TW201427732A - 置換人工保存液之血小板溶液之製造方法 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示用以製造具有血小板之活性化抑制性能、高血小板回收性能及高血漿去除性能之置換人工保存液之血小板溶液之新穎手段。本發明之置換人工保存液之血小板溶液之製造方法係具備過濾步驟及混合步驟；該過濾步驟係於下述式1所表示的條件下，使用與血小板溶液接觸的面之平均孔徑為0.1μm以上且小於2.0μm之分離膜，以25~1500s-1之入口管壁剪切率(wall shear rate)將前述血小板溶液交叉流過濾(cross flow filtration)而獲得濃縮血小板溶液；該混合步驟係將前述濃縮血小板溶液與人工保存液混合而獲得置換人工保存液之血小板溶液；1.0×1011＜(A×B)/(γ×μP)≦2.5×1013(個/(hr‧m2‧Pa))‧‧‧‧式1 A：血小板溶液所含的血小板濃度(個/mL；惟，8.0×107~200×107個/mL)B：每單位面積之過濾流量(mL/hr/m2) γ：入口管壁剪切率(s-1) μP：血小板溶液之黏度(Pa‧s)。
Description
本發明係關於置換人工保存液之血小板溶液之製造方法。
用於輸血或血液製劑之製造所進行的捐血可大致區分為全血捐血與成分捐血。將藉由捐血所採取的血液分離成各個成分，而製造各式各樣種類之血製劑。血小板製劑係指經濃縮的血小板分散於血漿(主成分為蛋白質及水分)的溶液。因血小板製劑中之血小板之濃度較全血高3倍量以上，有血小板彼此非常容易凝集的可能性。
血小板製劑現用於血小板減少症及血小板機能低下症中為了出血的預防或治療之輸血。現行之血小板製劑有於患者而引起蕁麻疹或發熱等之過敏反應的問題。就過敏之主原因而言，可舉例血小板製劑所含的蛋白質，正冀望去除含蛋白質的血漿，而置換成人工保存液的置換人工保存液之血小板溶液。
於上述之置換人工保存液之血小板溶液之製造方法中，除了要求在操作中血小板不活性化之外，亦要求高血小板回收率、高蛋白質去除率。歷來，就去除血小板製劑之蛋白質的方法而言，離心分離法為一般者
。於藉由離心分離法去除血小板製劑中之蛋白質的情形，已暗示有引起血小板活性化的可能性，又離心法之操作為煩雜，一般來說需要相當的時間。然而，目前的現狀是除了離心法以外，其他方法並未被實用化。
就其他方法而言，可考慮使用膜而分離的方法，就膜分離之方法而言，有用於血球(紅血球、白血球、血小板)與血漿之分離(專利文獻1~3)等之周知技術。專利文獻1揭示為了防止紅血球之溶血而著眼於膜之膨潤性，使用於多孔質膜難以膨潤的素材的同時，於多孔質膜將濕潤水分極小量化的技術。專利文獻2係規定膜之原纖維(fibril)構造，又使血液流量加快的技術。又專利文獻3揭示一種聚碸系樹脂多孔質膜，其作為難以產生阻塞或污垢的膜，著眼於親水性高分子，使多孔質膜中含有3~30質量%之親水性高分子。總之，先前技術之任一者中，過濾的對象皆為全血，而非以如血小板製劑之容易凝集的溶液作為對象。再者，僅著眼於膜，並未見到關於分離之方法的見解或暗示。
[專利文獻1]日本特開昭62-290469號公報
[專利文獻2]日本特開昭54-15476號公報
[專利文獻3]日本特開昭61-238834號公報
本發明係以提供用以製造具有血小板之活性化抑制性能、高血小板回收性能及高血漿去除性能之置換人工保存液之血小板溶液之新穎手段為目的。
本案發明人等專心檢討的結果，獲得藉由歷來之透析治療或分離術(apheresis)療法用途之分離膜而製造置換人工保存液之血小板溶液係非常困難的見解。就其原因而言，可舉例膜之構造設計並非適當。歷來之血液淨化用途之膜，係以自紅血球、白血球、血小板、蛋白質作為主成分的全血中去除尿素等之低分子量物質或一部分之蛋白質為目的而製作。因此，無法去除分子量大的蛋白質。
又，為了去除很多蛋白質，與原本之使用條件相比，提升過濾量時，在中途會變得不能過濾。此係因為在膜內部發生蛋白質阻塞，於膜表面，形成血小板捲入蛋白質的堆積層(濾餅，cake)而阻礙過濾。
阻塞或濾餅形成之原因係膜表面之孔為小的，而分子量大的蛋白質未脫離膜而留於膜表面或膜內部，與由於過濾的流量設計不適當，而血小板會大量堆積於膜表面。又，過濾被阻礙時，會見到蛋白質之去除量減少、血小板損失的增加、活性化血小板之增加。
如此，本案發明人等發現有使用配合血小板溶液及分離目的的構造之分離膜來設定分離條件的必要。然而，為了去除血小板溶液所含的蛋白質之膜設計與分離條件，至今則尚未被檢討。因此，進一步專心反覆
研究，成功地發現不活性化血小板而達成高血小板回收性能與高血漿去除性能的分離條件，遂而完成本發明。
即，本發明係提供一種置換人工保存液之血小板溶液之製造方法，其具備過濾步驟與混合步驟；該過濾步驟係於下述式1所表示的條件下，使用與血小板溶液接觸的面之平均孔徑為0.1μm以上且小於2.0μm之分離膜，以25~1500s-1之入口管壁剪切率(wall shear rate)，將前述血小板溶液交叉流過濾(cross flow filtration)而獲得濃縮血小板溶液；該混合步驟係將前述濃縮血小板溶液與人工保存液混合而獲得置換人工保存液之血小板溶液。
1.0×1011<(A×B)/(γ×μP)≦2.5×1013(個/(hr‧m2‧Pa))‧‧‧‧式1
A：血小板溶液所含的血小板濃度(個/mL；惟。8.0×107~200×107個/mL)
B：每單位面積之過濾流量(mL/hr/m2)
γ：入口管壁剪切率(s-1)
μP：血小板溶液之黏度(Pa‧s)
又，本發明係提供置換人工保存液之血小板溶液之製造方法，其具備過濾步驟、回收步驟與混合步驟；該過濾步驟係於下述式1所表示的條件下，使用與血小板溶液接觸的面之平均孔徑為0.1μm以上且小於2.0μm之分離膜，以25~1500s-1之入口管壁剪切率，將前述血小板溶液交叉流過濾而獲得濃縮血小板溶液；該回收步驟係使人工保存液與前述分離膜接觸，將前述過濾步驟
中未被回收於濃縮血小板溶液中的血小板回收於前述人工保存液中，而獲得含有血小板之人工保存液；該混合步驟係藉由將血小板人工保存液與前述濃縮血小板溶液混合，而獲得置換人工保存液之血小板溶液。
1.0×1011<(A×B)/(γ×μP)≦2.5×1013(個/(hr‧m2‧Pa))‧‧‧‧式1
A：血小板溶液所含的血小板濃度(個/mL；惟，8.0×107~200×107個/mL)
B：每單位面積之過濾流量(mL/hr/m2)
γ：入口管壁剪切率(s-1)
μP：血小板溶液之黏度(Pa‧s)
藉由上述之製造方法所獲得的置換人工保存液之血小板溶液，蛋白質去除率(將原血小板溶液中之蛋白質濃度作為100)為60%以上，且置換人工保存液之血小板溶液之CD62P陽性血小板比率為60%以下為較佳，蛋白質去除率為65%以上，且置換人工保存液之血小板溶液之CD62P陽性血小板比率為40%以下為更佳。於此，CD62P陽性血小板比率越高，表示血小板越活性化。
又，上述過濾步驟中的透膜壓差(transmembrane pressure difference)係5.0×103Pa以下為較佳，上述之分離膜之透水性係35~150mL/hr/m2/Pa為較佳。
此外，上述之分離膜係中空纖維膜(hollow fiber membrane)為較佳，上述交叉流過濾係內壓式交叉流過濾為較佳，上述之中空纖維膜之內徑係100~500μm
為較佳，上述之中空纖維膜之有效長度係5~50cm為較佳，上述之分離膜係含有親水性聚合物，且將前述分離膜之與血小板溶液接觸的面以測定角90°藉由X射線電子光譜法測定而獲得的前述親水性聚合物之存在量係30~60質量%為較佳。
此外，本發明提供一種濃縮血小板溶液之製造方法，其具備過濾步驟：於下述式1所表示的條件下，使用與血小板溶液接觸的面之平均孔徑為0.1μm以上且小於2.0μm之分離膜，以25~1500s-1之入口管壁剪切率，將前述血小板溶液交叉流過濾而獲得濃縮血小板溶液。
1.0×1011<(A×B)/(γ×μP)≦2.5×1013(個/(hr‧m2‧Pa))‧‧‧‧式1
A：血小板溶液所含的血小板濃度(個/mL；惟，8.0×107~200×107個/mL)
B：每單位面積之過濾流量(mL/hr/m2)
γ：入口管壁剪切率(s-1)
μP：血小板溶液之黏度(Pa‧s)
依據本發明之置換人工保存液之血小板溶液之製造方法，即使為非全血之血小板製劑之類容易凝集的血小板溶液，可抑制血小板之活性化，同時達成高血小板回收率及高蛋白質去除率，而可製造品質良好的置換人工保存液之血小板溶液。
第1圖A)實施例所使用的中空纖維膜之內表面(血液接觸面)之10000倍之掃描型電子顯微鏡像之一例。B)將實施例所使用的中空纖維膜之內表面(血液接觸面)之10000倍之掃描型電子顯微鏡像塗上顏色而二值化的畫像之一例。
於本發明，「血小板溶液」係指含血漿的媒質中分散有血小板及蛋白質的液體，實質上不含紅血球及白血球的液體。媒質典型為血漿，但可含有人工保存液等之緩衝液作為媒質之一部分。本發明所使用的血小板溶液之血小板濃度為8.0×107~200×107個/mL。血小板溶液係將全血離心分離後，藉由通過白血球去除過濾器等之方法而去除紅血球及白血球而可獲得。一般而言，作為血小板製劑而為人所知之製劑係使濃縮的血小板分散於血漿中的製劑，若血小板濃度於上述之範圍內，直接可作為「血小板溶液」提供於本發明之方法。或者，於本發明，亦可使用將血小板製劑所含的血漿之一部分以人工保存液替換者、或將人工保存液預先混合而稀釋者作為血小板溶液來使用。又，血漿係如此領域周知，意指藉由離心分離等之手法自全血去除紅血球、白血球、血小板而殘留的成分，主成分為蛋白質及水分。
於本發明，「人工保存液」係指可使用作為分散血小板的媒質的人工之(非天然之)溶液。血小板用之人工保存液為周知，就具體例而言，可舉例PASIII-M
或M-sol、生理食鹽水、BICANATE(註冊商標)等一般性作為輸液使用的溶液，又ACD-A液等之含檸檬酸的溶液。不過，並未限定於此等，只要為具有適合血小板保存的性能的溶液即可，即，在與血小板接觸時，不會由於凝集塊之發生或浸透壓等而誘導血小板之破壞的溶液即可，任一種皆可作為本發明中的「人工保存液」來使用。
「置換人工保存液之血小板溶液」係指血小板溶液之媒質之大部分被置換為人工保存液者。藉由主要為血漿的媒質被置換為人工保存液，血小板溶液中之蛋白質量被大幅地減少。只要依據上述之置換人工保存液之血小板溶液之製造方法，可獲得防止血小板之活性化的同時，蛋白質被理想地去除的置換人工保存液之血小板溶液。又上述之置換人工保存液之血小板溶液之製造方法中，蛋白質去除率為60%以上、且置換人工保存液之血小板溶液之CD62P陽性血小板比率為60%以下為較佳，蛋白質去除率為65%以上、且置換人工保存液之血小板溶液之CD62P陽性血小板比率為40%以下則更佳。於此，CD62P陽性血小板比率越高，則表示血小板越活性化。CD62P陽性血小板比率為60%以上時，因血小板會凝集，血小板機能容易降低，故不會活性化的製造方法係重要的。又，CD62P陽性血小板比率過低時，因亦有損及血小板凝集機能的可能性，置換人工保存液之血小板溶液中之CD62P陽性血小板比率為1%以上較佳，3%以上更佳。又，原血小板溶液之CD62P陽性血小板比率
作為1的情形之置換人工保存液之血小板溶液之CD62P血小板比率之增加比為3.0以下，較佳為2.0以下，更佳為1.5以下。
本發明之置換人工保存液之血小板溶液之製造方法中，使用與血小板溶液接觸的膜表面之平均孔徑為0.1μm以上且低於2.0μm之分離膜，於下述式1所表示的條件，將入口管壁剪切率設為25~1500s-1，而將血小板溶液交叉流過濾。藉由於此種條件下濃縮血小板溶液，抑制血小板之活性化的同時，可高效率達成蛋白質之去除。
1.0×1011<(A×B)/(γ×μP)≦2.5×1013(個/(hr‧m2‧Pa))‧‧‧‧式1
A：血小板溶液所含的血小板濃度[個/mL]
(惟，8.0×107~200×107個/mL)
B：每單位面積之過濾流量[mL/hr/m2]、
γ：入口管壁剪切率[s-1]、
μP：血小板溶液之黏度[Pa‧s]
藉由血小板溶液之過濾而製作去除血漿之血小板溶液時最大問題點為蛋白質及血小板會阻塞膜。膜表面之平均孔徑為0.1μm以上且低於2.0μm的情形，阻塞的原因係血小板堆積於表面，形成亦捲入蛋白質的堆積層。將此堆積層稱為濾餅。若形成濾餅，血漿之去除效率會降低。又，存在於濾餅中的血小板無法被完全地回收的緣故，血小板之回收率亦會降低。而且，濾餅中之血小板釋放出活性化因子的緣故，產生回收的血小板亦
被活性化的問題。即，於血小板溶液之過濾時，抑制濾餅形成係重要的。就血小板之回收率而言，80%以上為較佳，又85%以上為較佳，更佳為90%以上。
本案發明人等，發現作為抑制濾餅形成的過濾方法係交叉流過濾最適合。交叉流過濾係指僅將血小板溶液之一部分過濾，殘餘部分直接流出(未通過分離膜，於分離膜之表面流出)，藉此而存在有相對膜表面為垂直的水流與相對膜表面為平行的水流之2個水流的過濾方法。若以中空纖維膜為例，則成為由中空纖維膜之一方加入血小板溶液，將其一部分過濾，未過濾的殘餘血小板溶液自另一方排出的過濾方式。
垂直於膜的過濾水流係促進濾餅之形成，相對於此，平行於膜表面的水流係抑制濾餅之形成。本發明著眼於此2個水流，藉由以滿足式1的條件設定分離膜，控制流量的同時，進行過濾，而發現濾餅形成之抑制成為可能的。
式1中，分子(A×B)相當於形成濾餅的力，分母之(γ×μP)相當於抑制濾餅的力。(A×B)與(γ×μP)相比越小，則濾餅變得難以產生，不使血小板活性化，可以高血小板回收率而安定地去除蛋白質。如上述式1，藉由濾餅形成之力與抑制之力之比((A×B)/(γ×μP))成為較1.0×1011大且為2.5×1013以下，可於分離膜上一邊抑制濾餅形成而一邊過濾。又，(A×B)與(γ×μP)相比過小時，蛋白質之過濾變成無法充分地進行。從而濾餅形成之力與抑制之力之比，較佳為大於1.0×1011且2.0×1013以下，更
佳為大於1.0×1011且1.5×1013以下。
若以使用中空纖維膜作為分離膜的情形為例加以說明，入口管壁剪切率γ之求得方法如下。
γ(s-1)=4×C/D‧‧‧‧式2
C：供給液之線速度(m/秒)
D：相當半徑(m)
式2中之C係由以下之式3賦予。
C=(E/1000000)/(F×中空纖維根數)‧‧‧‧式3
E：供給的血小板溶液流量(mL/秒)
F：相對於與膜接觸的血小板溶液之未過濾的血小板溶液流動的方向為垂直方向之斷面之面積(m2)
F中的「與膜接觸的血小板溶液」係指於與血小板溶液接觸側之膜表面之垂直方向連續存在的血小板溶液。中空纖維膜之情形，F係指中空纖維膜斷面中的內腔部分的面積。
又，式2中之D係由以下之式4賦予。
D=2×(F/G)‧‧‧‧式4
G：於上述F所表示的斷面之外周，與壁面接觸的部分之合計長度(m)
中空纖維膜的情形，G係指斷面中的內腔部分之圓周之長度。
供給膜的血小板溶液之流量可於定速下送液，亦可於定壓下送液，任一者皆可。使用幫浦等而於定速下將血小板溶液送液的情形，將生理食鹽水流動1分鐘時之液量設為上述式3之血小板溶液流量E即可。另一方
面，於某一定的壓力下送液的情形之血小板溶液流量E可以下式求得。
E=H×(μP/μw)‧‧‧‧式5
H：於某一定之壓力下未進行過濾而將生理食鹽水送液1分鐘時之液量(mL/分鐘)
μP：血小板溶液之黏度(Pa‧s)
μw：生理食鹽水之黏度(Pa‧s)
入口管壁剪切率γ係指由血小板溶液於與膜最初接觸的入口地點的過濾前之血小板溶液之流量算出的管壁剪切率。管壁剪切率係指膜表面中的剪切率(shear rate)。剪切率係表示與膜表面平行的方向之線速度之速度梯度，越遠離水流中心越大，於膜表面成為最大。因濾餅於膜表面形成，對於濾餅抑制，管壁剪切率亦可謂重要。尤其，本案發明人等發現入口管壁剪切率係特別重要的。其可認為係於膜入口附近，血小板或蛋白質被活性化的情形，因於下游溶液容易產生對膜表面的附著，而形成濾餅。另一方面，管壁剪切率過高，血小板亦活性化。由上述而言，入口管壁剪切率係25秒-1以上為較佳，100秒-1以上為更佳，600秒-1以上為更佳。又，1500秒-1以下為較佳，1000秒-1以下為更佳。
又，就血小板溶液之黏度μP而言，越高抑制濾餅形成的力越大。另一方面，黏度高時，因血小板或蛋白質之濃度高，容易引起血小板活性化，而濾餅容易形成。考慮以上的結果，就血小板溶液之黏度而言，1.0×10-3Pa‧s以上為較佳，1.2×10-3Pa‧s以上為更佳。
又，2.5×10-3Pa‧s以下為較佳，1.8×10-3Pa‧s以下更佳。又，任意之溶液之黏度可使用市售之測定機器依據常法來測定。
本發明中，每單位面積之過濾流量B係將設定過濾流量除以血小板溶液接觸的膜之面積的值。每單位面積之過濾流量越小，則形成濾餅的力越小。另一方面，血小板溶液中之血漿之去除效率(進而蛋白質之去除效率)會降低。考慮以上的結果，每單位面積之過濾流量係4800mL/hr/m2~48000mL/hr/m2為較佳，14400mL/hr/m2~32000mL/hr/m2為更佳。
又，形成濾餅時，相較於設定的過濾流量，發生實際之過濾流量減少、或蛋白質去除量之降低。此種情形，透膜壓差(以下，TMP)變大。尤其，一旦濾餅被形成時，則會加速度地進行濾餅形成。因此，較佳為以透膜壓差5.0×103Pa以下，更佳為以3.0×103Pa以下之條件進行過濾。TMP可以下列式求得。
TMP(Pa)=((Pi+Po)/2)-PF‧‧‧‧式6
Pi：供給的血小板溶液之壓力(Pa)
Po：未過濾而排出的血小板溶液之壓力(Pa)
PF：經過濾而排出的溶液之壓力(Pa)
適合上述條件的膜係與血小板溶液接觸的膜表面之平均孔徑為0.1μm以上且低於2μm，較佳為0.3μm以上1.0μm以下之膜。因有必要盡可能去除蛋白質，膜表面之孔徑盡可能大者為佳。於另一方面，膜表面之孔徑大小係有必要較2~4μm的血小板為更小。若考慮蛋白質
與血小板兩者之大小，為了不使濾餅形成而過濾血小板溶液，上述孔徑最適合自血小板溶液去除蛋白質。
又，膜表面之開孔率越大，即使相同孔徑，因進入膜內部的路徑多，濾餅層越難以形成。膜表面之開孔率係10%以上為較佳，12%以上為更佳，15%以上又更佳。分離膜表面之開孔率低於10%的情形，由於透水性顯著降低而透膜壓差會上升，而與血小板的活性化及血小板回收率的降低有關。又，開孔率過高時，因膜強度不足，開孔率係30%以下為較佳，20%以下為更佳。關於膜表面之孔徑、開孔率之測定方法之詳細內容描述於後，但藉由將以電子顯微鏡放大1000倍的畫像以Matrox Inspector2.2(Matrox Electronic Systems Ltd.)等之周知軟體進行畫像處理而可獲得。
又，透水性越高的膜，越難形成濾餅層，可控制透膜壓差為低值。即，使用透水性高的膜係與血小板活性化之抑制及血小板回收率之提升有關。若考慮於高剪切率範圍盡可能去除多的血漿，膜之透水性係35mL/hr/m2/Pa以上為較佳，70mL/hr/m2/Pa以上為更佳。又，150mL/hr/m2/Pa以下為較佳。關於膜之透水性之測定方法的詳細內容描述於後，但可測定於一定壓力下每單位時間透過膜而流出的水量而獲得。
於本發明使用的分離膜之形狀並未特別限定。然而，為了達成上述記載之條件，以狹窄流路流通血小板溶液者最有效率。就分離膜之形狀而言，中空纖維為最適合，又以內壓式進行交叉流過濾為較佳。
使用中空纖維膜而即使以外壓式過濾亦無問題，但於此情形，中空纖維膜彼此之間隙有必要盡可能狹窄。又，由血小板濾餅形成之抑制或血小板溶液之流動性之保持的觀點，不使中空纖維膜彼此接觸的方法成為必要。就不使中空纖維膜彼此接觸的方法而言，可舉例於纖維束置入間隔纖維，將中空纖維外側之斷面作成星形等複雜的形狀、將纖維方向之形狀作成波形等。
於本發明，以內壓式交叉流使用中空纖維膜的情形，膜內徑越小，則越容易獲得高剪切率。另一方面，膜內徑過小時，因膜內腔本身阻塞的危險性亦變高，有注意膜之內徑的必要。考慮此點的結果，於本發明，中空纖維之膜內徑係100~500μm為較佳，200~350μm為更佳。詳細內容描述於後，但中空纖維膜內徑可藉由測定中空纖維膜外徑與膜厚而求得。
於內壓交叉流過濾使用中空纖維膜的情形，依膜之有效長度而每單位膜面積之過濾流量B會變化。因膜之有效長度越長，則每單位膜面積之過濾流量變越低，可進一步抑制濾餅形成。然而，由血小板活性之觀點來看的情形，因膜之有效長度越長，滯留於中空纖維內腔的時間，即血小板與膜表面之接觸時間變長，血小板變的容易活性化。考慮此點的結果，於本發明，中空纖維膜之有效長度係5~50cm為較佳，20~35cm又更佳。
本發明中的有效長度係指作為分離膜之有效作用的部分之長度。從而填充膜而作成模組的情形，膜以灌封劑(potting agent)等包埋，而不含無法過濾的部分
。以中空纖維膜為例時，相當於中空纖維膜中有效作用的部分之纖維長度。又，以平膜為例時，存在有縱及橫的長度，但相當於與流通血小板溶液的方向相同之方向之長度。
關於分離膜之素材，只要滿足上述條件者即可，並未限制，但與膜接觸亦不使血小板活性化，即具有血液相容性(blood compatibility)的素材為適合。就素材之例而言，可舉例以血液透析膜或血漿分離膜所使用的纖維素乙酸酯為代表的再生纖維素、或伸乙基乙烯醇(ethylene vinyl alcohol)共聚物及聚碸等之合成聚合物。
上述膜素材中尤其是聚碸、聚醚碸之所謂聚碸系聚合物作為主要原料的分離膜，已知透水性或劃分性能為優異。於本發明，就使用的素材而言，亦以聚碸系聚合物為最佳。於此，「聚碸系聚合物」係指其主鏈具有芳香環、磺醯基及醚基的聚合物。
就聚碸系聚合物而言，例如，可舉例通式(I)所示的聚碸、通式(II)所示的聚碸、聚醚碸及聚烯丙基醚碸等，但此等中以通式(I)所示聚碸及通式(II)所示聚碸為較佳，又n數為50~80者為更佳。又，通式(I)或(II)所示聚碸、與其他之單體之嵌段共聚物、或通式(I)或(II)所示聚碸之變性體亦包含於「聚碸系聚合物」。通式(I)或(II)所示的聚碸與其他之單體之嵌段共聚物中的來自「其他之單體」之構造，相對於嵌段共聚物全體，係10質量%以下為較佳。
又，已知藉由於膜素材之聚合物混練親水性聚合物、對膜表面修飾親水性聚合物，可製作血液相容性優異的膜。於本發明，分離膜含有親水性聚合物者亦為較佳。「親水性聚合物」係指水溶性之聚合物化合物、或雖為非水溶性，亦藉由靜電相互作用或氫鍵而與水分子相互作用的高分子。於此，就親水性聚合物而言，例如，可舉例聚伸烷基氧化物、聚乙烯醇、聚乙二醇及聚乙烯吡咯啶酮(以下，「PVP」)，其中以PVP為較佳。
就可添加作為親水性聚合物物質的PVP而言，存在有重量平均分子量為約6000(相當K-15)~1200000(相當K-90)者。於本發明使用的情形，為了使親水性提升，PVP之重量平均分子量係10000以上為較佳，40000以上為更佳。
使用以聚碸系聚合物與親水性聚合物作為主原料的分離膜的情形，與血小板溶液接觸側之最表層部分之親水性聚合物的存在量係30~60質量%為較佳，又50~60質量%為較佳。血小板溶液的情形，分離膜最表層部分之親水性聚合物之存在量係30質量%以上時，因膜表面之親水性會提升，血液相容性變良好，藉由較佳
地防止分離膜表面之血小板凝集，而可防止分離膜之分離性能的降低。又，分離膜最表層部分之親水性聚合物之存在量若成為50質量%以上，親水性進一步變高，因難以引起凝集，而更佳。另一方面，藉由抑制分離膜最表層部分之親水性聚合物之存在量為60質量%以下，因可抑制溶出於血小板溶液中的親水性聚合物之量，而可減少溶出的親水性聚合物之影響。
分離膜之最表層部分係指以測定角90°藉由X射線電子光譜法(XPS)所測定的範圍。於該方法，具體而言，可測定自表面起至深度為10nm(100Å)左右之親水性聚合物存在量。例如，於中空纖維膜之內側流通血小板溶液的情形，「分離膜最表層部分之親水性聚合物之存在量」可藉由調查中空纖維膜之內表面中的碳原子或氮原子等之元素之存在比率而算出。關於詳細內容係如後述。
「膜表面存在有親水性聚合物」係指親水性聚合物以某種形式停留於聚碸系分離膜之與血小板溶液接觸的膜表面、或非接觸側之膜表面的狀態。例如，包含親水性聚合物共價鍵結於聚碸系分離膜之與血小板溶液接觸的膜表面、或非接觸側之膜表面的態樣，藉由於製膜製程中於與血小板溶液接觸側使用親水性聚合物溶液而形成親水性聚合物含量高的層的型態，藉由事後的塗布而使親水性聚合物之皮膜形成的型態等之各式各樣的態樣，只要滿足上述與血小板溶液接觸側之膜最表層部分之親水性聚合物之存在量即可，可為任何型態。
就使親水性聚合物存在膜表面的方法之具體例而言，可舉例以下之方法。由製膜原液加以濕式製膜的情形，於表面上，為了防止熵損失(entropy loss)而有高分子量之聚合物聚集，且為了防止熵損失而有親水性聚合物聚集的傾向。據此，例如，聚碸膜的情形，若作成包含聚碸與親水性聚合物之2成分聚合物的原液，因於表面可使親水性聚合物原液濃縮，藉由聚合可於膜表面局部存在親水性聚合物。又，於分離膜為中空纖維膜之情形，自雙環狀紡嘴吐出時，於內側流入注入液，但於此注入液中可添加親水性聚合物。如上述而進行時，中空纖維膜會相分離，膜構造於決定之前，因注入液中之親水性聚合物會擴散至製膜原液側，而可使親水性聚合物局部存在於內表面。又或者，中空纖維膜於製膜後，可以親水性聚合物塗布於分離膜之機能層表面，此方法由於簡便而可較佳地使用。塗布後，藉由放射線或熱處理等，可使親水性聚合物交聯於分離膜，藉此，可較佳抑制親水性聚合物之溶出。又，可藉由化學反應將親水性聚合物與中空纖維膜固定化。
本發明之過濾步驟中，於上述式1所表示的條件下，藉由於適當血小板溶液用分離模組(具體而言，可舉例裝配上述中空纖維等之分離膜的管柱)中流通血小板溶液，而自血小板溶液過濾媒質(主要為血漿)之一部分而去除。據此，可獲得血小板濃縮於液中的濃縮血小板溶液。只要滿足式1之條件即可，濃縮的程度並未限定，通常去除媒質使血小板溶液之體積減少至數分之1~數
十分之1的程度。
此濃縮步驟作為抑制血小板之活性化且同時可高效率去除蛋白質的濃縮血小板溶液之製造方法或血小板溶液之濃縮方法皆為有用的。
濃縮步驟之後，進行添加人工保存液的混合步驟，而獲得置換人工保存液之血小板溶液。人工保存液之添加量並未特別限定，因應將獲得的置換人工保存液之血小板溶液作為血小板製劑使用時之使用目的，可適當選擇作成適合的血小板濃度。通常，添加人工保存液成為原本之血小板溶液之4分之1左右~相同程度之體積。
混合步驟之前，可進行回收分離膜上殘留的血小板的回收步驟。進行回收步驟的情形，使人工保存液接觸過濾步驟中使用的分離膜，將分離膜上殘留的血小板與人工保存液同時回收，此人工保存液中含有血小板，將此含有血小板之人工保存液作為於混合步驟中的人工保存液使用。經由回收步驟之導入，可回收於血小板溶液流入側之分離膜上、及分離膜之孔內殘留的血小板，而可提升血小板回收率。
回收步驟中，使人工保存液接觸過濾步驟所使用的分離膜，但接觸膜的方法並未特別限定。例如，有使人工保存液不於分離膜過濾，而使人工保存液接觸流入的血小板溶液所接觸的側之分離膜表面，使分離膜上殘存的血小板含於人工保存液中而回收的方法；將人工保存液以分離膜過濾，使孔內部殘存的血小板含於人
工保存液中而回收的方法；藉由將人工保存液以分離膜交叉流過濾，一邊將分離膜表面及孔內部殘存的血漿向膜外去除，一邊將血小板溶於人工保存液中而回收的方法等，但可使用任一者之方法，又亦可適宜組合此等方法來進行。其中，使人工保存液交叉流過濾而回收的方法為較佳，若藉由此方法，特別可提高血小板回收率。
又，回收步驟係可一邊變換流入分離膜的人工保存液之流量一邊回收。
回收步驟中的剪切率係控制為與式1同樣之剪切率的範圍的流量為較佳。關於每單位膜面積之過濾流量，設定為過濾步驟中進行的流量以下之流量者為較佳。藉由將每單位膜面積之過濾流量作成與過濾步驟中之過濾流量同等、或少的流量，而可不促進血小板之活性化而於回收步驟回收分離膜表面及孔內部殘存的血小板。此外，將獲得的置換人工保存液之血小板溶液作為原液，可再次進行相同之操作。為了提升蛋白質之去除率，重覆進行操作為較佳。惟，重覆進行操作時，因血小板回收率降低的緣故，就重覆操作的次數而言，可為5次，又3次以下為較佳。
供給於本發明之方法的血小板溶液、過濾步驟所獲得的濃縮血小板溶液、及回收步驟所獲得的含有血小板之人工保存液之各自所含的血小板數係可藉由周知之全自動血球測定器(例如，日本光電工業股份有限公司製之Celltacα(MEC-6318)等)而測定。又，血小板回收率可藉由以下之式算出。
血小板回收率(%)=(I+J)/K×100‧‧‧‧式7
I：濃縮血小板溶液所含的血小板數
J：含有血小板之人工保存液所含的血小板數
K：血小板溶液所含的血小板數
就呈現血小板之活性化的指標而言，可舉例CD62P陽性血小板比率。血小板由於外部刺激等而被活性化時，因CD62P轉移至血小板之細胞膜表面而表現，可依據表現CD62P的血小板之比率而評價血小板活性化的程度。CD62P陽性血小板比率詳細描述於後，但可以流式細胞儀分析(flow cytometry)測定。
又，就可簡便且短時間把握供給於本發明之方法的血小板溶液及依據本發明之方法所獲得的置換人工保存液之血小板溶液之品質之有用方法而言，可舉例旋渦(swirling)檢查。旋渦係指將置入含血小板的溶液之容器遮光而緩慢地攪拌時，可見到旋渦狀之圖案的現象。因未經活性化的血小板之形態為圓盤狀，藉由攪拌而圓盤狀血小板會使光一樣地折射而產生光散射現象，可觀察到旋渦。另一方面，由於活性化而血小板之形態變化時，不會產生光散射現象，旋渦會減低而消失。
關於蛋白質濃度之測定，直接利用周知之總蛋白質濃度之測定法即可。就總蛋白質濃度之測定方法而言，有以紫外吸收法為首之各種方法，顯色法經常被利用。若大致區分顯色法時，可分為以布拉福法(Bradford method)作為代表之利用蛋白質與顯色色素之化學結合的方法、及以二金雞鈉酸(bicinchoninic acid，BCA)法為
代表之利用於蛋白質存在下產生的還元銅離子之螯合錯合物的方法。關於蛋白質濃度之測定方法並未特別限定，但由精度之觀點，BCA法為最適合。BCA法之詳細內容描述於後。
蛋白質去除率可藉由下式算出。
蛋白質去除率(%)={(O×U)-(V×W)}×100/(O×U)‧‧式8
O：血小板溶液之蛋白質濃度(mg/mL)
U：血小板溶液液量(mL)
V：置換人工保存液之血小板溶液之蛋白質濃度(mg/mL)
W：置換人工保存液之血小板溶液之液量(mL)
以下，詳述各種參數之測定方法。
(1)透水性測定
「膜之透水性」可藉由以下之方法加以測定及算出。不論是平膜或中空纖維膜，基本上可由相同之下述式9而求得。例如，中空纖維膜的情形，於塑膠管中插入中空纖維膜，將中空纖維膜之兩端與塑膠管兩端部之內壁接著固定，而製作有效長度10cm之模組。於此模組，於與本發明之方法之過濾步驟中使用之相同過濾方向下施加壓力而使水流通而過濾。例如，自中空纖維膜之內側至外側來過濾的情形，自內側施加1.3×104Pa之水壓，測定流出至中空纖維膜之外側的每單位時間之水量，藉由下式算出「分離膜之透水性」。
透水性(mL/hr/Pa/m2)=QW/(T×P×X)‧‧‧式9
QW：流出至中空纖維膜之外側的水量(mL)
T：施加水壓的時間(小時)
P：水壓(Pa)
X：中空纖維膜之內表面之面積(m2)
使用平膜等與中空纖維相異形狀之膜的情形，亦同樣地，於塑膠等之容器，設置入口及出口。此時，以無通過膜以外的路徑的方式，將路徑以膜塞住的方式，作成模組。自膜之一方的表面至反對側之方向，由入口側，與上述記載之條件同樣地，施加1.3×104Pa之水壓，測定由膜之另一面之表面流出的每單位時間之水量，藉由上述之式，可算出「分離膜之透水性」。此情形，上述式9中之X係於路徑內與水接觸的部分之分離膜之表面積(m2)，通常可認為係路徑之剖面面積。
(2)中空纖維膜內徑測定
中空纖維膜內徑Ri可以下式求得。
Ri(μm)=Ro-2×Y‧‧‧‧式10
Ro：中空纖維膜外徑(μm)
Y：中空纖維膜厚(μm)
「中空纖維膜外徑」係將隨機選出的複數(例如16根)之中空纖維膜之外徑，以雷射位移計(laser displacement gauge，例如，可使用LS5040T(KEYENCE股份有限公司)等)各自測定的值之平均值。「中空纖維膜厚」係隨機選出的複數(例如，16根)之中空纖維膜之膜厚，以Microwatcher之1000倍透鏡(例如，可使用VH-Z100(KEYENCE股份有限公司)等)各自測定的值之
平均值。
(3)膜表面之孔徑及開孔率測定
「於表面存在的孔之平均孔徑」可藉由以下之方法加以測定及算出。首先，以掃描型電子顯微鏡(例如，可使用S-800(日立製作所)等)拍攝分離膜之表面之10000倍影像。此時，影像之明亮度、對比係使用裝置之自動機能。其次，使用周知之軟體(例如，可使用微軟小畫家(Microsoft Paint，Microsoft Ltd.)等)，將孔之部分塗黑。之後，進行二值化，使用周知之軟體(例如，可使用Matrox Inspector2.2(Matrox Electronic Systems Ltd.)等)，進行將孔之部分反白，使此以外之部分反黑之影像處理，求得白色孔之個數(以下，「總開孔數」)及白色孔之部分之像素數之總和(以下，「總開孔面積」)，藉由以下之式11，算出每一張影像之平均孔徑。將此等之測定作業，例如每中空纖維5根，各自隨機於10處，共計重覆50次，獲得全部50張影像之平均值，可將其作為「於內表面存在的孔之平均孔徑」。又，比較白與黑之二值化的影像與原始相片，進行確認孔是否未偏移。掃描型電子顯微鏡像中，於孔洞裡亦經常可確認孔(參照第1圖A)，此種情形，將最表面之孔優先進行影像處理(參照第1圖B)，算出「於表面存在的孔之平均孔徑」。又，即使未拍攝孔之全體，而邊緣被切除的情形，於拍攝影像處亦作為算出對象。此外，孔徑為低於0.05μm之孔，因有雜訊的可能性，不作為算出對象。
平均孔徑(μm)=總開孔面積/總開孔數‧‧‧‧式11
又，上述之10000倍影像之拍撮條件，例如可如以下所示。
[拍撮條件]
影像大小：655×740像素
影像解析度：0.0143μm/像素
影像面積：93.0μm2(縱9.37μm×橫9.93μm平方)
過濾血小板溶液時，透水性之劣化為少者為宜。就對透水性有很大影響的要素之一者而言，可舉例分離膜表面之開孔率。膜表面之開孔率係藉由與上述之「表面存在的孔之平均孔徑」相同之方法來測定，藉由以下之式12，算出每1張影像之開孔率。將此等之測定作業，例如每5根中空纖維，各自隨機於10處，重覆共計50次，獲得全部50張影像之平均值，可將其作為「表面之開孔率」。
開孔率(%)=總開孔面積/影像大小×100‧‧‧‧式12
(4)親水性聚合物之存在率測定
使與血小板溶液接觸側之膜表面露出，以超純水沖洗後，於室溫、0.5托(Torr)，使乾燥10小時，將其作為測定樣品。將樣品設置於X射線光電子光譜裝置(例如，可使用Thermo Fisher Scientific公司製之ESCALAB220i-XL等)，調整相對於X射線之入射角之檢測器之角度而將測定角作成90°來進行測定。由獲得的C1s、N1s及S2p之各自頻譜之面積強度、以及附屬於裝置之相對感度係數，求得自中空纖維膜之外表面起至約10nm深度為止的碳原子、氮原子及硫原子之存在比率。
於此，例如，「與血小板溶液接觸之側的膜表面中的親水性聚合物」為PVP的情形，將測定角作成90°而以XPS測定，藉由調查自分離膜之與血小板溶液接觸之側的膜表面起至約10nm之深度中的碳原子、氮原子及硫原子之存在比率，由以下之式13，可算出分離膜最表層部分之親水性聚合物之存在量。
分離膜最表層部分之親水性聚合物之存在量(質量%)=N×111/(N×111+S×442)‧‧‧‧式13
N：氮原子之存在比率
S：硫原子之存在比率
111：PVP之重複單元數
442：聚碸系聚合物之重複單元數
(5)CD62P陽性血小板比率測定
使用流式細胞儀的CD62P陽性血小板比率之測定係於置換人工保存液之血小板溶液製造後5分鐘以內進行採樣，使用1%三聚甲醛/PBS溶液進行固定化，將固定化後12小時以上至1週以內之固定化完成的血小板使用作為測定試料。測定試料以PBS洗淨，調整血小板數後，準備(i)添加抗活性化非依存性之血小板特異標記的抗體之CD61抗體與對照IgG的樣品，及(ii)添加CD61抗體與CD62P抗體的樣品。(i)及(ii)之樣品，於添加抗體後，靜置於暗處20分鐘。之後，(i)及(ii)之樣品各自添加以純水10倍稀釋之固定試藥Becton Dickinson公司製CellFix，並靜置一晚。之後，於各自樣品中添加PBS，以2000×g、10分鐘之條件離心，並進行洗淨。關於測定，首先，使
用(i)之樣品，藉由流式細胞儀除了依散射光樣式之血小板柵門外，亦使用CD61之螢光標識，設定血小板柵門。之後，以對照組IgG之螢光標識，使血小板之0.5%~1.0%成為陽性的方式，設定截止線(cut off line)。維持固定柵門及截止線的狀態將樣品變換為(ii)而同樣地測定，將超過截止線的血小板數之比率作為CD62P陽性血小板比率。
(6)使用BCA法的蛋白質濃度測定
使用BCA法的蛋白質濃度只要使用各公司販售的BCA套組即可簡便地測定。將血小板溶液及置換人工保存液之血小板溶液於5分鐘以內採樣，使用採樣後至24小時以內者。關於測定樣品，將採樣的血小板溶液及置換人工保存液之血小板溶液以2000×g、10分鐘之條件離心分離，將去除血小板的上清液作為測定樣品。測定樣品保存於4℃，測定係於採樣後至1週以內進行。關於測定，首先調製BCA試藥與校正曲線用之樣品。依據套組之說明書，於校正曲線用樣品或測定樣品添加BCA試藥，於室溫使用微攪拌機攪拌30秒。之後，於37℃保溫30分鐘，將樣品溫度降低至室溫後，測定波長562nm中的樣品之吸光度。測定吸光度的波長即使未嚴格地相同，只要於其附近之波長±20nm左右的範圍內即可。自校正曲線樣品，畫出蛋白質濃度與吸光度之校正曲線，藉由將測定樣品之吸光度代入校正曲線之式中，可求得測定樣品之蛋白質濃度。
以下，列舉實施例以詳細說明本發明，但本發明並未限於此等例。又，透水性、中空纖維膜內徑、膜表面之孔徑及開孔率、親水性聚合物之存在量、CD62P陽性血小板比率、以及蛋白質濃度之測定係如上述(1)~(6)記載之方法來實施。
(中空纖維膜之調製)
將包含15份之UDEL(註冊商標)聚碸(P3500；Solvay公司)、8份之PVP(K90；ISP公司)、75份之二甲基乙醯胺(以下，「DMAc」)及2份之水之混合物於90℃混合溶解後，將保溫於50℃者作成製膜原液。又，於包含80份之DMAC及20份之水的混合溶液中，添加30份之PVP(K30；ISP公司)並混合溶解者作為芯液。
外徑1.0mm/內徑0.7mm之孔口式(orifice type)雙層圓筒型紡嘴，自外側之筒將製膜原液、自內側之筒將芯液各自同時地吐出，通過設定於30℃的長度80mm之乾燥部後，使浸漬於置入包含90份之水及10份之DMAC之混合溶液的90℃之凝固浴而使凝固，再於80℃之溫水浴中以溫水洗淨後卷取於卷軸，獲得濕潤狀態之中空纖維膜。又，將製膜速度設為40m/分鐘的結果，中空纖維膜內徑成為300μm、中空纖維膜之膜厚成為80μm。於該中空糸內表面，使用場致發射型掃描型電子顯微鏡S-800(日立製作所)，拍攝10000倍影像。此時，影像之明亮度、對比係使用裝置之自動機能。其次，使用微軟小畫家(Microsoft Paint，Microsoft Ltd.)，將孔之部分塗黑。二值化後，使用Matrox Inspector2.2(Matrox
Electronic Systems Ltd.)，進行將孔之部分反白，除此以外之部分反黑的影像處理，求得白色孔之個數及白色孔之部分之總開孔面積，藉由式11，算出每1個影像之平均孔徑。將此等測定作業，每中空纖維5根各自隨機於10個處，共計重覆50次，獲得全部50張影像之平均值。第1圖A呈現代表性的電子顯微鏡觀察像，第1圖B呈現代表性的電子顯微鏡觀察像二值化處理的影像。
將獲得的濕潤狀態之中空纖維膜切斷成0.4m長度作成小份，於90℃之溫水浴鐘浸漬30分鐘並以溫水洗淨後，於100℃進行10小時之乾燥處理，再藉由乾熱乾燥機，於170℃進行5小時之加熱交聯處理，獲得中空纖維膜。
(實施例1)
使用由聚碸與PVP而成的中空纖維膜作為分離膜。
由中空纖維膜，如以下方式製作中空纖維膜模組(血小板溶液用分離膜模組)。首先，於18×310mm之筒狀塑膠模組中插入藉由上述製膜操作所獲得的528根中空纖維膜之束，將其浸漬至60質量%甘油水溶液後，於50℃乾燥一晝夜。接著，於設置於離心機的塑膠模組之兩端各自注入胺基甲酸樹脂，即灌封材5mL，以60G/15分鐘回轉(第1次的灌封)。其15分鐘後，再於塑膠模組之兩端各自注入灌封材10mL，再以60G/15分鐘回轉(第二次的灌封)，而製作中空纖維膜模組。
中空纖維膜內徑為300μm、膜面積為0.144m2、透水性為75mL/hr/Pa/m2、於內表面存在的開孔率為
17.3%、孔之平均孔徑為0.90μm、於內表面存在的親水性聚合物之存在量為54.2%。
使用製作的中空纖維膜模組，進行血小板溶液之過濾。具體而言，首先，於Terumo公司製Salacet F(註冊商標)746.2mL中添加大塚製藥公司製Meylon(註冊商標)52.2mL、Terumo公司製ACD-A液126.8mL、大塚製藥公司製硫酸Mg補正液(1mEq/ml)3.2mL、大塚製藥公司製蒸餾水71.6mL，並加以混合，作為人工保存液而調製M-sol。又，預先測定原來血小板溶液中之血小板數。
將含血小板2.0×1011個的血小板溶液600mL(血小板濃度為33×107個/mL)，使用血液幫浦，設定為67.2mL/分鐘，施加內壓而進行交叉流過濾(過濾步驟)。血小板溶液之黏度為1.6mPa‧s。又，此時之過濾速度係60.5mL/分鐘，入口管壁剪切率係800秒-1，每單位面積之過濾流量係60.5×60(mL/hr)÷0.144(m2)=25208mL/hr/m2，TMP係3.0×103Pa。
藉由此處理，血小板溶液通過中空纖維內側而被過濾，獲得濃縮血小板溶液60mL(過濾步驟)。之後，將M-sol以67.2mL/分鐘流入中空纖維內側而將溶有血小板之人工保存液回收(回收步驟)。然後，將此人工保存液與濃縮血小板溶液混合，而調製200mL之置換人工保存液之血小板溶液(混合步驟)。獲得的置換人工保存液之血小板溶液自原本之血小板溶液去除血漿蛋白質87%。血小板回收率為93%，置換人工保存液之血小板溶液之CD62P陽性血小板比率為10%，亦可觀察到旋渦。
(實施例2)
使用由聚碸及PVP而成之中空纖維膜作為分離膜。
由中空纖維膜，如以下方式製作中空纖維膜模組(血小板溶液用分離膜模組)。首先，於10×220mm之筒狀塑膠模組中插入經由上述製膜操作所獲得的50根之中空纖維膜束，將其浸漬於60質量%甘油水溶液後，於50℃乾燥一晝夜。接著，於設置於離心機的塑膠模組之兩端各自注入胺基甲酸樹脂，即灌封材0.5mL，以60G/15分鐘回轉(第1次的灌封)。其15分鐘後，再於塑膠模組之兩端各自注入灌封材1.7mL，再以60G/15分鐘回轉(第二次的灌封)，而製作中空纖維膜模組。
中空纖維膜內徑為300μm、膜面積為0.0094m2、透水性為75mL/hr/Pa/m2、於內表面存在的開孔率為17.3%、孔之平均孔徑為0.90μm、於內表面存在的親水性聚合物之存在量為54.2%。
使用製作的中空纖維膜模組，進行血小板溶液之過濾。具體而言，首先，於Terumo公司製Salacet F 746.2mL中添加大塚製藥公司製Meylon 52.2mL、Terumo公司製ACD-A液126.8mL、大塚製藥公司製硫酸Mg補正液(1mEq/ml)3.2mL、大塚製藥公司蒸餾水71.6mL，並加以混合，作為人工保存液而調製M-sol。又，預先測定原來血小板溶液中之血小板數。
將含血小板1.78×1010個的血小板溶液16.2mL(血小板濃度為110×107個/mL)，使用血液幫浦，設定為3.2mL/分鐘，施加內壓而進行交叉流過濾(過濾步
驟)。血小板溶液之黏度為1.9mPa‧s。又，此時之過濾速度為2.5mL/分鐘，入口管壁剪切率為400秒-1、每單位面積之過濾流量為2.5×60(mL/hr)÷0.0094(m2)=15957mL/hr/m2、TMP為4.5×103Pa。
藉由此處理，血小板溶液通過中空纖維內側而被過濾，獲得濃縮血小板溶液3.24mL。之後，將M-sol以3.2mL/分鐘流入中空纖維內側而將溶有血小板之人工保存液回收(回收步驟)。然後，將此人工保存液與濃縮血小板溶液混合，而調製16.2mL之置換人工保存液之血小板溶液(混合步驟)。獲得的置換人工保存液之血小板溶液自原本之血小板溶液去除血漿蛋白質73%。血小板回收率為94%，置換人工保存液之血小板溶液之CD62P陽性血小板比率為30%，亦可觀察到旋渦。
(實施例3)
與實施例1相同使用由聚碸與PVP而成之中空纖維膜作為分離膜。又，與實施例1同樣地製作中空纖維膜模組。
使用製作的中空纖維膜模組，進行血小板溶液之過濾。具體而言，首先，於Terumo公司製Salacet F 746.2mL中添加大塚製藥公司製Meylon 52.2mL、Terumo公司製ACD-A液126.8mL、大塚製藥公司製硫酸Mg補正液(1mEq/ml)3.2mL、大塚製藥公司製蒸餾水71.6mL，並加以混合，作為人工保存液而調製M-sol。又，預先測定原來血小板溶液中之血小板數。
將含血小板2.0×1011個的血小板溶液200mL(
血小板濃度為100×107個/mL)，使用血液幫浦，設定為7.5mL/分鐘，施加內壓而進行交叉流過濾(過濾步驟)。血小板溶液之黏度為1.9mPa‧s。又，此時之過濾速度為6.0mL/分鐘，入口管壁剪切率為100秒-1、每單位面積之過濾流量為6.0×60(mL/hr)÷0.144(m2)=2500mL/hr/m2、TMP為5.0×102Pa。
藉由此處理，血小板溶液通過中空纖維內側而被過濾，獲得濃縮血小板溶液80mL(過濾步驟)。之後，將M-sol以7.5mL/分鐘流入中空纖維內側而將溶有血小板之人工保存液回收(回收步驟)。然後，將此人工保存液與濃縮血小板溶液混合，而調製200mL之置換人工保存液之血小板溶液(混合步驟)。獲得的置換人工保存液之血小板溶液自原本之血小板溶液去除血漿蛋白質76%。血小板回收率為95%，置換人工保存液之血小板溶液之CD62P陽性血小板比率為20%，亦可觀察到旋渦。
(比較例1)
使用由聚碸及PVP而成之中空纖維膜作為分離膜。
由中空纖維膜，如以下方式製作中空纖維膜模組(血小板溶液用分離膜模組)。首先，於10×220mm之筒狀塑膠模組中插入經由上述製膜操作所獲得的50根之中空纖維膜束，將其浸漬於60質量%甘油水溶液後，於50℃乾燥一晝夜。接著，於設置於離心機的塑膠模組之兩端各自注入胺基甲酸樹脂，即灌封材0.5mL，以60G/15分鐘回轉(第1次的灌封)。其15分鐘後，再於塑膠模組之兩端各自注入灌封材1.7mL，再次以60G/15分鐘回
轉(第2次的灌封)，而製作中空纖維膜模組。
中空纖維膜內徑為300μm、膜面積為0.0094m2、透水性為75mL/hr/Pa/m2、於內表面存在的開孔率為17.3%、孔之平均孔徑為0.90μm、於內表面存在的親水性聚合物之存在量為54.2%。
使用製作的中空纖維膜模組，進行血小板溶液之過濾。具體而言，首先，於Terumo公司製Salacet F 746.2mL中添加大塚製藥公司製Meylon 52.2mL、Terumo公司製ACD-A液126.8mL、大塚製藥公司製硫酸Mg補正液(1mEq/mL)3.2mL、大塚製藥公司製蒸餾水71.6mL，並加以混合，作為人工保存液而調製M-sol。又，預先測定原來血小板溶液中之血小板數。
將含血小板1.78×1010個的血小板溶液16.2mL(血小板濃度為110×107個/mL)，使用血液幫浦，設定為15.9mL/分鐘，施加內壓而進行交叉流過濾(過濾步驟)。血小板溶液之黏度為1.9mPa‧s。又，此時之過濾速度為12.7mL/分鐘，入口管壁剪切率為2000秒-1，每單位面積之過濾流量為12.7×60(mL/hr)÷0.0094(m2)=81063mL/hr/m2，TMP為7.0×103Pa。
藉由此處理，血小板溶液通過中空纖維內側而被過濾，獲得濃縮血小板溶液4.2mL。之後，將M-sol以15.9mL/分鐘流入中空纖維內側而將溶有血小板之人工保存液回收(回收步驟)。然後，將此人工保存液與濃縮血小板溶液混合，而調製16.2mL之置換人工保存液之血小板溶液(混合步驟)。獲得的置換人工保存液之血小
板溶液自原本之血小板溶液去除血漿蛋白質61%。血小板回收率為86%，置換人工保存液之血小板溶液之CD62P陽性血小板比率為65%，無法觀察到旋渦。(A×B)/(γ×μP)之值未超過2.5×1013，但因入口管壁剪切率超過，血小板之活性變得很大的結果，由於許多血小板附著於膜上且阻塞，可認為或許蛋白質去除率變低。
(比較例2)
使用由聚碸與PVP而成之中空纖維膜作為分離膜。
由中空纖維膜，如以下方式製作中空纖維膜模組(血小板溶液用分離膜模組)。首先，於10×120mm之筒狀塑膠模組中插入經由上述製膜操作所獲得的50根中空纖維膜束，將其浸漬於60質量%甘油水溶液後，於50℃乾燥一晝夜。接著，於設置於離心機的塑膠模組之兩端各自注入胺基甲酸樹脂，即灌封材0.5mL，以60G/15分鐘回轉(第1次的灌封)。其15分鐘後，再於塑膠模組之兩端各自注入灌封材1.7mL，再以60G/15分鐘回轉(第二次的灌封)，而製作中空纖維膜模組。
中空纖維膜內徑為300μm、膜面積為0.0047m2、透水性為75mL/hr/Pa/m2、於內表面存在的開孔率為17.3%、孔之平均孔徑為0.90μm、於內表面存在的親水性聚合物之存在量為54.2%。
使用製作的中空纖維膜模組，進行血小板溶液之過濾。具體而言，首先，於Terumo公司製Salacet F 746.2ml中添加大塚製藥公司製Meylon 52.2mL、Terumo公司製ACD-A液126.8mL、大塚製藥公司製硫酸Mg補正
液(1mEq/mL)3.2mL、大塚製藥公司製蒸餾水71.6mL，並加以混合，作為人工保存液而調製M-sol。又，預先測定原來血小板溶液中之血小板數。
將含血小板8.9×109個的血小板溶液8.1mL(血小板濃度為110×107個/mL)，使用血液幫浦，設定為5.6mL/分鐘，施加內壓而進行交叉流過濾(過濾步驟)。血小板溶液之黏度為1.9mPa‧s。又，此時之過濾速度為3.9mL/分鐘，入口管壁剪切率為700秒-1，每單位面積之過濾流量為3.9×60(mL/hr)÷0.0047(m2)=49787mL/hr/m2，TMP為1.0×104Pa。
藉由此處理，血小板溶液通過中空纖維內側而被過濾，獲得濃縮血小板溶液4.1mL。之後，將M-sol以5.6mL/分鐘流入中空纖維內側而將溶有血小板之人工保存液回收(回收步驟)。然後，將此人工保存液與濃縮血小板溶液混合，而調製8.1mL之置換人工保存液之血小板溶液(混合步驟)。獲得的置換人工保存液之血小板溶液自原本之血小板溶液去除血漿蛋白質40%。血小板回收率為60%，置換人工保存液之血小板溶液之CD62P陽性血小板比率為45%，亦可觀察到旋渦。此係入口管壁剪切率為低，但因(A×B)/(γ×μP)之值超過2.5×1013，有形成濾餅層，可推測蛋白質之去除率及血小板回收率變低。此外，由於濾餅層形成，推測某程度上血小板被活性化。
上述實施例及比較例之各種數值資料彙整於表1。
Claims (11)
- 一種置換人工保存液之血小板溶液之製造方法，其具備過濾步驟及混合步驟；該過濾步驟係於下述之式1之條件下，使用與血小板溶液接觸的面之平均孔徑為0.1μm以上且小於2.0μm之分離膜，以25~1500s-1之入口管壁剪切率(wall shear rate)將前述血小板溶液交叉流過濾(cross flow filtration)而獲得濃縮血小板溶液；該混合步驟係將前述濃縮血小板溶液與人工保存液混合而獲得置換人工保存液之血小板溶液；1.0×1011<(A×B)/(γ×μP)≦2.5×1013(個/(hr‧m2‧Pa))‧‧‧‧式1A：血小板溶液所含的血小板濃度(個/mL；惟，8.0×107~200×107個/mL)B：每單位面積之過濾流量(mL/hr/m2)γ：入口管壁剪切率(s-1)μP：血小板溶液之黏度(Pa‧s)。
- 一種置換人工保存液之血小板溶液之製造方法，其具備過濾步驟、回收步驟及混合步驟；該過濾步驟係於下述之式1之條件下，使用與血小板溶液接觸的面之平均孔徑為0.1μm以上且小於2.0μm之分離膜，以25~1500s-1之入口管壁剪切率將前述血小板溶液交叉流過濾而獲得濃縮血小板溶液；該回收步驟係使人工保存液與前述分離膜接觸，將於前述過濾步驟中未回收於濃縮血小板溶液中的血小板回收於前述人工保存液中，而獲得含有血小板之 人工保存液；該混合步驟係將前述濃縮血小板溶液與前述含有血小板之人工保存液混合而獲得置換人工保存液之血小板溶液；1.0×1011<(A×B)/(γ×μP)≦2.5×1013(個/(hr‧m2‧Pa))‧‧‧‧式1A：血小板溶液所含的血小板濃度(個/mL；惟，8.0×107~200×107個/mL)B：每單位面積之過濾流量(mL/hr/m2)γ：入口管壁剪切率(s-1)μP：血小板溶液之黏度(Pa‧s)。
- 如請求項1或2之製造方法，其蛋白質去除率為60%以上，且置換人工保存液之血小板溶液之CD62P陽性血小板比率為60%以下。
- 如請求項1至3中任一項之製造方法，其中該過濾步驟中的透膜壓差(transmembrane pressure difference)為5.0×103Pa以下。
- 如請求項1至4中任一項之製造方法，其中該分離膜之透水性為35~150mL/hr/m2/Pa。
- 如請求項1至5中任一項之製造方法，其中該分離膜為中空纖維膜(hollow fiber membrane)。
- 如請求項6之製造方法，其中該交叉流過濾係內壓式交叉流過濾。
- 如請求項6或7之製造方法，其中該中空纖維膜之內徑為100~500μm。
- 如請求項6至8中任一項之製造方法，其中該中空纖維膜之有效長度為5~50cm。
- 如請求項1至9中任一項之製造方法，其中該分離膜係含有親水性聚合物，且將該分離膜之與血小板溶液接觸的面以測定角90°藉由X射線電子光譜法來測定時，該親水性聚合物之存在量為30~60質量%。
- 一種濃縮血小板溶液之製造方法，其具備過濾步驟：於下述之式1之條件下，使用與血小板溶液接觸的面之平均孔徑為0.1μm以上且小於2.0μm之分離膜，以25~1500s-1之入口管壁剪切率將該血小板溶液交叉流過濾而獲得濃縮血小板溶液；1.0×1011<(A×B)/(γ×μP)≦2.5×1013(個/(hr‧m2‧Pa))‧‧‧‧式1A：血小板溶液所含的血小板濃度(個/mL；惟，8.0×107~200×107個/mL)B：每單位面積之過濾流量(mL/hr/m2)γ：入口管壁剪切率(s-1)μP：血小板溶液之黏度(Pa‧s)。
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