TW201348249A - 多胜肽、編碼該多胜肽之核酸分子、以及該多胜肽之應用 - Google Patents

多胜肽、編碼該多胜肽之核酸分子、以及該多胜肽之應用 Download PDF

Info

Publication number
TW201348249A
TW201348249A TW101117779A TW101117779A TW201348249A TW 201348249 A TW201348249 A TW 201348249A TW 101117779 A TW101117779 A TW 101117779A TW 101117779 A TW101117779 A TW 101117779A TW 201348249 A TW201348249 A TW 201348249A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
peptide
amino acid
acid sequence
irbp
Prior art date
Application number
TW101117779A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI588153B (zh
Inventor
Tin-Yun Ho
Chien-Yun Hsiang
Original Assignee
Univ China Medical
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ China Medical filed Critical Univ China Medical
Priority to TW101117779A priority Critical patent/TWI588153B/zh
Priority to CN201610900684.XA priority patent/CN106977593A/zh
Priority to CN201210164364.4A priority patent/CN103421086B/zh
Priority to US13/557,374 priority patent/US8697649B2/en
Priority to EP15169670.5A priority patent/EP2940035B1/en
Priority to EP12179926.6A priority patent/EP2664622B1/en
Priority to JP2012198300A priority patent/JP5676538B2/ja
Publication of TW201348249A publication Critical patent/TW201348249A/zh
Priority to US14/160,791 priority patent/US9029326B2/en
Priority to JP2014263136A priority patent/JP5947872B2/ja
Application granted granted Critical
Publication of TWI588153B publication Critical patent/TWI588153B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

一種多胜肽、編碼該多胜肽之核酸分子、以及包含該多胜肽之醫藥組合物，其中，該多胜肽具如說明書之定義，可與胰島素受體結合，且具有降血糖、降低醣化血色素及減少糖尿病肝腎病變等功效。

Description

多胜肽、編碼該多胜肽之核酸分子、以及該多胜肽之應用
本發明係關於一種多胜肽及其用途，尤其係關於一種可與胰島素受體結合且具有降血糖、降低醣化血色素及/或減少糖尿病肝腎病變等功效之多胜肽及其用途。
糖尿病為慢性的代謝異常之疾病，主要原因係由於體內胰島素缺乏或功能不全，或者是因先天的基因加上後天環境造成周邊組織的胰島素抗性，以致於對醣類的利用能力減低，甚至完全無法利用，進而造成體內血糖過高及蛋白質與脂肪代謝的異常。此外，糖尿病會衍生慢性併發症，包括：眼底病變、神經病變(包含運動神經、感覺神經、及自主神經)、肝腎病變、糖尿病足、以及大血管病變(包含腦血管障礙、冠狀動脈病變、及週邊血管阻塞)等。
根據世界衛生組織(World Health Organization，WHO)的相關統計顯示，糖尿病患者的總數一直呈現驚人的成長，從1985年到2000年，全球糖尿病患者的總數已經由三千萬人增加到超過一億七千一百萬人。WHO更進一步指出，預估到2030年時，全球罹患糖尿病的總人口將突破三億四千六百萬人。且根據統計，美國於糖尿病及其併發症所耗的醫療保健費用，由1997年的四百四十億美金至2007年攀升到一千七百四十億美金。由此可知，糖尿病係一影響全球人類健康甚鉅之疾病，是故，研發可有效調整血糖的物質或藥劑乃維繫人類健康之一重要課題。
有關糖尿病之治療，自1922年以後，主要係利用胰島素來進行，然而，胰島素的缺乏僅是胰臟功能異常之部分現象，並非糖尿病之完整病因。因此，僅使用胰島素來治療糖尿病，所達成之療效有限。
除胰島素之外，根據藥物的作用機制，習知降血糖藥物可分為五大類：一、磺醯尿素(sulfonylureas，SU)類，可促進胰臟分泌胰島素及增加組織細胞之胰島素的接受器；二、安息香酸衍生物，可刺激胰島素之分泌；三、雙胍(biguanides)類，可抑制胃腸吸收糖分、抑制肝臟製造糖分、及促進組織利用糖分；四、α-葡萄糖酶抑制劑(α-glucosidase inhibitors)，可抑制雙糖分解為腸道可吸收之單糖；五、胰島素敏感劑，可降低周邊組織與肝臟細胞對胰島素的阻抗性。然而，上述藥物各具不同副作用。舉例而言，磺醯尿素類藥物會使病患發生皮疹及低血糖之現象；安息香酸衍生物會導致低血糖；雙胍類藥物會造成胃腸不適及乳酸中毒；α-葡萄糖酶抑制劑會使病患胃腸不適；而胰島素敏感劑則會導致肝功能異常及肝細胞傷害。綜上所述，開發具降血糖療效且低副作用之藥物係急迫須要的。
與一般化合物相較，多胜肽因具較佳之生物可代謝性及生物可接受性，故較可符合低副作用之需求。是以，近數十年來，全世界已研究許多不同的多胜肽，並運用於臨床治療中。例如台灣專利第I283684號，揭露類昇糖素胜肽-1(Glucagon Like Peptide-1)之類似物具有降血糖之療效；美國專利第7,393,919號，則教導利用人類胰島胜肽(Human prolslet Peptide，HIP)作為降血糖之藥 物，其中HIP係胰臟炎相關蛋白前驅物(pancreatitis-associated protein precursor)之活性片段。
經發現，具降血糖活性之多胜肽可自植物萃取物中取得。例如，美國專利第6,127,338號，揭露自苦瓜中取得具降血糖活性之多胜肽。根據該專利文獻，具有降血糖活性之多胜肽其胺基酸序列為KTNMKHMAGAAAAGAVVG，且分子量小於10千達爾頓。
儘管已有多種調節血糖之藥物，至今對於可成功地治療不同致病機制之糖尿病的單一或組合之治療方式或醫藥組合物，仍存在迫切的需求。
本發明係針對上述需求所為之研究，提供一種新穎多胜肽，其可與胰島素受體結合，並具有降血糖、降低醣化血色素及減少糖尿病肝腎病變等功效，尤其可用於治療糖尿病。
本發明之一目的在於提供一種多胜肽，其係具有一選自下列群組之SEQ ID NO：1的片段胺基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、及SEQ ID NO：6。
本發明之另一目的在於提供一種多胜肽，其係具有一下列SEQ ID NO：7胺基酸序列或其進行單一胺基酸之取代所衍生之同源性胺基酸序列：IVARPPTIG(SEQ ID NO：7)；其中，該同源性胺基酸序列係具有選自由SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：178所組成之群組中的任一胺基酸序列。
本發明之又一目的在於提供一種多胜肽，其係具有一選自下列群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、及SEQ ID NO：188。
本發明之再一目的在於提供一種多胜肽，其係具有一下列胺基酸序列或其進行單一胺基酸之取代所衍生之同源性胺基酸序列：RYKYQX1X2YI(SEQ ID NO：189)；其中X1為胱胺酸或色胺酸，X2為苯丙胺酸或色胺酸。
本發明之再一目的在於提供一種經單離之核酸分子，其係編碼上述多胜肽。
本發明之再一目的在於提供一種可與胰島素受體結合，並用於降血糖、降低醣化血色素及減少糖尿病肝腎病變等之醫藥組合物，其係包含上述多胜肽及一醫藥上可接受之載劑。
本發明之詳細技術及較佳實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
以下將具體地描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明之精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。此外，除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式。
本文所述之「同源性胺基酸序列」，除非特別說明，否則係指於一多胜肽之胺基酸序列中，進行單一或多個胺基酸之取代所衍生之胺基酸序列。此外，本文所述之「同源性多胜肽」，除非特別說明，否則係指於一多胜肽之胺基酸序列中，進行單一或多個胺基酸之取代所衍生之多胜肽同源物(homologues)。
已知於細胞中，當如胰島素之配體(ligand)與胰島素受體結合後，會引發胰島素受體自體磷酸化，進而啟動下游訊息傳導反應，引發相關基因之轉錄及轉譯作用，並使細胞啟動葡萄糖轉運效應，從而降低細胞外或血液中之葡萄糖濃度，據以達成降血糖之效果。
本案發明人研究發現，將具有SEQ ID NO：1所示胺基酸序列(共68個胺基酸)之多胜肽分割成不同片段，或進一步經由單點或多點突變技術，可提供各種多胜肽。該等多胜肽可與胰島素受體結合，且可降低血糖值、降低醣化血色素及/或減少糖尿病肝腎病變。於不受理論限制下，咸信本發明多胜肽係經由與胰島素受體結合後，引發胰島素受體自體磷酸化之機制而達成上述功效。
因此，本發明係提供一種第一多胜肽，其係自SEQ ID NO：1所示胺基酸序列(共68個胺基酸)之多胜肽分割而得，具有一選自下列群組之SEQ ID NO：1的片段胺基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、及SEQ ID NO：6。較佳地，該第一多胜肽之胺基酸序列係SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6。其中，SEQ ID NO：2為SEQ ID NO：1所示胺基酸序列之第1至19個胺基酸的片段胺基酸序列；SEQ ID NO：3為SEQ ID NO：1所示胺 基酸序列之第17至35個胺基酸的片段胺基酸序列；SEQ ID NO：4為SEQ ID NO：1所示胺基酸序列之第34至52個胺基酸的片段胺基酸序列；SEQ ID NO：5為SEQ ID NO：1所示胺基酸序列之第45至68個胺基酸的片段胺基酸序列；而SEQ ID NO：6為SEQ ID NO：1所示胺基酸序列之第55至68個胺基酸的片段胺基酸序列。
於下文中，將本發明多胜肽稱為「胰島素受體結合蛋白(insulin receptor-binding protein)」，或簡稱為「IRBP」。例如，本發明具有SEQ ID NO：1所示68個胺基酸構成之胺基酸序列的多胜肽，係簡稱為「IRBP-1-68」，而具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列(即，SEQ ID NO：1中第1至19個胺基酸的片段胺基酸序列)的多胜肽則簡稱為「IRBP-1-19」。
本發明另提供一種第二多胜肽，其係具下列SEQ ID NO：7胺基酸序列或具SEQ ID NO：7之同源性胺基酸序列：IVARPPTIG(SEQ ID NO：7)；其中，該SEQ ID NO：7胺基酸序列為SEQ ID NO：1中第60至68個胺基酸的片段胺基酸序列(即，IRBP-60-68)，自SEQ ID NO：1所示胺基酸序列分割而得；該同源性胺基酸序列則係經由以不同胺基酸對SEQ ID NO：7胺基酸序列施以單點突變技術而提供，且具有選自由SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：178所組成之群組中的任一胺基酸序列。較佳地，該第二多胜肽係具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：21之胺基酸序列。
此外，本發明另提供一種第三多胜肽，其係分別以不同胺基酸對IRBP-60-68中各個胺基酸進行三至六點突變/取代(即，置換三 至六個胺基酸)而獲得，具有一選自下列群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、及SEQ ID NO：188。較佳地，該第三多胜肽係具有一選自下列群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、以及SEQ ID NO：186。
本發明尚提供一種第四多胜肽，其係具下列胺基酸序列或其進行單一胺基酸之取代所衍生之同源性胺基酸序列：RYKYQX1X2YI(SEQ ID NO：189)；其中X1為胱胺酸或色胺酸，X2為苯丙胺酸或色胺酸。本發明之第四多胜肽係針對IRBP-60-68中九個胺基酸皆進行置換而獲得，其亦可與胰島素受體結合而降低血糖量。於本發明之一實施態樣中，該第四多胜肽係具有SEQ ID NO：189之胺基酸序列，且較佳地，X1為胱胺酸，X2為苯丙胺酸或色胺酸。於本發明之另一實施態樣中，該第四多胜肽係具有RYKYQCFYI(SEQ ID NO：191)之胺基酸序列(即，X1為胱胺酸，X2為苯丙胺酸)，或具有對SEQ ID NO：191之胺基酸序列進行單點突變/取代所提供之同源性胺基酸序列，且該同源性胺基酸序列為SEQ ID NO：194至SEQ ID NO：364之一者。
本發明第一至第四多胜肽，皆可與胰島素受體結合，並具降血糖活性，故可用於治療糖尿病(包括第一型糖尿病與第二型糖尿病)，且可改善糖尿病患者之後續病程(例如，降低醣化血色素、治療由糖尿病所引起之肝腎病變等)。
相較於臨床上用於治療糖尿病之胰島素及台灣專利第I342781號與日本專利第4772884號中所揭露之IRBP-1-68多胜肽，本發明多胜肽具有以下優點：一、本發明多胜肽之胺基酸序列長度較短且具優異降血糖活性，故可降低製造降血糖多胜肽之成本，同時提供相似程度之藥效，從而減輕患者之經濟負擔；二、本發明多胜肽之胺基酸序列長度較短而具較低分子量，其經投予至糖尿病患者後較易於吸收，故可提升生體可用率(bioavailability)，而更有利於臨床治療；以及三、本發明多胜肽具不同長度及胺基酸組成，故可依據病患之差異性(如性別、年齡、病狀、嚴重程度、及對藥物之反應性等)而提供更具彈性之治療手段。
本發明多胜肽可自植物萃取而得，或經由人工合成方式或透過生物體之基因重組方式取得，或者經由前述操作之結合而獲得。所謂人工合成方式，係視所欲之多胜肽，透過人工方式使胺基酸依序連接，包括化學合成法或透過利用化學合成原理之胜肽合成儀所進行之合成。人工合成法通常具有以下優點：可方便地於合成過程中改變多胜肽之一級結構、加入特殊的胺基酸、以及對多胜肽之末端進行修飾等。
可用以合成本發明多胜肽之化學合成法，可分為固相合成法及液相合成法。一般而言，液相合成法必須於完成每一胺基酸之連接後，進行萃取操作。此外，由於萃取所得之多胜肽中間物通常為混合物，因此，尚須進行層析純化步驟。換言之，以液相合成法進行多胜肽之合成，通常須涉及繁瑣的萃取及層析純化步驟，才能得到高純度的產物。相對於此，固相合成法係於溶劑中，在 固體聚合物顆粒(或聚合支撐物)上進行胜肽之鍵結反應。於此方法中，係先將所欲多胜肽之N端胺基酸共價鍵結至聚合物顆粒上，其後再透過專一性鍵結之方式將後續胺基酸依序連接上，最後合成該多胜肽。由於該聚合物顆粒並不溶於溶劑中，故僅需於反應終了透過清洗及過濾操作，即可將該聚合物顆粒(以及連接在該聚合物顆粒上之所欲之多胜肽)與反應試劑及副產物分開。此即，相較於液相合成法，固相合成法只須於整個合成過程中的最終步驟進行純化操作，不僅相對方便，且可大幅縮短反應時間，於長鏈多胜肽之合成上亦較具優勢。
目前，業已開發出多種可自動合成多胜肽之裝置，例如：固相胜肽合成儀、液相胜肽合成儀、及微波胜肽合成儀等，皆可視需要選用以合成本發明多胜肽。
亦可以「基因重組」方式合成本發明多胜肽。於此，係經由將包含編碼該多胜肽之核酸的表現載體轉形至宿主細胞中，並使該核酸表現的方式製得。其中，該宿主細胞可為大腸桿菌或酵母菌，且該表現載體可選自市面上常見之載體，例如：pQStrep2、pQStrep4、pGEX-6p1、或pQTEV等。
此外，亦可自植物萃取液中取得本發明多胜肽。經發現，可自葫蘆科植物萃取液中得到可調整血糖之多種多胜肽，例如：苦瓜、山苦瓜、胡瓜、南瓜、葫蘆、西瓜、栝蔞仁、天花粉、及其組合。其中，先前研究已以蛋白質電泳證實，葫蘆科植物之萃取液中所含可調整血糖之多胜肽，屬同源性蛋白質。然而，本發明之多胜肽亦可自葫蘆科植物以外之植物取得，例如：百日菊(Zinnia elegans)、苜蓿(Medicago truncatula)、葡萄、葡萄柚、迷迭香(Sambucus nigra)、阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)、稻、及其組合。此即，本發明多胜肽的來源並不侷限於葫蘆科植物。
以苦瓜為例，可先以如下步驟取得植物萃取液，再自萃取液純化(例如：以蛋白質電泳純化法或層析純化步驟)取得本發明多胜肽。首先，於溶劑中將苦瓜離解(maceration)以得到一粗懸浮液，該溶劑可為磷酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、或水等，且可利用攪拌器或研磨器以離解苦瓜。接著，以12,000轉數/分鐘(revolution per minute，rpm)至15,000轉數/分鐘之離心轉速，將粗懸浮液中的顆粒自液相中移除，並以孔徑為0.1微米至0.5微米之濾材來過濾上清液。然後，將所得之濾液通過30千達爾頓之濾膜，並取其濾液部分，即可獲得含有本發明之多胜肽的水溶性苦瓜萃取液。其中，該濾膜可選自習知濾材產品，例如：Amicon濾膜及Millipore濾膜等。其後，再以如蛋白質電泳或層析純化方法，以分離出所欲之多胜肽，或者，可進一步視需要以特定蛋白酶分解所得之多胜肽，以切割出所欲的多胜肽片段。於此，該蛋白酶並無特殊限制，其可為例如(但不限於)絲胺酸蛋白酶、蘇胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶等。最後，可視需要添加防腐劑(例如：苯甲酸鈉或水楊酸等)，並於-80℃下保存該多胜肽。
有關上述透過蛋白質電泳分離純化法以取得本發明多胜肽之操作，包含可利用如二維凝膠電泳分離出蛋白質的方式。首先，將上述之水溶性苦瓜萃取液進行蛋白質沉澱，將收集的蛋白質沉澱物進行一維等電點聚焦(iso-electric focusing，IEF)。第二天，配 置十二基硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)之膠體，再將該膠體注入一膠槽中，並以乙醇壓平該膠體。20分鐘後，將乙醇倒出。接著，將經等電點聚焦的膠條與蛋白質分子量標準(marker)樣品分別注入樣品槽，並以110伏特之電流進行電泳。待染劑移動至該膠體底部後，結束電泳，並將膠體取出並予以染色。接著，以清洗液(wash buffer)清洗染色劑，並以褪染劑(destain buffer)進行脫色。最後，將該膠體上之等電點為9至10且分子量約為7千達爾頓至1萬達爾頓之蛋白質色帶切出後，即可取得本發明多胜肽。
此外，亦可以上述手段之組合來取得本發明多胜肽。舉例而言，可以基因重組或植物萃取之方式取得所欲多胜肽之片段，或以人工合成之方式得到完整之多胜肽。
基於本發明多胜肽之降血糖活性，本發明另提供一種可結合到胰島素受體，且具有降血糖、降低醣化血色素及/或減少糖尿病肝腎病變等功效之醫藥組合物，其係包含有效量之本發明多胜肽及一醫藥上可接受之載劑。該醫藥組合物可使用於獸醫與人類醫藥上，且可呈任何形式，並以任何合宜之方式施用。舉例言之，但不以此為限，為避免多胜肽被消化道中的酵素分解，可選用皮下或靜脈注射方式進行本發明醫藥組合物之投藥，以經由血液直接將藥物帶至釋放處。當以口服之方式進行投藥時，則可於醫藥組合物中包含吸收延遲劑，以克服胃中強酸及小腸前半部之酵素的破壞，以將藥物順利帶至釋放處。
以製備適於皮下或靜脈注射之藥劑形式為例，可於本發明醫藥組合物中含有一或多種例如等張溶液、鹽類緩衝液(如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液)、增溶劑、乳化劑、以及其他載劑等成分，以製成如靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等。
至於製備適於口服投藥之藥劑形式，則可於本發明醫藥組合物中含有不會不利影響本發明之多胜肽活性之醫藥可接受載劑，例如：溶劑、油性溶劑、稀釋劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、潤滑劑、吸濕劑等。可利用任何合宜之方法，將該組合物製成適於口服投藥的形式，例如：錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、乳劑、及酊劑等等。
本發明醫藥組合物可視需要另含有調味劑、調色劑、著色劑等添加劑，以提高所得藥劑服用時的口適感及視覺感受；另可添加合理用量之保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等，以改善所得藥劑的儲存性。視需要地，可於本發明醫藥組合物中併含一或多種其他活性成分，進一步加強本發明醫藥組合物之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度。舉例言之，可於本發明醫藥組合物含有一或多種如下活性成分：胰島素、α-葡萄糖酶抑制劑、胰島素敏感劑、以及其他活性成分等，只要該其他活性成分對本發明多胜肽之效益沒有不利的影響即可。
當使用含本發明多胜肽之醫藥組合物以降低人類或動物血糖時，可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同投藥頻率施用 本發明醫藥組合物，端視投予標的之需求而異。舉例言之，當以口服投藥於人體以治療糖尿病時，藥劑之用量，以本發明之多胜肽的用量計，可為每天約10毫克/公斥體重至約50毫克/公斤體重；若以注射之方式投藥，則其調整血糖之有效劑量可為每日注射約1奈莫耳/公斤體重至約5奈莫耳/公斤體重。其中，該單位『毫克/公斤體重』或『奈莫耳/公斤體重』係指每公斤體重所須之投藥量。惟，對於急性病患而言，其用量可視實際需要而酌增至數倍或數十倍。
本發明另提供一種經單離之核酸分子，其係編碼本發明之多胜肽。其中，該核酸分子可以習知之選殖方式獲得。舉例言之，可自植物細胞中取得基因組去氧核糖核酸(genomic deoxyribonucleic acid)後，以其作為聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)之模板，並於PCR反應結束後，純化所得之產物，以提供本發明之經單離之核酸分子。
茲以下列具體實施態樣以進一步例示說明本發明。其中該等實施態樣僅提供作為說明，而非用以限制本發明之範疇。
[實施例]
[製備實施例]
(A)多胜肽之製備：以固相合成法製備以下實施例之多胜肽，該等多胜肽係具有如後附序列表所示之SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：364之胺基酸序列。
(B)實驗小鼠：使用BALB/c(血糖代謝正常)、STZ-induced(鏈 佐黴素誘發第一型糖尿病)、及ob/ob(自發性第二型糖尿病)之三種品系的小鼠進行實驗，此等小鼠均由國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center)所提供。
[實施例1]分子嵌合分析
以下列方法進行分子嵌合(molecular docking)分析：由Protein Data Bank網站獲得胰島素受體(PDB碼為2DTG)與胰島素受體結合蛋白(即，具SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列的IRBP-1-68多胜肽，PDB碼為1VBW)之PDB檔案，接著使用分子嵌合軟體(AutoDock，3.05及4.0版本)與基於網格之嵌合程式(grid-based docking prograrms)進行分子嵌合分析，評估配體(即，IRBP-1-68多胜肽)與胰島素受體間的分子間交互作用能量(包括凡得瓦力、排斥能、氫鍵交互作用能量、庫倫靜電能量、內部空間能量(steric energy))。結果顯示於第1圖，此試驗結果顯示IRBP-1-68(第1圖中央塊狀部分)可結合至胰島素受體。
[實施例2]胰島素受體自體磷酸化試驗
已知於細胞中，如胰島素之配體與胰島素受體結合後，會引發胰島素受體自體磷酸化，進而啟動下游訊息傳導反應，引發相關基因轉錄及轉譯作用，接著使細胞啟動葡萄糖轉運效應，而降低細胞外或血液中之葡萄糖濃度。因此，本實施例以胰島素受體自體磷酸化試驗來分析IRBP-1-68多胜肽是否可引發胰島素受體自體磷酸化，以觀察其是否與胰島素受體結合。
試驗方法如下：將人類淋巴癌细胞株(IM-9)在無血清的培養 液(RPMI培養液，包含0.1%小牛血清蛋白)中培養16小時，接著在37℃下以IRBP-1-68刺激15分鐘，以冰冷PBS緩衝液沖洗後純化約250毫克之總蛋白，再以抗胰島素受體之多株抗體(C-19)進行免疫沉澱。接著在4℃下以蛋白質G洋菜膠磁珠(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)吸附所得蛋白質2小時後，以SDS-PAGE電泳分析並轉漬至Immobilon-P轉印膜後，在4℃下以抗磷酸酪胺酸抗體(4G10)孵育(incubate)至隔天，進行免疫墨點(immunoblotting)分析，結果顯示於第2圖。
於第2圖中，免疫墨點分析之條帶越寬，表示所觀察之蛋白質的量愈高；此外，第2圖中所示之磷酸化胰島素受體與胰島素受體比率隨著IRBP-1-68濃度的增加而變大。
如第2圖所示，IRBP-1-68可引發胰島素受體之自體磷酸化，說明其可結合至胰島素受體。
[實施例3]受體結合試驗：IRBP-1-68
進行全細胞受體結合試驗，以進一步確認IRBP-1-68是否可與胰島素受體結合。
首先，將1.2×106個人類淋巴癌细胞株(IM-9)與溶於1毫升PBS緩衝液(含有0.1%小牛血清蛋白)之胰島素(對照組)或IRBP-1-68之多胜肽於室溫下混合培養15分鐘，以進行競爭性試驗。接著添加經碘-125(125I)標定之胰島素(20,000每分鐘計數(cpm)/毫升)，於16℃下培養90分鐘後，將細胞冷卻並於4℃下以2000轉/分鐘之轉速離心10分鐘，取沉澱物以冰冷清洗緩衝 液(10毫莫耳濃度/公升Tris及150毫莫耳濃度/公升NaCl，pH 7.6)清洗二次後，以伽瑪計數器(Gamma Counter)計數。每一多胜肽至少重複進行三次上述試驗。多胜肽促進碘-125結合至胰島素受體之濃度(EC50)係顯示於表1，其中EC50係代表可促進50%之經碘-125標定之胰島素與胰島素受體結合之多胜肽的濃度，EC50值愈低，則促進結合之效果愈強。
如表1所示，胰島素與IRBP-1-68皆可有效促進經碘-125標定之胰島素結合至胰島素受體，其中，IRBP-1-68之EC50值為4.15±1.77奈莫耳濃度，較胰島素為低，顯示IRBP-1-68確實可與胰島素受體結合，且具有更優異之促進胰島素結合至胰島素受體的效果。
[實施例4]葡萄糖攝取試驗
由於脂肪組織可自血液中攝取葡萄糖，使血中糖量降低，此為血糖調控的關鍵步驟，因此，於此實施例中進一步以3T3-L1脂肪細胞作為試驗平台，以進行葡萄糖攝取試驗。
以24孔培養盤培養3T3-L1脂肪細胞，經過4.5小時之飢餓期間(starvation period)後，以不含胰島素(負向控制組)、含1奈莫耳濃度胰島素(控制組)、及含1奈莫耳濃度胰島素與IRBP-1-68(實驗組)之KRB緩衝液(Krebs ringer bicarbonate buffer；118 毫莫耳濃度NaCl、4.7毫莫耳濃度KCl、1.3毫莫耳濃度CaCl2、1.2毫莫耳濃度MgSO4、1.2毫莫耳濃度Na2HPO4、2%小牛血清蛋白、0.5毫莫耳濃度葡萄糖、25毫莫耳濃度NaHCO3，pH 7.4)孵育30分鐘，接著添加[3H]-2-去氧-D-葡萄糖(0.1微居里/試驗)孵育10分鐘，以冰冷PBS清洗細胞三次並回溶於0.1% SDS，以閃爍計數器(scintillation counter)分析細胞內的放射性，結果顯示於表2。
表2中胰島素之放射比率係參照Life Sciences 2004；75：2653-64，該文獻全文併於此處以供參考。如表2所示，胰島素與IRBP-1-68皆可有效促進3T3-L1脂肪細胞進行葡萄糖攝取。此試驗說明IRBP-1-68可經由促進脂肪細胞攝取葡萄糖而達成降血糖功效。
[實施例5]微陣列晶片分析
以微陣列晶片進行全基因體掃描，探討IRBP-1-68促進3T3-L1脂肪細胞進行葡萄糖攝取之可能機轉。
使用RNeasy Mini kit(Qiagen，Valencia，加州，美國)萃取經IRBP-1-68處理或未經處理之3T3-L1脂肪細胞的總RNAs，並以Agilent 2100 bioanalyzer(Agilent Technologies，Santa Clara，加州，美國)進行評估，選擇RNA完整度數值大於8.0的RNA樣品，接著進行微陣列晶片分析(可參見Cheng,W.Y.等人，2009， Comprehensive evaluation of a novel nuclear factor-B inhibitor,quinoclamine,by transcriptomic analysis.Brit.J.Pharmacol.157(5)：746-756；Cheng,H.M.等人，2010，Application of bioactivity database of Chinese herbal medicine on the therapeutic prediction,drug development,and safety evaluation.J.Ethnopharmacol.132(2)：429-437；以及Hsiang,C.Y.等人，2009，Nuclear factor-B bioluminescence imaging-guided transcriptomic analysis for the assessment of hoist-biomaterial interaction in vivo.Biomaterials 30(17)：3042-3049，該等文獻全文併於此處以供參考)，統計出表現量增加或減少達2倍以上之與胰島素訊息路徑或脂肪細胞因子(Adipocytokine)訊息路徑相關之基因的數量，結果顯示於表3。
如表3所示，IRBP-1-68在3T3-L1脂肪細胞中可經由調控與胰島素訊息路徑相關之基因的表現量，而促進脂肪細胞攝取葡萄糖，進而達成降血糖功效。
[實施例6]西方墨點分析
利用西方墨點法分析與胰島素訊息路徑相關之基因的蛋白質表現量。在37℃下培養3T3-L1脂肪細胞24小時，以IRBP-1-68處理16小時，收集並以冰冷PBS清洗細胞，以300微升樣品緩衝液(62.5毫莫耳濃度Tris-HCl，pH 6.8、2% SDS、10%甘油、50毫 莫耳濃度二硫蘇糖醇、0.1%溴酚藍)打破細胞，並以Bradford方法(Bio-Rad，Hercules，加州，美國)測定蛋白質濃度。取10微克蛋白質進行SDS-PAGE電泳分析，並轉漬至硝化纖維膜(Amersham Pharmacia Biotech公司，Piscataway，紐澤西，美國)，以封鎖緩衝液(20毫莫耳濃度Tris-HCl，pH 7.6、140毫莫耳濃度NaCl、0.1% Tween-20、5%脫脂牛奶粉末)進行封鎖，並與抗-Akt、抗-磷酸化-Akt(Ser 473)、抗-磷酸化-Akt(Thr 308)、抗-磷酸化-第10號染色體同源刪除磷酸酶及張力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on Chromosome ten，PTEN)(Ser 380)、抗-磷酸化-糖原合成酶激酶-3β(glycogensynthasekinase-3β，GSK-3β)(Ser 9)、抗-磷酸化-Raf(Ser 259)、抗-磷酸化-磷酸肌醇依賴性激酶1(phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1)(Ser 241)之抗體(Cell Signaling Technology，Beverly，麻薩諸塞州，美國)進行反應，結果顯示於第3圖，其中第3圖中所示之數值係西方墨點法分析之條帶的強度，數值愈大表示所觀察之蛋白質的量愈高。
如第3圖所示，IRBP-1-68在3T3-L1脂肪細胞中可增加PDK-1、磷酸化-AKt(Thr 308)、磷酸化-AKt(Ser 473)、葡萄糖轉運蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)等與胰島素訊息路徑相關之基因的蛋白質表現量。此試驗顯示IRBP-1-68在3T3-L1脂肪細胞中可經由調控與胰島素訊息路徑相關之基因的表現量，而具有降血糖效果。
[實施例7]免疫組織分析
以下列方法進行免疫組織染色：將3T3-L1脂肪細胞培養並固定 於蓋玻片上，接著使細胞與1：50稀釋倍數之抗葡萄糖轉運蛋白4之單株抗體(Millipore，Billerica，麻薩諸塞州，美國)孵育至隔天，於室溫下以生物素化二級抗體(Zymed Laboratories，South San Francisco，加州，美國)孵育20分鐘，接著以抗生物素蛋白-生物素複合試劑孵育，並以3，3-二氨基聯苯胺(Histostain®-Plus Kit，Zymed Laboratories，South San Francisco，加州，美國)進行染色，結果顯示於第4圖。
如第4圖所示，3T3-L1脂肪細胞之免疫組織染色結果亦顯示IRBP-1-68可以促進3T3-L1脂肪細胞表現葡萄糖轉運蛋白4。已知葡萄糖轉運蛋白4為脂肪細胞中具有轉運葡萄糖功能的蛋白質，因此，上述試驗結果說明IRBP-1-68可經由提升葡萄糖轉運蛋白4的表現量，而促進脂肪細胞轉運葡萄糖，進而達成降血糖效果。
實施例1至7之試驗顯示IRBP-1-68可與胰島素受體結合，且可促進脂肪細胞攝取葡萄糖，而達成降血糖功效。
[實施例8]受體結合試驗：IRBP-1-68的片段胺基酸序列
以與實施例2相同之實驗方法，針對具表4所示之片段胺基酸序列(SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5SEQ ID NO：6、及SEQ ID NO：7)之多胜肽進行受體結合試驗。該等多胜肽促進經碘-125標定之胰島素結合至胰島素受體之濃度(EC50)係顯示於表4。
如表4之結果所示，本發明之具有IRBP-1-68的片段胺基酸序列(即，SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：7)的多胜肽皆具有促進胰島素結合至胰島素受體的功效，其中IRBP-1-19、IRBP-50-68、及IRBP-60-68具有較佳之促進效果。此試驗說明將IRBP-1-68裁剪至19個胺基酸(即，IRBP-1-19與IRBP-50-68)、甚至9個胺基酸後仍具有結合至胰島素受體的效果。以下針對IRBP-60-68做進一步之實驗分析。
[實施例9]分子嵌合分析：IRBP-60-68進行單一胺基酸之取代所衍生之同源性多胜肽
如表5所示，以固相合成法製備具有針對IRBP-60-68進行單一胺基酸之取代所衍生之同源性胺基酸序列(SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：178)的多胜肽，並以實施例1所述之方法進行該等多胜肽之分子嵌合試驗，評估其與胰島素受體間的分子間交互作用能量(包括凡得瓦力、排斥能、氫鍵交互作用能量、庫倫靜電能量、內部空間能量)。其中，以評分7000至8000標記為「+」；評分8000 至9000標記為「++」；評分9000至10000標記為「+++」。於此，評分愈高者表示多胜肽與受體間的分子間交互作用能量愈大，且結合作用愈強。
如表5所示，具有針對IRBP-60-68進行單一胺基酸之取代所衍生 之同源性胺基酸序列(SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：178)的多胜肽皆具有不同程度之結合到胰島素受體的能力。
[實施例10]受體結合試驗：IRBP-60-68進行單一胺基酸之取代所衍生之同源性多胜肽
以如實施例3所述之方法，對表5所示之具SEQ ID NO：21之胺基酸序列的多胜肽(即，將IRBP-60-68之胺基酸序列中的蘇胺酸取代為丙胺酸所產生之同源性多胜肽；下文簡稱為「IRBP-MC」)進行受體結合試驗，結果顯示於表6。
如表6之結果所示，IRBP-60-68進行單一胺基酸之取代所衍生之IRBP-MC多胜肽促進經碘-125標定之胰島素與胰島素受體結合之濃度為0.86±0.05(奈莫耳濃度)，顯示IRBP-60-68進行單一胺基酸取代後所衍生之同源性多胜肽仍具有與胰島素受體結合的能力。
此外，如下表7所示，進一步將IRBP-60-68進行單一胺基酸之取代所衍生之同源性多胜肽進行受體結合試驗，於此，以胰島素受體酪胺酸激酶(insulin receptor tyrosine kinase)活性作為多胜肽與胰島素受體結合之活性指標，胰島素受體酪胺酸激酶活性愈高，代表多胜肽與胰島素受體結合之能力愈強。以胰島素受體酪 胺酸激酶活性評估多胜肽之受體結合能力的實驗流程為：將多胜肽與胰島素受體置於冰浴上作用30分鐘，然後加入等體積的2倍激酶緩衝液(50毫莫耳濃度HEPES，pH 7.6；50毫莫耳濃度MgCl2；200微莫耳濃度ATP；200微莫耳濃度釩酸鈉；5毫克/公升麩胺酸與酪胺酸聚合物(poly(Glu,Tyr))；50微居里[γ-32P]ATP/毫升)，置於30℃水浴槽中反應10分鐘，接著加入TCA使受質poly(Glu,Tyr)沉澱於濾紙上，再將濾紙放入貝他射線偵測器，然後由放射強度換算胰島素受體酪胺酸激酶活性。
於表7中，每組多胜肽為IRBP-60-68進行一特定胺基酸取代後所得之多胜肽混合物。例如，IRBP-60-68-1@代表IRBP-60-68之第一個胺基酸分別以精胺酸(Arg，R)、丙胺酸(Ala，A)、纈胺酸(Val，V)、苯基丙胺酸(Phe，F)、脯胺酸(Pro，P)、甲硫胺酸(Met，M)、異白胺酸(Ile，I)、白胺酸(Leu，L)、天門冬胺酸(Asp，D)、麩胺酸(Glu，E)、離胺酸(Lys，K)、甘胺酸(Gly，G)、絲胺酸(Ser，S)、蘇胺酸(Thr，T)、酪胺酸(Tyr，Y)、組胺酸(His，H)、胱胺酸(Cys，C)、天門冬醯胺酸(Asn，N)、麩醯胺酸(Gln，Q)、或色胺酸(Trp，W)進行取代後所得之多胜肽混合物(包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO134、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：170之多胜肽)。
如表7之結果所示，IRBP-60-68進行一特定胺基酸取代後所得之多胜肽混合物具有與胰島素受體結合之活性。
[實施例11]受體結合試驗：IRBP-60-68進行多點突變所衍生之同源性多胜肽
如表8所示，進一步以固相合成法製備具有IRBP-60-68進行多點突變/取代(置換3至6個胺基酸)後所衍生之同源性胺基酸序列的多胜肽，並以如實施例3所述之方法進行受體結合試驗。該等同源性多胜肽之名稱、序列、及試驗結果係顯示於表8。
如表8之結果所示，具有SEQ ID NO：179至SEQ ID NO：188之胺基酸序列的多胜肽具有促進胰島素結合至胰島素受體的功效，此顯示由IRBP-60-68進行3至6個胺基酸之取代後所衍生之同源性多胜肽仍具有促進胰島素結合至胰島素受體的功效，其中IRBP-MT、IRBP-CM、IRBP-VV-1、及IRBP-CP具有較佳之促進功效。
[實施例12]受體結合試驗：IRBP-60-68進行多點突變所衍生之同源性多胜肽
以如實施例1所示之方式，透過分子嵌合軟體進行分子嵌合分析，篩選出如表9所示之四種具有9個胺基酸長度、與胰島素受體結合能力較佳的多胜肽(胺基酸序列為SEQ ID NO：190至SEQ ID NO：193；於本說明書中簡稱為IRBP-9A至IRBP-9D)。該等多胜肽具有RYKYQX1X2YI(SEQ ID NO：189)之通式序列，其中X1為胱胺酸或色胺酸，X2為苯丙胺酸或色胺酸。將該等多胜肽以實施例10所述之方法進行受體結合試驗，並以胰島素受體酪胺酸激酶活性作為多胜肽與胰島素受體結合之能力的指標，結果顯示於表9。
表9結果顯示，IRBP-9A至IRBP-9D(SEQ ID NO：190至SEQ ID NO：193)多胜肽可與胰島素受體結合，其中以IRBP-9B為例，磷酸酶活性可高達79.76±5.64(活性單位/毫升)。
[實施例13]分子嵌合分析：IRBP-9B進行單一胺基酸之取代所衍生之同源性多胜肽
如表10所示，以固相合成法製備具有針對IRBP-9B進行單一胺基酸之取代所衍生之同源性胺基酸序列(SEQ ID NO：194至SEQ ID NO：364)的多胜肽，並以實施例1所述之方法進行該等多胜肽之分子嵌合試驗，評估多胜肽配體與胰島素受體間的分子間交互作用能量(包括凡得瓦力、排斥能、氫鍵交互作用能量、庫倫靜電能量、內部空間能量)，以評分8000至10000標記為「+」；評分10000至12000標記為「++」；評分12000至14000標記為「+++」，其中，評分愈高表示多胜肽與胰島素受體間的分子間交互作用能量愈大，且結合力愈強。
表10之結果顯示，具有針對IRBP-9B進行單一胺基酸之取代所衍生之同源性胺基酸序列(SEQ ID NO：194至SEQ ID NO：364)的多胜肽皆具有不同程度之結合到胰島素受體的能力。
[實施例14]降血糖活性試驗
將IRBP-1-68、具有IRBP片段胺基酸序列之多胜肽、以及經多點突變所獲得之多胜肽進行降血糖活性試驗。首先，使每組3隻的血糖代謝正常小鼠(BALB/c)禁食18小時、及糖尿病狀態之小鼠(STZ-induced或ob/ob)禁食4小時後，以腹腔注射之方式投予實驗組中每隻小鼠如表11所示之各種多胜肽(100微升，2.5×10-9莫耳/公斤體重)，而對照組中，則投予每隻小鼠100微升的水。15分鐘後，以腹腔注射的方式將4公克/公斤體重的葡萄糖溶液投予正常小鼠(BALB/c)，並將1公克/公斤體重的葡萄糖溶液投予糖尿病狀態之小鼠(STZ-induced或ob/ob)，以造成小鼠的血糖值快速上升。150分鐘後，於小鼠的尾部取血，並以優勢血糖機(Accu-Check Advantage，Roche，德國)測量其血糖值，比較並分析實驗組與對照組中小鼠的血糖值。
如表11之結果所示，無論是正常小鼠或是糖尿病狀態之小鼠，以2.5×10-9莫耳/公斤體重之IRBP-1-68或由其衍生之同源性多胜肽皆可以有效地降低小鼠的血糖值。其中IRBP-1-68、IRBP-50-68、IRBP-60-68、及IRBP-9B之多胜肽在BALB/c小鼠之組別中可達到約61%至70%的血糖抑制比率；IRBP-1-68、IRBP-50-68、IRBP-60-68、IRBP-9A、IRBP-9B、IRBP-9C、及IRBP-9D之多胜肽在STZ-induced小鼠之組別中可達到約22%至67%的血糖抑制比率；IRBP-1-68、IRBP-50-68、及IRBP-60-68之多胜肽在ob/ob或db/db鼠之組別中可達到約33%至55%的血糖抑制比率。上述結果顯示IRBP-1-68、具有IRBP-1-68片段胺基酸序列之多胜肽、及經多點突變所得之多胜肽皆具有降血糖之功效。
[實施例15]醣化血色素值試驗
醣化血色素值(HbAlc)係指生物體之血液中的紅血球上所附著的葡萄糖濃度，一般而言，血糖濃度愈高則醣化血色素值愈高，且醣化血色素值亦為評估藥物治療糖尿病效果的黃金準則，因此本實施例藉由測量醣化血色素值評估多胜肽控制小鼠血糖值的效果。
如表12所示，將IRBP-50-68及IRBP-60-68多胜肽投予糖尿病狀態之小鼠(STZ-induced)。在實驗組中，以口服方式將1×10-6莫耳 /公斤體重之多胜肽(20微升)投予每隻實驗組中的小鼠，而控制組中，則投予每隻小鼠20微升的水。28天後測量其醣化血色素值。
如表12所示，本發明多胜肽可以有效地降低糖尿病狀態小鼠之醣化血色素值，顯示該等多胜肽確實具有控制糖尿病小鼠血糖值之功效。
[實施例16]肝功能指數測定
因為糖尿病患者常發生糖尿病肝腎病變等併發症，因此本實施例藉由測量肝功能指數評估多胜肽控制小鼠糖尿病肝病變的效果。
以如實施例14所述之方法，將IRBP-50-68之多胜肽以口服方式投予糖尿病狀態之實驗組的小鼠，28天後測量其麩胺酸草乙酸轉胺酶(GOT)與麩胺酸丙酮酸轉胺脢(GPT)之肝功能指數，以評估該多胜肽對於糖尿病狀態小鼠之後續糖尿病肝病變的影響，結果顯示於表13。
(以Student’s t-test進行統計分析，*p<0.05，***p<0.001)
如表13所示，本發明多胜肽可以有效地降低糖尿病狀態小鼠之肝功能指標(GOT及GPT)，顯示該多胜肽可經由降血糖之功效而改善糖尿病狀態小鼠之後續糖尿病肝病變。
[實施例17]腎功能指數測定
以如實施例14所述方法，將IRBP-50-68及IRBP-60-68之多胜肽以口服之方式投予糖尿病狀態之實驗組的小鼠，28天後測量其血中尿素氨(BUN)與血清肌酸酐(CRE)之腎功能指數，以評估該等多胜肽對於糖尿病狀態小鼠之後續糖尿病腎病變的影響，結果顯示於表14。
如表14所示，本發明多胜肽可以有效地降低糖尿病狀態小鼠之腎功能指數(BUN及CRE)，顯示該多胜肽可經由降低血糖而改善糖尿病狀態小鼠之後續糖尿病腎病變。
上述實施例僅係用以例示說明本發明之原理及功效，而非用於限制本發明。任何熟於此項技藝之人士均可在不違背本發明之技術原理及精神的情況下，對上述實施例進行修改及變化。因此，本發明之權利保護範圍應如後述之申請專利範圍所列者。
第1圖所示為IRBP-1-68與胰島素受體之分子嵌合模式圖；第2圖所示為IRBP-1-68促進胰島素受體自體磷酸化的免疫墨點分析圖；第3圖所示為IRBP-1-68促進與胰島素訊息路徑相關之基因之蛋白質表現的西方墨點分析圖；以及第4圖所示為IRBP-1-68促進3T3-L1脂肪細胞表現葡萄糖轉運蛋白4的免疫組織染色圖。

Claims (14)

  1. 一種多胜肽，其係具有一選自下列群組之SEQ ID NO：1的片段胺基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、及SEQ ID NO：6。
  2. 如請求項1之多胜肽，其中該SEQ ID NO：1的片段胺基酸序列係SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6。
  3. 一種多胜肽，其係具有一下列胺基酸序列或其進行單一胺基酸之取代所衍生之同源性胺基酸序列：IVARPPTIG(SEQ ID NO：7)；其中，該同源性胺基酸序列係具有選自由SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：178所組成之群組中的任一胺基酸序列。
  4. 如請求項3之多胜肽，其係具有一選自下列群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：21。
  5. 一種多胜肽，其係具有一選自下列群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、及SEQ ID NO：188。
  6. 如請求項5之多胜肽，其係具有一選自下列群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、以及SEQ ID NO：186。
  7. 一種多胜肽，其係具有一下列胺基酸序列或其進行單一胺基酸之取代所衍生之同源性胺基酸序列：RYKYQX1X2YI(SEQ ID NO：189)；其中X1為胱胺酸或色胺酸，X2為苯丙胺酸或色胺酸。
  8. 如請求項7之多胜肽，其係具SEQ ID NO：189之胺基酸序列。
  9. 如請求項8之多胜肽，其中X1為胱胺酸。
  10. 如請求項7之多胜肽，其係具下列胺基酸序列或該序列進行單一胺基酸之取代所衍生之同源性胺基酸序列：RYKYQCFYI(SEQ ID NO：191)；其中，該同源性胺基酸序列係具有選自由SEQ ID NO：194至SEQ ID NO：364所組成之群組中的任一胺基酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項之多胜肽，其係用於與胰島素受體結合。
  12. 如請求項1至10中任一項之多胜肽，其係用於降血糖、降低醣化血色素及減少糖尿病肝腎病變之至少一者。
  13. 一種經單離之核酸分子，其係編碼一如請求項1至10中任一項之多胜肽。
  14. 一種用於降血糖、降低醣化血色素及減少糖尿病肝腎病變之至少一者之醫藥組合物，其係包含至少一如請求項1至10中任一項之多胜肽以及一醫藥上可接受之載劑。
TW101117779A 2012-05-18 2012-05-18 多胜肽、編碼該多胜肽之核酸分子、以及該多胜肽之應用 TWI588153B (zh)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW101117779A TWI588153B (zh) 2012-05-18 2012-05-18 多胜肽、編碼該多胜肽之核酸分子、以及該多胜肽之應用
CN201610900684.XA CN106977593A (zh) 2012-05-18 2012-05-24 多胜肽、编码该多胜肽的核酸分子、以及该多胜肽的应用
CN201210164364.4A CN103421086B (zh) 2012-05-18 2012-05-24 多胜肽、编码该多胜肽的核酸分子、以及该多胜肽的应用
US13/557,374 US8697649B2 (en) 2012-05-18 2012-07-25 Polypeptides, nucleic acid molecule encoding polypeptides, and uses of polypeptides
EP15169670.5A EP2940035B1 (en) 2012-05-18 2012-08-09 Polypeptides, nucleic acid molecule encoding polypeptides, and uses of polypeptides
EP12179926.6A EP2664622B1 (en) 2012-05-18 2012-08-09 Polypeptides, nucleic acid molecule encoding polypeptides, and uses of polypeptides
JP2012198300A JP5676538B2 (ja) 2012-05-18 2012-09-10 ポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸分子、及びポリペプチドを含む医薬組成物
US14/160,791 US9029326B2 (en) 2012-05-18 2014-01-22 Polypeptides, nucleic acid molecule encoding polypeptides, and uses of polypeptides
JP2014263136A JP5947872B2 (ja) 2012-05-18 2014-12-25 ポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸分子、及びポリペプチドを含む医薬組成物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW101117779A TWI588153B (zh) 2012-05-18 2012-05-18 多胜肽、編碼該多胜肽之核酸分子、以及該多胜肽之應用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201348249A true TW201348249A (zh) 2013-12-01
TWI588153B TWI588153B (zh) 2017-06-21

Family

ID=46634071

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW101117779A TWI588153B (zh) 2012-05-18 2012-05-18 多胜肽、編碼該多胜肽之核酸分子、以及該多胜肽之應用

Country Status (5)

Country Link
US (2) US8697649B2 (zh)
EP (2) EP2940035B1 (zh)
JP (2) JP5676538B2 (zh)
CN (2) CN103421086B (zh)
TW (1) TWI588153B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI593703B (zh) * 2014-08-25 2017-08-01 Polypeptide for use in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment or / and prevention of a disease associated with a target

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI588153B (zh) * 2012-05-18 2017-06-21 中國醫藥大學 多胜肽、編碼該多胜肽之核酸分子、以及該多胜肽之應用
CN103992374B (zh) * 2014-06-04 2016-06-22 浙江省农业科学院 具有降血糖和降血脂双功能的二肽di及其用途
CN103992375B (zh) * 2014-06-06 2016-06-22 浙江省农业科学院 具有降血糖功能的二肽qn及其用途
TWI580690B (zh) * 2014-08-25 2017-05-01 The use of multidipins for the manufacture of pharmaceutical compositions for in vivo multipurpose effects
TWI680139B (zh) * 2018-07-21 2019-12-21 東海大學 短胜肽、及其組合物用於治療/預防糖尿病及與之相關疾病之用途
CN109452602A (zh) * 2018-09-29 2019-03-12 安徽省潜山县全丰农产品开发有限责任公司 一种炒制瓜蒌籽的加工工艺
CN114057831B (zh) * 2020-08-07 2024-03-12 三凡生技研发股份有限公司 促进血管增生的短链胜肽及其促进糖尿病伤口愈合的用途

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4156038B2 (ja) * 1997-04-01 2008-09-24 カリックス セラピューティックス インコーポレイテッド ニガウリの経口活性画分、その活性ペプチドおよび糖尿病治療におけるその使用
EP1033405A3 (en) * 1999-02-25 2001-08-01 Ceres Incorporated Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
JP2007524579A (ja) 2003-02-19 2007-08-30 ソシエテ・ドゥ・コンセイユ・ドゥ・ルシェルシュ・エ・ダプリカーション・シャンティフィック・エス・ア・エス Ｇｌｐ−１の類似体
CA2726759C (en) 2005-05-25 2016-02-16 Curedm Group Holdings, Llc Human proislet peptide, derivatives and analogs thereof, and methods of using same
CA2740058A1 (en) 2008-10-31 2010-05-06 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. An antidiabetic agent
TWI342781B (en) * 2008-12-01 2011-06-01 Univ China Medical Blood sugar-modulating polypeptides
AU2010323068B2 (en) * 2009-11-27 2015-09-03 Boehringer Ingelheim International Gmbh Treatment of genotyped diabetic patients with DPP-IV inhibitors such as linagliptin
MX2012009556A (es) * 2010-02-19 2013-01-29 Korea Res Inst Of Bioscience Composicion farmaceutica para tratar la diabetes, que contiene extracto de quamoclit angulata.
JP5185976B2 (ja) * 2010-06-08 2013-04-17 景岳生物科技股▲分▼有限公司 糖尿病及びその合併症の改善に使われる組成物、改善方法及び乳酸桿菌分離株
MY160979A (en) * 2010-07-21 2017-03-31 Oleg Llich Epshtein A combination pharmaceutical composition and methods of treating diabetes and metabolic disorders
US20130184272A1 (en) 2010-09-17 2013-07-18 Takeda Pharmaceutical Company Limited Diabetes therapeutic agent
TWI588153B (zh) * 2012-05-18 2017-06-21 中國醫藥大學 多胜肽、編碼該多胜肽之核酸分子、以及該多胜肽之應用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI593703B (zh) * 2014-08-25 2017-08-01 Polypeptide for use in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment or / and prevention of a disease associated with a target

Also Published As

Publication number Publication date
EP2664622A2 (en) 2013-11-20
US9029326B2 (en) 2015-05-12
EP2664622A3 (en) 2014-05-14
US20130310313A1 (en) 2013-11-21
JP2013240317A (ja) 2013-12-05
US20140155323A1 (en) 2014-06-05
CN106977593A (zh) 2017-07-25
JP5676538B2 (ja) 2015-02-25
JP5947872B2 (ja) 2016-07-06
TWI588153B (zh) 2017-06-21
JP2015145361A (ja) 2015-08-13
EP2940035B1 (en) 2016-09-21
CN103421086B (zh) 2016-12-14
EP2940035A1 (en) 2015-11-04
CN103421086A (zh) 2013-12-04
US8697649B2 (en) 2014-04-15
EP2664622B1 (en) 2015-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI588153B (zh) 多胜肽、編碼該多胜肽之核酸分子、以及該多胜肽之應用
CN110105432B (zh) 具有抗肥胖及抗糖尿病功效的肽及其的用途
CN103338790A (zh) 用聚乙二醇或其衍生物聚乙二醇化的唾液素-4类似物、其制备方法以及含有其作为活性成分的用于预防或治疗糖尿病的药物组合物
US8071716B2 (en) Thymus-specific protein
KR101841748B1 (ko) 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드 및 이의 용도
RU2721426C1 (ru) Пептид с эффективностью против ожирения и противодиабетической эффективностью и его применение
TWI633116B (zh) 降低血糖之化合物
TWI342781B (en) Blood sugar-modulating polypeptides
Leggio et al. Therapeutic potential of leptin receptor modulators
EP3800196A1 (en) Peptide for treating rheumatoid arthritis and use thereof
CN109912688B (zh) 一类ptp1b多肽抑制剂及其制备方法和应用
KR101954214B1 (ko) 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드 및 이의 용도
CN114621327B (zh) GLP-1、GIP和Gcg多重受体激动蛋白质
CN114558111A (zh) 一种抑制脂肪细胞分化和胰岛素耐受的药物
WO2021006819A1 (en) Epidermal growth factor receptor (egfr) ligands
CN114617956B (zh) 一种高效降糖的蛋白质药物
CN112679595B (zh) 脑源肽或融合肽在新生儿缺氧缺血性脑损伤药物中的应用
EP2623512A1 (en) Peptide capable of binding to immunoglobulin
CN117343145A (zh) 一类靶向PTP1B的长效化降糖BimBH3模拟肽及其制备方法与应用