TW201202422A - Strategies for the transgenic manipulation of filamentous fungi - Google Patents

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201202422 六、發明說明： 【相關申請案之交叉參考】 本申請案依據35 U.S.C.§ 119主張20 1〇年4月μ曰申 請之臨時申請案第61/342,429號的優先權，該案之全文以 引用的方式併入本文中。 【補助參考】

本發明係在美國農業部授予之符合赫奇法案（Hatch Act pr0ject)第PEn〇4〇96號的政府資助下且依據DARpA 授予的第HR001 1-07-9-0004號合同產生。政府擁有本發明 之一定權利。 【發明所屬之技術領域】 本發明大體係關於分子生物學領域。更特定而言，本 發明係關於基因轉殖操作真菌之新穎方法之特性化。本發 明之方法可用於藉由熟習此項技術者已知的重組技術改良 真菌物種，重組技術可為諸如針對以下者之操作：增強病 原體、害蟲及農藥抗性，增加產量及品質，延長生產存放 改良烹隹、營養及藥用價值，及其類似方面，以及商 業化生產異源（及同源）蛋白質。 【先前技術】 乏葉綠素且因此利用 〇ry Mycology (編）_ 真菌為微小產孢子有機體，其缺 死或活有機物獲得營養。Intr〇duct 201202422 〆 < Alexopoulos，C· j.，Mims，c w，及 Biackweii，m 第4版·第1早。由於其兼有植物與動物之共同特性因此 其在真菌界中獨立分類。在真g界内，存在「絲狀真菌 (fUamentous fungi )」，如此命名係因為其營養體由線狀 小長絲（稱作「菌絲（hyphae)」）組成。典型地，菌絲以 分支方式生長，遍佈於用作營養源的基質上或基質内，從 而形成菌絲網，稱為「菌絲體（mycelium)」。因此菌 絲體為真菌之營養體。在大部分絲狀真菌的生命週期中， 營養菌絲體產生無性或有性孢子。無性孢子可用多種名稱 提及，但常用術語為「分生孢子（c〇nidia或e〇ndi〇sp〇RS)」， 或簡稱「孢子（spores )」。真菌之營養菌絲體可在適當生 物學及環境提示下分化成有性繁殖產孢子結構。有些真菌 產生相當大的纖維狀（「肉質（fleshy」）產孢子繁殖結構， 各稱為「蘑菇（mushrooms )」、「子實體（fruit b〇dies )」、 「擔子果（basidiocarps)」、「子囊果（asc〇carps)」、 「馬蹄型子實體（conks)」或「擔子果（basid〇rnes)」。 有些真菌之子實體可食用；其具有烹飪、營養或藥用品質 之價值，因而商業需求很大或發展很快。 子實體可分化成專門化組織，諸如肉質傘狀菌蓋（cap ; PlleuO、菌柄（stem ; stipe ))、位於莖之基部的菌托（cup ; 〇lva)) ’及產生有性抱子的菌稍（giU; lamallae))。 稱為菌膜（veil ; velium )的薄組織可覆蓋菌蓋之底面。 當子實體接近成熟時’菌膜破裂’暴露菌褶且容許有性孢 子排入環境中。然而，有些真菌之子實體完全缺乏菌褶， 201202422 且相反係由產生有性抱子之貫穿小孔或小㈣肉質㈣構 成真菌之肉質繁殖結構所產生的有性孢子可用多種術語 才田述例如子囊孢子（ascospores )」、「擔孢子 (baSidi〇Spores)」，或簡稱為「孢子」。 因此真菌子貫體在功能上類似於植物之繁殖結構（稱 為铯）.而無性抱子與有性孢子類似於植物之種子，其對 於真菌在自然界中的韵德士&亦a 町政怖及存活具有重要作用。在適合的 %· i兄條件下，抱子萌芽而开> &史 .1. +J... 乃牙向形烕另一代營養菌絲且從而完成 真菌之生命週期。 絲狀真菌在其變化之天然生境内具有作為初級分解者 之的重要作用。其對於食品生產亦具有較大影響。有些 真菌（諸如磨益）用作食物，而其他真菌為導致全世界作 物毀滅性損失的植物病原體。.絲狀真菌因其分泌各種酵素 (例如蛋白酶、脂肪酶）以及初級代謝產物（例如有機酸） 及次級代謝產物（例如抗生素青黴素（peniciuin)及頭孢 菌素（cephalosporin ))而在工業及醫藥中亦具有重要作用。 栽培蘑菇雙孢蘑菇為重要作物，1990 年其全世界產量為一百五十萬噸。絲狀真菌作為大規模生 產同源蛋白質與異源蛋白質的宿主亦吸引人，因為其能夠 分泌大量蛋白質之故。 約40 /〇之市售酵素來源於絲狀真菌。L〇we, Handbook of Applied Mycology. Fungal Biotechnology (^) Arora, D.K. Elander, R.P. & Mukerji, K.G. 681-708 (Marcel Dekker, New York; 1992)。此等酵素通常由麯黴屬c^ergz_//WiS)及木黴 201202422 屬之菌種產生。由於其在培養基中分泌大 量蛋白質，因此其可大規模醱酵培養，且其對於食品工業 而言公認為安全。 與商業性栽培蘑菇（雙孢蘑菇）相關的一般問題包括 病原體所引起的疾病’諸如菌生輪枝菌（ fungicola)(乾'躁起泡）、哈：欠木徽（harzianum) 生物型2及4 (綠黴）、托拉氏假單胞菌（而則邮5 ίσ/atmO (斑點）及 dsRNA 病毒（La France 疾病及 Μνχ)、 主要蟲害[尖眼蕈蚊（sciarid fly ; I;；c〇rz.e//a _/ζ·)]、與細 菌性腐敗及快速老朽有關的產品極短存放期，及與内源性 ^酚氧化酶（ΡΡΟ，如酪胺酸酶）作用相關的子實體變褐色 (擦傷）。為進一步提高產品品質，習知雙孢蘑菇育種計 劃僅適度獲得成功且從長遠來看可能還不夠。此是因為習 知真菌育種技術非常費時，且因為受限於市售菌株之遺傳 變異，只能利用選擇提供少許改進（H〇rgen等人， Homology between mitochondrial DNA of Agaricus bisporus and an internal portion of a linear mitochondrial plasmid of Agaricus bitorquis Λ Curr Genet. 1991 #- 6 ^ ; 19:495-502)。 ’ 在雙也磨兹之情況下，有效育種策略的主要問題係由 才田異$的生Dp週期引起，其包括任—親代核（p⑽“Μ nucleus )異？^地同時分離為—個擔抱子。此擔孢子長出後， 形成異核_絲體’其所含的核特性及遺傳特性與存在於親 代菌、糸體中的彼等核特性及遺傳特性無不相同。另外，在 201202422 減數分裂期間僅觀測到少量重組活性（Summerbeu等人 1989. Geneticsl23: 293-300 )。 因此，全世界研究者均努力開發用於商業蘑菇（諸如 又？匕磨兹）的轉形系統，以便引入新賴特性。對於其他真 菌以及植物、動物及細菌而言，應用基因轉移技術極為常 見且已產生商業應用》然而，一般在野生型背景下適用於 多種真菌中之有效可再生穩定轉形系統的缺乏已強烈阻礙 對此等有機體進行分子生物學研究。 當前的真菌轉形技術已包括CaC丨2及聚乙二醇（pEG )、 電穿孔及粒子轟擊之組合以將DNA引入原生質體、菌絲體 或孢子中。此等技術未取得成功，或不可再現。缺乏實用 的基因轉移系統為單一的最大障礙，以致無法使用分子方 法對蘑菇進行遺傳改良。儘管對開發轉形方案存在相當大 的興趣，但由於效率低或缺乏實用性及便利性而至今尚無 普遍使用的方法。 在最新方法中，已使用基於土壤桿菌屬 的轉形系統對多種真菌（包括雙孢蘑菇） 進行轉形。雖然此等方法比現行的基於原生質體之方案更 方便，但其迄今受到因使用複雜系統而使得轉形效率比較 低的困擾》 舉例而言，Gouka等人描述在真菌中靶向同源重組的轉 形程序（Gouka 等人，Nature Biotechnology 第 17 卷，1999 年 6 月，Transformation ^^叩"/似㈣⑽ Agrobacterium ^mefaciens-mediated homol〇gous 201202422 m % recombination」第598_6〇 1頁）。根據此程序，使用經特 別工程改造之含有3缺失非功能型p少基因的泡盛麯黴（J a而接受菌株及含有適於藉由重組恢復基因之 二元載體的土壤桿菌菌株。修復構築體與接受宿主之間的 同源重組可恢復功能性WrG基因及使載體在基因座 整合。該論文報導每1 07個分生孢子高達丨5〇個轉形株。

De Groot等人報導對絲狀真菌進行轉形的另一種基於 土 壤桿菌之方法（De Groot 等人，Nature Biotechnology 第 16 卷.，1998 年 9 月，r Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi j 第 839-842 頁）。此 論文研究土壤桿菌將t_dna轉移至泡盛麯黴原生質體（已 移除具有細胞壁的營養細胞）及分生孢子中的能力。轉形 頻率為每107個原生質體約3〇〇個至7200個轉形株不等， 两達PEG轉形率（transf〇rmati〇n rate )的6〇〇倍。使用分 生抱子時’轉形頻率為每1〇7個分生孢子1〇〇〇個至9〇〇〇個. 轉形株不等。亦使用營養菌絲體組織。 其他真菌轉形方案揭示於WO95/02691及W09 8/45 45 5 中。所有此等方案均集中於使用原生質體、孢子及營養菌 絲體作為接受組織進行轉形。 很多科學工作者在其研究工作中係使用賓州基因轉形 法（PennState genetic transformation methodology)。文 獻中有愈來愈多的實施例顯示，該方法能夠使重組蛋白及 RNA轉錄物（亦即，f爽RNA誘導之RNAi)表現於雙抱 去去 f _ °在各種情況下，皆採用傳統方法’其中將需要相 201202422 關核苷酸序列連接至可操作啟動子及終止子的轉殖基因構 築體穩定整合於蘑菇屬（)基因組中，從而使子實 體兼有基因轉殖基因型與表型。以此方式產生的雙孢蘑菇 系目前具有低商業價值，因為經遺傳修飾之蘑菇目前市售 情況不佳。此外，若目標為使用雙孢蘑菇作為製造平台， 則傳統的遺傳修飾方法通常不能實現相關蛋白質的高表現 量。因此，不斷地需要鑑別用於實現較高層次之蛋白質生 產的新穎策略。 如自上文可見，此項技術中不斷地需要開發有效、方 便且快捷的真菌基因轉殖方案。 因此，本發明之一目標為提供滿足上述需要的真菌基 因轉殖操作系統。 旦本發明之另一目標為提供應用基因轉殖技術增加產 量、增強疾病及害蟲抗性、i品品f、延長存放期、或提

Mi、營養或藥用價值以實現商業化生產的機制，或其 他此等方案。 方案 而易 本發明之另-目標為提供可供此等基因轉殖操作 使用的多核脊酸構築體、載體、經轉形細胞。 本發明之其他目標自以下本發明說明將變得顯 【發明内容】 =所述的經改良之轉形方法提供使用基因轉殖技 術對、.糸狀真g進行遺傳改良的實用方法，且代表可對此等 201202422 有機體中之生物過程進行分子基因分析的重要工具。此 外’ S玄方法允經遺傳修飾之真菌用作生物醱酵物 (biofermentor )以便大規模生產所要產物，例如工業性或 治療性蛋白質。此外，修改所選啟動子及土壤桿菌菌株的 基因轉殖操作方案適用於所有產生肉質子實體的真菌物 種’且可藉_遥擇土壞桿菌菌株或啟動子來最佳化。適用 於本發明之絲狀真菌實例包括擔子菌門（Basidoiomycota ) 及子囊菌門（Ascomycota)之如下成員：鬼傘屬（ SPP·)、革蓋菌屬（Corz’o/ws spp.)、蘑菇屬，尤其包括以 下菌種.雙孢磨益、冬兹（ve/wii.pei)、香益 (Lentinula edodes)、羊肚菌屬（Morc/zeZ/a spp.)、黃孢 原毛平車菌 C Phanerochaete chrysosporium )、觀良蘇 iPleurotus ostreatus)、裂褶蛰（Schizophyllumcommune) 良私 % { Tricholoma matsutake) 〇 此新穎技術可對磨益進行基因轉殖修飾以賦予基因轉 殖基因型及/或表型。在食品蘑菇之基因轉殖育種中，可操 作真菌之子實體’從而賦予改變之表型，但基因型為野生 型。3玄子實體本身缺之任何同源轉殖基因，且申請人已發 現一種在真菌中合成及聚積蛋白質的新穎機制及一種獨立 控制子實體之基因型及表型的技術。 申請人已驚訝地發現，具有下層營養基質之雙層系統 中之上層持水基質（諸如泥炭）中所用的接種體之基因型 決定栽培蘑菇之子實體的基因型。使用基因轉殖接種體可 產生基因轉殖子實體。根據本發明，此接種體之比率必須 201202422 高到足以防止下層堆肥基質中之菌絲接種體生長穿過殼層 (case layer)且參與嵌合子實體之形成。申請人此外已發 現，定殖於下層堆肥基質中之菌絲體中所表現的所選啟動 子、重組蛋白及/或RNA轉錄物移位進入發育中之子實體 中。從而可操作子實體之表型及所表現的RNA及蛋白質不 同於其基因型。此為首次在真菌中長距離轉運蛋白質及/或 RNA轉錄物。 藉由本發明之基因轉殖操作方法，可利用此項技術中 已知的遺傳工程技術對絲狀真菌進行遺傳及表型操作以便 於栽培或生產，提高烹飪、藥用或營養價值，或生產重組 蛋白供收穫。 本發明此外包含新穎組成物，其包括自此等基因轉殖 真菌中所分離的蛋白質產物。亦包括可用於此程序中的表 現構築體’以及經轉形細胞、載體、及併有其之基因轉殖 真菌。 定義 上文中以及說明書及申請專利範圍令使用關於本發明 組成物及方法的各種術語，除非另有說明，否則該等術語 應具有本文中明確說明之含義。 各個單&、字首及符號可以其國際單位制可接受的形 式表不除非另有說明，否則分別地，核酸依5丨至3,取向 從左到右書寫；胺基酸序列依胺基至羧基取向從左到右書 寫。數值範圍包括限定該範圍之數值且包括所限定範圍： 的各整數。胺基酸在本文中可用其通常已知之三字母符齋 12 201202422

. 或1UPAC_IUB生物化學命名委員會（IUPAC-IUB

Biochemical nomenclature Commission )所推薦之單字母符 號提及。核苷酸同樣可用其通常已接受之單字母碼提及。 除非另有規定，否則如本文中所使用的軟體、電學及電子 學術語係如新IEEE電學及電子學術語標準詞典（The New IEEE Standard Dictionary 〇f Electrical and £1如_心 Terms )(第5版，1993 )中所定義。下文所定義的術語藉 由總體上參考說明書來更充分定義。 如本文中所使用，術語「土壤桿菌（」 應意欲包括能夠感染所要真菌細胞的任何細菌物種及其經 保守性修飾之變異體。本文中描述根癌農桿菌（儿 ）Ti質體，但本發明不受此限制。對特定細菌 載體進行選擇至多包括熟習此項技術者對參數進行常規最 佳化。可使用的其他細菌包括單一 T_DNA級構築體以及熟 習此項技術者經由諸如Genbank之來源可利用的其他構築 體。 ’、 反義泰核苷酸（antisense oligonucleotide)」為具有 至少6個鄰接核苷酸、較佳與DNA (反基因）或(反 義股）互補的分子，其干擾内源性蛋白質之轉錄或轉譯過 程’從而抑制基因產物。 「選殖載體（cloning vector)」為在宿主細胞中具有 自主複製能力的腦分子，諸如質體、黏接質體或細㈣ 菌體。選殖載體典型地含有一個或少數幾個可供外來DNa 序列以可確定的方式插入而不會損失載體之基本生物功能 13 201202422 的限制性核酸内切酶識別位點，以及適用於鑑別及選擇經 選殖載體轉形之細胞的標記基因。標記基因典型地包括提 供針對抗生素（諸如潮黴素（hygromycin )、四環素 (tetracycline)或胺苄西林（ampicUHn))之抗性的標記 基因。 編碼序列（coding sequence)」或「編碼區（c〇ding reg1〇n )」係指一種核酸分子，其具有表現序列時產生基因 產物所必需的序列資訊。 術語「經保守性修飾之變異體（c〇nservatively m〇dified vanants)」適用於胺基酸序列與核酸序列。就特定核酸序 列而言，經保守性修飾之變異體係指編碼胺基酸序列之一 致性或經保守性修飾之變異體的彼等核酸。由於遺傳密碼 之簡併性’因此大量功能上相同的核酸編碼任何指定蛋白 質。舉例而言，密碼子GCA、GCC、GC(J及gcu均編碼胺 二：丙胺g夂。因此，在用密碼子表示丙胺酸的每個位置， 广密碼子可在不改變所編碼多肽的情況下改變為任一個所 述相應密碼子。此等核酸變異為「靜默變| ( silent ΓΓΓη〇」且代表保守性修飾變異之—種。本文中亦編 酸靜默變Ϊ考遺傳密碼的每個核酸序列描述每種可能的核 羊靜默支異。—般技術者將瞭解，可修飾核酸中之各密碼 例^ AUG’其一般為甲硫胺酸之唯一密碼子；及 子。因I—般為色胺酸之唯一密碼子）以產生功能相同分 所述各多肽Γ碼本發明多狀之核酸之各種靜默變異隱含於 所过各多肽序列中且在本發明之範圍内。 14 201202422 * 關於胺基酸序列，熟習者將瞭解，引起所編碼序列中 單個胺基酸或小百分比之胺基酸改變、添加或缺失的核 酸、肽、多肽或蛋白質序列之個別取代、缺失或添加為「經 保守性修飾之變異體」，其中此變化引起胺基酸被化學上 類似之胺基酸取代。因此，選自由丨至15組成之整數群的 任何數目個胺基酸殘基可如此改變。因此，例如，可產生丄、 2 3 4、5、7或1 〇個變化^經保守性修倚之變異體典型 地提供與其所來源之未修飾多肽序列類似的生物活性。舉 例而言，受質特異性、酶活性、或配位體/受體結合性一般 為天然蛋白質對其天然受質的至少3〇%、4〇%、5〇%、6〇〇/。、 70%、80%或90% ^提供功能上類似胺基酸的保守性取代表 在此項技術中熟知。 以下六個群組各含有彼此間可保守性取代的胺基酸： 1 )丙胺酸（A )、絲胺酸（S )、蘇胺酸（τ); 2) 天冬胺酸（D)、麩胺酸（Ε); 3) 天冬醯胺（Ν)、麩醯胺酸（Q); 4) 精胺酸（R)、離胺酸（κ); 5 )異白胺酸（I )、白胺酸（L )、曱硫胺酸（Μ )、 纈胺酸（V);及 6.)苯丙胺酸（F)、酪胺酸（γ)、色胺酸（w)。 亦可參見 Creighton (1984) Proteins W.H. Freeman and

Company。 術語「共抑制（co-suppressi〇n)」為一種抑制有機體 中之基因表現的方法，其中將構築體引人有機體中。此構 15 201202422 築體具有與駐留基因一致或共有核苷酸同源性之序列的 或多個複本。 就特定核酸而言’ 「編碼（encoding ),·+、「 S;」或「經編碼 (encoded)」意謂包含用於轉譯成特定蛋白皙 J貝訊。編 碼蛋白質的核酸可在核酸之轉譯區令包含非轉譯序列（心 如内含子），或可缺乏此插入性非轉譯序列（例如，士 cDNA中）。藉以編碼蛋白質的資訊係使用密碼子特定說 明。典型地，胺基酸序列係由使用「通用」遺傳密碼的核 酸編碼。然而，可使用具有通用密碼之變里舻 又，、，诸如存在 於有些植物、動物及真菌粒線體、細菌山羊徽激菌 (Mycoplasma capricolum )或纖毛蟲大核（cU.丈 中的變異體，此時核酸可表現於其中，。 當以合成方式製備或改變核酸時，可利用效_主s 了 』〜用捋表現核酸 之預定宿主之已知優選密碼子。舉例而言，雖然本發明之 核酸序列可表現於植物與真菌物種中，但序列經修飾可說 明特定優選密碼子及優選GC含量，因為此等優選項已顯示 與本文引用之參考文獻中所述不同。 術語「表現（expression)」係指基因產物之生物合成。 結構基因表現包括結構基因轉錄成mRNA及mRNA接著轉 澤成一或多個多肽。 「表現載體（expression Vector)」為一種dna分子， 其包含表現於宿主細胞中的基因。典型地，基因表現係置 於在某些調節元件的控制下，包括啟叙工 ，，，，_*_ ^ 敬動子、組織特異性調 節元件及強化子。.此基因可稱為「可極你以λ 一 j钿作地連接於」調節 16 201202422 Λ/ 元件。 (fruit body )」意欲 、除營養菌絲體及孢 、菌褶、菌臈、菌托 如本文t所使用，術語「子實體 包括來源於真菌《有性|殖結構組織 子外的組織或細胞，包括菌蓋、菌柄 等。 如本文中所使用，關於核酸提及的「里源 ㈤响㈣）」為核酸來源於外來物種或者，若來源 ^相同物種’則其天然形式在組成及/或基因組基因座、 (gen〇_ —方面已藉由有意人為干預而經實質性修 飾。舉例而言，可操作地連接於異源結構基因的啟動子所 來源的物種不同於結構基因所來源的物種，或者，若來源 於相同物種，m一者或兩者的最初形式均經實質性修飾。 異源蛋白可來源於外來物種，或者，#來源於相同物種， 則其最初形式已藉由有意人為干預而經實質性修飾。 如本文中所使用，術語「高嚴格度」意謂相當於以下 者的條件或雜交：在42t下、在含有50%曱醯胺、5xSspE、 2% SDS、10χ丹哈氏溶液（Denhardt，s s〇luti〇n)及 i〇〇 叫/M 経魚精DNA的缓衝液中雜交12個小時，且在5 5 °C下用〇 1 xSSC、0.1% SDS 洗滌且在 _7(TC 下曝露於 Kodak X-〇mat 抗 反射膜（AR film) 4天。 「宿主細胞（host cell )」意謂含有載體且支持載體複 製及/或表現的細胞。宿主細胞可為原核細胞，諸如大腸桿 菌；或真核細胞，諸如真菌、昆蟲、兩棲動物或哺乳動物 細胞。宿主細胞較佳為真菌細胞。 17 201202422 在核酸插入細胞中之背景下的術語「引入（introduced )」 意謂「轉染（transfection)」或「轉形（transformation)」 或「轉導（transduption)」且包括提及將核酸併入真核或 原核細胞中，其中核酸可併入細胞之基因組（例如染色體、 質體（plasmid)、成形體（plastid)或粒線體DNA)中， 轉變為自主複製子，或經短暫表現（例如經轉染之mRN A )。 術s吾「多核普酸構築體（polynucleotide construct )」 或「DNA構築體（DNA construct)」有時用於指表現構築 體。然而’其亦包括經設計用於共抑制天然宿主細胞序列 或外來序列（例如對應於病毒中可見之彼等序列的外來序 列）的反義寡核苷酸或核苷酸。 術語「可操作地連接（0perablylinked)」意謂，表現 編碼序列所必需的調節序列置於核酸分子中相對於編碼序 列的適當位置處以使編碼序列能夠表現。此相同定義有時 應用於其他轉錄控制元件（例如強化子）在表現載體中的 佈置。 轉錄及轉譯控制序列為DNA調節序列，諸如啟動子、 強化子、聚腺苷酸化信號、終止子及其類似物，其為編碼 序列在宿主細胞中表現作準備。 如本文中所使用’ 「多核苷酸（p〇lynucIe〇tide )」包 括提及脫氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其類似物，其 具有天然核糖核苷酸之基本性質，原因在於其可在嚴格雜 交條件下與和天然存在之核苷酸實質上相同的核苷酸序列 雜交且/或可轉譯成與和天然存在之核苷酸相同的胺基酸。 201202422 -Λ * 夕核苷酸可為天然或異源結構性或調節性基因之全長序列 或子序列。除非另有說明，否則此術語包括提及特定序列 以及其互補序列。因此，如彼術語「多核苦酸」，本文令 亦涵蓋為穩定性或其他原因而主鏈經修飾的〇ΝΑ或隱。 此外，當術語在本文中使用時，包含諸如肌皆之稀有驗基 或諸如三苯甲基化鹼基之經修飾鹼基（剛好列舉兩個實例） 的DNA或RNA亦為多核苦酸。應瞭解，已對dna及rna 進行多種修飾以用於熟習此項技術者已知的多種適用目 的。當術語多核苦酸在本文中使用時，涵蓋多核芽酸之此 等化學、酶促或代謝修飾形式，以及具有病毒及細胞（尤 其包括簡單及複雜細胞）特性之DNA及rna的化學形式。 術語「多肽（P〇iypeptide)」、「肽（peptUe)」及「蛋 白質（protem)」在本文中可互換使用且指胺基酸殘基之聚 合物。該等術言吾適用於一或多個胺基酸殘基為對應之天然 存在胺基酸之人工化學類似物的胺基酸聚合物，以及天然 存在之胺基酸聚合物。天然存在之胺基酸之此等類似物之 基本性質為，當併入一種蛋白質中時’該蛋白質對抗體具 有特異性反應，誘發相同、但完全由天然存在之胺基酸組 成的蛋白質。術語「多肽」、「版」及「蛋白質」亦包括 修飾，包括（但不限於）-酸化、糖基化、脂質連接、硫 酉夂化、麩胺酸殘基之7羧基化、羥基化及ADp核糖基化。 應瞭解，多肽如眾所周知且如上所述不完全呈線性。舉例 而口’夕肽可因泛素化之結果而呈分支狀，且其一般由於 轉澤後事件（包括天然加工事件及天然不存在之由人類操 19 201202422 作引起之事钍^ y „ )而可呈具有或不具有分支之環狀。環狀、 分枝狀及分;ϊί2 & 枝％狀多肽可藉由非轉譯天然過程合成，且亦 可藉由完全人a、七、+人丄、 , Q攻方法5成。此外，本發明涵蓋使用本發明 蛋白質之合女 有甲硫胺k與缺少甲硫胺酸之胺基末端變異 體。就蛋白質而言’術語4末端區（N_terminalregi〇n)」 ’、〜靠近蛋白質之胺基末端的約50個胺基酸。 凡匕術語「啟動子」' 「啟動子區」或「啟動子序列」一 ♦曰基因之轉錄調節區’其可見於編碼區之5'或3，-側， :編碼區内，或内含子中。典錢，啟動子為能夠在細胞 結合RNA聚合酶且起始下游（3，方向）編碼序列轉錄的 驗調節區°曲型的5’啟動子序列在其3,末端以轉錄起始 位』為界且向上游（5’方向）延伸以包括為在高於背景值之 °貞則K準下起始轉錄所必需的最少數目個鹼基或元件。 一動子序歹j内有轉錄起始位點（宜利用核酸酶$ 1定位法界 定）以及負責結合RNA聚合酶的蛋白質結合域（共同序 列）。術語啟動子包括該序列之基本調節特徵且視情況可 包括，於轉譯起始位點之前的長末端重複序列區。 「重組宿主（recombinant h〇st)」可為含有選殖載體 或表現載體的任何原核或真核細胞。此術語亦包括已經遺 傳工程改造而在凉·太& & 宿主、·田胞之染色體或基因組中含有純系基 因的彼等原核或真核細胞。 術語「報導基g) (rep〇rtergene)」係指編碼容易藉由 標準方法直接或間接偵測之產物的基因。 術語「可選擇標記基因（selectable marker gene)」係 20 201202422 Μ ‘㈣碼表現時賦予經轉形細胞可選擇表型（諸如抗生素抗 性）之產物的基因。 就寡核普酸或其他單股核酸分子而言，術語「特異性 雜交（SPeCifiCally hybridizing )」係、指充分互補序列之兩 個單股核酸分子之間的締合以允許在此項技術中通常所用 之預定條件（亦即嚴格度條件）下雜交（有時稱為「實質 性互補（SUbStantiallyC〇mplementary)」）。特定而言該 術語係指募核皆酸與單股〇ΝΑ或RNa分子内所含之實質 1·生互補序列的雜父’且實質上排除寡核苷酸與非互補序列 之單股核酸的雜交。 「基因（gene)」為一種DNA序列，其轉錄成信使RNA (mR^A)，接著轉譯成具有特定多肽之特性的胺基酸序列。 「載體（vector)」為可供另一核酸區段可操作地插入 其中以促使该區段複製或表現的複製子，諸如質體、噬菌 體、黏接質體或病毒。 【實施方式】 本^明技術係基於申請人發現一種在真菌中合成/聚積 蛋白質的基本新穎機制及獨立控制子實體之基因型及表型 的技術。該技術補充且擴展了此項技術中已知用於培養及 產生基因轉殖蘑菇的方法。該等方法較佳使用土壌桿菌介 導食用菇（雙孢蘑菇）遺傳轉形，此轉形係藉由使重組蛋 白能夠表現於高生物質子實體（亦即蘑菇）中而達成。此 外，該新穎技術能夠對子實體進行基因轉殖修飾，從而賦 21 201202422 予改變之表型，作I mA l ^彳—基因型為野生型；該子實體本身缺乏同 源轉殖基因。 .本發明可用於商業應用，其中使用諸如蘑菇物種之絲 片真菌作為问彳貝值蛋白質（例如生物醫藥、工業酵素等） 之生產平台。此外，該技術可用於對雙孢蘑菇進行基因轉 殖育種以增強農業性狀，諸如昆蟲及病毒抗性、耐熱性、 延長存放期等，同時維持子實體之野生型基因型。或者， 忒方法可使用非基因轉殖蘑菇系之組合而用於增強農業性 狀。 雙孢蘑菇生長於植物及動物廢物之堆肥混合物中。堆 肥基質係使用「菌絲（spawn)」以真菌接種，其為由雙孢 蘑菇之營養菌絲體所定殖的穀粒。i 4天後，真菌菌絲體已 元王疋殖於堆肥中，此時，在其上覆蓋5 cm之中和泥炭層， 稱作「殼層」^將雙孢蘑菇之第二種菌絲體接種體（通常 稱作「CI」）與殼層混合以促進子實體及早均一形成 (MacCanna 及 Flanagan 1972; R〇maine 及 Schlagnhaufer 1992 )。結殼之後1 7-1 9天’開始出現子實體，且每隔約一 週以有規律的方式連續發育。 如同所有真菌，雙孢蘑菇既無法進行光合作用以將二 氧化碳轉化成複雜碳化合物，亦不能固定大氣中的氮 (Alexopoulos等人，1996 )。因此，其生長及發育所必需 的碳、氮及其他養分專門來自有機基質，包含堆肥基質。 自菌絲散發之菌絲體分泌一系列水解酶，使堆肥中的複雜 生物聚合物分解。低分子量降解產物及簡單分子（諸如糖） 22 201202422 ▲ ‘ 2及主動地運輸至真菌細胞中，支持所維持之菌絲體生 長穿過堆肥基質且最終形成子實體。 起儲=層堆肥基質用作主要貯食囊，但上層殼層基質 水曰作用，支持發育中之子實體快速細胞性膨服。 在研究栽培基質上層及下層中之轉殖基因與野生型 (wt)菌絲體接種體之各種組合對雙孢蘑菇子實體中之重 組蛋白表現之影響的過程中，得到兩個形成本發明之基礎 的發現。首先，用於上層中之雙孢磨兹接種體的基因型嚴 格決定子實體之基因型。因此，在上層中使用基因轉殖接 種體可產生基因轉殖子實體，而WT接種體產± WT子實 體。本文中，關鍵之處為上層中接種體的使用率高到足以 =止下層堆肥基質中之菌絲體生長穿過殼層且參與嵌合子 只體（WT/轉殖基因）之形成。且第二個發現為，定殖於下 負中之菌絲體中所表現的重組蛋白向上移位至發育中 之子實體中。 為產生具有基因轉殖表型及WT基因型的子實體，本發 明之杈佳實施方法包括使用基因轉殖雙孢蘑菇系作為下層 之接種體且WT系用於上層。本文中，重要的是基因構築體 以《亥基因轉殖系為特色，其中編碼蛋白質及/或特定RNA序 列之相關核苷酸序列的表現係由在營養菌絲體中具有高度 /舌）生的，動子驅動，諸如3 _磷酸甘油醛脫氫酶（G户乃）啟 動子（Harmsen等人，1992 )及蟲漆酶2(ZCC2)啟動子（Perry 等人，1993 ; Smith等人，1998)。以此方式可在定殖於下層 堆肥中的營養菌絲體中合成蛋白質及/或rNA轉錄物。在本 23 201202422 發明之有些應用中，需要蛋白質及/或RNA轉錄物穿梭往返 於發育中之子實體中’而在其他應用中，較佳為蛋白質及/ 或RNA轉錄物限制於堆肥中之菌絲體中。不同之處在於， 所表現之重組分子之存在是否必須直接存在於子實體組織 内以實現表型變化，或子實體之表型變化是否可長距離實 現（亦即，作為在定殖於下層堆肥中之菌絲體中表現重組 蛋白及/或轉錄物的結果）。在任一種情況下，由於用於上 層t的wt接種體決定基因型，因此所得子實體將具有wt 基因型，如根據其組成性細胞之基因組中缺乏整合式轉殖 基因所證明。說明本發明之此應用的實例為用如下搭配來 合併針對蠅及拉法郎氏疾病（LaFrance disease)的抗性： 以分別表現蘇力菌（sac〖uus ih“ringienesi.s)毒素及拉法郎 氏等軸病毒RNA來源之髮失轉錄物的基因轉殖系作為下層 之接種體，而在上層中使用商業WT系。 為王邓使用WT系產生具有經改良之表型的wt子實 體，本發明之較佳實施方法包括以下搭配：使用賦予子實 體所要商業性狀之WT系作為上層之接種體，而使用具有優 良營養性狀之WT系作為下層之接種體。優良營養性狀可包 括（但不限於）加之堆肥定殖率、耐熱性、針對病原體 及害蟲（諸如木黴屬綠黴及蠅）之抗性，及堆肥養分之利 用’及利用替代性堆肥成分之能力。實際上，此技術容許 將兩種雙抱磨益菌株組合使用以達成所要的營養及繁殖性 狀’此等性狀以其他方式可能難以或不可能併入單一菌株 中 0 24 201202422 為使子實體實現高蛋白質 包括以下搭配：由帶有相關：產$，本發明之-較佳方法 接種e _ 土因之基因轉殖系組成的下層 接種體，该相關基因由營 ^ 子㈣，金… 體中具有高度活性的啟動 子驅動，諸如Gi>D或zc 双勁子，由帶有相關基因之基 因轉殖糸組成的上層接種體， 丞 高度活性的啟動子驅動，例 于貫體中-有 疏水蛋白a 啟動子 (DeG则t#人，1996 )。在第二種較佳方法中，下層及上 層均用帶有相關基因之單—譬朽M ^ 山“杜 之早雙孢H系接種，該相關基因 由營養菌絲體中具有高；s：.、壬&

Un度活性的啟動子及子實體中具有高 度活性的啟動子驅動。對於兩種方法而言，子實體中相關 蛋白質的向量表現均由蛋白質自堆肥中之營養菌絲體長距 離移位及好實體中原位合成組合引起。彳自所收獲子實 體中萃取及純化而得之高價值生物醫藥及卫業酵素之表現 為說明本發明之此應用的另外少數實例。 本發明可使用習知之磨益栽培商業實務實施，包括文 化及環境制度（culture and environmental regime)、基質 製備及組成、接種體基質及延遲釋放之補充劑。然而，視 用作上層及下層接種體之雙孢蘑菇系的特定特性而定，可 能需要對接種體比率及/或定殖時間進行一些修改。一般而 言’每0.6 m2床層面積1 L接種體之習知接種體比率（其 範圍為1 L/0.5-0.75 m2)及14天培育期（其範圍為7至21 天）可用於實現雙孢蘑益菌絲體在下層堆肥中的完全定 殖。類似地’每2.1 m2床層面積1 L接種體之習知接種體 比率（其範圍為1 L/1.8至2.5 m2)及17天培育期（其範圍 25 201202422 為15至22天）可用於實現雙孢蘑菇菌絲體在上層泥炭中 的完全定殖及子實體之形成。對於任何接種體比率及培育 期方案而[首要目標為實現上層及下層基質層中其各別 接種體的⑦全疋殖及確保上層被其菌絲體接種體快速完全 定殖，以防止菌絲體自下層廣泛侵入。 本發明之較佳具體實例係使用與菌絲接合（包括其營 養菌絲體之實體接合）相容的雙孢蘑菇系/株/基因型作為下 層接種體及上層接種體。以此方式…直於下層中之菌絲 體中所產生的重組蛋白及/或其他可移動分子可自由移位通 過定殖於上層中的菌絲體且進入發育中之子實體中。 本發明因此涵蓋基因轉殖接種體物質用於蘑菇栽培的 用途。此基因轉殖蘑菇接種體可利用此項技術中已知的任 何方法產生且較佳利用土壤桿菌介導之轉形。 使用基於土壤桿菌之轉形系統的方法已針對多種不同 植物物種描述。根癌土壌桿菌（如） 為種格蘭氏陰性（gram-negative ) 土壤細菌，其在所感染 植物之傷口部位處引起冠癭腫瘤。在誘發腫瘤期間，土壤 桿菌將其腫瘤誘發性（Ti )質體之一部分，即t_DNa (側 接24 bp不凡全正向重複序列（以代以repeat))轉移至植 物細胞中。T-DNA接著在隨機位置整合於植物DNA中。 T-DNA轉移過程取決於一組病毒性（vir)基因之誘導，該組 基因亦位於Τι質體上。受傷植物細胞所分泌的化合物（諸 如乙醯丁香酮（acetosyring〇ne ; AS))可誘導基因。 在真菌轉形方案中，必須添加AS或其他vir誘導劑以誘導 26 201202422 • vir基因活性。使用容易、其轉形有效及T DNA整合準確已 引起人們廣泛利用此有機體將基因轉移至植物中，及針對 重要作物（包括穀類，諸如稻及玉米）開發轉形方案。 -般而言’諸如根癌土壤桿菌之細菌菌株用於在腫瘤 發生期間將其Ti f體之—部分轉移至植物中的遺傳轉形。 典型地’所用土壤桿g含有天然存在之Tif體之修飾型， 其中已移除致癌基因及蛋白石代謝基因，從而使dna轉移 至宿主細胞中而不會隨後形成腫瘤。此等方法包括將待插 入細胞基因組中的DNA插入Ti質體之邊界内，此〇1^入連 接至選擇性標記基因以便於選擇經轉形之細胞。細菌與接 爻植物組織一起培養以容許外來DNA轉移至植物細胞中， 接著使經轉形植物在選擇性培養基中再生。任何數目個不 同器g及組織可用作土壤桿菌介導之轉形的目標，如針對 蕓苔科（Brassicaceae )之成員特別所述。此等目標包括薄 細胞層（Charest，P. J.等人，1988，Theor· Appl· Genet-75:438-444) 、 胚軸 （ DeBlock， M.等人， 1989, Plant Physiol. 91:694-701 )、葉片（Feldman，K.A·，及 Marks，M.D.，1986, Plant Sci. 47:63-69)、莖（Fry J.等人，1987, Plant Cell Repts. 6:321-325 )、子葉（Moloney Μ. M.等人，1989，Plant Cell Repts. 8:238-242)及不定胚（Neuhaus，G 等人，1987, Theor. Appl_ Genet. 75:30-3 6) 。土壤桿菌介導之轉形已顯示有效 用於單子葉植物與雙子葉植物之許多物種。最近，土壤桿 菌轉形已在酵母中得以確認。參見 Bundock等人， 「Trans-kingdom T-DNA transfer from Agrobacterium 27 201202422 tumufaciens to c , accharomyces cerevzWae」 The EMB〇

Journal第14卷，第13期第32〇6 32i4頁，i995。然而有 趣的是，酵母Φ + a# 〒之轉移已顯示可藉由與在植物中所觀測到 之機制不同的機制發生。著者推斷整合主要由宿主因素而 非，、田菌本身決定。此結論具有重要作用，因為取決於特定 伯主，所以整合視存在的宿主因素而定可能發生或可能不 ’X生。最近’土壞桿菌介導之轉形已在雙孢蘑菇中得以確 % ( de Groot等人），但惟獨效率極低且程序延長。 根據本發明之至少一個具體實例，藉由土壤桿菌將多 核芽I構築體引入絲狀真菌細胞中，土壤桿菌充當轉形質 體之載^ °典型地’將多核苦酸構築體插入含有功能性vir 基因之Ti質體邊界内，但_基因與多核苷酸不 一質體上。 j 接著藉由將土壤;j：干菌與真菌子實體組織細胞—起忾單 =而發生遺傳轉形。隨後’殺死細菌且容許子實體㈣ 在選擇性壓力下再生以鑑別轉形株。 因此，本發明提供可根據本發明之土壤桿菌介 :所獲得之經轉形之絲狀真菌接種體，其不包含任何不需 用於培養經轉形真菌以產生所要蛋::或=^ 方法中。此外’根據本發明，為實 ▲列的 現短核酸序列’其可不編碼對應於 』表 物（編辟的窗广I、 —祀基因的蛋白質產 ^碼的伯主或病毒）。本發明亦涵蓋將基因轉 培養成蘑菇作為食物、醫藥等及作為 耷蛋白質之來源（例 28 201202422 如醫藥生產），以及將營養菌絲體培養成所要蛋白質之來 源。此外，蛋白質可保留於需要萃取之真菌細胞内，但蛋 白質亦可分泌進入生長培養基中以便回收。 根據本發明之另一具體實例’提供一種方法，其中將 DNA片段隨機整合於真菌基因組中；以及可藉由土壌桿菌 介導式轉形所獲得的經轉形真菌，其包含TDNA邊界序列 之一或多個部分；及一種培養此經轉形真菌以產生所要蛋 白質或特定核酸序列的方法。

較佳使用超毒性根癌農桿菌菌株，因為其轉形頻率相 對較高；Λ等菌株、其用途及用於製備此等菌株的載體描 述於文獻中；關於植物轉形，參見如等人u.Baeteri〇i〇W (1987) 4417-4425 & Molecular Microbiology 7 (1993) 55_562)、RaineH 等人（BI〇/TECHNOLOGY 8 (1990 年 1 ^) 33-38 ) ^ IshidafA ( Nature Biotechnology 14 (1 996) 745-750)，且關於酵母轉形’參見卩丨⑽等人

Acad. Sen. USA，93 (1996) 1613-1618)。 中vir基因在轉移中（in 野生型Ti質體之間的同 而以類似於植物轉形所 ’如本文中所述及如熟 可藉由二元系統進行轉形，其 tranS)起作用，或經由第一質體與 源重組、藉由共整合來起作用，從 知的方式將致癌墓因自質體中排除 習此項技術者所知。 將本發明之教干纺 組合可產生表現項技術中已知的多種技術及⑹ 組織。大多數情：上入表現的經遺傳修部之真1 王過程之各階段均存在替代性對策 29 201202422 選擇對策取決於以下變數：諸如經選擇用於選殖及引入重 組DNA分子的質體載體系統、待修飾之真菌物種、特定結 構基因、啟動子元件及所用上游元件^熟f此項技術者能 •夠選擇及使用可實現功能的適當替代方案。用於表現所要 結構基因的培養條件及培養細胞在此項技術中已為人所 知。亦如此項技術中所知’多種真菌物種可轉形且可再生， 從而可獲得含有所要基@及在本發明之啟動子分子之調節 性控制下表現所要基因的完整真菌，包括所有營養及繁殖 、且’、哉諸如g絲體、子實體及孢子。如熟習此項技術者所 2 ’經轉形冑菌中之表現可具有組織特異性及/或對某些發 月階段具有特異性。如熟習此項技術者所知，截短型啟動 子選擇及、·Ό構基因選擇為可加以最佳化以實現所要真菌表 現或抑制的其他參數（包括單一 T-DNA邊界構築體及本文 中教示之彼等構築體）。 下文為可用於執行本發明方法之分子生物學技術之非 限制性一般性概述^ 本發明之多核苦酸構築體將共用分子生物學技術中已

…、知的類似凡件。舉例而言，在各種構築射，才目關DNA =列較佳可操作地連接（亦即，經定位可確保起作用）至 今々DNA轉錄（轉錄成RNA轉錄物）的啟動子且包含包 括複製系統的載體。在較佳具體實例中，相關DNA序列具 有卜源&起源以試圖防止内源性基因之共抑制，除非共抑 制為所要方案。 重組異源構築體 30 201202422 ……包含異源核酸之重，且異源構築體 的真藏接種體株。編碼所要相關多核芽酸的核酸序列（例 如編碼多肽之cDNA或基因組序列長足以編碼活性蛋白質) 可用於建構可引入所要接種細胞系中的重組表現卡匿。重 組表現卡匡典型地包含可操作地連接至轉錄起始調節序列 的多核m Μ轉錄起始調節序列將引導多核苦酸在預 疋宿主細胞（諸如經轉形真菌之組織）中的轉錄。 舉例而言’表職體可包括⑴受5，及3ι調節序列之 轉錄控制的經選殖之真菌基因及⑺顯性可選性標記。必 要時此等表現載體亦可含有啟動子調節區（例如賦予誘 導性或組成性表現、環境上或發育上可調節之表現、或細 胞或組織特異性/選擇性表現的啟動子調節區）、轉錄起始 位點、核糖體結合位點、RNA加工信號、轉錄終止位點及/ 或聚腺*酸化信號。除表現卡E夕卜，重組異源多核苦酸構 築體可使用抑财狀㈣，諸如干擾性rna及其類似 物。重組構築體可用於上調異源基因之表現，或用作抑制 =下調異源或内源性基因之抑制構築體，然而所有構築體 皆具有如本文中所述的類似特徵。 啟動子 . 用於本發明方法中之構築體、啟動子或控制系統可包 括組織特異性啟動子、誘導性啟動子或組成性啟動子。 可供利用的適合啟動子系統有很多。舉例而言，適用 於本發明的—種組成性啟動子為花椰菜花葉病毒（CaMV) 35S。已顯示其在多種原核及真核物種中具有高度活性。

S 31 201202422 啟動子（及其他調節元件）可具異源性（亦即，不能 天然可操作地連接於來自相同有機體之DNA序列）。適用 於表現於真菌中之啟動子在此項技術中已知且可具誘導 性、組成性、組織特異性，可來源於真核生物、原核生物 或病毒’或具有此等特性之各種組合。 選擇可用於本發明方法中之啟動子時，可能需要使用 組織特異性或發育可調節啟動子。組織特異性或發育可調 節啟動子為一種DNA序列，其調節細胞/組織中對真菌之特 定發育期及/或功能具有關鍵作用之DNA序列的選擇性表 現。本發明方法中可使用任何促使表現於真菌中的可鑑別 啟動子且存在多種可利用的此等啟動子。使用可使構築體 在控制期期間表現的誘導性啟動子亦為有利。 誘導性啟動子亦可用於本發明中。參見Ward等人， 户/α«ί Mo/. 5ζ·σ/.22: 361-366 (1993)。例示性誘導性啟動子包 括（但不限於）來自對銅具有反應之ACE1系統的啟動子 (Mett 等人，尸AMS 90: 4567-4571 (1993));對苯磺醯胺除 草劑安全劑具有反應之玉米In2基因（Hershey等人，从〇/.

Gen. 227: 229-237 (1991)及 Gatz 等人，Mo/. C?e«·

Gewei/c·? 243: 32-38 (1994))或來自 TnlO 之 Tet 抑制基因 (Gatz 等人，Mo/· Gewei. 227: 229-237 (1991))。特別 較佳的誘導性啟動子為對誘導劑具有反應、而真菌對該誘 導劑通常無反應的啟動子。例示性誘導性啟動子為來自類 固醇激素基因的誘導性啟動子，其轉錄活性係由糖皮質類 固醇激素誘導。Schena 等人，Pn iVai/_ dead Scz.. C/.S.A 88: 32 201202422 0421 (1991)。 此等及其他此等啟動子已為人所知且可利用諸如 Genbank之來源獲得。、在一較佳具體實例中，啟動子與接受 宿主細胞物種同源。舉例而言，在雙孢蘑菇轉形方案中， 將雙孢蘑菇3-磷酸甘油醛脫氫酶（)啟動子用於多核 苷酸構築體中。真菌特異性啟動子之兩個實例包括（但不 限於）來自真菌小巢狀魏菌（丄) ( Mattern等人

1988，Fungal Genetics Newsletter 35:25 )及雙孢蘑菇 (Harmsen 等人，1992 Current Genetics 22:447-454)之（7PD 啟動子。 由於編碼區中包含内含子序列可能引起增強之表現及 特異性’因此亦可能需要在啟動子構築體中包括一些内含 子序列。 此外，為獲得所要啟動子活性，一個啟動子的區域可 連接至不同啟動子之區域，從而產生嵌合啟動子。亦可使 用調節基因表現的合成啟動子。 表現系統可藉由使用補充元件（諸如轉錄終止子及/或 強化子元件）進一步最佳化。 其他調節元件 除啟動子序列外，表現卡匣或多核苷酸構築體亦應含 有位於結構基因下游的轉錄終止區以有效終止。終止區或 聚腺苦酸化信號可獲自與啟動子序列相同的基因或可獲自 不同基因。聚腺苷酸化序列包括（但不限於）土壤桿菌章 魚驗（octopine)合成酶信號（Gielen 等人，ΕΜΒΟ J. (1984) 33 201202422 3:83 5-846 )或胭脂鹼（n〇paUne)合成酶信號（以…仏以等 人，Mol· and Appl. Genet. (1982) 1:561-573 )。 利用編碼信號序列之核苷酸序列可操作地連接於編碼 相關蛋白質之基因的5,及/或3,區域可使藉由轉殖基因所產 生的蛋白質轉運至亞細胞代謝區（subcellular c〇mpartment) 中，諸如液泡、過氧化體、乙醛酸循環體、細胞壁或粒線 體，或分泌進入無生質體系或生長培養基中。在蛋白質合 成及加工期間，位於結構基因之5,及/或3'端的靶向序列可 決定所編碼蛋白質最終定位之處。信號序列之存在可將多 狀引導至細胞内細胞器或亞細胞代謝區中或分泌至無生質 體系中或進入外部環境中。多種信號序列在此項技術中已 為人所知。 標記基因 含有本文中所述之任一種DNA序列及啟動子的重組 DNA分子可另外含有選擇性標記基因，該等標記基因編碼 賦予細胞針對化學試劑或生理應力之抗性，或賦予細胞可 辨別的表型特性的選擇性基因產物，使得經重組DNa分子 轉形的細胞容易使用選擇劑加以選擇。一種此選擇性標記. 基因為新黴素磷酸轉移酶（NPT II )，其賦予針對康黴素 (kanamycin)及抗生素G_418的抗性.經此選擇性標記基 因轉形的細胞可如下選擇：使用文獻中所述之技術試管内 檢定康黴素磷酸化的存在，或在來自經轉形植物之組織的 RNA中藉由北方墨點分析法（N〇rthern blot analysis )測試 編碼NPT II基因之mRNA的存在。聚合酶鏈反應（PCR ) 34 201202422

* 擴增亦用於鐘別轉殖基因或表現之存在（使用逆轉錄_PCR 擴增監測基因組DNA的表現及pcR)。其他常用選擇性標 δ己包括胺苄西林抗性基因、四環素抗性基因及潮黴素（好户 抗丨基因由此選擇的經轉形真菌細胞可生長且發育成營 養菌絲體’其最終將產生包括有性繁殖結構（子實體）及 抱子的完整真菌。應瞭解，選擇性標記基因亦可來源於真 菌。 蛋白質 使用本發明之基因轉殖真菌可大批量生產重組蛋白。 因此，利用此項技術中已充分瞭解的技術選擇且繁殖經轉 形之真菌可產生多個基因轉殖真菌，以習知方式收穫該等 真菌，接著自相關組織或總生物質中萃取外來蛋白，或讓 外來蛋白分泌進入生長培養基（液態或固態）令，接著回 收。可藉由已知方法自植物及真菌生物質萃取蛋白質，該 等方法論述於例如Heney及〇rr，114: 926 (1981)，及本文中所引用的參考文獻中。 ^相關重組蛋白可為適於在原核生物中表現的任何蛋白 質，且可包括工業用、治療性或農用蛋白質。可利用本發 明產生的蛋白質包括（但不限於）酵素、調節蛋白、受體、 肽（例如肽激素）、細胞因子、膜或轉運蛋白生長因子、 抗體及其類似物。相關蛋白質可與宿主同源或異源。 相關蛋白質可為酵素’其選自分解殿粉酶、蛋白水解 酶、纖維素分解酶、氧化還原酶及植物壁降解酶。此等酵 素之實例包括澱粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、蟲漆 35 201202422 酶、酚類氧化酶、氧化酶、角質 酶、酯酶m , 肖買略、纖維素酶、半纖維素 ° 鉍、觸酶、葡萄糖氧化酶、植酸酶 '果 膠酶、葡糖皆酶、異構酶、棘㈣： 植請果 酶。 酶轉移酶、半乳糖苷酶及幾丁質 關蛋白質亦可為接種疫苗所用之抗原、疫苗 '抗原 '二：白 '免疫刺激性蛋白f、過敏原、全長抗體或抗體 片段或何生物。抗體⑷但不限於）來源於任何物種、 需要自該物種大量生產的免疫球蛋白。特別較佳的是，抗 體為人類抗體。免疫球蛋白可選自任何類別，亦即G、A、 M、E或抗體彳#生物可選自由以下者所組成之群組：單 鏈㈣（SCFV)、Fab片段、Fv片段、單域抗體（^或、 片段）、域抗體（如路騎科單域抗體（Vhh，奈米抗體）） 或如例如編ersen及Reilly ( 2〇〇4 )或H〇出㈣及咖峨 (2005 )中所述的其他抗體形式。激素包括（但不限於） 促卵泡激素、促黃體激素、促皮質素释放因子、生長抑素、 促性腺素激素、升壓素、催產素、紅血球生成素、胰島素 及其類似物。生長因子為結合至細胞表面上之受體的蛋白 質’其主要結果為活化細胞增殖及/或分化。生長因子包括 (但不限於）血小板衍生生長因子、表皮生長因子、神經 生長因子、纖維母細胞生長因子、胰島素樣生長因子、轉 形生長因子及其類似物。 細胞因子為生長因子之獨特家族。主要自白也球分必 的細胞因子刺激體液免疫反應與細胞免疫反應，以及吞嗜 細胞之活化。細胞因子包括（但不限於）群落刺激因子、 36 201202422 ^素（IL 1α及β、IL_2至IL_⑴及干擾素。人類介白 (IL_3) 4含有133個胺基酸殘基的15 kDa蛋白質。 Μ為-種物種特異性群落刺激因子，其刺激巨核細胞、 嗜中性白血球、及巨噬細胞在骨髓培養液中之群落形成。 其他相關蛋白質為哺乳動物蛋白質。此等蛋白質包括 (但不限於）血液蛋白質（諸如血清白蛋白、因子vn、因 子νπι (或經修飾之因子vm)、因子ιχ、因子χ、組織 纖維蛋白溶解原因子、蛋白質c'溫韋伯氏因子（ν〇η Willebrand factor)、抗凝血酶m及紅血球生成素）、群 落刺激因子（諸如粒細胞群落刺激因子（g_csf )、巨噬細 胞群落刺激因子（M_CSF )及粒細胞巨嗤細胞群落刺激因子 (GM-CSF))、細胞因？（諸如介白素）、整合素、地址 素（addressin)、選擇素、歸巢受體（h〇mingrecept〇r)、 表面膜蛋白（諸如表面膜蛋白受體）、τ細胞受體單元、免 疫球蛋白、可溶性主要組織相容性複合體抗原、結構蛋白 質（諸如膠原蛋白、絲蛋白、彈性蛋白、微管蛋白、肌動 蛋白、及肌凝蛋白）、生長因子受體、生長因子、生長激 素、細胞週期蛋白、疫苗、血纖維蛋白原、凝血酶、細胞 因子、玻糖醛酸及抗體。 雖然產物大部分將為肽產物，但可引入基因，用於修 飾細胞所產生的非肽產物。可產生此等蛋白質、其片段（通 常為至少約30個胺基酸之片段）、融合之組合、突變體及 合成蛋白，不論此等蛋白質為完整合成或部分合成，只要 其序列與天然蛋白質相關。 37 201202422 同樣，利用本發明可在經轉形之真菌令表現農用基 因。更特定而言，可對真菌進行遺傳工程改造以表現農業 上的各種相關表型。與此方面相關的例示性基因包括（但 不限於）下文分類之彼等基因。 1 ·賦予針對害蟲或疾病之抗性及所編碼之基因： (A)植物病抗性基因。植物防禦機制通常藉由植物中 抗病基因（R )之產物與病原體中之相應無病毒性（Avr ) 基因之間的特定相互作用來活化。植物品種可用經選殖之 抗性基因轉形以將植物工程改造成對特定病原體株具有抗 性。參見例如Jones等人，Science 266: 789 (1994)(選殖番 加Cf-9基因用於抗番莊葉徽菌（yw/VMW ));

Martin等人，Science 262: 1432 (1993)(用於抗番茄細菌性 葉斑病pV t〇mat〇)的番茄 基 因編碼蛋白激酶）；Mindrinos 等人，Cell 78: 1089 (1994) ( >菜屬及户2基因用於抗斑點細菌病菌（ syringae))。。 (B )蘇力菌蛋白質、其衍生物或模擬其的合成多肽。 參見例如Geiser等人，Ge«e 48: 109 (1986)，其揭示价δ -内毒素基因之選殖及核苷酸序列。此外，編碼（5 -内毒素基 因的DNA分子可購自美國菌種保存中心（American Type Culture Collection) ( Rockville，MD)，例如 ATCC 寄存編 號 40098 、 67136 、 31995 及 31998 。 (C )凝集素。參見例如Van Damme等人，尸/imi Mo/ec. 仏〇/· 24: 25 (1994)之揭示内容，其揭示多種君子蘭（C7/Wa 38 201202422 • mMMM)甘露糖結合凝集素基因之核苷酸序列。 (D)維生素結合蛋白，諸如抗生物素蛋白。參見ρ〇τ 申請案US93/06487，其内容以引用的方式併入本文中。該 申請案教示抗生物素蛋白及抗生物素蛋白同源物用作抗昆 蟲害蟲之殺幼蟲劑的用途。 (Ε )酵素抑制劑，例如蛋白酶抑制劑或澱粉酶抑制 劑。參見例如 Abe 等人，乂 Βζ·〇/, C/iem. 262: 16793 (1987) (稻半胱胺酸蛋白酶抑制劑之核苷酸序列）；Huub等人， Mo/ec. 5ζ·〇/· 21: 985 (1993)(編碼煙草蛋白酶抑制因 子I之cDNA的核苷酸序列）；及Sumitani等人，

Biotech，Biochem. 57: 1243 (1993)(硝孢鏈黴菌 (少ce·? ) α-殿粉酶抑制劑之核苷酸序 列）。 (F )昆蟲特異性激素或費洛蒙（pherorn〇ne )，諸如 脫皮固醇及保幼激素、其變異體、基於其之模擬物、或其 拮抗劑或激動劑。參見例如.Hammock等人，Nature 344: 458 (1990)之揭示内容（經選殖之保幼激素酯酶（保幼激素之去 活劑）在桿狀病毒中之表現）。 (G )昆蟲特異性肽或神經肽，其表現時可干擾所感染 害蟲之生理機能。例如參見Regan，J. C/zew. 269: 9 (1994)(表現選殖產生編碼昆蟲利尿激素受體之DNA); 及 Pratt 等人，Bz’oc/ze/?!·Coww. 163: 1243 (1989) (已於太平洋折翅蠊（Diploptera puntata )中鑑別出別抑制 素（allostatin))之揭示内容。亦參見Tomalski等人之美 39 201202422 國專利第5,266,3 17號，其揭示編碼昆蟲特異性麻痹神經毒 素之基因。 2.賦予針對除草劑之抗性的基因，除草劑例如： (A)抑制生長點或分生組織之除草劑，諸如咪唑琳酮 或續酿脲。此類例示性基因編碼突變體ALS及AHAS酶， 分別如例如Lee等人，J. I: 1241 (1988)，及Miki等 人，77zeor. jpp/. Gewei. 80: 449 (1990)所述。 (B )草甘膦（Glyphosate)(分別由突變體5-烯醇丙 酮醯基-3-磷酸莽草酸合成酶（EPSP)及基因賦予抗性） 及其他膦酸化合物，諸如固殺草（glufosinate )(草胺膦乙 醯轉移酶（phosphinothricin acetyl transferase; PAT)及吸 水鏈黴菌（)草胺膦乙醯轉移酶 (6以）基因），及吼啶氧基或苯氧基丙酸及環己酮（乙醯 輔酶A羧化酶（ACCase )抑制劑編碼基因p參見例如Shah 等人之美國專利第4,940,835號，其揭示可賦予草甘膦抗性 之EPSP形式的核苷酸序列。編碼突變體基因的DNA 么子可依據ATCC寄存編號39256獲得，且突變體基因之 核苷酸序列揭示於Comai之美國專利第4,769,061號中。 Kumada等人之歐洲專利申請案第〇 333 〇33號及G〇〇dman 等人之美國專利第4,975,374號揭示賦予針對除草劑（諸如 L-草胺膦）之抗性的麩醯胺酸合成酶基因之核苷酸序列。草 胺膦乙醯轉移酶基因之核苷酸序列提供於Leemans等人之 歐洲申請案第0 242 246號中。De Greef等人， 7: 61 (1989)描述基因轉殖植物之產生，該等 201202422 植物表現編碼草胺膦乙醯轉移酶活性的嵌合基因。賦予 針對本氧基丙酸及環己酮（諸如西殺草（seth〇xydim )及合 氯氣（hal〇xyfop ))之抗性的例示性基因為

Marshall 等人 r/ieor. 83; 435 (1992)所述之 幻 及基因。 (C )抑制光合作用的除草劑，諸如三0井（psbA及gs + 基因）及苯曱腈（腈水解酶基因）。^旧以等人尸Ce// 3. 169 (1991)描述單胞藻屬（c/z/a—i/omowa·?)經編碼突 變體；基因之質體轉形。腈水解酶基因之核苷酸序列揭 不於Stalker之美國專利第4,810,648號中，且含有此等基 因的DNA分子可依據ATCC寄存編號53435、67441及67442 獲得。編碼麩胱甘肽S-轉移酶之DNA的選殖及表現描述於

Hayes 等人，J. 285: 173 (1992)中。 3.賦予或促成加值性狀的基因，加值性狀諸如： (A )經修飾之脂肪酸代謝作用，例如用硬脂醯基_Acp 去飽和酶之反義基因使植物轉形以提高植物之硬脂酸含 虽。參見 Knultzon 等人，Pn *Sc/. (/以 89: 2624 (1992) 。 (B)降低之植酸鹽含量 (1 )引入編碼植酸酶之基因可增強植酸鹽之分解，從 而向經轉形之植物中添加更多自由磷酸鹽。舉例而言，關 於黑曲黴菌（m’ger )植酸酶基因之核苷酸序列 的揭示内容，參見Van Hartingsveldt等人，Gwe 727: 87 (1993) 。 41 201202422 (2)可引入降低植酸鹽含量的基因。在玉米中，此可 如下實現：例如選殖與單一對偶基因相關的DNA且接著再 引入’此對偶基因可產生以低植酸含量為特性的玉米突變 株。參見 Raboy 等人，35: 383 (1990)。 (C)修改的碳水化合物組成，此可藉由例如用編碼改 變澱粉之分支型態之酵素的基因將植物轉形來實現。參見

Shiroza 等人，乂 170: 810 (1988)(變異鍵球菌 (心repiococcw )果糖轉移酶基因之核苷酸序列）；

Steinmetz 等人，Mo/ Ge«ei_ 200: 220 (1985)(枯草桿菌 (JwW/b )果聚糖蔗糖酶基因之核苷酸序列）；卩的 等人，价〇/7^以《〇/〇訂1〇): 292 (1992)(產生表現地衣芽孢桿 菌（//c/ze«(/〇r»n\s ) α_澱粉酶之基因轉殖植物）；

Elliot 等人，尸/咖/ Mo/ec.仏0/. 21: 5 15 (1993)(番莊轉化酶 基因之核普酸序列）；Seigaard等人，J. 5z.o/· C/zem. 268: 22480 (1993)(大麥α_澱粉酶基因之定點誘變誘發），及 Fisher 等人，1〇2: 1〇45 (1993)(玉米内胚乳澱 粉分支酶II)。 亦可根據本文中所揭示之的參考文獻使用反義或共抑 制技術。 在其他具體貫例中’可藉由分裂編碼多肽之基因來降 低或清除該多狀之活性。本發明涵蓋帶有基因突變的誘變 真菌’其中突變可降低相應基因之表現或抑制所編碼多肽 之活性。 可利用多種方法降低或消除多肽之活性。另外，可利 42 201202422 用一種以上方法降低單一多肽之活性。 1 · 基於多核苷酸之方法·· 在本發明之一些具體實例中，接種真菌株係用表現卡 匣轉形，該表現卡匣能夠表現抑制本發明多肽之表現的多 核苷酸。如本文中所使用的術語「表現（expressi〇n)」係 扣基因產物之生物合成，包括該基因產物之轉錄及/或轉 譯。舉例而言，為本發明之目的，能夠表現抑制至少一種 多肽表現之多核苷酸的表現卡匡為能夠產生抑制本發明之 至少一種多肽之轉錄及/或轉譯之RNA分子的表現卡匿。自 分子「表現」或「產生」蛋白質或多肽係指轉錄及轉 擇編碼序列而產生蛋白質或多肽，而自職分子「表現」 二f生」蛋白質或多肽係指轉譯嶋編碼序列而產生蛋 白^或多狀。 抑制多肽表現之多核苷酸實例提供如下。 i，有義抑制/共抑制 在本發明之一些具體實例中， 制抑制客肝主 j错由有義抑制或共抑 制扑制夕肽表現。對於共抑制而 現對應於信使RNA > 表現卡Ε設計成可表 枱使RNA之全部或一部分的R RNA依「古羔 & A分子’此4吕使 有義」取向編碼多肽。RNA分 低天然基因之表規。m^ 刀子之過度表現會降 因此，師檢經共抑制I i 多個真菌车以你μ w 、仰制表現卡匣轉形的 圈糸U鑑別對多肽表 系。 頦不最大抑制的彼等真菌 、；八抑制的多核苷酸可對應於編碼夕 部或一部分，容# 、、馬夕肽之序列的全 厂刀夕肽轉錄物之5,及/或3丨未轉^ 不得#區之全部或一 43 201202422 分’或編碼多肽之編碼序列與轉錄物之未轉譯區的全部 或一部分。在多核苷酸包含多肽編碼區之全部或一部分的 一些具體實例中，表現卡匣設計成可消除多核苷酸之起始 密碼子以便不轉譯成蛋白質產物。 共抑制可用於抑制基因表現以產生對於由此等基因編 碼的蛋白質而言具有不可偵測之蛋白質含量的真菌。參見 例如 Broin 等人，（2〇〇2) Ce// 14:1417-1432。共抑制亦 可用於抑制同一真菌中多種蛋白質之表現。參見例如美國 專利第5,942,657號。使用共抑制來抑制植物及真菌中之内 源性基因表現的方法描述於F丨ave丨1等人，（丨994) dead· Scrz. tASJ 91:3490-3496 ; Jorgensen 等人，（1996) Ρ/α«ί 31:957-973 ; Johansen 及 Carrington，（2001) P/嫌 户126:930-938 ; Broin 等人，（2002)户/_ Ce// 14:1417-1432 ; Stoutjesdijk 等人，（2002)尸/_ P/zW〇/. 129.1723-1731，Yu 等人，（2003) 63:753-763 ;及美國專利第5,034,323號、第5,283,184號及 第5,942,657號；該等各文獻均以引用的方式併入本文中。 可藉由在表現卡匣中在有義序列之位置3,及聚腺苷酸化信 號之5'包括poly-dT區來提高共抑制效率。參見美國專利公 開案第20020048814號’該案以引用的方式併入本文中。 典型地，此核苷酸序列具有與内源性基因之轉錄物之序列 實質上一致的序列’較佳大於約65%序列一致性，更佳大 於約85%序列一致性，最佳大於約95%序列一致性。參見 美國專利第5,283,184號及第5,034,323號；該等專利以引 44 201202422 用的方式併入本文中。 li· s義抑制 在本發明之—此且栌眷 多肽表現。對於反義：卩制來抑制 、，扁碼夕肽之信使RNA之 見與 義RNA分子之過声矣银合^ J刀互補的RNA分子。反 於 又 a降低天然基因之表現。因此，鋪 檢經反義抑制表規+际击电 匕 師 制表現卡g轉㈣多個真菌以_ 現顯示最大抑制的彼等真菌系。 肽表 :二義抑制的多核*酸可對應於編碼多肽之 互補序列的全部或一部分，轉錄物之5，及/或 互補序列的全部戋一邱八， c之 物之未轉肽之編碼序列與轉錄 物之未轉#£之互補序列的全部或一部分。另外， 核苦酸可與衫列完全互補（亦即，與乾序列之互補^ 贈。-致）或部分互補（亦即，與輕序列之互補序列小於 100%-致）。反義抑制可用於抑制同一真菌t多種蛋白質 之表現。參見例如美國專利第5,942,657號。此外反義核 芽酸之-部分可用於干擾乾基因之表現。一般而言，可使 用至少50個核皆酸、100個核皆酸、200個核苦酸、300個 核苷酸、400個核苦酸、45〇個核菁酸、5〇〇個核普酸、55〇 個核苦酸、或550個以上核皆酸之序列。使用反義抑制來 抑制真菌中内源性基因之表現的方法描述於例如Liu等人， (2002)户/α价户/^以_〇/. 129:1732_1743及美國專利第 5,759,829號及第5,942,657號中，各文獻均以引用的方式併 入本文中。可藉由在表現卡匣中在反義序列之位置及聚 45 201202422 腺芽Ιλ化彳s號之5’包括poly-dT區來提高反義抑制效率。參 見美國專利公開案第20020048814號，該案以引用的方式 併入本文中。 iu•雙股RNA干擾 在本發明之一些具體實例中，可利用雙股rna (dsRNA )干擾抑制多肽表現。對於dsRNA干擾而言，有 義RNA分子（如上文針對共抑制所述）及與有義rna分子 完全或部分互補的反義RNA分子表現於同一細胞中，從而 抑制對應内源性信使RNA之表現。 可藉由設計包含有義序列與反義序列的表現卡匣來表 現有義與反義分子。或者，有義序列與反義序列可使用各 別表現卡匣。接著篩檢經dsRNA干擾表現卡匣或表現卡匣 轉形的多個真菌系，以鑑別對多肽表現顯示最大抑制的真 菌系。使用dsRNA干擾來抑制内源性真菌基因表現的方法 描述於 Waterhouse 等人，（1998) 七以.&·. 95:13959-13964 ； Liu 等人，(2002) Plant Physiol.

129:1732-1743 ;及 WO 99/49029、WO 99/53050、WO "/61631及WO 00/49035中，該等各文獻均以引用的方式 併入本文中。 ζν·髮夾RNA干擾及含有内含子之髮夹RNA干擾 在本發明之一些具體實例中，可利用髮夾rna (hpRNA )干擾或含有内含子之髮夾rn A ( ihpRN A )干擾 來抑制多肽表現。此等方法可高效抑制内源性基因表現。 參見 Waterhouse 及 Helliwell, (2003) Genei. 46 201202422 4:29-3 8及其中所引用的參考文獻。 對於hpRNA干擾而言，表現卡匣設計成可表現與自身 雜交的RNA分子，以形成包含單股環區域及鹼基配對莖 (base-paired stem )的髮夾結構。鹼基配對莖區域包含對 應於内源性信使RNA之全部或一部分的有義序列’該信使 RNA編媽欲抑制表現的基因；及與該有義序列完全或部分 互補的反義序列《或者，鹼基配對莖區域可對應於控制欲 抑制之基因之表現之啟動子序列的一部分。因此，分子之 驗基配對莖區域一般決定RNA干擾之特異性。hpRNA分子 可尚效抑制内源性基因表現，且其誘導的RNA干擾可遺傳 給真菌後代。參見例如Chuang及Meyerowitz，（2000) ZVoc. dcGi/· «Scz·. /75^4 97:4985-4990; Stoutjesdijk 等人，（2002) 129:1723-173 1;以及 Waterhouse 及 Helliwell， (2003) iVai. Genei. 4:29-38。使用 hpRNA 干擾來抑制基

因表現或使基因表現沉默的方法描述於例如Chuang及 Meyerowitz, (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:4985-4990 ; Stoutjesdijk 等人，（2002) P/_ 129:1723-173 1 ; Waterhouse 及 Helliwell，（2003) 及ev. Genei. 4:29-38，Pandolfini 等人，A.oiec/zwo/ogy 3:7 ; 及美國專利公開案第2003/0175965號中，該等各文獻均以 引用的方式併入本文中。關於hpRNA構築體活體内使基因 表現沉默之效率的瞬態檢定（transient assay )已描述於

Panstruga 等人，（2003) Mo/ 价〇/. 30:135-140 中，該文 獻以引用的方式併入本文中。 47 201202422 lhpRNA之干擾分子與hpRNA之干擾分子具有相同的 通用結構’但RNA.分子另外包含能夠在表現ihpRNA的細 胞中剪接的内含子。使用内含子可使髮夾RNA分子的環尺 寸在剪接後最小化，且由此提高干擾效率。參見例如Smith 等人，（2000) 407:319-320。實際上，Smith 等人顯示 使用ihpRNA介導之干擾可1〇〇%抑制内源性基因表現。使 用ihpRNA干擾來抑制内源性真菌基因表現的方法描述於 例如 Smith 等人，（2000)iVaiMre 407:3 19-320; Wesley 等人， (2001) </· 27:58 1-590，Wang 及 Waterhouse，（2001)

Cwrr. 5:146-150 ; Waterhouse 及 Helliwell， (2003) iVizi. Gewei. 4:29-38，Helliwell 及 Waterhouse， (2003) Mei/zoA 30:289-295 ，及美國專利公開案第 20 03/018094 5號中，該等各文獻均以引用的方式併入本文 中〇 用於hpRNA干擾之表現卡匣亦可設計成使得有義序列 及反義序列不對應於内源RNA。在此具體實例中，有義序 列及反義序列側接環序列’該環序列包含對應於靶基因内 源性信使RNA之全部或一部分的核苷酸序列《因此，其為 決定RNA干擾之特異性的環區域。參見例如w〇 02/00904 ; Mette 等人，（2000)五«/ 19:5194-5201 ; Matzke 等人， (2001) Cwrr. Ge/tei. Z)eve/· 1 1:221-227 ; Scheid 等人， (2002) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 99:13659-13662 ； Aufsaftz 等人，（2002)Proc. iVW/· Jcat/· 99(4): 16499-16506; Sijen 等人，Cwrr.价〇/. (2001) 1 1:436-440)中，該等文獻以 48 201202422 引用的方式併入本文中。 V. 擴增子介導之干擾 擴增子表現卡匣包含來源於真菌病毒的序列，該序列 含有靶基因之全部或一部分，但通常並非含有天然病毒基 因之全部。存在於表現卡匣之轉錄產物中的病毒序列容許 轉錄產物引導其自身的複製。利用擴增子產生的轉錄物相 對於靶序列（亦即多肽之信使RNA)而言可為有義或反義。

使用擴增子抑制内源性真菌基因表現的方法描述於例如 Angell 及 Baulcombe，（1997)五篇〇 乂 16:3675_3684 ; AngeU 及 Baulcombe，（1999) 20:357-362，及美國專利第 6,646,805號中，該等各文獻均以引用的方式併入本文中。 vi. 核糠酶 在一些具體實例中，由本發明之表現卡匣表現的多核 苷酸為催化性RNA或具有專門針對多肽之信使RNA的核糖 酶活性。因此，多核苷酸可降解内源性信使RNA，從而降 低多肽表現。此方法描述於例如美國專利第4，9 8 7 0 71號 中，該專利以引用的方式併入本文中。

vii. 小型干擾RNA或微小RNA 在本發明之一些具體實例中，可藉由RNA干擾、藉由 表現編碼微小RNA ( miRNA )的基因來抑制多肽表現。 miRNA為由約22個核糖核苷酸組成的調節劑。可 向效抑制内源性基因表現。參見例如javier等人，（2〇〇3) A^we 425:257-%3，該文獻以引用的方式併入本文中。 用於miRNA干擾的表現卡昆設計成可表現模擬内源性 49 201202422 rmRNA基因的RNA分子e miRNA基因編碼形成髮夾結構 的RNA，該髮夾結構含有與另一内源性基因（靶序列）互 補的22個核苦酸序列。為抑制表現，該22個核苦酸序列 係選自轉錄物彳列且含有呈有義取向之該序列中之22個核 苦酸及與有義序列互補之對應反義序列中之21個核苦酸。 miRNA分子可高效抑制内源性基因表現，且其誘導的rna 干擾可遺傳給真菌後代。 在其他具體實例中，此等真菌已穩定併入其基因组（一 種包含可操作地連接於啟動子之本發明核芽酸序列的核酸 分子，該啟動子驅動細胞中之表現）中。 轉形 除土壌桿菌轉染外，亦可使用傳統轉形技術。已用於 將重組分子引入植物細胞中的其他方法包括機械手段，諸 如直接DNA攝取、脂質體、電穿孔（Guerche，p等人，I%' Plant Science 52:111-116)及微注射（Neuhaus，g 等人，

Theor. APP1. Genet. 75:3〇_36)。使用微彈及搶或其他裝置 將塗有DNA的小金屬粒子擊入細胞内的可能性亦受到相當 大的關注（Klein，Τ.Μ·等人，1987,仏㈣Mu?”。 通常需要DNA序列處於同型接合子狀態，此可能需要 -個以上的轉形事件以產生親代系；使得轉形必需使用均 編碼相同基因產4勿的第—與第二重組DNA分子。繁殖基因 轉殖同型接合子的另一種方式為將兩個反向交配型同^體 (帶有單一核型的單抱子系）個別地轉形且使其雜交以產 生可繁殖的異核系。A太務明太汰+ _ ΛΙ_ β . 50 201202422 一步涵蓋真菌細胞用含有至少兩種DNA序列的重組 分子轉形或用一種以上重組DNA分子轉形。在此等具體實 例中，DNA序列或重組DNA分子可置於同一载體中而實體 上連接，或在不同載體上而實體上分開。細胞可用一個以 上載體同時轉形，其限制條件為各載體具有獨特的選擇性 :記基因。或者，細胞可用一個以上載體依序轉形，從而 容許在用第一載體轉形後進行中間再生步驟。此外，可使 含有不同舰序列或重組DNA分子的個別真菌或真菌系 進行有性雜交（較佳地，該等DNA序列或重組分子連接在 -起或位於同—染色體上），接著自雜交子代中選擇含有 兩種DNA序列或重組dna分子的真菌。 含有本文中所述之DNA序列及啟動子的重組DNA分 子在經轉形真菌細胞中的表現可使用熟習此項技術者已知 的北方墨點技術及/或南方墨點技術監測。 再生真菌轉移至標準生县與基I / . 长培蚕基（例如固體或液體營 養培養基、穀物、蛭石、堆肥、、无山 隹肥泥厌、木材、木鋸屑、麥 稈等）中且以熟習此項技術去p知沾七上 议_考已知的方式生長或培養。 多核苷酸穩定併入再生的其α 士 丹玍的基因轉殖真菌中之後，可藉 由有性雜交轉移至其他真菌中。i目仗 具囷1P。視待雜交之物種而定，可 使用多種標準育種技術中的任一種。 為回收不爻任何位置影響的直益 v警的具®，宜用任何重組構第 體產生大量個別經轉形真菌。齡佔廿 旲囷較佳亦可選擇含有所引入重 組dνα分子之一個以上複本以#洁士、^ +便達成重組分子之高表現量 的真菌。 51 201202422 =所說明’可能需要在特定物種中產生（若可幻 因為同型接合子的真菌系。在一些物種_，此係 A因I:子培養來實現。使用此等技術可產生帶有所插入 :’早倍體系，接著染色體數目自發地或藉由使用秋水 仙驗而加倍。由此產生所插入基因為同型接合子的真菌， 插入基因隨身帶有適用於谓測帶有該基因之真菌的選 擇性標記基因，則該真菌容易檢定。或者，真菌可自我辦 殖’從而屋生抱子混合物’在最簡單的情況下，其由三種 如下類型組成：所插人基因為同型接合子（25%)、異型接 合子（观）及零基因（25%)。雖然對含有該基因之真菌 中的零真菌記分相對容易，實務上可藉由南方墨點分析 對同型接合子真菌與異型接合子真g記分，其中小心注意 來自混合種群之剛好等量DNA的加載，及利用對所插入基 因具有特異性之探針的信號強度對異型接合子記分。最好 藉由容許各獨立轉形株自我增殖來驗證南方墨點分析結 果’因為以下簡單實情可另外證明同型接合性：若真菌之 所插入基因為同型接合子，則來自自交個體的所有後代真 菌系皆含有該基因；然而，若真菌之該基因為異型接合子， 則由自交種子生長而成的-代將含有零真菌系。因此，利 用簡單的自我增殖，可選擇的同型接合子真菌系亦可藉由 南方墨點分析法確認。 形成同型接合子親代系可產生雜交真菌及含有經修飾 之蛋白質組分的孢子。維持基因轉殖同型接合子親代系， 其中各親代含有可操作地連接於啟動子的第一或第二重組 52 201202422 DNA序列。此方案甲亦合併培養雜交作物的優勢，包括更 有價值的性狀與雜交優勢之組合。 以下實施例意欲進一步說明本發明，而非以任何方式 限制本發明。雖然本文中之實施例及論述特別提及雙孢蘑 菇，然而本文中之教示同樣適用於任何其他真菌，較佳為 產生肉質子實體的絲狀真菌，（但不限於）蘑菇屬巴西種 (blazei )、雙孢磨菇種（bisp〇rus )及高溫兹種㈣小 實施例 方法 本研究始終使用商業中間體雙孢蘑菇之白色雜交株。 野生型培養物係於麥芽精瓊脂（MEA ; 20 “I麥芽精、2 1 M〇PSpH7.〇、15g瓊脂）上維持且基因轉殖培養物係於含 有50 pg/ml潮黴素b之MEA上維持。 本文中所有實驗皆使用帶有卜葡萄糖醛酸酶（報 導基因及賦予針對抗生素潮黴素Β之抗性之潮黴素磷酸轉 移酶（贈）基因的雙孢蘑菇基因轉殖系執行。圖2及圖3 描緣專屬土壤桿菌二元質體載體（Ρ237 ; lntr_公司）及 表現卡匣之一般設計。此質體載體合併陳等人（2〇〇5及 2009 )所私出之基本特徵’包括主鏈及作 為選擇性標記&游基因，f亥财基因連接至雙跑磨兹 ⑽啟動子及花椰菜花葉病I 35S終止子，所有該等特徵 皆位於土壤桿菌T-DNA邊界序列之間。. 在載體P237實例中，_基因連接至雙孢蘑菇虹2 啟動子及终止+ ’置於T_DNA邊界之間。本研究中 53 201202422 所用的其他GUS表現載體具有相同設計，但其中啟 動子置換為天然GPD或丑啟動子及專屬（Intrex〇n公 司，Germantown，MD ) β-肌動蛋白（JC7W)或凝集素（ZC7W) 啟動子（圖3 )。對於一個載體而言，Gi^基因連接至專屬 天然子實體特異性D ( 啟動子（Intrex〇n公司）及 芬菜屬多泛素終止子（Callis等人，1995 )。 使用雙孢蘑菇之菌褶組織進行的土壤桿菌介導式轉形 係依照 Chen 等人（2〇00 )及 Romaine 及 Schlagnhaufei< 2〇〇6 ) 所指示進行。 製備純系菌絲體接種體時’將含有5 m 1黑麥穀物、〇. 8 g碳酸鈣、0.8 g硫酸鈣及60 ml Milli-Q水的250 ml燒瓶（下 層接種體）或含有50 g專属基質（Lambert公司，Coatesvilie， PA 及 Sylvan 公司，Kittanning，PA)及 75 ml Milli-Q 水的 25〇ml燒瓶（上層接種體）熱壓處理3〇分鐘。含有接種體 的各燒瓶用雙孢蘑菇之三個菌絲體瓊脂塊接種且在室溫 下、在可使接種體再分佈的偶爾搖振下保持2_3週。 使用習知實務及環境參數（賓州1982; Beyer 2003 )、 如Romaine及Schlagnhaufer( 1992 )所簡要概述栽培蘑菇， 其中進行以下修改：將15 g下層接種體與18 kg堆肥混合， 接著填裝於25 cm直徑的塑膠容器中，且將25 g上層接種 體與1.5 L基於中和泥炭之基質混合且覆蓋於堆肥上。收穫 子貫體，用水沖洗，切塊，且藉由在_20。〇 ( PCR及Gus檢 定）或-78 C ( RT-PCR)下處理而以聚集物樣品的形式儲存。 對子實體之GUS活性進行組織學檢定時，將剛收穫之 54 201202422 子實體的縱向切片（2-3 mm厚度）於l〇 mi x_Gluc受質（100 mM 磷酸鉀 pH 7·0、25 mM 抗壞血酸、0.02% Triton X-1 00、 0.08%乙醇、0.5 mg/ml 5-溴-4-氣-°弓丨哚酚葡糖醛酸（Gold Biotechnology，St. Louis, MO)中培育 1.5-4 小時。 為分析生長於堆肥中之營養菌絲體的GUS酶活性，在 含有用於產生子實體之堆肥的12 cm直徑塑膠瓶之側面鑽 出1.75 cm孔眼’且濕潤之2.3 cm直徑Whatman 3MM渡紙 片用膠帶固定以覆蓋孔眼。14天堆肥磨兹定瘦期後，移除 紙片且於X-Gluc受質中置放2小時。 為評估生長於純種培養物（axenic culture )中之營養菌 絲體的GUS活性，將6 cm直徑皮氏培養盤（petri piate) 中所含之MEA上生長的菌絲體群落浸入5 mi x_Gluc受質 中且培育隔夜。 為定量檢定子實體之GUS活性，使用ρτ 10-35 GT均 質機（Kinematica 公司，Lucerne, Switzerland )將冷凍子實 體組織（3 g )於9 ml萃取緩衝液（5 〇 mM磷酸鈉pH 7 .〇、 10 mM EDTA、10 mM 酼基乙醇、〇」〇/〇 Triton X-100、0.1% 十二烧基肌胺酸鈉（sarkosyl ))中均質化1分鐘。萃取物 在1 1,000 g下澄清U分鐘且利用Bradford方法（Bradford 1976 )測定蛋白質濃度。 使用4-曱基香豆素基（4-methylumbeliferyl ) B-D-葡萄 糖酸:酸（MUG ’ Sigma，St. Louis，MO )受質（O'Neill 等人 2008 )、藉由榮光檢疋來定量GIJS活性。數值以4-甲基-7_ 六香豆素（MU )形成之莫耳速率與總可溶性蛋白質之比率 55 201202422 之平均值報導。 為師檢擔抱子之共㈣^^基因（賦予潮徽素抗性選 擇性標記），將接近完全成熟的子實體於1〇%商業漂白溶 液(最終濃度0.6% NaC10)中浸泡i分鐘，接著用無菌 MUli-Q水澈底沖洗。使用剝刀切開菌柄及菌膜組織以 菌褶，且菌蓋於無菌玻璃室内用鋼絲鉤懸掛於9啦直徑無 菌濾紙片上方。培育隔夜後，用無菌MiUi_Q水將所排出之 擔孢子自濾紙表面洗去。將混濁擔孢子懸浮液之丨〇〇 W等 分樣品（>100,000個擔孢子/毫升，如利用血細胞計數法所 測疋）展佈於具有MEA及含1〇〇 pg/mi潮黴素之MEA的 10 cm直徑皮氏培養盤之每一者上，且培養盤在室溫下培育 3-4 週。 為檢定子實體組織之潮黴素抗性，將0.5 cm内部菌蓋 組織切片無菌轉移至具有MEA及含有50 pg/ml潮黴素之 MEA之6cm直徑皮.氏培養盤之每一者上。培養盤在室溫下 培育2 - 3週。 使用LETS程序（Chen等人，1999)、利用FastPrep FP-120 系統（Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ)自冷 凍的子實體組織（100 mg)中萃取DNA。DNA在-78°c下儲 存於 TE 緩衝液（10 mM Tris-HCl，2 mM EDTA，pH 8.0) 中。 使用 RNAqueous 套組（Applied Biosystems，Foster City, CA)及FastPrep系統自冷凍的子實體組織（100 mg)萃取 RNA。RNA 在 3 7°C 下、於 Tris-HCl pH 7.5、2.5 mM MgCl2、 56 201202422 0.5 mM CaCl2中用2 U脫氧核糖核酸酶（DNAse)處理1 小時，隨後執行標準苯酚萃取及乙醇沈澱。RNA在-78°C下 儲存於TE緩衝液中。 進行PCR擴增，最終體積為25 μΐ，其含有0.75 U Taq DNA聚合酶及標準Taq緩衝液（New England Biolabs， Ipswich，ΜΑ)、200 μΜ dNTP、0.2 μΜ 各引子及 10-50 ng DNA 模板。引子組 I:前置 5’CGTGACAAGAACCATCCAAGCG3· ( SEQ ID ΝΟ:1 ) 及反置 5'GGGTAGCCATCACAAACAGCAC3' ( SEQ ID N0:2)用於 擴增GtAS基因之163 bp序列。或者，使用引子組II :前置 5'CGAACTAGTCTGTACCCGATCAACACC3'( SEQ ID NO:3 ) 及反置 5'TCCGCACGCCGAACGGCTCTTC3' ( SEQ ID N0:4)，其界定GCAS基因之835 bp序列。作為DNA模板 對照物，使用以下引子組進行各別反應：引子組：前置 5，CGACGGGTGTGAACGCAAAGG3,（ SEQ ID NO:5 )及反置 5' CAATCAGTCGATCAACGTTCGC3' ( SEQ ID NO:6)，其 界定天然多酚氧化酶1 (尸尸Ο )基因之403 bp序列（Wichers 等 人 ， 2003 ) ; 或 引子組： 前置 S'GGAAGTTTAGATAGGGGACCS1 (SEQ ID NO:7)及反置 5'GTGGCTGTCTGAAAAGATAC3' (SEQ ID NO:8)，其界 定天然醛縮酶脫氫酶（ZLD )基因之500 bp序列（Genbank 序列寄存編號Y17825 )。熱循環參數為：94°C維持5分鐘； 35輪：94°C維持1分鐘、58°C維持1分鐘及72°C維持1分 鐘。 57 201202422 使用 MasterAmp RT-PCR 套組（Epicentre Biotechnologies，Madison, WI)進行 RT-PCR ( 25 μΐ 最終體 積），在各別反應中使用30-100 ng RNA模板及GtAS PCR 引子組（引子組II)及户尸(9基因。熱循環參數為：60°C維 持20分鐘；94*t維持2分鐘；40輪：94°C維持1分鐘及 60°C維持1分鐘；72°C維持7分鐘。 在哈克基因組學核心研究院（Huck Institute Genomics Core Facility, The Pennsylvania State University, University Park，PA )使用標準方案執行即時qPCR。GtAS引子為：前 置 5'CGACGGACTGACCATCGAT3' ( SEQ ID NO:9)，及 反置 5，GAACTTGCCGTCGTTGACTTC3' ( SEQ ID NO: 10 ) ， 且 BHQ 探針 序列為 ： 5TAMCCGTTCGGCGTGCGGACC3，（ SEQ ID NO: 11 引子為：前置 5'ATGCTCCTCGTGCCGTCTT3’（ SEQ ID NO: 12 )，及反置 S'TGCCCCATACCAACCATCAS^ SEQ ID NO: 13 ) ， 且 BHQ 探 針 序列為 ： 5'FAMCCTTCCATCGTCGGTCGTCCTCG3' ( SEQ ID NO: 14)。擴增參數為：95°C維持l〇分鐘；40輪：95°C維持 15秒及60°C維持1分鐘，使用7300即時序列偵測系統 (Applied Biosystems )。結合 delta delta Ct 方法、使用 基因及參考d 基因之Ct值測定相對含量。 實施例1 雙孢蘑菇之商業栽培係於雙層基質上進行，該雙層基 質由各自經菌絲體接種體接種的上層泥炭層及下層堆肥層 58 201202422 組成（圖η。由於定殖薄上層所必需的接種體相當少，因 此使用㈣WT接種體接種下層的雙重接種體策略可將生 物質生產所需的基因轉殖接種體降低約7〇%且將重組蛋白 製造時間縮短兩週以上。因此，經由施用表現基因轉殖⑽ 之雙孢蘑菇菌絲體接種體（表示為XGS，其中X係指用於 驅動GTO轉殖基因之表現的啟動子）i上層中及施用资 接種體至下層中來評估實現重紕蛋白生產的實務。本文中 對「上層接種體/下層接種體」使用接種體記數系統，此處 .理稱為「XGS/WT」。 營養菌絲體之組織學GUS檢定 為/刀析生長於堆肥中之營養菌絲體的GUS酶活性，在 含有用於產生子實體之堆肥的12 cm直徑塑膠瓶之側面鑽 出1.75 cm孔眼且邊/閏之2.3 cm直徑Whatman 3MM渡紙 片用膠帶固定以覆蓋孔眼。14天堆肥蘑菇定殖期後，移除 紙片且於X-Gluc受質中置放2小時。 為評估生長於純種培養物中之營養菌絲體的Gus活 性，將6 cm直徑皮氏培養盤中所含之MEA上生長的菌絲 體群落&入5 ml X-Gluc受質中且培育隔夜。 子實體cDNA文庫。 使用Tn-Reagent溶液（Ambion公司）自剛收穫的子實 體（成熟期3-4 )中萃取總RNA，且使用〇lig〇_(dT)15纖維 素（Pr〇mega公司）分離P〇ly(A)+RNA。使用具有xh〇 I限 制性核酸内切酶位點的oUgo_dT引子、藉由逆轉錄合成第 一股cDNA，隨後在核糖核酸酶H存在下使用DNA聚合酶 59 201202422 合成第二股。雙股cDNA在其5'端接合至EcoRI接頭 (adaptor )且選殖於 pBluescriptll XR 載體（Agilent

Technologies公司）中。總共4,6〇8個菌落斑點點在 Hybond-N膜（GE Healthcare )上且用合成的基因特異性dna 寡核苷酸（60 nt) (Integrated DNA Technologies)探測， 該等DNA寡核苷酸已使用ECL DNA/RNA直接標記/靖測套 組（GE Healthcare )標記。探索性研究結果認為，雙重接 種體方法可大量生產重組蛋白（GUS酶活性），但其功效 依賴於用於驅動G CAS基因表現的啟動子。舉例而言，當帶 有由啟動子控制之基因的基因轉殖雙孢蘑菇系 (HGS)用作上層接種體且用WT系接種下層（HGS/WT) 時，子實體表現的GUS活性為針對處理HGS/HGS (其中雙 層均用基因轉殖接種體接種）所觀測到之Gus活性的63% (圖4 )。形成鮮明對比的是，使用帶有由GpD啟動子（GGs 系）或ZCC2啟動子（LGS系）驅動之基因的基因轉 殖系作為上層接種體（XGS/WT)導致GUS活性100。/。損失。 不論何種接種體處理，qPCR分析結果均顯示子實體中 存在GtAS"基因（圖4)。然而，雙重接種體組合（XGS/WT) 所產生的子實體顯示GtAS1基因量比由單一基因轉殖接種體 (XGS/XGS )生長而成之子實體中的GUS基因量減少約 25-50%。子實體中_基因之存在（如qpcR分析所測定） 係經非定量PCR分析結果證實（圖5 )。 實施例1之結果說明嵌合子實體（GUS/WT)之形成與 基因轉殖及wt雙重接種體條件相關。下層中之WT系若生 60 201202422 長速率相對高於基因轉殖系，則很可能會浸入及侵入上層 中。儘管如此’但是因使用雙重接種體而引起基因含 量高達50°/。的減少無法說明與LGS及GGS系相關之Gus 活性100%損失。 實施例2 此貫施例基本上與實施例1 一致，例外為針對GGS及 L G S每一者sf·估三種獨立基因轉瘦系。如實施例1中所觀 測，具有明顯GUS活性的子實體可使用其中上層使用Gus 系與下層使用WT系組合的基質生長而成。然而，所觀測到 之I#活性望驅動Gt/iS基因的啟動子而變（圖6及表1)。 表1 :實施例2—對使用野生型及基因轉殖接種體生長而成 之子實體的定量GUS活性檢定。 *4 1 li^TTHUL 2 —------ 雙孢蘑菇系1 GUS活性2 減少％ 單一接種體 雙重接種體4 WT 0.075 (0.03-0.10) HGS 1.04(1.02-1.05) 0.83 (0.78-0,88) 20 GGS-42 1.44(1.43-1.44) 0.00 (0.00-0.00) 100 GGS-C1 3.25 (3.16-3.35) 0.17(0.17-0.18) 95 GGS-47 2.26 (2.17-2.34) 0.00 (0.00-0.00) 100 LGS-3 19.14(18.2-20.1) 0.26 (0.26-0.26) 99 LGS-409 7.12(6.59-7.66) 0.23 (0.23-0.24) 97 LGS-412 5.30 (4.87-5.80) 0.13 (0.12-0.15) 98 力腳註不可見於Macild型（WT)系；帶有啟動子 (HGS ) 、G尸乃啟動子（GGS )及ZCC7啟動子（LGS ) 的GUS系；42、C1、47、3、409及412表示不同基因轉殖 系。 2每100微克總可溶性蛋白質每分鐘水解的奈莫耳MUg。 61 201202422 3上層與下層均用指定系接種。 上層用札定系接種且下層用WT系接種。 值代表平均值，其中n=2 ;(值範圍）。 帶有啟動子系之hgS系得到的GUS最高活性量 為針對兀全基因轉殖接種體對照物（hgs/hgs )所觀測到 之酶活性量的8G% (亦即減少20%)。再次形成鮮明對比 的疋eSWT接種之下層頂上的上層巾分別使用帶有^^ 及ZCC2啟動子之六種GGS及LGS系中的任-種時，Gus 活性降低95-100%。 表2總結經各種單一接種體及雙重接種體處理生長而 成之子實體中之GCASr基因的qPCR分析結果。但有一個可 月b例外（LGS-409系），使用包含基因轉殖系及资系之雙 重i妾種體組σ生長而成的子實體顯示基因含量相對於 由其各別完全基因轉殖接種體對照物而成之子實體中 可見的基因含里未明顯降低。此結果說明雙重接種體條件 所產生的子實體實質上不為嵌合體。如實施例丄中所觀測， 由WT系與GGS系或LGS系之組合生長而成之子實體中的 I1 生員著損失無法依據G 基因含量之相應減少來說 明。 、 62 201202422 表2 :實施例2—使用野生型及基因轉殖接種體生長而成之 子實體中之基因的qPCR分析。 上層接種體/下層接種體1 相對GOS基因值2 HGS/HGS 571 (±124) HGS/WT 642 (±129) GGS-42/GGS-42 1,611 (±285) GGS-42/WT 1,850 (±315) GGS-C1/GGS-C1 1,692 (±162) GGS-C1/WT 2,343 (±731) GGS-47/GGS-47 2,096 (±167) GGS-47/WT 2,065 (±114) LGS-3/LGS-3 2,734 (±712) LGS-3/WT 2,711 (±330) LGS-409/LGS-409 753 (±101) LGS-409/WT 680 (±7) LGS-412/LGS-412 517(+98) LGS-412/WT 659(±3)

1野生型（WT)系；帶有啟動子（HGS ) 、GPDGPD 啟動子（GGS)及ZCC2啟動子（LGS )的GUS系；42、 C1、47、3、409及412表示不同基因轉殖系。 2數值表示針對内源性d CT#基因校正之平均值，其中n=3 ; (s.d.)。 實施例3 在此試驗中，使用WT與帶有ZCC2啟動子的LGS系 的所有可能組合來接種栽培基質之上層及下層。若兩層均 用WT系接種，則子實體顯示WT基因型與表型（GtAS基因 呈PCR陰性且缺乏GUS酶活性）（圖7 )。類似地，兩層 均使用LGS系作為接種體可產生具有GtAS基因型及表型的 子實體，如依據PCR偵測之GtAS基因及GUS酶活性證明。 63 201202422 如實施例1及2中所觀測，用LGS系接種上層及用WT系 接種下層（LGS/WT)產生的子實體顯示GCAS基因型（PCR 陽性），但表型為WT;表示自無至痕量之GUS酶活性。 有趣的是，當顛倒接種體時：WT系用於上層中且GUS系 用於下層中（WT/LGS )，則子實體性狀逆轉，展現WT基 因型（GtAS基因呈PCR陰性）及GUS表型（高GUS活性 表現量）。 此研究之結果證明且拓展了實施例1及2之彼等結 果。對於所有接種體處理而言，子實體之基因型均依據引 入殼層中之雙孢蘑菇系之GCAS基因型嚴格確定。亦證實基 因型不能預測子實體之GUS表型。 實施例4 執行完全因子設計實驗，其中表現由4種不同啟動子 驅動之GCAS的雙孢蘑菇系各自與WT系搭配作為雙層之接 種體。此等研究包括HGS、LGS及GGS以及AGS系，其 具有由β-肌動蛋白（JCTiV)啟動子驅動的GCAS基因。與上 述實施例（其中GUS系用於上層中）之觀測結果一致，來 源於HGS/WT之子實體產生的最大GUS活性為使用 HGS/HGS所得到之最大GUS活性的約70% (圖8A、8B )， 而來源於LGS/WT之子實體（圖8C、8D)及來源於GGS/WT 之子實體（圖8E、8F )顯示的活性相對於LGS/LGS及 GGS/GGS所得到之活性分別降低>95%。相比之下，與針對 AGS/AGS所觀測到之活性相比，在來源於AGS/WT之子實 體中AGS系顯示產生約50%GUS活性（圖8G、圖H)。 64 201202422 亦以倒轉的構形檢查各雙重接種體處理，其中wt接種 體用於上層中且GUS接種體用於下層中。與HGS/HGS子 實體所觀測到之GUS活性相比，來源於WT/HGS之子實體 現顯示GUS活性降低>95% (圖8A、圖B )。意外的是， WT/LGS (圖8C、圖D )及WT/GGS (圖8E、圖F )子實體 顯示的GUS活性分別為LGS/LGS及GGS/GGS子實體所觀 測到之GUS活性的80%。由於來源於AGS/WT及WT/AGS 的子實體顯示相似的GUS活性量（圖8G、圖Η)，因此 AGS系表明該等接種體之空間調換基本上不具有影響。 為說明GUS活性與基因型之間的關係與基因轉殖接種 體之空間位置有關，對子實體的GtAS基因及RNA轉錄物分 別進行PCR及RT-PCR分析。在所有情況下，僅依據用於 上層中之接種體的基因型確定子實體之基因型。僅當基因 轉殖接種體施加於上層中時，才可在子實體中偵測到可預· 測GCAS基因及mRNA的GtAS擴增子（圖9及圖10 )。此 結果說明，上層中之菌絲體接種體產生子實體，基本上將 下層接種體排除在外。 雖然上層中接種體之基因型嚴格決定子實體中之GCAS 基因的存在或不存在，但是此基因型不能很好地預測GUS 酶活性。最值得注意的是，WT/LGS、WT/GGS及WT/AGS 組合可產生顯示較高GUS活性、但完全缺乏GtAS基因及轉 錄物的子實體（圖8-圖10)。 若GUS酶不在子實體及上層菌絲體中合成，而是以蛋 白質或mRNA形式自下層菌絲體移位，則只能說明GUS基 65 201202422 因型與表型之間的不相容性。然而，RT_PCR顯示GUS活 性量高的子實體不含有GCAS轉錄物。因此，移位的分子必 定為GUS蛋白質。根據此證據可得出結論：雙孢蘑菇之器 B形成與蛋白質自定殖於下層堆肥層中之菌絲體遷移至發 育中之子實體的高穩，固機制相關。 子實體所表現之GUS活性量與GtAS基因的存在或不存 在並不密切相關。此觀測結果可舉以下者為例很好說明： WT/LGS、WT/GGS及WT/AGS子實體，其呈現高（jus活 性量，然而缺乏GtAS基因及轉錄物。此等結果只能藉由gus 蛋白質自下層菌絲體移位至子實體中來說明。 實施例5 在此貫施例中，對定殖於下層堆肥中之多種基因轉殖 系菌絲體所表現之GUS活性量特性化。已發現，基因轉殖 •雙孢蘑菇系之子實體中的GUS聚積變化可由其驅動Gt^轉 殖基因表現之啟動子之組織特異性差異來說明（圖丨丨）。 舉例而言，LCC2基因高度表現於雙孢蘑菇營養菌絲體中

(Perry 等人，1993 ; Smith 等人，1998 )。因此，在 WT/LGS 處理中，下層中之帶有菌絲體ZCC2啟動子的Gus系支持 GUS蛋白質之合成（圖u) ，GUS蛋白質接著移位至完全 由上層中之WT菌絲體發育而成的子實體中。倒轉接種體 (LGS/WT)產生含有G⑽基因、但顯示Gus活性明顯減 弱的子實體，因為GUS蛋白質不再自下層中之WT菌絲體 移出之故。 或者，好//Μ啟動子在子實體中，而非在營養菌絲體中 66 201202422

因此，當 其中子實 體完全由其菌絲體形成。

搭配時為何產生咼GUS活性，原因為GUS蛋白質可由下声 菌絲體合成且自下層層菌絲體中移出，且可在子實體及上 層菌絲體中原位合成。 實施例ό 類似於實施例5，該研究檢查在整個52天種植週期期 間生長於堆肥中之帶有菌絲體活性ZCC2啟動子之系 菌絲體的GUS活性量變化。圖丨2說明GUS酶在丨6天堆肥 疋殖期（第7天及第16天）及14天泥炭定殖期（第23天 及第30天）期間聚積，接著酶活性在子實體收穫期（第37、 45、52天）期間穩定降低。此等結果說明菌絲體在堆肥定 殖期期間合成GUS蛋白質及GUS蛋白質移位至發育中之子 實體中。 、 實施例7 在此研究中’檢定由WT與LGS系之組合生長而成之 子貫體菌蓋組織所產生之菌絲體培養物的GUS活性及潮黴 67 201202422 素磷酸轉移酶（HPT)選擇性標記活性，潮黴素磷酸轉移酶 (HPT )選擇性標記活性可賦予潮黴素抗性。圖13顯示， 菌絲體培養物穩定表現GUS及HTP酶活性絕對依賴於用作 菌絲體組織來源之子實體中GtAS基因的存在。特別值得注 意的的是，來源於WT/LGS子實體之菌絲體缺乏穩定的Gus (圖13C)及HPT (圖13D)活性，其表現高Gus活性量， 但元全缺之GCAS1基因（圖13B)。然而，WT/LGS組織切 片呈現暫時的潮黴素抗性（圖丨3D，插圖2 )，說明Ηρτ 與GUS蛋白質已自下層LGS菌絲體中共移位。此研究之結 果驗證性證明WT/LGS子實體之真實WT組成。 測定擔孢子及子實體組織中之HPT活性》 為篩檢擔孢子之共轉形/fpr基因（賦予選擇性標記潮 徽素抗性），將接近完全成熟的子實體於丨0%商業漂白溶 液（最終濃度0.6〇/〇 NaCIO)中浸泡1分鐘，接著用無菌

Milli-Q水澈底沖洗。使用剝刀切開菌柄及菌臈組織以暴露 菌褶，且菌蓋於無菌玻璃室内用鋼絲鉤懸掛於9 直徑無 菌濾紙片上方。培育隔夜後，用無菌MiUi_Q水將所排出之 擔孢子自濾紙表面洗去。將混濁擔孢子懸浮液之ι〇〇 Μ等 分樣品（>100,000個擔孢子/毫升，如利用血細胞計數法所 測定）展佈於具有MEA及含1〇〇 pg/ml潮黴素之mea的 l〇cm直徑皮氏培養盤之每一者上，且培養盤在室溫下培育 3-4 週。 為檢定子實體組織之潮黴素抗性，將〇·5 cm内部菌蓋 組織切片無菌轉移至具有MEA及含有5〇叫/⑺丨潮黴素之 68 201202422 。培養盤在室溫下 MEA之6cm直徑皮氏培養盤之每一者上 培育2-3週。 實施例8 作為實施例7之推論，該研究之目標係檢查航活性 遺傳給由WT肖LGS系組合生長而成之子實體所產生的擔 孢子。根據實施例7之結果’脚基因遺傳給擔孢子群（根 據潮黴素抗性之表現）完全依賴於用作擔抱子來源之子實 體中GtAS基因的存在。因此，"户了轉殖基因不遺傳給呈現 高GUS酶活性量、但基因呈pcR陰性之wt/lgs子 實體所產生的擔孢子。 此等結果之實用性結論強調能夠獨立操作子實體之基 因型及表型，從而為應用生物技術改良作物創造絕無僅有 的良機。在雙重接種體策略中，基因轉殖系可用於下層中 以使賦予所要性狀之蛋白質能夠移位至來源於上層的不同 WT子實體中。除可食用子實體之無轉破基因狀況外，此策 略將提供增強之生物防護的優勢，因為擔孢子亦不含轉殖 基因。 實施例9 瞭解雙孢蘑菇中之蛋白質移位能夠合理設計基因轉殖 構築體以便提高重組表現。在該研究中，測試「空間基因 疊加（spatial gene-stacking )」策略，其中經由蛋白質自下 層移位與在子實體中原位合成之組合來獲得高重組蛋白含 量。此處，帶有強菌絲體活性ICC2啟動子的LGS系個別 地與帶有不同子實體優選啟動子的GUS系（作為上層接種 69 201202422 體）搭配。此等系為HGS (那以啟動子）、ags (π， 啟動子）、DGS ( 奶啟動子）及LnGS UC2W啟動子）。 圖丨5及圖16顯示，除AGS系外，各成對基因轉殖接種體 相對於單一基因轉殖接種體所得到之活性量均獲得明顯提 高之GUS活性》酶活性之提高範圍為丨5倍（對於DGs系） 至3_6倍（對於HGS系）。對於AGS系未觀測到Gus活 性之提高，因為代表Gt/S構築體的獨立基因轉殖系顯示的 酶活性高於代表LGS之基因轉殖系。 參考文獻

Alexopoulos，C. J.，C. W. Mims，及]\1.；81&〇1^611.1996· Introductory Mycology. John Wiley and Sons 公司，New York， New York.第 869 頁。

Beyer, D. M. 2003. Basic procedures for Agaricus mushroom growing. College of Agricultural Sciences. Agricultural and Research and Cooperative Extension. The Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania.第 15 頁。

Bradford, Μ. M. 1976. Rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254 。

Broothaerts W, Mitchell HJ, Weir B, Kaines S, Smith LMA, Yang W, Mayer JE, Roa-Rodriguez C, Jefferson RA. 2005 . Gene transfer to plants by diverse species of bacteria. 70 201202422

Nature 433:629-633。

Callis, J., T. Carpenter, C. W. Sun,及 R. D. Vierstra. 1995. Structure and evolution of genes encoding polyubiquitin and ubiquitin-like proteins in Arabidopsis ί/ζα/ζ’αηα ecotype Columbia. Genetics 139:921-39 o

Chen, X., C. P. Romaine, M. D. Ospina-Giraldo,及 D. J. Royse. 1999. A PCR-based test for the identification of Trichoderma harzianum biotypes 2 and 4 inciting the worldwide green mold epidemic in cultivated Agaricus Zjz.iSporwi. Appl. Microbiol· Biotechnol. 52:246-250 o

Chen, X., M. Stone, C. Schlagnhaufer,及 C· P. Romaine. 2000. A fruiting body tissue method for efficient Agrobacterium-mediated transformation of Agaricus bisporus. Appl. Environ. Microbiol. 66:45 10-45 13。

De Groot, P. W. J., P. J. Schaap, A. S. Sonnenberg, J. Visser,及 L. J. L. D. Van Griensven. 1996. The Agaricus bisporus hypAgene encodes a hydrophobin and specifically accumulates in peel tissue of mushroom caps during fruit body development. L Mol. Biol· 257:1008-1018 o

Harmsen, M. C, F. H. J. Schuren, S. M. Moukha, C. M. van Zuilen,及 P. J. Punt. 1992. Sequence analysis of the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase genes from the basidiomycetes Schizophillum commune， Phanerochaete chrysosporium, and Agaricus bisporus · Curr. Genet. 71 201202422 22:447-454 °

Ibrahim，A. S.等人，2010. The high affinity iron permease is a key virulence factor required for Rhizopus pathogenesis. Mol· Microbiol. 77:587-604。 MacCanna, C,及 J. B. Flanagan. 1972. Casing types and techniques. Mushroom Sci. 8:727-73 1 0

Neveu，B.，M. Michaud, F· Belzile,及 R. R. Belanger. 2007. The Pseudozyma flocculosa actin promoter allows the strong expression of a recombinant protein in the Pseudozyma species. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74:1300-1307 。 O'Neill, K. A.，J. S. Larsen，及 W. R. Curtis. 2008· Scale-up of Agrobacterium-mediated transient protein expression in bioreactor-grown Nicotiana glutinosa plant cell suspension culture. Biotechnol. Prog. 24:372-376 °

Penn State Handbook for Commercial Mushroom Growers. 1982. P. J. Wuest 及 G. D. Bengtson (編）· The

Pennsylvania State University. University Park, Pennsylvania. 第 129 頁0

Perry C. R.，M. Smith, C. Η· Britnell，D. A. Wood,及 C. F. Thurston. 1993. Identification of two laccase genes in the cultivated mushroom Agaricus bisporus · J. Gen. Microbiol. 139: 1209-1218。

Romaine, C. P.及 X. Chen. 2005. Methods and 72 201202422 compositions for highly efficient transformation of filamentous fungi. Romaine, C. compositions for filamentous fungi. Romaine, C. 美國專利第6,964,866號。 P.及 X. Chen 2009. Methods and highly efficient transformation of 美國專利第7,700,349號。 P.及 B. Schlagnhaufer. 1992.

Characteristics of a hydrated alginate-based delivery system for cultivation of the button mushroom. Appl. Environ. MicTobol. 58:3060-3066 °

Romaine，C. P.及 C. Schlagnhaufer. 2006· Mushroom (Agaricus bisporus). Agrobacterium Protocols,第 2 卷，第 453-463 頁.K. Wang (編）.Methods in Molecular Biology 344. Humana Press 公司。

Smith, M., A. Shnyreva, D. A. Wood,及 C. F. Thurston· 1998. Tandem organization and highly disparate expression of the two laccase genes lccl and lcc2 in the cultivated mushroom Agaricus bisporus. Microbiol. 144:1063-1069 ° Wichers，H. J.等人，2003. Cloning, expression and characterization of two tyrosinase cDNAs from Agaricus Appl. Microbiol. Biotechnol. 61:336-341 。 【圖式簡單說明】 圖1為顯示頂廣兹（button mushroom )(雙抱磨益 (dgar/cw ))之栽培方案的像片。圖示為由堆肥 73 201202422 (下層）及泥炭覆蓋層（上層）之床層組成之雙層生長基 質的橫截面，其分別用作使子實體發育之養分及水之主要 來源。下層用雙孢蘑菇純系接種體接種，且在14天培養期 期間，顯示賦予下層白色而賦予堆肥層褐色的營養菌絲體 充分定殖於基質中。亦經雙孢蘑菇接種體接種的上層泥炭 層接著施加於堆肥層表面上。生長於泥炭層及堆肥層中的 菌絲體在雙層之界面（虛線）處實體上融合，形成遍佈於 生長培養基中的唯一網狀物。施加泥炭層之後約17天開始 收穫子實體。 圖2為土壤桿菌二元質體載體之基本設計圖。舉例而 言，圖示p237含有土壞桿菌T_DNA邊界序列（T DNA邊 界）、雙孢蘑菇蟲漆酶2啟動子[ZCC2(p)]、p葡萄糖醛酸 酶基因（GtAS*)、雙抱蘑兹疏水蛋白a終止子、 雙孢蘑菇3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子[GPjC)(p)]、供潮黴素 選擇用之潮黴素磷酸轉移酶（基因（HYGR )、花椰 菜化葉病毒（Caw/(//〇>!；e"所35S 終止子[35S(T)] 及 pCAMBIA 1300 主鏈（pCAMBIA 1300 )。 圖3為顯示表現卡匣之結構性組織的線性映圖。作為 可選擇標記之賦予潮黴素抗性的潮黴素磷酸轉移酶（付户r) 基因及 GtAS 報導基因（; CambiaLabs ) ( Broothaert 等人，2005 )位於土壤桿菌τ-DNA之左邊界序列（T_DNA LB )與右邊界序列（τ-DNA RB )之間。GUS基因連接至天 热 HYPA、LCC2、GPD、ACTN、LCTN 氙 FBSD 故動 + ^ 敗 動子）。GtAS構築體含有終止子序列（終止子）， 201202422 例外為構築體合併芥菜屬多泛素基因終止子（Callis 荨人，19 9 5 ) 。//Γ/Μ内含子在GtAS1基因中之位置顯示於圖 中。好户Γ基因連接至天然3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子 CCPD-P)及花椰菜花葉病毒35S終止子（35S-T) ( Chen 等人，2000) 。5 52 bp、1270 bp及264 bp之啟動子序列係 藉由PCR擴增直接位於各別起始密碼子之上游的DNA序 列、分別自天然 De Groot 等人，1996 )、Perry 專人’ 1993，Smith 等人，1998)及 GPZX Harmsen 等人，1992) 基因中为離而付。ICTW、yi C7W及尺SSZ)啟動子係由Intrexon 公司（Germantown，MD )提供，其藉由添加/fy凡4内含子2 及3而經修飾，連接至位於nco I限制位點的天然啟動子序 列。分別位於//r/M基因及芥菜屬多泛素基因之各別終止密 碼子之下游的經PCR擴增之183 bp及405 bp序列用作終止 子0 圖4為顯示使用野生型及基因轉殖接種體生長而成之 首次收穫子實體的GUS基因型及表型之圖表。所示為雙層 栽培基吳之上層接種體/下層接種體。野生型（WT )系·帶 有丑啟動子之Gus系（HGS)、帶有啟動子之 GUS系（GGS )及帶有ZCC2啟動子之gus系（l叫。 圖示為GUS活性之組織學檢定及定量檢定之結果。後者之 活丨生係以每1 〇〇 總可溶性蛋白質每分鐘所水解的奈莫耳 (nm〇1)MUGS示，其巾η=2。括弧令之百分比表示雙重 接種體處理之平均冑（㈣於其各別單—基因轉殖接種體 處理1 〇〇% ) °亦顯示GtAS>基因之qPCR分析結果。數值 75 201202422 代表針對内源性dczw基因校正之平均值，其中n=3 ; (s.d.)。 圖5顯示使用野生型及基因轉殖接種體生長而成之子 實體中之GCAS基因的PCR分析。所示為雙層栽培基質之上 層接種體/下層接種體。圖示為野生型（WT)系：帶有//"ypj 啟動子之GUS系（HGS )、帶有GPD啟動子之GUS系（GGS ) 及帶有LCC2啟動子之GUS系（LGS ):無模.板PCR對照 (NC );尺寸以kbp表示的DNA標記（Mkr ) 。GtAS基因 (GUS)及内源性醛縮酶脫氫酶基因（之擴增子分別 顯示為835 bp及500 bp期望值。 圖6碉示實施例2之使用野生型及基因轉殖接種體生 長而成之子實體中的GUS活性。所示為雙層栽培基質之上 層接種體/下層接種體。野生型（WT)系：帶有GPD啟動 子之GUS系（GGS );帶有啟動子之GUS系（HGS ); 帶有 ICC2 啟動子之 GUS 系（LGS ) ; 42、CI、47、322、 3、409及412表示不同的基因轉殖系。當上層中之ggs或 LGS系與下層中之WT系組合使用（xgs/WT)時，相對於 使用完全基因轉殖接種體（XGS/XGS )所得之活性量，觀 測到子實體中之GUS活性損失殆盡。相比之下，HGS系當 用作上層接種體、而WT接種下層時產生相對較高的GUS 活性量。 圖7顯示實施例3之使用野生型及基因轉殖接種體生 長而成之子實體的GUS基因型及表型。所示為雙層栽培基 質之上層接種體/下層接種體》野生型（WT)系：帶有 76 201202422 啟動子之GUS系（LGS)。（A)對G奶基因之子實體的 PCR分析顯示預測之163 bp擴增子（σα$ί)及内源性多酚 氧化酶（尸户0)基因之500叶擴增子。（^(}118活性之組 織學檢定。 圖8顯示實施例4之使用野生型及基因轉殖接種體生 長而成之子貫體的GUS活性檢定。所示為雙層栽培基質之 上層接種體/下層接種體❶野生型（WT )系；帶有啟 動子之GUS系（HGS )、帶有/啟動子之GUS系（LGS )、 帶有啟動子之GUS系（GGS)及帶有動子之 GUS 系（AGS )。圖示為（A，B ) HGS、 （ C，D ) LGS、 (E，F ) GGS及（G，H) AGS系之子實體中之GUS活性 的組織學及定量檢定結果。對於定量檢定而言，Gus活性 係以每1 00 pg總可溶性蛋白質每分鐘所水解之奈莫耳mug .表示’且代表兩次獨立實驗之平均值。 圖9顯示實施例4之使用野生型及基因轉殖接種體生 長而成之子實體中之GCAS基因的pcr分析》所示為雙層栽 培基質之上層接種體/下層接種體。野生型（WT )系；帶有 ZfTPj啟動子之GUS系（HGS )、帶有ZCC2啟動子之GUS 系（LGS )、帶有GPD啟動子之GUS系（GGS )及帶有4C7W 啟動子之GUS系（AGS )。圖示為（A ) HGS、（ B ) LGS、 (C ) GGS及（D) AGS系之結果。所示為預測之i63 bp GtAS 擴增子（GUS )及内源性多酚氧化酶1 ( />/)ο)基因之403 bp 擴增子（其係作為PCR對照物包括在内）。 圖1 〇顯示實施例4之使用野生型及基因轉殖接種體生 77 201202422

長而成之子實體中之Gt/lS>轉錄物的RT-PCR分析。所示為 雙層栽培基質之上層接種體/下層接種體。野生型（WT )系； 帶有Z/riM啟動子之GUS系（HGS )、帶有ICC2啟動子 之GUS系（LGS )、帶有啟動子之GUS系（GGS )及 帶有dCTiV啟動子之GUS系（AGS)。圖示為（A) HGS、 (B) LGS、（C) GGS及（D) AGS系之結果。所示為預 測之163 bp GCAS轉錄物擴增子（Gt/S)及内源性多酚氧化 酶1 ( )基因轉錄物之403 bp擴增子（其係作為pcR 對照物包括在内）。 圖1 1顯示實施例5之不同基因轉殖系之定殖於下層雄 肥基質中之菌絲體的GUS酶活性。對於各系而言，將三個 紙片在種植週期之14天菌絲體定殖階段期間暴露於堆肥， 且接著檢定GUS活性。堆肥處理；未接種（無）；WT接 種（WT);用帶有啟動子之GUS系（HGS )、帶有 乙CC2啟動子之GUS系（LGS )及帶有jC7W啟動子之Gus 系（AGS)接種。GUS活性與營養菌絲體中之啟動子的預 測活ft及所觀測到的特定雙孢蘑菇系之將gus蛋白自下層 移位至子實體中的能力正相關。 圖12顯示實施例6之定殖於堆肥中之雙孢蘑菇菌絲體 所顯現的GUS酶活η盘括姑.H + 性與種植週期之時間有關。在塑膠容器 中沿縱向鑽出—速表-1 n r 串二個l .75 cm直徑、間距2 cm之孔眼， 以便跨越12 cm深夕τ旺达〇 之下層堆肥層。母串三個縱向孔眼用一個 ’慮紙條覆蓋。接菩腺广A、

(., (A)堆肥或（B )經基因轉殖系LGS '、由菌絲體活性ZCC2啟動子驅動）接種 78 201202422 之堆肥填入容器中。在各時間間隔，移除LGS菌絲體所定 殖的濾紙條，且檢定GUS活性。 圖1 3顯示實施例7之使用野生型及基因轉殖接種體生 =而成之子實體所產生之菌絲體中的GUS活性及潮黴素磷 酸轉移酶（HPT)可選擇標記活性。所示為雙層栽培基質之 上層接種體/下層接種體。野生型（WT )系：帶有ICC7啟 動子之基因轉殖GUS系（LGS ) ° ( A )組織學GUS檢定 及（B)子實體之GUS_PCR分析。（+)指示存在σ⑽基 因或（-)指不不存在基因，藉由組織化學檢定分析來 原於子貫體之菌絲體組織培養物的（C ) gus活性，及（D ) HPT活性。藉由在含有潮黴素（ +Hyg)的mea中培養來評 估潮黴素抗性。插圖卜2:箭頭所指示之組織切片的較高 倍放大。 圖14顯示潮黴素磷酸轉移酶（Hp 可遺傳給實施…使用野生型及基因轉殖接== 成之子實體所產生的擔孢子。所示為雙層栽培基質之上層 接種體/下層接種體。野生型（WT)系：帶有啟動子 之基因轉殖GUS系、（LGS)。藉由在不含有潮徽素（_Hyg) 及含有潮黴素（+Hyg)的MEA中培養來評估潮黴素抗性。 圖15顯示在雙孢磨益中使用蛋白質移位機制來增加實 施例9之子實體的重組蛋白質產量。圖示為使用單一基.因 轉殖接種體及雙重基因轉殖接種體策略生長而成之子實體 中的GUS活性。所示為雙層栽培基質之上層接種體/下層接 種體。兩層之單-接種體處理均使用帶有子實體活性啟動 79 201202422 子的雙孢蘑菇系作為接種體：HGS ( //Γ/Μ啟動子）、LnGS (LCTN啟動子）、OGS ( FBSD啟動子）氙AGS ( ACTN啟 動子）。對於雙重接種體處理而言，使用HGS、LnGS、DGS 及AGS系作為上層接種體且個別地與作為下層接種體的帶 有菌絲體活性LCC2啟動子之LGS系搭配。GUS活性係以 每1 00 總可溶性蛋白質每分鐘水解之奈莫耳MUG表示， 且代表兩次獨立實驗之平均值。接種體處理之GUS活性 WT/LGS = 3.77。 圖1 6顯示在雙孢蘑菇中使用蛋白質移位機制來增加實 施例9之子實體的重組蛋白質產量。圖示為使用單一基因 轉殖接種體及雙重基因轉殖接種體策略生長而成之子實體 中之GUS活性的組織學檢定結果。所示為雙層栽培基質之 上層接種體/下層接種體。單一接種體處理係使用帶有子實 .體活性啟動子的雙孢蘑菇系接種兩層：HGS ( 啟動子）

LnGS ( ZC7W 啟動子）、DGS ( 啟動子）或 AGS ( JC7W 啟動子）。對於雙重接種體處理而言，在上層中使用HGS、 LnGS、DGS及AGS系且個別地與下層中之帶有菌絲體活性 LCC2啟動子之LGS系搭配。 【主要元件符號說明】 無 80 201202422 補充序列表 <110> 潘恩政府硏究基金會 羅曼，彼德c. 史朗浩佛，卡爾D. 伍斯頓，班哲明Μ. <120> 基因轉殖操作絲狀真菌的策略 <130> P09588US01 <150> <151> 61/342,429 2010-04-14 <160> 14 <170> Patent In第3.5版 <210> <211> <212> <213> <400> 1 22 DNA 雙抱磨链（Agaricus bisporus) 1 cgtgacaaga accatccaag eg 22 <210> <211> <212> <213> 2 22 DNA 雙孢蘑菇 <400> 2 gggtagccat cacaaacagc ac 22 <210> <211> <212> <213> 3 27 DNA 雙孢蘑菇 <400> 3 cgaactagtc tgtacccgat caacacc 2Ί <210> <211> <212> <213> 4 22 DNA 雙孢蘑菇 . <400> 4 tccgcacgcc gaaeggetet tc 22 <210〉 <211> <212> <213> 5 21 DNA 雙孢蘑菇 <400> 5 cgacgggtgt gaacgcaaag g 21 <210> 6 <211> 22 1 201202422 <212> DNA <213〉雙孢蘑菇 <400> 6 caatcagtcg atcaacgttc gc <210> Ί <211> 20 <212> DNA <213>雙孢蘑链 <400> 7 ggaagtttag ataggggacc <210〉 8 <211> 20 <212> DNA <213> 雙孢磨経 <400> 8 gtggctgtct gaaaagatac <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213>雙孢磨藤 <400> 9 cgacggactg accatcgat <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> 雙孢蘑菇 <400> 10 gaacttgccg tcgttgactt c <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213>雙孢磨菇 <400> 11 ccgttcggcg tgcggacc <210〉 12 <211> 19 <212> DNA <213> 雙孢磨薛 <400> 12 atgctcctcg tgccgtctt <210> 13 <211〉 19 <212> DNA <213〉 雙孢蘑菇 201202422 <400> 13 tgccccatac caaccatca 19 <210> 14 <211> <212> <213> 23 DNA 雙孢蘑菇 <400> 14 ccttccatcg tcggtcgtcc teg 23 2 3

Claims (1)

1. 201202422 七、申請專利範圍： !.-種產生絲狀真菌子實體的方法，該絲狀真菌子實體 賦予改變之表型但基因型為野生型，該方法包含： 用第一絲狀真菌菌絲體接種體接種下層營養基質層， 以使得該基質被該菌絲體接種體定殖， 用已經第二基因轉殖衅妝亩试— w值、、乐狀真菌菌絲體接種體接種之上 層持水基質層覆蓋該下層營養基質層，其中該第二基因轉 殖絲狀真菌菌絲體接種體併有異源多核苦酸構築體，及 容許子實體形成，其中所形成的子實體包括來源於該 第二基因轉殖絲狀真菌菌絲體接種體的異源多核普酸產 物。 2·如申凊專利範圍第丨項之方法，其中該第二基因轉殖 接種體具有異源表現構築體。 3. 如申凊專利範圍第2項之方法，其中該表現構築體編 碼農用、工業用或治療性蛋白質。 4. 如申凊專利範圍第2項之方法，其中該異源多核苷酸 構築體為抑制性構築體。 + 5 ·如申印專利範圍第1項之方法，其中該第一絲狀真菌 菌’糸體接種體為併有異源多核苷酸構築體的基因轉殖絲狀 真菌。. * 6.如申請專利範圍第5項之方法，其中該第一接種體多 核苦酸構築體包含可操作i也連接於在營養菌絲體中優先表 見之啟動子的編碼異源蛋白之多核皆酸序列。 7·如申请專利範圍第6項之啟動子，其中該啟動子係選 201202422 自由3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子及蟲漆酶2啟動子所組成 之群組。 8. —種如申請專利範圍第2項之第二絲狀真菌接種體 多核苷酸構築體，其中該構築體包含可操作地連接於在該 子實體中優先表現之啟動子序列的編碼異源蛋白之多核苦 酸序列。 9. 如申請專利範圍第7項之啟動子，其中該啟動子為 HYPA。 10. —種調節絲狀真菌子實體中之内源或異源蛋白之活 性的方法，該方法包含： 用第一基因轉殖絲狀真菌菌絲體接種體接種下層營養 基質層，以使得該基質被該菌絲體接種體定殖， 其中該第一基因轉殖絲狀真菌菌絲體接種體併有異源 多核苷酸構築體， 用已經第二非基因轉殖絲狀真菌菌絲體接種體接種之 上層持水基質層覆蓋該營養基質，及 容許子實體形成，其中來源於該第一基因轉殖絲狀真 菌接種體構築體的多核苷酸構築癥調節所形成之子實體中 的内源蛋白或異源蛋白。 11. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該第二接種體 為野生型。 12. 如申請專利範圍第1〇項之方法，其中該異源蛋白構 築體為表現構築體’其具有可操作地連接於在真菌細胞中 具有'舌性之啟動子的編碼蛋白質之多核苷酸序列。 2 201202422 13.如申請專利範圍第12 貝<方法’其中該蛋白質存. 於該等子實體中，但該多核苦 广質存在 體中。 #桌體不存在於該等子實 14.如申請專利範園第μ 貝之方法，其中該異源多核苷 酸構築體為抑制性構築體，並且 八/、有可刼作地連接於在真菌 細胞中具有活性之啟動子的抑制性序列。 一 15.如申請專利範圍第12項之方法，其中該蛋白質於子 實射受到調節，但該抑制性構築體不存在於子實體中。 /6·一種基因轉殖操作絲狀真菌的方法，該方法包含： f該真菌接種於上層栽培基質中，其中該接種體具有在子 實體十所要之基因型，及 用包含在該所得子實體中所要之RNA及/或蛋白質的 真菌接種下層栽培基質。 17·如申請專利範圍第16項之方法，其中該上層接種體 為非基因轉殖型，以便賦予該子實體野生型基因型，且此 外其中該下層堆肥接種體（c〇mp〇stin〇culant)為基因轉殖 !且蛋白質/mRNA向上穿梭移入該野生型子實體中。 18.—種長距離轉運絲狀真菌中之蛋白質及/或rNa轉 錄物的方法，該方法包含： 使遠真菌暴露於包含接種體之下層營養基質層，該接 種體具有可操作地連接於在營養菌絲體中表現之啟動子的 異源夕核皆酸構築體，暴露程度足以使該RNA及/或蛋白質 轉運至該絲狀真菌之該子實體内。 19·一種產生子實體的方法，該子實體包括一種接種體 201202422 之基因型及第二接種體之表型，該方法包含： 用第一絲狀真菌菌絲體接種體接種下層營養基質層， 以使得該基質被該菌絲體接種體定殖，該第一接種體之表 型為在所產生子實體中所要之表型， 用已經第二絲狀真菌菌絲體接種體接種的上層持水基 質層覆蓋該下層營養基質層，該第二接種體之基因型為在 s亥所產生子實體中所要之基因型；及 容許子實體形成，其中該等所形成之子實體包括該第 二接種體之基因型及該第一接種體之表型。 / 2〇·如申請專利範圍第19項之方法，其中該第一接種體 包括所要營養性狀。 2!•如中請專利範圍帛2Q歡方法，其中該所要營養性 大係選自由以下者所組成之群組：替代性堆肥養分利用能 堆肥足殖、耐熱性、針對真菌病原體之抗性、針對真 z人如申請專利範圍第 包 —个以〜乃忒，具中該第—按裡 商業上所要之性狀’其存在在該子實體中所要„ 之性=。：請專利範圍第22項之方法，其中該商業上茂 义性狀為產生異源蛋白。 24·-種產生絲狀真菌子實體的方法，該方法包含： =基因轉殖㈣、體接種體接種下層營養基質層，.以 于^基質被該菌絲體接種體定殖，及 用上層持水基質層覆蓋該下層營 基質層已用與該下層基質”所用2基質，該上層持 層&貨層中所用相同的基因轉殖菌絲 4 201202422 接種體接種，或 基質水基質層覆蓋該下層營養基f，該上層持水 中所菌絲體接種體接種，但容許被該下層基質層 、土因轉殖菌絲體接種體定殖，及 容許子實體形成，其中該等所形成的子實體具 於δ亥基因轉殖菌絲體接種體的重組蛋白。 、 25,如申請專利範圍第24項之方法，其中該基因轉殖菌 4體接種體包括多核#酸構築體，該構築體編碼可操作地 連接於在該營養菌絲體及子實體中表現之啟動子的 & c ' 26_如申請專利範圍第25項之方法’其中該多核苷酸構 築體包括第二啟動子：一者在該營養菌絲體中具有高度活 性且另一者在該子實體中具有高度活性。 27.如申請專利範圍第24項之方法，其中該基因轉殖菌 絲體接種體帶有可操作地連接於一或多個啟動子之多核苦 酸構築體的多個複本，該等啟動子在該營養菌絲體或該子 實體中具有高度活性，或在該營養菌絲體與該子實體中均 具有高度活性。 八、圖式： (如次頁） 5