CN103339142B - 能够穿过血脑屏障的药物递送材料，和肽及其应用 - Google Patents

Abstract

肽，其中所述肽包括由下列SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列、由下列SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列、由下列SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列、由下列SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列、或其任何组合：ALGDSLYGAASLN(SEQ ID NO:1)；MTVDNPASTTNKDKLFSVWK(SEQ ID NO:2)；PGAVPEK(SEQ ID NO:3)；和STKDLTTY(SEQ ID NO:4)。

Description

能够穿过血脑屏障的药物递送材料，和肽及其应用

技术领域

本发明涉及渗透血脑屏障的肽、药物转运蛋白、抗脊髓灰质炎病毒剂、血脑屏障渗透剂和运铁蛋白(transferrin)受体捕获体。

背景技术

中枢神经系统中的血脑屏障(BBB)严格限制物质进入中枢神经系统。这是因为血脑屏障通过稠密存在的血管内皮细胞和其他细胞被物理地变窄，并且这些细胞具有限制物质进入的生理机能。尚未揭示物质渗透通过血脑屏障的机制。目前，即使在中枢神经系统中发生不适，药物也不能递送至中枢神经系统中的目标位置。

中枢神经系统中的不适包括：例如，脊髓灰质炎病毒和日本脑炎病毒引起的感染；和神经变性疾病比如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿舞蹈症。中枢神经系统中的感染已经通过接种疫苗预防，并且感染的患者主要经历症状疗法。以该方式，还未发现有效的治疗方法。

提出的一种抗脊髓灰质炎病毒的治疗药物是包含柠檬酸和/或锌、L-精氨酸以及可接受的载体的抗病毒剂组合物(见PTL1)，提出的另一种治疗药物是包含作为有效成分的司立吉林(selegiline)的抗病毒剂(见PTL2)。这些抗病毒剂不能渗透血脑屏障，其在使用时有问题。

在更安全和有效地使用药物的尝试中，最近的兴趣不仅仅集中在适于药物的剂型并且也集中在有效递送药物至体内目标位置的药物递送方法。尤其，已经出现了对作为运输系统的药物递送系统(DDS)实际用于将药物在要求的时机以要求的量递送至需要位置的需求。

在中枢神经系统中，已经提出了使用病毒载体的方法(见，例如，PTL3)。但是，该方法在安全性方面有问题并且迄今还未实际使用。目前，还未发现允许药物渗透血脑屏障的DDS。

同时，病毒渗透血脑屏障感染中枢神经系统。例如，作为属于小RNA病毒科肠道病毒属的阳性单链RNA病毒的脊髓灰质炎病毒(PV)是脊髓灰质炎(polio)的原因并且已知具有神经趋向性。其天然宿主仅仅是人，但是实验上脊髓灰质炎病毒可感染灵长类。脊髓灰质炎病毒经口途径感染人，在消化道中增殖，并且经扁桃体或淋巴集结侵入血液。接着，脊髓灰质炎病毒渗透血脑屏障侵入中枢神经系统，在那里其主要感染运动神经细胞以破坏它们的细胞功能。结果，感染的患者遭受它们四肢的麻痹。也已知中枢神经系统具有脊髓灰质炎病毒从骨骼肌以逆行方式在神经轴突输送到达运动神经细胞的途径。

关于脊髓灰质炎病毒受体(PVR)，已知CD155参与脊髓灰质炎病毒感染(见NPL2)。

但是，使用引入PVR基因的转基因小鼠的研究表明，CD155不涉及脊髓灰质炎病毒渗透通过血脑屏障(见NPL1)。该发现显示另一受体大概参与脊髓灰质炎病毒渗透通过血脑屏障。

尽管揭示脊髓灰质炎病毒感染的机制被认为揭示从血液至中枢神经系统的血脑屏障渗透机制，但还未揭示脊髓灰质炎病毒感染的机制。

引用列表

专利文献

PTL1：日本专利申请公开(JP-A)号2009-298800

PTL2：JP-A号2004-292399

PTL3：JP-A号2009-159988

非专利文献

NPL1：Yang WX等,Virology.1997Mar17;229(2):421-8。

NPL2：Koike S等,EMBO J.1990Oct;9(10);3217-24。

发明内容

技术问题

本发明的目的是解决上面本领域相关的问题并且实现下列目标。即，本发明的目标是提供：能够渗透血脑屏障的肽；能够运输药物至中枢神经系统中靶细胞的药物转运蛋白；能够预防脊髓灰质炎病毒引起的疾病发展的抗脊髓灰质炎病毒剂；血脑屏障渗透剂；和运铁蛋白受体捕获体。

技术方案

本发明人进行大量的研究以解决上面的问题并且已经发现了下列发现。即，他们发现，包括由下列SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列、由下列SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列、由下列SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列、由下列SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列或其任何组合的肽渗透血脑屏障，基于该发现完成本发明。

本发明基于本发明人获得的上面发现，并且解决上面问题的方式如下。

<1>肽，

其中所述肽包括由下列SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列、由下列SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列、由下列SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列、由下列SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列或其任何组合：

ALGDSLYGAASLN(SEQ ID NO:1)；

MTVDNPASTTNKDKLFSVWK(SEQ ID NO:2)；

PGAVPEK(SEQ ID NO:3)；和

STKDLTTY(SEQ ID NO:4)。

<2>根据<1>的肽，其中肽渗透血脑屏障。

<3>根据<1>或<2>的肽，其中肽结合运铁蛋白受体。

<4>根据<3>的肽，其中肽结合运铁蛋白受体的AD(顶结构域)。

<5>根据<1>至<4>任一项的肽，其中肽结合由下列SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列、由下列SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列、由下列SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列、由下列SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列或其任何组合：

TQFPPSQSS(SEQ ID NO:5)；

TQFPPSRSS(SEQ ID NO:6)；

TQFPPVASS(SEQ ID NO:7)；和

TQFPPVESS(SEQ ID NO:8)。

<6>药物转运蛋白，其包括：

根据<1>至<5>任一项的肽。

<7>根据<6>的药物转运蛋白，进一步包括：载体。

<8>根据<7>的药物转运蛋白，其中载体是大分子、微装配(microassembly)、微颗粒、微球、纳米球、脂质体、乳液或其任何组合。

<9>根据<7>或<8>的药物转运蛋白，进一步包括：载体中携带的药物，其中药物用于诊断、预防、治疗或其任何组合。

<10>根据<9>的药物转运蛋白，其中用于诊断、预防、治疗或其任何组合的药物是核酸、多核苷酸、基因、其类似物、糖胺聚糖、其衍生物、寡糖、聚糖、其衍生物、蛋白质、肽、抗神经炎剂(antineurotic agent)、抗病毒剂、抗癌剂、抗生素、酶药物、抗氧化剂、抗炎剂、类固醇药物、血管紧张素转化酶抑制剂、血管扩张剂、平滑肌细胞增殖和/或迁移的抑制剂、血小板聚集抑制剂、抗凝剂、化学递质释放抑制剂、免疫抑制剂、脂质摄入抑制剂、激素药物、血管紧张素受体拮抗物、用于血管内皮细胞增殖或抑制的药剂、醛糖还原酶抑制剂、系膜细胞增殖抑制剂、脂肪加氧酶抑制剂、免疫强化剂、美拉反应抑制物、淀粉状蛋白病抑制剂、氧化氮合酶抑制剂、渐进性糖化终极产物抑制剂、自由基净化剂、或其任何组合。

<11>根据<6>至<10>任一项的药物转运蛋白，其中药物转运蛋白通过胞吞作用转运至细胞。

<12>根据<11>的药物转运蛋白，其中细胞是血管内皮细胞。

<13>根据<6>至<12>任一项的药物转运蛋白，其中药物转运蛋白用于口服施用。

<14>抗脊髓灰质炎病毒剂，其包括：

根据<1>至<5>任一项的肽，

其中抗脊髓灰质炎病毒剂预防脊髓灰质炎病毒引起的疾病的发展。

<15>血脑屏障渗透剂，其包括：

根据<1>至<5>任一项的肽，

其中血脑屏障渗透剂渗透血脑屏障。

<16>运铁蛋白受体捕获体，其包括：

根据<1>至<5>任一项的肽，

其中运铁蛋白受体捕获体结合运铁蛋白受体。

本发明优势效果

本发明可提供：能够渗透血脑屏障的肽；能够运输药物至中枢神经系统中靶细胞的药物转运蛋白；能够预防脊髓灰质炎病毒引起的疾病发展的抗脊髓灰质炎病毒剂；血脑屏障渗透剂；和运铁蛋白受体捕获体，其可解决上面本领域相关的问题并且实现上面的目标。

附图说明

图1是测试实施例1中脊髓灰质炎病毒的血脑屏障渗透测试中获得的结果图，其中垂直轴是渗透量(μL)和水平轴是时间(min)。

图2是测试实施例2的示意性、说明性表示。

图3图解测试实施例2中蛋白质印迹的结果。

图4是小鼠运铁蛋白受体1(mTfR1)的结构域结构的示意性、说明性视图。

图5是测试实施例3中产生的构建体的示意性、说明性视图。

图6是测试实施例4-1和4-2中蛋白质印迹研究的示意性、说明性表示。

图7-1图解测试实施例4-1中蛋白质印迹的结果。

图7-2图解测试实施例4-2中蛋白质印迹的结果。

图8描绘由X射线晶体学分析确定的脊髓灰质炎病毒(Mahoney株)的硬脂酸构造(2.2埃)(PDB ID:1HXS)。

图9图解测试实施例5中蛋白质印迹的结果。

图10图解测试实施例6中蛋白质印迹的结果。

图11是测试实施例7中由SEQ ID NO:1表达的肽的血脑屏障渗透测试中获得的结果图，其中垂直轴是渗透量(μL)和水平轴是时间(min)。

图12A描绘脊髓灰质炎病毒的VP1、VP2和VP3的复合体的模拟模型。

图12B描绘放大的脊髓灰质炎病毒的VP1的模拟模型。

图12C描绘运铁蛋白受体的模拟模型。

图12D描绘其中脊髓灰质炎病毒的VP1、VP2和VP3的复合体结合运铁蛋白受体的模拟模型。

具体实施方式

(肽)

本发明的肽包括由下列SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列、由下列SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列、由下列SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列、由下列SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列、或其任何组合。肽主要具有渗透血脑屏障的功能。

N末端-ALGDSLYGAASLN-C末端(SEQ ID NO:1)

N末端-MTVDNPASTTNKDKLFSVWK-C末端(SEQ ID NO:2)

N末端-PGAVPEK-C末端(SEQ ID NO:3)

N末端-STKDLTTY-C末端(SEQ ID NO:4)

只要肽渗透血脑屏障，肽可由这样的氨基酸序列组成：其与SEQ IDNOs:1至4表示的每个氨基酸序列或其任何组合相同，除了在其全部或部分中一个或数个氨基酸被替代、缺失或添加。肽的N或C末端也可经历化学修饰。化学修饰不被具体限制并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括乙酰化作用、肉豆蔻酰化、酰胺化和胱氨酰化(cystinylation)。

肽可由SEQ ID NOs:1至4表示的每一个氨基酸序列或其任何组合组成。

获得肽的方法不被具体限制并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括：化学合成肽的方法；和基于脊髓灰质炎病毒(PV)的基因序列通过分子生物学技术获得肽的方法。

化学合成肽的方法不被具体限制并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括使用肽合成仪(例如，Shimadzu Corporation Ltd.的产品)化学合成肽的方法。

基于脊髓灰质炎病毒的基因序列通过分子生物学技术获得肽的方法不被具体限制并且可取决于例如肽的序列适当选择。其例子包括下列方法：从脊髓灰质炎病毒制备的基因组RNA用逆转录酶处理以合成cDNA，其用作模板并通过PCR方法扩增，随后克隆。

用于PCR方法的引物不被具体限制并且可取决于期望的目的适当选择，只要它们可扩增由SEQ ID NOs:1至4表示的每个氨基酸序列或其任何组合。在扩增由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列的情况下，优选使用由下列SEQ ID NO:9表示的有义引物和由下列SEQ ID NO:10表示的反义引物。在扩增由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的情况下，优选使用由下列SEQ ID NO:11表示的有义引物和由下列SEQ ID NO:12表示的反义引物。在扩增由SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列情况下，优选使用由下列SEQ ID NO:13表示的有义引物和由下列SEQ ID NO:14表示的反义引物。在扩增由SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列情况下，优选使用由下列SEQ ID NO:15表示的有义引物和由下列SEQ ID NO:16表示的反义引物。

有义引物:

5’-GCTCTAGAGACCAATCAGCAGCGTTGGGCGATTCACTTTATGGTGCTGCATCC-3’(SEQ ID NO:9)

反义引物：

5’-CCCAAGCTTCTATTATTAGTTCAAGGATGCAGCACCATAAAGTGAATC-3’(SEQ ID NO:10)

有义引物:

5’-GCTCTAGAATGACTGTGGACAACCCGGCTTCTACTACAAACAAAGACAAATTGTTTTCT-3’(SEQ ID NO:11)

反义引物：

5’-CCCAAGCTTCTATTATTACTTCCACACAGAAAACAATTTGTCTTTGTTTGTAGT-3’(SEQ ID NO:12)

有义引物:

5’-GCTCTAGACCAGGGGCACCGGTGCCAGAGAAATAAT-3’(SEQID NO:13)

反义引物：

5’-CCCAAGCTTCTATTATTATTTCTCTGGCACCGGTGC-3’(SEQ ID

NO:14)

有义引物:

5’-GCTCTAGACTCGCTCCCTTATCCACCAAAGACCTGACAACGTACGCTAG-3’(SEQ ID NO:15)

反义引物：

5’-CCCAAGCTTCTATTATTAGTACGTTGTCAGGTCTTTGGTGGAT-3’(SEQ ID NO:16)

<肽结合的靶>

不具体限制肽结合的靶并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括运铁蛋白受体。

-运铁蛋白受体-

已知运铁蛋白受体(TfR)的细胞外结构域包括，如图4中图解，第一蛋白酶样结构域(PD1；蛋白酶样结构域1)，顶结构域(AD；顶结构域)，第二蛋白酶样结构域(PD2；蛋白酶样结构域2)和螺旋结构域(HD；螺旋结构域)。

这些结构域中，肽优选结合AD，并且肽更优选结合由下列SEQ IDNOs:5至8表示的每个氨基酸序列或其任何组合。注意，由下列SEQ IDNO:5表示的氨基酸序列是源自小鼠运铁蛋白1受体的序列。由下列SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列是源自人运铁蛋白1受体的序列。由下列SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列是源自人运铁蛋白2受体的序列。由下列SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列是源自小鼠运铁蛋白2受体的序列。

N末端(321)-TQFPPSQSS-(329)C末端(SEQ ID NO:5)

N末端(318)-TQFPPSRSS-(326)C末端(SEQ ID NO:6)

N末端(341)-TQFPPVASS-(349)C末端(SEQ ID NO:7)

N末端(336)-TQFPPVESS-(344)C末端(SEQ ID NO:8)

除了渗透血脑屏障的功能，肽还可结合具有例如包括由SEQ IDNOs:5至8表示的每个氨基酸序列或其任何组合的受体的任何细胞，并且取决于细胞类型进入细胞。而且，肽结合的靶不限于受体并且可取决于期望的目的适当选择。

<使用>

不具体限制肽的使用并且可取决于期望的目的适当选择。肽适合用于例如下述本发明的药物转运蛋白、抗脊髓灰质炎病毒剂、血脑屏障渗透剂和运铁蛋白受体捕获体。

(药物转运蛋白)

本发明的药物转运蛋白至少包括本发明的肽；并且，如果必要，进一步包括其他成分比如载体和药物。

<肽>

不具体限制药物转运蛋白中肽的量并且可取决于期望的目的适当选择，只要药物转运蛋白可转运药物。

如上述，肽可由与由SEQ ID NOs:1至4表示的每个氨基酸序列或其任何组合相同的氨基酸序列组成，除了在其全部或部分上一个或数个氨基酸被替代、缺失或添加。肽的N或C末端也可经历化学修饰。不具体限制氨基酸的替代、缺失或添加和药物转运蛋白的化学修饰并且可取决于待转运的药物适当选择。药物可携带在肽上转运或可携带在下述载体上转运。

<载体>

不具体限制载体的形式并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括：其中药物封闭在由膜限定的密闭空间中的形式；其中药物封闭在膜之间的形式；和其中药物封闭在膜中的形式。而且，载体的形式可为这些形式的组合形式。如此，载体可具有各种形式，并且因此取决于形式比如密闭、封装和相互作用“携带”或“携带的”具有宽范围含义。

载体形式的具体例子包括大分子、微装配、微颗粒、微球、纳米球、脂质体和乳液。不具体限制载体并且可取决于期望的目的从药物制备领域中已知的那些适当选择。

不具体限制药物转运蛋白的平均颗粒直径并且可取决于期望的目的适当选择，只要药物转运蛋白可转运至细胞。

不具体限制药物转运蛋白进入细胞的方法并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括吞噬作用、胞吞作用、胞饮和大胞饮。

许多细胞已知使用胞吞作用进行摄入。能够通过胞吞作用摄入的尺寸达约300nm。当等于或大于该尺寸时，摄入量可显著降低。

因此，药物转运蛋白的平均颗粒直径优选小于300nm。平均颗粒直径可用颗粒分布分析仪测量。

<药物>

不具体限制药物并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括用于预防、治疗、诊断的药物，或其任何组合，和其他药理学上可接受的药理学活性物质、生理学活性物质和诊断物质。

不具体限制药物的性质并且可取决于期望的目的适当选择，但是可以是亲水性药物或疏水性药物。

不具体限制药物的种类并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括：生理学活性物质比如核酸、多核苷酸、基因、其类似物、糖胺聚糖、其衍生物、寡糖、聚糖、其衍生物、蛋白质和肽；和药理学活性物质比如抗神经炎剂、抗病毒剂、抗癌剂、抗生素、酶药物、抗氧化剂、抗炎剂、类固醇药物、血管紧张素转化酶抑制剂、血管扩张剂、平滑肌细胞增殖和/或迁移的抑制剂、血小板聚集抑制剂、抗凝剂、化学递质释放抑制剂、免疫抑制剂、脂质摄入抑制剂、激素药物、血管紧张素受体拮抗物、用于增殖或抑制血管内皮细胞的药剂、醛糖还原酶抑制剂、系膜细胞增殖抑制剂、脂肪加氧酶抑制剂、免疫强化剂、美拉反应抑制物、淀粉状蛋白病抑制剂、氧化氮合酶(NOS)抑制剂、渐进性糖化终极产物(AGE)抑制剂和自由基净化剂。这些可单独使用或其两种或多种组合使用。

因为药物转运蛋白可适当渗透血脑屏障，在这些药物中，药物优选是用于中枢神经系统中治疗、诊断或二者的药物，并且更优选是能够治疗脊髓灰质炎病毒感染的药物。

抗神经炎剂的具体例子包括抗焦虑剂，比如克鲁勃(Constan)、氯恶安定(Sepazon)、Cersine、恶唑仑(Serenal)、Solanax、乙替唑仑(Depas)、异恶氟草(Balance)、来克伦(Meilax)、氯噻西泮(Rize)、氯安定(Rivotril)、溴西泮(Lexotan)、劳拉西泮(Wypax)、坦度螺酮(Sediel)、托非索洋(Grandaxin)和愈利舒盼(Erispan)；抗抑郁药比如安拿芬尼(Anafranil)、妥富脑(Tofranil)、阿米替林(Tryptanol)、阿莫沙平(Amoxan)、洛菲帕明(Amplit)、度硫平(Prothiaden)、西替普塔林(Tecipul)、盐酸米安色林(Tetramide)、马普替林(Ludiomil)、曲唑酮(Desyrel)、Reslin、舒必利(Abilit)、脱蒙治(Dogmatyl)、止吐灵(Miradol)、利他林(Ritalin)、氟伏沙明(Depromel)、帕罗西汀(Paxil)、马来酸氟伏沙明(Luvox)和盐酸米那普仑(Toledomin)；安眠药比如佐匹克隆(Amoban)、海乐神(Halcion)、氯甲西泮(Evamyl)、酒石酸唑吡坦(Myslee)、利马扎封(Rhythmy)、溴替唑仑(Lendormin)、双氯苯卓醇(Loramet)、氟硝西泮(Silece)、夸西泮(Doral)、Benzarin、艾司唑仑(Eurodin)、氟硝西泮(Rohypnol)、盐酸氟安定(Insumin)、卤恶唑仑(Somelin)、Dalmate、苯巴比妥(Phenobal)和异戊巴比妥(Isomytal)；安定剂比如稻丰散(Wintermin)、氯丙嗪(Contomin)、氰噻嗪(Neuleptil)、左美吗嗪(Hirnamin)、奋乃静(PZC)、硫利达嗪(Melleril)、溴哌利多(Impromen)、氟哌啶醇(Serenace)、匹莫奇特(Orap)、莫沙帕明(Cremin)、氯哌咪嗪(Clofekton)、盐酸卡匹帕明(Defekton)、奥昔哌汀(Forit)、佐替平(Lodopin)和安泰乐(Atarax)；情绪稳定剂比如碳酸锂(Limas)和卡马西平(Tegretol)；抗癫痫药比如乙苯妥英(Ethotoin)、苯妥英(Phenytoin)、乙酰苯丁酰脲(Acetylpheneturide)、扑米酮(Primidone)、舒噻美(Sultiame)、乙琥胺(Ethosuximide)、氯安定(Clonazepam)、卡马西平(Carbamazepine)、丙戊酸钠和唑尼沙胺(Zonisamide)；和帕金森病治疗剂比如左旋多巴剂、甲磺酸培高利特(pergolide mesilate)、盐酸金刚烷胺(amantadine hydrochloride)、盐酸苯海索(trihexyphenidyl hydrochloride)、盐酸吡洛黑汀(piroheptinehydrochloride)、盐酸马扎替可(mazaticol hydrochloride)、盐酸美噻吨(metixene hydrochloride)、比哌立登(biperiden)、普罗吩胺(profenamine)和屈昔多巴(droxidopa)。

抗病毒剂的具体例子包括阿昔洛韦(acyclovir)、更昔洛韦(ganciclovir)、去羟肌苷(didanosine)、齐多夫定(zidovudine)、索立夫定(sorivudine)和阿糖腺苷(vidarabine)。

抗癌剂的具体例子包括环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥氮氧化物盐酸盐、塞替派(thiotepa)、白消安(busulfan)、卡巴醌(carboquone)、盐酸尼莫司丁(nimustine hydrochloride)、雷莫司汀(ranimustine)、美法仑(melphalan)、托西英丙舒凡(improsulfan tosilate)、达卡巴嗪(dacarbazine)、盐酸丙卡巴肼(procarbazine hydrochloride)、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐(cytarabine ocfosfate)、依诺他滨(Enocitabine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、硫代肌苷(thioinosine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、去氧氟尿苷(Doxifluridine)、替加氟(tegafur)、甲氨蝶呤(methotrexate)、卡莫氟(Carmofur)、羟基脲(Hydroxycarbamide)、硫酸长春新碱(vincristine sulfate)、硫酸长春碱(vinblastine sulfate)、硫酸长春地辛(vindesine sulfate)、依托泊苷(etoposide)、色霉素A3(chromomycin A3)、盐酸柔红霉素(daunorubicin hydrochloride)、盐酸多柔比星(doxorubicin hydrochloride)、盐酸阿柔比星(aclarubicinhydrochloride)、吡柔比星(pirarubicin)、盐酸表柔比星(epirubicinhydrochloride)、放线菌素D(dactinomycin)、盐酸米托蒽醌(mitoxantronehydrochloride)、盐酸博来霉素(bleomycin hydrochloride)、硫酸培洛霉素(peplomycin sulfate)、丝裂霉素C(mitomycin C)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、L-天冬酰胺酶(L-asparaginase)、醋葡醛内酯(aceglatone)、二溴甘露醇(mitobronitol)、葡聚糖硫酸钠(dextran sulfatesodium)、醋酸奥曲肽(octreotide acetate)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、枸橼酸他莫昔芬(tamoxifen citrate)、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)、雌莫司汀磷酸钠(estramustine sodiumphosphate)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)和醋酸亮丙瑞林(leuprorelinacetate)。

抗生素的具体例子包括苄基青霉素G钾、苄星青霉素、苯氧甲基-青霉素钾、苯氧乙基青霉素钾、氯唑西林钠、氟氯西林钠、氨苄西林、托西酸舒他西林(sultamicillin tosilate)、盐酸巴氨西林(bacampicillinhydrochloride)、盐酸酞氨苄青霉素、仑氨西林、海他西林钾、环己西林、阿莫西林、盐酸匹美西林、阿扑西林、羧苄西林钠、卡茚西林钠、磺苄西林钠、替卡西林钠、哌拉西林钠、头孢噻唑、头孢噻吩钠、头孢唑啉钠、头孢吡硫钠、头孢环己烯、头孢氨苄、头孢曲秦丙二醇、头孢沙定、头孢克洛、头孢羟氨、盐酸头孢替安、盐酸头孢替安酯、头孢呋辛钠、头孢呋辛酯、头孢孟多钠、头孢地尼、盐酸头孢他美酯、头孢布烯(ceftibuten)、头孢三唑钠、头孢西丁钠、头孢替坦钠、头孢米诺钠、头孢拉宗钠、头孢匹胺钠、头孢磺啶钠、头孢氧哌唑钠、头孢唑肟钠、盐酸头孢甲肟、头孢曲松钠、头孢他啶、头孢咪唑钠、头孢克肟、妥米龙、头孢唑喃钠、头孢泊肟酯、头孢地秦、硫酸头孢匹罗、氧杂头霉唑钠、氟氧头孢钠、亚胺培南、西司他丁钠、氨曲南、卡芦莫南钠、硫酸链霉素、硫酸卡那霉素、硫酸新霉素、硫酸阿米卡星、硫酸庆大霉素、硫酸巴龙霉素、硫酸卡那霉素B、硫酸核糖霉素、硫酸地贝卡星、妥布霉素、硫酸西索米星、硫酸光辉霉素(mithromycin)、硫酸阿司米星、硫酸奈替米星、硫酸异帕米星、硫酸阿贝卡星、红霉素、吉他霉素、乙酰吉他霉素、磷酸竹桃霉素、交沙霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素、醋酸麦迪霉素、罗他霉素、罗红霉素、克拉霉素、盐酸四环素、盐酸土霉素、四环素偏磷酸盐、盐酸地美环素、罗利环素、盐酸多西环素、盐酸米诺环素、氯霉素、氯霉素琥珀酸钠、无味氯霉素、甲砜霉素、盐酸甲砜霉素甘氨酸酯、硫酸粘菌素、粘菌素甲磺酸钠、硫酸多粘菌素B、杆菌肽、盐酸万古霉素、盐酸林可霉素、克林霉素、盐酸大观霉素和磷霉素钙。

酶药物的具体例子包括糜蛋白酶、结晶的胰蛋白酶、链激酶-链道酶、透明质酸酶、尿激酶、那沙普酶(nasaruplase)、阿替普酶(alteplase)、氯化溶菌酶、半碱性蛋白酶、舍雷肽酶(serrapeptase)、替来激酶(tisokinase)、度替普酶(duteplase)、巴曲酶(batroxobin)、链酶蛋白酶(pronase)和菠萝蛋白酶(bromelain)。

抗氧化剂的具体例子包括生育酚、抗坏血酸和尿酸。

抗炎剂的具体例子包括水杨酸胆碱、双水杨酸酯、水杨酸钠、阿司匹林、二氟尼柳、氟芬那酸、甲芬那酸、夫洛非宁、托芬那酸、双氯芬酸钠、托美丁钠、舒林酸、芬布芬、联苯乙酸乙酯、吲哚美辛、法呢吲哚美辛(indometacin farnesil)、阿西美辛、马来酸丙谷他新(proglumetacin maleate)、氨芬酸钠、萘丁美酮、布洛芬、氟比洛芬、氟比洛芬酯、酮洛芬、萘普生、丙替嗪酸、普拉洛芬、苯氧布洛芬钙、噻洛芬酸、奥沙普秦、洛索洛芬钠、阿明洛芬、扎托洛芬、保泰松、氯非宗(clofezone)、凯布宗(ketophenylbutazone)、吡罗昔康(piroxicam)、替诺昔康(tenoxicam)、安吡昔康、盐酸噻拉米特、盐酸替诺立定、盐酸苄达明、依匹唑和依莫法宗。

类固醇药物的具体例子包括醋酸可的松、氢化可的松(磷酸酯、醋酸盐)、丁酸氢化可的松、琥珀酸氢化可的松钠、去氢氢化可的松(醋酸盐、琥珀酸盐、叔丁乙酸酯、磷酸酯)、甲基去氢氢化可的松(乙酸酯)、甲基去氢氢化可的松琥珀酸钠、曲安西龙、曲安奈德(醋酸曲安西龙)、地塞米松(磷酸酯、醋酸盐、磷酸钠盐、硫酸酯)、棕榈酸地塞米松、倍他米松(磷酸盐、2钠盐)、醋酸帕拉米松、醋酸氟氢可的松、醋酸卤泼尼松、丙酸氯倍他索、哈西奈德、二丙酸倍氯米松、戊酸倍他米松、乙酸倍他米松和醋酸可的松。

血管紧张素转化酶抑制剂的具体例子包括阿拉普利(alacepril)、盐酸咪达普利(imidapril)、盐酸替莫普利(temocapril)、盐酸地拉普利(delapril)、盐酸贝那普利(benazepril)、卡托普利(captopril)、西拉普利(cilazapril)、马来酸依那普利(enalapril)和赖诺普利(lisinopril)。

血管扩张剂的具体例子包括茶碱、二羟丙茶碱、丙羟茶碱(proxyphylline)、氨茶碱(aminophylline)、胆茶碱(choline theophylline)、前列腺素、前列腺素衍生物、前列地尔α-环糊精包合物(alprostadilalfadex)、前列地尔(alprostadil)、利脉前列素(limaprost alfadex)、罂粟碱(papaverine)、环扁桃酯(cyclandelate)、桂利嗪(cinnarizine)、富马酸苄环烷(bencyclane fumarate)、马来酸桂哌齐特(cinepazide maleate)、盐酸地拉卓(dilazep)、曲匹地尔(trapidil)、盐酸地芬尼多(difenidol)、烟酸、六烟酸肌醇酯(inositol hexanicotinate)、枸橼酸烟胺乙酯(nicametatecitrate)、烟碱醇酒石酸酯(nicotinyl alcohol tartrate)、生育酚烟酸盐、癸烟酯(hepronicate)、盐酸异克舒林(isoxsuprine)、硫酸巴美生(bamethan)、盐酸妥拉唑啉(tolazoline)、双氢麦角毒碱甲磺酸盐(dihydroergotoxinemesylate)、酒石酸艾芬地尔(ifenprodil tartrate)、盐酸莫西赛利(moxisylyte)、尼麦角林(nicergoline)、盐酸尼卡地平(nicardipine)、尼伐地平(nilvadipine)、硝苯地平(nifedipine)、盐酸贝尼地平(benidipine)、盐酸地尔硫卓(diltiazem)、尼索地平(nisoldipine)、尼群地平(nitrendipine)、盐酸马尼地平(manidipine)、盐酸巴尼地平(barnidipine)、盐酸依福地平(efonidipine)、盐酸维拉帕米(verapamil)、盐酸曲美他嗪(trimetazidine)、卡托普利(captopril)、马来酸依那普利(enalapril maleate)、阿拉普利(alacepril)、盐酸地拉普利(delapril)、西拉普利(cilazapril)、赖诺普利(lisinopril)、盐酸贝那普利(benazepril)、盐酸肼屈嗪(hydralazine)、盐酸托屈嗪(todralazine)、布屈嗪(budralazine)、卡屈嗪(cadralazine)、吲达帕胺(indapamide)、盐酸卡波罗孟(carbocromen)、乙氧黄酮(efloxate)、盐酸依他苯酮(etafenone)、盐酸奥昔非君(oxyfedrine)、尼可地尔(nicorandil)、亚硝酸戊酯和硝酸异山梨酯。

平滑肌细胞增殖和/或迁移的抑制剂的具体例子包括肝素钠、达肝素钠(低分子量肝素)、肝素钙和硫酸葡聚糖。

血小板聚集抑制剂的具体例子包括盐酸噻氯匹定(ticlopidine)、西洛他唑(cilostazol)、二十碳五烯酸乙酯(ethyl icosapentate)、贝前列素钠、盐酸沙格雷酯(sarpogrelate)、巴曲酶和双嘧达莫(dipyridamole)。

抗凝剂的具体例子包括肝素钠、达肝素钠(低分子量肝素)、肝素钙、硫酸葡聚糖、杀鼠灵的钾盐(warfarin potassium)和阿加曲班(argatroban)。

化学递质释放抑制剂的具体例子包括曲尼司特(tranilast)、富马酸酮替芬(ketotifen fumarate)、盐酸氮卓斯汀(azelastine)、奥沙米特(oxatomide)、氨来呫诺(amlexanox)和瑞吡司特(repirinast)。

免疫抑制剂的具体例子包括环孢霉素(cicrosporin)。

不具体限制用于诊断的药物并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括X射线造影剂、放射性同位素标记核医学诊断药物和核磁共振诊断药物。

X射线造影剂的具体例子包括泛影酸葡甲胺盐(meglumineamidotrizoate)、碘他拉酸钠(sodium iotalamate)、碘他拉葡胺(meglumineiotalamate)、胃影葡胺(gastrografin)、碘达明(meglumine iodamide)、碘化油注射液(lipiodol ultra fluide)、胆影葡胺(adipiodone meglumine)、碘克沙酸(ioxaglic acid)、碘西曲葡胺(meglumine iotroxate)、碘曲仑(iotrolan)、碘番酸(iopanoic acid)、碘帕醇(iopamidol)、碘海醇(iohexol)、碘氟醇(ioversol)、碘泊酸钠、碘美普尔(iomeprol)、甲泛影钠(isopaque)和碘沙酸。

不具体限制药物转运蛋白上携带的药物的量并且可取决于例如药物的类型适当选择。

<其他成分>

不具体限制药物转运蛋白中的其他成分并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括添加剂、补充物和水。这些可单独使用或其两种或多种组合使用。

不具体限制添加剂或补充物并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括消毒剂、防腐剂、粘结剂、增稠剂、粘合剂、整合剂、着色剂、稳定剂、pH调节剂、缓冲液、张度剂、溶剂、抗氧化剂、防紫外线剂、晶体沉淀的预防剂、消泡剂、性质改善剂和消毒剂。

其他成分可与药物转运蛋白一起配制或配制在载体中。

不具体限制消毒剂并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括阳离子表面活性剂、比如苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苄索氯铵(benzethonium chloride)和西吡氯铵(cetylpyridinium chloride)。

不具体限制防腐剂并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括对羟基苯甲酸酯、氯丁醇和甲酚(clesol)。

不具体限制粘结剂、增稠剂和粘合剂并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括淀粉、糊精、纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基淀粉、普鲁兰多糖(pullulan)、藻酸钠、藻酸铵、丙二醇海藻酸酯、瓜耳树胶、刺槐豆胶、阿拉伯树胶、黄原酸胶、明胶、酪蛋白、聚乙烯醇、聚环氧乙烷、聚乙二醇、乙烯/丙烯嵌段聚合物、聚丙烯酸钠和聚乙烯吡咯烷酮。这些可单独使用或其两种或多种组合使用。

不具体限制整合剂并且可取决于期望的目的适当选择。整合剂的例子包括水、乙醇、丙醇、单糖浆(simple syrup)、葡萄糖液、淀粉液、明胶液、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基淀粉、甲基纤维素、乙基纤维素、紫胶、磷酸钙和聚乙烯吡咯烷酮。

不具体限制着色剂并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括氧化钛和氧化铁。

不具体限制稳定剂并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括黄蓍胶、阿拉伯树胶、明胶、焦亚硫酸钠、EDTA、巯基乙酸和硫羟乳酸。

不具体限制pH调节剂和缓冲液并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括柠檬酸钠、醋酸钠和磷酸钠。

不具体限制张度剂并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括氯化钠和葡萄糖。

不具体限制药物转运蛋白中其他成分的量并且可取决于期望的目的适当选择。

<药物转运蛋白的转运>

不具体限制运输药物转运蛋白至细胞的方法并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括使用药物转运蛋白转运至的细胞的功能或性质的方法。

可用于药物转运蛋白的转运的细胞功能或性质的例子包括细胞的吞噬作用和胞吞作用。

施用药物转运蛋白之前，细胞可提前活化以引起吞噬作用或胞吞作用。当细胞过分活化而增加了它们的黏着性或造成聚集时，它们可用适当选择的方法失活。

不具体限制可应用药物转运蛋白的细胞并且可取决于期望的目的适当选择，只要细胞可识别由上面SEQ ID NOs:1至4表示的每个氨基酸序列或其任何组合。因为本发明的肽可渗透血脑屏障；即，药物转运蛋白可渗透血脑屏障，其可适用于例如预防、治疗或诊断中枢神经系统。

不具体限制构成中枢神经系统的细胞并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括神经细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞和周细胞。在它们中，药物转运蛋白合适地转运至血管内皮细胞。

<施用>

不具体限制药物转运蛋白的施用方法、施用剂量、施用周期和施用目标并且可取决于期望的目的适当选择。

不具体限制施用方法并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括局部施用方法、肠内施用方法和肠胃外施用方法。

不具体限制局部施用方法并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括皮肤施用方法、吸入施用方法、输注施用方法、施用滴眼剂在结膜上的方法、鼻内施用方法和阴道内施用方法。

不具体限制肠内施用方法并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括口服施用方法、管饲方法和灌肠施用方法。

不具体限制肠胃外施用方法并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括静脉内施用方法、动脉内施用方法、肌内施用方法、心内施用方法、皮下施用方法、骨内施用方法、皮内施用方法、鞘内施用方法、腹膜内施用方法、膀胱内施用方法、经皮施用方法、粘膜施用方法、吸入施用方法、硬膜外施用方法和玻璃体内施用方法。

不具体限制施用剂量并且可考虑施用目标的各种因素适当选择，比如年龄、体重、组成、症状和包含其他有效成分的药物施用的存在或不存在。

不具体限制用作施用目标的动物种类并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括人、猴、猪、牛、绵羊、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠和鸟，合适地使用人。

<使用>

药物转运蛋白可单独使用或与包含其他有效成分的药物或药物转运蛋白组合使用。而且，药物转运蛋白可在使用之前配制成包含其他有效成分的药物。

<应用>

因为本发明的药物转运蛋白可渗透血脑屏障，所以药物转运蛋白可适当用于预防、治疗或诊断中枢神经系统中的不适。尤其，其适当用于预防、治疗或诊断脊髓灰质炎病毒的感染。

(抗脊髓灰质炎病毒剂和血脑屏障渗透剂)

<抗脊髓灰质炎病毒剂>

本发明的抗脊髓灰质炎病毒剂包含本发明的肽；并且，如果必要，进一步包含其他成分。

抗脊髓灰质炎病毒剂可适当结合作为中枢神经系统的血管内皮细胞上、尤其是构成血脑屏障的血管内皮细胞上存在的脊髓灰质炎病毒受体的运铁蛋白受体。当抗脊髓灰质炎病毒剂结合运铁蛋白受体时，通过例如胞吞作用，抗脊髓灰质炎病毒剂被摄入具有运铁蛋白受体的血管内皮细胞。结果，抗脊髓灰质炎病毒剂对脊髓灰质炎病毒渗透通过血脑屏障具有竞争性抑制作用，并且可防止脊髓灰质炎病毒渗透通过血脑屏障以预防伴随脊髓灰质炎病毒感染的神经系统不适。

不具体限制抗脊髓灰质炎病毒剂中肽的量并且可取决于期望的目的适当选择，只要抗脊髓灰质炎病毒剂可防止脊髓灰质炎病毒渗透通过血脑屏障。而且，抗脊髓灰质炎病毒剂可以是肽本身。

<血脑屏障渗透剂>

本发明的血脑屏障渗透剂包含本发明的肽；并且，如果必要，进一步包含其他成分。

不具体限制血脑屏障渗透剂中肽的量并且可取决于期望的目的适当选择，只要血脑屏障渗透剂可渗透血脑屏障。而且，血脑屏障渗透剂可以是肽本身。

<其他成分>

不具体限制抗脊髓灰质炎病毒剂或血脑屏障渗透剂中的其他成分并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括药理学上可接受的载体。

也不具体限制上面载体并且可取决于例如抗脊髓灰质炎病毒剂的剂型适当选择。其例子包括上述作为药物转运蛋白中的其他成分的那些。

不具体限制抗脊髓灰质炎病毒剂或血脑屏障渗透剂中其他成分的量并且可取决于期望的目的适当选择。

抗脊髓灰质炎病毒剂或血脑屏障渗透剂可单独使用或其两种或多种组合使用。抗脊髓灰质炎病毒剂或血脑屏障渗透剂可结合包含其他有效成分的药物使用。而且，抗脊髓灰质炎病毒剂或血脑屏障渗透剂可在使用之前配制成包含其他有效成分的药物。

<剂型>

不具体限制抗脊髓灰质炎病毒剂或血脑屏障渗透剂的剂型并且可取决于预期施用方法适当选择。其例子包括固体制剂、半固体制剂和液体制剂。

不具体限制生产抗脊髓灰质炎病毒剂或血脑屏障渗透剂的方法并且可取决于剂型从常规方法适当选择。

-固体制剂-

不具体限制固体制剂并且可取决于期望的目的适当选择。当其用作内服制剂时，固体制剂的例子包括片剂、咀嚼片剂、起泡片剂、口服崩裂片剂、含片、滴液、硬胶囊、软胶囊、颗粒、粉末、丸剂、干糖浆和浸剂。

当固体制剂是外用制剂时，固体制剂的例子包括栓剂、泥罨剂和石膏。

-半固体制剂-

不具体限制半固体制剂并且可取决于期望的目的适当选择。当其用作内服制剂时，半固体制剂的例子包括药糖剂、口香糖、甜点(whip)和凝胶。

当半固体制剂用作外用制剂时，半固体制剂的例子包括软膏、乳霜、奶油冻、吸入剂和鼻用凝胶。

-液体制剂-

不具体限制液体制剂并且可取决于期望的目的适当选择。当其用作内服制剂时，液体制剂的例子包括糖浆、饮料、悬液和醑剂。

当液体制剂用作外用制剂时，液体制剂的例子包括液体、滴眼剂、气溶胶和喷雾剂。

<施用>

不具体限制药物转运蛋白的施用方法、施用剂量、施用周期和施用目标并且可取决于期望的目的适当选择。

不具体限制施用方法并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括局部施用方法、肠内施用方法和肠胃外施用方法。

不具体限制施用剂量并且可考虑施用目标的各种因素适当选择，比如年龄、体重、组成、症状和包含其他有效成分的药物施用的存在或不存在。

不具体限制用作施用目标的动物种类并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括人、猴、猪、牛、绵羊、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠和鸟，合适地使用人。

(运铁蛋白受体捕获体)

本发明的运铁蛋白受体捕获体包含本发明的肽；并且，如果必要，进一步包含其他成分。运铁蛋白受体捕获体可适当地捕获运铁蛋白。

不具体限制运铁蛋白受体捕获体中肽的量并且可取决于期望的目的适当选择，只要运铁蛋白受体捕获体可捕获运铁蛋白受体。而且，运铁蛋白受体捕获体可以是肽本身。

<其他成分>

不具体限制运铁蛋白受体捕获体中的其他成分并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括药理学上可接受的载体。

也不具体限制上面载体并且可取决于期望的目的适当选择。其例子包括上述作为药物转运蛋白中的其他成分的那些。

不具体限制运铁蛋白受体捕获体中其他成分的量并且可取决于期望的目的适当选择。

运铁蛋白受体捕获体可单独使用或其两种或多种组合使用。运铁蛋白受体捕获体可结合包含其他有效成分的药物使用。而且，运铁蛋白受体捕获体可在使用之前配制成包含其他有效成分的药物。

实施例

接下来将通过实施例详细描述本发明，其不应解释为对本发明的限制。

(测试实施例1：运铁蛋白对脊髓灰质炎病毒渗透通过血脑屏障的作用)

-制备脑毛细血管内皮细胞-

在包含按质量计10%失活胎牛血清(FBS)(COSMO BIO Co.，Ltd.的产品)的D-MEM(Sigma Co.，Ltd.的产品)中培养小鼠脑毛细血管内皮细胞(MBEC)4。

通过用胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸盐)处理，分散这些脑毛细血管内皮细胞。

注意，已经根据Shirai A等，BBA；1994年7月21日；1222(3)：400-404的描述制备MBEC。

-制备脊髓灰质炎病毒-

根据之前本发明人报道的Yang WX.等，1997，Virology，Vol.229，p.421-p.428的描述，制备纯化的脊髓灰质炎病毒(PV)。

用Dounce型匀化器在缓冲液(10mM Tris-HCL(pH7.4)、100mM氯化钠、1.5mM氯化镁、5mM EDTA)中匀化感染了脊髓灰质炎病毒(Mahoney株)的漂浮HeLa细胞。用DEAE-琼脂糖(商品名：CL-6B，GE Healthcare，Co.，Ltd.的产品)处理细胞质部分并进行蔗糖密度-梯度离心和氯化铯密度-梯度离心。其后，用脱盐柱(商品名：PD-10，GEHealthcare，Co.，Ltd.)处理所得产物以纯化脊髓灰质炎病毒颗粒。

-制备荧光标记的脊髓灰质炎病毒-

用下述对上面纯化的脊髓灰质炎病毒进行荧光标记：商品名：Alexa Fluor(注册商标)568-蛋白质标记试剂盒(Invitrogen Co.，Ltd.的产品)。在PBS中制备荧光标记的脊髓灰质炎病毒以便具有0.4mg/mL的浓度。

注意，PBS的组成如下：2.7mM氯化钾、1.47mM磷酸二氢钾(无水)、137mM氯化钠和8.1mM磷酸氢二钠(无水)。

<脊髓灰质炎病毒的血脑屏障渗透测试>

在37℃下用I型胶原(Sigma Co.，Ltd.的产品)包被Transwell板(商品名，Corning Incorporated的产品(12孔))4小时并且在使用前干燥过夜。

将上面制备的脑毛细血管内皮细胞以7×10⁴个细胞/孔放置在Transwell板的上层部分，并且在37℃和5%CO₂下在包含按质量计10%失活胎牛血清(FBS)(COSMO BIO Co.，Ltd.的产品)的D-MEM(SigmaCo.，Ltd.的产品)中培养72小时，从而建立血脑屏障的体外模型培养系统。

将荧光标记的脊髓灰质炎病毒(127μg/mL)和荧光标记的运铁蛋白(商品名：Alexa Fluor(注册商标)555-运铁蛋白，Invitrogen Co.，Ltd.的产品)(180μg/mL)或FITC标记的葡聚糖(Sigma Co.，Ltd.的产品)(180μg/mL)添加至Transwell板中的脑毛细血管内皮细胞的培养物中。在其后的5min、10min和15min，回收Transwell板下层部分中的培养物并且用荧光分光光度计(商品名：F-2500，Hitachi High-TechnologiesCorporation的产品)测量荧光强度。荧光强度表示为脊髓灰质炎病毒通过Transwell板中脑毛细血管内皮细胞的渗透量。

结果显示在图1中。在仅仅添加脊髓灰质炎病毒的情况下(对应图1中的“PV”)，PS值(渗透率，渗透活性)是1.89。在添加脊髓灰质炎病毒和运铁蛋白的情况下(对应图1中的“PV+Tf”)，PS值是1.02。在添加葡聚糖的情况下，PS值是0.20。

因为在混合脊髓灰质炎病毒和运铁蛋白并且添加至脑毛细血管内皮细胞的(PV+Tf)情况下渗透率小于脊髓灰质炎病毒单独添加至脑毛细血管内皮细胞的(PV)情况，发现运铁蛋白抑制脊髓灰质炎病毒渗透通过血脑屏障。该结果显示，脊髓灰质炎病毒经与运铁蛋白相同的受体渗透脑毛细血管内皮细胞。

(测试实施例2：确认脊髓灰质炎病毒和运铁蛋白受体之间的结合)

接下来，通过蛋白质印迹以下列方式确认脊髓灰质炎病毒是否直接结合运铁蛋白受体。图2是测试实施例2的示意性、说明性表示。

-制备运铁蛋白受体-

--克隆小鼠运铁蛋白受体1(mTfR1)--

已经从小鼠的肝脏制备的总RNA用于通过PtimeScript1st StrandcDNA合成试剂盒(TAKARA BIO INC.的产品)制备cDNA。制备的cDNA用作克隆mTfR1可溶性结构域(R123至F763)的模板。基于GeneBank记录号BC054522.1的序列，设计和使用下列引物：下列SEQID NO:17表示的包含SacII切割位点(下划线序列)的引物序列的有义引物；和下列SEQ ID NO:18表示的包含XhoI切割位点(下划线序列)(从3’侧终止密码子下游150个碱基)的引物序列的反义引物。使用这些引物进行PCR以扩增mTfR1的基因片段。将基因片段插入融合N末端Strep标签的蛋白质(商品名：pASK-IBA7(+)，IBA Co.，Ltd.的产品)的表达载体的SacII-XhoI切割位点。如此构建的表达载体下文可称为pASK-mTfR1。

有义引物:

5’-TCCCCGCGGTCGCTTATATTGGGCAGACCTCAAA-3’(SEQID NO:17)

反义引物：5’-CCGCTCGAGTCCAACCCCGCACTAAAAGCTG-3’(SEQ ID NO:18)

--Strep-mTfR1的表达和纯化--

构建的表达载体pASK-mTfR1用于转化大肠杆菌JM109(TOYOBO CO.，LTD的产品.)，其在37℃下培养直到在OD600的浊度达到0.5。其后，以200ng/mL添加四环素至培养物，并且在引入mTfR1之后3小时收获细胞。用STD缓冲液(20mM Hepes-KOH(pH7.4)，150mM氯化钠)洗涤收获的细胞。超声破碎悬浮在STD缓冲液中的细胞20sec10次(间隔：30sec)，随后以10,000×g并且在4℃下离心15min。已经去除未破碎细胞的离心产物用作裂解液(上清液)。通过使所得上清液使用柱(商品名：Strep-tactin supper-flow琼脂糖柱，IBA Co.，Ltd.的产品)进行亲和纯化并且凝胶过滤(商品名：NAP-10柱，GE Healthcare，Co.，Ltd.)，制备纯化的Strep-mTfR1。

-制备活的脊髓灰质炎病毒-

用脊髓灰质炎病毒(Mahoney株)感染在包含按质量计5%的新生牛血清(NCS)的D-MEM中培养的AGMK(非洲绿猴肾)细胞，并且从AGMK细胞的培养物上清液制备活的脊髓灰质炎病毒。发现该活的脊髓灰质炎病毒具有10⁸pfu/mL的病毒滴度。

-制备混合物2-1-

将活的脊髓灰质炎病毒(150μL)和Strep-mTfR1(10μg)在STD缓冲液中混合在一起，使混合物的总量是0.25mL。将所得混合物在37℃下温育2小时并且接着在4℃下16小时。

-制备混合物2-2-

以与混合物2-1的制备相同的方式制备混合物2-2，不同的是不添加Strep-mTfR1。

-制备混合物2-3-

以与混合物2-1的制备相同的方式制备混合物2-3，不同的是Strep-mTfR1变为Strep-tagII(IBA Co.，Ltd.的产品)。

<脊髓灰质炎病毒和运铁蛋白受体之间的结合测试>

将混合物2-1至2-3的每一个添加至Strep-Tactin(注册商标)琼脂糖(超流速)(IBA Co.，Ltd.的产品)中，随后在4℃下温育1小时。所得混合物以900rpm离心3min并且丢弃上清液。添加200μL的STD缓冲液至沉淀物，并且混合物以900rpm离心3min以洗涤沉淀物。该洗涤处理总共进行5次以纯化。作为该纯化的结果，结合Strep-Tactin(注册商标)琼脂糖(超流速)的一些化合物(具有和/或结合Strep-tag的化合物)残留在沉淀物中，并且不与其结合的一些化合物被洗涤掉。

纯化之后，悬浮在STD缓冲液中的8μL的5mM脱硫生物素(Sigma Co.，Ltd.的产品)被添加至获得的沉淀物，并且该混合物以900rpm离心3min以获得上清液。该处理释放Strep-Tactin(注册商标)琼脂糖(超流速)和结合Strep-Tactin(注册商标)琼脂糖的化合物之间的结合，使其流入上清液。

将用于SDS-PAGE的5×样品缓冲液添加至纯化的混合物2-1至2-3每一个的上清液中。而且，作为阳性对照，取样25μL未纯化的混合物2-1(按质量计混合物总量的10%)并且向其添加用于SDS-PAGE的5×样品缓冲液。这些混合物在95℃下温育3min，接着以900rpm离心3min，并且上清液用作SDS-PAGE的样品。

注意，用于SDS-PAGE的5×样品缓冲液的组成如下：0.312MTris-HCl(pH6.8)、按质量计5%的十二烷基硫酸钠(SDS)、按质量计50%的甘油、按质量计0.025%的溴酚蓝(BPB)和5mM的二硫苏糖醇(DTT)。也在下列测试实施例中，也使用相同的用于SDS-PAGE的5×样品缓冲液。

根据常规方法对这些样品进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。使用抗脊髓灰质炎病毒颗粒抗体(商品名：兔多克隆抗体)或抗牛抗体(商品名：抗血清白蛋白，小鼠单克隆抗体，ANTIBODY SHOP Co.，Ltd.的产品)作为一抗，并且抗兔Ig-HRP抗体(商品名：Anti-Rabbit Ig-HRP，DAKOCo.，Ltd.的产品)作为二抗，进行蛋白质印迹。

结果显示在图3中。在包含脊髓灰质炎病毒和Strep-mTfR1的混合物2-1情况下，即使纯化之后也检测到带。该结果显示脊髓灰质炎病毒直接结合运铁蛋白受体。

(测试实施例3：鉴定运铁蛋白受体对脊髓灰质炎病毒的结合结构域)

接下来，采用下列方法确认运铁蛋白受体结合脊髓灰质炎病毒的结构域。

如图4中图解，已知小鼠运铁蛋白受体1(mTfR1)包含：从N末端侧第124残基至第185残基的第一蛋白酶样结构域(PD1)；第186残基至第387残基的顶结构域(AD)；第388残基至第608残基的第二蛋白酶样结构域(PD2)；和第609残基至第763残基的螺旋结构域(HD)。这些结构域是细胞外结构域。

使用测试实施例2中制备的pASK-mTfR1作为PCR的模板，通过常规方法产生下列6种构建体：细胞外结构域的全长的构建体1；PD1和AD的构建体2；去除AD的细胞外结构域的全长的构建体3(ΔAD)；仅仅AD的构建体4；PD2和HD的构建体5；和仅仅PD1的构建体6。图5示意性图解构建体1至6。

在Strep-tag表达载体(商品名：pASK-IBA7(+)，IBA Co.，Ltd.的产品)中克隆产生的构建体1至5的每一个。在GST-tag表达载体(商品名：pGEX-p4X，Promega Co.，Ltd.的产品)中克隆构建体6。

下文，包含构建体1的表达载体可称为“pASK-构建体1”，包含构建体2的表达载体可称为“pASK-构建体2”，包含构建体3的表达载体可称为“pASK-构建体3”，包含构建体4的表达载体可称为“pASK-构建体4”，包含构建体5的表达载体可称为“pASK-构建体5”和包含构建体6的表达载体可称为“pGEX-构建体6”。

接下来，将pASK-构建体1引入大肠杆菌JM109(TOYOBO CO.，LTD的产品.)，其中表达重组体蛋白质1(细胞外结构域的全长)。

与pASK-构建体1的情况类似，pASK-构建体2用于表达重组体蛋白质2(PD1+AD)，pASK-构建体3用于表达重组体蛋白质3(ΔAD)，pASK-构建体4用于表达重组体蛋白质4(AD)，pASK-构建体5用于表达重组体蛋白质5(PD2+HD)和pGEX-构建体6用于表达重组体蛋白质6(GST-PD1)。

将测试实施例2中制备的活的脊髓灰质炎病毒(150μL)、重组体蛋白质1至6的每个(10μg)和STD缓冲液混合在一起，使混合物的总量是0.3mL，并且所得混合物在37℃下温育2小时并且接着在4℃下16小时。

这些混合物以与测试实施例2中相同的方式用于制备用于SDS-PAGE的样品，其以与测试实施例2相同的方式进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。

结果呈现在下列表1中。表1中，“A”表示其中重组体蛋白质和脊髓灰质炎病毒彼此结合的样品(其中蛋白质印迹检测到带)和“B”表示其中重组体蛋白质和脊髓灰质炎病毒未彼此结合(其中蛋白质印迹未检测到带)的样品。

表1的结果表示，脊髓灰质炎病毒结合运铁蛋白受体的AD。注意，已知结合运铁蛋白受体比如运铁蛋白的其他配体已经报道结合PD2+HD(见Cheng Y等，2004，Cell，116:565-576)。因此，脊髓灰质炎病毒结合的位点不同于那些已知配体结合的位点。

表1

重组体蛋白质	结构域	结合脊髓灰质炎病毒
			1	细胞外结构域全长	A
2	PDI+AD	A
			3	ΔAD	B
4	AD	A
			5	PD2+HD	B
6	PD1	B

(测试实施例4-1：鉴定运铁蛋白受体中脊髓灰质炎病毒的结合位点)

通过蛋白质印迹研究脊髓灰质炎病毒和小鼠运铁蛋白受体1(mTfR1)之间的结合能力。图6是测试实施例4-1中蛋白质印迹研究的示意性、说明性表示。

-制备GST-mTfR1-

由下列SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列是小鼠运铁蛋白受体1(mTfR1)的部分序列。由SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列在GST-tag表达载体(商品名：pGEX-p4X，Promega Co.，Ltd.的产品)中克隆。以与测试实施例3相同的方式使用所得产物制备融合GST的重组体蛋白质(下文可称为“GST-mTfR1”)。

321-TQFPPSQSS-329 (SEQ ID NO: 5)

-制备混合物4-1-

将测试实施例2中制备的活的脊髓灰质炎病毒(150μL)、GST-mTfR1(10μg)和STD缓冲液混合在一起，使混合物的总量是0.2mL。所得混合物在37℃下温育2小时并且接着在4℃下16小时。

-制备混合物4-2-

以与制备混合物4-1相同的方式制备混合物4-2，不同的是GST-mTfR1变为GST-tag(Promega Co.，Ltd.的产品)。

-制备混合物4-3-

以与制备混合物4-1中相同的方式制备混合物4-3，不同的是未添加脊髓灰质炎病毒。

-制备混合物4-4-

以与制备混合物4-1中相同的方式制备混合物4-4，不同的是未添加GST-mTfR1。

-制备混合物4-5-

以与制备混合物4-1中相同的方式制备混合物4-5，不同的是GST-mTfR1变为测试实施例2中制备的Strep-mTfR1。

<运铁蛋白受体和脊髓灰质炎病毒之间的结合测试>

将混合物4-1至4-4的每一个添加至谷胱甘肽-琼脂糖(快流速)(GEHealthcare，Co.，Ltd.的产品)，随后在4℃下温育1小时。所得混合物以900rpm离心3min并且丢弃上清液。添加200μL的STD缓冲液至沉淀物，并且混合物以900rpm离心3min以洗涤沉淀物。该洗涤处理总共进行5次以纯化。作为该纯化的结果，结合谷胱甘肽-琼脂糖的一些化合物(具有和/或结合GST-tag的化合物)残留在沉淀物中，未与其结合的一些化合物被洗涤掉。

纯化之后，将悬浮在STD缓冲液中的8μL的10mM谷胱甘肽添加至获得的沉淀物，并且混合物以900rpm离心3min以获得上清液。该处理释放谷胱甘肽-琼脂糖和结合谷胱甘肽-琼脂糖的化合物之间的结合，使其流入上清液。

将混合物4-5添加至Strep-Tactin(注册商标)琼脂糖(超流速)(IBACo.，Ltd.的产品)，随后在4℃下温育1小时。所得混合物以900rpm离心3min并且丢弃上清液。将200μL的STD缓冲液添加至沉淀物，并且混合物以900rpm离心3min以洗涤沉淀物。该冲洗处理总共进行5次以纯化。

纯化之后，将悬浮在STD缓冲液中的8μL的5mM脱硫生物素(Sigma Co.，Ltd.的产品)添加至获得的沉淀物，并且混合物以900rpm离心3min以获得上清液。

以与测试实施例2中相同的方式处理纯化的混合物4-1至4-5和未纯化的混合物4-1的上清液，以制备用于SDS-PAGE的样品，其以与测试实施例2中相同的方式进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。

结果显示在图7-1中。在使用包含脊髓灰质炎病毒和Strep-mTfR1混合物的阳性对照中，纯化之后检测到带。也在包含脊髓灰质炎病毒和GST-mTfR1混合物情况下，纯化之后类似检测到带。

该结果显示由SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列直接参与结合脊髓灰质炎病毒。

(测试实施例4-2：运铁蛋白受体中脊髓灰质炎病毒结合位点的鉴定)

以与测试实施例4-1相同的方式研究脊髓灰质炎病毒和小鼠运铁蛋白受体1(mTfR1)之外的其他运铁蛋白受体之间的结合能力。

-制备GST-hTfR1-

由下列SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列是人运铁蛋白受体1(hTfR1)的部分序列。在GST-tag表达载体(商品名：pGEX-p4X，PromegaCo.，Ltd.的产品)中克隆由SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列。以与测试实施例3相同的方式使用所得产物，以制备融合GST的重组体蛋白质(下文可称为“GST-hTfR1”)。

318-TQFPPSRSS-326(SEQ ID NO:6)

-制备GST-hTfR2-

由下列SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列是人运铁蛋白受体2(hTfR2)的部分序列。在GST-tag表达载体(商品名：pGEX-p4X，PromegaCo.，Ltd.的产品)中克隆由SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列。以与测试实施例3中相同的方式使用所得产物，以制备融合GST的重组体蛋白质(下文可称为“GST-hTfR2”)。

341-TQFPPVASS-349(SEQ ID NO:7)

-制备GST-mTfR2-

由下列SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列是小鼠运铁蛋白受体2(mTfR2)的部分序列。在GST-tag表达载体(商品名：pGEX-p4X，PromegaCo.，Ltd.的产品)中克隆由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列。以与测试实施例3中相同的方式使用所得产物，以制备融合GST的重组体蛋白质(下文可称为“GST-mTfR2”)。

336-TQFPPVESS-344(SEQ ID NO:8)

-制备混合物4-6-

将测试实施例2中制备的活的脊髓灰质炎病毒(100μL)、GST-hTfR1(5μg)和STD缓冲液混合在一起，使混合物的总量是0.2mL。所得混合物在37℃下温育2小时并且接着在4℃下16小时。

-制备混合物4-7-

以与制备混合物4-6中相同的方式制备混合物4-7，不同的是GST-hTfR1变为测试实施例4-1中制备的GST-mTfR1。

-制备混合物4-8-

以与制备混合物4-6中相同的方式制备混合物4-8，不同的是GST-hTfR1变为GST-hTfR2。

-制备混合物4-9-

以与制备混合物4-6中相同的方式制备混合物4-9，不同的是GST-hTfR1变为GST-mTfR2。

-制备混合物4-10-

以与制备混合物4-6中相同的方式制备混合物4-10，不同的是GST-hTfR1变为GST-tag(Promega Co.，Ltd.的产品)。

-制备混合物4-11-

以与制备混合物4-6中相同的方式制备混合物4-11，不同的是未添加GST-hTfR1。

<运铁蛋白受体和脊髓灰质炎病毒之间的结合测试>

使用谷胱甘肽-琼脂糖(快流速)(GE Healthcare，Co.，Ltd.的产品)，混合物4-6至4-11的每一个以与测试实施例4-1中相同的方式进行运铁蛋白受体和脊髓灰质炎病毒之间的结合测试。

以与测试实施例2中相同的方式处理纯化的混合物4-6至4-11的上清液和测试实施例4-1中未纯化的混合物4-1，以制备用于SDS-PAGE的样品，其以与测试实施例2中相同的方式进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。

结果显示在图7-2中。与小鼠运铁蛋白受体1(mTfR1)的部分序列(SEQ ID NO:5)结果类似，发现人运铁蛋白受体1(hTfR1)的部分序列(SEQ ID NO:6)、人运铁蛋白受体2(hTfR2)的部分序列(SEQ ID NO:7)和小鼠运铁蛋白受体2(mTfR2)的部分序列(SEQ ID NO:8)直接参与结合脊髓灰质炎病毒。

(测试实施例5：运铁蛋白受体中脊髓灰质炎病毒结合位点的鉴定)

图8描绘通过X射线晶体学分析测定的脊髓灰质炎病毒(Mahoney株)的硬脂酸构造(2.2埃)(PDB ID:1HXS)。病毒颗粒的直径是30nm。脊髓灰质炎病毒表面的黑色部分是脊髓灰质炎病毒颗粒中的下凹部分，并且称为峡谷。在峡谷中，存在称为VP1、VP2和VP3的蛋白质。通过下列方法研究VP1与运铁蛋白受体的结合能力。

-制备MBP-VP1GH链I-

基于GeneBank记录号EF374015.1的脊髓灰质炎病毒基因组RNA序列设计引物。利用这些引物，使用脊髓灰质炎病毒cDNA序列作为模板进行常规PCR，以扩增脊髓灰质炎病毒的VP1中称为GH链(第637碱基至第735碱基)的结构域。

在MBP表达载体(商品名：pMAL-p4X，New England Biolabs(NEB)的产品)中克隆扩增的VP1GH链I的基因片段。所得产物以与测试实施例3中相同的方式用于转化，从而制备VP1GH链I和MBP的融合的重组体蛋白质(下文可称为“MBP-VP1GH链I”)。

注意，MBP-VP1GH链I具有由下列SEQ ID NO:19表示的脊髓灰质炎病毒VP1中GH链第213残基至第245残基的氨基酸序列。

213-SKVPLKDQSAELGDSLYGAASLNDFGILAVRVV-245(SEQID NO:19)

-制备MBP-VP1GH链II-

基于基因组GeneBank记录号V01149的脊髓灰质炎病毒RNA序列设计引物。利用这些引物，使用脊髓灰质炎病毒的cDNA序列作为模板进行常规PCR，以扩增脊髓灰质炎病毒VP1中称为GH链(第637碱基至第739碱基)的结构域。

以与制备MBP-VP1GH链I相同的方式制备VP1GH链II和MBP(下文可称为“MBP-VP1GH链II”)的融合重组体蛋白质，不同的是VP1GH链I的基因片段变为VP1GH链II的基因片段。

MBP-VP1GH链II具有由下列SEQ ID NO:20表示的脊髓灰质炎病毒的VP1中GH链第213残基至第245残基的氨基酸序列。

213-SKVPLKDQSAALGDSLYGAASLNDFGILAVRVV-245(SEQID NO:20)

-制备MBP-VP1GH环-

使用基于GeneBank记录号V01149的脊髓灰质炎病毒的基因组RNA序列设计的下列SEQ ID NO:9表示的有义引物和由下列SEQ IDNO:10表示的反义引物，通过PCR常规扩增编码脊髓灰质炎病毒的VP1中称为GH环的结构域的片段(第667碱基至第1,006碱基)。

以与制备MBP-VP1GH链I相同的方式制备VP1GH环和MBP的融合的重组体蛋白质(下文可称为“MBP-VP1GH环”)，不同的是VP1GH链I的基因片段变为VP1GH环的基因片段。

注意，MBP-VP1GH环具有由下列SEQ ID NO:1表示的脊髓灰质炎病毒的VP1中GH环第223残基至第235残基的氨基酸序列。

有义引物:

5’-GCTCTAGAGACCAATCAGCAGCGTTGGGCGATTCACTTTATGGTGCTGCATCC-3’(SEQ ID NO:9)

反义引物：

5’-CCCAAGCTTCTATTATTAGTTCAAGGATGCAGCACCATAAAGTGAATC-3’(SEQ ID NO:10)

223-ALGDSLYGAASLN-235(SEQ ID NO:1)

-制备混合物5-1-

将MBP-VP1GH环(0.5μg)、GST-mTfR1(5μg)和STD缓冲液混合在一起，使混合物的总量是10μL。所得混合物在23℃下温育2小时并且接着在4℃下16小时。

-制备混合物5-2-

以与制备混合物5-1中相同的方式制备混合物5-2，不同的是未添加MBP-VP1GH环。

-制备混合物5-3-

以与制备混合物5-1中相同的方式制备混合物5-3，不同的是MBP-VP1GH环变为MBP(NEB Co.，Ltd.的产品)。

-制备混合物5-4-

以与制备混合物5-1中相同的方式制备混合物5-4，不同的是MBP-VP1GH环变为MBP-VP1GH链I。

-制备混合物5-5-

以与制备混合物5-1中相同的方式制备混合物5-5，不同的是MBP-VP1GH环变为MBP-VP1GH链II。

<脊髓灰质炎病毒和运铁蛋白受体之间的结合测试>

将混合物5-1至5-5的每一个添加至直链淀粉树脂(商品名：Amylose-resin，NEB o.，Ltd.的产品)，随后在4℃下温育1小时。所得混合物以900rpm离心3min并且丢弃上清液。添加200μL包含按质量计1%Triton X-100的STD缓冲液至沉淀物，并且混合物以900rpm离心3min以洗涤沉淀物。该洗涤处理总共进行5次以纯化。作为该纯化的结果，结合直链淀粉树脂的一些化合物(具有/或结合MBP的化合物)残留在沉淀物中，未与其结合的一些化合物被洗涤掉。

纯化之后，悬浮在包含按质量计1%Triton X-100的STD缓冲液中的8μL的20mM麦芽糖被添加至获得的沉淀物，并且混合物以900rpm离心3min以获得上清液。该处理释放直链淀粉树脂和结合直链树脂的化合物之间的结合，使其流入上清液。

将纯化的混合物5-1至5-5和未纯化的混合物5-1的上清液以与测试实施例2中相同的方式处理，以制备用于SDS-PAGE的样品，其根据常规方法进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。

注意，使用抗GST抗体(商品名：Anti-GST-tag，小鼠单克隆抗体，MBL Co.，Ltd.的产品)作为一抗和抗小鼠IG-HRP抗体(商品名：Anti-mouse Ig-HRP，DAKO Co.，Ltd.的产品)作为二抗进行蛋白质印迹。

结果显示在图9中。在MBP-VP1GH环和GST-mTfR1的混合物5-1的情况下，甚至在纯化之后检测到带。另外，在包含MBP-VP1GH链I和GST-mTfR1的纯化的混合物5-4中和包含MBP-VP1GH链II和GST-mTfR1的纯化的混合物5-5中也检测到带。

该结果显示，脊髓灰质炎病毒和运铁蛋白受体之间的结合是由于脊髓灰质炎病毒的VP1中由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列和运铁蛋白受体的AD中由SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列之间的结合。

(测试实施例6：运铁蛋白受体中脊髓灰质炎病毒的结合位点的鉴定)

通过下列方法研究运铁蛋白受体和VP1中不同于测试实施例5的结构域之间的结合能力。

-制备MBP-VP1BC环-

使用基于GeneBank记录号V01149的脊髓灰质炎病毒的基因组RNA序列设计的由下列SEQ ID NO:11表示的有义引物和由下列SEQID NO:12表示的反义引物，通过PCR常规扩增编码脊髓灰质炎病毒的VP1中称为BC环的结构域的片段(第268碱基至第327碱基)。

在MBP表达载体(商品名：pMAL-p4X，NEB的产品)中克隆扩增的VP1BC环的基因片段。所得产物用于以与测试实施例3中相同的方式转化，从而制备VP1BC环和MBP的融合重组体蛋白质(下文可称为“MBP-VP1BC环”)。

注意，MBP-VP1BC环具有由下列SEQ ID NO:2表示的脊髓灰质炎病毒的VP1中BC环第91残基至第109残基的氨基酸序列。

有义引物:

5’-GCTCTAGAATGACTGTGGACAACCCGGCTTCTACTACAAACAAAGACAAATTGTTTTCT-3’(SEQ ID NO:11)

反义引物：

5’-CCCAAGCTTCTATTATTACTTCCACACAGAAAACAATTTGTCTTTGTTTGTAGT-3’(SEQ ID NO:12)

91-MTVDNPASTTNKDKLFSVWK-109(SEQ ID NO:2)

-制备MBP-VP1EF环-

使用基于GeneBank记录号V01149的脊髓灰质炎病毒的基因组RNA序列设计的由下列SEQ ID NO:13表示的有义引物和由下列SEQID NO:14表示的反义引物，通过PCR常规扩增编码脊髓灰质炎病毒的VP1中称为EF环的结构域的片段(第484碱基至第507碱基)。

以与制备MBP-VP1BC环相同的方式制备VP1BC环和MBP的融合的重组体蛋白质(下文可称为“MBP-VP1BC环”)，不同的是VP1BC环的基因片段变为VP1EF环的基因片段。

注意，MBP-VP1EF环具有由下列SEQ ID NO:3表示的脊髓灰质炎病毒的VP1中EF环第162残基至第169残基的氨基酸序列。

有义引物:

5’-GCTCTAGACCAGGGGCACCGGTGCCAGAGAAATAAT-3’(SEQID NO:13)

反义引物：

5’-CCCAAGCTTCTATTATTATTTCTCTGGCACCGGTGC-3’(SEQ IDNO:14)

162-PGAVPEK-169(SEQ ID NO:3)

-制备MBP-VP1EG环-

使用基于GeneBank记录号V01149的脊髓灰质炎病毒的基因组RNA序列设计的由下列SEQ ID NO:21表示的有义引物和由下列SEQID NO:22表示的反义引物，通过PCR常规扩增编码脊髓灰质炎病毒的VP1中称为FG环的结构域的片段(第528碱基至第617碱基)。

以与制备MBP-VP1BC环相同的方式制备VP1FG环和MBP的融合的重组体蛋白质(下文可称为“MBP-VP1FG环”)，不同的是VP1BC环的基因片段变为VP1EG环的基因片段。

注意，MBP-VP1EG环具有由下列SEQ ID NO:23表示的脊髓灰质炎病毒的VP1中EG环第176残基至第205残基的氨基酸序列。

有义引物:

5’-GCTCTAGACAAACGTCCTCCAACCCATCAATTTTCTACACCTACGGCACGGCACCAGCTCGAATT-3’(SEQ ID NO:21)

反义引物：

5’-CCCAAGCTTTTACTATTAATACGCGTTAGAAATGCCAACGTATGGAACCGAAATTCGAGCTGGTGCCGTGCCGTAGGT-3’(SEQ ID NO:22)

176-PSIFYTYGTAPARISVPYVGISNAY-205(SEQ ID NO:23)

-制备MBP-VP1C末端-

基于GeneBank记录号V01149的脊髓灰质炎病毒基因组RNA序列设计由下列SEQ ID NO:15表示的有义引物和由下列SEQ ID NO:16表示的反义引物。利用这些引物，使用脊髓灰质炎病毒的cDNA序列作为模板进行PCR常规以扩增脊髓灰质炎病毒的VP1中C末端区域(第883碱基至第906碱基)。

以与制备MBP-VP1BC环相同的方式制备VP1C末端区域和MBP融合的重组体蛋白质(下文可称为“MBP-VP1C末端区域”)，不同的是VP1BC环的基因片段变为VP1C末端区域的基因片段。

注意，MBP-VP1C末端区域具有由下列SEQ ID NO:4表示的脊髓灰质炎病毒的VP1中C末端区域的第295残基至第302残基的氨基酸序列。

有义引物:

5’-GCTCTAGACTCGCTCCCTTATCCACCAAAGACCTGACAACGTACGCTAG-3’(SEQ ID NO:15)

反义引物：

5’-CCCAAGCTTCTATTATTAGTACGTTGTCAGGTCTTTGGTGGAT-3’(SEQ ID NO:16)

295-STKDLTTY-302(SEQ ID NO:4)

-制备混合物6-1-

将MBP-VP1FG环(0.5μg)、测试实施例4-1中制备的GST-mTfR1(5μg)和STD缓冲液混合在一起，使混合物的总量是10μL。所得混合物在23℃下温育2小时并且接着在4℃下16小时。

-制备混合物6-2-

以与制备混合物6-1相同的方式制备混合物6-2，不同的是MBP-VP1FG环变为MBP。

-制备混合物6-3-

以与制备混合物6-1相同的方式制备混合物6-3，不同的是MBP-VP1FG环变为MBP-VP1BC环。

-制备混合物6-4-

以与制备混合物6-1相同的方式制备混合物6-4，不同的是MBP-VP1FG环变为MBP-VP1EF环。

-制备混合物6-5-

以与制备混合物6-1相同的方式制备混合物6-5，不同的是MBP-VP1FG环变为测试实施例5中制备的MBP-VP1GH环。

-制备混合物6-6-

以与制备混合物6-1相同的方式制备混合物6-6，不同的是MBP-VP1FG环变为MBP-VP1C末端。

<脊髓灰质炎病毒和运铁蛋白受体之间的结合测试>

以与测试实施例5中脊髓灰质炎病毒和运铁蛋白受体之间的结合测试相同的方式进行结合测试，不同的是混合物5-1至5-5变为混合物6-1至6-6。

以与测试实施例2中相同的方式处理纯化的混合物6-1至6-6和未纯化的混合物6-1的上清液，以制备用于SDS-PAGE的样品，其以与测试实施例5相同的方式进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。

结果显示在图10中。在所有的混合物中检测到带，除了其中仅仅MBP与GST-mTfR1混合的混合物6-2。

结果清楚地显示，脊髓灰质炎病毒和运铁蛋白受体之间的结合是由于脊髓灰质炎病毒的VP1中由SEQ ID NOs:2至4表示的氨基酸序列和运铁蛋白受体的AD中由SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列之间的结合。

(测试实施例7：SEQ ID NO:1表达的肽渗透通过血脑屏障)

-制备Alexa488-MBP-VP1GH环-

使用Alexa Fluor(注册商标)488-蛋白质标记试剂盒(Invitrogen Co.，Ltd.的产品)，将Alexa Fluor(注册商标)488引入测试实施例5中制备的MBP-VP1GH环的MBP标签的氨基酸侧链的主要氨基酸部分。下文，荧光标记的MBP-VP1GH环可称为“Alexa488-MBP-VP1GH环”。

在STD缓冲液中制备Alexa488-MBP-VP1GH环，以具有2mg/mL的浓度。

-制备Alexa488-MBP-

以与制备Alexa488-MBP-VP1GH环相同的方式荧光标记MBP，不同的是MBP-VP1GH环变为MBP2。下文，荧光标记的MBP可称为“Alexa488-MBP”。

使用Alexa Fluor(注册商标)488-蛋白质标记试剂盒(Invitrogen Co.，Ltd.的产品)制备Alexa488-MBP，以具有2mg/mL的浓度。

<SEQ ID NO:1表达的肽通过血脑屏障的渗透测试>

使用与测试实施例1中使用的相同的血脑屏障体外模型培养系统进行测试。

将Alexa488-MBP-VP1GH环(90μg/mL)、荧光标记的运铁蛋白(Alexa Fluor(注册商标)488-运铁蛋白(Invitrogen Co.，Ltd.的产品)，下文可称为“Alexa488-Tf”)(180μg/mL)、Alexa488-MBP(90μg/mL)或荧光标记的葡聚糖(平均分子量为70kDa的Alexa Flor(注册商标)488-标记的葡聚糖，Invitrogen Co.，Ltd.的产品)(180μg/mL)添加至Transwell培养板(Corning Incorporated产品)的上层部分。在其后的10min、20min和30min，回收Transwell培养板下层部分的培养物并且用荧光分光光度计(商品名：F-2500，Hitachi High-Technologies Corporation的产品)测量荧光强度。荧光强度表示为脊髓灰质炎病毒通过Transwell中脑毛细血管内皮细胞的渗透量。

结果显示在图11中。Alexa488-MBP-VP1GH环的PS值是0.82，荧光标记的运铁蛋白的PS值是0.33，Alexa488-MBP的PS值是0.28，和荧光标记的葡聚糖的PS值是0.33。

与运铁蛋白类似，Alexa488-MBP-VP1GH环渗透脑毛细血管内皮细胞，并且渗透率也几乎相同。

该结果显示包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列的肽可渗透血脑屏障。

<通过共聚焦显微镜观察确认渗透通过血脑屏障>

使用基于GeneBank记录号BC054522.1的信息设计的由下列SEQID NO:24表示的有义引物和由下列SEQ ID NO:25表示的反义引物，以与测试实施例2中相同的方式，从小鼠cDNA通过PCR制备运铁蛋白受体1(mTfR1)的全长基因。

有义引物:

5’-CCGCTCGAGGCCACCATGATGGATCAAGCCAGATCA-3’(SEQ IDNO:24)

反义引物：5’-CGCGGATCCCGAAACTCATTGTCAATATTCC-3’(SEQ ID NO:25)

将扩增的基因片段插入红色荧光蛋白质表达载体(商品名：pmCherry-N1，Clontech Co.，Ltd.的产品)的XhoI-BamHI切割位点，从而获得其中mCherry与mTfR1的羧基末端融合的表达载体(下文可称为“pmCherry-mTfR1”)。使用FuGENE6(NEB Co.，Ltd.的产品)用获得的表达载体转染测试实施例1中使用的脑毛细血管内皮细胞，以表达mCherry-mTfR1。

添加Alexa488-MBP-VP1GH环至表达mCherry-mTfR1的脑毛细血管内皮细胞，并且用共聚焦显微镜(Carl Zeiss Co.，Ltd.的产品)观察60min。

结果，观察到运铁蛋白受体和Alexa488-MBP-VP1GH环彼此结合并且进入脑毛细血管内皮细胞约20min。同时，Alexa488-MBP未进入其中。

基于获得的结果，使用E_RDock和ZDock进行蛋白质-蛋白质相互作用的对接模拟。使用的分析程序是ACCELYS，Co.，Ltd的产品。图12A描绘脊髓灰质炎病毒的VP1、VP2和VP3的复合体的模拟模型。图12B描绘放大的VP1的模拟模型。图12C描绘运铁蛋白受体的模拟模型。图12D描绘其中图12A的复合体结合图12C的运铁蛋白受体的模拟模型。获得的计算值确认SEQ ID NO:1表示的脊髓灰质炎病毒的氨基酸序列结合SEQ ID NO:5表示的运铁蛋白受体的氨基酸序列。

工业实用性

因为本发明的肽可渗透血脑屏障，其可适合用于例如能够运输药物至细胞、尤其是中枢神经系统的细胞的药物转运蛋白、抗脊髓灰质炎病毒剂、血脑屏障渗透剂和运铁蛋白受体捕获体。

Claims (13)

1.肽，

其中所述肽由下列SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列、下列SEQ IDNO:2表示的氨基酸序列、下列SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列、或下列SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列组成：

ALGDSLYGAASLN(SEQ ID NO:1)；

MTVDNPASTTNKDKLFSVWK(SEQ ID NO:2)；

PGAVPEK(SEQ ID NO:3)；和

STKDLTTY(SEQ ID NO:4)。

2.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽结合由下列SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列、由下列SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列、由下列SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列、或由下列SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列：

TQFPPSQSS(SEQ ID NO:5)；

TQFPPSRSS(SEQ ID NO:6)；

TQFPPVASS(SEQ ID NO:7)；和

TQFPPVESS(SEQ ID NO:8)。

3.药物转运蛋白，其包括：

根据权利要求1或2所述的肽。

4.根据权利要求3所述的药物转运蛋白，进一步包括：载体。

5.根据权利要求4所述的药物转运蛋白，其中所述载体是大分子、乳液、或其任何组合，其中所述大分子是微球、纳米球、脂质体、或其任何组合。

6.根据权利要求4到5中任一项所述的药物转运蛋白，进一步包括：所述载体中携带的药物，其中所述药物用于诊断、预防、治疗或其任何组合。

7.抗脊髓灰质炎病毒剂，其包括：

根据权利要求1或2所述的肽，

其中所述抗脊髓灰质炎病毒剂预防脊髓灰质炎病毒引起的疾病的发展。

8.血脑屏障渗透剂，其包括：

根据权利要求1或2所述的肽，

其中所述血脑屏障渗透剂渗透血脑屏障。

9.运铁蛋白受体捕获体，其包括：

根据权利要求1或2所述的肽，

其中所述运铁蛋白受体捕获体结合运铁蛋白受体。

10.药物转运蛋白，其包括：

由下列SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列组成的肽、由下列SEQ IDNO:2表示的氨基酸序列组成的肽、由下列SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列组成的肽、由下列SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列组成的肽、或其任意组合：

ALGDSLYGAASLN(SEQ ID NO:1)；

MTVDNPASTTNKDKLFSVWK(SEQ ID NO:2)；

PGAVPEK(SEQ ID NO:3)；和

STKDLTTY(SEQ ID NO:4)。

11.抗脊髓灰质炎病毒剂，其包括：

由下列SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列组成的肽、由下列SEQ IDNO:2表示的氨基酸序列组成的肽、由下列SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列组成的肽、由下列SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列组成的肽，或其任意组合：

ALGDSLYGAASLN(SEQ ID NO:1)；

MTVDNPASTTNKDKLFSVWK(SEQ ID NO:2)；

PGAVPEK(SEQ ID NO:3)；和

STKDLTTY(SEQ ID NO:4)。

12.血脑屏障渗透剂，其包括：

由下列SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列组成的肽、由下列SEQ IDNO:2表示的氨基酸序列组成的肽、由下列SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列组成的肽、由下列SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列组成的肽、或其任意组合：

ALGDSLYGAASLN(SEQ ID NO:1)；

MTVDNPASTTNKDKLFSVWK(SEQ ID NO:2)；

PGAVPEK(SEQ ID NO:3)；和

STKDLTTY(SEQ ID NO:4)。

13.运铁蛋白受体捕获体，其包括：

由下列SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列组成的肽、由下列SEQ IDNO:2表示的氨基酸序列组成的肽、由下列SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列组成的肽、由下列SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列组成的肽、或其任意组合：

ALGDSLYGAASLN(SEQ ID NO:1)；

MTVDNPASTTNKDKLFSVWK(SEQ ID NO:2)；

PGAVPEK(SEQ ID NO:3)；和

STKDLTTY(SEQ ID NO:4)。