TW201309334A - 角質層剝離促進劑 - Google Patents

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Akiko Yamada
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Abstract

本發明係提供一種選自由銀杏樹葉萃取物、虎耳草萃取物、刺蘼萃取物、甘草酸二鉀及四氫甲基嘧啶羧酸(ectoine)所組成之群中的中胰蛋白酶(mesotrypsin)表現促進劑及包含其之角質層剝離促進劑。

Description

角質層剝離促進劑
本發明係提供一種選自由銀杏樹葉萃取物、虎耳草萃取物、刺蘼萃取物、甘草酸二鉀、四氫甲基嘧啶羧酸所組成之群中的中胰蛋白酶表現促進劑及包含其之角質層剝離促進劑。
作為表皮之最外層之角質層(SC，stratum corneum)包含經角化之細胞(角質細胞)與連續之細胞外脂質層，且形成生理化學性障壁，而有效保護身體免受環境災害。SC係通過角質細胞之最終分化而連續地產生。與此同時，亦引起細胞脫落(剝離)，從而將SC維持為一定之厚度。於正常之剝離時，各個角質細胞即較小之集合體自皮膚表面剝離。雖健康人無法感知該過程，但於某種疾病之狀態下，於SC之產生與剝離之間存在不均衡。其結果，成為眼睛可看見之過量之鱗屑。其係於牛皮癬等炎症性皮膚疾病中發現。
Lundstrom與Egelrud報告有胰凝乳蛋白酶樣絲胺酸蛋白酶存在於SC中，並參與剝離(非專利文獻1)。自人之腳底之SC純化該酶作為角質層胰凝乳蛋白酶，且編碼角質層胰凝乳蛋白酶之cDNA係自人角質細胞cDNA基因庫單離(非專利文獻2；非專利文獻3)。本發明者顯示出不僅胰凝乳蛋白酶，且胰蛋白酶樣絲胺酸蛋白酶亦參與腳底以外之SC之剝離過程。根據最近之研究，明確編碼15種絲胺酸蛋白酶(將其稱為胰舒血管素1~15(KLK1~15))之人組織胰舒血 管素基因家族作為簇而位於染色體19q13.4上(非專利文獻4；非專利文獻5)。該等絲胺酸蛋白酶之大部分廣泛於人組織中表現，其中包含皮膚。以前明確參與剝離之該等蛋白酶作為胰舒血管素家族之成員，被重新命名。即，角質層胰凝乳蛋白酶被命名為胰舒血管素7(KLK7、hK7)(非專利文獻6)，胰蛋白酶樣酶被命名為胰舒血管素5(KLK5、hK5)(非專利文獻7)。KLK5與KLK7於剝離時具有極重要之功能。
另一方面，不同3種之胰蛋白酶原存在於人胰液中。該等胰蛋白酶原係基於其等電位點，而稱為陽離子性胰蛋白酶原、陰離子性胰蛋白酶原、中胰蛋白酶原。根據最近之研究，該等胰蛋白酶原係分別藉由不同基因PRSS1、PRSS2、PRSS3而進行編碼(非專利文獻8)。作為PRSS1基因產物之胰蛋白酶原1與作為PRSS2基因產物之胰蛋白酶原2為主要之消化性胰腺蛋白酶。PRSS3為中胰蛋白酶原基因，至少生成2個剪切變異體(胰蛋白酶原3與4)。該等胰蛋白酶原全部具有推定之切割部位序列DDDDK-1，該推定之切割部位序列DDDDK-1係存在於源自各種材料之胰腺胰蛋白酶原中，並非常高度地保存，且藉由腸激酶而活化(Light與Janska，1989年)。胰蛋白酶原不僅於胰腺中表現，亦於其他組織中表現，其中包含各種組織之上皮細胞與人腦。頗有意思的是，中胰蛋白酶與其他2種胰蛋白酶的基質特異性與抑制劑敏感性不同。中胰蛋白酶不太切割蛋白質基質。其最特徵性之性質係對於作為天然之胰蛋白 酶抑制劑之α1-胰蛋白酶抑制劑、胰腺分泌胰蛋白酶抑制劑(Kazal型)、大豆胰蛋白酶抑制劑(Kunitz型)等為耐性。該等見解暗示：胰蛋白酶除參與腸中之消化以外，亦可能參與各種生理學之反應。
本發明者自人角質細胞cDNA基因庫進行胰蛋白酶原基因之cDNA克隆，其結果，使中胰蛋白酶原基因PRSS3之2個剪切同功異型物單離，其一方面與胰蛋白酶原4(腦胰蛋白酶原)相同，並且另一方面僅編碼N末端區域之外顯子不同，從而將其命名為胰蛋白酶原5(非專利文獻9)。
兩個同功異型物共同具有活化序列DDDDK-1。DDDDK-1於切割部位中主要存在帶負電之殘基，因此於胰蛋白酶本身中幾乎未被切割。對照而言，腸激酶對於DDDDK-1序列之特異性較高(非專利文獻10)。例如，腸激酶相對於牛胰蛋白酶原之觸媒效率係相對於牛胰蛋白酶的34,000倍。因此，腸激酶為生理學地將胰蛋白酶原變換為胰蛋白酶之唯一的酶。亦發現腸激酶一般存在於表皮之顆粒層中。該等胰蛋白酶原與其活化酶腸激酶之表現及存在部位係與中胰蛋白酶參與角質細胞之末端分化的見解一致。
於末端分化時，大部分之現象與蛋白質分解作用相關聯。於最外層之顆粒細胞中，核與全部之細胞器消失，角蛋白之分子量減少，並且絲聚蛋白源加工成絲聚蛋白。於最近之研究中，顯示作為絲胺酸蛋白酶抑制劑之淋巴上皮KAZAL5型相關抑制劑(LEKTI，Lympho-epithelial Kazal-type-related inhibitor)對於角質層剝離較為重要。LEKTI基 因之突變體SPINK5被鑑定為具有作為Netherton症候群而眾所周知之重度之先天性魚鱗癬樣紅皮病的患者之缺陷基因。主要角質層剝離蛋白酶(KLK5、KLK7)係由LEKTI而有力地抑制(非專利文獻11)。欠缺SPINK5之小鼠顯示出表皮蛋白酶之過量亢進，又，通過橋粒芯糖蛋白1之過量分解，顯示與Netherton症候群相似之症狀。亦有時複數個表皮胰舒血管素通過橋粒芯糖蛋白1之切割，而參與角質層剝離，且該等係藉由LEKTI調節。
角質層剝離係產生KLK作用於顯示細胞黏著運動之細胞間橋體中，而使其分解之情況，且若LEKTI抑制KLK之作用，則亦抑制角質層剝離。一般認為到目前為止，中胰蛋白酶僅藉由使LEKTI分解而促進角質層剝離。
[先前技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1]Arch.Dermatol.Res.282：34-7(1990)[非專利文獻2]J.Invest.Dermatol.101：200-4(1993)[非專利文獻3]Arch.Dermatol.Res.283：108-12(1991)[非專利文獻4]J.Biol.Chem.275：37397-406(2000)[非專利文獻5]Biol.Chem.382：5-14(2001)[非專利文獻6]Gene 254：119-28(2000)[非專利文獻7]J.Invest.Dermatol.122：1235-44(2004)[非專利文獻8]Protein Pept.Lett.12：457-64(2005)[非專利文獻9]J.Invest.Dermatology,130：944-952(2010) [非專利文獻10]Trends.Biochem.Sci.14：110-2(1989)[非專利文獻11]Biol.Chem.386：1173-84(2005)
本發明之課題在於提供一種新穎之角質層剝離促進劑。角質層剝離促進劑如文字所述，藉由促進角質層剝離，而發揮皮膚粗糙改善效果等。
本發明者發現：中胰蛋白酶不僅使LEKTI分解，令人吃驚的是亦對有助於角質層剝離之KLK7直接活化。因此，篩選使中胰蛋白酶之表現亢進之候補藥劑，結果發現銀杏樹葉萃取物、虎耳草萃取物、刺蘼萃取物、甘草酸二鉀及四氫甲基嘧啶羧酸具有中胰蛋白酶表現亢進效果，從而完成本發明：
(1)一種中胰蛋白酶表現亢進劑，其係選自由銀杏樹葉萃取物、虎耳草萃取物、刺蘼萃取物、甘草酸二鉀及四氫甲基嘧啶羧酸所組成之群中。
(2)一種角質層剝離促進劑，其包含如(1)之中胰蛋白酶表現亢進劑。
(3)一種角質層剝離促進方法，其係對於期望促進角質層剝離之對象者，藉由將選自由銀杏樹葉萃取物、虎耳草萃取物、刺蘼萃取物、甘草酸二鉀及四氫甲基嘧啶羧酸所組成之群中之成分應用於皮膚上，從而促進角質層剝離。
(4)，一種用以皮膚粗糙之預防及/或改善之美容方法，其係 藉由將選自由銀杏樹葉萃取物、虎耳草萃取物、刺蘼萃取物、甘草酸二鉀及四氫甲基嘧啶羧酸所組成之群中之成分應用於皮膚上，從而預防及/或改善皮膚粗糙。
(5)一種成分之用以促進角質層剝離之用途，該成分係選自由銀杏樹葉萃取物、虎耳草萃取物、刺蘼萃取物、甘草酸二鉀及四氫甲基嘧啶羧酸所組成之群中之成分。
根據本發明，銀杏樹葉萃取物、虎耳草萃取物、刺蘼萃取物、甘草酸二鉀及四氫甲基嘧啶羧酸係使中胰蛋白酶活化，藉此發揮角質層剝離促進效果，其結果，通過角質層之剝離而尋求皮膚粗糙改善等。
角質層剝離促進劑
於一種觀點中，本發明係提供一種包含選自由銀杏樹葉萃取物、虎耳草萃取物、刺蘼萃取物、甘草酸二鉀及四氫甲基嘧啶羧酸所組成之群中的中胰蛋白酶表現亢進劑的角質層剝離促進劑。
關於銀杏樹葉萃取物、虎耳草萃取物、刺蘼萃取物，雖用於皮膚外用劑，但不知何種萃取物具有角質層剝離促進效果。又，刺蘼萃取物具有腦醯胺合成促進效果(日本專利特開2006-111560)、膠原酶抑制效果(日本專利特開2006-241148)等為公知。雖甘草酸二鉀及四氫甲基嘧啶羧酸亦同樣地，用於皮膚外用劑，但不知何種萃取物亦具有角質層剝離促進效果。
上述萃取物可藉由常法而獲得，例如可將成為其起源之植物之一部分或全部與萃取溶劑一起於常溫下，或進行加熱並浸漬或進行加熱回流，之後進行過濾，濃縮而獲得。於溶劑萃取之前，亦可使萃取部位乾燥。作為萃取溶劑，若為通常用於萃取之溶劑，則可任意使用，例如可將有機溶劑例如甲醇、乙醇、丙二醇、1,3-丁二醇、丙三醇等醇類、含水醇類、氯仿、二氯乙烷、四氯化碳、丙酮、乙酸乙酯、己烷等；或水性溶劑，例如水、生理鹽水、磷酸緩衝液、硼酸緩衝液等分別單獨使用，或組合使用。較佳為較好地使用選自水、甲醇、乙醇、1,3-丁二醇中之1種或2種以上作為溶劑。
可直接使用利用上述溶劑進行萃取而獲得之萃取物，或使用例如藉由凍結乾燥等而進行濃縮之萃取物，又若需要，則可使用吸附法，例如利用使用離子交換樹脂而除去雜質者或多孔性聚合物(例如Amberlite XAD-2)之管柱進行吸附後，於所期望之溶劑中溶出，進而亦可使用經濃縮者。
銀杏樹葉萃取物、虎耳草萃取物、刺蘼萃取物之萃取物或甘草酸二鉀、四氫甲基嘧啶羧酸等藥劑係濃度依賴性地顯示中胰蛋白酶表現促進作用。因此，就此種觀點而言，本發明之角質層剝離促進劑中之銀杏樹葉萃取物、虎耳草萃取物、刺蘼萃取物、甘草酸二鉀及/或四氫甲基嘧啶羧酸之調配量於劑總量中，作為乾燥物，為0.0001~20.0質量%，較佳為0.0001~10.0質量%。
本發明之角質層剝離促進劑可按照常法進行製造，又雖可製備上述萃取物1種或2種以上作為構成相同角質層剝離促進劑之成分，但視需要，適當調配通常包含準藥品之化妝品或醫藥品等皮膚外用劑等中所使用之成分，例如油分、界面活性劑、粉末、有色材料、水、醇類，增黏劑、螯合劑、聚矽氧類、抗氧化劑、紫外線吸收劑、保濕劑、香料、各種藥效成分、防腐劑、pH值調整劑、中和劑等。
本發明之角質層剝離促進劑之劑型並無特別限定，例如可採用溶液系、助溶系、乳化系、粉末分散系、水-油二層系、水-油-粉末三層系、軟膏、凝膠、噴霧劑等任意之劑型。又，使用形態亦無特別限定，例如可採用化妝水、乳液、乳霜、香精劑、凍膠、凝膠、軟膏、膏狀面膜、面膜、粉底等任意之形態。
本發明之角質層剝離促進劑應用於皮膚，藉此可利用於用以尋求皮膚粗糙之予防及/或改善之美容方法。此種美容方法中之本發明之角質層剝離促進劑之用法、用量亦無特別限定，並根據劑型或處理之皮膚之皺紋之狀態而適當決定，但就典型性而言，每天數次，例如1次~5次；適量，例如每1平方cm2自0.1 ml至1 ml，而直接塗抹於皮膚上，又可使其適量滲入紗布等中後，貼附於皮膚上。
[實施例]
繼而，藉由實施例對本發明進行進而詳細之說明。再者，本發明並不受其限定。
(1)利用中胰蛋白酶之KLK7之活化係簡單地按照以下之步 驟進行調查。
合成基質(chromogenic substrate)
1)S-2444：pyroGlu-Gly-Arg-p-nitroanilide
2)S2586：Arg-Pro-Tyr-p-nitroanilide
所使用之酶之濃度
腸激酶：2 μg/ml
中胰蛋白酶原：1 μg/ml
分析法
首先，藉由上述1之中胰蛋白酶原之活化法，從而利用腸激酶進行中胰蛋白酶原之活化。於中胰蛋白酶之活性之確認時，雖使用合成基質S-2444等，但於proKLK7之活化時，培養之後，將5 μl之包含經過活化之中胰蛋白酶之溶液直接添加於包含proKLK7與PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸鹽緩衝鹽水)之溶液中，於室溫下放置10分鐘 之後，加入基質溶液(S-2586)，於37℃下培養30分鐘，並以405 nm測定游離之對硝基苯胺(pNA)。其結果可知：中胰蛋白酶濃度依賴性地使KLK7活化(圖1)。
(2)顯示中胰蛋白酶表現促進效果之天然藥之篩選
於包含補足上皮生長因子(0.1 ng/ml)、胰島素(10 μg/ml)、氫化可的松(0.5 μg/ml)、牛下垂體萃取物(0.4%)、建它黴素(50 μg/ml)、兩性黴素B(50 ng/ml)之MCDB 153培養基之角質細胞生長培養基中，於各種天然藥萃取物(自丸善製藥獲取)及藥劑(4-20 μg/ml)之存在下，於24小時室溫下培養源自正常之包皮之人角質細胞(Cascade Biologics公司，Portland，Maryland州)。使用0.1%之1,3-丁二醇作為對照組。
RT-PCR
使用random．hexamer與Superscript II R酶H反轉錄酶(Gibco-BRL公司，Gettysburg，Maryland州)，將自如上所述經培養之人角質細胞單離之全RNA(500 ng)進行反轉錄之後，使用Taq.DNA聚合酶(Takara公司，京都，日本)與下述之引子進行PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)放大。執行94℃下30秒，60℃下1分鐘，72℃下1分鐘之放大週期40次。
根據圖2之結果可知，與對照組相比，銀杏樹葉萃取物、虎耳草萃取物、刺蘼萃取物、甘草酸二鉀及四氫甲基嘧啶羧酸顯著使中胰蛋白酶之表現亢進。因此，該等萃取均促進中胰蛋白酶之表現，因此暗示使KLK7之活性亢 進，其結果顯示出角質層剝離促進效果。
正向引子：gacaatgacatcatgctgatcaaactctc(序列編號1)反向引子：cctcaaggaagcccacacagaac(序列編號2)
[序列表]
圖1係表示中胰蛋白酶具有使KLK7之前驅物(proKLK7)活化之能力。
圖2係表示各種天然藥及藥劑之中胰蛋白酶表現促進效果。圖中，各天然藥萃取物名之末尾之數值表示濃度(μg/ml)。
<110> 日商資生堂股份有限公司<120> 角質層剝離促進劑<130> Z786-PCT <140> 101106445 <141> 2012/02/24 <150> 2011-039978 <151> 2011/02/25 <160> 2 <170> 專利版本3.5 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 中胰蛋白酶正向引子<400> 1 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 中胰蛋白酶反向引子<400> 2

Claims (2)

  1. 一種中胰蛋白酶表現促進劑，其係選自由銀杏樹葉萃取物、虎耳草萃取物、刺蘼萃取物、甘草酸二鉀及四氫甲基嘧啶羧酸(ectoine)所組成之群中之1種或複數種。
  2. 一種角質層剝離促進劑，其包含如請求項1之中胰蛋白酶表現促進劑。
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