JP6738280B2 - 角層剥離の抑制又は亢進に起因する肌状態を改善するための美容方法及び評価方法 - Google Patents
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Description
[1] 被験者の角層におけるセルピンB12の発現を亢進することにより、角層剥離の亢進に起因する肌状態を改善するための美容方法。
[2] 前記セルピンB12の発現の亢進が、セルピンB12プロモーター領域の−1bp〜−150bpの領域におけるコアプロモーター活性の促進、及び/又はセルピンB12プロモーター領域の−150bp〜−600bpの領域におけるサイレンサー活性の阻害によりもたらされる、1に記載の方法。
[3] 被験者の角層におけるセルピンB12の発現を抑制することにより、角層剥離の抑制に起因する肌状態を改善するための美容方法。
[4] 前記セルピンB12の発現の抑制が、セルピンB12プロモーター領域の−1bp〜−150bpの領域におけるコアプロモーター活性の阻害、及び/又はセルピンB12プロモーター領域の−150bp〜−600bpの領域におけるサイレンサー活性の促進によりもたらされる、3に記載の方法。
[5] 被験者の皮膚から採取した角層試料中のセルピンB12の発現量を測定し、前記セルピンB12の発現量の増大を角層剥離の抑制の指標とすることを特徴とする、角層剥離の抑制の評価方法。
[6] さらに、前記角層試料中のメソトリプシンの発現量を測定し、前記メソトリプシンの発現量の減少を角層剥離の抑制の指標とすることを特徴とする、5に記載の方法。
[7] セルピンB12プロモーター領域の−1bp〜−150bpの領域におけるコアプロモーター活性、及び/又はセルピンB12プロモーター領域の−150bp〜−600bpの領域におけるサイレンサー活性を測定し、前記コアプロモーター活性の増大、及び/又は前記サイレンサー活性の減少を角層剥離の抑制の指標とすることを特徴とする、5又は6に記載の方法。
[8] 前記角層剥離の抑制が肌老化に起因する、5〜7いずれかに記載の方法。
[9] 前記角層剥離の抑制が尋常性魚鱗癬又は疣贅から選択される皮膚疾患に起因する、5〜7いずれかに記載の方法。
[10] 被験者の皮膚から採取した角層試料中のセルピンB12の発現量を測定し、前記セルピンB12の発現量の減少を角層剥離の亢進の指標とすることを特徴とする、角層剥離の亢進の評価方法。
[11] さらに、前記角層試料中のメソトリプシンの発現量を測定し、前記メソトリプシンの発現量の増大を角層剥離の亢進の指標とすることを特徴とする、10に記載の方法。
[12] セルピンB12プロモーター領域の−1bp〜−150bpの領域におけるコアプロモーター活性、及び/又はセルピンB12プロモーター領域の−150bp〜−600bpの領域におけるサイレンサー活性を測定し、前記コアプロモーター活性の減少、及び/又は前記サイレンサー活性の増大を角層剥離の亢進の指標とすることを特徴とする、10又は11に記載の方法。
[13] 前記角層剥離の亢進が、日焼け、乾燥肌、アトピー性皮膚炎、乾癬、ネザートン症候群又は先天性魚鱗癬様紅皮症から選択される肌状態又は皮膚疾患に起因する、10〜12のいずれかに記載の方法。
[14] 角層剥離促進剤のスクリーニング方法であって、候補薬剤を培養細胞に適用した場合、該細胞におけるセルピンB12の発現を阻害する薬剤を角層剥離促進剤として選定することを特徴とする方法。
[15] さらに、前記細胞におけるメソトリプシンの発現を亢進する薬剤を角層剥離促進剤として選定することを特徴とする、14に記載の方法。
[16] セルピンB12プロモーター領域の−1bp〜−150bpの領域におけるコアプロモーター活性を阻害する薬剤、及び/又はセルピンB12プロモーター領域の−150bp〜−600bpの領域におけるサイレンサー活性を促進する薬剤を角層剥離促進剤として選定することを特徴とする、14又は15に記載の方法。
[17] 前記角層剥離促進剤が、肌老化の予防又は改善に用いられる、14〜16のいずれかに記載の方法。
[18] 前記角層剥離促進剤が、尋常性魚鱗癬又は疣贅から選択される皮膚疾患の予防又は治療に用いられる、14〜16のいずれかに記載の方法。
[19] 角層剥離抑制剤のスクリーニング方法であって、候補薬剤を培養細胞に適用した場合、該細胞におけるセルピンB12の発現を亢進する薬剤を角層剥離抑制剤として選定することを特徴とする方法。
[20] さらに、前記細胞におけるメソトリプシンの発現を阻害する薬剤を角層剥離抑制剤として選定することを特徴とする、19に記載の方法。
[21]セルピンB12プロモーター領域の−1bp〜−150bpの領域におけるコアプロモーター活性を促進する薬剤、及び/又はセルピンB12プロモーター領域の−150bp〜−600bpの領域におけるサイレンサー活性を阻害する薬剤を角層剥離抑制剤として選定することを特徴とする、19又は20に記載の方法。
[22] 前記角層剥離抑制剤が、日焼け、乾燥肌、アトピー性皮膚炎、乾癬、ネザートン症候群又は先天性魚鱗癬様紅皮症から選択される肌状態又は皮膚疾患の予防、改善又は治療に用いられる、19〜21のいずれかに記載の方法。
[23] 前記培養細胞が表皮角化細胞である、14〜21のいずれかに記載の方法。
[24] 被験者の角層におけるセルピンB12の発現を亢進することにより、角層剥離の抑制に起因する皮膚疾患を治療するための医療方法。
[25] 被験者の角層におけるセルピンB12の発現を抑制することにより、角層剥離の亢進に起因する皮膚疾患を治療するための医療方法。
[26] セルピンB12発現亢進剤を含んで成る、角層剥離の抑制に起因する皮膚疾患を治療するための医薬組成物。
[27] セルピンB12の発現抑制を含んで成る、角層剥離の亢進に起因する皮膚疾患を治療するための医薬組成物。
セルピンB12遺伝子のRT−PCR分析には、例えば、以下のプライマーを使用することができる。
フォワード・プライマー:CTGGGTTGAATGTCAATCCC(配列番号1)
リバース・プライマー :CACCGTGTTTTCATGGTCAA(配列番号2)
美容器具WIDE SCRATCH(素数株式会社)で踵を製品マニュアルの方法で削り、その削った角層を回収した。
回収した角層は、重量を測定後、溶解バッファー(0.1 M Tris―HCl(pH 8.0)+ 0.14 M NaCl + 0.1% Tween 20)を加え、氷上でテンブロック型ホモジナイザー(Cat.No.357428, WHEATON社)を用いて全て液状になるまでホモジナイズした。タンパク量はDC protein assay kit (Bio−Rad)を用いた。
ステップ1:脱塩処理
精製には、AKTAprime(GE Healthcare)のシステムを用いて、低温条件(4℃)で行った。脱塩処理に用いた脱塩カラムはHiprep 26/10 Desalting(GE Healthcare)であり、製品マニュアルの条件で行った。溶出バッファーには、Tris−HCl(pH8.0)を用いた。
ステップ2:陰イオン交換
精製には、AKTAprime(GE Healthcare)のシステムを用いて、低温条件(4℃)で行った。陰イオン交換には、陰イオン交換カラムHiprep 16/10 Q XL(GE Healthcare)を用いた精製を行った。作業は、製品マニュアルの条件で行った。溶出バッファーには、Tris−HCl(pH8.0)+NaClを用い、NaClの濃度は0mM〜500mMの濃度変化をつけて溶出を行った。
ステップ3:ハイドロキシアパタイト
精製には、Pharmacia LKB・controller LCC−501 Plus(Pharmasia)のシステムを用いて、低温条件(4℃)で行った。ハイドロキシアパタイトカラムCHT2−I(Bio−Rad)を用いて、製品マニュアルの条件で行った。溶出バッファーには、リン酸バッファー(pH6.8)を用い、0mM〜500mMの濃度変化をつけて溶出を行った。
ステップ4:強陽イオン交換
精製には、Pharmacia LKB・controller LCC−501 Plus(Pharmasia)のシステムを用いて、低温条件(4℃)で行った。Mono S 5/50 GL (GE Healthcare)を用いて、製品マニュアルの条件で行った。溶出バッファーには、リン酸バッファー(pH6.0)+NaClを用い、0mM〜1000mMの濃度変化をつけて溶出を行った。
ステップ5:等電点の差
精製には、Pharmacia LKB・controller LCC−501 Plus(Pharmasia)のシステムを用いて、低温条件(4℃)で行った。Mono P 5/50 GL(GE Healthcare)を用いて、製品マニュアルの条件で行った。バッファーには、開始バッファーとして0.025M Bis−Tris, pH6.3, HClを用い、溶出にはPolybuffer 74, pH4.0, HClを用いた。
ステップ6:ゲルろ過
精製には、Pharmacia LKB・controller LCC−501 Plus(Pharmasia)のシステムを用いて、低温条件(4℃)で行った。Mono P 5/50 GL(GE Healthcare)を用いて、製品マニュアルの条件で行った。溶出バッファーには、PBS(DULBECCO‘S リン酸バッファーED SALINE(Sigma))を用いた。
活性測定のバッファーにはセリンプロテアーゼ・バッファー(0.1M Tris−HCl(pH8.0)、0.1% Tween20)を使用した。メソトリプシンの活性測定には、recombinant−PRSS3(Cat.No.3714−SE−010、R&D systems社)を用いて行った。酵素基質として、Boc−Gln−Ala−Arg−MCA(Cat.No.3135−V)、ペプチド研究所)を使用した。基質反応は2030 Multilabel Reader ARVO X3(Perkin Elmer社)による測定によって定量化した。
角層抽出液由来のメソトリプシン阻害画分を回収し、以下の試験を行った。
(1)CBB染色
角層抽出液由来のメソトリプシン阻害画分は、5〜20% e−PAGEL(Cat.No.E−T520L、ATTO社)を用いてSDS−PAGEを行った後、ゲルのみを容器に入れ、MilliQ水による洗浄を5分×3回行い、CBB Stain One Super(Cat.No.11642−31、nacalai tesque)による染色を行った。
(2)ウェスタンブロット解析
精製によって得られたサンプルは、5〜20% e−PAGEL(Cat.No.E―T520L、ATTO社)を用いてSDS−PAGEを行った後、iBlot Gel Transfer system(Invitrogen)もしくは半乾式法によってPVDF 膜に転写した。転写膜は、PBSによる洗浄を5分×2回を行った後、イムノブロック(Cat.No.KN001A、DSファーマバイオメディカル株式会社)で約1時間のブロッキングを行った。ブロッキング後、PBSTによる洗浄を10分×2回、PBSによる洗浄を10分×1回を行い、一次抗体を転写膜上に加え、室温で1時間、もしくは4℃で一晩反応させた。セルピンB12の抗体は、anti−SERPINB12 polyclonal antibody(S−15)(Cat.No.sc−85145、Santa Cruz者)[濃度:1/1000]、anti−SERPINB12 monoclonal antibody(H3−1B)(Cat.No.sc−32234、Santa Cruz社)[濃度:1/1000]を用いた。一次抗体反応後、PBSTによる洗浄を10分×2回、PBSによる洗浄を10分×1回を行い、二次抗体を転写膜上に加え、室温で1時間、もしくは4℃で一晩反応させた。二次抗体反応後、PBSTによる洗浄を10分×2回、PBSによる洗浄を10分×1回を行い、ECL Prime Western Blotting Detection Reagent(Cat.No.RPN2232、GEヘルスケア社)を転写膜上に加え、FUJI MEDICAL X−RAY FILM(Cat.No.47410 07547、富士フィルム株式会社)に焼付けを行った。
(3)LC−MS/MS解析
(i)タンパク質混合物のトリプシン消化
透析したタンパク質混合物をそれぞれ20μlの0.1% RapiGest (Waters Co., Milford, MA)/50 mM炭酸アンモニウム溶液に懸濁させた。ボルテックス攪拌した後、常法に従って還元・アルキル化処理,L−1−トシルアミド−2−フェニルエチルクロロメチルケトン処理トリプシン(TPCKトリプシン)による酵素消化を行った。消化後、消化反応の停止及び界面活性剤(RapiGest)の不活化のため、トリフルオロ酢酸を終濃度0.5% になるように加えた。
(ii)液体クロマトグラフィー/エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析によるタンパク質の同定
酵素消化したタンパク質混合物中のタンパク質同定は、既報のLC/MS/MS法により行った。概略としては、混合物をオートサンプラー (SI−2 semi−microHPLC system, Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan)でフューズドシリカ製トラップカラム(100μm内径×1cm長さ, JupiterProteo C14, 10μm, Phenomenex, Torrance, CA)にロードした。トラップカラムにグラジエントの初期バッファー(0.1% ギ酸, 5%アセトニトリル/蒸留水)を30分間流して脱塩した後、二方バルブを切り替えることでフューズドシリカ製分析カラム(100μm内径× 12cm長さ, JupiterProteo C14, 4μm, Phenomenex)に直結させた。酵素消化液中のペプチドは、90分の有機溶媒グラジエント(5〜75% アセトニトリル)で分離した。カラム流速はスプリット抵抗キャピラリー(50μm内径)の長さの調節(50〜200mm)により300〜400 nl/minに調節した。カラムから溶出したペプチドは、ハイブリッド型タンデム質量分析計(LTQ−Orbitrap, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)に直接エレクトロスプレーイオン化することにより導入した。質量分析計は、自動データ異存MS/MS並行測定モードで動作させた。電場FT型質量分析計(Orbitrap)で高分解能サーベイスキャンスペクトル(分解能60,000)を取得後、強度の強い5つのピークをプリカーサーイオンとしたMS/MSスペクトルを自動的にイオントラップ型質量分析計(LTQ)で取得した。取得したMS/MSスペクトルは、Bioworksソフトウエア上で動くSEQUESTアルゴリズム(Thermo Fisher Scientific)にてデータベースサーチに供し、配列との一致度からタンパク質同定を行った。タンパク質同定を行う際の配列データベースには、非冗長ヒトタンパク質データベース (NCBI, 2010)を用いた。タンパク質の偽同定を最小化するため、厳しいサーチ基準を用いた(Sf score 0.85, peptide probability0.001,number of top matches:1, precursor mass tolerance: 10 ppm, minimum number of peptides to identify proteins: 1, enzyme specificity: half−tryptic or fully tryptic peptides only)。
活性測定のバッファーにはセリンプロテアーゼ・バッファー(0.1M Tris−HCl(pH8.0)、0.1% Tween20)を使用して、各KLKに対するセルピンB12の阻害活性を測定した。KLK8の活性測定には、メソトリプシン(PRSS3)と共に、精製したrecombinant−KLK8を用いて行った。同様に、KLK5の活性測定には、recombinant−KLK5(Cat.No.1108−SE、R&D systems社)、KLK7の活性測定には、精製したrecombinant−KLK7を用いて行った。酵素基質として、Boc−Gln−Ala−Arg−MCA(Cat.No. 3135−V、ペプチド研究所)を使用した。基質反応は2030 Multilabel Reader ARVO X3(Perkin Elmer社)による測定によって定量化した。
図3及び図4に示されるとおり、セルピンB12は各KLK(KLK5/7/8)の活性を阻害することが判明した。
ヒトのまぶた及び腹部、踵から皮膚組織を採取し、マウス抗セルピンB12抗体(Cat.No.sc−32234、SantaCruz社)及びメソトリプシンを認識するウサギ抗トリプシン抗体(Cat.No.01−19−032000、ATHENS社)による免疫染色をおこなった。図5に示されるとおり、比較的角層が薄いまぶたや腹部では、メソトリプシンが強く発現している一方、セルピンB12の発現は殆ど検出されなかった。反対に、比較的角層が厚い踵では、顆粒層において、セルピンB12の強い発現が見られた。
ヒトケラチノサイト初代培養細胞(Normal Human Epidermal Keratinocytes (NHEK)) を75cm2シャーレで培養し、セルピンB12の過剰発現のためにpCMV−HA/Serpin B12 (2μg/ml) をFuGENE(R) HD Transfection Reagent(Cat.No.E2311、Promega)でトランスフェクションし、セルピンB12のノックダウンのためにsi−Serpin B12(Cat.No. SASI_Hs02_00362273、sigma)をLipofectamineTM RNAiMAX Transfection Reagent(Cat.No.13778075、invitrogen)でトランスフェクションした。siRNAの配列は以下のとおりである。
Hs_SERPINB1_2273_s: 5‘rGrGrArAUrCUrCUrCrCrArArGUrCrCrCrATT
Hs_SERPINB1_2273as: 5‘UrGrGrGrArCUUrGrGrArGrArGrAUUrCrCTT
トランスフェクション後は、インキュベーターの中でコンフルエントになるまで2日間培養を行い、空気暴露させた。その後、3D Keratinocyte Starter Kit(Cat.No.PR3D−K−50、CELLnTEC)の標準プロトコールに従って培養し、14日目で回収し、ヘマトキシリン・エオシン染色によって、組織解析を行った。3D Keratinocyte Starter Kit(Cat.No.PR3D−K−50、CELLnTEC)の標準プロトコールの手順として、具体的には、付属しているセルインサートを細胞培養ディッシュ(60 mm)に設置し、前駆細胞のニッチ環境を正確に再現した各種上皮細胞用の Progenitor Cell Targeting(PCT)培地CnT−Prime medium(Cat.No. CnT−PR)で浸潤させた。その後、NHEKにpCMV−HA/Serpin B12をトランスフェクションした培養細胞の懸濁液を、各インサートに添加し、細胞培養ディッシュ(60 mm)にはCnT−Prime mediumを添加した。ディッシュをCO2インキュベーターに入れ、細胞がコンフルエントになるまで2日間培養した。迅速な細胞の分化と多層化を可能にするケラチノサイト3次元培養用特殊培地CnT−Prime 3D Barrier medium(Cat.No.CnT−PR−3D、CELLnTEC)にインサート内外の培地を交換し、ディッシュをCO2インキュベーターに入れ、一晩培養した。表皮層を多層化させるための空気暴露操作として、インサート内外のすべての培地をアスピレーターで除去し、インサート外に分化用培地CnT−Prime 3D Barrier mediumを添加した。その後、インサート外にのみ、分化用培地CnT−Prime 3D Barrier mediumの交換を3日毎に行った。
セルピンB12を亢進させた場合には、角層細胞内に残存核成分がみられ、角層が厚くなる一方で、セルピンB12を抑制した場合には、角層が非常に薄くなることが確認された(図6)。
その結果、セルピンB12の発現量とケラチノサイトの角化には、有意な相関性が存在することが確認された(図7)。特に、2.0μg/mlのpCMV−HA/SerpinB12を用いた場合には、角層が非常に厚くなり、角層ないに残存核成分が見られる一方で、顆粒層が扁平化していないことがわかる。
アトピー性皮膚炎の患者から皮膚組織を採取し、メソトリプシンを認識するウサギ抗トリプシン抗体(Cat.No.01−19−032000、ATHENS社)による免疫染色を行った。図8に示されるとおり、アトピー性皮膚炎の患者ではメソトリプシンが強く発現している部分が見られる。
以下のプライマー・セットを用いて定量的PCRを行い、各薬剤の添加前後のケラチノサイト中のセルピンB12の発現を測定した。
フォワード・プライマー:CTGGGTTGAATGTCAATCCC(配列番号1)
リバース・プライマー :CACCGTGTTTTCATGGTCAA(配列番号2)
得られた値は、G3PDH(フォワード・プライマー:GGTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG(配列番号3),リバース・プライマー:TATTGGAACATGTAAACCATGTAGTTGAGG(配列番号4))の発現量をもとに補正して比較した。
用いたcDNAは、ケラチノサイトを無血清培地で培養し、コンフルエント後、1.5mMカルシウム添加し、さらに2日間培養した後、以下の薬剤を添加し24時間培養、その後、Isogen(日本ジーン)処理を行い通常の方法でmRNAを調製した。具体的には、100μlのクロロホルムを加え、クロロホルムとIsogenが混ざるまで上下に振った。2〜3分室温で静止させて後、4℃、12000gで15分遠心した。上清を新チューブに移し、イソプロパノールを250μl加えた。上下に振って混ぜ、室温で10分静止させた。4℃、12000gで15分遠心し、上清を除去した後、沈殿に70%エタノールを1ml加え、沈殿を剥がす程度に上下に振った。4℃、12000gで5分遠心後、上清を捨て、完全にエタノールを除去した。10分ほど沈殿を乾かした後、適切な量の水で沈殿を溶かした。1μgのRNAを用い、通常の方法で、逆転写を行い、PCRに供した。
各薬剤は、DMSOに10mg/mlになるように溶解し、その後、PBSもしくは、培地を用いて、最終濃度10μg/mlになるよう希釈して用いた。
結果を図9及び図10に示す。
Human Genomic DNA (Cat.No.G3041)[PROMEGA]を鋳型として、セルピンB12遺伝子の転写開始点の上流約1500bpの領域(−1bp〜−1500bp)をターゲットにクローニングを行った。領域として、−1500bp(−1bp〜−1500bp)、−1200bp(−1bp〜−1200bp)、−900bp(−1bp〜−900bp)、−600bp(−1bp〜−600bp)、−300bp(−1bp〜−300bp)、−150bp(−1bp〜−150bp)をポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)で下記の配列番号5〜11のプライマーを用いて増幅した。
−1500bpフォワード・プライマー:TTTGGTACCTAGATTGGGTGGGGAAG(配列番号5)
−1200bpフォワード・プライマー:TTTGGTACCTTCTCTCTCTCTCTCCTG(配列番号6)
−900bpフォワード・プライマー :TTGGGTACCGGTGAGAATGTTAACAAGG(配列番号7)
−600bpフォワード・プライマー :TTTGGTACCAGGGTCTTTGCAGATGTG(配列番号8)
−300bpフォワード・プライマー :TTTGGTACCTGGGAGAATAAACTCCTGC(配列番号9)
−150bpフォワード・プライマー :TGGGGTACCTAGTTTTCCAGTTCTTAATAGC(配列番号10)
共通リバース・プライマー :GCGGCTAGCTGTAAAACTTATAACGATC(配列番号11)
PCR反応には、PrimeSTAR(R) Max DNA Polymerase(Cat.No.R045A、TAKARA)を用いた。それらには、制限酵素KpnIとNheIで切断される配列を付加しており、ホタルルシフェラーゼレポーターベクターpGL4.12[luc2CP](Cat.No. E6671、PROMEGA)にライゲーション反応で組み込み、その後コンピテントセルをプラスミドで形質転換した。ライゲーション反応には、Ligation High(Cat.No. LGK−101、TOYOBO)を用い、コンピテントセルにはOne Shot(R) OmniMAXTM 2 T1R Chemically Competent E. coli(Cat.No.C8540−03、Invitrogen)を用いた。その後、形質転換体から目的のプラスミドを精製した。プラスミドの精製には、QIAprep Spin Miniprep Kit(Cat.No.27106、QIAGEN)、EndoFree Plasmid Maxi Kit(Cat.No.12362、QIAGEN)を使用した。精製されたプラスミドを用いて、ヒトケラチノサイト初代培養細胞(Normal Human Epidermal Keratinocytes (NHEK)) にFuGENE(R) HD Transfection Reagent(Cat.No.E2311、Promega)でトランスフェスションした。トランスフェクション後は、インキュベーターの中で48時間培養を行った。その後、Dual−Luciferase(R) Reporter Assay System(Cat.No.E1980、Promega)を用いたルシフェラーゼアッセイを行うことで、セルピンB12の転写調節領域の決定を行った。ルシフェラーゼアッセイの標準化として、pGL4.74[hRluc/TK](Cat.No.E6921、Promega)を使用した。
結果を図11に示す。
−1bp〜−150bp欠失用フォワード・プライマー:AATGACCTGCTAGCCTCGAGGATATC(配列番号12)
−1bp〜−150bp欠失用リバース・プライマー :AGGCTAGCAGGTCATTATCATCCCTG(配列番号13)
部位特異的変異導入ポリメラーゼ連鎖反応法にはPrimeSTAR(R) Mutagenesis Basal Kit (Cat.No.R046A、TAKARA)を用いた。その後、コンピテントセルをプラスミドで形質転換した。コンピテントセルにはOne Shot(R) OmniMAXTM 2 T1R Chemically Competent E. coli(Cat.No.C8540−03、Invitrogen)を用いた。その後、形質転換体から目的のプラスミドを精製した。プラスミドの精製には、QIAprep Spin Miniprep Kit(Cat.No.27106、QIAGEN)、EndoFree Plasmid Maxi Kit(Cat.No.12362、QIAGEN)を使用した。精製されたプラスミドを用いて、ヒトケラチノサイト初代培養細胞(Normal Human Epidermal Keratinocytes (NHEK)) にFuGENE(R) HD Transfection Reagent(Cat.No.E2311、Promega)でトランスフェスションした。トランスフェクション後は、インキュベーターの中で48時間培養を行った。その後、Dual−Luciferase(R) Reporter Assay System(Cat.No.E1980、Promega)を用いたルシフェラーゼアッセイを行うことで、セルピンB12の転写調節領域の決定を行った。ルシフェラーゼアッセイの標準化として、pGL4.74[hRluc/TK](Cat.No.E6921、Promega)を使用した。
図12に示されるとおり、−1bp〜−150bpの領域の欠失により転写活性がほとんど見られなくなったことから、−1bp〜−150bp領域はコアプロモーターとして機能することがわかる。
−300bp〜−600bp欠失用フォワード・プライマー:TGGAAATTGGGAGAATAAACTCCTG(配列番号14)
−300bp〜−600bp欠失用リバース・プライマー :TCTCCCAATTTCCAAACAAGGTCAT(配列番号15)
部位特異的変異導入ポリメラーゼ連鎖反応法にはPrimeSTAR (R) Mutagenesis Basal Kit (Cat.No.R046A、TAKARA)を用いた。
また、−300bp〜−600bp領域のクローニングにはHuman Genomic DNA (G3041)[PROMEGA]を鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)で下記の配列番号8および16のプライマーを用いて増幅した。
−600bpフォワード・プライマー :TTTGGTACCAGGGTCTTTGCAGATGTG(配列番号8)
−300bpリバース・プライマー :TTTGCTAGCTGGTTCTGGGGGACAAAC(配列番号16)
PCR反応には、PrimeSTAR(R) Max DNA Polymerase(Cat.No.R045A、TAKARA)を用いた。それらには、制限酵素KpnIとNheIで切断される配列を付加しており、ホタルルシフェラーゼレポーターベクターpGL4.12[luc2CP](Cat.No. E6671、PROMEGA)にライゲーション反応で組み込み、その後コンピテントセルをプラスミドで形質転換した。ライゲーション反応には、Ligation High(Cat.No. LGK−101、TOYOBO)を用い、コンピテントセルにはOne Shot(R) OmniMAXTM 2 T1R Chemically Competent E. coli(Cat.No.C8540−03、Invitrogen)を用いた。
その後、形質転換体から目的のプラスミドを精製した。プラスミドの精製には、QIAprep Spin Miniprep Kit(Cat.No.27106、QIAGEN)、EndoFree Plasmid Maxi Kit(Cat.No.12362、QIAGEN)を使用した。精製されたプラスミドを用いて、ヒトケラチノサイト初代培養細胞(Normal Human Epidermal Keratinocytes (NHEK)) にFuGENE(R) HD Transfection Reagent(Cat.No.E2311、Promega)でトランスフェスションした。トランスフェクション後は、インキュベーターの中で48時間培養を行った。その後、Dual−Luciferase(R) Reporter Assay System(Cat.No.E1980、PROMEGA)を用いたルシフェラーゼアッセイを行うことで、セルピンB12の転写調節領域の決定を行った。ルシフェラーゼアッセイの標準化として、pGL4.74[hRluc/TK](Cat.No.E6921、PROMEGA)を使用した。
図13には、−150bp〜−600bpの領域はサイレンサー機能することが示されている。このうち、−300bp〜−600bpの領域は、サイレンサー領域としてプロモーター領域に影響を与えているものの、単独ではサイレンサーとしての機能を有さない。一方、−150bp〜−300bpの領域は、単独でもサイレンサーとして機能するものと考えられる。
Claims (15)
- 被験者の皮膚から採取した角層試料中のセルピンB12の発現量を測定し、前記セルピンB12の発現量の増大を角層剥離の抑制の指標とすること、さらに、前記角層試料中のメソトリプシンの発現量を測定し、前記メソトリプシンの発現量の減少を角層剥離の抑制の指標とすることを特徴とする、角層剥離の抑制の評価方法。
- セルピンB12プロモーター領域の−1bp〜−150bpの領域におけるコアプロモーター活性、及び/又はセルピンB12プロモーター領域の−150bp〜−600bpの領域におけるサイレンサー活性を測定し、前記コアプロモーター活性の増大、及び/又は前記サイレンサー活性の減少を角層剥離の抑制の指標とすることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記角層剥離の抑制が肌老化に起因する、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記角層剥離の抑制が尋常性魚鱗癬又は疣贅から選択される皮膚疾患に起因する、請求項1又は2に記載の方法。
- 被験者の皮膚から採取した角層試料中のセルピンB12の発現量を測定し、前記セルピンB12の発現量の減少を角層剥離の亢進の指標とすること、さらに、前記角層試料中のメソトリプシンの発現量を測定し、前記メソトリプシンの発現量の増大を角層剥離の亢進の指標とすることを特徴とする、角層剥離の亢進の評価方法。
- セルピンB12プロモーター領域の−1bp〜−150bpの領域におけるコアプロモーター活性、及び/又はセルピンB12プロモーター領域の−150bp〜−600bpの領域におけるサイレンサー活性を測定し、前記コアプロモーター活性の減少、及び/又は前記サイレンサー活性の増大を角層剥離の亢進の指標とすることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 前記角層剥離の亢進が、日焼け、乾燥肌、アトピー性皮膚炎、乾癬、ネザートン症候群又は先天性魚鱗癬様紅皮症から選択される肌状態又は皮膚疾患に起因する、請求項5又は6に記載の方法。
- 角層剥離促進剤のスクリーニング方法であって、候補薬剤を培養細胞に適用した場合、前記細胞におけるセルピンB12の発現を阻害し、かつ、前記細胞におけるメソトリプシンの発現を亢進する薬剤を角層剥離促進剤として選定することを特徴とする方法。
- セルピンB12プロモーター領域の−1bp〜−150bpの領域におけるコアプロモーター活性を阻害する薬剤、及び/又はセルピンB12プロモーター領域の−150bp〜−600bpの領域におけるサイレンサー活性を促進する薬剤を角層剥離促進剤として選定することを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 前記角層剥離促進剤が、肌老化の予防又は改善に用いられる、請求項8又は9に記載の方法。
- 前記角層剥離促進剤が、尋常性魚鱗癬又は疣贅から選択される皮膚疾患の予防又は治療に用いられる、請求項8又は9に記載の方法。
- 角層剥離抑制剤のスクリーニング方法であって、候補薬剤を培養細胞に適用した場合、前記細胞におけるセルピンB12の発現を亢進し、かつ、前記細胞におけるメソトリプシンの発現を阻害する薬剤を角層剥離抑制剤として選定することを特徴とする方法。
- セルピンB12プロモーター領域の−1bp〜−150bpの領域におけるコアプロモーター活性を促進する薬剤、及び/又はセルピンB12プロモーター領域の−150bp〜−600bpの領域におけるサイレンサー活性を阻害する薬剤を角層剥離抑制剤として選定することを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 前記角層剥離抑制剤が、日焼け、乾燥肌、アトピー性皮膚炎、乾癬、ネザートン症候群又は先天性魚鱗癬様紅皮症から選択される肌状態又は皮膚疾患の予防、改善又は治療に用いられる、請求項12又は13に記載の方法。
- 前記培養細胞が表皮角化細胞である、請求項8〜14のいずれか1項に記載の方法。
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