TW201124447A - Process for preparing polyglutamic acid - Google Patents

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201124447 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 揭露於此之内容總括為用以獲得聚麵胺酸的方法。更 具體而言，揭露於此之内容為用以獲得具有所需重量平均 分子量（weight average molecular weight)之聚鏠胺酸的受 控方法。 【先前技術】 市面上可購買到聚麩胺酸，然而，其價格相當昂貴， 大約每克要價$350-$500 (西格瑪奥瑞奇化學公司，sigma Aldrich Chemical Company)。這樣的高價格與難以合成具 有特定分子量的聚麩胺酸有關。聚麩胺酸常藉著以起始劑 (initiator)來啟動 N-叛酸gf (N-carboxyanhydride，NCA) 之聚合反應而獲得。在認為已達到特定分子量時，此聚合 反應會被終止。然而，難以預測何時中止反應以獲得特定 分子量的聚麩胺酸。此外，難以製造具有低聚合度分佈性 指數（polydispersityindex)的聚麩胺酸，亦難以大規模量 產聚麩胺。 ' 【發明内容】 揭露於此之-些實施例為關於一種製備聚楚胺酸的方 法，其可用以在狹窄的千道爾頓（kil〇Dalt〇ns，kDa)範圍 内獲得具有所需重量平均分子量的聚麩胺酸。除了以相對 精度（relative accuracy)獲得具有所需重量平均分子量的 聚麩胺酸之外，在一些貫施例中，此方法較目前市面可得 的方法便宜。此外，在一些實施例中，此方法可用以獲得 201124447 規模水準（scalelevel)在10克至_克的聚麵胺酸。 -些實施例可包括：取得具有等於或者大於8〇仙 的第-重量平均分子量之起始聚麩胺酸 Μ票第二重量平均分子量，所述目標第二= 小於80 kDa ;選擇水解條件，所述水解條件有效地將起始 聚麵胺酸之第-重量平均分子量減少到所選的聚麵胺酸之 目標第二重量平均分子4 ;以及在此些水解條件下，將起 始聚麩胺酸水解，藉此而得到產物聚麵胺酸，其中產物聚 麵胺酸具有約在所選的目標第二重量平均分子量±1〇 kDa 内之重量平均分子量。 一些實施例可包括：取得具有等於或者大於185 kDa 的第一重量平均分子量之起始聚麩胺酸；選擇聚麩胺酸之 目標第二重量平均分子量，所述目標第二重量平均分子量 小於185kDa;選擇水解條件，所述水解條件有效地將起始 聚麵胺酸之第一重量平均分子量減少到所選的聚麩胺酸之 目標第二重量平均分子量；以及在此些水解條件下，將起 始聚麩胺酸水解’藉此而得到產物聚麩胺酸，其中產物聚 麩胺酸具有約在所選的目標第二重量平均分子量±1〇 kDa 内之重量平均分子量。 以下更詳細說明這些實施例以及其他實施例。 【實施方式】 I.定義 除非另有定義，所有使用於此之技術及科學用語所具 有之意思如所屬領域中具有通常知識者一般所習知。所有 4 201124447 / pif 於此引用之專利、申請案、公開之申請案以及其他公開發 表，除非另有聲明，其全部内容透過引用而併入於此。在 此若一個名詞有多個定義的情況下，除非另有聲明，優先 採用此部分中之定義。 ’’聚麩胺酸"或者"PGA”之用語依所屬領域中具通常知 識者所知之原意使用於此。所屬領域中具通常知識者知道 在特定pH水準（pH level)下(例如pH > 7)，接在聚麩胺 酸之側位（pendant)叛酸基的氫可用適當的陽離子如納置 換之。因此，聚麵胺酸包含由麩胺酸單體單元（monomer unit)組成之聚合物，其中之側位羧酸被質子化或被去質 子化。被去質子化的聚楚胺酸之麵胺酸單體單元包括麵胺 酸鹽（glutamate salt)如納鹽（sodium salt )、鉀鹽（potassium salt)、鐘鹽（lithium salt)、辦鹽（calcium salt)、鎮鹽 (magnesium salt)以及銨鹽（ammonium salt)(如四丁銨 (tetrabutylammonium ， TBA ) 、四 丙敍 (tetrapropylammonium ，TPA )、十六院基三甲基銨 (hexadecyltrimethylammonium ) '十二烧基三乙基銨 ( dodecyltriethylammonium ) 、四 甲其銨 ( tetramethylammonium ) 、四 乙其銨 (tetmethylammonium )、及三（羥曱基）胺基曱烷鹽（tris (hydroxymethyl) aminomethane salts))以及其組合。 在一些實施例中，羧酸基末端的氫可用適當的保護基 置換之。因此，聚麩胺酸包括無保護之聚麵胺酸以及有保 護之聚麩麟。適當的保護基為關領域具通常知識者所 201124447 習知。酯類保護基包括（但不限於）C^Ch烷基酯(alkyl ester)、Q〜C10芳基酯（aryl ester)以及C7〜C14芳烷基酯 (aralkyl ester )。例示之聚麩胺酸的酯類保護基包括（但不 限於）本基酉曰（phenyl ester)、节基酉旨（benzyl ester)、烧 基酯（如曱基酯、乙基酯、丙基酯、異丙基酯、丁基酯、 第三丁基酯以及庚基酯），以及任何其他在此領域中已知的 酯類保護基。參見如伍斯與格林《有機合成中的保護基》； 约翰威立父子出版社，2007 (Wuts and Greene, GVe⑼心 Protective Groups in Organic Synthesis; John Wiley and Sons, 2007)。在一些實施例中，保護基可為苄基酯，如苄酯 (benzylic ester ) ° 因此’ ”聚麵胺酸"或者”PGA”之用語為一般性的術 語，其包括變異型（variants)，例如在羧酸基上的氫以相 對離子（counterion)及/或適當的保護基置換的聚胺基戊 二酸酯（polyglutamate)及聚麩胺酸（p〇iygiutamic acid)。 聚麵胺酸包括聚-α-麵胺酸（poly-alpha-glutamic acid)以 及聚-r_ 麩胺酸（P〇ly-gamma-glutamic acid)。舉例而言， ”聚麩胺酸”之用語包括聚-α -麵胺酸· 7 -(苄基）醋 (poly-alpha-glutamic acid-gamma- (benzyl) ester)以及聚 -α -麵胺酸-γ-(第三丁基）輯（p〇ly-alpha-glutamic acid-gamma- (t-butyl) ester)。聚麩胺酸包括其中有 75〇/〇 或更多單體單元為聚麩胺酸單體單元之聚合物。 如此處所使用的”水解”（hydrolysis )以及’’水解的" (hydrolyzing)之用語’表示從聚麩胺酸切除保護基以及/ 6 201124447 或者切除聚麩胺酸中的醯胺基（amide)主鏈（backbone) 之鍵結。 如此處所使用的”水解條件”（hydrolyzing condition) 之用語表示會造成水解的化學反應參數。例示之水解條件 參數包括（但不限於）時間、溫度、溶劑以及水解試劑 (hydrolyzing reagent)。例示之水解試劑包括（但不限於） 酸性試劑（acid reagent)、鹼性試劑（basic reagent)以及 /或者酵素性試劑（enzymatic reagent)。水解條件在所屬 領域中一般已習知。參見史密斯與馬奇《馬奇高等有機化 學》；约翰威立父子出版社，2007，第1400-1411頁（Smith and March 5 March's Advanced Organic Chemistry 5 John Wiley & Sons，2007，pages 1400-1411 )。 如此處所使用的”重量平均分子量”（weight average molecular weight)或者"M、v”之用語可用以描述聚合物之分 子量。重量平均分子量為各個部分的莫耳質量（molar mass)乘上其重量分率（weight fraction)的乘積之總和。 參見如楊《聚合物導論》，查普曼與霍爾出版社，1981， 第8頁；以及史蒂文斯《高分子化學導論》，牛津大學出 版，第 35-37 頁（Young，ίο Pofymw Chapman and Hallj 1981 5 page 8; and Stevens 5 Polymer Chemistry: An Introduction > Oxford University Press 5 pages 35-37)。 如此處所使用的"數量平均分子量"（number average molecular weight)或者”M"”之用語可用以描述聚合物之分 子量。數量平均分子量為各個部分的莫耳質量（molar 7 201124447 mass)乘上其莫耳分率（mole fraction)的乘積之總和。參 見如楊《聚合物導論》，查普曼與霍爾出版社，1981，第 5頁；以及史蒂文斯《高分子化學導論》，牛津大學出版， 第 35-37 頁（Young，ίο /Wymers，Chapman and

Hall > 1981 » page 8; and Stevens » Polymer Chemistry： An Introduction > Oxford University Press > pages 35-37)。 如此處所使用的”聚合度分佈性指數”之用語表示重量 平均分子量與數量平均分子量之比率。聚合度分佈性指數 可以數學式表示為^^/疋。 應瞭解的是，當此處提供一數字範圍時，其意為包括 所提供的範圍内之各個整數。舉例而言，應暸解當提及聚 合物具有在20〜25kDa範圍之分子量時，為描述具有之分 子篁為 20 kDa、21 kDa、22 kDa、23 kDa、24 kDa 以及 25 kDa的各種聚合物。同樣地’應瞭解當提及溫度在2〇〜4〇〇c 範圍時，為描述20°〇21°(：、22。(：、23。(：、24。(：、：25。(：、 26 C、27 〇C、28 °C、29 〇C、30 〇C、31 °C、32 °C、33 〇C、 34 °C、35 °C、36 °C、37 〇C、38 °C、39 °C 以及 40 °C 的 各種溫度。 應瞭解的是，於此處所描述具有一或多個掌性中心 (chiral center)任何化合物中，若未明確地指出絕對立體 化學（absolutestereochemistry)，則各個中心可獨立地為 R 組態（R-C〇nfigUrati〇n)或 S 組態（s_c〇nfigurati〇n)或 者其混合物。因此，此處提供之化合物可為純鏡像異構 (enatiomerically pure )或為立體異構混合物 8 201124447 (stereoisomeric mixtures )。此外應瞭解的是，於此户所 描述之具有一或多個雙鍵（可被定義為E或Z)產生:幾 何異構物（geometrical isomer)的任何化合物中，各個錐 鍵可獨立地為E或Z其混合物。同樣地，意為所有互變= 構型式（tautomeric form)亦包括在内。 II.聚麩胺酸 揭路於此之内容為用以製備聚楚胺酸的方法。揭雨於 此的一些實施例中為有關用以製備聚麵胺酸的方法，=可 包括取得具有等於或者大於185 kDa的第一重量平均二; 量之起始聚麵胺酸；選擇小於185 kDa的聚麵胺酸之== 第二重量平均分子量；選擇可有效率的將起始聚楚胺酸: 第一重量平均分子量減少到所選的聚麵胺酸之目標第二 里平均分子置的水解條件；以及在此些水解條件” ： 始聚麩胺酸水解，藉此而得到產物聚麵胺酸，其產將， 麵胺酸具有約在所選的目標第二重量平均分子旦 物聚 範圍内之重量平均分子量。 $±1° kDa 在-些實施例中，用以製備聚麵胺酸的 擇具有在50kDa至500kDa之間的第一重量平均八匕曰璉 起始聚麵胺酸的步驟。製備聚麩胺酸的方二子1之 有高達100,000 kDa的第一重量平均分子旦i 選擇具 酸的步驟。 $之起始聚麩胺 用以製備聚麵胺酸的方法，可包括選擇 聚麩胺酸的分子量之目標第二重量平均分=】於起始 之步驟。 卞。刀子爾麵胺酸 201124447 此用以製備聚麵胺酸的方法，可包括選擇酸性、驗性 或酵素性的水職件的細，此水解條件能有效的將起始 聚麵胺酸之重量平均分子量減少到目標第二重量平均分子 量。 此用以製備聚麩胺酸的方法可產生具有約在所選的 I標第二重量平均分子量±5至挪跑朗内之較低的重 量平均分子量的產物聚麩胺酸。用以製備聚麩胺酸的方法 可產生具有約在所選的目標第二重量平均分子量±1%至土 10%範圍内之較低的重量平均分子量的產物聚麩胺酸。-A.起始聚麵胺酸 起始聚麩胺酸可自不同來源取得。舉例而言，起始聚 麩胺酸可由如西格瑪奥瑞奇化學公司的商業來ς取得。°除 此之外’亦可合成起始聚麵胺酸。用以合成起始聚麵胺酸 之適當方法為所屬領域所習知。—種用以合成起始聚麵胺 酸的方法是將麵胺義（glutamie e咖）I體和適當的起 始劑反應。麩胺酸酯單體和起始劑之間的適當反應的一實 例繪示於流程圖1A中。

流程圖1A

其中R為賴保護基。可使用任何於所屬領域所習知 2〇1124447κ V/X V/ / 或者先如在此及之醋類保護基。在一些實施例中，R為 Ci〜CI4烧基，C6〜Ci〇芳基，or C7〜C14芳院基。在一些實施 例中’ R為苄基、苯基、第三丁基、異丙基、乙基或者曱 基。 舉例而言，T基酯麵胺酸N-叛酸酐可與胺類起始劑反 應而產生聚麩胺酸苄基酯聚合物，如流程圖1B所示。胺 類起始劑可為三乙基胺（triethyl amine，TEA)。此反應 可在室溫下於二氧陸圜（dioxane)中進行。

流程圖1B

i·起始聚麵胺酸分子量 起始♦麵胺酸和由水解而來的產物聚缝胺酸相比，具 有較鬲之重量平均分子量。在一些實施例中，起始聚麩胺 酸具有等於或大於80 kDa的第一重量平均分子量。在一些 貫施例中’起始聚麩胺酸具有等於或大於1〇〇 kDa的第一 重量平均分子量。在一些實施例中，起始聚麩胺酸具有等 於或大於130 kDa的第一重量平均分子量。在一些實施例 中，起始聚麩胺酸具有等於或大於15〇 kDa的第一重量平 201124447

A 均分子量。在一些實施例中，起始聚麩胺酸具有等於或大 於170 kDa的第一重量平均分子量。在一些實施例中，起 始聚麵胺酸具有等於或大於185 kDa的第一重量平均分子 量。確認起始聚麵胺酸之重量平均分子量的方法為所屬領 域中具有通吊知識者所習知。各式的方法包括（但不限於） 使用適宜的分子量偵測技術（如光散射）的體積排除層析_ 尚效液相層析（size exclusion chromatography-high pressure liquid chromatography，SEC-HPLC )、小角度中子散射 (smallangle neutron scattering，SANS )、X 射線散射（X_ray scattering )以及沉降速率（sedimentati〇n vel〇dty )。 SEC-HPLC亦可指如凝膠滲透層析法（gd permead〇n chromatography，GPC)。若兩種或更多用以決定聚麩胺酸 之重量平均分子量的方法產生了不同的分子量值，則較佳 為由SEC-HPLC所得到之重量平均分子量值。在一些實施 例中，起始聚麩胺酸可具有等於或大於19() kDa的第一重 量平均分子量。在其他實施例中，起始聚麵胺酸可具有等 於或大於200 kDa的第一重量平均分子量。又在其他實施 例中，起始聚麩胺酸可具有等於或大於22〇kDa的第一重 里平均分子1。而又在其他實施例中，起始聚麩胺酸可具 有專於或大於230 kDa的第一重量平均分子量。在一些實 施例中，起始聚麩胺酸可具有等於或大於24〇kDa的第一 重量平均分子量。 在一些實施例中，起始聚麩胺酸具有在約5〇 kDa至 約500 kDa範圍内的第一重量平均分子量。在一些實施例 12 201124447 I yjit t ^ ^ 80 kDa 300 kDa $, s , „ 第里千句刀子！。在一些實施例中，起始聚麵胺酸且 有在約議至約13〇_範圍内的第一重量=; 量。在-些實施例中，起始聚麵胺酸具有在約13〇伽至 約 _範圍内的第—重量平均分子量。在-些實施例 中，起始聚麵胺酸具有等於或大於8QkDa的第—重量平均 分子置。在-些實施例巾，起始讀胺酸具有等於或大於 40 kDa的第一重量平均分子量。 ii.聚合用起始劑 一般而言，流程圖丨人中所示之聚合起始劑為親核物 (nucleophile)。此外，聚合起始劑較佳為具有可使起始 劑由產物聚合物被分離出來，抑或可在聚合反應完成時由 反應混合物中被消除的物理性質。例示的起始劑包括节基 胺（benzylamine)、正已基胺（n_hexylamine)、二乙基 胺（diethylamine)、三乙基胺（triethylamine)、曱醇鈉 (sodium methoxide ) 、N-苄基胺甲酸酯鈉（sodium N-benzylcarbamate)、氫氧化鈉（sodium hydroxide)、硼 氫化鈉（sodium borohydride)、乙醇鈉（sodium ethoxide)、 丙醇鈉（sodium propoxide )、曱醇鉀（potassium methoxide )、乙醇钾（potassium ethoxide )、丙醇鉀 (potassium propoxide )、第三 丁醇鉀（potassium tert-butoxide)、二異丙基乙胺（diisopropylethylamine)、 1，8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-嫦（l，8-diazabicyclo[5,4,0] undec-7-ene ， DBU ) 、 4-二曱氨基0比口定 13 201124447 (4-dimethylaminopyridine » DMAP )、楚胺酸二甲基酯 (glutamic acid dimethyl ester )以及麩胺酸-7 -第三 丁基酯 (glutamic acid-gamma-tert-butyl ester )或者任何所屬領域 中所習知的陰離子性之開環起始劑（anionic ring opening initiator)。 B.目標分子量 在一些實施例中，所選的目標第二重量平均分子量等 於或小於40 kDa。在一些實施例中，所選的目標第二重量 平均分子量可在約40 kDa至約12 kDa的範圍内。在其他 實施例中’所選的目標第二重量平均分子量可在約3〇kDa 至約15 kDa的範圍内。又在其他的實施例中，所選的目標 第二重量平均分子量可在約25 kDa至約20 kDa的範圍 内。選擇某個選定的目標重量平均分子量有各種理由。在 這些非限定的理由中包括：具所選的目標第二重量平均分 子量的聚楚胺酸之增加之溶解度，減少以及/或者防止由體 内（例如由腎）而分泌出來的聚麩胺，以及降低身體對於 聚麩胺酸的免疫反應。 此外，一些性質如於活體中的降解時間（ζ·„ degradation time )、血循環時間（blood circulation time )、 生物相容性（biocompatibility)、毒性（toxicity)、抗原 表位（antigenic potential)、免疫原性刺激（immunogenic stimulation)、生物穩定性（biological stability)、水解穩 定性（hydrolytic stability )、酵素穩定性（enzymatic stability)、溶解度（solubility)、渗透性（permeability)、 201124447 膨脹性（swelling )、玻璃轉移溫度（glass transition temperature )、溶點（melting temperature )、裂解溫度 (decompositiontemperature)、係數（modulus)、拉伸強 度（tensile strength)、彈性（elasticity)以及輸送擴散 (diffusivity transport)可依所選的目標聚麩胺酸聚合物之 分子量決定。 在一些實施例中，所選的目標第二重量平均分子量可 在約100 kDa至約1 kDa範圍内。在一些實施例中，所選 的目標第二重量平均分子量可在約1〇〇〜8〇 kDa、90〜70 kDa、80〜60 kDa、70〜50 kDa、60〜40 kDa、50〜30 kDa、40〜20 1<^、30〜101<^、(^20〜11<^的範圍内。在一些實施例中， 所選的目標第二重量平均分子量可在約45〜35 kDa、40〜35 kDa、35〜30 kDa、30〜25 kDa、25〜2〇 kDa、22〜17 kDa、20〜15 kDa、15〜10 kDa、10〜5 kDa或者5〜2 kDa的範圍内。 在一些實施例中，所選的目標第二重量平均分子量為 30kDa± 10%>29 kDa± 10%>28kDa± 10%>27 kDa± 10 %、26 kDa ± 10 %、25 k:Da ± 1〇 %、24 kDa ± 10 %、23 kDa ± 10 %、22 kDa ± 10 %、21 kDa ± l〇 〇/0、20 kDa ± 10 %、 19kDa±10%、18kDa± 10%、i7kDa± 1〇%、16kDa± 1〇 %、15 kDa 士 10 %、14 kDa ± l〇 〇/0、13 kDa ± 1〇 %、12 kDa ± 10 %、11 kDa ± 10 %、或者 i〇 kDa 士 10 %。 在一些實施例中，所選的目標第二重量平均分子量為 30 kDa ± 5 %、29 kDa ± 5 %、28 kDa ± 5 %、27 kDa ± 5 %、 26 kDa± 5 %、25 kDa± 5 %、24 kDa± 5 %、23 kDa± 5 %、 15 201124447 22 kDa ± 5 %、21 kDa ± 5 %、20 kDa ± 5 %、19 kDa ± 5 %、 18 kDa ± 5 〇/〇、17 kDa ± 5 〇/〇、16 kDa ± 5 〇/〇、15 kDa ± 5 〇/〇、 14kDa± 5 %、13 kDa± 5 %、12kDa士 5 %、11 kDa± 5 %、 或者 10 kDa 士 5 %。 在一些實施例中，所選的目標第二重量平均分子量為 約 30 kDa、29 kDa、28 kDa、27 kDa、26 kDa、25 kDa、 24 kDa、23 kDa、22 kDa、21 kDa、20 kDa、19 kDa、18 kDa、 17 kDa、16 kDa、15 kDa、14 kDa、13 kDa、12 kDa、11 kDa、 或者10 kDa. 在一些實施例中，所選的目標第二重量平均分子量小 於40 kDa。在一些實施例中，所選的目標第二重量平均分 子量小於30 kDa。在一些實施例中，所選的目標第二重量 平均分子量小於20 kDa。 C.水解條件 起始聚麩胺酸可被水解而產生產物聚麩胺酸。產物聚 麩胺酸之重量平均分子量可小於起始聚麩胺酸之重量平均 分子量。一種水解起始聚麩胺酸的方法是藉著使起始聚麩 胺酸以水解條件處理，如流程圖2所繪示。 流程圖2

起始聚麩胺酸^ 水解條件p

產物聚麩胺酸^ 16 201124447 其中’R表示賴類保護基；X和y代表整數；而乂大 於 y (即，x>y)〇 在-些^施例中，產物聚楚胺酸可被質子化或去質子 化在^貫知例中，產物聚鎚胺酸包括楚胺酸鹽殘基如 鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、鈣鹽、鎂鹽以及銨鹽（如四丁銨（TBA)、 四丙錢（TPA)、十六燒基三曱基錄、十二燒基三乙基按、 四甲基銨、：乙基銨、及三（羥曱基）胺基曱烷鹽)。 在一些實施例中’水解條件將保護基由起始聚麵胺酸 切除。在一些實施例中，水解條件將起始聚麩胺酸中的醯 胺基主鏈之鍵結切斷。在—些實施财，水解條件將起始 聚麩胺酸中的保護基以及醯胺基主鏈之鍵結均切除。 可用各種條件來水解起始聚麵胺酸。用以選擇適宜水 解條件的適當方法為所屬領域中具有通常知識者所習知。 在一些實施例中，此些水解條件包括使用酸。適當的酸為 所屬領域中具有通常知識者所習知。在一些實施例中，此 酸可為質子酸（protic acid)。舉例而言，酸可為氫溴酸 (hydrobromic acid)、氫氣酸（hydrochloric acid)以及硫 酸（sulfuric acid)。若有必要及/或需要’此酸可在質子溶 劑（protic solvent)中稀釋，例如水、醋酸以及/或二氣乙 酸（dichloroaceticacid)。在一實施例中，此酸可為溴化氫 -醋酸（HBr-AcOH)。在一些實施例中，此酸可具有約在 20%至約60%範圍内的質量百分組成（percent composition by mass)。在其他實施例中，此酸可具有約在30%至約40% 範圍内的質量百分組成。又在其他實施例中，此酸可具有 17 201124447 大約33%的質量百分組成。在一些實施例中，水解條件可 根據由實驗產生的圖表來選擇，實驗中具有大於所選的目 標第二重量平均分子量的重量平均分子量的聚麩胺酸經不 同水解條件處理。如圖1所示為此種圖表之一例。在一些 實施例中，用以產生圖表的聚麵胺酸可用購買方式取得了 在一些實施例中，用以產生圖表的聚麩胺酸可為合成的， 例如用此處所說明之步驟。 i·選擇水解條件 水解條件包含會造成將聚麩胺酸聚合物中的保護基以 及/或者其醯胺基主鏈之鍵結切除的反應參數。例示的水 條件參數包括（但不限於）水解試劑、溫度、時間、溶劑 2及濃度。可調整不同水解條件以產生具有目標重量 的產物聚麵紐聚合物。因此，選騎當的水解條 >將產生具有目標重量平均分子量的產物聚麵胺酸 速率高的水解溫度通常增加聚麩胺酸水解的 較高的水解、、田产^=此，和選擇較低的温度相比，選擇 產=麵=將傾向於產生具有較低重量平均分子量的 通常酸聚合物以水解條件處理的時間， 均分子量的麵轉胺^ 產生具杨低重量平 解的劑通常會增加聚麵胺酸水 ^里因此，和選擇較弱的水解試劑相 18 201124447 :子水解試劑會傾向於產生具有較低重量平均 比，較強的^=; ° _而言’和較弱的酸性試劑相 量的產傾向於產生具有較低重量平均分子 a认物聚麵知同樣地’和較弱的驗性試劑相比，較 劑會傾向於產生具有較低重量平均分子量的產 水解試劑 辛性2程圖2所繪示之水解條件包括酸性、驗性以及酵 1Γ,]用不同試劑實行所選的水解條件，而由起 =麩胺酸產生具有目標重量平均分子量的所需產物= 在一些實施例中可利用酸性水解條件。酸性條件可用 值在6到1⑼的溶液魅。可経贿水觸件的試 Μ 匕括（但不限於）Ηα、HBr、HF、Hcl〇4、Hci〇3、HC队、 H曰 CIO、H2so4、hno3、H3p〇4、醋酸、HC02H、C12CHC02H、 1¼離子乂換樹脂或者其中之任意組合。 舉例而§，如流程圖2所繪示之水解條件包括在 C12CHC02H㈣HBr和醋酸混合物。在—些實施例中， 水解條件包括在CUCHCO2!!中的HC1和醋酸混合物。 在一些實施例中，可利用鹼性水解條件。鹼性條件可 用pH值在8到14之間的溶液產生。可產生驗性水解條件 的試劑包括（但不限於）鹼金屬氫氧化物（alkali metal hydroxide )(如 NaOH、KOH、LiOH、Ba(〇H)2、Cu(OH)2)、 t-BuOK、NaH、陰離子交換樹脂或者其中之任意組合。 19 201124447l 在一些利用酵素性催化水解條件的實施例中，可被利 用的酵素包括（但不限於）酯解酶（esterase)(如豬肝酯 解_:以及來自枯草桿菌（)的醋解酶）、脫 水酶（anhydrase)(如碳酸針酶（carb〇nic anhydrase))、脂 肪 (lipase )(如豬的膜脂肪酶（p〇rcine pancreatic lipase )、 嗜熱蛋白酶（thermitase )、以及來自雪白根黴（及⑽ m’vews)、黑麴菌（J印ergz·//⑽)、南極假絲酵母菌 ()、爪α圭毛徽（）的脂 肪酶）以及任何其他已知可水解化學鍵結的酵素。 iii·溫度 除了使用一種或更多種水解酵素之外，水解條件可包 括將起始聚麩胺酸以升高的溫度處理。在一些實施例中， 起始的聚麩胺酸聚合物可用大於或等於約6〇cc的溫度處 理。在其他貫施例中，起始聚麩胺酸聚合物可用大於或等 於約50°C的溫度處理。X在其他實_巾，起始聚麵胺酸 ♦合物可用大於或等於約4〇〇C的溫度處理。在一些實施例 中，起始聚麩胺酸聚合物可用在約4〇<>c到約6〇〇c範圍内 的溫度處理。除此之外’可在約沉的室溫下财解條件 處理起始雜胺酸聚合物。在—些實施例中，水解條件可 包括在-40〇C到300°C範圍内的溫度。 iv.時間 起始聚麵胺酸可在不同時間量下經水解反應處理 2實施例中，雜胺酸聚合物在i到儒分鐘的一 間範圍經水解反應處理。在—些實施例中，聚麵胺酸聚合 201124447 物在i到24小時的一段時間範圍經水解反應處理。在一些 實施例中，聚麵胺酸聚合物在約丨天到約3天的一段時間 範圍經水解反應處理。在一些實施例中，聚麩胺酸聚合物 經大於3天的水解反應處理。應瞭解的是，當於此處揭露 一時間範圍，此範圍包含在所提供的時間範圍内含有的各 個整數以及小數。糊*言，卜2小時的相翻為描述 1.0 1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9 以及 2.0 小時的一段時間。 在-些實施例中’水解條件可包括將起始聚麩胺酸聚 =物以第-溫度處理第—段時間，及以第二溫度處理第二 k時間4乍為-例，起始聚麩胺酸聚合物可以如上所述的 間，並以如上所述的第二溫度處理 第-1又時間’其中第—溫度和第二溫度不同。在一 例中，第二溫度可小於第一.、田许 一貫 、'田产可*度在其他實施例中，第二 /皿又了大於第1度。又在其他實施例巾田 度可大約相同。舉例而言，起始聚麩胺酸聚合物可；: 而 範_第—溫度下處理第-=於約 弟一段時間在室溫下進行。 匙始眾麩胺酸經第 可不相同。舉例而言’第-溫度時期可和;夺間 大或者小。除此之外，第-間 在-些實施例中’第1時間可等於或 π J小時。在 21 201124447 其他實施例φ，贫 , 他實施例中，笛_:時^可等於或者小於2小時。又在其 施例争，第時期可等於或者小於1小時。在一些實 中，第二時发；^月可等1或者大於1小時。在其他實施例 中，第二時期可等大3於2時但又在其他的實施例 圍内在在施例中’第一時期在1分鐘至⑽分鐘的範 圍内。在—H時期在1小時到24小時的範 在-此第—時期在1天到3天的範圍内。 在些貫施例t，第-時期大於3天。 圍内。在—0^例中，第二時期在1分鐘到120分鐘的範 ^ ^些實施例中，第：時期在1小時到24小時的範 :二4;?實:_中，第二時期在1天到3天的範圍内。 二實轭例中，第二時期大於3天。 職聚合物可賴選的水解條件處理之總 水解條件一些實施例中，起始聚麩胺酸可在所選的 水解至少共2小時。在其他實施例中，起始聚 ，胺夂可在所選的水解條件下水解至少共25小時。又在 ；:他^施例中’起始聚麵胺酸可在所選的水解條件下水解 〉J小時。而又在其他實施例中 所選的水解條件下水解至少共4小時。在-此實施例ί在 起始聚麵㈣可麵選的水解條件下轉至少共5小時、 至少共6小時或者至少共7小時。在其他實施例中，起始 聚麵胺酸可在所選的水解條件下水解共少於8小時。 22 201124447 V.規模 不同量的起始聚麵胺酸聚合物可經此處所描述之水 解條件處理。此處所描述之步驟對於大規模生產特別有 用。在一些實施例中，於任何特定批次中，經水解條件處 理之起始聚麩胺酸聚合物的量在1〇克到1〇〇克的範圍内。 在一些實施例中，於任何特定批次中，經水解條件處理之 起始聚麩胺酸聚合物的量在100克到L000克的範圍内。 在些貫施例中，於任何特定批次中，經水解條件處理之 起始聚麩胺酸聚合物的量在1公斤到丨〇公斤的範圍内。 vi.溶劑 可使用任何適用於水解聚麩胺酸之溶劑。在一些實施 例中，此水解溶劑為選自二氧陸圜（dioxane)、笨甲醚 (anisole)、苯（benzene)、氣仿（chloroform)、氯苯 (chlorobenzene )、醋酸乙酯（ethyl acetate )、硝基苯 (nitrobenzene )、乙腈（acetonitrile )、二曱基甲酿胺 (dimethylformamide )、石肖基曱烧（nitromethane )、曱醇 (methanol )、醋酸（acetic acid )、丙酮（acetone )、正 丁醇（n-butanol)、醋酸丁醋（butyl acetate)、四氣化碳 (carbon tetrachloride)、環己烧（cyclohexane)、1,2-二 氣乙烧（l，2-dichloroethane)、二氯曱烧（dichloromethane)、 二曱基亞石風（dimethylsulfoxide)、乙醇（ethanol)、二乙 喊（diethyl ether )、庚院（heptane )、己烧（hexane )、 曱醇（methanol)、曱基第三丁基醚（methyl-t-butyl ether)、 曱基乙基酮（methyl ethyl ketone)、戊烧（pentane)、正 23 201124447 丙醇（n-propanol )、異丙醇（is〇pr〇pan〇i )、二異丙峻 (diisopropyl ether)、四氫〇夫0南（tetrahydrofuran)、甲苯 (toluene )、二氣乙烯（trichi〇roethylene )、水（water )、 二曱苯（xylene)以及任何其中之混合物。 較佳之溶劑包括極性溶劑，如極性質子或極性非質子 溶劑。水解條件可於選自水性溶劑、醇溶劑或者其中任何 混合物的溶劑中進行。例示之溶劑包括（但不限於）甲醇、 乙醇、丙醇、丁醇、水或者其中任何混合物。較佳的溶劑 包括醋酸、一氣醋酸以及醋酸和二氣醋酸之混合物。 vii.測量水解程度 在一些實施例中，聚麩胺酸的水解受到監控。舉例來 說，可進行測量以監控起始聚麩胺酸聚合物的水解程度。 此測量可用來確認是否已產生具目標重量平均分子量$聚 麩胺酸。此測量亦可用來確認在此方法中任何所選階段之 水解溶液裡所含的聚麩胺酸之重量平均分子量。 可用不同的技術來監控聚麩胺酸的水解。舉例而古， 聚麩胺酸的水解可藉以下的技術來監控，其包括（但;限 於）使用適宜的分子量偵測技術（如光散射）的體積排^ 層析-高效液相層析（SEC-HPLC )、小角度中子散射 (SANS)、X射線散射、沉降速率、體積排除層析/高效 液相層析、氣相層析質譜分析（GC/MS)、液相層析質譜 分析（LC/MS )、基質辅助雷射脫附/游離質雄^析 (MALDI-MS)、電喷灑游離質譜分析（ESI/MS)、^速原 子撞擊質譜分析（FAB-MS )、感應耦合電聚質譜分析 24 201124447 (ICP-MS)、加速器質譜分析（AMS)、熱離子源質譜分析 (TIMS)、火花源質譜分析（SSMS)、滲透壓測定法 (osmometry )、光散射、超高速離心（ultracentrifugation)、 冰點測定法（cryoscopy )、沸點測定法（ebulliometry )、端 基分析（end-group analysis)、滴定法（titration)、凝固點 下降（freezing pint_depression)、沸點上升（b〇iling_p〇int elevation)、滲透壓或者任何所屬領域中已知確認聚合物分 子s的方法。若兩種或更多用以碟認聚麵胺酸之重量平均 勿子量的方法產生了不同的分子量值，則較佳為由 SEC-HPLC所得到之重量平均分子量值。 〜在些實施例中，進行對全部水解溶液之測量。在一 ^貝施例中’測量—樣本或-小部分水解溶液。在-些實 部水解溶液和水解溶液之—樣本均被測量以確 涊起始聚麩胺酸水解的程度。 崎 viii.多重測量 聚合物水解的二中二，2重測量以監控起始聚麵胺酸 認是否已產生例中’進行多重測量以確 次數可在2到4Q f子量的聚甦胺酸。測量的 行多重測量。舉例而1 =超過♦可在不同時間點進 的時間點間隔内夠量=β 、約1分鐘到、約120分鐘範圍 上述^時間與聚麵胺酸分子量相互關聯 理之時間量==酸可解條件下處 里里十均刀子量作關聯。舉例而 25 201124447 言，聚麩胺酸的重量平均分子量對時間的圖表如圖1及圖 2所示。這些圖表是藉著從含有聚麩胺酸以及水解試劑的 ，液中，於不同時間間隔下，對聚麩胺酸的重量平二^子 篁進打測量而產生。此些圖表可被用以確認起始 處理的時間量，以產生所需之具有所選的 目私重里千均分子量的產物聚麩胺酸聚合物。 X.選擇水解條件 以選雜胺酸重量平均分子量的關係，可 以遠擇月，有效產生具有目標重量平均分 酸聚合物的水解條件。 ⑽I麩知 在些實施例中，水解時間和聚麵 ，係可用以選擇能有效地產生具有目標重以： 里之產物騎胺酸聚合物的時間量姑 選擇約1小時的水解時間，以產 根據^ _的產物聚楚胺酸。此外， 单曰 約2小時的水解時間，以產生星有重旦 千均刀子篁約50 kDa的產物聚麵胺酸 ，、有重里 約3小時的水解時間，以產生且^旦^圖卜可選擇 -的產物聚麵胺酸。根據圖J 子T 40 解時間，以產生具有重量平约八^ ^擇約4〜5小時的水 胺酸。根據圖！，可選=^子/約34kDa的產物轉 有重量平均分子量擇解時間，以產生具 可選擇約7小時的水解時間，以產生 1 麵有胺重酸^虞圖1， 約20kDa的產物聚_酸。 L、有重置平均分子量 26 201124447 / 根據用以產生圖2的水解 解時間，以產生具有重量平 了&擇，力1小纣的水 胺酸。此外，根據圖= 的產物聚麵 產生具有重量平均分 ^擇、力2小時的水解時間，以 圖2，可選擇約3小時^水^的產物聚麵胺酸。根據 分子量約％咖的以產生具有重量平均 小時的水解時間，以產生具 k擇·、，勺4 的m去、负更里十均分子I約2δ kDa 以產生具有重量平均分+^… ㈣謂時間’ 據圖2,可選擇w 8丨/ 仏的產物聚麵胺酸。根 单妁八y、㈣、時的水解時間，以產生具有重量 ”約20 kDa的產物聚麵胺 ‘ I9〜10小時的水解時間，以產生具有重量平均分 獅a的產物聚麵胺酸。根據圖 == =，，以產生具有重量平均分子量約13_= 聚麵Μ夂。根據圖2，可選擇約13〜15小時的水解 以產生具有重量平均分子量約12 kDa的產物聚麵胺酸曰。 於此所描述的水解條件與聚麩胺酸重量平均分 間的不同關係可用以產生具有所選的目標重量平均= 的聚麵胺酸聚合物。 里 xi·純化 選擇性地，產物聚麩胺酸可隨後被分離以及/或者 ，。可用所屬領域巾具通常知識者所習知的適當方法來八 離以及/或者純化產物聚麵胺酸。若有必要以及/或者I 要’產物聚麵胺酸可藉所屬領域中具通常知識者所習知5 27 201124447 適當方法乾燥。舉例而言，聚麩胺酸可藉添加試劑而由溶 液中沉澱出來。在一些實施例中，此試劑可為丙酮。所形 成的任何產物聚麵胺酸沉澱可隨後被過濾以及清洗，例如 用丙酮。產物聚麩胺酸可選擇性地藉任何適當方法來純 化。舉例而言，產物聚麩胺酸可溶解至碳酸氫鈉（s〇dium bicarbonate)溶液中，以纖維素膜在水中透析，以及可將 產物聚麩胺酸冷凍乾燥而分離。 如此處所描述，由所選的水解條件而獲得的產物聚麩 胺酸具有小於起始聚麩胺酸的重量平均分子量。用以確認 產，聚麵胺酸的重量平均分子量之方法描述於此處。在一 些實施例中，產物聚麩胺酸的重量平均分子量可在約35 kDa至約12kDa的範圍内。 β如以上所討論，在一些實施例中，此處所述方法的優 點疋可在相對狹窄的千道爾頓（kDa)範圍内獲得具有所 需重量平均分子量之產物聚麵胺酸的能力。在一些實施例 中，產物聚麩胺酸可具有在所選的目標第二重量^均分子 量約±5 kDa範圍内之重量平均分子量。在其他實施例中， 產物聚麩胺酸可具有在所選的目標第二重量平均分子量約 ±3 kDa、±1.〇 kDa、±0.5 kDa、土〇 2 kDa、±〇] kDa 或刊 〇5 kDa範圍内的重量平均分子量。 xii.聚合度分佈性 此處描述的水解條件可用以產生具有低聚合度分佈性 指數的產物聚麩胺酸聚合物。在—些實 胺酸聚合物可具小於…小於⑵_、於=3 28 201124447 度分佈性。在一些實施例中，產物聚麩胺酸聚合物具有約 1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9 或 2.0 的聚合 度分佈性。在一些實施例中，產物聚麩胺酸聚合物具有在 1.01和1.09之間的聚合度分佈性。在一些實施例中，產物 聚麩胺酸聚合物具有約1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、 1.07、1.08或1.09的聚合度分佈性。 實例 提供下述實例之目的為進一步說明此處所描述之實施 例，並不限定所主張之範圍。 實例1 市面購得之PGA之水解 由西格瑪奥瑞奇化學公司取得聚麩胺酸（PGA)，其 具有17 kDa的分子量。購得之PGA以如表1所示的水解 條件處理。產生的產物PGA之重量分子量亦如表1所示。

S 29 201124447 表1 樣本 起始材料 水解條件 由 GPC-MALS 確認之分子量 (kDa) ci2chco2h 33%HBr-AcOH 在50°C加熱及 (置於室溫）的時間 1 Sigma PGA, 17 kDa， - - 0 h + (0 h) 17.00 2 Sigma PGA, 17kDa 40 ml /g 3.75 ml/g 0 h + (3 h) 15.33 3 Sigma PGA, 17 kDa 40 ml /g 3.75 ml/g 1 h + (1 h) 12.85 4 Sigma PGA, 17 kDa 40 ml /g 3.75 ml/g 2 h + (2 h) 8.25 5 Sigma PGA， 17 kDa 37 ml /g 6.6 ml/g 2 h + (4 h) 6.38 實例2 PGA-苄酯之合成 二氧陸園*^ 室溫，3天一

PGA苄酯^ 5-苄酯麩胺酸v 三乙基胺^ N-碳酸酐(NCA> 0.02當量^ 1.0 當量— 50:1^ 30 201124447 在用烘箱乾燥之500 mL的圓底燒瓶中，置放塗上聚 四氟乙烯（Teflon)的攪拌子，加入1〇克（38毫莫耳，1 當量）的5-苄酯麵胺酸-N-碳酸酐（NCA)以及190mL之 '一氧陸圜。所產生的溶液以氮氣通氣（purge)約5分鐘。 然後加入約0.106 mL (0.76毫莫耳，〇.〇2當量）新鮮蒸餾 的二乙基胺（〇.〇2當量）。此反應混合物再以氬氣通氣約 5分鐘’並攪拌1〇分鐘。攪拌停止後，使此反應混合物置 放72小時。然後將此反應混合物缓慢地倒入快速攪拌的 1000 mL無水乙醇（anhydrous ethanol)。沉澱出的產物呈 現長條白色、纖維絲狀。將此混合物過濾，產物被分離出 來再以250 mL乙醇清洗。任何殘餘的溶液於真空中（& vac⑹）去除。所產生的pGA樣本（作為實例3中的起始 PGA樣本）之重量平均分子量以有光散射分子量彳貞測的 GPC作確認。另外兩個PGA樣本賴似的步驟製造。更 ^目關條件和所產生的PGA樣本之重量平均分子量的細 郎呈現於表2中。 表2 樣本 起始材料與聚合用溶劑 '~~~~----- PGA苄酯分子量 (GPC-光散射法偵測） 聚合度分佈性 1 市面購得之NCA與二氧 191 kDa 1.162 2 再結晶之NCA與蒸餾 ------- ----- 221 kDa 1.032 3 市面購得之NCA與蒸餾 I含鈉的二氧陸圜 240 kDa --------- 1.123 31 201124447 實例3 PGA之水解 tTi 33% HBr-AcOH CH2 -► |=〇 δ CI2CHCOOH 0Na 在用烘箱乾燥之100 mL的圓底燒瓶令，置放塗上聚 四氟乙烯的攪拌子以及氣體接頭（gasadapt〇r)，加入1 〇 克（4.57毫莫耳’丨當量）由實例2所得的pGA_r苄酯（具 有重量平均分子量191 kDa)以及40 mL之二氯醋酸。反 應混合物置於氬氣環境下，並攪拌15分鐘，使得酯部分溶 解容注射器加入3.5 mL ( 28.5宅莫耳，6.24當量）33% 的HBr-AcOH溶液。然後攪拌此反應混合物約6小時。添· 加丙酮（50 mL)而形成白色沉澱。過濾產生的泥狀物， 以丙酮（50 mL)清洗而取得固體。將此固體溶解於1 N 碳酸氫鈉水溶液直到pH值達到〜8 (約2〇 mL)。將此溶 液置放入透析管，於4 L去離子水中進行約1小時的透析。 在1小時後’將100%的水置換，再繼續進行另1小時透 析。重覆此步驟2次以上，然後將此溶液過夜透析。此透 析溶液以0.45 μιη之纖維醋酸膜（ceUul〇se acetate

membrane )過滤，並以冷凍乾燥移除水。所獲得的產物pGA 32 201124447, V-/V f p*·! 為白色固體（0.18克，產率31%，重量平均分子量16 80 kDa)。 實例3的步驟是在添加33%HBr-AcOH後進行，於1、 2、3、4、5、6及7小時時從反應混合物取出部分（aliqu〇ts)。 由這些部分而來的產物PGA以實例3中所述步驟進行純化 及分離。由這些部分而來的產物P G A之重量平均分子量被 雜認而呈現於表3中。 表3 樣本1 樣本2 樣本3 樣本4 樣本5 樣本6 時間 分子量 分子量 分子量 分子量 分子量 平均分子量 (hr) (kDa) (kDa) (kDa) (kDa) (kDa) (kDa) 1 75.55 64.36 • 73.63 87.91 75.36 2 52.35 43.69 40.40 49.34 57.73 48.70 3 40.25 31.21 39.83 48.8 40.02 4 - 25.40 29.21 38.34 41.86 33.70 5 30.59 20.76 33.25 43.5 32.03 6 23.46 17.77 25.72 29.31 32.23 25.70 7 17.96 16.88 - 26.34 - 20.39 *分子量=以GPC-光散射法確認之重量爭均分子量 圖1中所示的圖表為由表3的資料所產生。所屬領域 中具通常知識者可選擇一目標重量平均分子量，並使用此 圖表確認需要水解起始聚麩氨酸的時間，以獲得產物聚麵 胺酸，其中產物聚麩胺酸具有之分子量在所選的目標重量 平均分子量約±1〇 kDa範圍。 33 201124447 實例4 PGA之水解 第一個具有起始重量平均分子量130 kDa的PGA节醋 樣t!?8 ’ 22 85毫莫耳，1當量）和二氣醋酸（200 ml) 在氬乳W下加入用供箱乾燥之5〇〇ml圓底燒槪中（其中 置放塗上聚四氟乙烯的磁攪拌子）。 …降低燒瓶使其進人職之3(TC油浴。產生的懸浮物可 攪拌15分鐘，使得g旨可部分溶解。透過注射器加入 HBr_AC〇H溶液（17.5 m卜觸.1毫莫耳，4.37當量）。在 添加HBr AeOH，錢1小時後，透過注射管移除2 〇毫升 的部分溶液（此時所有PGA·關進人紐巾）。將此部 分溶液置入離心管並以33 mL丙酮稀釋，再進行振盪 (vortex)以均勻地散佈溶液混合物+的聚合物。然後於 2:C以3000 rpm離心5分鐘。聚合物在離心管底部形成緊 欲的栓塞物（plug)。輕倒出上清液並加入另外的33虹 丙酮至管巾。紐如上述㈣縫及離心、。在移除產 生的上清液後，將聚合物栓塞物溶解於1〇 —的1n碳酸 氫鈉水溶液。在另外的Μ小時之後的每個小時，移除一部 分2.0 mL的反應混合物，並如上所述步驟進行操作。此聚 合物以有光散射偵測器的凝膠滲透層析法檢測其特性。確 認此產物PGA之重量平均分子量。 第二個具有起始重量平均分子量13〇]<1)&的1)(}八苄酯 樣本根據上述的相同步驟水解。由第一個樣本及第二個^ 本而來的產物PGA的重量平均分子量如表4所示。 34 201124447 表4 樣本1 樣本2 時間 分子量 分子量 — (kDa) (kDa) 1 ------ 72.14 72.14 2 49.21 49.21 3 ~—__ 36.15 36.15 4 --__ 27.78 ----~~— 27.78 5 —--- 23.44 23.44 6 --------- 19.71 19.71 7 20.37 20.37 8 18.4 18.4 〜 9 -- 15.61 15.61 ^ 10 --— 15.7 ------- --------- 15.7 11 --—__ 13.34 13.34~~~ 12 13.59 13 -^—--- 一 11.53 11.53 14 —------ 11.67 11.67 15 "~'"·*·>〜 11.08 11.08 以GPC-光散射法確認之重量平均分子量 固Z尸吓不的 句从衣4的資料所產生，访曰千中卢 =2::Γ ’此兩個樣本_^ 均分子旦、巾具通常知識者可選擇目標重量平 = :rV 圖表去確認水解起始聚麵胺酸所需 物聚麵胺酸，其中，產_酸具 重量平均^子^4第—重1平均分子量邊kDa範圍内的 35 201124447 實例5 PGA之水解 利用水解具有起始重量平均分子量13〇伽的PM 物的八個樣本來顯示水解條件之再現性。簡單地說， PGA节醋樣本（5·〇 g，22別毫莫耳，i當量）以及^氣 醋酸,(20()ml)在氬氣環境下加人用烘箱乾燥之5〇_圓 底燒瓶中（其中置放塗上聚四氟乙烯的磁祕子）。降低 ^〇瓶使其進人預熱之3GC油浴。產生的懸浮物授拌15分 釦，使得酯可部分溶解。加入HBr Ac〇H溶液（i7 5 ， 100.1毫莫耳’ 4.37當量h此反應攪拌6小時。將此反 1倒入1500 mL快速授拌的混合物，此混合物為在醋酸乙 酉曰中S 10/〇己烧。15分鐘期間内沉殿出的產物呈透明凝膠 狀固體產生的混合物以54級濾紙（Grade 54 paper filter ) 過濾。收集產生的固體並以2 x25〇mL乙酸乙酯沖洗。將 此材料轉移到置有擾拌子的錐形瓶中。然後加入mL IN碳酸氫鈉溶液至瓶中，此材料會溶解。將此溶液置入分 液漏斗，水層（下層）會由在上的有機層（苯甲基溴化物 (benzyl bromide)副產物以及一些殘餘的醋酸乙酯）中分 離出來。將水層置於透析膜上，並以4 L·去離子水透析1 小時。進行1〇〇%水的置換，然後再透析i小時 。此步驟 再重複兩次’然後隔夜透析。此溶液以50級濾紙過濾，然 後冷凍乾燥以移除水。產生的聚合物之組成以1h_nmr光 5杳核測，而其重量平均分子量以有光散射偵測器的凝膠滲 36 201124447κ 透層析法檢測。確認八個樣本中的每一個產物PGA之重量 平均分子量’並呈現於表5中。 表5 樣本 規模 起始分子量 產率 產物分子量 1 5g 130 kDa 44% 20.53 kDa 2 5g 130 kDa 61% 19.34 kDa 3 5g 130 kDa 71% 21.27 kDa 4 5g 130 kDa 79% 19.71 kDa 5 5g 130 kDa 74% 21.21 kDa 6 5g 130 kDa 87% 21.34 kDa 7 5g 130 kDa 83% 18.27 kDa 8 5g 130 kDa 94% 19.56 kDa 實例6 PGA之水解 此處描述之水解條件的易變性（versatility)藉著水解 六個具有起始重量平均分子量在130 kDa或270 kDa的 PGA聚合物樣本來顯示，且樣本之大小在5和5〇克之間。 簡單地說’ PGA苄酯樣本以及二氯醋酸在氬氣環境下加入 用烘箱乾燥之500ml圓底燒瓶中（其中置放塗上聚四氟乙 烯的磁授拌子）。降低燒瓶使其進人預熱之撕油、、谷 生的懸浮物攪# 15分鐘，使得醋可部分溶解：加入 HBr-AcOH溶液（4·37當量）。此反應搜掉6小時。將此 反應倒人快賴拌的混合物，歧合物為在轉乙醋中含 10%己H5分鐘期間内沉殿出的產物呈透明凝勝狀固 37 201124447 體。產生的混合物以54級濾紙過濾。收集產生的固體並以 乙酸乙酯沖洗兩次。將此材料轉移到置有攪拌子的錐形瓶 (Erlenmeyer flask)中。然後加入1N碳酸氫鈉溶液至瓶 中’此材料會溶解。將此溶液置入分液漏斗，水層（下層） 會由在上的有機層（苯甲基溴化物（benzyl bromide)副產 物以及一些殘餘的醋酸乙酯）中分離出來。將水層置於透 析膜上，並以去離子水透析1小時。進行100%水的置換， 然後再透析1小時。此步驟再重複兩次’然後隔夜透析。 此溶液以50級濾紙過濾，然後冷凍乾燥以移除水。產生的 聚合物之組成以1H-NMR光譜檢測，而其重量平均分子量 以有光散射偵測器的凝膠滲透層析法檢測。球認六個樣本 中的每一個產物PGA之重量平均分子量而呈現於表6中。 表6 樣本 _ 規模 起始分子量 產率 1 5g 130 kDa 44% 2 5β 130 kDa KUd 10 1/1 i,t\ - 3 — 4 _llg_ 270 kDa 19.46 kDa 2〇e 130 kDa 51% 5 — —__ ~~_ 270 kDa 270 kDa —__54% --- 20-09 kDa __^?_kDa _ 19.22 kDa 申請域中具有通常知識者應瞭解’在不脫 理解:作許多及不同的修正。因此，應 主張之t 露之形式僅為說明性，而_以 38 201124447 ^ ^ Λ. ^ 【圖式簡單說明】 圖1所示之圖表為圖示在包括溴化氫-醋酸而於30°c 進行數小時的水解條件下，藉由水解起始之重量平均分子 量為191kDa的聚麩胺酸节酯所獲得的聚麩胺酸之重量平 均分子量。 圖2所示之圖表為圖示在包括溴化氫-醋酸而於30°C 進行數小時的水解條件下，藉由水解起始之重量平均分子 量為130kDa的兩個聚麩胺酸苄酯樣本所獲得的聚麩胺酸 之重量平均分子量。 【主要元件符號說明】 無 39

Claims (1)

1. 201124447 七、申請專利範圍： L 一種製備聚麩胺酸的方法，包括： 取得具有等於或者大於80 kDa的第一重量平均分子 量之起始聚麵胺酸； 選擇聚越胺酸之目標第二重量平均分子量，所述目標 第二重量平均分子量小於80 kDa ; 選擇水解條件，所述水解條件有效地將所述起始聚麩 月女酸之所述第-重量平均分子量減少到所賴選的聚麵胺 酸之所述目標第二重量平均分子量；以及 在所述所選擇之水解條件下，將所述起始聚麩胺酸水 解，藉此而得到產物聚麩胺酸，其中所述產物聚麩胺酸具 有約在所述所選的目標第二重量平均分子量· kDa範/圍 内之重量平均分子量。 2· 一種製備聚麩胺酸的方法，包括： 取付具有等於或者大於185 kDa的第一重量平均分子 量之起始聚麵胺酸； 一選，聚麵胺酸之目標第二重量平均分子量，所述目標 第二重量平均分子量小於185 kDa ; ^選擇水解條件，所述水解條件有效地將所述起始聚麩 ^夂之所述第—重量平均分子量減少到所述所選的聚麵胺 酉文之所述目標第二重量平均分子量；以及 f所述所選擇之水解條件下，將所述起始聚麵胺酸水 2，藉此而得難物雜舰，其帽述產物聚麩胺酸具 有約在所述所選的目標第二重量平均分子量±10 kDa範^ 内之重量平均分子量。 祝固 201124447 3. 如申^專利· P項或第2項所述 酸的方法’其中所述產物聚麩紐具有約在所述：:= 標第二重莖平均分子量±5 kDa範圍内之重量平^ β 4. 如申^專利範圍^_2销胺 酸的方法，其中所述產物聚麩胺酸具有約在所述戶= 5. 如申請專利範圍第心二重;::分子量。 法，其中所述起始聚麩胺酸具有等於或 ^月女酸的方 所述第一重量平均分子量。〆 ；〇〇kDa的 6. 如申請專·圍第5項所叙製 t約目標第二重量平均分子量在=她 法 重I平均刀子i±5 kDa範圍内之重量平均八子旦 重量平均分子量±3kDa範圍内之重量平均又子^目&第一 選擇之水解條件包括將所述起始繼酸 10·如申3青專利範圍第9項所述 法，其中所述駿為漠化氫_醋酸。_錢胺酸的方 法其中所达起始讀胺酸具有等於或者大於⑽仙的 41 201124447 所述第一重量平均分子量。 12. 如申請專利範圍第n項所述之製備聚麵胺酸的 方法，其中所述所選的目標第二重量平均分子量在約 35kDa至約15kDa範圍内。 13. 如申請專利範圍第12項所述之製備聚麵胺酸的 方法，其中所述產物聚麩胺酸具有約在所述 二重量平均分子量獅a範圍内之重量目U 方At申請專利範圍第12項所述之製;聚二酸的 方法：其中所述產物聚_酸具有約在所述所選的目標第 一重量平均分子量土3 kDa範圍内之重量平均八子旦 方、範圍第12項所述之製;聚二的 酸與酸i應。，補之轉條件包括將所述起始雜胺 16.如申請專利範圍第15項所 方法’其情親料域_麟。 備聚麩胺㈣ 所述弟一重夏平均分子量。 18.如申請專利範圍第17項所 方法’其中所述所選的目標第二重，麩臟的 35舰至約咖am_。弟重里千均分子量在約 方二==18項所述之製備聚飄的 :重量;=ί=ί:具有約在所述所選的目標第 一直里十 于里-5kDa乾圍内之重量平均八曰 2。·如申請專利範圍第18項所述之“胺酸的 42 201124447. 方法’其中所述產物雜麟具有約在所述所選的目 二重量平均分子量±3 kDa範圍内之重量平均分子量。 方第18項所述之製:聚:胺酸的 g酸^ 擇之水解條件包括將所述起始聚麵胺 方本圍*21項所述之製備聚麩胺酸的 方法，其中所述酸為溴化氫-醋酸。 23. 如t請專鄉㈣1項崎之製備料胺酸的方 法，其中所述起始聚麩胺酸具有等於或者大於no kD 所述第/重量平均分子量。 24. 如申^專利範圍第23項所述之製 方法，其中所述所選的目標第二重量八，= 35kDa多約15kDa範圍内。 刀罝在、，勺 25. 如ΐ請專利範，24項所述之製 方法，其中所述產物聚麵胺酸具有約在所述=== 二重量乎均分子量±5 kD4_之重量平均分 不 26. 如申請專·圍第24摘述 方法，其中所述產物減胺酸具有約在所述 二重量範圍内之重量平均分子量。下 27. 如申，月專利範圍第24項所述之 所述所選擇之水解條件包括將所述起始聚:胺 方二述之製峨胺酸的 29.如申請糊麵第1項絲2項所述之製備聚麵 43 201124447 胺酸的方法，其巾所述起始雜㈣具有等 190 kDa的所述第一重量平均分子量。 30. 如申請專利範圍第29項所述之製備聚麵胺酸的 方法，其中所述所選的目標第二重量平 35kDa至約15kDa範圍内。 在約 31. 如申請專利範圍第3〇項所述之製備聚麩胺酸的 方法，其情述產物雜胺酸具有約在所述所選的目標第 二重量平均分子量±5 kDa範圍内之重量平均分子旦 32·如申請專利範圍第3〇項所述之製備聚^胺酸的 方法，其中所述產物聚麩胺酸具有約在所述所選的目栌第 二重量平均分子量±3kDa範圍内之重量平均分子量。不 33.如申請專利範圍第3〇項所述之製備聚二酸的 方法’其中所述所選擇之水解條件包括將所述起始聚麵胺 酸與酸反應。 34. 如申請專利範圍第33項所述之製備聚麵胺酸的 方法’其中所述酸為溴化氫-醋酸。 35. 如中請專利範圍第！項或第2項所述之製備聚麵 胺酸的方法，其中所述起始聚麵胺酸具有等於或者大於 220 kDa的所述第一重量平均分子量。 、 36. 如申請專利範圍第35項所述之製備聚麵胺酸的 方法，其中所述所選的目標第二重量平均分子量在約 35kDa至約15kDa範圍内。 37. 如申請專利範圍第36項所述之製備聚麵胺酸的 方法，其中所述產物聚麩胺酸具有約在所述所選的目標第 二重量平均分子量±5kDa範圍内之重量平均分子量。不 44 201124447^ 古本專利範圍第36項所述之製備聚麵胺酸的 方^旦^所述產物聚麵胺酸具有約在所述所選的目標第 -重里平均分子量±3 kDa範_之重量平均分子量。 方二St圍第％項所述之製備聚編的 酸與酸ιΓ擇之水解條件包括賴述起始聚_ 方二ΐΐί專利範圍第39項所述之製備聚麵胺酸的 方法，，、中所述酸為溴化氫_醋酸。 41·如申請專利範圍第丨項或第2項所述之製備 胺I的方法’其+料起始料贿 ^ 240kDa的所述第一重量平均分子量。 飞者大於 方：2·盆如Λ，利細41酬述之製備聚麩胺酸的 方法、、中所述所選的目標第二重量平均分 35kDa至約15kDa範圍内。 里在、、、勺 43甘：申請專利範圍第42項所述之製備聚麩胺酸 ^法，:中所1物聚楚胺酸具有約在所述所選的目標 -重量平均i子l±5 kDa範ϋ内之重量平均分子 44·如中料利範㈣42項所述之製備轉胺酸 方Ϊ量;約在所述所選的目標第 -重里千均刀子里±3 kDa$|圍内之重量平均分子ι 45·如中請專利範_ 42項所狀 ^ 方法，其中所述所選擇之水解條件包括將 酸與酸反應。 巧始來麵月女 46. 士:申請專利範圍第45項所述之製備聚麩胺酸的 方法，其中所述酸為溴化氫_醋酸。 麩胺馱的 45 201124447. 47·如申請專利範圍第1項所述之製備聚麩胺酸的方 法’其中所述起始聚麩胺酸具有在8〇kDa至約3〇〇kDa範 圍内的所述第一重量平均分子量。 48. 如申請專利範圍第47項所述之製備聚麩胺酸的 方法，其中所述所選的目標第二重量平均分子量在約 35kDa至約15kDa範圍内。 49. 如申請專利範圍第48項所述之製備聚麩胺酸的 方法，其中所述產物聚麩胺酸具有約在所述所選的目標第 二重量平均分子量±5 kDa範圍内之重量平均分子量。 50. 如申請專利範圍帛48項所述之製備聚麵胺酸的 方法，其中所述產物聚麩胺酸具有約在所述所選的目標第 二重量平均分子量±3 kDa範圍内之重量平均分子量。 51. 如中明專利範g第48項所述之製備聚楚胺酸的 方法，其中所述所選擇之水解條件包括將所述起始聚麵胺 酸與酸反應。 52·:請專利範圍第51項所述之製備料胺酸的 方法’其中所述酸為溴化氫-醋酸。 53.如申請專觀圍第丨項所述之製備聚麵胺酸的方 法，其中所述起始聚麵胺酸具有在130kDa至 圍内的所述第一重量平均分子量。 ^ 項所述之製備聚麵胺酸的 方去，其中所述所選的目標第二重量平 35kDa至約15kDa範圍内。 '•刀子里在約 55.如申請專利範圍第54項所述之韌很 方法，其中所述產物聚麵胺酸具有約在所述所 46 201124447 二重量平均分子量±5kDa範圍内之重 56. 如申請專利範圍第54項 制^刀子1。 U中所述產物聚麵胺酸具有約 -重董平均分子量±3kDa範圍内之第 57. 如申請專利範圍第54項所制:里 方法，其巾所述所選擇之水解 ^麵胺酸的 酸與酸反應。 匕栝將所述起始聚麩胺 58. 如申請專利範圍第57項 方法，其中所述酸為演化氫_醋酸。t備聚楚胺酸的 胺酸=申1項或第2項所述之製備聚麵 應產物。八a &。聚麵賊為触_旨和胺之反 60.如申請專利範圍第 =方法’其中所述所選的目; 於或小於40kDa。 王里丁叼刀于里寻 胺二i申述之_ 約35kDa至約i5kDa範二重1平均分子量在 62.如申請專利節囹 胺酸的方法，其中所項或第2項所述之製備聚麩 條件下至少共水解2小日^聚麩麟在所述所選擇之水解 胺酸:方;:申1項或第2項所述之製備聚麵 條件下至少共水解3小^雜麟在所麟卿之水解 士申°月專利圍第1項或第2項所述之製備聚楚 201124447 胺酸的方法’其中所述起始聚麩胺酸在所述所選擇之水解 條件下至少共水解5小時。 65.如申請專利範圍第丨項或第2項所述之製備聚麩 胺酸的方法，其中所述起始聚麩胺酸在所述所選擇之水 條件下至少共水解8小時。 —66.如申請專利範圍第i項或第2項所述之製備聚麩 胺酸的方法’其巾所述輯擇之水祕件包括將所述起始 聚麩胺酸與酸反應。 σ 67.如申請專利範圍帛66帛所述之製備聚麵胺酸的 方法，其中所述酸為溴化氫_醋酸。 —68·如申請專利範圍第1項或第2項所述之製備聚楚 月女酸的方法’其巾所述所選擇之水解條件包括將所述起始 聚麵胺酸控制在大於25。〇的第一溫度。 69. 士申明專利範圍第⑽項所述之製備聚楚胺酸的 脸I所Ϊ所選擇之水解條件更包括將所述起始聚麵 酉夂控制在不等於所述第—溫度的第二溫度。 方法:利範圍第69 ’所述之製備聚麩胺酸的 解第二Π “而始聚麵胺酸的聚合物以所述第-溫度水 解第-&時間’而以所述第二溫度水解第二段時間。 48