TW201107470A - Gram-positive bacteria specific binding compounds - Google Patents

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Description

201107470 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明涉及生物學，免疫學和醫學的領域。 【先前技術】 革蘭氏陽性菌(Gram-positive microorganisms)引起大多數的全 身性感染。革蘭氏陽性病原體中一個重要成員是金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus )。約有20%的人口是金黃色葡萄球菌長 期的帶菌者。金黃色葡萄球菌可引起的一系列疾病，從輕微的^ 膚感染，如丘疹，膿皰病（也可能是由化膿性鏈球菌引起），痼， 蜂窩組織炎，毛囊炎，癤病，癰，燙傷皮膚症候群和膿腫，到嚴 ^的危及生命的疾病，如肺炎，腦膜炎，骨髓炎，心内膜炎，中 毋性休克症候群（TSS)，和敗血症。金黃色葡萄球菌能威毕各插 ，和組織。金黃色葡萄球菌感染發生在有免疫能力的 叉損的人。大約50%美國重症加護病房的感染是這種病原體造 成。據极導在美國每年有三十萬人感染金黃色葡萄球菌，、導致 12,000 人死亡（也見 M〇ran 等氏，，355 期，666_674 頁（2⑻6 年））。 ，要的問題是金黃色葡萄球菌不斷增加的抗生素耐藥性。” =甲氧笨青黴素之金黃色葡萄箱，，（以下略為廳§A)的出現在 世紀60年代。初步鑑定係在衛生保健機構。然而，目前看來 社=(耐？氧笨青黴素之金黃色®萄球8)亦存在於沒有住院的 中。治療MRSA是困難和昂貴的，由於對抗辛 ，，然而，只有極少數之抗生素替代品可用 H 療耐青黴素的廳八。美國專利第6,939,543號描述- 能夠^曰〇iP〇teiCh〇iCaCid ’以下略為LTA)之小鼠抗體 萄球菌。在此小鼠抗體基礎上，所產生重組嵌 ί 3有人類重鍵和輕鍵不斷域(恒定區）。然而，這種 重躲點是驗賴轉在，給人體制時涉及嚴 £ 3 201107470 【發明内容】 本發明之目的是提供抵制和/或防止革 手段和方法。本發明之另—目的是提供 =財關疾病的 佳為葡萄球菌屬，尤佳為廳八有结合'約 陽性菌，較 善的化合物。本㈣之進—步目岐提供和/或改 __，最好是MRSA，具雜麵較佳 ;萄球菌種。因此，他們是有用的：===言 囷種存在有_疾病。最好是，對抗金 葡萄^ ，，具體内涵是對抗顯。較佳為另==: 菌是表皮»萄球g。 轉軌的葡萄球 染風但患者的免疫系統往往在發展感 可以疋在醫院和社區得到，但感染更 臼丄表易又表皮葡萄球菌感染的是靜脈注射毒品使用者:^生 導 ^人=臟瓣膜，分流器等）之感染，也常發生在人工關節裝 吕，大傷口。症狀包括發燒，頭痛，乏力，厭食及呼吸困難 ㈣具體内涵$，本發明提供孤立或重組之人類抗 功能等性結合《球菌屬之 等同體’可抵制各種葡萄球菌種。因此該人類 ㈣非X # ㈣等物種之感染。和嵌合抗體相比，由於 白綱盆，故本發明之人類抗體或其功能部件或免疫球蛋 U力此相體更適合治療和/或獅人類娜赫。這大大 4 201107470 降低副作用的風險。 根據本發明一個特佳抗體是“F1”抗體，如第1圖的描繪， 其具重鏈(heavy chain )和輕鏈（light chain)的”可變區序列，, (variable domain sequences)。在此使用的“F丨” 一詞為涵蓋所有 F1的抗體，例如隔離或重組所得的“F1”。重組所得的“fi” 此亦稱之為 “rFi” 。打的 CDR(C0mplementary_determi region .互補決定區序列，以下略為CDR)，其中對π的抗原結合 特性特別有嫌，也描繪在第丨圖。F1抗體是完全人性化 巧異，結合金黃色葡萄_的物種，如金黃色葡萄球菌和表 萄球菌，因此較佳為使用於人類個體之治療。 、重要的疋’ F1抗體能夠在體内和體外結合整個細菌。因此， 進一步提供一個孤立的或重組的人類抗體或其功能部件，能夠特 異性結^金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌。此外，π抗體能夠 結合細菌，該細菌生長在已感染的組織(例如動物的組織）中。因 匕，/、要;^孤立的抗體，它可結合在活體内成長之金黃色葡萄球 ^ ’其中在活體内成長，’是指生長在受金黃色葡萄球菌感染的 動物組織中。另外提供的—個孤立的、重組或合成免疫球蛋白鍵 或其功能等同體，其中包括至少一種人類免疫5求蛋白可變區之 CDR序列’該區專屬金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌。 抗體的一個功能部件被定義為含量不拘而具有抗體之至少一 巧共同性質的部件。該功能部件是和抗體一樣，能夠結合相同的 ^原，，然不一定要在同一程度。抗體的功能部件最好包含單域 抗體，單鏈抗體，奈米抗體，一體式抗體，單鏈可變區片段（single chain variable fragment ’以下略為scFv) ’免疫球蛋白上結合抗 原的片段（Fab片段)或F(ab，)2片段。 "° 抗體的一個功能部件也是一種抗體改變而產生之抗體，由此 201107470 守的氨基酸替代，即氨基酸殘基另于，例如通過保 大致相同的殘基取代，這樣’整體運作是不可能受^響等） 的鏈中較了 不^疫球蛋白分子兩種類型 結合。抗體的輕鏈係”免疫球蛋^，σσ變域’其中可變域參與抗原 的鏈中較小者。輕鏈包括不變域和型 的可變域，參與抗原結合。 ι域訂變域’連同重鏈 之超itt定體區重(鏈於在重鏈可變域和輕㈣ 抗體重鏈和所連接輕鏈的CDR 一起形成抗原結合位點。 在此免疫球蛋白鏈的功能等同體 力之人工合成化合物，包括至少一 CDR=疋的免約束 接供洞察第1 ®所轉之⑽(互補決定區)序列， 需的具有結合約束力的特點 “ :⑽，。舉例來說，採接上=酸i
Li ,變少一個在第1圖所描緣之CDR序列，以便 ^變二/几? ’或f功能部件；和F1相比’其中至少有-個改變 ，国較佳為’所提供抗體或其功能部件之CRD 第 竿佳為改變第1圖所描繪之CDR序列，導 斤ίί體或其功能部件包括至少一個改進性能，例如和F1相 有改進的結合親和力’選擇性和/或穩定性。變形抗直 件包含氨基酸序列，至少有7〇%和第1目所描緣之^ ^ Γ因此也屬於本發明的範圍。文獻上有多種方法可用於 文隻减酸排序。例如，具預期的CDR序列之重鏈或輕鏈序列是 6 201107470 經突變，例如使 人工合成的。較佳為具CDR序列之核酸序列編碼 用隨機-或定點-致突變。 因此’在本發明之具體内财，提供―種抗體或其功能部件 或免疫球蛋白鏈或其功能等同體，其中包括： -重鍵CDR1序列，包含至少70%的序列 (SEQIDNO : 1)序列，和/或 -重鍵CDR2序列’包含至少7〇%的 SINNGNNPYYARSVQY ( SEQ ID NO : 2 )，和/或
-重鏈CDR3序列，包含至少7〇%的 DHPSSGWPTFDS ( SEQ ID NO ： 3 ) 〇 J 等同種抗體或其功能部件或免疫球蛋白鏈或其功能 -輕鏈CDR1序列，包含至少7〇 %的 RASENVGDWLA ( SEQ ID NO : 4 ) ’ 和/或 輕鏈CDR2序列，包含至少70%的序列相 (SEQE)NO:5)，^ -輕鏈CDR3序列，包含至少7〇 %的序 QHYXRFP YT，其中 X 是 ί 或 M ( SEQ N〇 : 6 )。 上述的CDR序列是抗體FI; VH IgHV3 23和VH IgHV3 23， 及其變種的CDR糊。結合化合物包含至少萬糊相同於 序列，特別適合抵制和/或防止金黃色葡萄球菌和/或 表皮葡萄球菌的感染(之影響)。結果表明，F1變種包含呢域加 23和VLIgKVl 5，其中在輕鏈①幻之異亮氨酸修改為蛋氨酸， 仍然能夠特異性結合例如金黃色葡萄義和表皮葡萄球菌之葡萄 球菌。 較佳為’根據本發明有結合約束力的化合物包括其CDR序列 201107470 和第1圖所描繪之CDR序列相同至少75%，較佳為至少80%， ^佳為至少多85%，更佳為至少％%，尤其佳為至少87% ,更尤 ”么為至少88%，特佳為至少89%，而最好為至少90%。最好， ，據發明具有結合約束力的化合物包括一個CDR序列，至少％ %,’、較佳為至少92%，尤佳為至少93%，更佳為至少94%，最好 至少95%相同於第丨圖所描繪之CDR序列。特佳的n抗體，如 上所巧，包括第1圖所描繪之CDR序列。於是本發明之特佳具體 =涵提供一個孤立的、合成或重組抗體或其功能等同體，能g特 /、性結合金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌，而它包括： -重鏈CDR1序列，包含序列rfams (SEQIDNO : 1)，和/ 或 -重鏈CDR2序列，包含序列SINNGNNpYYARSVqY (SEQIDNO : 2)，和/或
-重鍵CDR3序列’包含序列DHPSSGWpTFDS ( s D 3 )和/或 乂
_輕鏈CDR1序列，包含序列RASENVGDWLA (SEQ ID ~〇:4)，和/或 V -輕鏈 CDR2 序列’包含序列 KTSILES ( SEQ ID NO : 5 )， 和/或 -輕鏈CDR3序列，包含序列QHYXRppYT，豆中X是 M (SEOIDNO ： 6^) 〇 ’、 〆 在-具體内财’―種有結合約束力的化合物包括第丨圖所 田繪之重鏈CDR1和CDR2序列’和輕鏈CDR1之和CDR2序 ^ ’或至少70% ’較佳為至少75%，尤佳為至少8〇%，更佳為至 ，，尤其佳為至少82%，更尤其佳為至少84%，最好至少 的序列與之相同。因此’進—步提供孤立的、合成或重組抗 ，或其功能部件或免疫球蛋白鏈或等值的功能體，包括重鍵 R1序列，其至少70%的序列相同於腿燃（seqdnq : d 和重鍵CDR2序列’其至少7〇 %的序列相同於 8 201107470 SINNGNNPYYARSVQY (SEQ ID NO : 2)和輕鏈 CDR1 序列， 其至少70%的序列相同於raSENVGDWLA (SEq ID N〇 : 4) 和輕鏈CDR2序列’其至少70%的序列相同於KTSILES ( SEQ ID NO : 5)。該具有結合約束力的化合物較佳為包含CDR序列，至 少75% ’較佳為至少80% ’尤佳為至少85%，更佳為至少86% ,， 尤其佳為至少87%，更尤其佳為至少88% ,特佳為至少89%，更 特佳為至少90%，更更特佳為至少91%，尤其特佳為至少92%， 尤其更特佳為至少93%，尤其更更特佳為至少94%，最好為至少 95%的序列相同於上述重鏈cdr序列和輕鏈cdr序列。較佳為， 該具有結合約束力的化合物還包括重鏈CDR3序列，其序列至少 70%相同於序列 DHPSSGWPTFDS ( SEQ ID NO : 3 )〔和/或輕鏈 SDR3序列，其序列至少70 %相同於序列QHYXRFPYT，其中X 疋I或M (SEQ ID NO : 6)。也提供具有結合約束力的化合物， 包括上述重鏈CDR卜CDR2和CDR3序列，以及上述輕鏈 CDR1，CDR2 和 CDR3 序列。 —現在，本發明提供能触異性結合8萄_屬的人類抗體， 匕已可能產生免疫球蛋白鏈或其魏等同體，包括至少一種人 白可變區之CDR序列，其特別能對付葡萄球菌屬。因此， 立的、重組或合成免疫球蛋白鏈或其功能等同體， 種能對付__屬之人齡疫球蛋白可變 種i類CDR序列或至少一種序列，其中至少框架ί内 C突變為ίίϊί約束力的效率或穩幻生。這是例如在 約束定性和/或結合 有利:往往是 改善結合約束效率或穩定性。例如藉由二=為 £ 9 201107470 列加以編碼’而使框架序列優化，然後較佳為檢驗 用為框架序列區。較佳為 ίυ吏t體、免疫球蛋白鏈、或同等功能體或其功能部件的免 ϊ 因為這些序狀不太可能包含細胞體改 f寺可能;區的個― •還長：供抗體或其功能部件或免疫球蛋白鏈或其功能等同體， 包含重鏈氨基酸序列，其中至少有70%序列相同於第丨圖所描繪 之序，。這種重鏈序列提供所欲的像F丨抗體的結合約束性。此外曰， 輕鏈氨基酸序列有至少70%相同於第1圖所描繪之序列，且CDR3 異亮氨酸變更為蛋氨酸之輕鏈序列亦提供所需的結合約束性，如 F1抗體和F1的變種所表明者。因此，進一步提供根據發明之抗 體或其功能部件或免疫球蛋白鏈或其功能等同體，具有重鏈序 列’其中至少70%的序列相同於序列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGR
GLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNL RAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO:7) 和/或具有輕鏈序列，其中至少70%的序列相同於序列 DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKA PNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ HYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV，其中 X 是 I 或 M( SEQ ID NO: 8 )。 除上述異亮氨酸輕鏈CDR3被改變為蛋氨酸的變種外，F1抗 體的幾種變體已開發出來。這些變種都能夠結合到金黃色葡萄球 菌物種。根據本發明的抗體變種或其功能部件或免疫球蛋白鏈或 201107470 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPG RGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNN LRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO:9), 和/或序列 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGR GLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNL RAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO:7), 和輕鏈序列 DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKA PNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ HYXRFPYTFGQGTKLEIKRA，其中 X 是 I 或 M (SEQ ID NO:10)， 和/或序列 DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKA PNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ HYXRFPYTFGQGTKVEIKRTV，其中 X 是 I 或 M (SEQ ID NO: 11)， 和/或序列 DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKA PNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ HYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV，其中 X 是 I 或 M(SEQ ID NO:8) &根據發明之抗體或其功能部件或免疫球蛋白鏈或其功能等同 體能特異/生結合蛋白質，包含”絲氨酸、天門冬氨酸，，（以下略為 SD)重複體。絲氨酸_天門冬氨酸重複體（⑽加哪她把哪細， 以下略為？DR’或Sd〇的蛋自質是細胞表面相關的蛋自質，存在 於一些細菌如金黃色葡萄球菌物種中。Sdr蛋白質一般包括氨基末 端^號序，功能域稱為A區，SD重複區，細齡跨=末 曰TG主通，疏水膜跨越域和帶正電的殘基系列。該LPXTG主 題疋針對具有蝴蘇氨酸和甘紐殘基之間的基本相之轉肽酶 201107470 ΐί ΐί ΐίϊί f氏陽性菌細胞壁的肽聚醣。Sdr蛋白質被認為 icifA^Clf.已知的灿蛋白質包括金黃色葡萄球菌 ί t i ♦叢子)（SdrA )，ClfB ( SdrB )，SdrC，咖和 SdrE . 咖，咖和SdrH ’腐生葡萄球菌之Sdrl，凱 曰k森i]姆囷之SdrX，以及馬鞍藤_球菌之SdmaSdrZ。 = 明首選的抗體或其功能部件或免疫球蛋白鏈 體特別能結合金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐 球a，凯普迪森㈣_和馬鞍藤葡萄球菌。較佳為抗體， 或其魏制體或魏部件能結合金黃色葡萄球 fe之 ClfA (SdrA)，ClfB (SdrB)，SdrC，SdrD 和 SdrE，表皮 球菌之SdrF，SdrG和SdrH，腐生葡萄球菌之SdrI，凱普迪森 萄球^之SdrX，以及馬鞍藤葡萄球菌之SdrY及SdrZ。根據本 發明，體、免疫球蛋白鏈或其功能等同體或功能部件的，，抗原決定 部位"(epitope)，包括sdr蛋白質的SD重複體依賴之抗原決定部
位，例如存在於金黃色葡萄球菌ClfA，ClfB，SdrC, SdrD和SdrE ^SD重複體依賴之抗原決定部位。在此SD重複體依賴之抗原決 定部位定義為抗體F1所認知的抗原決定部位，該抗原決定部位需 要至少一部分SD重複體的存在，就例如存在於，但不限於，金黃 色葡萄球菌ClfA，ClfB，SdrC，SdrD和SdrE和表皮葡萄球菌
SdrF ’ SdrG和SdrH中。在一具體内涵中，抗原決定部位包含至 少部分結合之分子，或Sdr蛋白質。這些分子的例子包括，但不 僅限於’氨基酸、肽、蛋白質、糖及糖殘基。在另一項具體内涵 中，該抗原決定部位包括修改的SD重複區。該修改包括，例如， 但不限於，糖基化，醯胺化和/或碟酸化。對此領域之熟悉技藝者 將是明白這兩個具體内涵的結合也是可能的。 因此，本發明提供一種抗體或其功能部件或免疫球蛋白鏈或 其功能等同體、根據發明能夠結合SD重複體依賴之抗原決定部 位。另外提供的一種能夠结合到金黃色葡萄球菌clfA，clfB, SdrC， 12 201107470 和SdrE之抗體或其功能部件或免疫球蛋白鏈或其功能等同 根據本發明進-步提供_結合到㈣球8屬，較佳為金普 菌和/或表皮葡萄球菌和/或腐生葡萄球菌和/或凱普迪森 fc萄球菌和/或馬鞍藤葡萄球菌’尤佳為(耐甲氧苯青黴素之 金黃色葡萄球菌)之-種抗體或其功能部件或免疫球蛋白鏈或盆 能等同體 .八 抗體的缺點疋他們的穩定性(例如在苛刻的條件下)可能會減 少。比如可能會出現去醯胺化而失去醯胺功能基。去醯胺化是一 種蛋白質降解途徑，可能會影響蛋白質的生物功能，並主要發生 在天冬酰胺殘基，並在較低程度上發生在谷氨酰胺殘基。因此在 二本發明之具體内涵中，以另一個氨基酸取代天冬醯胺和谷氨醯 胺，則能防止發明抗體或其功能部件或免疫球蛋白鏈或其功能等 同體之去醯胺化。天冬醯胺較佳為被谷氨醯胺以外的氨基酸取 代，因為去醯胺化可能發生在谷氨醯胺殘基。天冬醯胺之取代較 佳為不大幅影響本發明抗體對抗原之結合親和力。在一具體内涵 中，在重鏈位置53天冬醯胺酸的去醯胺化（編號根據卡貝特氏， 1991年）之防止是以另一個氨基酸取代天冬醯胺。較佳為藉由防 止天冬醯胺酸在53位置去醯胺化，可提升根據發明抗體或其功能 部件或免疫球蛋白鏈或其功能等同體的穩定性。正如例子所示， 儘管該天冬醯胺是坐落在CDR中，並在該位置取代天冬醯胺，並 沒有實質上影響發明抗體或其功能部件或或免疫球蛋白鏈或其功 能等同體的抗原親和力。在重鏈位置53的天冬醯胺較佳為被非谷 氨醯胺之氨基酸取代，尤佳為在該位置的天冬醯胺被絲氨酸替 換。因此，本發明還提供一種根據本發明之抗體或其功能部件或 免疫球蛋白鏈或其功能等同體’其中冬醯胺，較佳為在重鏈位置 53的天冬醯胺’被另一個氨基酸(較佳為絲氨酸)替換。 在一本發明之具體内涵中，一種根據本發明之抗體或其功能 部件或免疫球蛋白鏈或其功能等同體耦合到另一個基團，而形成 13 201107470 抗體藥物的共軛體。根據本發明 白鏈或其魏等Μ，可例如_彳纟疫= :菌減:r止細菌 輕合到抗體以能=團因或=藉”基 或f功能部件ί免疫球蛋白;其功“同體胱ΐίί -酸在$ ^本發明之抗體或其功能部件中納入到 入根據本發明之㈣或其魏等同·特定錄，該位 =體ίΐ功能等同體之折疊，並且不改變抗原之結合或效應ΐ =。因此，本發锻供根據本發明之抗奴其功^疫 ϊίί=ϊ功能等同體’其中至少有—個半胱氨酸以外的氨基 =^=，代^佳為至少兩個非半耽氨酸的氨基酸已被半 具_涵中’至少有—個非半耽氨酸的 ，基酉文係在輕鏈的位置15之_酸，和/或在輕鏈的位置144之丙 氣酉文和/或在輕鏈的位置168之絲氨酸，和/或在輕鏈的位置2〇5 之绳氨酉^，和/或在輕鏈的位置11〇之類氨酸，和/或在重鏈的位置 84之丙氨酸’和/或在重鏈的位置114之丙氨酸，和/或在重鍵的位 置158之丙氨酸’和/或在重鏈的位置172之絲氨酸，尤佳為在輕 鏈的位置205之纈氨酸，和/或在輕鏈的位置11〇之纈氨酸，和/ 或在重鏈的位置114之丙氨酸（編號根據Kabat氏，1991年）。 個熟練的人都會認識到如果取代不影響抗體或其功能等同體之 折疊，且不改變抗原之結合或效應或功能，則重鏈和/或輕鏈的一 種或多種其他氨基酸可被半胱氨酸取代，作為一種替代或補充。 在國際專利申請案 WO2006/034488，W02008/141044， W02009/052249 ’ W02009/012256 > W02009/012268 和 W02009/099728中’描述抗體和反應性半胱氨酸殘基之工程方法 以及適合半胱氨酸工程之氨基酸位置。 201107470 ΐ之輕鏈序列’其中在⑽3中異亮氨酸修改為蛋=:= ,，該結合化合物就越類似於F1抗體。根據發::u 能部件或免疫球蛋自鏈或其魏等同驗 &s ^ %，最好為至少95%相同於第佳為至少％ 列，或CDR3中異亮氨酸修改為蛋氨酸第曰H列^輕鏈序 土一具體内财’提供-種抗體或其功能ϊ附it之二鍵二: 3 鏈或輕鏈序列，同時保持具有所欲 ΪΓ f為’生成__之重鏈或輕鏈，和原來的重 二早i 早鏈抗體或奈米抗體或—體式抗體i 八如^體片'^又。因此也提供—種抗體的魏部件，包括至少一部 牛？戈⑽中異亮氨酸修改i 201107470 70%相同於第丨圖所描繪之重鏈CDR1序列和至少
/ΰ相同於第1圖所描纟會之輕鏈cj)R3序列， 鏈CDR3 ’其中異亮氨酸修改為蛋氨酸。 ^ y” 和至少 7。 或第1圖所描緣之輕 *本發_提供-種具至少15個核微，較佳為至少3 苷酸，尤佳為至少50個核苷酸，最好為至少75個核苷酸長度之 孤立、合成或重組的核酸序列或或其功能等同體，其編碼本發明 具有結合約束力的化合物。這種核酸是例如從B細胞分離出^， 其能夠產生根據發明之抗體。一較佳的具體内涵提供核酸序列， 包含至少70%序列相同於第丨圖所描繪之核酸序列中至少15個核 苷酸。根據本發明之核酸序列較佳為包括一序列，其中至少75%二 較佳為至少80%，尤佳為至少85%，更佳為至少90%，最好為至 少95%的序列相同於第丨圖所描繪之核酸序列中至少15個核苷 酸。較佳為，該第1圖所描緣之核酸序列包括至少一個Cdr(互補 決定區)的編碼序列。 一較佳的具體内涵提供一種孤立、合成或重組的長度至少有 15個核苷酸之核酸序列，或其功能等同體，具至少有一種根據本 發明抗體或免疫球蛋白鏈的CDR(互補決定區)序列的編碼。較佳 為該核酸序列編碼序列至少有一個CDR具有至少70%序列相同 於F1抗體的CDR(互補決定區）邛1 CDR(互補決定區)編碼的核酸 序列描繪在第1圖。因此，進一步提供一種孤立、合成或重組之 核酸序列，或其功能等同體，其中至少70%序列相同於一組序列 選自 cgctttgccatgagc(SEQIDNO:12)， tcgatcaataatgggaataacccatactacgcacggtcggtacaatac (SEQ ID NO: 13), gatcaccctagtagtggctggcccacctttgactcc (SEQ ID NO: 14), cgggccagtgaaaacgttggtgactggttggcc (SEQ ID NO: 15), 16 201107470 aagacatctattctagaaagt(SEQIDNO:16)和 caacactatatacgtttcccgtacact (SEQ ID NO: 17) ° 該核酸序列或其功能等同體較佳為包括一個序列，至少75 % ’較佳為至少80%，尤佳為至少85%，最好為至少90%相同於 任何上述序列。此外還提供一個核酸序列或其功能等同體，包括 一個序列，至少70%相同於至少部分第1圖所描繪核苷酸序列， 該部分至少具15個核苷酸和至少有一個CDR(互補決定區)之編 碼。 根據本發明之核酸序列或其功能等同體較佳為具有至少70% 序列相同於FI CDR(互補決定區）、F1重鏈和/或F1輕鏈之編碼 區。一具體内涵提供一種孤立、合成或重組的核酸序列，其功能 等同體’包括氨基酸編碼的序列，其中至少有70%的序列相同於 序列RFAMS (SEQ ID ΝΟ:1)，和/或至少70%的序列相同於序列 SINNGNNPYYARSVQY (SEQ ID NO : 2)，和/或至少 70%的序 列相同於序列DHPSSGWPTFDS (SEQIDNO : 3),和/或至少70 %序列相同於序列RASENVGDWLA (SEQ ID NO : 4)，和/或至 少70%序列相同於序列KTSILES (SEQ ID NO : 5)，和/或至少 70%序列相同於序列QHYXRFPYT，其中X是I或M (SEQ ID NO : 6 )，和/或至少70 %序列相同於序列 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGR GLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNL RAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS ( SEQ ID NO : 7 )，和/或至少70 %序列相同於該序列 DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKA PNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ HYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV，其中 X 是 I 或 M ( SEQ ID NO : 8)。另外提供核酸序列或其功能等同體，具根據發明F1抗體變體 的編碼。本發明所提供的是’例如，具重鏈序列編碼的核酸序列， 17 201107470 包 含序列 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPG RGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNN LRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO:9) ， 和 / 或序列 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGR GLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNL RAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO:7)，和具輕鏈序列編碼的核酸序列包含序列 DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKA PNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ HYXRFPYTFGQGTKLEIKRA, wherein X is I of M (SEQ ID NO: 10) ’ 和 / 或序列 DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKA PNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ HYXRFPYTFGQGTKVEIKRTV ’ 其中 X 是 j 或 M(SEq ID NO:ll) ’ 和 / 或序列
DIQLTQ SP S ALPA S V GDRV SIT CRASEN V GD WL AWYRQKPGKA PNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ HYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV，其中 X 是 i 或 m ( SEQ ID NO : 8) ° 在一具體内涵中’於重鏈位置53之天冬醯胺（編號根據Kabat 氏，1991年）被另一個谷氨醯胺以外的氨基酸替換，以防止在該 天冬醯胺的去醯胺化。較佳為該天冬醯胺被絲氨酸替換。 這裡術語“％序列相同”是指在對準兩個序列和引進的差距 後，候選核酸氨基酸殘留物相同於參考序列的百分比，如有必要， 須達到最大百分之相醉。鮮之方法和計算機程序是文獻上眾 201107470 如此處使用，本發明核酸分子或核酸序列較佳為包括核苷酸 鏈，更好為DNA(Deoxyribonucleic acid :脫氧核糖核酸)和/或 RNA(Ribonudeicacid :核糖核酸）。在另一具體内涵中，本發明核 酸分子或核酸序列包括其他種類的核酸結構，比如DNA/RNA螺 旋，肽核酸（PNA) ’鎖核酸（LNA)和/或一個核酶。這些其他核 酸結構被稱為核酸序列的功能等同體。所謂“核酸序列的功能等 同體”還包括和自然核苷酸同樣功能的非天然核苷酸、修改核苷 酸和/或非核苷酸構成要素之鏈。 根據本發明的核酸序列是特別有用的，可產生具有結合約束 力的化合物，特別能對付金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌。舉 例來說，這是藉由引進這樣的核酸序列進入細胞，使細胞的核酸 翻譯機產生編碼的結合性化合物。在一具體内涵中，基因編碼本 發明之重鏈和/或輕鏈均以所謂生產者細胞，比如中國倉鼠卵巢 (CHO) ’ NSO (小鼠骨髓瘤）或293 (τ)的細胞系表達，其中 有些疋適應商業化抗體之生產。該生產者細胞增殖的結果形成能 夠生產據本發明之抗體或其功能部件的生產者細胞系。較佳為， 該生子者細胞系適用於生產人類使用之化合物。因此，該生產者 細胞系較佳為不含致病劑，如致病微生物。最好，具人類序列之 結合性化合物是依照本發明藉核酸序列產生。 、因此，根據本發明還提供一種能夠產生抗體或其功能部件或 免疫球蛋白鏈或其功能等同體的孤立或重組抗體之細胞，以及生 產本發明^體或其魏部件或免疫球蛋自鏈或其魏制體的方 =，包括提供一種根據本發明具核酸序列或其功能等同體之細 胞，及根據本發明讓該細胞轉化該核酸序列或其功能等同體，從 =產生本發明之抗體或其魏部件或免疫球蛋白鏈或其功能等同 體0 201107470 和/或有犯力發展成為—種能夠生產和/或分泌 為-個細胞。—種根據本發明生成抗體之細胞較佳 :!HSE;==:=蛋：: 之額外=======在任意 體特能部件或免疫球蛋_或其功能等同 ^ Aiiii ：ίί ； 麵。賴，雜品可齡根據本發= 二： 的方法自樣口口刀離出來，例如，但不限於， 2珠分離或藉由使賴定在圓柱之次級抗體分離。結合之2 ^几體，免疫球蛋自鏈或其魏等同體或魏部件經清洗後 ^文獻上任何已知的方法，細菌可以從該抗體，免疫球蛋白鍵^ 或功能部件洗脫。例如，細菌和抗體， 20 201107470 金黃色葡萄球菌(較佳為金黃色 .的分離，可用於各種應用。例如: 或表皮葡萄球菌) 可能會導賴體纽重疊錄。在義感染， 黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球下’可能難以區分金 明之抗體或其功能部件或免疫球蛋白、陽性菌。根據本發 檢測金黃色葡萄球菌和/或Ϊ皮葡體可以用來 萄球菌和/或表皮葡萄球菌及其他細菌“田菌分fi色葡 萄球菌和/或表皮葡萄補或任何1他來金更色葡 成该金貰色to萄球g濃度增加和/或純度更高。㈣u马刀離& 較佳為金黃色_⑽和/或表皮賴球菌， 尤 素之金黃色葡萄球_分離，例如可以 f步用來鑑別樣品中特定的金黃色葡萄球菌和/ 株。該菌株之鑑別可^_ =¾葡情況下’較佳為先取得分“金黃色葡 細々i—本發明之具咖涵中，根據本發明之抗體或免疫球蛋白 =或其功能等同體或功能部件可加以標記(但不限於熒光標記，或 射性標記）’以便例如能夠偵測該抗體或免疫球蛋白鏈或其功能 ^同體或功能部件。另外，使用標記次級抗體偵測本發明之抗體 ，其功能部件錢疫球蛋自鏈或其功鮮同體，該標記次級抗體 】針對本發明之抗體或免疫球蛋白鏈或其功能等同體或功能部 件。如果偵測該抗體或免疫球蛋白鏈或其功能等同體或功能部件 之結合約束力’可發現金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌之存在。 因此本發明提供使用根據本發明之抗體或其功能部件或免疫 1蛋，鏈或其功能等同體診斷金黃色葡萄球菌的感染，較佳為金 汽色葡萄球菌的感染，尤佳為MRSA的感染，並檢測金黃色葡萄
S 21 201107470 或表皮葡萄球菌’較佳為歐认，並區分金黃色葡萄 ϋίϊί皮葡萄球菌，較佳為和其他革蘭氏陽性菌。另 蓉η ^ ^康本發明之抗體或其功能部件或免疫球蛋白鏈或其功能 感染’較佳為金黃色*峨 白鏈ΐ⑦艮5本發明之抗體或其功能部件或免疫球蛋 功食 白鍵或其功能等同體’使得本發明之抗體或其 葡萄球其功能等同體能結合於存在之金黃色 球菌細菌’和使結合於本發明之抗體或其 皮葡萄球鏈或其功能等同體金黃色葡萄球菌和/或表 核酸明之革蘭氏陽性菌特異性結合化合物和 2^亍。本發明之革蘭氏陽性菌特異性結合“ =據本發 =====用作藥物和，或預防劑當= 或其功能部件。該_或預防输 抗體F卜 金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌的感染或抵制或至=== 22 201107470 根據本判之抗體或其魏部件或免疫球蛋白硬w 或核酸序列或其功能_體’用作藥物和/或預防}， ，治療和/，預防金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球 炎非:m例子有皮膚感染、粉刺、膿皰病、癤、蜂寫 、、且織炎、毛敎、翻、癰、费傷皮膚綜合症、_蜂】 叫膜炎、令毒性休克综合徵候和敗血症^南 進一 鏈或其功能 至少 ίϋί ⑽炎、$毒性休克综合徵候和敗血症。較佳 制it少部分阻止金黃色葡萄球菌感染。最好為抵制降 部分阻止MRSA錢。因此亦提供根據本發明之U 免?球蛋白鏈或其功能等同體或核酸序列或其功能 “ M 為賴和/或獅劑，至少在部分治療和/或預ί方全黃 菌和/或表皮葡萄球菌之感染，以及提供方法^方^ 防金黃色葡萄球_或表皮_ ^ =便而要的個人顧有效治療㈣本發明之抗 ίΐ疫ΐ蛋白鏈或其功能等同體。該徵候較佳為至少ί括^列 出的金黃色葡萄球菌有關之徵候，最好是嫩 抗體較佳為抗體Π，或其功能部件。疋縱SA的有關徵候。該 為了對付革蘭氏陽性g，較佳為 力的化合物。或是，使已感_3== 二匕染危險。本發明具有結合約束力 =匕口物&佳為错由-次或多次注射施用。本锋人 療f用之劑量範圍係基於具的臨 ίί ΐΐ 床研究。典型的劑量為αι和1〇毫克/每公斤 可接具有齡約束力化合物的絲朗itt_藥學上 匙孔:合適的載體例子包括例如鑰 蛋白（KLH) ’血以蛋白（如牛血清白蛋白或RSA)和
S 23 201107470 液在—較麵具體内财，該合適的龍包括例如生理 編碼。f如J中服結合約束力化合物使用核酸 東力的化合物。所人體會製造具有結合約 或對抗革蘭氏陽性細菌感染和預防和/ fr佳為用於㉗同= 的核酸相或其魏進—步提供本發明 部分治療和/或防止革1氏㈣氣和/或預防劑之應用，至少 佳為金黃色葡萄球菌的感染，最好為MRsig^困的感I尤 白鏈或其功功能部件或免疫球蛋 類使用。 成亥樂劑組成物較佳為適合人 【實施方式】 這些實施例並不限制 他出版物均可供所有 玆以下面的實施例進一步解釋本發明。 本發明的範圍，而只是有助於明瞭本發明。 在此詳細引述之所有專利文件和其 目的納入參考。 實施例1 方法 24 201107470 B細胞分離 B細胞係採用費苛爾(Fic〇ll)分離法及CD4/CD8具微珠之 陰性選擇法(參閱製造商-米爾泰尼生物技術公司所描述的說明）， 自成年人的新鮮血液取得。要獲取記憶B細胞，細胞分類為 CD 19+CD3:CD27+IgmgA-型/FACSaria (Becton
Dickinson公司）。這些組織的使用已被醫療機構倫理委員會 批准，並在知情的情況而同意。根據醫院欲獲得具基因型群組 109和16之MRSA菌株而選擇捐血者。 細胞培養 採用50奈克/毫升之保持在含imdm培養液（Gibco公司）， 8%胎牛血清（HyClone公司）和青黴素/鏈黴素（羅氏公司）之 標準培養基的B細胞，該B細胞係在γ-照射（5〇Gy)穩定表達 CD40L (CD40L- L細胞，1〇5個細胞/毫升）之小鼠l纖維原細 胞和重組小鼠IL-21 (25奈克/毫升，研發系統）上共培養。細胞 進行常規的PCR檢測’被發現在支原體和EBV (數據未顯示）存 在下呈陰性。 批量轉導人類記憶B細胞雙陽性NGFR和GFP用 FACS(fluorescent actived cell sortor :螢光激活細胞分類器）進行純 化，和在96孔板培養，細胞密度為每孔500個細胞。在ELISA(酶 聯免疫吸附試驗)儀測試培養基上清液，使用紐曼株和SH1000株 之溶菌產物。陽性培養基進行細胞株的次株化，在96孔板培養， 細胞密度為每孔10個細胞，亦用ELISA(酶聯免疫吸附試驗)儀測 試。隨後在每孔接種1個陽性培養基細胞，並用ELISA儀測試其 對金黃色葡萄球菌株紐曼和SH1000的反應性。 逆轉錄病毒轉換作用(Retroviral transduction) 以往已有記載BCL6逆轉錄病毒結構（參閱Shvarts A等氏， 基因開發 16 期，681-686 頁（2002 年））。Stanley Korsmeyer 博士
S 25 201107470 熱心提供cDNA(互補DNA)基因編碼人類Bcl-xL。BCL6和Bel -xL分別無性繁殖(clone)成為BCL6 - NGFR和BclxL - GFP的結 構。以往已有記載這些結構基因轉染成逆轉錄病毒包裝細胞 LZRS (參閱 Jaleco A.C.等氏，血液 94 期，2637〜2646 期（1999 年）；ScheerenF.A.氏’自然免疫 6 期，303-313 期（2005 年））。 文獻上有記載在rmlLJl存在下，於CD40L-L細胞上激活後，藉 由$ BCL6和Bcl-xL之逆轉錄病毒，使記憶性B_細胞雙轉換36 小時（參閱Diehl S.A.等氏，免疫學期刊，丨80期，48〇5_48 i 5頁（2008 年）；Kwakkenbos M.等氏 ’ Nat Med 新聞（2009 年））。藉由 rmIL-21，使轉換細胞保持在CD4〇L_L細胞上。 ELISA(酶聯免疫吸附試驗)儀 ，了確定抗體含量’在37〇C或4°C使5微克/毫升在PBS(構 酸鹽緩衝液)中之抗人體IgG (傑克遜免疫研究實驗室）
塗 ELISA 板上1小時，和在ELISA儀中以洗滌緩衝液（磷酸鹽緩衝液，〇 5 %IWeen_20-一種聚山梨酯界面活性劑）洗滌。在細胞培養基上 層清液連續稀釋和添加酶-共軛檢測抗體[1:25〇〇稀釋的HRp(辣根 =化物酶)·共輛抗-IgG (傑克遜公司）]之前，4%在繼鹽緩衝 f中之牛奶被用來作為阻斷劑。TMB基板/中止溶液（Bioso刪 么司）用於發展ELISA(酶聯免疫吸附試驗)試法。 為篩選之目的，我們用得自紐曼株和SH1〇〇〇株之溶菌產物。 鱗酸鹽緩衝液中製造，並在B細胞培養基上層清液進行 和/或1:?稀釋之前’直接以5至1〇微克，毫升之濃度塗佈。 谜辟H探討讀购紐繁殖F1 原㈣性，· LTA(脂 菌、枯EUSA法。在加入次級抗體前，使由金黃色葡萄球 m製劑加人塗有多無性繁殖的鼠抗_瓜（1 / ^十所 笔克/氅升，QED生命科學公司）之EUSA板。 26 201107470 (生=究法測試幾個源於菲舍爾開發之庫藏 (VU，阿姆浙姓且鬧—根大予，德國）’及由aAPPelmelk公司 R.等氏，提供的LTA製劑，[詳情見（Keller V.Y ^ 5 6〇 W ? 3664-3672 ^ ( 1992 ^ ) ； Polotsky • 期刊，64 期，380-383 頁（1996 年）和 (19^3 氏 ’ 期刊 ’ 64 期，3318_332 頁 6期，m缝（WeidenmaierC.等氏，國家微生物學綜述， 昭;從頁（2008年）]。在加入rF1⑽微克/毫升）或對 釋之雜交瘤細胞上層清液）並進一步以抗人類或鼠 之前’塗佈LTA 1微克/毫升製劑。純化LTA製劑盤 3、錐抱才旱菌、金黃色葡萄球菌、乳酸乳球菌、格氏乳球 Ξ、ί歧桿菌、米球菌、乳酸桿菌、腸膜明串珠菌、地衣芽孢桿 —ί 爾斯李斯特氏菌、小腸腸球菌、棉子糖乳球菌、變形鏈球 ，口肺炎鏈球g。幾㈣齡有或缺乏丙紐殘基和/或脂質側鏈 Cil裡不描述）。 F1抗體對細菌培養基的結合約束力 =+使用紐曼金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌株（血清型3)。使紐 ，菌株培養於50毫升的TSH(0/N)，然後取1毫升再懸浮於100 毫升中歷2至2.5小時，至〇d :卜其後收集細菌。肺炎鏈球菌 培養於托德休伊特介質與酵母之混合介質中。在此之前，細菌與 F1抗體’對照IgG (D25，一種人類抗·呼吸道合體細胞病毒抗體） 一起培養’或僅與次級抗體（IgG_PE)培養，細胞以100%總小鼠 血清進行預處理，以防止背景染色。洗滌後加入次級抗體 (IgG-PE)。抗體在冰上孵育2〇分鐘。 F1序列測定和無性繁殖表達 我們用Trizol試劑（Invitrogen公司）提取總RNA(核糖核酸)’ 用上標RT生成cDNA，進行PCR和複製重鏈和輕鏈可變區到 27 201107470 PCR2.1 ΤΑ無性繁殖載體（Invitrogen公司）。為了排除逆轉錄酶或 DNA聚合酶引起的突變，我們進行一些獨立的無性繁殖實驗。為 了產生重組抗體FI mAb，我們在人體igGl和Kappa恆定區框架 結構中複製重鏈和輕鏈可變區成為pcDNA3.i (invitrogen公司） 系載體，瞬時轉染293T細胞。我們藉由蛋白質a從培養基上層产 液純化重組的F1。 曰m 結果 F1無性繁殖的產生 從三個對MRSA(耐甲氧笨青黴素之金黃色葡萄球菌）呈陽性 但未生病者收集50〜60毫升肝素血液，和採用費柯爾（Fic〇u)吨化 步驟後，分離外周B細胞中。從幾個B細胞群中取出之B細胞萨 由含BCL6 _ NGFR和Bel - XL的逆轉錄病毒（Diehl等^ Kwakkenbos等氏）雙轉導。從對IgG，CD27呈陽性群開始^ 板(細胞密度為個/孔）小型培養基多無性繁殖B細胞培 °收集這些*型培養基上層清液，使用於ELISA言式驗，以^ 、存在之金黃色葡萄球菌特異性IgG抗體f在这此pt tqa
LTA |^f殖系培養基上層清液巾抗體結合於由金黃色葡萄球菌
我們已經發現F1的上層清液 萄球菌細胞的溶解液。革蘭氏 28 201107470 =生菌主要細賴化合物是LTA(脂龜酸），因此，我們決定在 法中測試？1上層清液對金黃色葡萄球菌LTA製劑之結合 ί 2 1ΐ表1所示，F1無性繁絲上層清液結合於S·⑻和 =的金4㈣球細胞溶解液，而且也能結合於商業 =黃色葡萄球菌LTA製劑。然而，我們注意到，對LTA 製;=il之、纟α δ約束力明顯低於整個細菌所觀察之結合約束力。 Ϊ L I1無性繁殖系上層清液結合於金黃色㈣球菌LTA製劑 之抗减病毒抗^ 爾…、物疋”檢
重組所製之F1抗體結合於從多種來源的LTa製劑 抗體基目經過無性繁_表達介體 if ’以該奶抗體測試來自 酸菌和化膿性鏈球菌的LTAfta、穩固地結合於得自乳 炎鏈球菌的LTAi 口?r 1抗體沒有結合到得自肺 桿菌’地衣芽孢桿g和兩株分離 、^_自，卓牙孢 從乳酉^球菌格Γ 於從變形鍵球g (第犯圖）★ 腸膜明串珠菌、威氏利斯特菌二囷微球“轉菌' 菌和肺炎鏈_之LTA^糖«菌、變形鍵球
S 29 201107470 重組的F1抗體結合於活生之金黃色葡萄球菌細菌 為了研究是否rFl抗體也認得活生之革蘭氏陽性菌，藉由流 式細胞儀檢測流式細胞儀檢測rFl抗體對金黃色葡萄球菌和肺炎 鏈球菌的結合約束力。如第3A圖所示，rFi抗體能結合於活生 金黃色葡萄球菌細菌（紐曼株），而不是肺炎鏈球菌。此外，我們 還表明rFl認得6種臨床金黃色葡萄球菌分離株；其一是p%陽 性之致病株，3種普通株和2種MRSA菌株（第3B圖）。 實施例2 方法 細菌菌株和培養基
而:甲严青黴素之金黃色㈣_ (MRSA) _株·usa3〇〇 (1114 )、USA400、N315、USA卿、USA1_、c〇L 苯Γ素敏感之金黃色葡萄球菌（職）菌株韻 :、貝克爾、史密斯擴散、_8和萬古黴素中介敏感（VISAf 株Mu50，都是從耐藥性金黃色葡萄球 ^ 株ί ί和羅森巴赫得自ATcc。表皮葡萄=^芽 得自ATCC。細菌生長在’，姨蛋白酶大$，自：^ 37°C輔以5%羊血18小時。就靜拉盖=\CTSA)板上’在 落接種於胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)u 板:單：菌 步經歷不二, τ_靖物養基，進- rFl結合於體外生長的整個 衝鹽溶液（HBSS)清洗，敝之漢克氏緩 和一肝素納’一⑽S液;' 30 201107470 心20分鐘。在630奈米讀取光密度，以估計細菌濃度。使2〇χΐ〇8 CFU(菌落形成單位)/毫升在冊(血紅蛋白)緩衝液中細菌懸浮液混 合，體積通克/毫升兔IgG (Sigma公司），並在室溫（RT) 孵月1小日守以阻止非特異性IgG之結合。加入初級抗體(包括 和人類IgGl同型對照)使最終濃度為2微克/毫米，在室溫孵育這 些化合物15分鐘。經過hb(血紅蛋白)緩衝液洗兩次後，使細菌顆 粒再抗人體IgG二次抗體（傑克遜免疫研究所）溶液 中，並室溫孵育15分鐘。這種細菌用PBS(磷酸鹽緩衝液)清洗兩 二人，和1%多聚甲酿再懸浮於pBS，並作流式細胞法分析。 以熒光激活細胞分類器分析rF1對感染組織整個細菌的結合 為分析抗體對感染组織之細菌的結合’用pBS(磷酸鹽緩衝 液)洗滌TSB(胰蛋白酶大豆肉湯)中USA300之次培養基4小時。 小鼠靜脈注射10P微升USA300/PBS(磷酸鹽緩衝液)懸浮液，估計 濃度為10xl08CFU(菌落形成單位)/毫升。三天後，收集腎臟、肝 臟和肺’並用錐形組織研磨管（VWR公司）均化。若有加註，則 在不同的感染時間點收集器官。為溶解小鼠細胞，使勻漿在室溫 於含0.1%Triton- X100(—種非離子界面活性劑，Therm〇公司）， 10微克/毫升DNAsel (羅氏公司）和完全迷你蛋白酶抑製劑雞 尾酒（羅氏公司）之PBS(鱗酸鹽緩衝液)中孵育1〇分鐘，並通過 一 40微米過濾器（Falcon公司）。用PBS洗細胞懸液兩次，並在 HB(血紅蛋白)緩衝液中再懸浮，混合等體積之600微克/毫升的人 體IgG (Sigma公司）’並在室溫孵育1小時。加入包括rFl和人 體IgGl同型對照之初混合物，使得最終濃度為2微克/毫升。為
了區分得自小鼠器官殘骸之細菌，加入兔IgG抗-金黃色葡萄球 菌（Abeam公司），濃度為2〇微克/毫升。在室溫孵化15分鐘後， 以HB(血紅蛋白)緩衝液洗細胞兩次，並再懸浮於抗人體IgG和抗 兔IgG次抗體的混合物中，每一個均加不同的熒光染料（傑克遜 免疫研究所）作標記。經過用PBS(鱗酸鹽緩衝液)洗滌兩次，細胞 再懸浮於具2%多聚甲醛之pbs，和流式細胞儀分析。藉由兔1gG
S 31 201107470 而 結果 rFl強力結合至14株金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌 測試rFl抗體結合於七種财甲氧苯青黴素 (MRSA”株 '六種對甲氧苯青黴素敏感之金黃 JMSSA)—囷株、—種對萬古黴素中間體敏感的金黃色玻= (VISA)菌株、表皮葡萄球菌和其他一些革蘭六 如圖4所示^強烈結合於所有14種金黃_^= ，；)和表，葡萄球菌（第4B圖〉菌株，但沒有結合 陽性物種（第4B圖）。 他皁蘭氏 於ϋΐ長階段的MRSA及從體内感染的MRSA(耐甲氧 苯青黴素之金黃色葡萄球菌） I T氧 防止rF1結合於兩個不同的組織中的細菌及 天後腎臟、肝臟和肺組織分離出來之細菌，並發現其對 分離出來之細菌有穩定的結合能力，感染後2，3和 &
約束細菌。 八“b、、OS 測試rFl抗體對不同生長階段_即在TSB(騰蛋白酶大 期（2小時）和後指㈣長（8树）的廳SA (耐甲軋本月黴素之金黃色葡萄球菌-USA300菌株）之結人食匕 ^ ’及在TSA(胰蛋白酶大豆瓊脂)板上堅實菌落生長情形。“ 示rFl強烈結合到所測試之所有生長階段的細菌（第5a圖^。，、’、 —在小鼠系統感染MRSA (耐甲氧苯青黴素之金黃色葡萄球菌） 三天後’取出小鼠腎臟钱’測試rF1抗體對錢到整個 MRSA (USA300 8株）細菌之結合能力。如第5B圖所示:奶 32 201107470 =)合於自感染組織取得的通从(耐甲氧苯青徽素之金黃色葡萄 實施例3 ^步的實驗來確定rF1抗體結合約束抗原決定部位 力。雖“已觀察到對LTA(脂磷壁酸)製劑之結合約束力（例如 =1)，但結合約束力不盡如人意，移結合輕個細菌 見 暗示rFl可能參與結合另一抗原決定部位。 刀 方法 ϊίί 菌、表皮葡萄球菌和商業化wta製劑之細胞壁溶 解液的免疫沉藏，免疫印跡和質譜 得自W〇〇d®46金黃色葡萄球菌菌株（生物設計部/子 命科學公司，緬因州）之40微克商業化壁鱗垣酸(wta)製劑 分成兩部分，並藉由丨微克/毫升rF1或同型對照人類抗體，使之 免疫沉殿。以蛋白質A/GUltralink樹脂（皮爾斯公司）抓參 ^ =樣品進行處理-使用50mM(mM毫摩爾濃度)二硫蘇^醇， ^ 8%他⑧（三基）氨基甲烧)_甘氨酸 凝膠’隨後以rFl作免疫印跡。 f 37 C利用削^克/毫升的溶葡球菌酶在戰棉子糖緩衝 ，中處理轉基3G分鐘，麟細賴在20 ί升隔夜USA3〇〇金 黃色葡萄球菌菌株培養基（40毫克細胞顆粒/毫升）製 細田胞壁製劑，稀釋至10毫升_解二 月曰糖（西格瑪公司）培養兩次，盡量從細胞壁製 最後細胞壁製劑分為兩部分，以i微克/亳升rF1j:ga貝^類 ，體作免疫沉澱。以蛋白質A/GUltralink樹脂（皮爾斯）獲取的 抗體。然後樣品進行處理-使用50mM二硫蘇糖醇，1〇mM 2_減乙 醯胺和8% Tris-甘氨酸凝膠，隨後銀染或以汗丨作免产印跡。
S 33 201107470 過夜培4紅溶解_備係在 =稀釋到，。毫二為之兩 ㈣樹脂（皮爾斯 和桃Tris •甘氨雜膠，隨 1;^^作 考二預製的sds page迷你凝膠和溶解蛋白質，並用 、疑二』ϊ _assie Biue) ’以便作蛋白質體分析。切除得自 法，利用、、曰人綠 、、、e反相液相層析-奈米級電噴霧串聯質譜 給數^檢ί =11司）進行分析。_聯質譜法結果提交 析。 索精由σ祥物(Mascot)軟體（矩陣科學公司）加以分 =不為金黃色和场桿狀絲⑽猶目子姻表 因子⑽之金黃色㈣球錄達：該”聚叢 主吒士 ί㈤基因係擴增自USA300基因組DNA的LPXTG n謹序列編碼之信號序列之PCR(聚合
==f^PXTG主題的最後機到⑽U 結公司之pSAS10)。然後使由此產生的 t電牙孔於金汽色响球菌WT腦220。從隔夜培養基（起 :600值0·15)接種20毫升無論是電穿孔RN4220或RN4220 ^不攜Φ —表達載體）的培養基，在姨蛋白酶大豆肉湯（tsb ) 、壷1小時’然後以脫水四環素（2〇〇奈克/毫升）誘導蛋白質表 達小時。在誘導期結束時，金黃色葡萄球菌培養基藉由溶葡球 34 201107470 菌酶（50微克/毫升）預溶解，然後再於溶解緩衝液（15〇 mM氣 化納’ 2〇mMTris pH值π ’ 1% trit〇n_x(一種非離子界面活性 劑)矛:無EDTA之羅氏蛋白酶抑製劑鍵片）中，以珠擊溶解。然後 在4 °C於10 mM的咪唑的存在下，用NiNta樹脂（Qiagen公司） 培養清淨之溶解液1小時，以便下拉重組〇比八蛋白質。
His(六聚組氨酸)-標籤Clfa的大腸桿菌表達： 該:聚叢因子-A ’’（clfA)基因係擴增自USA300基因組DNA的 C-放LPXTG主題中甘氨酸序列編碼之N_款信號序列（以蛋氨酸 開始）+之PCR(聚合酶鏈反應）。然後擴增的pCR產物藉由c _端 His標籤在框架中結紮於pET逃⑴大腸桿菌表賴體（N〇琴n 公司）。由此產生的結構轉化成大腸桿菌BL21-金（DE3)活性細 胞（Stratagene公司）和根據製造商的指示，藉由IpTG(異丙基硫 代士乳糖#)料蛋自表達3.5树。料的大腸桿*培養基於溶
解緩衝液（150 mM 氯化鈉，2〇mM Tris pH 值 7.5，1% triton-X ，無EDTA之羅氏蛋白酶抑製劑鍵片）中，以珠擊溶解。然後在4 °C = 10 mM的咪唑的存在下，用NiNta樹脂（⑶吨⑶公司）培 養清淨之；谷解液1小時，以便下拉重組蛋白質。 ，示為大腸桿紅聽㈣的表達並⑽黃色葡萄㈣溶解液培 養 在大腸桿菌中金黃色葡萄球菌細胞表面SDR蛋白質clfA， ClfB，SdrC，SdrD，SdrE 的表達和純化；該 QfA，clfB，S(irC， SdrD和SdrE基因係擴增自USA300基因组DNA的LPXTG主 題中甘減相蛋自質_絲編碼之錢序狀pCR(聚合酶 鏈反，），和藉由N ·末端Unizyme標籤於ST239介體（(}_滅 ^司結紮在框架内。該結構轉化成大腸棚則（伽⑶她 么司）’誘導蛋白質表達和其後加以純化。
NiNta樹脂捕捉NT Unizyme標籤之SDR蛋白f : 微克純化 £ 35 201107470 末端Unizyme 標鐵之SDR 蛋白質（cifA，clffi，sdrC, sdrD， r),稀釋於含有蛋白酶抑製劑（無EDTA)之PBS(填酸鹽緩衝 =)’並在4°C以NiNta樹脂（Qiagen公司）培養1.5小時。然 ίί捕獲的Unizyme標籤SDR (絲氨酸-天門冬氨酸重複體)蛋 &貝之NiNta樹脂用洗滌緩衝液（5〇 _的磷酸二氫鈉，3〇〇mM 氣化鈉;pH值8.0)清洗一次。 藉由金黃^色葡萄球菌溶解液使大腸桿菌所生產的SDR蛋白 、改性· 25毫升培養基先從APan Sdr突變體（ClfA - ClfB -S^rC^E空；添福斯特，都柏林三一學院之禮品）及紐曼金黃色葡 ^球菌（起始OD_值〇.15)通宵培養，並在37〇c及2〇〇轉/分 鐘之條件下’於TSB(胰蛋白酶大豆肉湯)中生長3小時（指數相）。 然^該指數相培養基再在懸浮於1毫升pBS，並在37°C於250 位的笨酮酶核酸（Novagen公司）存在下，以200微克/毫升 溶葡球菌酶溶解30分鐘。於4〇C用微型離心機以最大速度旋轉 =分鐘，使該溶解物清除碎片。NiNta樹脂抓獲之大腸桿菌蛋白 質在37°C藉由清淨化处肋sdr突變體金黃色葡萄球菌溶解液進 行孵育1小時，進行改性。
改性大腸桿菌SDR蛋白質之免疫印跡：然後未改性或改性之 NjNta樹脂抓獲大腸桿菌SDR蛋白質樣本，用洗滌緩衝液(5〇 mM 磷酸二氫鈉’ 300mM氣化納，1〇 mM咪嗤，pH值8.0)洗三次， 準備作免疫印跡’並在8% Tris甘氨酸凝膠（Invitrogen公司）上 操作。免疫印跡以rFl抗體或抗Unizyme抗體（Genentech公司） 抹除。 SDR(絲風酸-天門冬氨酸重複體)域作為抗原以識別rFi MBP-SD結構之金黃色葡萄球菌表達：”麥芽糖結合蛋白質，, (MBP)基因藉由pMAL - c5x載體（新英格蘭生物實驗所[略為 36 201107470 伊普斯維奇’刺’翻）從__開崎成熟蛋自質序列編 碼’直到FactorXa裂解位點序列編碼，而以pcR擴增。 合成不同長度的C _末端His·標籤SD (SD SDS D SDSD，SDSDS, SDSDSD)成為單鏈寡核聽，並退得 雙鍵DNA。C1fA基因之Sdr區係從Sdr區開始（56〇D) 碼的PCR(聚合酶鏈反應)擴增，其中包括SD區之618a戋邛兇 序列編碼，其次由各自的質體基因pTet clfA sD^8A pTet.ClfA.SD709S(GenenteCh 公司）之 His_標籤作 DNA 序 作為對照的是，開始從成熟蛋自質的clfA基因A區編碼 直 到最後-區（538G)的編碼序列，其次鐵編碼序列係 體基因 pTet.ClfA.Adom.538G (Genentech 公司）的 pcr^辦。 MBP(麥芽糖結合蛋白質)隨著各種SD插入或a域插入，而 結紮到pTet金黃色葡萄球菌表達載體（Genentech公司之 pSASlO)。然後使所產生的結構電穿孔成為金黃色葡 RN4220A分選酶（在RN4220背景之分選酶缺失突變株）。 20毫升培養基·無論是電穿孔rncm △分選酶或空抓422〇 Δ分選酶（不攜帶pTet表達載體）從隔夜培養基（開始〇D 值0.15)接種’在胰蛋白酶大豆肉湯（TSB)並辅以葡萄糖（2克 /升）生長1小時，然後藉由脫水四環素（2〇〇奈克/毫升）誘導蛋 白質表達2小時。在誘導期結束時，使金黃色葡萄球菌培^基再 懸浮於緩衝柱（150 mJV[氣化鈉，20mMTris pH值7.5和羅氏蛋白 酶抑製劑-無EDTA錠）’並在37。C於250個單位笨酮酶核酸 (Novagen公司）的存在下，以200微克/毫升溶葡球菌酶溶解3〇 分鐘。在4。C藉由微型離心機以最大旋轉速度離心1〇分鐘，清 理該溶解物除去碎片。然後在4。C用直鏈澱粉樹脂（neb公司） 配用最後EDTA濃度為lmM培養該清理後的細胞溶解液丨5小 時，以便捕捉表達的MBP-SD蛋白質。 · 201107470 f 葡萄球菌表達的^? - SD的結構之免疫印跡：具被 子的π PAD蛋白質直鏈澱粉樹脂以緩衝柱洗三次，進一步準備 供免，印跡分析，並在W Tris·甘氨酸凝膠上操作。免疫印跡以 ^體或抗五His_抗體（Qiagen公司）或抗-抗體（他^ 公司）抹除。 結果 金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中反應生成—種獨特的 SDR (絲氨酸·天冬氨酸_重複)蛋白質族 在免疫沉澱後，測試商業化磷壁酸製劑和金黃色葡萄球菌 (USA300株）細胞壁溶解液（WTA公司）對rFi的結合能力。 rFl ^結合於商業化磷壁酸製劑（第6A圖，左側板）之幾個成分 ^金黃色=萄球菌之細胞壁溶解液（第6B圖，左側板）。利用質 谱儀鑑別這些WTA製劑的成分和細胞壁溶解液，確定為
(SdrA)，ClfB (SdrB)，SdrC，SdrD 和 SdrE(第 6A 圖，右側板和第 6B 圖，右側板）。 在免疫此澱後’測試表皮葡萄球菌細胞壁溶解液結合於rF1 的能力。第6C圖（左側板）顯示rF1對表皮葡萄球菌細胞壁溶解 液的幾個成分的結合約束力。這些成分未用對照抗體鑑定。利用 質譜分析這些細胞壁成分，鑑定為SdrF，SdrG和sdrH (第6C 圖右側板）° 在金黃色葡萄球菌和大腸桿菌中外源ClfA之表達 表達在金，色葡萄球菌中之外源（：比八對1^1呈反應性，而 表達在大腸桿菌中之C1认則不反應（第圖7A)。不過，表達在大
腸桿菌中之巧蛋白質 cifA (SdrAX ClfB (SdrB；)，SdrC，SdrD 和SdrE以金黃色葡萄球菌溶解物孵育，則能恢復rF1之反應性 7B 圖）。 38 201107470 rFl結合於表達在金黃色葡萄球菌中之sdr域 rFl抗體結合於ClfA Sdr域，其包含表達在金黃色 中之 ClfA 560D - 618S 和 ClfA 560D - 709S (第 8 圖），rFl 並^ 結合於C1A的A域或含最多重複三個SD之小肽序列。 實施例4 方法 rFl之可變區無性繁殖成pRK載體
Phusion ®DNA 聚合酶，限制性酶 Ec〇RV，KpnI，pvun，A賊 Agel，及Ahdl，T4 DNA連接酶均購自英格蘭生物實驗所，伊普斯 維奇，麻州，美國。Pfli DNA聚合酶，快速變化二定點突變試劑 盒均購自Stmtagene / Agilent科技公司，聖克拉拉，加利福尼亞 州’美國。2%瓊脂糖凝膠購自invitr〇gen公司，卡爾斯巴德，加 利福尼亞州，美國。PRK治療載體pRK.LPG3HuKap^a和 pRK.LPG4.HumanHC得自基因泰克/羅氏公司，南舊金山，加利福 尼亞州，美國。
將得自pCPEO載體的rFl Mab(單無性繁殖抗體)的重鏈和輕 鏈變量域放入pRK哺乳動物表達載體。總量5〇微升的pfU DNA 聚合酶按照標準PCR(聚合酶鏈反應)程序進行PCR聚合酶鏈反 應。重鏈可變區(VH)藉由下列引物擴增：YiHCF) 5，_ATG GCT GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT G-3’（SEQ ID NO:18) and YiHCR2 5’-GAA CAC GCT GGG GCC CTT GGT GCT GGC ACT
CGA GAC TGT GAC CAG GGT GCC AGG T*CC CCA G-3,（SEQ IDNO:19) (PvuII和Apal限制位置以畫底線和*標出表示單核苷 酸G到T改變成消除内部Apal位置）；輕鏈可變區(VL)藉由下列 引物擴增：YiLCF 5’-CGG CTC GAC CGA TAT CCA GCT GAC CCA GAG-3’（SEQ K) NO:20) and YiLCR 5，-GAT TTC CAG CTT GGT ACC CTG GCC G-3’（SEQ ID NO:21) (EcoRV 和 Kpnl 晝底 線標出）。分別具有393 (VH)和328(VL)bp之獨特PCR產物可直
S 39 201107470 ，被 PvuII 及 Apal (對 VH 而言），EcoRV 及 ΚρηΙ (對 VL 而言） 肖化，人疋凝膠淨化（採用Invitrogen&司，產品目錄#Κ21〇〇 -12)。藉由T4DNA連接酶，vh和VL分別單獨配位成重鏈用 的 pRK/PvuII，Apal PRK ’ 和輕鏈用的 prk/ec〇rv，KpnI 之治療載 ，片段。DNA原核質體以限制酶消化模式證實，即在2%瓊脂糖 凝膠上，Agel釋出rFlVH〜3〇〇 bp和5.8 kb帶，而Ahdl釋出 rFlVL〜2.3 和 3.1 kb 帶。 化工壓力測試 生比較抗體主要序列數據和實驗觀察到退化的情況，它已經很 清楚，某些序列基元可能會有退化（亦即天門冬氨酸在DD， 及DS序1之異，構化和天冬醯胺在NG序列之去醯胺化）。如果這 種退化的熱點出現在抗體的CDR (互補決定區），則結合約束 力^影響么可能會受到負面影響。對於含有熱點的分子而言，化 工壓力測試提供一種方法來評估這些圖案的降解敏感性，包含將 抗體放在平台配方緩衝區和比較對照樣本在4〇。c施壓兩個星 期。如果觀察到退化，則主要序列可以重新設計，以消除熱點。 樣本在40。C施壓兩個星期後，進行各種化驗分析，以評估 那裡f生多少退化。進行影像毛細管等電聚焦（icIEF )分析，以 研究荷電變種，而利用質譜驗證完整和減少之抗體質量，以及進 行LC-MS/MS肽圖’以獲得特定點的退化資訊。 突變 rFl pRK原核質體進行一系列的定點突變，藉由具fhv 5’-GGT GGC CAG CAT CAA CAGCGG CAA CAA CCC CTA CTA CG-3’（SEQ ID NO:22)及 RHV 5，-CGT AGT AGG GGT TGT TGC C^£_EGT TGA TGC TGG CCA CC-3’（SEQ ID NO:23)之重鏈 CDR2中的N (AAC) 53S (AGC)，穩定rFl Mab。（突變位址畫底 線標出）藉由奎克改變II定點工具包。突變體加以排序。 201107470 結果 抗體rFl的主要序列在輕鏈CDR2 : NNGNN (SEQIDNO : 24)含一個潛在的天冬醯胺去醯胺位址。壓力測試顯示受壓樣品 在N53增加去酿胺化（編號根據Kabat氏，1991年）。執行定點 突變，藉由 N (AAC，（SEQ ID NO:25))至 53S(AGC，（SEQ ID NO:26))替代重鏈CDR2，以穩定rFIMab(單無性繁殖抗體）。突 變體之排序證實N53S突變。 實施例5 開發半胱氨酸變體在抗體藥物共輛體（ADC)的應用 使rFl pRK原核質體進行一系列定點突變的方法包含藉 由募聚物 rFlpRK.LC(205/210)VCF (468075) 5，-GGG CCT GAG CTC GCC CTG CAC AAA GAG CTT CAA CAG-3，(SEQ ID NO:27)及 FlpRK.LC(205/210)VCR (468076) 5’-CTG TTG AAG CTC TTT GTG CAG GGC GAG CTC AGG CCC-3,（SEQ ID NO:28)，（半胱氨酸突變晝底線標出）來產生輕鏈rFl硫代Mab 之連接器，和 rFlpRKHCN53S.A121CF (468464) 5’-CTG GTC ACA GTC TCG AGT TGC AGC ACC AAG GGC CCA TC-3’（SEQ ID NO:29)及 rFlpRK.HCN53S.A121CR (468465) 5’-GAT GGG CCC TTG GTG CTG CAA CTC GAG ACT GTG ACC AG-3,（SEQ ID NO:30)(半胱氨酸突變晝底線標出），藉由Stratagene的定點方 法，產生rFl硫代Mab重鏈之連接器完成之。輕鏈V205C與重 鏈A114C均以變體的排序確認之（第9圖）。
S 41 201107470 【圖式簡單說明】 第1圖.抗體F1之重鏈和輕鏈序列。 第2 ^ . F1的抗體結合於從幾個革蘭氏陽 壁酸)製劑。W LTA(脂磷壁酸)製劑均來自西格^^ (月= 鼠多無性繁殖抗-LTA之ELISA捕獲法測試，< ( ^ LTA(脂磷壁酸)製劑來自菲舍爾公司之m5 =b)间度純化 合體細胞赫)紐獅來作鱗齡_ /RS== 繁殖抗-LTA抗體作為陽性對照。 …、而小既夕無性 第3圖：纽Π抗魏合驗黃色 菌。（a)細菌以F1抗體，或對照IeG 囷/二不疋肺火鏈球 細胞病毒抗體)或無第一抗體(只用】’：抗體 ^ (igG-PE).(b) 體的F1結合性。測試PVL+株(SA-1}，三正 SA-3^SA-4)^^MRSA(SA-5^SA-6) 第4圖：（a) rFl抗體結合於μ株全音备苗益七枯 抗體結合於表皮葡萄球菌，但不結;^草色 李斯特菌和化膿性鏈_。 料牙胁i、糞腸球囷、 第5圖.（a) rFl抗體結合在不同生長 氧= 二 =:來自心 ϊί广！疫沉澱（ιρ) ’其次是藉由们抗體（左） WTA»^ 片段’（b)金育色葡萄球菌（USA300株）細胞壁溶解液藉由rF1 42 201107470 或對照抗體作免疫沉澱（IP)，其次是藉由 印跡（WB)與質譜分析得自rF1抗體 j左）作，疫 (USA300 株），（c)藉由 rF1 或同型 = 溶解液作免疫沉殿，其次是藉由rF1抗體囷ς 用質譜分析rFl抗體⑷結合之細胞壁體片(段。）作免疫印跡，並 第7圖：rFl對表達於金黃色葡萄球菌和 -天門冬氨㈣_蛋白質之結合約束力j = 的c轉叢因子_A)之金黃色二 am^Sd^ s"drD ^ Sd^ 疫印跡，接著以具rFi⑴或抗他(六 I且政)抗體⑺之金黃色葡萄球菌溶解液孵育。 色色ί 天門冬氨 合性，具抗搬（麥芽糖tit囷J；達的結構對rF1 (左）之結 抗體（右）的金黃色葡萄^蛋白貝），抗_Hls(六聚組氨酸)和rFl 彳_ 溶解液之免疫印跡。 弟9圖：抗體rpi的重鏈 序列。根據Kabat氏(二(輪^ 年），及匣：CDR(互補決定區）編碼。 【主要元件符號說明】 益
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Claims (1)

  1. 201107470 七、申請專利範圍： 1. 一種抗體或其功能部件或免疫球蛋白鏈或其功能等同體， 括： -重鏈CDR1序列，其中至少70%序列相同於序列处观8，和/ 或 -重鏈CDR2序列，其中至少70 %序列相同於序列 SINNGNNPYYARSVQY，和/或 -重鏈基因CDR3序列，其中至少70 %序列相同於序列 DHPSSGWPTFDS，和/或 -輕鏈CDR1序列，其中至少70%序列相同於序列 RASENVGDWLA，和/或 -輕鏈CDR2序列，其中至少70%序列相同於序列KTSILES， 和/或 -輕鏈CDR3序列’其中至少70 %序列相同於序列 QHYXRFPYT，其中 X 是 I 或 Μ。 2. 如申請專利範圍第1項所述之抗體或其功能部件或免疫球蛋白 鏈或其功能等同體’具有一種重鏈序列其中至少70%序列相同 於序列 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAP GRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQM NNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS 和/或 一輕鏈序列，其中至少70%序列相同於序列 DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPG KAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATY YCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV，，其中 X 是 I 或 Μ。 3. 如申請專利範圍第1項所述之抗體或其功能部件或免疫球蛋白 鏈或其功能等同體，具有一個重鏈序列其中至少70%序列相同 於序列 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAP GRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQ S 45 201107470 MNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS 和/或具有一輕鏈序列其中至少70%序列相同於序列 DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPG KAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFAT YYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRA，其中 X 是 I 或 Μ。 4.如申請專利範圍第1項所述之抗體或其功能部件或免疫球蛋白 鏈或其功能等同體，具有一個重鏈序列其中至少70%序列相同 於序列 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQA PGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSL QMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS 和/或具有一輕鏈序列其中至少70%序列相同於序列 DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPG KAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFAT YYCQHYXRFPYTFGQGTKVEIKRTV，其中 X 是 I 或 Μ。 5·如申請專利範圍第1項所述之抗體或其功能部件或免疫球蛋白 鏈或其功能等同體’具有一個重鏈序列其中至少70%序列相同 於序列 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQA PGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSL QMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVS S 和/或具有一輕鏈序列其中至少70%序列相同於序列 DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKP GBCAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDF ATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV，其中 X 是 I 或 Μ。 6·如申請專利範圍第1項所述之抗體或其功能部件或免疫球蛋白 鏈或其功能等同體，具有一個重鏈序列其中至少70%序列相同 於序列 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAP 46 201107470 GRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQ MNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS 和/或具有一輕鏈序列其中至少70%序列相同於序列 DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPG KAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFAT YYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRA，其中 X 是 I 或 Μ。 7. 如申請專利範圍第1項所述之抗體或其功能部件或免疫球蛋白 鏈或其功能等同體’具有一個重鏈序列其中至少70%序列相同 於序列 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAP GRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQ MNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS 和/或具有一輕鏈序列其中至少70Α序列相同於序列 DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPG KAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFAT YYCQHYXRFPYTFGQGTKVEIKRTV，其中 X 是 I 或 M。 8. 如申請專利範圍第1〜7項任一項所述之抗體或其功能部件或 免疫球蛋白鏈或其功能等同體，其中天冬醯胺已被換成另一個 氨基酸。 9. 如申請專利範圍第8項所述之抗體或其功能部件或免疫球蛋白 鏈或其功能等同體，其中該天冬醯胺是一種在重鏈位置53之 天冬醯胺，而氨基酸係根據卡貝特氏編號（1991年）。 10. 如申請專利範圍第8項所述之抗體或其功能部件或免疫球蛋白 鏈或其功能等同體，其中該另一個氨基酸係絲氨酸。 11. 如申請專利範圍第1〜7項任一項所述之抗體或其功能部件或免 疫球蛋白鏈或其功能等同體，其中至少有一個非半胱氨酸之氨 基酸已被半胱氨酸取代。 12. 如申請專利範圍第n項所述之抗體或其功能部件或免疫球蛋 白鏈或其功能等同體，其中該至少有一個非半胱氨酸之氨基酸 201107470 =二和/或在輕鏈位置110的顯氨酸，和 年）= 喊，而氨基酸是根據卡貝特氏（_ 第1〜7項任一項所述之抗體或其功能部件咬免 ^蛋白鏈或其功能等同體，其為人類的抗體。午次免 15‘如中’它能結合在活體内生長的金黃色葡萄球菌。 i範圍第14項所述之抗體，其中該抗體是用於^員。 .j抗體或其功能部件或免疫球蛋白鏈或其功能等同體，其 、-、《 δ於SD -重複依賴之抗原決定部位。 /、 17. 體或其功能部件或免疫球蛋自鏈或其功能等同體，豆能 、，口 5 於金黃色葡萄球菌 ClfA，ClfB，SdrC，SdrD 和 SdrE。^、 18. —種抗體或其功能部件或免疫球蛋白鏈或其功能等同體，立 與申請專利範圍第1〜I3項任一項所述之抗體或其功能部j牛或 ，疫球蛋白鏈或其功能等同體競爭用於結合於金黃色葡萄球 菌種。 19. 一種孤立的、合成或重組核酸序列，其長度至少有15個核苷 酸，或其功能等同體，且具至少有一個如申請專利範圍第1〜13 項任一項所述之抗體或其功能部件或免疫球蛋白鏈或其功能 等同體的CDR(互補決定區）之序列編碼。 20. —種孤立的、合成或重組核酸序列，或其功能等同體，包括一 個序列，其中至少有70%序列相同於序列選自 cgctttgccatgagc, tcgatcaataatgggaataacccatactacgcacggtcggtacaatac, gatcaccctagtagtggctggcccacctttgactcc, cgggccagtgaaaacgttggtgactggttggcc, aagacatctattctagaaagt 及 caacactatatacgtttcccgtacact. 21. 如申請專利範圍第20項所述之核酸序列或其功能等同體，其 中該核酸序列或其功能等同體，包括一個序列，其中至少有70 %序列相同於至少部分的第1圖所描述核苷酸序列，而該部分 至少有15個核苷酸，且至少有一個CDR(互補決定區)之編碼。 22. —種孤立的、合成或重組核酸序列，或其功能等同體，包括一 48 201107470 氨基酸序列的編碼，其中至少有70%的序列相同於 序歹|J FAMS，和/或至少70 %的序列相同於序列 SINNGNNPYYARSVQY和/或至少7〇%的序列相同於序列 DHPSSGWPTFDS，和/或至少70 %的序歹相同於序列 RASENVGDWLA，和/或至少70 %的序列相同於序列 KTSILES，和/或至少70%序列相同於序列QHYXRFPYT，其 中X是I或Μ 和/或至少70%的序列相同於序列 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQA PGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSL QMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVS S, 和/或至少70%的序列相同於序列 DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKP GKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDF ATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV，其中 X 為 I 或 μ。 23. 如申請專利範圍第^22項任一項所述之抗體或其功能部件或 免疫球蛋白鏈或其功能等同體或核酸序列或其功能等同體 為藥物和/或預防劑之應用。 寻』體作 24. 如申請專利範圍第卜22項任一項所述之抗體或其功能部件或 巧:求蛋自鏈或其魏等同體或核酸序列或其魏等同體作 或預防劑之應用，以便至少部分治療和/或防止革蘭 氏1%性囷有關的疾病。 ’包含μ請專利範圍第1〜22項任-項所述之抗體 免疫球蛋白鏈或其功能等同體核酸序列或 二I備藥物和/或預防劑，以便至少部分治療和/或 防止革蘭氏陽性菌有關的疾病。 腳7飞 物’包含中請專利範圍第卜2 抗體或其功能部件或免疫球蛋白 = 列或其功__和製藥可其功4_或核酸序 辨J接又载體’稀釋劑或賦形劑。 49 201107470 27. -種孤立贼纽抗體域_，其能財生巾料利範 1〜18項任-項所述之抗體或其功能部件或免疫球 功能等同體。 八 28·-種生產申請專利範圍第卜18項任一項所述之抗體或其功能 部件或免疫球蛋白鏈或其功__之方法，包括提供 請專利翻第19-22項任-項所述之核酸序列或其功能等同體 之細胞，且使該細胞轉成申請專利範圍第19_22項任一項 之核酸序列或其功能等同體，從而產生申請專利範圍第 Γΐί項所狀抗體或其舰部件或免疫球蛋_或其功能 29. 如申請專利顧第28項所述之方法，進—步包括收獲，淨化 和/或孤立該申請專利範圍第丨〜18項任 能部件或免疫球蛋白鏈或其功能等同體。I机篮次，、功 30. -種應用，包含以申請專利範圍第w =功能料錢疫料自戦其魏制體 31. -種應用，包含以申請專利範圍第項任一 疫球蛋白鏈或其功能等同體檢測金黃3 萄球囷和/或表皮葡萄球菌。 32. —種申請專利範圍第丨〜18項 处 含使用申靖制和或表皮_球菌之方法，包 50
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