CN1376778A - 利用转基因真菌生产人胰岛素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明以蕈菌和丝状真菌为生物反应器生产人胰岛素。人胰岛素基因的两个功能单位由人工合成并置于高效表达的真菌专一性启动子(如甘油醛磷酸脱氢酶基因的5端调控区)的驱动之下。同时有来自透明颤菌的血红蛋白基因在该启动子驱动下表达,使在氧受限的条件下胰岛素表达量大增。本发明对于人胰岛素大量制备和防治某些类型的糖尿病有重要意义。
Description
本发明是利用转基因真菌做为一种生物反应器来制造人胰岛素的方法。所选用的真菌受体包括食用和药用的高等担子菌如蘑菇、灵芝等。这些高等真菌无毒,可以直接服用,同时也可以从它们的菌丝中分离胰岛素成分制成注射用的人胰岛素。
本发明的主要创新之点在于:(1)人工合成胰岛素基因,选用适合于高等真菌和植物中表达的密码子来设计其DNA序列;(2)采用在真菌中高效表达的甘油醛磷酸脱氢酶基因的5端调控区的顺序来驱动人胰岛素的表达;(3)在受体真菌中引入来自透明颤菌(Vitreoscilla)的血红蛋白基因。该基因的表达,促进需氧代谢的进行。大大提高了人胰岛素生物合成的产量。
生物反应器是近年来许多生物技术研究部门十分关注的领域。诸如奶牛、奶山羊乳腺生物反应器生产人的生长因子。在植物生物反应器中利用马铃薯生产乙肝疫苗的研究受到广泛的重视。北京大学林忠平等人利用番茄生产多肽药物亦已取得良好结果。利用可以食用的蘑菇、香菇、灵芝一类高等真菌生产多肽成分具有很大的应用潜力。因为这些高等真菌能够完成对于多肽的折叠、糖基化修饰等功能,且有生长迅速、易于培养、不产生毒性物质的优点。
人胰岛素对于胰岛素依赖的糖尿病患者的治疗十分重要。
本项发明的技术要点如下:
(1)关于人胰岛的DNA序列
将人胰岛素的两个功能单位A链与B链的氨基酸顺序,采用真菌常用的或植物偏爱的密码子进行人工合成。A链与B链之间有一小的(含6个氨基酸)的连接片段。(2)关于启动子的采用
采用在真菌中表达量很高的甘油醛磷酸脱氢酶(gluceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GPD)基因的5端调控区。本专利申请人克隆了该基因的上游区,并经实验证实1400bp的序列可以驱动报告基因(GUS或GFP)在真菌中高水平表达。
(3)关于透明颤菌血红蛋白基因的应用
近年来的研究表明来自透明颤菌(Vitreoscilla)的血红蛋白(hemoglobin)有很高的氧解离常数。将该基因导入细菌、真菌、酵母、高等动植物等各类生物后可以促进这些生物的需氧代谢。尤其在氧受限的条件下,此血红蛋白基因的作用更加明显。例如导入透明颤菌血红蛋白(VHb)基因的(Acremanun chrysogenum)显著增加了头孢霉素C的产量。VHb基因还使红色糖多孢菌增加红霉素产量70%。VHb基因在灵芝中明显提高了外源胰岛素基因的表达量。
(4)本项发明在引入人胰岛素基因的同时,采用真菌高效启动子驱动的VHb基因。在我们的一种实验中在外源基因表达载体上同时含有GPD启动子驱动下的人胰岛素基因和GPD启动子调控下的VHb基因。
其余的技术要点包括真菌菌丝体获得原生质体、对真菌原生质体的遗传转化、真菌转化中标记基因的选择、转化的真菌细胞的筛选,以及转基因真菌的鉴定。目的基因产物人胰岛素表达量的测定等。
关于本发明的实施方案:
在一个实施方案中关于人胰岛素基因的合成。在以植物偏爱密码子合成人胰岛素A链(63个碱基)和B链(90个碱基)DNA序列的基础上,依据真菌对密码子使用的偏爱性又做了适当的更动。将A链与B链组成的人胰岛素基因克隆于pGEM-11zf(+/-)载体上。见图一:人工合成的人胰岛素基因的克隆。
在一个实施方案中我们将人胰岛素基因置于甘油醛磷酸脱氢酶基因5’端调控之下。见图二:人工合成的人胰岛素基因表达载体的构建流程图(其中人胰岛素基因处于香菇组成型启动子PLeGPD的控制下)。
在一个实施方案中我们完成了香菇甘油醛磷酸脱氢酶LeGPD启动子驱动下透明颤菌血红蛋白基因(VHb)表达质粒的构建。见图三:透明颤菌血红蛋白(Vhb)基因表达载体的构建流程图(其中vhb处于香菇组成型启动子PLeGPD的控制下)。
在一个实施方案中我们按图四:含vhb的人胰岛素基因表达载体的构建流程图(其中vhb及人胰岛素基因均处于香菇组成型启动子PLeGPD的控制下)构建了同时含有磨菇甘油醛磷酸脱氢酶启动子(LeGPD)驱动的人胰岛素基因(Ins)和透明颤菌血红蛋白(VHb)基因的表达质粒。
在一个实施方案中我们采用下列程序进行真菌原生质体的制备和真菌遗传转化。其程序(药用蕈菌灵芝的遗传转化)如下:
1、灵芝菌丝培养条件:菌丝培养于CYM琼脂培养基(1%麦芽糖,2%葡萄糖,0.2%酵母抽提物,0.2%胰蛋白胨,0.05%MgSO4·7H2O,0.46%KH2PO4,1%琼脂)并在26℃下保温3天,加入玻璃小球,每天振荡2次使之分散,而后将菌丝置于0.6M甘露醇溶液中用于制备原生质体。
2、原生质体的制备和电激:从200ml菌丝培养液收集菌体,无菌水洗涤,在含有1.5mg/ml融壁酶的1ml 0.6M甘露醇溶液溶液中缓慢摇动下30℃孵育4小时。以棉花过滤和离心(500xg,5分钟)收集的方法得到原生质体。以0.6M甘露醇溶液洗原生质体2次。重悬浮于200μl缓冲液进行一次电激处理(电极距离0.4cm,1.0kV,25μF,400Ω),质粒DNA浓度为1μg/μl。电激处理原生质体在4℃下放置15分钟后混入1%低熔点胶中铺在20ml含CYM的1%琼脂糖板上26℃培养7天,在5-7天内在CYM板上可长出转化体。参考文献[1]Patel SM,Stark BC,Hwang KW,Dikshit KL,Webster DA.Cloning andexpression of Vitreoscilla hemoglobin gene in Burkholderia sp.strain DNT forenhancement ..of. 2,4-dinitrotoluene.degradation......Biotechnol.....Prog.2000,Jan-Feb;16(1):26-30.[2]Penttia M,Nevalainen H,Ratto M,Salminen E,Knowles J.A versatiletransformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei.Gene.1987,61:155-164[3] T.Hirano,T.Sato,K.Yaegashi,H.Enei.Efficient transformation of the ediblebasidiomycete Lentinus edodes with a vector using a glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase promoter to hygromycin B resistance.Mol Gen Genet.2000,263:1047-1052
Claims (6)
1.向真菌导入外源的人工合成的人胰岛素基因,获得能高效表达人胰岛素的真菌。其中人工合成的胰岛素基因的密码子的采用,应包括不同生物偏爱的密码子的改造。包括采用植物、真菌及其它物种的偏爱性的密码子。
2.权利要求1中,人胰岛素基因的合成包括其它完整人胰岛素基因或和部分人胰岛素基因序列的合成与应用,以及人胰岛素基因与其它多肽序列的融合基因的合成与应用。
3.权利要求1中的人胰岛素基因是置于一种在真菌中高效表达的启动子的驱动之下。这种启动子应包括所有可在真菌中调控人胰岛素基因的DNA序列。
4.权利要求1中关于人胰岛素基因的高效表达。在说明书中已提到采用一种来自细菌的血红蛋白基因以促进真菌的需氧代谢,从而提高人胰岛素的产量。所以导入的外源基因,除人胰岛素基因的启动子序列之外,还应包括另外的增强人胰岛素表达的另外的外源基因的应用。
5.权利要求1中涉及导入外源基因的方法。除了在实施方案中提到的电激方法,还应包括其它方法,如基因枪法和通过PEG的应用、PH和Ca离子的调节等方法将外源基因导入真菌细胞。
6.权利要求1中,将外源基因导入真菌细胞,既包括菌丝体细胞及其原生质体,也包括直接将基因导入真菌的孢子和真菌的其它类型组织,如子实体。
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CN01109906A CN1376778A (zh) | 2001-03-22 | 2001-03-22 | 利用转基因真菌生产人胰岛素的方法 |
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CN1376778A true CN1376778A (zh) | 2002-10-30 |
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CN01109906A Pending CN1376778A (zh) | 2001-03-22 | 2001-03-22 | 利用转基因真菌生产人胰岛素的方法 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US8686218B2 (en) | 2010-04-14 | 2014-04-01 | The Penn State Research Foundation | Strategies for the transgenic manipulation of filamentous fungi |
-
2001
- 2001-03-22 CN CN01109906A patent/CN1376778A/zh active Pending
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US8686218B2 (en) | 2010-04-14 | 2014-04-01 | The Penn State Research Foundation | Strategies for the transgenic manipulation of filamentous fungi |
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