TW201215414A - Lyophilized formulation of recombinant human bone morphogenetic protein-2 - Google Patents

Description

201215414 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種具有改善的保存安定性之人骨形成 蛋白-2變異體凍結乾燥製劑。更詳細而言，係關於N末端 經加成丙胺酸殘基之人骨形成蛋白-2之;東結乾燥製劑。 【先前技術】 骨形成蛋白-2(Bone Morphogenetic Protein~2，後文 記載為「BMP-2」）係一種屬於轉形生長因子-y3 (transforming growth factor /3，TGF_々）超級家族之蛋 白質，於骨的形成、器官的形成（牙齒、心臟、眼睛、軟骨 等的形成）等方面擔任重要的生物學角色。BMP已知有幾個 成員，且任一者皆具有由3個雙硫鍵（稱為「半胱胺酸結 (cysteine knot))與1個分子間雙硫鍵形成之高度保存半 胱胺酸殘基。BMP-2每1分子係由1個半胱胺酸結、1個 α -螺旋（α -hel ix)、及至少4個/3 -摺板（召-sheet)構 成，且據此形成之單體可形成二聚體。換言之，活性型之 BMP-2係由單一 BMP-2所組成之同源二聚體（homodimer)形 BMP-2係於哺乳動物細胞内合成為經糖鏈修飾之非活 性型同源二聚體的前驅物BMP-2蛋白，之後分泌至細胞外 經由蛋白酶處理（processing)轉變為活性型的同源二聚體 成熟蛋白。此活性型同源二聚體BMP-2蛋白係作為BMP-2 第I型或第II型受體之配位體（ligand)而結合於該等受 體，並藉此將BMP-2的訊號傳遞至細胞内。 3 323454 201215414 為了製造Β Μ P - 2 ’係使用一般的基因重組技術。可經 由載體（vector)為媒介，將編碼BMp—2之導入原核或 真核生物細胞中，而於該等細胞中表現及轉譯該⑽八'進= 獲得重組BMP-2(專利文獻丨、2及3，以及非專利文獻】。 如上所述，BMP-2為了轉變為活性型，則必須形成二聚體 結構，此時必須形成正確的雙硫鍵且同時折疊宮） 至正確的立體位置（專利文獻4)。 使用原核生物細胞製造重組BMP_2時，與使用真核細 胞時不同，所生成之重組蛋白並不帶有糖鏈。雖然已知大 部分BMP成員即使無糖鏈依然保有其生物活性，但由於 BMP-2為疏水性較高之蛋白質，因此，無糖鏈之重組BMp-2 具有易產生凝集，又，對於弱酸性範圍至中性範圍的水之 溶解性不佳的缺點。又，如上所述，由於BMP_2為了具有 活性而必須形成正確摺疊之二聚體，因此使用原核生物細 胞製造重組BMP-2時，於製造BMP-2之步驟及其製劑化成 醫藥品之步驟方面’如何使BMP-2安定便成為一大課題。 雖然以大腸桿菌表現之基因重組蛋白，其自N末端開 始讀取之胺基酸殘基必須為Met，但由於此Met可有時切

除有時不切除，因此可獲得以Met-Ala為重組BMP-2之N

末端序列（非專利文獻1)而完全將N末端之Met切斷之N 末端一致地自Ala開始的基因重組BMP-2。此種Ala-BMP-2 與BMP-2同樣形成同源二聚體，且具有與受體結合之活 性 '體外之誘發ALP至標的細胞之活性、體内之骨頭誘發 活性。 s 4 323454 201215414 此種「N末端經加成丙胺酸殘基之活性型人骨形成蛋 • 白-2同源二聚體」，由於其N末端結構一致，因此作為醫 ，藥品用有效成分，於工業生產之品質管理上有其利益。 此外，使用原核生物細胞製造上述之「N末端經加成 丙胺酸殘基之活性塑人骨形成蛋白_2同源二聚體」，以及 關於其蒸餾水中之凍結乾燥物方面，係記載於非專利文獻 1。但該凍結乾燥物對於水、生理食鹽水之溶解性不佳，無 法作為令人滿意之醫藥品製劑。 [先前技術文獻] [專利文獻] 專利文獻1 :國際公開W02002/013, 84〇號小冊 專利文獻2 :國際公開W02006/125, 868號小冊 專利文獻3 :國際公開W01999/18, 196號小冊 專利文獻4 :歐洲發明專利第433,225號 [非專利文獻] 非專利文獻 1 : R. Ruppertetal·，Eur, J Biochem, 237 : 295-302 (1996) 【發明内容】 [發明欲解決之課題] 如上述先前技術中所言，以原核生物細胞產生之重組 人類BMP-2,具有容易凝集且對於中性範圍PH的水或緩衝 水溶液溶解性為非常低的缺點，因此其成為使BMP_2製劑 應用之1個障礙。相反地，由於該等重組BMP-2不含有糖 鏈’因此藉由使用容易自體培養同時有優良的增殖能力之 5 323454 201215414 原核生物細胞具有可大量製造之優點。又’自異種真核生 物細胞製造重組人類BMP-2時之與人類蜜糖鏈不同的碳水 化合物的觀點來看，其亦具有無需考慮與人體有關之負面 影響的優點。然而，對於不含糖鏈之重組人類BMP-2而言， 除了凝集性、溶解性之課題，仍然存在許多關於包含貯藏 時活性降低及形成沉澱之貯藏安定性、活體内骨再生或修 復之所謂的BMp—2持續性效能之應該解決的課題。 因此’本發明以提供解決上述課題之中，特別是重組 簡P-2之凝集性、溶解性及貯藏安定性的課題之BMp_2製 主要目檩。本發明復以提供該BMP-2製劑之製造方法 二合有該隊2製劑之用於骨再生或骨治療之套組為目 [解決課題之手段] 將發明者們為解決上述課題而專心研究之，並發現 二聚端經加成丙胺酸殘基之活性型人骨形成蛋白-2同源 χ -(後文汜載為「Ala—β贴- 強酸溶液後調製 苟來結乾燥製劑，龙 之碎s 其可達到優良之再溶解性及保存安定性 欢果。而本案發明去彳 究之沾里 贫們从此知識為基礎再加上進一步研 、’、。果，確 ^ 了对於 V -λ- 製劑，遂完成本”有優良溶解性之上絲結乾燥 換言之’本發㈣如下顺示者。 —種將含有Ala〜BMp 成之康絲卜與㈣之溶好4結乾燥而 [2]如⑴所述之洗结V燥製劑，其中，該強酸係選自由 323454 6 201215414 \ 鹽酸、擰檬酸、三氟乙酸及曱磺酸所組成群組之至少 一種； [3] 如[1]或[2]所述之凍結乾燥製劑，於at時該強酸之 pH 為 0. 2 至 5. 1 ; [4] 一種含有Ala-BMP-2之凍結乾燥製劑之製造方法，其 包含下列步驟： (1) 以原核生物產生Ala-BMP-2之步驟； (2) 將得自步驟（1)之Aia_BMp_2溶解於強酸溶液之 步驟；以及 (3) 將得自步驟（2)之強酸溶解液凍結乾燥之步驟； [5] 如[4]所述之方法，其中，該強酸係選自由鹽酸、擰 振酸、二氟乙酸及甲續酸所組成群組之至少一種； [6] —種提升Ala-BMP-2之溶解性之方法，其包含下列步 驟： (Γ )將Ala-BMP-2溶解於強酸溶液之步驟；以及 (2’）將得自步驟（丨，）之強酸溶解液凍結乾燥之步 驟； [7] 如[6]所述之方法，其中，該強酸係選自由鹽酸、擰 檬酸、三氟乙酸及甲磺酸所組成群組之至少一種； [8] —種將含有Aia-BMP-2與強酸之溶液予以;東結乾燥而 成之凍結乾燥製劑，以及磷酸鈣系骨填補材料分別包 含於個別容器而成之用於骨再生或骨治療之套組。 [發明之效果] 藉由本發明係同時解決Ala-BMP-2之凝集性、溶解性 7 323454 ^ 201215414 及保存安定性之課題。據此，Ala-BMP-2可能使用於骨再 生及骨治療。 過去已知BMP-2於pH4附近易溶解，若使用酸性溶液， 則經純水透析之BMp〜2凍結乾燥製劑便容易溶解。然而此 種凍結乾燥製劑對於純水則難以溶解，而於生理食鹽水亦 無法溶解。因此，一旦考慮到實際使用於醫療現場，則不 可缺少對於此等溶媒具有優良溶解性之BMP-2製劑。 本發明之凍結乾燥製劑係具有對於純水極為良好之溶 解性（再溶解性）’據此，即便是手術中必須調配BMP-2的 情況下’亦可迅速地將BMP-2溶解於注射用水等而製造 BMP-2製劑。又，所得之再溶解液黏度低，且作業性優良。 =外，本發明之凍結乾燥製劑，由於可容易溶解於醫療現 %通㊉使用之溶媒（注射用水等），因此無需準備 =為安全性高之特定溶媒，於便利性、成本面看來亦: 【實施方式】 後文針對本發明進行說明。 (I)骨形成蛋白-2 較佳:::中’於，之動物種類方面並無特•制， 323454 遂 8 201215414 本發明之「Ala-BMP-2」為N末端經加成丙胺酸殘基之 活性型人類BMP-2同源二聚體。 如上述先前技術中所言，Ala-MP-2 與BMP-2同樣地， 具有由被稱作半胱賊結之3個雙硫鍵與丨個分子間雙硫 鍵形成之咼度保存之半胱胺酸殘基。Ma BMp_2每i分子 係由1個半胱胺酸結、1個α-螺旋、及-擅板 組成，且所形成之單體可形成二聚體。Ala-BMP-2與ΒΜΡ-2 同樣形成同源二聚體而轉變為活性型。 如如所述BMP 2係於D翁乳動物細胞内合成為經糖鏈 修飾之非活性型同源二聚體的前驅物歷，之後分泌至 、、、田胞外經蛋㈣處理轉變為活性型㈣二紐的成熟蛋白。 人類BMP-2之核苦酸序列及胺基酸序列係登錄於

GenBa_CBI，美國），其登錄職（A— Number) 為·_001200。 一特別是本發明之Ala-BMP-2係一種於人類BMP-2同源 -聚體之胺基酸序列之N末端各職加成丙胺酸殘基，且 =加成糖鏈之蛋白。各單體（成熟型人類BMp_2)之序列相 田於序列編號1之第2殘基至第115殘基之114殘基部分。 本發明之跗卜2，只要具有上述結構，則其製法拉無 曱」限制’例如，當製造時，可藉由將已加成 、现胺黾殘基之編碼BMp_2之基因（序列編號2) 以原，生物表現而製造之。此外本案發明者們已確認經此 /製造之重組Ala-BMP-2之N末端胺基酸序列皆為Aia。 本發明之BMP-2可經由載體使用基因重組技術製造厶。

S 9 323454 201215414 例如，當製造Ala-BMP-2時，於載體中的例如編碼

Met-Ala_BMP-2 之 DM、編碼 Ala-BMP-2 之 DNA 中，除了經 加成分泌訊號序列之DNA以外，可包含調控序列、選擇性 標記（marker)序列等。 調控序列係包含例如啟動子（prompter)、促進子 (enhancer)、終止子（terminater)、複製起始點、sd序列 (Shine-Dalgarno sequence)等。啟動子可列舉如：來自噬 菌體（phage)之T3啟動子、T5啟動子、T7啟動子、SP6啟 動子、PL啟動子、PR啟動子等；來自細菌之丨狀啟動子、 trp啟動子、鹼性蛋白酶啟動子、α—澱粉酶啟動子等。又， 選擇性標記包含例如抗藥性基因（青黴素 性基因、新黴素（ne〇rayein)抗性基因、康呵 抗性基因等）等 上迷戟體中 牛貝體lpiasmid)、嘆菌辦望 具體而言為PBR系、pUC系、pBluescript、 專’更 用於生產本發明之BMP_2之宿主 4體等。 物細胞’此等例如大腸桿菌、枯草桿菌、肺原核生 菌等之細t較佳係包含大腸㈣。 〜球菌屬細 原核生物之培養中，切桿g、枯 菌屬細菌等可用公知培養條件進行。於_、肺炎雙球 源、微量元素等的最適當PH之液體培養基7來源、氮來 之培養溫度及培養時間進行培養。碳^ ’以適合細胞 質、葡萄糖、乳糖、蔗糖等。又，氣办、、糸包含澱粉、麩 物、蛋白腺（peptone)、魚肉萃取物、尿^係包含酵母萃取 素、銨鹽、胺基酸

S 323454 201215414 類等。無機鹽及微1：元素係包含例如麟子、鋼離子、辞 離子、鎂離子、練子、嶋子、锰離子、_子等金屬 離子。培養溫度通常於2〇至4(rc之範圍内。 本發明之BMP-2可自破壞經形質轉換n細胞之萃 取液回收。當操作基gj使該重組蛋自可分泌至細胞外時， 亦可自培養基回收目標蛋自。接著將回收之蛋白進行再摺 疊（re-folding)之精製處理。而精製可使用肝素（hepaHn) 親和性層析法等之親和性層析法、凝膠贿層析法、離子 父換層析法、HPLC、鹽析法、透析法、超過濾法、電泳法、 等電點電泳法等進行。經此等方法可得到BMp_2。又回 收Ala-BMP-2之一實例亦可參考非專利文獻i記載之 Ala-BMP-2回收方法。 (II) BMP-2凍結乾燥製劑 本發明之來結乾燥製劑係將含有於活性型Bmp-2的n 末端經加成丙胺酸殘基之蛋白質與強酸之溶液凍結乾燥而 成之具有優良安定性之凍結乾燥製劑。 特別疋本發明之凍結乾燥製劑較佳為含有Αΐ&_βΜρ_2 與強酸之溶液經來結乾燥，含有因強酸而安定之Aia_BMp_2 作為有效成分’且具有優良安定性之BMP_2凍結乾燥製劑。 後文係敘述關於本發明之較佳態樣「Ala_BMp_2凍結乾燥 製劑」。 製造本發明之Ala-BMP-2凍結乾燥製劑時，第一，如 上所述回收藉由原核生物產生之A〗&_8肝_2。該「（ 1)以 原核生物產生Ala-BMP-2之步驟，以及Ala-BMP-2之回收 § 323454 11 201215414 方法」係如前所述音。 第二，將回收之Ala-BMP-2直接溶解於強酸溶液中， 並對強酸溶液之回收的Ala-BMP-2進行超過遽或透析，或 是對回收的Aia-BMP-2進行凝膠過濾層析等，進而調配出 Ala-BMP-2之強酸溶液。關於此「（2)將得自產生Ala-BMP-2 之步驟（1)之Ala-BMP一2溶解於強酸溶液中之步驟」，係詳 述於後文。 強酸溶液可列舉如 ____________",- π 液、甲續酸水溶液、填酸水溶液、硫酸水溶液、擰檬酸水 溶液等強酸水溶液，較佳為高揮發性且對其強 =之纟:酸水频，更㈣魏水紐、檸滅水溶液: St溶液、甲磺酸水溶液，最佳為鹽酸水溶液。 會有-此:夜之ΡΗ依據測定環境（例如裝置、水、溫度等） 下，較=動，但於肌測定時，係約〇.2以上約5.1以 4. 6以下=G· 2以上約4· 6以下，更佳為約3· 7以上約 結乾燥操作V匕°·2還低(即’酸性區域)時，當後續之凍 而使操作變^旱到之來結乾燥物再溶解時，恐怕因PH過低 Ala'BMP〜2古于不方便’又，當Ala'MP—2之溶解度降低時’ (即，中性分解之情形。另-方面，比 例如，2 怕心卿'2無法溶解。 度可選擇自G nf此等PH範圍之鹽酸水溶液時，其鹽酸濃 範圍之發M至33〇ml之濃度範圍。又，於此等濃度 鹽酸而製作。^ ’可用滅財稀釋以製作醫藥上容許之 s 12 323454 201215414 之可溶解範= ?la’P、2之濃度’只要於不產生沉澱 20mg/ml，較佳為貝=特別限制，但通常為1mg/ml至 5mg/ml。 ，、、、吨 ml 至 bmg/ml，更佳為 lmg/ml 至 的強酸溶上述濃度或。H範圍之⑽倍體積. MP—2緩慢地少量加入該強酸溶 声為（ΤΓ $ q ^MP~2強酸溶液。此時，該強酸溶液之溫 又*·，、 3〇 C，較佳為4〇C至2(TC，更佳為至10t t

Ala.~BMP—2 % ^ ^ ^ 強@文溶液可單以將Ala-BMP-2加入強酸溶 、 衣作但較佳為將此溶液進一步經由超過濾步驟， 透析v驟之方式製作。超過遽、透析之方法可適當使用本 身公知的方法。 a例如’可經由Ala_BMp_2強酸溶液反覆稀釋與濃縮約 3久之超過濾、㈣，而使Ala_BMp_2溶解於強酸溶液中。 而稀釋方法贿縮方法可適#使用本身公知的方法。

^又AhlMP·'2強酸溶液，例如已調整為上述濃度或pH 祀圍之1GG倍體積量㈣酸賴可進行約3次透析而製備 出來又’透析時之條件設定可由本技術領域者適宜設定 之0 上述'合解步驟之後續’係進行將水自所得之Ala-βΜΡ-2 強酉文/合液去除的凍結乾燥步驟。闕於該步驟（3):將溶解步 驟（2)中所得之強酸溶解液束結乾燥，於後文詳述之。 柬結乾燥步驟係包含當Ala_BMp_2強酸溶液凍結之後， 於真工t將水刀蒸發之步驟。凌結乾燥之方法可採用 以往 323454 13 201215414 公知的手段:亦可使用公知的滚結乾燥裝置。又〜 冷凝器、岐營、栓塞、絲瓶、泵等各裝置組合而成之凉 結乾燥裝置。此等袭置’商業上可自例如taitec公司得到

經此一來’將Ala'脚1強酸溶财結乾燥而得。 結乾燥體。後文將此象結乾燥體記載為「Aia_Mp 士東 乾燥製劑」等。 Q 本發明之A1 a ’ p七東結乾燥製劑具有優良安定性， 即便是進行祕乾燥亦不減損秦2之實f活性。因此， 本發明之綠簡製财必要添加—般的·所含之心 劑、安定性等，僅為Ala，p-2之;東結乾燥體即可。但/， 只要不減損本發明之效果’則不關添加其他成分。 其他成刀 <列舉如·添加賦形劑時，其可適宜選擇自 以往公知者，如隸、海藻糖（trehalGse)、棉子糖 (raffinose)、甘露糖醇（mannit〇1)、葡聚糖（(1以什抓）等 糖，精胺酸、組胺酸、甘胺酸、絲胺酸、脯胺酸等胺基酸。 此外，亦可添加界面活性劑、官能性物質（例如蛋白質、核 酸等）。 於本發明之Ala_BMP~2中，由於以原核生物細胞（較佳 為大腸桿菌）製造為特徵，因此為不含糖鏈之蛋白質。且以 本發明之方法所製造之A1 a - b M p _ 2凍結乾燥製劑於4 5 π以 下，較佳為4至25C更佳為4°C或5°C之低溫下可安定 地保存3個月以上。特別是本發明之Alamp_2凍結乾燥 4劑即便以;東結乾燥口體之形態冷藏（5。〔〕）保存或冷柬保 存3個月，仍可安定地保存，且實質上不失活性。 s 323454 14 201215414 於此之「安定地保存」，係由電泳測試（參照後文實施 例）實質上無法確認蛋白質分解的狀態，而/又，意指以於 Biacore測試（GeHeal thcare ;參照後文實施例）對於BMP 受體的活化型 IIB 受體（activine type IIB receptor， ActRIIB)之結合能力實質上保持之狀態予以保存。該安定 性之確認亦可藉由逆相HPLC(例如：C4管柱；移動相A為 0. 1%TFA ;移動相b為1〇〇%乙腈；流速為lmi/min ;梯度為 0M至100%B，20分鐘）進行之。 又較佳之「安定地保存」更進一步意指以骨誘發活性 等BMP活性實質上保持之狀態予以保存。 -本發明之Ala-BMP-2凍結乾燥製劑不僅安定地保存於 上述條件中，即便是凍結溶解亦不喪失實質活性，且保持 完整的MP活性（例如骨誘發活性）广又，即便保存於40°C 環境仍實質上不喪失BMP活性。 如上所述，以本發明之方法所 Ala_BMp_2凍結 乾燥製劑具有改善之保存安定性 又本發明之Ala-BMP七東綠乾 ’當以水再溶解 劑而復原為;東結乾燦前的_時’其pH範圍 :、有通“ 3以上5以下’較隹為3. 7以上4. 6以下之特 徵由於仔到此pH範圍之Ala、卿—2水洛液，並將其含浸 後述骨填補材料，藉此使Ala、_K_形成骨填㈣ 料之魏.由埋人骨疾病部 到具有骨再生

能力之骨填補材料之點而言 之价一BMP 一2凍結乾 燥製劑可認為是極其有用者。 s 15 323454 201215414 此外，以往的Ala-BMP-2凍結乾燥製劑對於水、生理 食鹽水之溶解性低（容易凝集），復亦欠缺BMP之安定性（參 照非專利文獻1)。因此，為了提升以往的Ala-BMP-2凍結 乾燥製劑之溶解性、安定性，必須加入各種添加劑。 但是本發明之Ala-BMP-2凍結乾燥製劑具有即便不勉 強加入各種添加劑，例如糖類、蛋白質、界面活性劑、胺 基酸等安定化劑，或是甘胺酸緩衝水溶液等所謂的緩衝劑 之物質，仍能保有其溶解性、安定性之特徵。據此，以本 發明之方法所製造之Ala-BMP-2凍結乾燥製劑，由具有實 質上難以產生凝集且高度保存安定性之點而言，相較於以 往的Ala-BMP-2凍結乾燥製劑而言極其有用。 本發明之Ala- BMP-2凍結乾燥製劑之製造方法之中， 溶解至強酸溶液之步驟（2)及凍結乾燥強酸溶解液之步驟 (3)皆亦可視為提升Ala-BMP-2之溶解性所必須包含之步 驟。 即，本發明亦為提供一種包含下列步驟： (1，）Ala-BMP-2被溶解於強酸溶液之步驟；以及 (2’）將得自步驟（Γ )之強酸溶解液凍結乾燥之步驟 而提升Ala-BMP-2之溶解性之方法者。 又本發明之Ala-BMP-2凍結乾燥劑之製造方法之中， 溶解至強酸溶液之步驟（2)及凍結乾燥強酸溶解液之步驟 (3)皆亦可視為提升Ala-BMP-2之保存安定性所必須包含 之步驟。 即，本發明亦為提供一種包含下列步驟： s 16 323454 201215414 (1 ) Ala-BMP-2被溶解於強酸溶液之步驟；以及 (2 )將得自步驟（1，）之強酸溶解液凍結乾燥之步驟 而提升Ala-BMP-2之保存安定性之方法者。 本發明之Ala-BMP-2凍結乾燥製劑可於使用時添加再 洛解用溶液而將製劑再溶解。再溶解溶液係可使用水（例如 注射用水、滅菌水、抑菌水）、水溶液（例如生理食鹽水）、 緩衝溶液（例如醋酸緩衝水溶液、酞酸緩衝水溶液、甘胺酸 、或衝水溶液）等。本發明之凍結乾燥製劑對此等再溶解用溶 液具有優良溶解性，並可於短時間内按照需求調配出〆备

Ala-BMP-2水溶液。此外，此種Aia〜BMp水溶液亦保持充 分的Ala-BMP-2活性，係可發揮優良之骨再生及治療效果 者。 遠Ala-BMP-2水溶液，含浸後述骨填補材料含浸於此 水溶液’藉此使Ala-BMP-2韻於形成骨填充材料之磷酸 每’埋入骨疾病部位時可容易得到具有骨再生能力之骨填 補材料。因此’於骨折部位、骨缺損部位之骨再生或骨治 療亦變得可能。 ° (ΙΠ)用於骨再生之醫藥製劑 本發明更進一步提供一種含有Ala-BMP-2凍結乾燥製 齊J之醫藥製劑。 由於本發明之醫藥製劑含有本發明之Ala_BMp_2凍結 乾燥製劑，故相較於以往的BMP凍結乾燥製劑更具有高^ 存安定性。因此，其實質上不需要用於一般醫藥製劑之職 形劑、載劑、添加劑等，可以直接使用於醫療用途上。作 17 323454 5 201215414

病治療劑等物質。 由於本發明之醫藥製劑具有Bmp-2活性 上可容許之賦 之藥劑、骨疾 ’特別是原本 BMP-2擁有的骨誘發活性，因此可使用於骨之再生、修復 或治療。再者，為使骨再生’便必須有骨形成蛋白⑽p)、 幹細胞及骨再生之支架（骨填補材料）。 骨再生之支架（骨填補材料）可列舉如聚乳酸（pLA)、聚 乳酸-輕乙酸（p〇ly(lactic~co-glyc〇lic acid) PLGA)、 PLA-PEG、PLGA-PEG(此處之PEG表示聚二乙醇）等合成聚合 物，玻尿酸、膠原蛋白、不全型膠原蛋白（atelocallagen) 等天然高分子，羥填灰石（hydroxyapatite)、73 -三構酸妈 (/3-TCP)、a -TCP等磷酸鈣等。 實際上，係將多孔性之支架（例如擁有顆粒、海綿、塊、 膠等之型態）和本發明之醫藥製劑（或是，本發明之 A1 a-BMP-2柬結乾燥製劑）與水溶液一起混合，而埋入骨之 患部例如骨折部位、缺損部位、異常部位等。據此，吸附 於支架之同樣的Ala-BMP-2作用至内生性幹細胞，並藉由 誘發幹細胞分化使骨組織再生。當支架為顆粒時，於整形 外科使用時係通過3至5毫米（mm)篩的箭之粒徑大小者， 另一方面，於牙科使用時係通過〇· 5至1. 5mm篩的箭之粒 徑大小者，而一般地使用之。本發明之醫藥製劑係包含 Ala-BMP-2與支架混合之型態、Ala-BMP-2塗钸於支架之型 態、Ala-BMP-2吸附於支架之型態等。 18 323454 201215414 於本發明之醫藥製劑中，Ala-BMP-2於人體之單次臨 床投予量（單次埋入或注入）最適量係依投予部位、缺損大 小、搭配組合之支架（膠原蛋白、骨填補材料、高分子膠等） 而異，一般為骨填補體積每lcm3約0. 2至3毫克（mg) (Ala-BMP-2之重量），例如骨填補體積約0. 5至20cm3左右 之範圍時，為每患者0. 1至60mg的範圍。但是，該單次臨 床投予量可能依據患者之性別、年齡、體重、病情嚴重度 等各條件改變。 本發明之醫藥製劑可使用於骨缺損之再生或填補、骨 折之早期治癒、軟骨、腱、韌帶、椎間板、半月板、齒槽 骨等骨之異常部位的再生及治療等。由於本發明之醫藥製 劑中之有效成分Ala-BMP-2有高骨誘發能力、低侵入性、 安定的品質管理及供給之優點，被期待使用於上述醫療用 途中。 (IV)用於骨再生或骨治療之套組 本發明係提供一種將Ala-BMP-2凍結乾燥製劑及磷酸 鈣系骨填補材料分別包含於個別容器而成之用於骨再生或 骨治療之套組 磷酸鈣系骨填補材料只要是包含以例如羥磷灰石、 /3-TCP及a-TCP等磷酸鈣系為主成分之骨填補材料，則 不特別限制。 本發明之套組亦可更進一步包含使用說明書、含有注 射用水等再溶解用之溶液的注射器、滅菌墊、已滅菌刮勺 等。此時，於注射器中，Ala-BMP-2溶解於水（水溶液）中， s 19 323454 201215414 並且非滿佈而是喷灑至墊内之磷酸鈣系骨填補材料（顆粒） 並以刮勺混合均勻。此種套組係意圖於骨（再生）治療之吁 使Ala-BMP-2再構成或再溶解者。本發明之簡卜2 '東 結乾燥製劑由於在水（水溶液）中短時間溶解，且所得之容 解液亦黏度低’因此醫療現場中可具有高作業效率之優署^ [實施例] ° 本發明係根據下列實施例、試驗例更進一步具體說 明，但本發明之範圍並不被此等實施例、試驗例等限制。 實施例1 : Ala-BMP-2之調配

Ala-BMP-2之s周配係以把載於非專利文獻1之方法為 基準進行。換言之’係進行利用大腸桿菌BL-21、使編石馬 Met-Ala-BMP-2(序列編號1)之DNA表現，並使用已知方法 之組合、回收其包涵體（inclusion body)、再摺疊蛋白質、 回收二聚體等各操作。將溶解於4M尿素溶液中之Ala-BMP-2 放入分子量篩截（cut-off m〇lecular weight)為35〇〇之透 析管，並以下列試驗例1中記载之各種酸性水溶液進行透 析（調配例1至2、比較例1、對照資料丨及2) ^回收透析 液，以0D278mn確認其、/農度接著藉由超過濾進行濃縮。此 濃縮步驟係使用Amicon(註冊商標）uitra_15離心過濾單 元10K(由Millpore公司製造）。 實施例2:東結乾燥 回收實施例1之濃縮步驟所得之試料，以〇D278nm確 認濃度後，將Ala-BMP-2分裴至l 5mL試管中，於„_8〇〇c凍 結1個晚上以上。凍結之試料係使用凍結乾燥裝置凍結乾 20 323454 201215414 燥之。 試驗例1:再溶解試驗 於實知例1揭系之透析步驟，係使用下表1列示之各 種水溶液（透析液）而進行透析。 觀察各試料於逸析時之狀況、凍結乾燥之容易性、所 得之凍結乾燥製劑對於水的再溶解性。再溶解係將5mg/mi 濃度之凍結乾燥製劑以注射用水溶解而進行。 [表1 ] 調配例1 調配例2 比較例1 對照試料 對照試料 透析條件 透析時之狀況 康結 乾燥 凍結乾燥製劑之再溶解性 於0· 5mM鹽酸中3次 於0· 8mM檸檬酸中3 次 於0.06%醋酸中3次 於蒸餾水t 3次 專利文獻1記載之方 ___ 於0. 001%三氟乙酸中 1次—蒸館水中3次 (以*1之不溶物為起 始試料） 於蒸餾水t 專利文獻1記載之方 法）_ 於〇. 5mM鹽酸中1二欠 蒸餾水中3次(以* 之不溶物為起始試 料） 透析開始後馬上沉 澱，但於3〇分鐘内迅 速地再溶解 透析開始後馬上沉 澱’但需要3小時左 右的時間再溶解 透析開始後馬上沉 澱’但於30分鐘内迅 速地再溶解 透析開始後馬上沉 殿，無再溶解 30分鐘内迅速地再溶 解 透析開始後馬上沉 殿，無再溶解 30分鐘内迅速地再溶 解 21 容易 一加入注射用水後便浸泡 之，靜置5分鐘左右便大部分 再溶解。進行渴流(vortex) 等攪梢辦可更容易再溶解 容易 容易 容易 容易 一加入注射用水後便浸泡 之’靜置5分鐘左右便大部分 再溶解。進行渴流(vortex) 等檀拌操作可更容易再溶解 雖然一加入注射用水便浸 泡之’靜置20分鐘左右仍 有一半左右未再溶解《進 行渦流（vortex)等攪拌操 作可更容易再溶解，但其 高黏性，使操作變得煩雜 一加入注射用水後便浸泡 之’靜置20分鐘左右便大 部分再溶解。進行渦流 (vortex)等攪拌操作可更 容易再溶解 雖然一加入注射用水便浸 泡之’靜置20分鐘左右仍 有一半未再溶解》進行渦 流(vortex)等攪拌操作， 並花時間可再溶解 323454

S 201215414 如表1所示，於強酸水溶液中進行透析之調配例1及 調配例2中，雖然透析開始後沉澱但仍能再溶解，凍結乾 燥亦可容易進行。此外，用凍結乾燥製劑調配之調配例1 及調配例2，任一者皆顯示良好的再溶解性。 另一方面，於弱酸水溶液（〇. 06%醋酸)中進行透析之比 較例1之中，雖透析時及凍結乾燥梦驟中與調配例1昱現 同樣的變動，但其凍結乾燥製劑之與溶解性的評價係高黏 性，且若不攪拌便無法再溶解。 又’於按照記載於非專利文獻1之以往方法進行透析 之對照試料X及對照試料γ中，透析時沉澱便無再溶解。 但是將此等試料於強酸水溶液中進行透析後再以蒸顧水透 析，可得到高再溶解性之凍結乾燥製劑。 此外，已明確了解相對於對照試料1及對照試料2 ’ 調配例1及調配例2之溶解速度較快。 試驗例2:貯藏安定性評價 (1) Ala-BMP-2 之調配 使用記載於實施例1之方法進行Ala-BMP-2之製造’ 並進行回收。此時，藉由超過濾/透析過濾置換〇. 5inM/L 之鹽酸’將Ala-BMP之濃度調整為2. 5mg/ml。 (2) 凍結乾燥 回收上述（1)中已調整濃度之試料，以1〇mg分涑矣真 I，义 徑24.5mrax53mm之小瓶（Viai)中，於—5〇°c凍結1個晚上 上。凍結之試料係使用凍結乾燥裝置凍結乾燥之。凍結乾 燥裝置係使用上述實施例2中所使用之相同者。 201215414 (3 )貞了藏女定性試驗 ”、τ藏女义性有關之評價項目及評價方法方面，係如 表2所示。[表2]

以曰本藥典/2. 〇1液體層析法為基準。（使用管柱：東 會社製造之 TSKgel SuperSW2000)

非還原 SDS-PAGE 蛋白質定量(UV 法） C2C12細胞生物 §式驗assay※ BIAcore試驗※ 不溶性異物 以曰本藥典/參考情報6. SDS聚丙烯醯胺電泳法為基 準。利用其確認分子量。（使用之密度計：GE Healthcare japan 公司製造 Personal Densitometer SI) 以曰本藥典/參考情報6. SDS聚丙烯醯胺電泳法為基 準。利用其確認純度。（使用之密度計：GE Healthcare japan 公司製造 Personal Densitometer SI) 以曰本藥典/2. 24紫外可見光吸光度測定法為基準。 使用C2C12細胞株（小鼠肌纖維母細胞；myoblasts)之 細胞生物試驗。將BMP-2添加於已知會分化為肌管細胞 (myotube)之C2C12細胞並培養之，則抑制肌管細胞之 分化而分化為成骨細胞(osteoblast)。故，當確認分化 至成骨細胞時，可判斷BMP-2具有活性 使用BIAcore 2000之配位體-受體結合瓦應試驗。藉^ 評價對於BMP受體之活化型I IB受體(Act I IB)之結合能 力，確認BNP-2之活性的有無。 (分析物：Ala-BMP-2，配位體：Act RIIBecd) 以了本藥典/6. 06注射劑之不溶性 —· _ I _ · * · — , /、 ττ ~ w» ※對於Ala-BMP-2原藥暫訂標準物質（由東 造）之相對力值。 評價結果列示於表3。 23

S 323454 201215414 [表3] p S S Ή il ι〇 〇卜 y ^ 眘！《 if 保存3個月 白色塊狀 2分3 0秒 無色澄清液 〇 4m0em 1 99.5% 96.6% 96.6% 1_ 2.4mg/mL 103.8% 97.7% 無法檢測出 .^ P «〇 e« Ή Ή 〇 ΙΟ (D 食剌 保存3個月 白色塊狀 2分3 0秒 無色澄清液 9) CQ 4m0em 99.8% 1_ 97.5% 97.6% 1- 2.4 mg/mL 1 90.2¾ 1______-_ ! 98.9% 無法檢測出 ! 保存於5 土 3*C 保存3個月 白色塊狀 2分3 0秒 無色澄清液 0>· CO 4m0em 99.9% 98.2% 98.2% 2.5 mg/mL 101.0% 100.3% 無法檢測出 試驗開始時 白色塊狀 2分00秒 | 無色澄清液 μ 3m0em 10096 98.2% 98.2% 2.6 mg/mL 101.6% 98.2% 無法檢測出 試驗項目 性狀 溶解時間 溶解後性狀 id a 滲透壓 |膠體過濾層析法& 還原纽DUPAGE:※ 非還原 蛋白質定量OJV法） C2C12細胞生物試驗& BIAcore 試驗& 不溶性異物 。一J-叙毋 w*%001 嫦(划斜哫<-53'3)00103坟*<)|;吞«1-鲜^轳鹅«!?0>||<:12|0|«<来 24 323454 201215414 如表3所示，即便於任一保存條件下凍結乾燥製劑之 物性、溶解特性不會減損，且亦充分保持再溶解後之 Ala-BMP2活性。此外，於40±2°C、相對濕度75±5%的這種 較為嚴酷之保存條件下，其物性、Ala-BMP-2活性亦不會 減損。換言之，顯示本發明之凍結乾燥製劑具有優良之保 存安定性。 實施例3 : Ala-BMP-2凍結乾燥製劑之製造 將下列組成之溶液填充於10mL小瓶中，混合均勻後， 於-80°C凍結1個晚上以上。凍結之試料係使用凍結乾燥裝 置凍結乾燥之。將此試料以橡膠栓塞拴住，並蓋上蓋子， 而製成小瓶填充凍結乾燥製劑。 (溶液1) 含有 Ala-BMP-2 (5mg)之 O.lmM 鹽酸 l.OmL (溶液2) 含有 Ala-BMP-2 (5mg)之 0.5mM 鹽酸 l.OmL (溶液3) 含有 Ala-BMP-2 (5mg)之 O.lmM 檸檬酸 l.OmL (溶液4)

含有 Ala-BMP-2 (5mg)之 0. ImM TFA 1· OmL (溶液5) 含有 Ala-BMP-2 (5mg)之 O.lmM 曱石黃酸 l.OmL [產業利用性] 本發明係可使用於醫療目的之藉由大腸桿菌等原核生 物細胞所製造之Ala-BMP-2。由於Ala-BMP-2於骨之再生 s 25 323454 201215414 及治療方面為有用的蛋白質，因此其在醫療領域方面之角 色備受期待。 [序列表全文] 序列編號1為N末端經加成丙胺酸殘基之人骨形成蛋 白-2之胺基酸序列。 序列編號2為編碼N末端經加成丙胺酸殘基之人骨形 成蛋白-2之DNA序列。 【圖式簡單說明】 無 【主要元件符號說明】 無

S 26 323454 201215414 序 列 表 <110〉奧斯堤歐製藥股份有限公句 <120>重組人骨形成蛋白-2凍結乾燥製劑 <130〉 552432 <160> 2 <170> Patent In version 3.3 <210> 1 <211〉 115 <212> PRT <213〉人工的 <220〉 <223〉成熟人骨形成蛋白-2其中N末端經丙胺酸殘基修飾 <400> 1

Ala Gin Ala Lys His Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 15 10 15

Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 lie Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Giy 6lu Cys 35 40 45

Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala lie Val 50 55 60

Gin Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys lie Pro Lys Ala Cys Cys 65 70 75 80

Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn 85 90 95

Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gin Asp Met Val Val Glu Gly Cys 100 105 110

Gly Cys Arg 115 <210〉 2 <211> 348 <212> DNA <213〉人工的 <220> <223〉DNA編碼之成熟人骨形成蛋白-2其中N末端經丙胺酸殘基修飾 <400> 2 atggctcaag ccaaacacaa acagcggaaa cgccttaagt ccagctgtaa gagacaccct 60 ttgtacgtgg acttcagtga cgtggggtgg aatgactgga ttgtggctcc cccggggtat 120 cacgcctttt actgccacgg agaatgccct tttoctctgg ctgatoatct gaactccact 180 aatcatgcca ttgttcagac gttggtcaac tctgttaact ctaagattcc taaggcatgc 240 tgtgtcccga cagaactcag tgctatctcg atgctgtacc ttgacgagaa tgaaaaggtt 300 (1) s 323454 201215414 gtattaaaga actatcagga catggttftg gagg&ttgtg ggtgtcgc 348 ⑵ 2

323454 S

Claims (1)

1. 201215414 •七、申請專利範圍： 1，一種涞結乾燥製劑’其係將含有Aia_BMP_2與強酸之溶 液予以:東結乾燥而成。 2. 如申請專利範圍第丨項所述之凍結乾燥製劑，其中，該 強酸係選自由鹽酸、擰檬酸、三氟乙酸及甲石黃酸所組成 群組之至少一種。 3. 如申請專利範圍第丨項或第2項所述之凍結乾燥製劑， 其中’於25Ϊ時該強酸之PH為〇. 2至5. 1。 4. 一種含有Ala-BMP-2之凍結乾燥製劑之製造方法，其包 含下列步驟： (1) 以原核生物產生Ala-BMP-2之步驟； (2) 將得自步驟（丨）之Ala_BMp_2溶解於強酸溶液之步 驟；以及 (3) 將得自步驟（2)之強酸溶解液凍結乾燥之步驟。 5·如申請專利範圍第4項所述之方法，其中，該強酸係選 自由鹽酸、檸檬酸、三氟乙酸及甲磺酸所組成群組之至 少一種。 6. —種提升Ala-BMP-2之溶解性之方法，其包含下列步 驟： (1 )將Ala-BMP-2溶解於強酸溶液之步驟；以及 (2’）將得自步驟（1，）之強酸溶解液凍結乾燥之步 驟。 7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中，該強酸係選 自由鹽酸、擰檬酸、三氟乙酸及曱磺酸所組成群組之至 1 323454 S 201215414 β 少 "種。 ， 8. —種用於骨再生或骨治療之套組，其係將含有Ala-BMP-2 ' 與強酸之溶液予以柬結乾燥而成之束結乾燥製劑，以及 磷酸鈣系骨填補材料分別包含於個別容器而成者。 s 2 323454 201215414 四、指定代表圖： • (一)本案指定代表圖為：第（）圖。（本案無圖式) (二)本代表圖之元件符號簡單說明：（無） 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： 本案無化學式 .€ 2 323454