者(2型糖尿病；T2D)和其它哺乳动物物种像是猴和猫中的β细胞功能障碍和死亡相关。淀粉样蛋白是具有β-折叠片结构的不可溶的、纤丝状的蛋白聚集物。淀粉样蛋白当使用Congo红或硫磺素S染色后具有典型的光学特性，并可以通过光学显微镜分析。然而，淀粉样蛋白的形成开始于纤丝或聚集物的形成(直径7-10nm而长度几百nm)，在通过光学显微镜观察到淀粉样蛋白迹象前，其可以通过电子显微镜检测。在T2D患者中，对胰腺组织的组织学分析表明，IAPP聚集物的累积导致β细胞团替换，导致进行性的β细胞功能障碍和高血糖症。除此之外，IAPP纤丝似乎对胰岛具有直接的损伤作用。在多于95％的II型糖尿病患者中发现胰腺淀粉样蛋白沉积物，并且其形成与疾病进展密切相关。通常来说，淀粉样蛋白可以从蛋白形成，所述蛋白以其非聚集状态折叠为紧凑的三级结构，或者其可以源自内源性无序多肽，所述多肽无法以其可溶的天然状态采取紧凑的三级结构。IAPP是一种内源性无序多肽的重要例子，其在体内形成淀粉样蛋白。虽然IAPP是T2D患者胰腺中的胰岛淀粉样蛋白的主要成分，在这些沉积物中已鉴定了至少两种另外的成分：apoE和硫酸乙酰肝素蛋白多糖素(HSPGs)。淀粉样蛋白形成的动力学复杂并表现出S型概况，其特征为最终稳定的状态，其中可溶形式的肽与淀粉样蛋白纤丝达到平衡。可以通过在称为“播种”的过程中添加少量的预制纤丝加速淀粉样蛋白的形成。在T2D中分泌的一部分IAPP是未完全处理的。对pro-IAPP的NH₂端处理的损害导致淀粉样蛋白形成和β细胞死亡。NH₂端延伸的人pro-IAPP中间物(IAPP-Npro)的积累可能是淀粉样蛋白形成的重要起始步骤。实际上，虽然发现IAPP-Npro在溶液中比成熟的IAPP较少产生淀粉样蛋白，其与HSPGs的一种组分，葡糖氨基葡聚糖(GAGs)更有效地相互作用。因此，具有损害的NH₂端处理的IAPP形式，特别是IAPP-Npro，是根据本发明的包含αSyn的聚集物中优选的形式。

根据本发明的包含αSyn的聚集物的另一个优选实施方案涉及聚集物，其除了αSyn或αSyn多肽以外，含有除了αSyn或αSyn多肽以外的至少两种其它的聚集物组分，特别是一种或多种Aβ或其变体和/或一种或多种Tau蛋白或其变体和/或一种或多种IAPP或其变体。

根据本发明的包含αSyn的聚集物的另一个优选实施方案涉及聚集物，其除了本文公开的αSyn或αSyn多肽以外，含有不同的聚集物形成多肽种类的聚集组分(如本文所使用的，术语“多肽”包括术语“蛋白”并且通常这两个术语同义地使用；因此术语“蛋白”应用于本文也用于具有少于100个或少于50个氨基酸残基的多肽)。优选地，这种其它的聚集物形成多肽种类选自下组：Tau蛋白或其聚集物形成变体，Aβ1-42肽或其聚集物形成变体；IAPP和其聚集物形成变体，特别是IAPP-Npro，TAR-DNA结合蛋白43(TDP43)或其聚集物形成变体；以及超氧化物歧化酶1(SOD1)或其聚集物形成变体形式。

如已经陈述的，Tau的优选聚集物形成变体(“Tau变体”)是过度磷酸化的Tau，异常磷酸化的Tau(如Shahani等，J.Neurosci.26(2006),6103-6114中所述并定义的)，具有疾病标志物功能的Tau蛋白变体(所有6中自然存在的同种型的任一同种型(Tau441,Tau412,Tau410,Tau383,Tau381,Tau352)或其突变形式(例如P301L,P301S,V337M等)例如，优选地在氨基酸181,202,205,212,214,231,396以及任选在Tau中存在的另外残基像是18,153,175,199,235,262,394,404和422同时磷酸化的Tau441,Tau412,Tau410,Tau383,Tau381,Tau352(对Tau磷酸化更详细的分析公开于例如，Hanger et al.,Trends in Mol.Med.15(2009),112-119中)。

根据本方法，其中αSyn特异性抗体待检测的样品与αSyn聚集物接触，以完成与所述样品中可能存在的αSyn特异性抗体的结合(以及相对αSyn聚集物反应)。因此，为了提供足够的抗体结合位置，必须调节αSyn聚集物的浓度。因此，用于结合所述样品中的抗体的αSyn聚集物的浓度优选在0.01至10μM的范围内，优选0.1至1μM。最优浓度也取决于待结合的抗体的特性，所述样品的特性，计划的接触时间和所述聚集物的尺寸。

本方法主要目标为应用于人样品。因此优选的生物样品是人血液或源自人血液的样品，优选人血清或人血浆；人脑脊液或淋巴液。使用这些样品来源，也可以建立系列和常规检测(特别是对于源自血液的样品)。

允述样品中的抗体与所述聚集物适当结合的优选接触时间为至少10分钟(例如10分钟至48小时)，优选从15分钟至24小时，特别是从30分钟至2小时。

如果所述生物样品没有特别的预处理，具有与αSyn聚集物结合能力的αSyn特异性抗体将在与αSyn聚集物接触期间结合。通过根据本发明的方法，在所述样品中被掩蔽的αSyn特异性抗体(例如，那些已经结合了结合伴侣(例如包含αSyn的结构，或内源性αSyn肽)的抗体)将不被检测到(没有这些特定样品的前处理)。然而。仅对反应性抗体的鉴定和定量在很多情况下将是足够的和所需的，也许存在这样的情况或诊断问题，其中应当检测αSyn特异性抗体的总量(反应的和不反应的)，或者应当检测以下所有项：反应性αSyn特异性抗体，不反应的αSyn特异性抗体(“掩蔽的”)以及αSyn特异性抗体总数。

因此，根据本发明的另一个优选实施方案，所述样品被解蔽，例如，在与根据本发明的αSyn聚集物接触之前，αSyn特异性抗体从与样品中存在的任意结合伴侣的结合“释放”。这允许检测样品中所有的αSyn特异性抗体而不仅检测样品中那些未结合到结合伴侣的抗体(“游离的”或“反应性的”抗体)。在本发明的过程中，确定了反应性αSyn特异性抗体，特别是反应性αSyn特异性IgG的量，是PD和MSA的诊断和发展的关键标志物。如上文所述，本方法适合用于确定样品中αSyn特异性抗体的总量，即游离的(或“反应性的”)抗体以及样品中那些已经结合(例如，结合到αSyn结构)的抗体。这可以有助于建立样品中反应性vs非反应性抗体的差异(Δ)，这一参数对于PD和MSA诊断也非常重要。然而这种差异在具有就DP和MSA而言的“健康状态”的人中不存在(或低)，就αSyn特异性IgG和αSyn特异性IgM而言，这一差异对于PD和MSA的标志物功能至关重要。

本发明的方法应用单颗粒检测技术。这种技术允许鉴定和定量(“计数”)αSyn特异性抗体和αSyn聚集物“阳性”结合结果的数目和量。该技术的优选实施方案是FACS，其在本领域中是已建立的技术。其它用于检测结合到αSyn聚集物的抗体的方法为，例如Luminex或大量细胞计数法(mass cytometry)。

根据Luminex技术，可以如材料和方法中所述的进行样品的制备。样品制备后，被特定的αSyn特异性抗体识别的αSyn聚集物可以通过偶联了荧光染色微球的二抗检测，所述微球可以在多重检测系统例如Luminex读数器中检测(Binder等，Lupus15(2005):412-421)。

如果大量细胞计数法用作单颗粒检测技术，也可以如下面的实施例部分的材料和方法中所述的进行样品制备。如所述的完成样品制备。样品制备后，被异性抗体识别的αSyn聚集物可以通过偶联了过渡元素的稳定同位素的二抗检测，所述同位素可以通过原子质谱检测。接着所述样品可以通过加热到温度>5,500K的氩等离子填充的感应线圈喷射(sprayed)。所述样品被气化并电离成其原子成分，而通过飞行时间质谱法定量同位素标记的抗体的数量(Janes等，Nat.Biotechnol.29(2011):602-604)

或者，也可以应用单颗粒检测技术，其中一个结合伴侣(αSyn聚集物或抗体/血清)固定但在流动条件下测量结合。例子是Hybcell技术和表面等离子共振技术。在本发明中使用Hybcell技术，可以将血清样品点在Hybcell(旋转圆筒)的表面上并可以与直接荧光标记的预孵育的αSyn聚集物，或者与荧光标记的单克隆αSyn特异性第二抗体进行孵育。使用激光检测结合αSyn聚集物的抗体(Ronacher,Anagnostics Technical Note ANA-TN-005(2010))。如果在本发明的方法中使用表面等离子共振，可以应用反向设置：可以将预孵育的αSyn聚集物固定在芯片表面。来自血清的αSyn特异性抗体与芯片上的αSyn聚集物的结合可以通过芯片表面质量的增加来检测，因此没有必要标记结合伴侣。为了增加灵敏度或确定IgG亚型，抗IgG-AB的系列注射是可能的(Cannon等，Anal.Biochem.328(2004):67-75)。代替直接将αSyn聚集物固定在芯片表面，可以使用捕获抗体。对于这一设置，αSyn特异性抗体被固定在芯片表面上，接着注射预孵育的αSyn聚集物。在捕获聚集物后，注射血清并通过质量的增加测量反应性。

根据本发明，检测αSyn特异性抗体对αSyn聚集物的结合可以通过任意适合的已知方法进行，例如荧光光谱仪(Missailidis等，Methods in Molecular Biology 248(2003):431–441)，用于通过二抗(标记的抗IgG或抗IgM二抗)检测结合到αSyn聚集物的αSyn特异性抗体。

对结合到聚集物的自身抗体的检测也可以使用特异性结合抗体的物质进行，例如蛋白A(Protein A)或蛋白G(Protein G)。另一种可能性是使用αSyn聚集物沉淀αSyn聚集物特异性的自身抗体，洗涤复合物并生物素化所述抗体。接着可以使用链霉亲和素作为第二步骤试剂。

与现有技术公开不同(例如，WO 2010/099199 A1,WO 2010/069603 A1,和EP 2366 714 A1)，其中蛋白，例如αSyn，Tau，Aβ或其变体固定在颗粒上(例如纳米颗粒，纳米或微珠等)，根据本发明提供的聚集物没有这种表面，但在没有任何支架或表面助剂下由聚集物自身形成。这比使用微珠或纳米珠更接近自然情况，特别是在人血液中。

本发明用途的优选领域是突触核蛋白病的诊断，包括帕金森病(PD)，路易体病(LBD)，路易体痴呆(DLB)，帕金森病痴呆(PDD)，多系统萎缩(MSA)，单纯性自主神经衰竭(PAF)，REM睡眠行为障碍(RBD)，脑铁沉积型神经退行性病变I型(NBIA Type I)以及包涵体肌炎(IBM)；以及其它疾病，例如阿尔兹海默病(AD)和唐氏综合症(DS)，进行性核上性麻痹(PSP)，皮质基底节变性(CBD)，额颞叶痴呆/匹克氏病(FTD/PiD)。

本发明的优选实施方案是蛋白病(proteinopathies)的诊断，其通过本发明显著改善。蛋白病是由畸形的蛋白质导致的疾病，特别是神经退行性疾病。根据本发明优选的待诊断的蛋白病是阿尔兹海默病(AD)，唐氏综合症中的痴呆，帕金森病(PD)，路易体病(LBD)，路易体痴呆(DLB)，帕金森病痴呆(PDD)，多系统萎缩(MSA)，单纯性自主神经衰竭(PAF)，REM睡眠行为障碍(RBD)，脑铁沉积型神经退行性病变I型(NBIA Type I)，包涵体肌炎(IBM)；皮质基底节变性(CBD)，进行性核上性麻痹(PSP)，皮克氏病(Pick’s Diease,PiD)，拳击员痴呆症(慢性创伤性脑病，DP)，额颞痴呆(FTD)，Lytico-Bodig病(LD)，亨廷顿氏病(HD)和脊髓小脑性共济失调(1，2，3和7型)和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，prionosis和II型糖尿病；以及具有α-突触核蛋白沉积和/或聚集的疾病，特别是阿尔兹海默病(AD)唐氏综合征(DS)，进行性核上性麻痹(PSP)，皮质基底节变性(CBD)，额颞痴呆/皮克氏病(FTD/PiD)；特别是用于蛋白病的早期追踪和用于观察用于治疗蛋白病的药物的临床试验的开发。

本方法特别适用于与PD和MSA诊断相关联。使用本发明，人类患者中的αSyn特异性自身抗体作为PD和MSA状态的标志物。在他们的血液中具有正常水平的αSyn特异性抗体的人对于PD和MSA是“健康的”。如果在患有PD和MSA的患者或具有形成PD和MSA的风险或怀疑患有PD和MSA的受试者中该水平改变，这种改变水平与PD和MSA相关。“改变的”水平可以是αSyn特异性抗体绝对数量的变化，或αSyn特异性抗体的总体反应性的改变(例如，给定类型的αSyn特异性抗体(IgG，IgM等))。例如，改变的反应性αSyn特异性IgG与PD和MSA相关，并且是PD和MSA的标志物。使用本方法，当将反应性αSyn特异性IgG的“健康的”水平设置为100％时，血液样品中反应性αSyn特异性IgG的显著变化为，例如，降低到70％或更低，降低到50％或更低和降低到30％或更低，或增加至少30％，例如至少50％或至少100％。

由于本发明提供用于PD和MSA和甚至是用于PD和MSA发展的标志物，可以使用本方法观察疾病的发展以及可能的治疗方法的效果，特别是所述治疗方法是否能建立Aβ特异性抗体，特别是IgG或IgM“健康的”或“更健康的”水平。

因此，本发明优选用于监控PD和MSA患者，特别是使用用于治愈或改善PD和MSA的药物治疗的PD和MSA患者。本方法可以成功的应用于在PD和MSA疫苗(例如，PD01A，TrialAFF008，NCT 01568099)或αSyn靶向疾病改造药物的临床试验中观察患者。

本发明的方法还可以用于评价形成蛋白病的风险，优选突触核蛋白病，特别是PD和MSA，或者用于检测早期的蛋白病，优选突触核蛋白病，特别是PD和MSA。使用本发明，在原理上使得在比认知和/或功能损伤明显更早的时间点检测患者的免疫学配置中关于αSyn特异性自身抗体的变化成为可能。如果相对于较大部分人群以常规检测形式建立，这可以允许对蛋白病，优选突触核蛋白病，特别是PD和MSA的早期诊断的显著改善。这使得患者符合蛋白病，优选突触核蛋白病，特别是PD和MSA的早期治疗方案和/或预防(或延迟)策略，特别是免疫疗法(包括疫苗接种)的条件。

根据另一个方面，本发明涉及用于实施本发明方法的试剂盒，包含：

-包含αSyn的聚集物，和

-样品容器，特别是用于人样品(例如，血液，血清，血浆)。

优选地，根据本发明的试剂盒可以进一步含有用于检测结合到αSyn特异性抗体的包含αSyn的聚集物的方法，优选二抗，特别是标记的二抗，例如，抗IgG或抗IgM抗体。其它组分可以是标准样品，阳性和/或阴性对照，使用说明和适合的包装设备(例如，牢固的盒子，彩色小瓶等)。

本发明通过以下实施例和附图进一步说明，但不受限于此。

图1示出了使用FACS分析的αSyn聚集物尺寸测定。可以使用流式细胞术检测αSyn聚集物并在斑点印记中描绘为SSC-A(对数尺度)和FSC-A(对数尺度)通道中的同质群体(A)。如FSC-A-直方图中所示，使用市售的校准尺寸珠(1,2,4,6,10,和15μm)确定αSyn聚集物的尺寸分布(通过FCS-A信号确定)(B)。

图2示出了使用基于FACS的试验检测单克隆抗体对αSyn聚集物(A，B，C)和Aβ1-42聚集物(D，E，F)的反应性。αSyn特异性单克隆抗体LB509特异性结合αSyn聚集物(A)但不结合Aβ1-42聚集物(D)。相反，Aβ1-42特异性抗体3A5结合Aβ1-42(E)但不结合αSyn聚集物(B)。使用抗免疫球蛋白-PE-标记的二抗在FL2-PE-通道中确定反应性。

不相关的对照mAb D129既不与αSyn(C)也不与Aβ1-42(F)相互作用，表明不同的聚集物结合各自特异性的mAb的发现(E)。当聚集物与仅PE标记的二抗孵育时，可以看到如C和F示出的荧光强度与背景染色可比。

图3示出了两种不同方法，基于FACS的方法(A，C)和ELISA(B，D)试验灵敏度(A，B)和试验线性度(C，D)的比较。(A)αSyn聚集物与mAb LB509的稀释物系列孵育，并使用流式细胞术在FL-2通道确定反应性。(B)在用αSyn包被的ELISA板上，mAb LB509的滴定。请注意用于比较的所有结果以背景信号的倍数给出。

下组示出了本文所述的FACS聚集试验(C)和ELISA(D)的线性范围。在FACS聚集试验中使用范围从80ng/ml至0.128ng/ml(超过三个对数阶)而在ELISA中范围从15.625ng/ml至0.498ng/ml(超过两个对数阶)的αSyn特异性mAb确定线性范围。黑线表示在Excel中计算的指定范围的趋势线。指出了两种滴定的皮尔森确定系数(The Pearson’s coefficientof determination)(R2)。

图4示出了来自于αSyn FACS聚集试验(黑条)和αSyn ELISA(灰条)，使用源自各个小鼠的不同血清稀释物(A，B，C)，或使用源自用αSyn特异性疫苗免疫的20只小鼠的1:100稀释物的CSF(D)的信号。所有的值描述为背景值的倍数。

可以看到FACS聚集试验以比标准方法例如ELISA高达30倍更高的灵敏度检测αSyn特异性抗体。

来自于小鼠2(B)和3(C)的血清甚至在1:125,000的稀释下表现出2x BG以上的MFI信号，而来自小鼠1(A)的血清在1:25,000的稀释下产生MFI>2x BG，而在ELISA中使用所示的稀释不能检测到信号。

使用1:500稀释的血清MFI信号达到了超过背景的400倍(C)而在ELISA系统中，相同的血清稀释物仅产生20倍的背景增加。

使用1:100的CFS样品比较两种方法，导致在ELISA中20个样品中仅1个达到了显著的信号检测。当在FACS聚集试验中测量时，20个样品中的17个表现出MFI信号>2x BG。

图5示出了在人的IgG制备物(IVIG)中，对αSyn特异性IgG自身抗体的反应性的确定，所述IVIG从来自健康供体的血浆提取。对IVIG进行所述的FACS试验。在FL2-PE通道中评价Aβ聚集物的荧光强度，并表示为中位数荧光强度(MFI)。

图6示出了mAB针对聚集物的反应性，所述聚集物从αSyn与Aβ1-42，αSyn与p(E)Aβ3-42或Aβ1-42与p(E)Aβ3-42的等摩尔混合物生成。将聚集物与针对Aβ1-42(3A5),p(E)Aβ3-42(D129)和αSyn(LB509)的特异性单克隆抗体孵育，并确定所述混合的聚集物的mAB结合模式。

FACS PT直方图表明，单克隆抗体3A5仅仅与含有Aβ1-42聚集物的混合物结合(6A+B)但对p(E)Aβ3-42/αSyn聚集物混合物没有反应性(6C)。抗p(E)Aβ3-42mAB D129仅结合含有p(E)Aβ3-42的混合物(6E+F)但对Aβ1-42/αSyn(6D)表现出无反应性。所述αSyn特异性mABLB509仅与含有αSyn的聚集物混合物反应(6G+I)但不与Aβ1-42/p(E)Aβ3-42聚集物混合物反应(6H)。

图7：对聚集物的FACS分析，所述聚集物使用差异荧光标记的Aβ1-42和αSyn肽Aβ1-42-Hilyte-555(PE)和αSyn-Hilyte-488(FITC)的等摩尔混合物生成。获得的具有尺寸范围为0.5-10μm的聚集物在FSC-A/SSC-A中的P1中门控(gated)(A)且P1进一步在PE/FITC点图中评价以确定Aβ1-42-Hilyte-555(PE)和αSyn-Hilyte-488(FITC)的贡献(C)。使用未标记的混合的聚集物作为阴性对照(B)。

图8：针对从不同浓度的αSyn和Aβ1-42生成的聚集物的mAb反应性。αSyn和Aβ1-42肽如表1中所示混合。

图9示出了Aβ1-42(3A5),Aβp(E)3-42(D129)和αSyn(LB509)特异性抗体针对由等摩尔的Aβ1-42,Aβp(E)3-42和αSyn肽组成的聚集物的反应性。

图10示出了源自PD患者的人血浆中，IgG(A)和IgM(B)自身抗体反应性的确定。血浆样品(1:300稀释)进行所述的FACS试验。在FL2-PE通道评价与αSyn聚集物结合的荧光强度，并表示为中位数荧光强度(MFI)。

实施例

材料和方法

使用ELISA检测αSyn特异性抗体

将αSyn肽(购自Anaspec)以5μg/ml的浓度稀释于100mM NaHCO₃(pH 9.2)并在Maxisorp96孔板上包被过夜。为了防止非特异性结合，使用1％BSA/PBS封闭板，37℃1小时。使用溶于结合缓冲液(PBS/0.1％BSA/0.1％Tween20)的系列稀释物mAbs(从所示浓度起始)在37℃1小时进行ELISA。在使用PBS/0.1％Tween20重复洗涤步骤(3x)后，添加抗人IgG HRP(0.5μg/ml)检测二抗，37℃1小时。样品再次洗涤3x并添加ABTS(0.68mM溶于pH 4.3的0.1M柠檬酸)30分钟用于试验显影，之后在读板器(Biotek-Gen5 Program)上在波长405nm进行OD测量。

使用FACS分析检测αSyn特异性抗体

通过重悬和短暂的涡旋振荡直到溶液澄清而将500μg冻干的αSyn溶解于100μl无菌过滤的MonoQ。接着将该溶液在超声水浴中超声处理30秒，并以5μl等分试样不进行急冻(shock-freezing)而储存于-20℃。为了诱导聚集物的形成，将等分试样解冻且整个体积的αSyn溶液以35μM的浓度在Eppendorf管中的1％NH4OH(pH 4.5)溶液中在振动器上(350rpm)37℃孵育过夜。αSyn聚集物仅用于一个试验，并且弃去残余物。

另外，对于每个实验，在样品制备前确定聚集物的量以确保可比的αSyn聚集物密度。

在样品制备前，过夜孵育后生成的聚集物数量在FSC/SSC通道中测量，并且标准化作为底物使用的聚集物的数量。详细的说，如上文所述将3μl过夜生成的αSyn聚集物稀释于97μl 0.5％BSA/PBS中。3μl代表了用于每个样品的底物的标准量。使用FACS Canto II，70μl的该αSyn溶液以高流速(2μl/s)测量，结果是35秒的收集时间，并确定聚集物的数量。将在这些条件下获得的约10,000个颗粒定义为标准。如果检测到了较多或较少的聚集物，调整在进一步样品制备中用作底物的αSyn聚集物的体积以确保在不同实验中样品内的可比的聚集物密度。这意味着例如如果仅获得了5000个事件，则用于样品制备的底物的体积增加到6μl每孔。如上所述，对于每一个样品制备，～10,000以上的颗粒用作起始材料。

对于αSyn特异性抗体的检测，将3μl的αSyn聚集物悬浮液与92μl的0.2μm过滤的0.5％BSA/PBS混合，并接着转移到96孔V型底板的孔中用于进一步的样品制备。将这些悬浮液在RT孵育60分钟用于封闭。

将-80℃的鼠或人血清样品的等分试样新鲜解冻用于每个测量，对于鼠血清样品以1:50稀释或者对于人血清样品以1:5稀释于0.5％BSA/PBS，接着通过0.22μm 96孔过滤板在96孔板离心机中离心(3000rpm，3分钟)将这些样品0.2μm过滤。CSF样品以1:5预稀释到0.5％BSA/PBS且不无菌过滤。将5μl预稀释的血清或CSF样品添加到95μl的αSyn聚集物悬浮液中，产生最终1:1000的鼠血清稀释物和1:100的人血清或CSF稀释物。在振动器上(450rpm)室温孵育60分钟后，将0.5％BSA/PBS添加到每个孔。将所述板以3000rpm离心5分钟(96孔板离心机)并通过将其彻底倒入水槽移除上清液(SN)。其后，添加200μl的0.5％BSA/PBS并重复此洗涤步骤3次。对于鼠血清和CSF样品的检测，在第4次洗涤步骤后，再次弃去上清液，并将沉淀重悬于100μl 0.5％BSA/PBS中，该溶液含有1:10000稀释的PE标记的抗mIgG(H+L)F(ab′)₂片段(Jackson Immuno Research)。对于IVIG的检测，使用1:1000稀释的PE标记的抗mIgG(H+L)F(ab′)₂片段(Jackson Immuno Research)。样品在振动器上(600rpm)再室温孵育60分钟。接着，无需额外的洗涤步骤，在装有高通量取样器(HTS)的FACS Canto上测量样品。基于它们的FSC/SSC特征鉴定αSyn聚集物。在FL2-PE通道中评估Abs结合到聚集物的信号，并使用FASC Diva软件基于其中位数荧光强度(MFI)评价。

混合聚集物的生成和检测

为了测试不同的肽(例如，αSyn和Aβ1-42)是否形成含有两种肽的混合聚集物，使用N端荧光标记的Aβ1-4和C端标记的αSyn肽。如Anderson和Webb所述(BMC Biotechnology2011,11:125)，标记Aβ和αSyn肽不阻止淀粉样蛋白聚集物的形成。因此，以等摩尔的比率(20μM)混合Aβ1-42-Hilyte-555(在PE通道中可检测)和αSyn-Hilyte-488(在FITC通道中可检测)，并在1％NH4OH(pH 4.5)中在振动器上(350rpm)室温孵育20小时。孵育后，使用FACSCanto II分析这些聚集物。获得的聚集物在FSC-1/SSC-A的P1中进行尺寸门控(～0.5μm–10μm)，接着在PE/FITC点阵图中进一步分析P1以确定Aβ1-42-Hilyte-555(PE)和αSyn-Hilyte-488(FITC)的分布。

使用从单体αSyn,Aβ1-42和p(E)Aβ3-42蛋白的混合溶液生成的聚集物作为底物通过FACS分析检测特异性抗体反应性

通过重悬和短暂的涡旋振荡直到溶液澄清而将500μg冻干的αSyn或100μg Aβ1-42或p(E)Aβ3-42溶解于100μl无菌过滤的MonoQ(αSyn)或100μl无菌过滤的1％NH4OH pH11(Aβ1-42和p(E)Aβ3-42)。接着将该溶液在超声水浴中超声处理30秒，并以5μl等分试样不进行急冻而储存于-20℃。为了诱导聚集物的形成，将单个蛋白的等分试样解冻，且三种蛋白溶液的全部体积在1％NH4OH(pH4.5)稀释到～35μM的等摩尔浓度。在Eppendorf管在振动器上37℃孵育20小时之前，将这些蛋白溶液以所有三种可能的组合混合：Aβ1-42&αSyn,Aβ1-42&p(E)Aβ3-42和p(E)Aβ3-42&αSyn。此外，不仅是等摩尔的比率(＝50:50)，也进行滴定实验以测试聚集混合物的不同比率。聚集混合物的比率示于实验中(例如，1:100＝1μlαSyn(20μM)+99μl Aβ1-42(20μM)溶液)。混合的聚集物作为底物用于进一步的样品制备并如以上段落所述的对αSyn聚集物的处理而进行处理。

解蔽(Demasking)

为了破坏αSyn特异性自身抗体与患者血清中可能存在的αSyn的结合，以及因此阻止通过基于抗原的方法(ELISA或FACS)对这些结合αSyn的自身抗体的检测，将血清以1:16.7预稀释到10mM的pH2.6甘氨酸中5分钟。接着，将5μl酸化的血清与3μlαSyn共孵育另外5分钟。然后通过添加92μl 0.5％BSA/PBS中和混合物，并孵育20至60分钟。如上文所述的用于非解蔽血清的进行洗涤步骤和使用二抗孵育。

结果

αSyn聚集物：低聚化和纤丝形成

近几年，已经在多种条件下对从单体αSyn形成αSyn聚集物进行了深入研究。已发现αSyn肽的聚集非常依赖于不同的条件包括pH，温度，缓冲液组分和蛋白浓度。聚集开始于从单体形成β-发夹，导致可溶性的低聚物。接着，构象转变为平行的β-折叠导致纤丝和纤丝状聚集物的形成，其可以通过离心沉淀。

根据本发明，生成了αSyn聚集物(全长人αSyn 1-140)。这些αSyn聚集物可以使用FACS分析检测。如材料和方法(MM)中所述，为了这一目的，将无核的可溶αSyn以35μM浓度在37℃孵育20小时。如图1A所示(上组)，通过FACS分析可以检测到清晰的αSyn聚集物同质群体。使用范围从1至15μm的校准尺寸珠分析αSyn聚集物(通过前向散射FSC-A确定)的大小分布(流式细胞术尺寸校准试剂盒(Cat.#F-13838)通过分子探针)(图1下组)。使用该分析，表明生成的αSyn聚集物的尺寸正如预期的从亚微米范围直到10μm，其中大多数生成的聚集物在～500nm直到2μm的范围内。

mAbs对αSyn聚集物的反应性

为了确定αSyn聚集物是否允许αSyn特异性抗体的结合和为了确定是否可以使用本文所述的基于FACS试验监控这种相互作用，进行了另一组实验。为了这一目的，生成了αSyn聚集物以及Aβ1-42聚集物(根据国际申请PCT/EP2012/068494中的公开内容制备)，并与αSyn(LB509)或Aβ1-42(3A5)特异性单克隆抗体孵育。另外，两种形式的聚集物与非特异性的对照抗体mAB D129孵育。如图2中的FACS直方图所示，单克隆抗体LB509仅仅结合αSyn聚集物而mAb 3A5仅与Aβ1-42聚集物相互作用。此外，用作同种型对照的不相关mAb D129既不与αSyn也不与Aβ聚集物反应。这表明所述基于FACS的试验允许以高特异性的方式检测αSyn抗体。

在FACS试验和ELISA系统中确定针对αSyn的抗体反应性的线性范围

为了确定线性分析测量范围的上限和下线，使用mAb LB509进行了滴定实验(图3)，

使用Pearson′s决定系数在Excel中计算估算的线性范围，在FACS聚集试验中浓度范围为80-0.128ng/ml的LB509的结果是R2值>0.9966，从而穿过了三个对数级。在ELISA中确定线性度，结果是线性范围在15.625ng/ml和0.489ng/ml之间，从而仅穿过了两个对数级。R²值为1将表示100％的线性度。

确定用于用αSyn特异性疫苗处理的动物血清和CSF中特异性自身抗体的αSyn结合的FACS聚集物试验和ELISA的灵敏度

本实验的目的是确定和比较两种独立检测方法(ELISA和基于FACS的试验)用于源自用αSyn特异性疫苗免疫的动物的血清和CSF样品的αSyn反应性的检测极限。因此，将αSyn固定在Maxisorp微量滴定板上用于ELISA测量。或者，生成αSyn聚集物用于FACS分析。接着，将系列稀释的3种血清或1:100稀释的20个不同鼠CSF样品应用到单独系统，并对ELISA确定405nm的OD值或对于FACS试验确定荧光强度(MFI值)。为比较的原因，对不同的血清和CSF测量评价信噪比，且信号表示为背景信号的倍数(xBG)。

通过对来自免疫的小鼠的血清滴定，证实了FACS聚集试验较高的灵敏度。来自小鼠2(B)和3(C)的血清甚至在1:125,000稀释时表现出MFI信号大于2x BG，对于小鼠2为2xBG而对于小鼠3为3.11x BG，然而在ELISA中使用这一血清稀释物不能检测到信号。另外与使用这一稀释物在ELISA中没有特异性信号相比，使用来自小鼠1(C)的血清的MFI信号测量的结果在1:25,000稀释时MFI为4,45x BG。

此外，也使用两种试验分析了来自20只小鼠的CSF样品。使用1:100稀释的CSF样品比较两种方法的结果是ELISA中20个样品中仅一个达到显著信号检测(对于小鼠8为2.02xBG)，而当在FACS聚集试验中测量时，20个样品中的17个表现出MFI信号>2x BG。分析来自小鼠2的CSF样品，结果是几乎30x BG的MFI信号。相同的CSF样品在ELISA测量中没有传递出阳性信号。

这表明新开发的基于FACS的试验检测αSyn特异性自身抗体比传统的试验系统例如ELISA更灵敏高达30倍。

使用IVIG确定人自身抗体的αSyn反应性

IVIG(静脉内免疫球蛋白)是一种市售的血液产品。其含有从来自健康供体的血浆提取的汇集的IgG部分(来自至少1000个供体的人血浆)。已证明IVIG制品含有对αSyn肽特异的自然存在的抗体(自身抗体)。

本实验的目的是确定本文所述的技术是否提供以有效的方式检测IVIG中αSyn特异性自身抗体的可能性(IVIG-Subcuvia，购自Baxter,Austria)。

为了这一目的，生成αSyn聚集物用于FACS分析。接着，不同IVIG稀释物(范围从200μg–64ng/ml)应用于所述聚集物并确定荧光强度(MFI值)。如图5中所示，基于FACS的试验提供强荧光信号，表明新开发的基于FACS检测αSyn特异性自身抗体的试验对于αSyn自身抗体是高度灵敏的。

mAb对混合聚集物的反应性

为了确定混合的聚集物是否允许以及在什么程度上允许αSyn,Aβ1-42,和p(E)Aβ3-42特异性抗体的结合，以及为了确定是否可以通过本文所述的基于FACS的试验监控这种相互作用，进行了另一组实验。为了这一目的，除了纯的αSyn聚集物,Aβ1-42聚集物和p(E)Aβ3-42，还如MM中所述生成了等摩尔的混合物或使用不同比率的个体蛋白的聚集混合物。接着，这些聚集物与对αSyn(LB509)或Aβ1-42(3A5)和p(E)Aβ3-42(D129)特异的单克隆抗体孵育，并确定混合聚集物的mAB结合模式。

这些mABs对三种不同的聚集物底物(通过混合等摩尔量的所示肽建立)的反应性示于图6中。如FACS PE直方图所示，单克隆抗体3A5仅仅结合含有Aβ1-42聚集物的混合物(6A+B)而其对p(E)Aβ3-42/αSyn聚集混合物不表现出反应性(6C)。抗p(E)Aβ3-42mAB D129仅结合含有p(E)Aβ3-42的混合物(6E+F)但对Aβ1-42/αSyn不表现出反应性。此外，αSyn特异性mAB LB509仅与含有αSyn的聚集混合物反应(6H)。这表明，首先，可以产生含有不同肽的混合的聚集物，其次，这些聚集物与相应的mAbs特异性反应。

形成具有差异化标记的肽的混合聚集物

如MM中所述，生成了差异荧光标记的Aβ1-42和α-突触核蛋白肽的等摩尔混合的聚集物。因此，将等摩尔比率的Aβ1-42-Hilyte-555(在PE通道中可检测)和αSyn-Hilyte-488(在FITC通道中可检测)混合并通过过夜孵育生成聚集物。孵育后，使用FACS Canto II分析混合的聚集物。在FSC-A/SSC-1中的P1中门控具有大小范围为0.5-10μm的获得的聚集物，并在PE/FITC点阵图中进一步评价P1以确定Aβ1-42-Hilyte-555(PE)和αSyn-Hilyte-488(FITC)的贡献。Aβ1-42-Hilyte-555和αSyn-Hilyte-488的共孵育产生～90％双阳性的混合聚集物，表明了在聚集物群体中Aβ1-42和αSyn的均质分布。

在进一步的实验中，检测了特异性α-Aβ1-42-和αSyn-mAB针对具有不同肽构成的混合物的反应性，而p(E)Aβ3-42特异性AB用作阴性对照。因此，在样品制备前，使用单体Aβ1-42和αSyn的定量的，对称的滴定系列用于生成不同的混和聚集物底物。详细的说，将35μMAβ1-42和αSyn的单体溶液以如表1中所示的比率混合，并在样品制备后确定PE-MFI。

表1

正如所预期的，非特异性对照AB D129没有反应性，且当100％的Aβ1-42用作底物时，使用αSyn特异性AB LB509也没有反应性。但是滴定系列显示，只要0.1％/1％的αSyn与99,9/99％的Aβ1-42混合，足以诱导αSyn特异性AB LB509的强反应性，其甚至比当LB509与100％的αSyn聚集物孵育达到的信号更强。其一个原因可能是αSyn单独形成具有非常紧凑包裹的表位的聚集物，因为空间位阻其抑制mAB接近所有可得的表位。另一方面，在混合的聚集物中，αSyn以这样的方式整合，其中所有可得的表位可以被mAB接近而不封闭自身，并因此与当100％的αSyn聚集物用作底物时相比，PE-MFI信号增加。

确定来自PD患者的人血液中的αSyn淀粉样蛋白抗体

a. IgG对αSyn的反应性

使用如上文所述的αSyn聚集物和FACS分析，分析来自PD患者(n＝30,～60-80岁)的血清样品自然存在的αSyn特异性抗体含量。在所有测试的样品中检测到了对αSyn聚集物特异的自然存在的抗体。结果表明，尽管自身抗体的水平在患者与患者之间明显不同，在所有测试的样品中检测到了对αSyn聚集物特异的自然存在的抗体(图10A)。

b. IgM对不同的αSyn聚集物的反应性

在下一组实验中，在如上文所述的相同组的血清样品中确定了αSyn聚集物特异性IgM反应性。在所有测试的样品中检测到了对αSyn聚集物特异的自然存在的IgM同种型抗体。再一次，与IgG抗体的反应性类似，在该PD患者组中可以检测到不同水平的自身抗体(图10B)。

Claims

1.包含α突触核蛋白(αSyn)的聚集物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测生物样品中αSyn特异性抗体的方法，所述方法包含以下步骤：

- 使所述样品与包含αSyn的聚集物接触，并允许所述αSyn特异性抗体结合所述包含αSyn的聚集物，和

- 通过单颗粒检测技术检测结合到所述包含αSyn的聚集物的αSyn特异性抗体，

其中所述包含αSyn的聚集物具有50 nm至15 µm的尺寸。

2.权利要求1的用途，特征在于所述包含αSyn的聚集物是αSyn组成的聚集物。

3.权利要求1或2的用途，特征在于所述单颗粒检测技术是荧光激活的细胞分选（FACS）。

4.根据权利要求1至3任一项的用途，特征在于所述αSyn特异性抗体是人抗体。

5.根据权利要求4的用途，其中所述αSyn特异性抗体是人IgG或人IgM抗体。

6.根据权利要求4的用途，其中所述αSyn特异性抗体是人IgG抗体。

7.根据权利要求1至6任一项的用途，特征在于所述αSyn特异性抗体是自身抗体。

8.根据权利要求1至7任一项的用途，特征在于所述包含αSyn的聚集物具有从100 nm至10 µm的尺寸。

9.根据权利要求8的用途，其中所述包含αSyn的聚集物具有从200 nm至5 µm的尺寸。

10.根据权利要求8的用途，其中所述包含αSyn的聚集物具有从500 nm至2 µm的尺寸。

11.根据权利要求1至10任一项的用途，特征在于所述包含αSyn的聚集物通过在pH 2至9孵育αSyn至少20分钟而制备。

12.根据权利要求11的用途，其中所述包含αSyn的聚集物通过在pH 2至9孵育至少1小时而制备。

13.根据权利要求11的用途，其中所述包含αSyn的聚集物通过在pH 2至9孵育至少4小时而制备。

14.根据权利要求1至13任一项的用途，特征在于所述包含αSyn的聚集物以0.01至10 µM的量存在，用于使所述样品接触包含αSyn的聚集物。

15.根据权利要求14的用途，其中所述包含αSyn的聚集物以0.1至1 µM的量存在。

16.根据权利要求1至15任一项的用途，特征在于所述生物样品是人血或源自人血的样品；人脑脊液或人淋巴。

17.根据权利要求16的用途，其中所述生物样品是人血清或人血浆。

18.根据权利要求1至17任一项的用途，特征在于所述包含αSyn的聚集物与所述样品接触至少10分钟。

19.根据权利要求18的用途，其中所述包含αSyn的聚集物与所述样品接触10分钟至24小时。

20.根据权利要求18的用途，其中所述包含αSyn的聚集物与所述样品接触20分钟至2小时。

21.根据权利要求1至20任一项的用途，特征在于使所述样品接触包含αSyn的聚集物之前，在样品中的αSyn特异性抗体上进行解蔽（demasking）步骤。

22.根据权利要求1-20任一项的用途，其中在检测IgM抗体时使所述样品接触包含αSyn的聚集物之前，在样品中的αSyn特异性抗体上进行解蔽步骤。

23.根据权利要求1至22任一项的用途，其中所述生物样品是正在接受或者理应接受αSyn免疫治疗的患者的样品，且其中检测到的αSyn特异性抗体的量与同一患者在从所述患者取出样品的同时，蛋白病相关的诊断结果有关。

24.根据权利要求23的用途，其中所述蛋白病是突触核蛋白病。

25.根据权利要求1至24任一项的用途，其中所述方法在同一患者不同时间取出的样品上进行至少两次。

26.根据权利要求25的用途，其中检测到的αSyn特异性抗体的量与同一患者在从所述患者取出样品的同时，蛋白病相关的诊断结果有关。

27.根据权利要求26的用途，其中所述蛋白病是突触核蛋白病。

28.根据权利要求25-27任一项的用途，其中所述方法每六个月进行至少一次。

29.根据权利要求28的用途，其中所述方法每三个月进行至少一次。

30.根据权利要求28的用途，其中所述方法每个月进行至少一次。

31.包含α突触核蛋白(αSyn)的聚集物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于突触核蛋白病的诊断，所述诊断包括以下步骤：

- 使样品与包含αSyn的聚集物接触，并允许αSyn特异性抗体结合所述包含αSyn的聚集物，和

其中所述包含αSyn的聚集物具有50 nm至15 µm的尺寸。

32.根据权利要求31的用途，其中所述突触核蛋白病选自帕金森病（Parkinson’sdiseas, PD），路易体病（Lewy Body Disease，LBD），路易体痴呆（Dementia with LewyBodies，DLB），帕金森病痴呆（Parkinson’s Disease Dementia，PDD），多系统萎缩（Multiple System Atrophy，MSA），单纯性自主神经衰竭（Pure Autonomic Failure，PAF），REM睡眠行为障碍（REM Sleep Behavior Disorder，RBD），脑铁沉积型神经退行性病变I型（Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation type I，NBIA Type I），包涵体肌炎（inclusion body myositis，IBM），皮质基底节变性（Cortico-Basal Degeneration，CBD），进行性核上性麻痹（Progressive Supranuclear Palsy，PSP），皮克氏病（Pick’sDiease, PiD），拳击员痴呆症（Dementia pugilistica）（慢性创伤性脑病，DP），额颞痴呆（Frontotemporal dementia，FTD），Lytico-Bodig病（LD），亨廷顿病（Huntington'sdisease，HD）和脊髓小脑性共济失调（Spinocerebellar ataxias， 1，2，3和7型）和肌萎缩性侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS），prionosis和II型糖尿病。

33.包含α突触核蛋白(αSyn)的聚集物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于具有α-突触核蛋白沉积和/或聚集的疾病的诊断，所述诊断包括以下步骤：

其中所述包含αSyn的聚集物具有50 nm至15 µm的尺寸。

34.根据权利要求33的用途，其中所述具有α-突触核蛋白沉积和/或聚集的疾病是阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease，AD）唐氏综合征（Down Syndrome，DS），进行性核上性麻痹（PSP），皮质基底节变性（CBD），额颞痴呆/皮克氏病（FTD/ PiD）。

35.根据权利要求31的用途，其中所述试剂盒用于突触蛋白病的早期追踪和用于观察用于治疗突触核蛋白病的药物的临床试验的开发。

36.用于执行根据权利要求1至30任一项中所述的方法的试剂盒，包含

- 荧光标记的包含αSyn的聚集物，和

- 样品容器，其中所述包含αSyn的聚集物具有50 nm至15 µm的尺寸。

37.根据权利要求36的试剂盒，特征在于所述包含αSyn的聚集物具有从100 nm至10 µm尺寸。

38.根据权利要求37的试剂盒，其中所述包含αSyn的聚集物具有从200 nm至5 µm的的尺寸。

39.根据权利要求37的试剂盒，其中所述包含αSyn的聚集物具有从500 nm至2 µm的尺寸。

40.根据权利要求36至39任一项的试剂盒，特征在于所述包含αSyn的聚集物以0.01至10 µM的量存在，用于使所述样品接触包含αSyn的聚集物。

41.根据权利要求40的试剂盒，其中所述包含αSyn的聚集物以0.1至1 µM的量存在。