201249987 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種真菌的培養方法，特別是關於一種桑黃 類子實體、培養方法及其固態發酵培養基。 【先前技術】 桑黃(原學名為乃/加⑼奶，分類學上現在亦用 /«〇«〇加"咐之新學名），屬真菌界(Fungi)、擔子菌門 (Basidiomycotina)、擔子菌綱（Hymenomycetidae)、多孔菌 目（Aphyllophorales)、多孔菌科(p〇lyp〇raceae)、層孔菌屬 (Phellinus )、（火木層孔菌）（Inonotus linteus )，其子實體入藥， 味微苦’能利五臟、軟堅、排毒、止血、活血等。桑黃無毒， 為衛生署核可之食用菌，桑黃為其俗稱，藥用最早收錄於李時 珍《本草綱目》中，又稱桑耳、猢猻眼等通長生長在桑屬植物 上、子實體顏色鮮黃而得名。 劉波在1974年第一版的《中國藥用真菌》一書中指出桑 .黃的學名是⑽/gm'ar/ws，中文名稱是「火木針層孔菌」。 劉波在1978年版的《中國藥用真菌》書中又指出，真正的桑 質是似。這種最早發現於墨西哥尤卡 坦半島’現在被認為是尸心///⑽51 /z.rt如(裂蹄木層孔菌）的同 異名。曰、韓對於桑黃的研究，皆以尸⑸&⑽為其學名。而中 國大陸戴玉成研究P 標本，認為尸//w(eM>s只分布在中 美洲，東亞地區過去被鑑定為P "«如^的種，其實是尸 baumii。苕前条夤衣贷、韓智認為^Phellinus linteus (SL碟學 201249987 名是P hwmz·/)，在中國則分別有支持p 及支持尸 igniarius兩派。PheHinus igniarius可支長在許多粮類的闊葉 樹，為一複合種，在歐洲就有五個種被分出。尸;顯仏麵)· 为布在東亞地區，種類的鑑定並無疑問，它雖然被普遍認為是 桑κ ’卻不長在桑樹上。民眾在林中採摘桑樹，有經驗者可能 辨識出P 及Ρ吻/αη·⑽這兩種目前普遍認為是桑黃的 代表種。就桑黃黃褐色硬質的多孔菌特徵，一般民眾所採的桑 黃大都是這屬的若干種類，除上述兩種外，還有尸 gilvus, R lonicericola, P. lonicerinus, R piniy R torulosus, P. 等種類亦有被視為桑黃且加以使用。目前就分類上而 言，裂蹄木層孔菌(/>知///麵//脱㈣、鲍氏木層孔菌(尸 baumii)及火木層孔菌㈣仙臓igniarius)皆被認定為桑黃。 由於近年来研究結果顯示出長期服用桑黃，不但無毒、無 副作用，同時在許多細胞及動物實驗中皆顯示出桑黃具有顯著 的抗癌、降血壓、降血糖、降膽固醇和提高免疫力等療效，因 此被認為具有可開發的潛力。其中最具代表性的便是具有許多 機能性成分如多醣體、類三莊化合物、腺苷、鍺化合物與有機 砸，此類成份具有抗癌、降血壓、降也糖、降膽固醇和提高免 疫力等療效。經⑽研究結果顯示，從桑黃分離出來的多聽 體，旎顯著刺激細胞產生免疫反應，可透過第一型血基質氧化 SlOieme Ηαι)，抑制脂多醣〇ip〇p〇lysaccharide， LPS)刺激巨噬細胞，具有抗發炎作用。另外，在動物實驗中 可抑制貫驗老鼠的血管增生(angi〇genic)，還有止痛、調節體 液、刺激免疫反應等作用，且經不同萃取方式所得的桑黃萃取 物’顯示可抑制金黃色葡萄球菌少生長 201249987 桑黃還可降低血糖值，預防及改善糖尿病、以 月;甬防治癌症方面等。目前桑黃功效性的研究以日未 σ韓國最為熱衷’歸納其研究結果顯示，⑽實桑黃且有許 少扣下幾鋪理活性，包括:增強免疫力 /:系統、触細脑性，尤其是涵雜及細胞免 卩1魅長）、抗腫瘤活性(包括抑制癌細胞增生、誘導 ^^T(aP〇P^ 5 ^ 作用AUn 對於槪道癌症的抑制效果十分顯著）、抗菌 (利二二&良好的金黃色葡萄球菌抑制效果）、抗發炎作用 m 細胞所5丨起的發炎反應)、抗氧化作用(例 (可過氧化以及清除自由基的作用）、調節血糖作用 用=糖尿㈣者血槪獅雜）、_賴作用及預 菌：=:這些廣泛的功效性使得桑黃成為_用真 ，黃的子實體具有触免疫力、增癌潍等效用雖然 =為人所知，但因人工栽培極為不易，無法量產 天數量非常有限，無論是供給研究之用或 σπ其數量上常無法滿足需求。尤其是中國大陸一直 =桑黃的主要生產與出口地區，但自從發現桑黃的抗癌功效之 I中國大陸即大力收集並出口，包括在黑龍江省東部、烏蘇 /工與興朗之間、東北地區的長白山林區、哈爾濱與吉林 妙、張廣才嶺’其次是西北地區的陝西與讀交界之子午嶺自 固、保護區產#較多。但近年來，由於外難求量大、價格高， 此+國大陸各地W現掠雜祕，峨子實 置形成，在缺找效管制之下，東北地_野生桑黃_2 201249987 難以恢復’西北地區也即將枯竭，發展人工栽培桑黃菌已喊 為當務之急。因此，曰韓等國均發展以椴木或液態發酵典養， 其中以椴木培養最具市場價值，文獻報導槪木培養之桑立與天 然桑黃之齡她’諸乡文_人工轉的桑黃進行實驗，發 現人工培養祕黃子實魏有_抑制敵，對於免疫力有強 化的作用，因此相當受到市場重視，但因生長時間仍需w 年生’生長速度相當緩慢，因此尋求快速有效的替代培養 受到市場關切及期待。 桑黃的藥理功效性主妓在1968年時，日本國立癌症研 發f其具有抗癌的功效，制是_軸細胞(sarcoma ^:達96%的抑㈣效，由於桑黃為安全的伽真菌已經獲 ^ 前研究重师餘桑黃的椴木栽培與液態發酵方 H卻較少針《發酵培養桑黃進行研究，且利用来發 :酵，僅能得到以發酵米為主的部份，並無法‘ 檢木裁培整的的桑黃類子實賴塊。由於 黃類子實體 、生長期，因此若能驗生麟間開發桑 、 *且又具有相近成分，可提供市場所需。 【發明内容】 等效tnfir倾林触纽力、職抗癌活性 培養，然而锻木裁培不易’目前主要以撅木或液態發酵 產時間開料主$ n 社的线期。目此’如何縮短生 待解决的= 產物而且又具有相近成分，是目前亟 201249987 緣此’本發明之— 方法。 § 鶴黃妍實體的培養 本發明之另一目 桑黃類子實體。 本發明之又一目 態發酵培養基。 的即是提供—_上縣養綠所得之 的即疋提供一種培養桑黃類子實體之固 種桑之二:採為-種⑽將二Γ餘 其步驟包括：㈧提供一桑黃菌 卷―箱〜二、.汽菌種接種於一液體培養基，並置於室溫下培 Μ且疋日Β (Ο將步驟(B)的桑黃菌種接種於—固態發酵 :土並置於•良溫怪濕環境下避光培養一預定時間；⑼ ^步驟(Q的桑黃g種置於—&跡騎境下照光培養一預定 日’間’（E)收集生長於該固紐酵培養基上方的桑黃類子實 體^其中細態發酵培養基包括以—40重量分的水、10〜60 重篁分的米、G.5〜5重量分的纖維素、〇 5〜5重量分的玉米粉、 _1〜1重量分的硫酸鎂以及〇._〜〗重量分的磷酸氫二鉀配 製並經滅菌而成。 反上述培養方法所得之桑黃類子實體，其十桑黃類子實體 具有一預定含量的多醣體、總黃酮及單醣成分，其多醣體含量 為250mg/g’總黃酮含量為89mg/g’而單醣成分包括選自由鼠 李糖(Rhamnose)、阿拉伯糖（Arabinose)、岩藻糖(Fucose)、葡 萄糖胺(Glucosamine)、半乳糖(Galactose)、葡萄糖(Glucose)及 麥芽糖(Mannose)所組成之群組。 另外’本發明更包括提供一種用於培養桑黃類子實體之固 態發酵培養基，包括以一 40重量分的水、10〜6〇重量分的米、 201249987 0.5〜5重量分的纖維素、0.5〜5重量分的玉米粉、0.001〜1重量 分的硫酸鎂以及0.001〜1重量分的磷酸氫二鉀配製並經滅菌而 成。較佳地，其中該固態發酵培養基的米係選自由：再來米、 蓬萊米、糙米、大麥、小麥、高梁、小米、玉米及有機米所組 成的群組；而該固態發酵培養基的水係選自由：自來水、山泉 水、礦泉水、電解水、海洋深層水、蒸餾水及去離子水所組成 的群組。 經由本發明所採用之技術手段，以桑黃菌種進行固態發酵 培養’在適合的溫度、渔度與光線下培養，大約三個月後即可 得到桑黃類子實體之菌塊。本發明之作法不但較傳統作法更為 簡單’成本低廉(無須購買椴木），且更重要的是可以在相對較 短的培養時間(僅需2·3個月）即得到具有高含量多醣體與黃酮 類成分(㈣II含量為25Gmg/g，總黃时量為89mg/g)的桑黃 類子實體，因此非常適合進行大量生產。在未來，以此培養方 法及方向發展，應可符合生技、保健食品及製藥相關產業的需 【實施方式】 本發明之桑黃類子實體、培養方法及其_ 可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得邮核 士可以據枝叙’細核之實施並非可由 限制其實施贿，«本之人士仍可依據_揭紅3 =的精神推々出其他實施例，該等實施例皆#屬於本發明之範 名詞定義： 201249987 本文中所述之「桑黃」，係包括層孔菌屬中的尸/ze//z.m^ linteus、Phellirms baumii及PheUinus igniarius三値镜楂。 本文中所述之「桑黃類子實體」，係指經由人工栽培的所 得到的桑黃菌塊’且經成分鑑定其多醣體及總黃酮含量皆與天 然桑黃子實體相近。 本文中所述之「固祕酵培養基」，触制於傳統液態 培養及椴木鱗之方式，以特定_之穀類成分為主的發酵培 養基’特別是使用如再來米、蓬萊米、輪米、大麥、小麥、高 梁、小米、玉米及有機米。 培養方法簡述： 本發明培養方法有別於傳統液態培養及锻木培養之方 ^ ’主要是以特定比例之榖類成分為主的發酵培養基進行桑 m其^要優點在於可短時間培養出桑黃類子實體之菌 醣成八析触實杉賴含量、總辆含量及單 醣成刀組成s與天然桑黃子實體相近。 驟、為本㈣桑黃類子實_培養方法之步 二養方法之整體步驟，具體實施例將詳 細敘述於後。如圖所示，本 其步驟包括:(A)提供中=桑二類子實體的培養方法， 一液體培養基，並置於室溫該桑黃_接種於 ，黃菌種難於—固 酵培養基上方的料鮮2時間；⑹轉生胁該固態發 201249987 其中所使用的固態發酵培養基包括以一 40重量分的水、 10〜60重量分的米、〇.5〜5重量分的纖維素、〇.5〜5重量分的玉 米粉、0.001〜1重量分的硫酸鎂以及0.001〜1重量分的碟酸氣 二_配製並經滅菌而成。 實施例1: 本實施例中’固體培養基材料包括大米、纖維素、玉米粉、 硫酸鎮、破酸氮'一舒專在溫度20〜28°C、澄度65〜75%下先避光 再照光培養二〜三個月的到類子實體之桑黃菌塊。 請參閱第1圖，本實施例包括下列步驟： 步驟(A):提供一桑黃菌種。本實施例係將野外採集之桑 黃子實體經由組織分離於馬鈴薯葡萄糖培養基瓊脂(p〇tat〇 dextrose agar，PDA)培養獲得純化之菌種(原種），其實體照片如 第2圖所示。 本實例使用的桑黃菌種經鑑定為加纪⑽ (尸如奶聰(參閱附件一、附件二），但該領域熟習此技藝 者應可理解並非僅限於此，另外包括p/ze/如⑽^⑽^及 办z如7·⑽亦可適用於本發明之培養方法。 步驟(B):將步驟(A)的桑黃菌種接種於馬鈐薯葡萄糖培養 基(Potato dextrose broth，PDB)，並置於抑之下搖瓶培養4天。 ▲步驟(C):將步驟(B)的桑黃雜接種於_發酵培養基， 固態發酵培養基係以大米(再來米)25g、纖維素匕、玉柳g、 硫酉夂鎂O.llg、鱗酸氫二卸0 lg、蒸鶴水4_置於玻璃罐内密 封細。C滅菌丨㈣後(固態培養基下部之乾燥桑黃米如第3 圖所不）待冷部取出並於無菌培養環境接種步驟⑻之桑黃液 201249987 體菌種3m卜接種完菌種後移至怪溫培養室㈣。 65〜75%之條件下避光培養大約兩週。 - 乂驟⑼·將步驟(C)的桑黃菌種移至自然光培養室典養為 5圖戶斤不，爿用本發明之培養方法可在經過大約9〇 天的發酵後，除了固態培養基的發酵之外，並且在發酵後率且 =;;r固態培養基上方長出-塊厚實的二 本發月之桑κ類子實體。第4圖係顯示經本發明之培 養後i位於上部的桑黃類子㈣1錢下部的_發酵培養基°2 =思圖。實體照片可參閱第SA__，第_為生長成完整 驅物’第5_顯示生長成完整随之紐，由兩 旦白了明顯看到經培養後在下部的固態發酵培養基、以及生 長於上部的桑黃類子實體之菌塊。 步驟⑹：待培養轉齡出生胁培養基上部的桑黃類 =菌塊’其厚度約lem高，並於_之下烘乾後，稱重得 養(如第6_示）。經由此方法培養所得到生長 養基上部之桑黃1 奸倾，料f知鱗錢解触養得到 類子實體菌塊。其實_可__ =不、=述方法培養所得並採集下來的完整桑黃類子實體菌 龙’而第7關顯示桑黃類子實體聽辦之情形。 實施例2 : 本實_巾，纽紐麵與纽州她，⑽下列步 集之桑 步驟(A):提供-桑黃雜。本實施儀將野外採 201249987 η子實體經由組織分離於馬铃薯葡萄糖培養基壇脂(ρ〇{^〇 dextrose agar，PDA)培養獲得純化之菌種(原種）。 步驟(B):將步驟(A)的桑黃菌種接種於馬鈐薯葡萄糖培養 基(Potato dextrose broth，PDB)，並置於24。(：之下搖瓶培養4天。 步驟(C):將步驟(B)的桑黃菌種接種於固態發酵培養基， 固態發酵培養基係以糙米3〇g、纖維素0 5g、玉米粉〇 5g、硫酸 鎂o.ig、磷酸氫二鉀〇.lg、蒸餾水4〇ml置於玻璃罐内密封於 121°C滅菌15min後，待冷卻取出並於無菌培養環境接種步驟(B) 之桑黃液體菌種3ml，接種完菌種後移至恆溫培養室以〜如艽避 光培養大約兩週。 步驟(D):將步驟(C)的桑黃菌種移至自然光培養室培養為 期約兩個半月的20〜3〇°C恆溫培養。 步驟(E).待培養完畢後取丨生長於培養基上部的桑黃類 子實體8塊，其厚度約〇.7em高，並測。(:之下賊後，稱重 得到重量4.25g。 ，本發明實施例中的固態發酵培養基的米雖使用再來米(大 米)及糙米，但在該領域中熟習此技藝者應可理解並非僅限於 此。特別疋’固態發酵培養基的米係可選自由：再來米、蓬萊 米、链米、大麥、小麥、高梁、小米、玉米及有機米所組成的 群，、且另外’軸發酵培養基所使用之水係可選自由：自來水、 山泉水、礦泉水、電解水、海洋深層水、麵水及去離子水所 組成的群組。此些相讀料的賴，·可達到本發明之功致 實施例3 : 12 201249987 本實施例主要係將虹述培養方法所狀桑黃類子 塊進行成份駿，分所含有_標性齡，包括多醣體Ϊ ϊ、類黃酮含量及單軸分組成，其方關述如下： (A)單醣分析方法 一、樣品製備： 1. 將8mg的樣品溶於iml的去離子水。 2. 將樣品稀釋到濃度為2mg/ml。 3. 取100ul的樣品溶液混合觸以你三氟乙酸(tfa)。 4. 製備的混合液於loot恆溫加熱4小時後待冷卻至常溫 再將樣品真空乾燥。 5. 再將乾燥的樣品回溶於i〇〇ui去離子水中。 6. 注射20ul的樣品於高效能液相層析-電化學偵測儀(ffigh Performance Liquid Chromatography - electrochemical detection, HPLC-ECD)進行分析。 二、分析方法與條件： 分析系統：Dionex BioLC DX-600 分析管柱：CarboPac PA1 analytical (4 x 250 mm，Dionex)
Aminotrap (Dionex) 緩衝液A : H20 ;緩衝液B : 100 mMNaOH ;沖提比例:a/b (84/16) 注射體積：20ul 流速：1 .〇 ml/min 偵測器：ECD (B)總黃酮分析方法： 以UV法測定桑黃總黃酮的含量’其步驟如下： 13 201249987 1. 溶液的配製：準確稱取芸香素(rutin)標準品23. 2mg，用 70%乙醇溶解並定容至5〇ml，作為標準液備用。 2. 複合試劑：稱取0. 8 g蝴酸和1. 〇 g醋酸鋼，用7〇%乙醇溶 解並定容至100 ml，作為複合試劑。 3. 標準曲線：準確吸取標準mtin溶液〇 5、丨5、2 〇、2 5、 3.0 ml力口70〇/〇乙醇定容至25 mb 4. 分別精密吸取上述溶液5 ml’加5ml複合試劑混勻後，384 nm處測OD (optical density)值。 5. 樣品分析：得到樣品之吸光值後從第三項標準曲線進行 内插得到實際總黃酮含量。 結果： 經由本發明培養方法所得之桑黃類子體菌塊，其中的多醣 體含量=25Gmg/g ’總黃啦量=89mg/g。而其單輸成包括： 鼠李糖(Rhamnose)、阿拉伯糖（Arabin〇se)、岩藻糖㈣⑺记）、 葡萄糖胺(Glucosamine)、半乳糖(Galactose)、葡萄糖(Gluc〇se) 及麥芽糖(Mannose)。 由以上實施例可知，本發明所提供之桑黃類子實體、培養 方法及其固態發酵培養基確具產業上之利用價值，惟以上之敘 述僅為本發明之較佳實施例說明，凡精於此項技藝者當可依據 上述之說明而作其它種種之改良，惟這些改變仍屬於本發明之 精神及以下所界定之專利範圍中。 【圖,式簡單說明】 第1圖係為本發明桑黃類子實體的培養方法之步驟流程圖； 第2圖係顯示本發明所使用的桑黃菌種照片； 201249987 燥桑黃 第^之圖係顯示本發明使用之固態發酵培養基之下部乾 第^軸示經本發明之培養方法培養後，位於上部 實_及下部_態發酵培養基之示意圖；^ ' ㈣之轉找轉後，位於上部的 .方法培養所得之桑黃類子實 第^圖下部的固態發酵培養基之實體照片； 體 圖係‘、、、員不經本發明之培養： 菌塊； 第了圖係顯示經本發明之培養 菌塊切碎之情形。 方法培養所得之桑黃類子實體 【主要元件符號說明】 桑黃類子實體 固態發酵培養基 15