TW201107344A - A method to produce a highly concentrated immunoglobulin preparation for subcutaneous use - Google Patents

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201107344 六、發明說明： 本申請案主張於2009年5月？7 η由二主 2 干5月27曰申請之美國臨時專利申 請案第61/181，606號之權兴，兮略„±11_± + 權皿該臨時申請案全文以引用方 式明確併入本文_以用於所有目的。 【先前技術】 在1952年，源自人血衆之免疫球蛋白產物首次用於治療 免疫缺陷。最#，所選方法為肌内或皮下投與邮 '然 而，為注射有效治療各種疾病所需大量IgG，人們研發出 具有較低濃度IgG (50 mg/mL)之靜脈内投藥產品。靜脈内 免疫球蛋白(IVIG)通常含有源自一千多個血液提供者之血 漿之混合免疫球蛋白G (IgG)免疫球蛋白。…⑴通常含有 超過95%之具有完整Fe依賴性效應子功能之未經修飾⑽ 及僅痕量之免疫球蛋白A (IgA)或免疫球蛋白M (igM)，其 為無菌純化IgG產物且主要用於治療以下三大類醫學病 況：1.免疫缺陷，例如X-連鎖丙種球蛋白缺乏血症 '低丙 球蛋白血症（原發性免疫缺陷）、及特徵為低抗體含量的獲 得性免疫低下病況（繼發性免疫缺陷）；2炎症性及自身免 疫疾病；及3 _急性感染。 多個IVIG商品供應商提供多種ivIG產物。與在重新溶解 後溶液中僅含有50 mg/mL蛋白質之先前凍乾IVIG產物相 比，最新研發成果係具有高純度及高濃度人類Ig(}抗體之 100 mg/mL即用型無菌液體製備物。由於諸如卩1(}等1§(3 產物係自混合人類血漿製造’故來自提供者血液之病原體 148623.doc 201107344 污染物（尤其已知可引發各錄 丨知各種人類疾病之病毒)係製程中之 嚴重問題《在IgG產物中之另—重 Μβ η ^ μ ^ μ ^ 考慮因素係其在儲存 曰1穩疋性’尤其對於即用型製備物而言。句彻相 比，可皮下投與之免疫球蛋白製備物之優點在於可用於家 庭護理治療且副作用較少。為減少在每個位點注射體積較 小之缺點，較濃縮IgG(例如含有2〇〇叫/虹而非⑽ mg/mL)顯著較佳。 在一系列關於A清及血漿蛋白<製備及特性之學術論文 之第四期中，Cohn等人(V 〇 牙八^.相.C7^w. 5W·，1946，68(3): 459-475)首:欠闡述醇分級分離血㈣白之方法（方法6)，其 使得可分離來自人類血焚之富含IgG之組份。若干年後， Oncley 等人（乂敲 ―，1949, 71⑺ 54155◦基於

Cohn之方法進行了擴展，其公開了使得可分離更純淨的 IgG製備物之方法（方法9)。 儘f該等方法為整個血漿源血液因子工業奠定了基礎， 但其所提供IgG製備物之純度未高至足以治療若干種免疫 相關疾病，包括川崎症候群（Kawasaki syndr〇me)、免疫性 血小板減少性紫癜、及原發性免疫缺陷。因此，業内研發 出採用諸如離子交換層析等各種技術之其他方法來提供具 有較高純度及較高濃度之IgG調配物。Hoppe等人（Mw«c；2

Foch似c/ir 1967 (34): 1749-1752)及 Falksveden(瑞典 專利第 348942 號）及 Falksveden 及 Lundblad (Mei/zo心 〇/ P/aswflr /Voiez·;? 1980)首先採用離子交換層析 來達成此目的。 148623.doc 201107344 多種現代方法採用與管柱層析偶聯之沉澱步驟，例如辛 酸鹽沉澱（Lebing等人，。X Sang 2003(84):193-201)及 Cohn組份（1+)11+111 乙醇沉殿（Tanaka等人，Med . 心5 20〇〇 (3 3)37-30)。最近，Teschner等人（Kox Sawg, 2007 (92):42-55)闡述產生10°/〇 IVIG產物之方法，其中首先自混 合血漿移除冷凍沉澱物’然後實施經修改的Cohn-Oncley 冷乙醇分級分離’之後對中間體實施S/D處理，進行離子 交換層析’奈米過濾’且視需要實施超濾/透析過濾。 然而，儘官§玄專I g G製造方法可提供改良的純度、安全 性及產率，但仍需要適合皮下及/或肌内投與之高濃度IgG 製備物。本發明滿足該等其他需要，且闡述穩定、高純 度、病毒經滅活且具有高濃度IgG之即用型產物的製造方 法。 【發明内容】 在一態樣中，本發明提供每升組合物包含超過約〗8 〇克 蛋白質之組合物，且該蛋白中至少95%係IgG，例如人類 IgG。在某些實施例中，該組合物係藉由產生適合皮下及 靜脈内投與之產物之方法來製造，且可在最終容器中於升 * 高溫度下處理以使病毒滅活，無論其濃度係在1〇%至22% - 之蛋白質濃度範圍之間調節。在某些情形下，組合物中之 蛋白質濃度為20%(w/v)或約20%(w/v)。在其他情形下，組 合物可另外包含約O.i-0.3 M甘胺酸。本發明組合物之pH 可變，例如約3-6或約4-6。 在另-態樣中’本發明提供自血衆製備濃縮邮組合物 148623.doc 201107344 之方法，其改良在於包含以下步驟：藉由超濾將血漿製 備物中之蛋白質濃縮至5%(w/v)或約5%(w/v);及（2)藉由透 析過濾將製備物中之蛋白質進一步濃縮至2〇%(w/v)或約 20%(w/v)。該組合物中所提及之蛋白質的至少95%係 IgG ’例如人類IgG。在某些實施例中，步驟（1)係使用標 稱截留分子量（NMWCO)為1〇〇 kDa或更低之超濾膜來實 施。在其他實施例中’步驟（2)係相對於PH為4.2±0.1之甘 胺酸透析過濾緩衝液來實施。在某些情形下，透析過濾緩 衝液具有0.25 Μ甘胺酸且pH為4.0。在某些特定實施例 中’在步驟（2)後蛋白質濃度高於2〇〇/〇(w/v)且隨後用透析過 濾緩衝液將其調節至20%(w/v)或約20°/〇(\ν/ν) <, 在另一態樣中，本發明提供自血漿製備濃縮IgG組合物 之方法，其包含以下步驟： (1) 藉由離心自血漿分離液體與沉澱物； (2) 混合預冷卻乙醇與來自（1)的液體以形成混合物， 該混合物之乙醇濃度為8%(v/v)或約8%(v/v); (3) 藉由離心自（2)之混合物分離液體與沉澱物； (4) 將（3)之液體之pH及乙醇濃度分別調節至7.0或約 7.0及20-25%(v/v)，由此形成混合物； (5) 藉由離心自（4)之混合物分離液體與沉澱物； (6) 用緩衝液以1比1 5或約1比1 5之重量比使（5)之沉澱 物再懸浮以形成懸浮液； (7) 混合二氧化矽（Si02)與（6)之懸浮液並藉由過濾獲 得濾液； 148623.doc 201107344 ⑻混合洗條劑及冷醇與⑺之遽液並藉由離心獲得沉 澱物； (9) 使沉殿物溶於包含溶劑<洗》條劑之水性溶液中並 將該溶液維持至少60分鐘； (10) 在（9)錢溶液流過陽離子交換層析f柱並將吸附 在管柱上之蛋白洗脫於洗出液中； (π)使（10)之洗出液流過陰離子交換層析管柱以獲得 流出液； (12) 使流出液流過奈米過濾器以獲得奈米濾液； (13) 使奈米濾液流過超濾膜以獲得超濾液； (Μ)相對於透析過濾緩衝液對超濾液進行透析過濾， 從而獲得蛋白質濃度為2〇%(w/v)或約2〇%(w/v)之 溶液；及 (15)藉由經由0.2 μηι或更小之濾膜過濾溶液來對（14) 之溶液進行滅菌，由此獲得濃縮IgG組合物。 在某些實施例中，步驟（2)係在約_2<t至〇£>c之溫度下實 鉍，或將步驟（2)之混合物混合至少丨5分鐘且隨後在約 至〇°C之溫度下將其維持至少2小時。在某些實施例中，將 步驟（4)混合至少丨5分鐘且隨後在_7C>c或約_7它之溫度下將 其維持至少8小時。在某些實施例中，在約代至8。匚之溫 度及5 .〇或約5 ·〇之pH下將步驟⑹之懸浮液攪拌約4〇·⑽分 鐘’或步驟（7)中之二氧化石夕濃度為4〇 g/kg步驟⑹之懸浮 液且混合係在約2至8。〇之溫度下實施至少約5〇分鐘。在某 些實施例中，步驟⑻係在約-代至·阶之溫度下實施。 148623.doc 201107344 在某些實施例中，步驟（9)之溶液包含1.0%(v/v)Triton X-100、0.3%(v/v)Tween-80、及 0.3%(v/v)填酸三（正 丁基）醋 (TNBP)。在某些實施例中，將步驟（9)之溶液維持在約18 至25°C之溫度下。在某些實施例中，用1〇 mM pH 5.5±0.1 之乙酸鹽緩衝液洗滌步驟（10)之陽離子交換層析管柱且用 35 mM填酸二氫鈉、10 mM Tris、pH 8.5士0_ 1、電導率 5.0 土0.2 mS/cm之緩衝液來洗脫。在某些實施例中，在步驟 (1 1)之前將步驟（10)之洗出液調節至pH為6.4±0_2且電導率 為約1.5至2_5 mS/cm。在某些實施例中，在步驟（12)之前 使步驟（1 1)之流出液流過孔徑為〇. 2 pm或更小之渡膜。在 某些實施例中’步驟（13)之超濾液之蛋白質濃度為5±1〇/〇 (w/v)或約5±l%(w/v)。在其他實施例中，步驟（13)之超濾 膜之標稱截留分子量（NMWCO)為50 kDa或更低。在某些 實施例中’步驟（14)之透析過濾緩衝液為pH為4.2±〇1之 0.25 Μ甘胺酸溶液。在其他實施例中，步驟（14)之溶液之 蛋白質濃度大於20%(w/v)且隨後用透析過濾緩衝液將其調 節至20_4±0.4% (w/v)或約2〇.4±〇.4%(w/v)。在某些實施例 中，步驟（13 )及（1句係在約2至8 〇c之溫度下實施。在其 他實施例中，製備方法另外包含在無菌條件下將步驟〇 5) 之滅菌溶液分配至容器中且隨後密封該等容器之步驟。 在其他實施例中，上述方法可另外包含將密封容器在約 30 C至32C下儲存約21至22天之步驟；或該方法可另外包 含調配步驟以使2G% IgG產物與相關技術之祕靜脈内調 配物同樣穩定。 148623.doc 201107344 在另一態樣中，本發明提供藉由上述製備方法產生之水 性組合物’且其包含至少18%(w/v)免疫球蛋白例如至少 20%(w/v)免疫球蛋白。 在另一態樣中，本發明提供治療患者有免疫缺陷 '自身 免疫疾病或急性感染之患者的方法，其包含向該患者投與 有效量之上述組合物。 【實施方式】 定義 「抗體」係指實質上由免疫球蛋白基因或其片段編碼之 多肽，其可特異性結合並識別分析物（抗原）。所識別免疫 球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、怪定區基因以及無 數免疫球蛋白可變區基因。輕鏈歸類為 <或λ。重鏈歸類為 γ μ、α、δ、或ε，其繼而分別定義免疫球蛋白種類Ig(5、 IgM、IgA、IgD、及IgE 〇 貫例性免疫球蛋白（抗體）結構單元由兩對多肽鏈組成， 每一對具有一個「輕」鏈（約25 kDa)及一個「重」鏈（約 50-70 kDa)。每一鏈之沁末端定義主要負責抗原識別之具 有約1 00-110個或更多胺基酸之可變區。術語可變輕鏈（v〇 及可變重鏈（VH)分別係指該等輕鏈及重鏈。 術語「超渡（UF)」涵蓋多種膜過濾方法，其中流體靜力 壓將液體壓在半透膜上。保留高分子量懸浮固體及溶質， 而水及低分子量溶質透過該膜。此分離方法經常用於純化 及濃縮大分子（1〇3-1〇6 Da)溶液，尤其蛋白質溶液。端視所 保留分子大小可使用多種超濾膜。超濾之特徵通常在於膜 148623.doc •9- 201107344 孔徑介於1 kDa與1刚kDa之間且作業壓力介於g別巴與ι〇 巴之間’且尤其可用於分離諸如蛋白質等勝體與諸如糖及 鹽等小分子。 術語「透析過滤」係用與超遽相同之膜來實施且係切向 流動過遽。在透析過遽期間，將緩衝液引入循環罐中且自 單元作業中移除濾液。在產物存於滲餘物(例如聊中之 =法中’透析㈣將各組份自產物池洗出至濾液中，由此 交換緩衝液並降低不期望物質之濃度。 本文所用詞語「約」表示自所述值加或減IG%之大致範 圍。例如，表述「約20%」涵蓋18_22%之範圍。 術語「混合」閣述藉由任何形式之㈣使兩種或更多種 不同化合物或物質均句分佈於溶液或懸浮液中之活動。本 申請案中利術語「混合」之結果i^要求所有成份皆完 全均勻地分佈於溶液或懸浮液中。 在本申請案中’術語「溶劑」涵蓋能溶解或分散一或多 種其他物質之任何液體物f 4容劑可具有無機性質，例如 水；或其可為有機液體’例如乙醇、丙_、乙酸甲酉旨、乙 酸乙醋、己烧、石油趟等。術語「溶劑洗務劑處理」中所 =溶劑表示有機溶劑（例如磷酸三正丁基自旨），其係用於使 /谷液中之脂包膜病毒滅活的溶劑絲劑混合物之一部分。 本申請案中所用術語「洗務劑」可與術語「表面活性 劑」或「表面活性試劑」互換使用。表面活性劑通常為兩 性分「子性有機化合物，即含有疏水基團（「尾」）及親水基 團（「頭」）’此使得表面活性劑可溶於有機溶劑及水中。 148623.doc 201107344 表面活性劑可根據其頭部中所存在之形式上帶電的基團來 :類。非離子型表面活性劑在其頭部不具有帶電基團，而 離子型表面活性劑在其頭部攜載淨電荷。兩性離子型表面 活性劑之頭部具有兩種相反帶電基團。常見表面活性劑之 某些實例包括：陰料型（基於疏酸根、續酸根或碳酸根 陰離子）：全氟辛酸鹽（PF0A或PFO)、全氟辛烷磺酸鹽 (PFOS)、十一烷基硫酸鈉（SDS)、十二烷基硫酸銨、及其 他烷基硫酸鹽、聚氧乙烯烷基硫酸鈉（亦稱作十二烷基醚 硫酸鈉、或SLES)、烷基苯磺酸鹽；陽離子型（基於四級銨 陽離子）：溴化十六烷基三甲銨（CTAB)(亦稱作十六烷基三 曱銨溴化物）、及其他烷基三甲銨鹽、西吡氣銨 (cetylpyridinium chl〇ride)(CPC)、聚乙氧基牛脂胺 (POEA)、笨紮氣|安（benzaik〇nium chloride)(BAC)、节索氯 銨（benzethonium chl〇ride)(BZT);長鏈脂肪酸及其鹽，包 括.辛酸鹽、辛酸、庚酸鹽、己酸、庚酸、壬酸、癸酸、 及諸如此類；兩性離子型（兼性）··十二烷基甜菜鹼；椰油 醯胺丙基甜菜鹼；椰油兩性甘胺酸鹽；非離子型：烧基聚 (環氧乙烷）、烷基酚聚（環氧乙烷）、聚（環氧乙烷）與聚（環 氧丙烷）之共聚物（商業上稱作帕洛沙姆（p〇l〇xamer)或帕洛 沙胺（Poloxamine))、烷基多聚葡萄糖苷（包括辛基葡萄糖 苷）、癸基麥芽糖苷、脂肪醇（例如十六烷基醇及油醇）、椰 油醯胺MEA、椰油醯胺DEA、聚山梨醇酯（Tween 2〇、 Tween 80等）、Triton洗滌劑、及氧化十二烷基二甲胺。 本文所用術語「靜脈内IgG」或「IVIG」治療一般係指 148623.doc •11· 201107344 以靜脈内、皮下或肌内方式向患者投與IgG免疫球蛋白植 合物以治療諸如免疫缺陷、炎症性疾病及自身免疫疾病等 多種病況之治療性方法。IgG免疫球蛋白通常係自血漿混 合並製備。可使用全抗體或片段。IgG免疫球蛋白可以較 高濃度（例如大於10%)調配以供皮下投與，或可經調配以 供肌内投與。此對於特異性IgG製備物而言特別常見，其 係以咼於特異性抗原（例如Rho D因子、百日咳毒素、破傷 風毒素、臘腸毒素、狂犬病等）之平均效價之濃度來製 備。為便於論述，該等皮下或肌内調配IgG組合物亦涵蓋 於本申請案之術語「IVIG」中。 「治療有效量或劑量」或「足夠/有效量或劑量」意指 可產生投藥後欲獲得效應之劑量。確切劑量可取決於治療 目的’且可由熟習此項技術者使用已知技術來確定（例 如’參見Lieberman，P/zarmacewiica/ Dosage Form·?(第 1-3 卷，1992) ; Lloyd，77ze dri, Sciewce

Pharmaceutical Compounding (1999) ； Pickar, Dosage Calculations (\999) ·，反 Remington: The Science and iVacn’ce 〇/ P/mrmacy，第 20 版，2003，Gennaro 編輯， Lippincott，Williams & Wilkins，該等文獻之揭示内容係全 文以引用方式併入本文中以用於所有目的）。 如現代醫學中的常規實踐，使用濃免疫球蛋白（尤其 IgG)之滅菌製備物來治療屬於以下三大類之醫學病況：免 疫缺陷、炎症性及自身免疫疾病、及急性感染。調配一種 常用IgG產物（靜脈内免疫球蛋白或IVIG)用於以（例如）1〇% 148623.doc -12· 201107344 之濃度貫施靜脈内投與。亦可調配濃免疫球蛋白用於以 (例如）2G%或約㈣之濃度實施皮下或肌内投與。 :一態樣中’本發明係關於自混合灰漿產生高純度及高 ,又免f球蛋白組合物之改良新方法。與先前使用之IgG ，，屯及/辰縮方去相比，本發明者納入超渡及調配步驟，從 而獲得較高IgG濃度而不大量損失IgG且在最終調配物中維 持低pH。通常，產物之蛋白質濃度為至少Μ%重量^積 一)’其中絕大部分（通常不小於95%)係邮，且阳在仲 範圍内此匕可促進對諸如病毒等金激中可能存在的病 原體的滅活。由於本發明之產物具有高⑻濃度且因此降 低了投與體積，故其適合於皮下及/或肌内投與。在某些 實施例中，IgG產物之黏度不大於18毫帕斯卡秒且因此亦 適合於靜脈内投與。由於可將靜脈内產物之品質屬性與皮 下及肌内產物所需之高濃度組合’故簡單稀釋亦可使得能 進行靜脈内投與。本發明IgG組合物之另一優點在於，其 在儲存期間具有優良穩定性。 在某些態樣中，本發明提供製備高濃度IgG製備物之方 法，其最終蛋白質濃度大於約17%且IgG純度為至少約 95%。在某些實施例中，製備物具有經延長穩定性且經調 配以供靜脈内、皮下、及/或肌内投與。 在另一態樣中，本發明提供根據本文所提供改良製造方 法製備之IgG組合物之醫藥組合物及調配物。在某些實施 例中，該等組合物及調配物提供相對於市場上其他現有 IVIG組合物經改良之特性。舉例而言，在某些實施例令， 148623.doc •13· 201107344 本文所提供組合物及調配物可在延長時間内保持穩定。在 另-實施例中，本文所提供組合物及調配物之邮濃产古 於市場上現有的其他屬組合物。在其他實施例中，本: 所提供組合物及調配物具有較高IgG濃度^在延 中保持穩定。 & 在另一態樣中，本發明提供治療免疫缺陷.、炎症性及自 1免疫疾病、及急性❹之方法，其包含投與使用本文所 &供改良方法製備之IgG組合物。 1·產生經濃縮及純化之IgG製備物 已闡述包含全抗體之⑽組合物可用於治療某些自身免 疫病況。（例如，參見美國專利公開案第us 2〇〇2/〇ιΐ48〇2 號、第US 2003/0099635號、及第us 2〇〇2/_182號卜該 等=考文獻中所揭示之⑽組合物包括多株抗體。 一般而言’本發明免疫球蛋白製備物可自任何適宜起始 材料來製備，例如回收血漿或原料血漿。在一典型實例 中，自健康提供者收集血液或血梁。通常’自與接受所投 二免疫球蛋白製備物之個體相同物種之動物收集血液(通 书稱作@源」免疫球蛋白）。藉由適宜程序自血液分離 免疫球蛋白，例如沉殿法（醇分級分離或聚乙二醇分級分 )層析法（離子父換層才斤、親和層析、免疫親和層析）、 超速離U法、及電泳製備法、及諸如此類。(例如，參見 C〇hn等人，乂版〜以仏68 459 75㈦心〇n咖等 人 乂版以㈣·71:541-50 (1949) ; Barundern 等 人〜7:157-74 (1962) ; Kobiet等人，Fox ☆«义 148623.doc 201107344 (1967);美國專利第5，i22,373號及第5川，⑼ 5虎，该等文獻之揭示内容係全文以引用方式併 用於所有目的）。 與上述方法不同，在—態樣中，本發明提供採用貧冷;東 沉澱物起始材料製備濃縮IgG組合物之方法。一般而言’ 本文所提供方法採用經修改cohn_〇ncle—分級分離步驟 及離子父換層析二者來提供較高IgG產率，同時維持與現 有市售IVIG製備物相同（若未改良）之品質。 在多種情形下，免疫球蛋白係自藉由熟f此項技術者孰 知之醇分級分離及/或離子交換層析及親和層析方法產I 之含γ球蛋白產物來製備。通常使用純化的c〇hn組份Η。 起始Cohn組份Π糊劑通常含有95%或约95% Ig(}且包括四種 IgG亞型。不同亞型存於組份π中之比率與其存於產生其 之混合人類血漿中之比率大致相同。在調配為可投與產物 之前對組份η實施進-步純化。舉例而言，可使組份_ 劑溶於純化冷醇水溶液中且經由沉澱及過濾來移除雜質。 在最終過濾後，可對免疫球蛋白懸浮液實施透析或透析過 濾（例如使用標稱分子量極限小於或等於1〇〇,〇〇〇道爾頓之 超濾膜）以移除醇。可對溶液實施濃縮或稀釋以獲得期望 蛋白質濃度，且可藉由熟習此項技術者熟知之技術對其進 行進一步純化。 可使用製備型步驟來富集特定同種型或亞型之免疫球蛋 白。舉例而言，可使用蛋白Α、蛋白G或蛋白Η瓊脂糖層析 來富集IgG免疫球蛋白或特定IgG亞型免疫球蛋白之混合 148623.doc -15- 201107344 物。（一般參見 Harlow 及 Lane，t/nwg 山·α，Cold

Spring Harbor Laboratory Press (1999) ; Harlow及 Lane， Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor

Laboratory Press (1988);美國專利第 5,180,8 10號）。 如下文所詳述，本發明高濃度IgG產物係藉由與產生 IVIG之方法具有多個相同或類似步驟之方法來產生。超渡/ 透析過濾之額外步驟使用開放通道型膜且在製程接近結束 時實施特別設計之後洗滌及調配，從而使所得IgG組合物 之蛋白質濃度（200 mg/mL)約為相關技術iviG(例如 GAMMAGARD® LIQUID)之兩倍且不影響產率及健存穩定 性。大多數市售超濾膜皆不能在不損失較多蛋白之情形下 達成200 mg/mL IgG之濃度。該等膜會過早封閉且因此難 以達成充分後洗滌。因此不得不使用開放通道型膜構造。 即使採用開放通道型膜，亦不得不使用特別設計之後洗滌 程序以獲得期望濃度且不造成較多蛋白質損失（損失小於 2%)。甚至更令人驚訝的事實在於，2〇0 mg/mL之較高蛋 白質濃度並不影響低pH儲存步驟之病毒滅活能力。產生高 濃度IgG組合物之通用方法包括以下步驟： A.分離冷凍沉澱物 純化方法通常始於使預先冷凍之混合血漿解凍，該混合 血漿已經安全性及品質因素檢查。解凍通常係在不高於 6 C之溫度下實施。然後在血漿解凍後於低溫下實施離心 或過濾以分離固體與液體，通常在與解凍時相同之低溫下 實施。隨後在下一步驟中處理液體部分（亦稱作「貧冷凍 148623.doc •16- 201107344 沉殿物血襞」，其係藉由離心或過遽自剛解;東血㈣除冷 不溶性蛋白後獲得）。此時可實施多個額外步驟來分離因 子VI11抑制劑旁路活性（factor eight inhibh〇r⑽咖 a^iVity)(FEIBA)、因子IX_複合體、因子vn濃縮物、或 抗凝血酶III-複合體，其詳述於實例1中。 B·獲得分級分離I之上清液 在此步驟中’通常使貧冷凍沉澱物血漿 約一將其PH調節至7·。或約7·。。在某些實^ 中’將PH調節至介於約7.〇與約7 5之間，較佳介於71或約 7」與7.3或約7_3之間’最佳為72或約72。在一實施例 中’將調節至7·〇或約7.〇。在另一實施例中，將pH調節 至7.1或約7」。在另_實施^，將阳調節至72或約 7.2。在另-實施例中，將pH調節至73或約73。在另—實 施例中’將pH調節至7.4或約7·4。在另一實施例巾，將阳 調節至7·5或約7.5。隨後在攪拌血漿的同時添加預冷卻乙 醇至8%ν/ν之目標乙醇濃度，使溫度進—步降低至介 於約_4C與約〇°C之間，較佳約-2°C，以使諸如α2_巨球蛋 白、PlA及Plc·球蛋白、、纖、維蛋白原' 及因子vm等污毕物 沉殿。通常，沉殿事件可包括至少約i小時之維持時間， 但亦可採用更短或更長維持時間。隨後，#由離心、過濾 或另適且方法來收集理想地含有貧冷凍沉澱物血漿中 全部1gG含量之上清液（上清液I)。 c·分級分離II+III之沉澱物 為進一步提高分級分離之IgG含量及純度，對上清液硪 J48623.doc -17. 201107344 施第二沉澱步驟。一般而言，將溶液之pH調節至介於約 6.8與約7_2之間、較佳7.0或約7.0之pH。然後在攪拌的同 時將醇（乙醇較佳）添加至溶液中至介於約20%與約25% (v/v)之間之終濃度。在一實施例中，醇之終濃度為2〇%或 約20%。在另一實施例中，最終醇濃度為21%或約21〇/〇。 在另一實施例中，最終醇濃度為22%或約22。/。。在另一實 施例中’最終醇濃度為23%或約23%。在另一實施例中， 最終醇濃度為24%或約24°/。。在另一實施例中，最終醇濃 度為25%或約25%。可進一步處理液體部分（亦稱作組份 ΙΙ+ΙΠ上清液）已提取因子V。在下一步驟中進一步處理此 步驟之沉澱物。在一實施例中，步驟B及C亦可一起實 施。 D.自分級分離II及III沉澱物進行提取 使用冷提取緩衝液以1份沉澱物存於15份提取緩衝液中 之典型比率來使組份II+III沉澱物再懸浮。實例性提取緩 衝液含有5 mM構酸二氫鈉及5 mM乙酸鹽，且pH為4 5土 0.2或約4.5±0.2且電導率為〇_7至0.9 mS/cm或約0.7至0.9 mS/cm。在一實施例中，提取緩衝液之電導率為〇 7 mS/cm 或約0.7 mS/cm。在另一實施例中，提取緩衝液之電導率 為0.8 mS/cm或約0.8 mS/cm。在另一實施例中，提取緩衝 液之電導率為0.9 mS/cm或約0.9 mS/cm。提取過程係在2〇c 至8°C或約2°C至8°C之溫度下實施。 可使用其他適宜再懸浮比率，例如約1:8至約1:3〇、或約 1:1〇至約1:20、或約1:12至約丨：18、或約1:13至約1:17、或 148623.doc • 18· 201107344 約1:14至約1:16。在某些實施例中，再懸浮比率可為以下 比率或約為以下比率·· 1:8、1:9、1:1〇、1:11、1:12、 1:13 、 1:14 、 1:15 、 1:16 、 1:17 、 1:18 、 1:19 、 1:20 、 1:21 、 1:22 、 1:23 、 1:24 、 1:25 、 1:26 、 1:27 、 1:28 、 1:29、1:30、或更高。 用於提取Π+ΙΙΙ沉澱物之適宜溶液的pH一般介於約4 〇與 約5.5之間。在某些實施例中，溶液之？11可介於約4 〇與約 5.0之間。在另一實施例中，溶液ipH可介於約4 5與約5 〇 之間。在其他實施例t，提取溶液之pH可為約4 〇、4」、 4.2、 4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、 5.2、 5.3、5.4或5.5。在一實施例中，提取缓衝液之pH可 為4.5或約4.5。在另一實施例中，提取緩衝液之？11可為46 或約4.6。在另一實施例中，提取緩衝液可為4 7或約 4.7。在另一實施例中，提取緩衝液之pH可為4 8或約4 8。 在另一實施例中，提取緩衝液2pH可為4 9或約4·9。在另 貫施例中’提取緩衝液之pH可為5 ·〇或約5.〇。 提取緩衝液之電導率較佳為約〇 5 至約2 〇 S cm 。舉例而s，在某些實施例中，提取緩衝液之電 導率可為0.5 mS·cm 1或約〇.5 mS.cm-1，或為以下數值或約 為以下數值：0.6、0.7、〇.8、〇.9、1.〇、K1、L2、！ 3、 U、1·5、1.6、1.7、1.8、1·9、或約 2.0 mS.cm·1。熟習此 項技術者可瞭解如何獲得具有適當電導率之提取緩衝液。 E•煙化二氧化矽處理及過濾 在某些實施例中，將煙化二氧化矽（例如氣相二氧化矽 148623.doc •19· 201107344 (Aerosil)380或等效物）添加至上一步驟之懸浮液中至濃度 為40 g/kg懸浮液或約40 g/kg懸浮液，或等效於1.8 g/升貧 冷凍沉澱物血漿。在約2°C至8°C下混合至少50至70分鐘。 在某些情形下’添加助濾劑（例如得自World Minerals之

Hyfl〇-Supper-Cel ’ 以 0.5 kg/kg懸浮液或約 0.5 kg/kg懸浮液 之濃度使用）以促進隨後藉由過渡來分離液體/固體之步 驟。使用提取緩衝液實施壓濾機之後洗滌。將過渡過程維 持在約2°C至8°C之溫度下。 F.沉澱物G之分級分離 然後將上一步驟之濾液與聚山梨醇酯_8〇混合至濃度g 0.2% w/v或約0.2% w/v並在約2。(：至8。(：之溫度下攪拌至j 3〇分鐘。然後將去水檸檬酸鈉混合至溶液中以8 g/升或約 g/升，且在約2°C至8°C之溫度下再攪拌3〇分鐘。然後將2 液之pH調節至7.0 土 0.1或約7.0±(M。在某些實施例中，月 氫氧化鈉或乙酸調節pH。然後將冷醇添加至溶液中至濃方 為 25¾ v/v或約 25% v/v，並實施盥 c〇hn TTts γ 只％、L〇nn U頬似之沉澱当 驟。 G. 沉澱物G之懸浮 使上一步驟之沉澱物溶解並用標稱孔徑為〇2 之深 遽膜（例如C_ VR〇6據膜或等效物）過據以獲得澄清 液。在另—實施财，溶解沉澱物且隨後進行離心以回 澄清上清液。 H. 溶劑及洗滌劑處理 使用上一步驟之濾液進扞玄琳丨 逆仃冷劑/洗滌劑處理。典型溶, 148623.doc •20- 201107344 洗滌劑處理混合物包含丨0%(Wv)Trit〇n χ1〇〇、〇 3%(V/V) TWeen-80、及〇.3%(v/v)TNBp，且通常將該混合物在約 18 C至25 C之溫度下維持至少6〇分鐘。洗滌劑處理血漿源 組份之方法為業内所熟知。一般而言，可結合本文所提供 方法使用任何標準非離子型洗滌劑處理。 1_陽離子交換層析 為自經S/D處理之PptG濾液進一步純化並濃縮IgG，可採 用陽離子交換及/或陰離子交換層析。使用離子交換層析 純化並濃縮IgG之方法為業内所熟知。舉例而言，美國專 利第5,886，154號闡述如下方法：其中在低pH(介於約3 8與 4 · 5之間）下提取組份ιΙ+ΙΙΙ沉澱物，之後使用辛酸使“ο沉 澱，且最後實施兩個陰離子交換層析步驟。美國專利第 6,069,236號闡述完全不依賴醇沉澱之層析型IgG純化方 案。PCT專利公開案第w〇 2〇〇5/〇73252號闡述Ig(}純化方 法，其涉及提取組份ιι+ιπ沉澱物、辛酸處理、PEG處理、 及單一陰離子交換層析步驟。美國專利第7，186,41〇號闡述 IgG純化方法，其涉及提取組份Ι+ΙΙ+ΙΠ或組份〗〗沉澱物， 之後在驗性pH下貫施單一陰離子交換步驟。美國專利第 7,5 53,938號闡述一種方法，其涉及提取組份Ι+Π+ΙΙΙ或組 份II+III沉澱物、辛酸鹽處理、及一個或兩個陰離子交換 層析步驟。美國專利第6,〇93,324號闡述純化方法，其包含 使用在介於約6.0與約6.6之間之pH下作業之大孔陰離子交 換樹脂。美國專利第6,835,379號闡述在不存在醇分級分離 之情形下依賴陽離子交換層析之純化方法。 148623.doc -21- 201107344 在一實施例中’隨後使上一步驟中含有溶劑/洗滌劑之 蛋白質溶液流過陽離子交換管柱以移除溶劑及洗務劑。在 洗出SD試劑後，隨後用高pH洗脫緩衝液洗脫所吸附蛋白 質。在一實施例中，洗脫緩衝液之pH可介於約7.5與約9 5 之間。在另一實施例中’洗脫緩衝液之pH可介於約8.〇與 約9.0之間。在一較佳實施例中，洗脫緩衝液ipH可為8 5 土0·1 或約 8.5±0.1。 J. 陰離子交換層析 將上一步驟之洗出液調節至ρΗ 6且稀釋至適宜電導率以 用於隨後經平衡之陰離子交換管柱。收集裝載及洗滌期間 之管柱流過液（flow-through)以用於進一步處理。 K. 奈米過濾 為進一步降低本文所提供IgG組合物之病毒載量，可使 用適宜奈米過濾裝置對陰離子交換管柱流出液實施奈米過 濾。在某些實施例中，奈米過濾裝置之平均孔徑可介於約 1 5 nm與約200 nm之間。適用於此應用之奈米濾膜之實例 包括（但不限於）DVD、DV 50、DV 20 (Pan)、viresolve NFP、Viresolve NFR (Millipore)、Planova 15N、20N、 35N、及75N(Planova)。在一具體實施例中，奈米濾膜之 平均孔徑可介於約1 5 nm與約72 nm之間，或介於約〖9 nm 與約35 nm之間，或為15 nm、19 nm ' 35 nm或72 nm或約 1 5 nm、1 9 nm、35 nm或72 nm。在一較佳實施例中，奈米 渡膜之平均孔性可為35 nm或約35 nm，例如Asahi PLANOVA 3 5N濾膜或其等效物。 148623.doc -22- 201107344 L_超濾及透析過濾 在貫施奈米過滤後’藉由超渡將慮液進一步濃縮至蛋白 質濃度為5±1% w/v。在某些實例中，超濾係具有開放通道 型篩網之盒中實施且超濾膜之標稱截留分子量（NMWC〇) 為50 kDa或更低。 在一實施例中，可藉由超濾來將奈米濾液濃縮至蛋白質 濃度介於約2%與約10%(w/v)之間。在某些實施例中，在 具有開放通道型篩網之盒中實施超濾且超濾膜之標稱截留 分子量（NMWCO)小於約1〇〇 kDa或小於約90、80、70、 60、5〇、4〇、30 kDa、或更小。在一較佳實施例中，超濾 膜之NMWCO不超過50 kDa。 在完成超濾步驟後’可藉由相對於適合靜脈内或肌内投 與之溶液實施透析過濾來進一步濃縮濃縮物。在某些實施 例中，透析過濾溶液可包含穩定及/或緩衝劑。在—較佳 實施例中，穩定及緩衝劑係具有適宜濃度之甘胺酸，例如 濃度介於約0.20 Μ與約〇.3〇 Μ之間，或介於約0 22 M與約 0.28 Μ之間，或介於約0.24 Μ與約0.26 Μ之間，或濃产為 以下數值或約為以下數值：2.0、2.1 ' 2.2、2.3、2 4 2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、或3.0。在一較佳實施例中透 析過濾緩衝液含有0.25 Μ或約0.25 Μ甘胺酸》 在一較佳實施例中，在完成超濾步驟後，相對於〇 25 Μ 低pH甘胺酸溶液對濃縮物實施透析過濾。通常，最小交換 體積為初始濃縮物體積之6倍，且將溶液濃縮至蛋白質濃 度為20% w/v以上。在透析過濾及濃縮過程結束時，溶液 148623.doc •23- 201107344 之pH通常介於4.4至4·9之間。 通常’最小交換體積為初始濃縮物體積之至少約3倍或 初始濃縮物體積之至少約4、5、6、7、8、9、或更多倍。 可將IgG溶液濃縮至最終蛋白質濃度介於約5%與約22% (w/v)之間，或介於約10%與約22%(w/v)之間，或介於約 15%與約22%(w/v)之間，或介於約18%與約22%(w/v)之 間，或介於約20%與約12%之間，或濃縮至終濃度為以下 數值或約為以下數值：5°/。、或6°/。、7%、8%、9%、10〇/〇、 11%、120/〇、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、 20°/。、21°/。、22%、或更高。在較佳實施例中，可將IgG溶 液濃縮至最終蛋白質濃度為約20%或約20%至22%之間或 約22% »通常’在濃縮過程結束時，溶液之pH可介於約4.6 至5.1之間。 M.調配 在完成透析過濾步驟後，用透析過濾緩衝液將溶液之蛋 白質濃度調節至終濃度介於約5°/。與約20%(w/v)之間，或 介於約10%與約20%(w/v)之間，或介於約15%與約20% (w/v)之間，或介於約18%與約2〇%(w/v)之間，或調節至終 濃度為約 5% 或 6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、 13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、或 20%。在一 較佳實施例中，溶液之最終蛋白質濃度介於19%或約19% 與2 1 %或約2 1 %之間。在一較佳實施例中，在完成透析過 濾後’用透析過濾緩衝液將溶液之蛋白質濃度調節至剛剛 超過 20% w/v，例如 20.4土0.4% w/v或約 20_4土0.4% w/v。 148623.doc • 24· 201107344 Ν·進一步滅菌 藉由首先經由、.€·對孔控為〇.2微米或更小之膜過遽器過 遽來對_配總體溶液進行進—步滅g。然後以無菌方式 將溶液分配至適當㈣之最終容器中，且取樣以供測試。 最終步驟係將密封容堯在3(rc至32t下儲存延長時間段， 例如21至22天。 II. 濃縮IgG組合物 在一態樣中，本發明係關於藉由本文所提供方法製備之 水性IgG組合物。一般而言，藉由本文所述新穎方法製備 之IgG組合物可具有尚igG含量及純度。舉例而言，本文所 提供IgG組合物之蛋白質濃度可為至少約15%(w/v)且IgG含 里大於90%之純度。忒等高純度igG組合物適合於治療性 投與’例如適合皮下及/或肌内投與。在一實施例中，本 文所提供IgG組合物適合於藉由（例如）在投與前稀釋來進 行靜脈内投與。在一實施例中，IgG濃度為20%或約20%且 用於皮下或肌内投與。 在一實施例中’本發明提供藉由包含以下步驟之方法製 備之水性IgG組合物： (1) 藉由離心自血漿分離液體與沉澱物； (2) 混合預冷卻乙醇與來自（1)的液體以形成混合物， 該混合物之乙醇濃度為8°/。（v/v)或約8% (v/v); (3) 藉由離心自（2)之混合物分離液體與沉澱物； (4) 將（3)之液體之pH及乙醇濃度分別調節至7.0或約 7.0及20-25% (v/v)，由此形成混合物； •25· 148623.doc 201107344 (5) 藉由離心自（4)之混合物分離液體與沉澱物； (6) 用緩衝液以約1比1 5之重量比使（5)之沉澱物再懸 浮以形成懸浮液； (7) 混合二氧化石夕（Si〇2)與（6)之懸浮液並藉由過濾獲 得滤液， (8) 混合洗滌劑及冷醇與（7)之濾液並藉由離心獲得沉 澱物； (9) 使沉澱物溶於包含溶劑或洗滌劑之水性溶液中並 將該溶液維持至少60分鐘； (1〇)在（9)後使溶液流過陽離子交換層析管柱並將吸附 在管柱上之蛋白洗脫於洗出液中； (11) 使（10)之洗出液流過陰離子交換層析管柱以獲得 流出液； (12) 使流出液流過奈米過濾器以獲得奈米渡液； (13) 使奈米濾液流過超濾膜以獲得超遽液； (14) 相對於透析過濾緩衝液對超濾液進行透析過濾， k而獲得蛋白質濃度為20% (w/v)或約2〇% (w/v) 之溶液；及 (15) 藉由經由〇.2 μηι或更小之濾膜過濾溶液來對（14) 之溶液進行滅菌，由此獲得濃縮1§(：丨組合物。 在一實施例中，本發明提供水性Ig(3組合物，其蛋白質 濃度介於約150 g/L與約250 g/L之間。在某些實施例中， IgG組合物之蛋白質濃度介於約175 g/L與約225 g/L之間， 或"於約200 g/L與約225 g/L之間，或為該等範圍内之任 I48623.doc •26- 201107344 一適宜濃度，例如以下濃度或約為以下濃度：1 50 g/L、 155 g/L、160 g/L、165 g/L、170 g/L、175 g/L、180 g/L 、 185 g/L 、 190 g/L 、 195 g/L 、 200 g/L 、 205 g/L 、 210 g/L 、 215 g/L 、 220 g/L 、 225 g/L 、 230 g/L 、 235 g/L 、 240 g/L、245 g/L、250 g/L、或更高。在一較佳實施例中，水 性IgG組合物之蛋白質濃度為200 g/L或約200 g/L。在一尤 佳實施例中，水性IgG組合物之蛋白質濃度為204 g/L或約 204 g/L。 本文所提供方法使得可製備具有極高純度之IgG組合 物。舉例而言，在一實施例中，本文所提供組合物中至少 約95%之總蛋白可為IgG。在其他實施例中，至少約96%之 蛋白為IgG，或組合物中總蛋白之至少約97%、98%、 99%、99.5%、或更多可為IgG。 類似地，本文所提供方法使得可製備含有極低污染物含 量之IgG組合物。舉例而言，在某些實施例中，提供含有 小於約100 mg/L IgA之IgG組合物。在其他實施例中，IgG 組合物可含有小於約50 mg/L IgA、較佳小於約35 mg/L IgA、最佳小於約20 mg/L IgA。 III.醫藥組合物 在另一態樣中，本發明提供包含藉由本文所提供方法製 備之純化IgG之醫藥組合物及調配物。一般而言，藉由本 文所述新穎方法製備之IgG醫藥組合物及調配物可具有高 IgG含量及純度。舉例而言，本文所提供IgG醫藥組合物及 調配物之蛋白質濃度可為至少約15% (w/v)且IgG含量可大 148623.doc •27- 201107344 於約90%純度。該等高純度IgG組合物適合於治療性投 與，例如適合皮下及/或肌内投與。在一實施例中，本文 所提供IgG組合物適合於藉由（例如）在投與前稀釋來進行 靜脈内投與。在一實施例中’ IgG濃度為20%或約20%且用 於皮下或肌内投與。 在一實施例中’本文所提供醫藥組合物係藉由調配使用 本文所提供方法分離的水性IgG組合物來製備^ 一般而 言，可對經調配組合物實施至少一個、較佳至少兩個、最 佳至少三個病毒滅活或移除步驟。可用於本文所提供方法 中之病毒滅活或移除步驟之非限制性實例包括溶劑洗滌劑 處理（Horowitz等人，B/ooi/ Coagw/ FUrz^io/少仏 1994(5增 刊 3).S21-S28，及 Kreil 等人，2003 (43):1023_ 1028’兩個參考文獻都是全文以引用方式明確併入本文中 以用於所有目的）、奈米過濾（Hamam〇t〇等人，〜X心叹 1989 (56)230-236 ;及 Yuasa等人，j κ>〇/ 1991 (72 (pt 8)):2〇2 1-2024，兩個參考文獻都是全文以引用方式明 確併入本文中以用於所有目的）、及在高溫下之mpH培育 (Kempf 等人，1991 (31)423 427;及^卜等 人，价1994 (22):13-19)。 在某些實施例中，提供IgG含量介於約175 g/L IgG與約 225 g/L IgG之間之醫藥調配物。一般而言，該等ivi(j係藉 由以下方式來製備：使用本文所述方法自血聚分離IgG組 合物，濃縮該組合物，並在適合靜脈内投與之溶液中調配 經濃縮組合物。可使用熟習此項技術者已知之任何適宜方 148623.doc -28· 201107344 法來濃縮IgG組合物^在一實施例中，藉由超濾/透析過濾 來/辰縮組合物。在某些實施例中，用於濃縮組合物之超濾 裝置可採用標稱截留分子量（NMWc〇)小於約1〇〇 kDa或小 於約90、80、70、60、50、40、30 kDa、或更小之超濾 膜。在一較佳實施例中，超濾膜之NMWCO不超過50 kDa。可使用熟習此項技術者已知之任何適宜技術來達成 緩衝液交換。在一具體實施例中，藉由透析過濾來達成緩 衝液交換。 在一具體實施例中’提供IgG之醫藥組合物，其中igG組 合物係使用包含以下步驟之方法自血漿來純化： (1) 藉由離心自血漿分離液體與沉澱物； (2) 混合預冷卻乙醇與來自（1)的液體以形成混合物， 5亥混合物之乙醇》農度為8% (v/v)或約8% (v/v); (3) 藉由離心自（2)之混合物分離液體與沉澱物； (4) 將（3)之液體之pH及乙醇濃度分別調節至7.0或約 7.0及20-25% (v/v)，由此形成混合物； (5) 藉由離心自（4)之混合物分離液體與沉澱物； (6) 用緩衝液以約1比15之重量比使（5)之沉澱物再懸 浮以形成懸浮液； (7) 混合二氧化矽（Si〇2)與（6)之懸浮液並藉由過濾獲 得丨慮液， (8) 混合洗滌劑及冷醇與（7)之;慮液並藉由離心獲得沉 澱物； (9) 使沉澱物溶於包含溶劑或洗滌劑之水性溶液中並 148623.doc •29· 201107344 將違溶液維持至少60分鐘； (10)在（9)後使溶液流過陽離子交換層析管柱並將吸附 在官柱上之蛋白洗脫於洗出液中； ⑴）使（10)之洗出液流過陰離子交換層析管柱以獲得 流出液； (12) 使流出液流過奈米_器以獲得奈求遽液； (13) 使奈米濾液流過超濾膜以獲得超濾液； (14) 相對於透析過遽緩衝液對超遽液進行透析過滤， 從而獲得蛋白質濃度為20% (w/v)之溶液；及 藉由、座由0,2 μηι或更小之濾膜過濾溶液來對（丨4) 之溶液進行滅菌，由此獲得濃縮IgG組合物。 曲在一實施例中’本發明提供㈣醫藥组合物，其蛋白質 濃度介於約150 g/L與約25〇 g/L之間。在某些實施例中， ㈣組合物之蛋白質濃度介於約175 g/L與約225 g/L之間， 或"於約 2〇〇 g/L 盘 rr/T P9 , g ，、、.勺225 g/L之間，或為該等範圍内之任 -適宜濃度’例如以下濃度或約為以下濃度：15〇 * 155 g/L、160 g/L、165 g/L ' 17〇 —、i75 抑、刚 g/L、185 g/L、19〇 g/L、195 g/L、2〇〇 —、2〇5 心、2ι〇 g/L 、 215 g/L 、 220 g/L 、 225 g/L 、 230 g/L 、 235 g/L 、 240 g/L 245 g/L ' 250 g/L、或更高。在一較佳實施例中，水 性18(}組合物之蛋白質濃度為200 g/L或約200 g/L。在一尤 佳實施例中’水性IgG組合物之蛋白質濃度為2〇4 Μ或約 204 g/L。 本文所提供方法使得可製備具有極高純度之賊醫藥組 148623.doc 201107344 合物。舉例而言，在一實施例中，本文所提供組合物中至 少約95%之總蛋白可為igG。在其他實施例中，至少約96〇/〇 之蛋白為IgG ’或組合物中總蛋白之至少約97%、98%、 99%、99.5%、或更多可為ig(^ 類似地，本文所提供方法使得可製備含有極低污染物含 量之IgG醫藥組合物。舉例而言，在某些實施例中，提供 含有小於約100 mg/L IgA之IgG組合物。在其他實施例 中’ IgG組合物可含有小於約5〇 mg/L IgA、較佳小於約35 mg/L IgA、最佳小於約 20 mg/L IgA。 本文所k供商樂組合物通常可包含一或多種適合靜脈内 投與之緩衝劑或pH穩定劑。適合調配本文所提供igG組合 物之緩衝劑之非限制性實例包括甘胺酸、擰檬酸鹽、鱗酸 鹽、乙酸鹽、麩胺酸鹽、酒石酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、 組胺酸或其他胺基酸、葡糖酸鹽、蘋果酸鹽、琥珀酸鹽、 甲酸鹽、丙酸鹽、碳酸鹽、或其調節至適宜pH之任一組 合。一般而言’緩衝劑可足以將調配物中之適宜pH維持延 長時間段。在一較佳實施例中，緩衝劑係甘胺酸。 在某些實施例中’緩衝劑在調配物中之濃度可介於約 100 mM與約400 mM之間，較佳介於約15〇 mM與約35〇 mM之間，更佳介於約150 mM與約300 mM之間，最佳介於 約175 mM與約225 mM之間。在一尤佳實施例中，濃縮 組合物可包含介於約150 mM與約250 mM之間之甘胺酸， 表佳包含約200 mM甘胺酸。在另一較佳實施例中，濃縮 IgG組合物可含有250 mM或約250 mM甘胺酸。 148623.doc -31 - 201107344 在某些實施例中，調配物之pH可介於約4 ·丨與約5 6之 間，較佳介於約4.4與約5.3之間，最佳介於約4.6與約5.丨之 間。在特定實施例中’調配物之阳可為約4丨、4 2、4 3、 4·4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0 ' 5.1、5.2、5.3、 5·4、5.5、或 5.6 〇 在某些實施例中’本文所提供醫藥組合物視需要可另外 包含用於調節組合物容積滲透濃度之試劑。容積滲透濃度 試劑之非限制性實例包括甘露醇、山梨醇、甘油、蔗糖、 葡萄糖'右旋糖、左旋糖、果糖、乳糖、聚乙二醇、磷酸 鹽、氣化納、氣化卸、氯化弼、葡糖酸葡庚糖酸約、二曱 基碉、及諸如此類。 通常，本文所提供調配物之容積滲透濃度可與生理容積 渗透濃度相當’為約285-295 mOsmol/kg(Lacy等人， /«/brmaiz·⑽ 1999:1254)。在某些實施 例中，調配物之容積滲透濃度可介於約200 mOsmol/kg與 約350 mOsmol/kg之間，較佳介於約240與約300 mOsmol/kg之間。在特定實施例中，調配物之容積滲透濃 度可為約 200 mOsmol/kg、或 210 mOsmol/kg 、230 mOsmol/kg、250 mOsmol/kg、265 mOsmol/kg、280 mOsmol/kg、295 mOsmol/kg、320 mOsmol/kg、240 mOsmol/kg ' 255 mOsmol/kg、270 mOsmol/kg、285 mOsmol/kg、300 mOsmol/kg 、330 mOsmo.l/kg、220 mOsmol/kg 、245 mOsmol/kg 、260 mOsmol/kg 、275 mOsmol/kg 、290 mOsmol/kg 、310 mOsmol/kg 、 340 148623.doc -32- 201107344 mOsm〇l/kg、340 mOsmol/kg、或 350 mOsmol/kg » 本文所提供IgG調配物一般可在延長時間段内以液體形 式保持穩定。在某些實施例中，調配物可在室溫下穩定至 少約3個月’或在室溫下穩定至少約4、5、6、7、8、9、 、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、或24個月。調配物一般亦可在冷凍條件（通常介 於約2°C與約8°C之間）下穩定至少約18個月，或在冷;東條 件下穩定至少約 21、24、27、30、33、36、39、42、或 45 個月。

IgG製備物之投與 如現代醫學中的常規實踐，使用濃免疫球蛋白（尤其 JgG)之滅菌製備物來治療屬於以下三大類之醫學病況：免 疫缺陷、炎症性及自身免疫疾病、及急性感染。該等 製備物亦可用於治療多發性硬化症（尤其復發-緩解型多發 性硬化症或RRMS)、阿茲海默氏病（Alzheimeris disease)、 及帕金森氏病（Parkinson’s disease)。本發明之純化IgG製 備物適合於該等目的以及臨床上可接受之IgG製備物之其 他應用》 FDA已批准使用iVIG來治療各種適應症，包括異基因骨 髓移植、慢性淋巴細胞白血病、特發性血小板減少性紫癜 (ITP)、兒科HIV、原發性免疫缺陷、川崎病⑽卿也 disease)、慢性炎症性脫髓鞘性多發性神經病、及 具有高抗體接受者或具有AB◦不相容性提供者之腎移植。 在某些實施例中’本文所提合物可用於治療或管 148623.doc -33- 201107344 控該等疾病及病況。 此外’一般向患者提供IVIG之標示外應用以治療或管控 各種適應症’例如慢性疲勞症候群、難辨梭菌結腸炎、皮 肌炎及多肌炎、格雷夫氏眼病（Graves' ophthalmopathy)、 吉蘭-巴雷症候群（Guillain-Barr6 syndrome)、肌營養不良 症、包涵體肌炎、蘭伯特-伊頓症候群（Lambert Eat〇n syndrome)、紅斑狼瘡、多灶性運動神經病、多發性硬化 症（MS)、重症肌無力、新生兒同種免疫性血小板減少症、 細小病毒B19型感染、天皰瘡、輸血後紫癜、腎移植排 斥、自然流產/流產、僵硬人症候群、眼陣攣-肌陣攣症候 群、成年危重病人之嚴重敗血症及膿毒性休克、中毒性表 皮壞死溶解症、慢性淋巴細胞白血病、多發性骨髓瘤、χ_ 連鎖丙種球蛋白缺乏血症、及低丙球蛋白血症。在某些實 施例中，本文所提供IVIG組合物可用於治療或管控該等疾 病及病況。 最後’業内已提出IVIG用於治療或管控包括原發性免疫 缺陷、RRMSm海默μ及料錢病㈣之疾病之 實驗性應用（美國專利申請公開案第u s 2〇〇9/〇148463 號，其係全文以引用方式併入本文中以用於所有目的）。 在某些實施例中’本文所提供㈣組合物可用於治療或管 控原發性免疫缺陷、_、阿兹海默氏病或帕金森氏 病。在包含每曰投藥法之某些實施例中，可由醫師在考慮 以下個體差異後來確定投與個體之有效量：年齡、體重: 疾病嚴重度、投藥路徑（例如靜脈内對皮下）及對療法之反 148623.doc -34- 201107344 應。在某些實施例中，本發明免疫球蛋白製備物可以每天 約5 mg/公斤至約2〇〇〇 mg/公斤之量投與個體。在其他實施 例中’免疫球蛋白製備物可依以下用量投藥：至少約j 〇 mg/ a斤、至少15 mg/公斤、至少2〇 mg/公斤、至少25 mg/ 么斤、至少30 mg/公斤、或至少5〇 mg/公斤。在其他實施 例中’免疫球蛋白製備物可依每天最多約1〇〇 mg/公斤、 最多約150 mg/公斤、最多約200 mg/公斤、最多約250 mg/ 公斤、最多約300 mg/公斤' 最多約4〇〇 mg/公斤之劑量投 與個體。在其他實施例中，免疫球蛋白製備物之劑量可增 加或減少。此外，免疫球蛋白製備物可每天投與一或多個 d量。熟悉IgG製備物所治療疾病之臨床醫師可根據業内 已知之標準來確定患者之適宜劑量。 調配一種常用IgG產物（靜脈内免疫球蛋白或IVIG)以供 靜脈内投與。由於本發明IgG製備物已達到極高免疫球蛋 白濃度（20% w/v或更高），從而顯著降低治療性有效劑量 之體積，故本發明組合物尤其有利於向患者進行皮下及/ 或肌内投與，即使靜脈内投藥法仍為可選用之投藥方式。 術語「有效量」係指免疫球蛋白（尤其IgG)製備物可使 個體所接受治療醫學病況（例如原發性免疫缺陷、RRMS、 阿茲海默氏病、帕金森氏病等）獲得改善或補救之量。可 由醫師在考慮以下個體差異後來確定投與個體之有效量： 年齡、體重、疾病嚴重度、投與路徑（例如靜脈内對皮下） 及對療法之反應。在某些實施例中，本發明免疫球蛋白製 備物可以每天約5 mg/公斤至約2000 mg/公斤之量投與個 148623.doc •35- 201107344 體。在其他實施例中，免疫球蛋白製備物可以以下量來投 與：至少約10 mg/公斤、至少15 mg/公斤、至少20 mg/公 斤、至少25 mg/公斤、至少30 mg/公斤、或至少50 mg/公 斤。在其他實施例中，免疫球蛋白製備物可以每天最多約 1 00 mg/公斤、最多約150 mg/公斤、最多約200 mg/公斤、 最多約250 mg/公斤、最多約300 mg/公斤、最多約400 mg/ 公斤之劑量來投與個體。在其他實施例中，免疫球蛋白製 備物之劑量可較大或較小。此外，免疫球蛋白製備物可每 天投與一或多個劑量。熟悉IgG製備物所治療疾病之臨床 醫師可根據業内已知之標準來確定患者之適直劑量。 在某些實施例中，濃縮IgG製備物可以每次投與約5 mg/ 公斤至約2000 mg/公斤之劑量投與個體。在某些實施例 中，劑量可為至少約5 mg/kg、或至少約10 mg/kg、或至少 約 20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg、60 mg/kg、 70 mg/kg、80 mg/kg ' 90 mg/kg、100 mg/kg、125 mg/kg、 150 mg/kg ' 175 mg/kg、200 mg/kg、250 mg/kg、300 mg/kg、350 mg/kg、400 mg/kg、450 mg/kg、500 mg/kg、 5 50 mg/kg ' 600 mg/kg、650 mg/kg、700 mg/kg、750 mg/kg、800 mg/kg、850 mg/kg、900 mg/kg、950 mg/kg、 1000 mg/kg、1100 mg/kg、1200 mg/kg、1300 mg/kg、 1400 mg/kg ' 1500 mg/kg、1600 mg/kg、1700 mg/kg、 1 800 mg/kg,、1900 mg/kg、或至少約 2000 mg/kg ° 根據本發明，完成治療時程所需時間可由醫師來確定且 可介於短至一天至一個月以上之範圍内。在某些實施例 148623.doc -36· 201107344 中，治療時程可為丨至6個月。 辰縮IgG治療之劑量及頻率尤其取決於以下因素.所▲ 療疾病或病泥及患者疾病或病況的嚴重度。-般而言，: 於原發性免疫功能障礙而言，可大約每3至4週投與介於約 100 mg/kg體重與約彻mg/kg體重之間之劑量。對於神經 性及：身免疫疾病而言，經3至6個月投與最多2 *體 重，每月投與一次，每次時程為5天。此一般補充有維持 療法，其包含大約每3至4週投與一次介於約1〇〇喻㈣ 重與約？〇 mg/kg體重之間之劑量…般而言，患者可接 受大約每14至35天、或A約每21至28天_次之投藥或治 療。治療頻率尤其取決於以下因素：所治療疾病或病況及 患者疾病或病況之嚴重度。 々在-較佳實施例中’提供治療有需要之人類之免疫缺 陷、自身免疫疾病、或急性感染之方法’該方法包含投與 本發明IgG醫藥組合物。 〃 實例 僅以》兒明性方式而非限制性方式提供以下實例。熟習此 項技術者可容易地瞭解多種非關鍵參數，可對該等參數進 行改變或修改而獲得基本上相同的結果。 實例1 :各種IgG濃縮及調配之穩定性研究 1·目的 此研究之目的係比較具有較高蛋白質濃度之低pH調配 (0.25 Μ甘胺酸，pH 4.4_4.9，如在濃溶液中所量測）與當前 用於肌内及皮下可注射免疫球蛋白之中性pH調配（22 5 g/1 I48623.doc •37· 201107344 甘胺酸，3 g/l NaCl ’ pH 7)之儲存穩定性。 2.實驗設計 所有試驗皆以將奈米濾液濃縮至5%蛋白質開始。相對 於0· 1 5 Μ甘胺酸（所研究最低甘胺酸濃度）進行十倍緩衝液 交換’之後最終濃縮至高於20%蛋白質之目標值。在第一 組實驗中使用截留分子量為30 Κ之〇_5 m2聚醚砜Millipore 膜（普通篩網），而第二組實驗係使用具有開口篩網之〇. 5 m2聚趟ί風Millipore膜來實施，該篩網更適合具有較高黏度 之溶液，且藉由具有較小膜表面積（〇. 1 m2，開口篩網）之 第二超濾/透析過濾裝置來濃縮後洗滌組份以降低產率損 失。 在低pH下調配並儲存最終容器，或整體實施低pH儲存 且隨後在儲存前於中性pH下對其進行調配。 表1 :超濾/透析過濾步驟（30 K聚醚砜膜）及最終容器pH之 概述 0.5 m2超濾裝置 標準篩網 標準篩網 開口篩網 開口篩網 0.1 m2超濾裝置 益 益 開口篩網 開口篩網 最終容器pH 4.7 7 4.7 7 3·測試方法 PH : pH係用配備有 Mettler Toledo L〇T405-DPA-SC-S8/120 電極及 ρτ looo 溫度探頭之 Knick P〇rtamess 911 型 XPH來測試。 148623.doc •38· 201107344 蛋白質：蛋白濃度值係使用雙縮脲法（Biuret)來測定。 分子量分佈係藉由使用高效尺寸排除層析來測試。 ACA效價係如歐洲藥典（European Pharmacopoeia)中所述 來測試。 4. 驗收標準 界定以下驗收標準： •藉由HPLC來量測分子量分佈： i. 單體及寡聚體/二聚體290% ii· 聚集體：係針對IV投與而言） • ACA效價： 對於IV投與小於50%所消耗CH50單位/mg蛋白。 5. 結果及討論 5.1. 比較在低pH(pH 4.7及pH 7.0)下調配之製備物中 的聚集體及片段含量及AC A效價 在下表2中，展示在28至30°C下儲存3個月後不同蛋白質 濃度之標準調配（pH 4.7，0.25 Μ甘胺酸；或pH 7.0，22.5 g/L甘胺酸，3 g/L NaCl)之聚集體及片段含量以及ACA效 價。 表2 :在28至30°C下儲存3個月後，不同蛋白質濃度之低 pH與pH 7.0調配的片段、聚集體及ACA值 片段％ 聚集體％ AC A效價％ 蛋白質 pH 4.7 pH 7.0 pH 4.7 pH 7.0 pH 4.7 pH 7.0 14% 1.35 1.50 0.10 0.92 44.1 52.0 16% 1.24 1.38 0.08 0.91 40.5 53.1 18% 1.24 1.60 0.11 0.93 40.3 52.4 20% 1.35 1.52 0.12 0.93 37.5 62.7 14S623.doc -39· 201107344 數據明確顯示’在28至3(TC下儲存3個月後，低pH調配 具有較低聚集體及較低ACA效價。pH 7調配之所有ACA效 價皆高於此測試所界定之驗收標準。表3中展示在2至8它 下儲存3個月後之數值。 表3 :在2至下儲存3個月後，不同蛋白質濃度下低？11 與pH 7.0調配的片段、聚集體及aCa值 片， V/〇 聚集體。/〇 ACA效價 蛋白質 pH 4.7 pH 7.0 pH 4.7 pH 7.0 pH 4.7 pH 7.0 14% 0.36 1.80 0.16 1.09 38.3 46.5 16% 0.30 0.51 0.11 1.01 37.4 44.7 18% 0.33 1.10 0.17 0.86 35.8 39.8 20% 0.33 1.98 0.20 1.06 36.1 46.0 在2至8°C下之結果證實了在28至30。(：下觀察到之傾向。 ACA效價皆低於驗收標準所界定之限值，但pH 7.〇調配似 乎具有較高數值。蛋白濃度值不影響所測試參數之結果。 5·2不同濃縮程序對製備物iGSC60(pH 4.7，A-篩網）及 IGSC62(pH 4·7，V-篩網，用較小UF系統實施後洗滌濃縮） 中聚集體及片段含量以及ACA效價之影響 在下表4中’展示在28至30°C下儲存3個月後使用不同濃 縮程序之低pH調配在不同蛋白質濃度下之聚集體及片段含 量以及ACA效價。 148623.doc -40· 201107344 表4 :在28至30°C下儲存3個月後，使用不同蛋白暂增始古沐 之低pH調配之片段、聚集體及ACA值 * 片段(％) 聚集體(％) ACA效價 蛋白質 標準篩網 開口篩網 標準篩網 開口篩網 標準筛網 開口篩網 14% 1.35 0.92 0.10 0.21 44.1 42.6 16% 1.24 1.09 0.08 0.20 40.5 40.9 18% 1.24 0.96 0.11 0.23 40.3 40.7 20% 1.35 0.98 0.12 0.30 37.5 41.6 數據顯示，在儲存3個月後，兩種濃縮模式具有類似結 果。在表5中展示在2至8。(：下之相應數值。 表5:在2至8°C下儲存3個月後，使用不同蛋白質濃縮方法 之低pH調配之片段、聚集體及aca值

在2至8°C下獲得之數值證實了在㈣咐下獲得之結 果。濃縮方法不影響產物之穩定性。 由於該方法具有兩個系統’ 一個系統用於主濃縮過程且 另系統用於後洗蘇濃縮，且該方法可獲得較高產率，故 判斷此方法更適合於大規模製造。 6.結論 148623.doc •41· 201107344 根據此研究所示結果可得出以下結論： •在2至8C及28至30。(：下儲存3個月後，低pH調配獲 知較低ACA數值、較低聚集體及較低片段含量。 •在28至30°C下儲存3個月後，中性pH調配之ACA數 值高於驗收標準。 •蛋白濃度值不影響所測試參數之結果。 * 濃縮方法不影響產物之穩定性。 •僅在使用開口筛網膜時可達成充分後洗滌。 根據該等結論，人們決定藉由低pH調配製造用於皮下投 與之新IgG產物，其中濃縮方法使用用於濃縮後洗滌液之 第二較小裝置，即具有開口篩網膜之超濾/透析過濾裝 置’且蛋白質含量為20%±2%。 實例2 : SUB Q NG之超濾及調配 1·背景 在製造用於規模放大及臨床前之2〇%批料期間收集此資 汛。用於製造20%批料之方法中直至奈米過濾步驟之前的 邛分係如上文所述。改良超濾/透析過濾以將溶液濃縮至 2〇〇/。（限值：18%至22%广為將產率損失降至最低，藉由配 備有相同膜之第二較小裝置來濃縮用於透析過濾之超濾裝 置之後洗滌液’且隨後將其添加至總體溶液中。 令人驚訝地’顯示溶液之蛋白質濃縮並不影響低pH儲存 期間之病毒滅活。在1〇%溶液（GAMMAGARI)® LIQUID)及 2〇%溶液中達成相 似之病毒清除。因此，對於2〇〇/0產物而 言維持作為病毒清除步驟之低pH儲存。 148623.doc -42- 201107344 2.方法陳述 超濾 將奈米濾液之甘胺酸濃度調節至0.25 Μ之目標值。經由 超濾（UF)將溶液濃縮至蛋白質濃度為6±2% w/v。通常，蛋 白質濃度係藉由量測AU280-32()來測定。使用14.1之消光係 數。將pH調節至5,2±0.2。所用uf膜之標稱截留分子量 (NMWCO)為50,000道爾頓或更小且經特別設計以用於高黏 度產物（例如得自Millipore之V篩網）。舉例而言，NMWCO 為50 K道爾頓或更小之Millipore peiiiC011 Biomax。膜材料 係聚醚砜。 相對於0.25 Μ甘胺酸溶液（pH 4.2±0.2)對濃縮物實施透 析過濾。最小交換體積為初始濃縮物體積之1〇 X ^在整個 超滤/透析過渡作業中，使溶液維持在4°c至2〇°c下。 在透析過濾後，將溶液濃縮至蛋白質濃度為最小22% w/v。將溶液溫度調節至2。〇至8°C。蛋白質濃度可藉由使 用14.1之消光係數值進行UV讀數來測定。 為回收系統中之全部殘餘蛋白，以再循環模式用至少2 倍死體積對第一較大超濾系統實施後洗滌，以確保洗出所 有蛋白。然後用配備有相同類型之膜且尺寸為第一系統之 十分之一或更小之第二超濾/透析過濾系統將第一超濾系 統之後洗滌液濃縮至蛋白質濃度為至少22% w/v。將後洗 滌濃縮液添加至總體溶液中。然後對第二超渡系統實施後 洗滌。使用此後洗滌液來調節步驟14中最終總體溶液之蛋 白質濃度。將溶液溫度;調節至2°C至8。(：。 148623.doc •43. 201107344 調配 用第二較小超濾系統之後洗滌液及/或用透析過濾緩衝 液將蛋白質濃度進一步調節至20.4±0.4% w/v。若需要，將 pH調節至4.4至4.9。 實例3 :製造20%批料 1.介紹 此報告闡述臨床前製造並概述Baxter之新研究型免疫球 蛋白製備物「SUBQ NG, 20°/。」之結果，該製備物係用於 皮下使用之20% (w/v)液體多價人類免疫球蛋白製備物。 該製造係如「發明實施方式（Detailed Description of the Invention)」中所述來實施，其中濃縮方法如上文所述。 分級分離始於分離冷凍沉澱物。然後可使用貧冷凍沉澱物 血漿來分離各種粗凝血因子及抑制劑，隨後實施冷醇分級 分離。選擇七種途徑自貧冷;東沉澱物血漿_分批吸附粗凝血 因子及抑制劑，之後實施SUBQ NG，20%之純化，且該七 種途徑在下表中稱作途徑1至7。 表6

吸附途徑 步驟 凝膠 肝素 1 2 3 4 5 6 7 冷凍沉澱 - - X X X X X X X FEIBA 0.5gDEAE-葡聚糖凝膠/1 - X X 因子IX 0.5gDEAE-葡聚糖凝膠/1 2000 IU/ml X X X X 因子VII 120 mg Α1(ΟΗ)3/1 750 IU/ml X X 抗凝血酶 1 gDEAE-葡聚糖凝膠/1 80000 IU/ml X X X 148623.doc -44- 201107344 對於臨床前SUBQ NG，20%之製造，選擇源自途徑1、3 及6之Cohn起始材料以涵蓋眾多種不同吸附選項。各種吸 附方法闡述於以下文獻中：Teschner等人，2007，Fox •Sawg. 92:42-55 ; Polsler等人，2008，Sawg. 94:184- I92 ;美國專利第6,395,88〇號及第5,409,990號；及 Prothrombin complex: Brummelhuis in Methods of Plasma Ρ/βίΛίΛ /Voiez.w Curling編輯，Academic

Press，1980) 0 經修改Cohn醇分級分離產生主要中間體IgG組份，其稱 作沉澱物G，使用層析型純化對其實施進一步處理以獲得 最終產物。下游製造包含陽離子交換層析（快流速CM_瓊脂 糖）及陰離子交換層析（快流速ΑΝχ_瓊脂糖）且包括三個獨 立的病毒滅活或移除步驟，即 •溶劑/洗滌劑處理（1% Triton Χ-100、〇.3°/。構酸三正 丁基酯與0.3%聚山梨醇酯·8〇之混合物）， •奈米過渡（Asahi Planova 35 nm)及 • 在升高溫度下低pH儲存3週。 為連到皮下應用之較高蛋白質濃度，不得不在超濾/透 析過渡步驟中使用開放通道型篩網。較佳使用第二超滤/ 透析過渡裝置來濃縮後洗務組份以自第―裝置回收所有蛋 白質。 SUBQ NG，20%係免疫球蛋白G (ig(})之液體調配物，其 中至少95%之蛋白質為γ球蛋白。產物具有等滲性且在低 ΡΗ下加以調配。在1G%之蛋白f濃度下，在最終濃縮步驟 148623.doc -45· 201107344 期間pH為4.4至4.9。可在可獲得延長穩定性研究之結果後 測定20%溶液之最終pH。最終溶液含有180 g至220 g蛋白 質且每升溶液含有0.1至0.3莫耳甘胺酸作為唯一賦形劑。 液體製備物係澄清至輕微淡黃色且基本不含可見微粒。 2.臨床前批料之數據及質量平衡

1. 臨床前批料：SC00107NG

吸附選項 1 :選項 6 : F IX、F VII、AT-III 起始材料之批號：沉澱物GVNELG171(US來源） 最終容器之批號：SC00107NG

2. 臨床前批料：SC00207NG

吸附選項 3 : FEIBA、AT-III

起始材料之批號：沉澱物GVNELG1‘73(US來源） 最終容器之批號：SC00207NG

3. 臨床前批料：SC00307NG 吸附選項1 :無吸附步驟

起始材料之批號：沉澱物GLB0790301(US來源） 最終容器之批號：SC00307NG 148623.doc •46- 201107344 表7 步驟 無菌總體 測試/方法 批料 SC00107NG SC00207NG SG00307NG 'r-, …. 總蛋白/UV g/L血漿 3.4 3.7 3.7 IgG/比濁法 g/L血漿 3.0 3.0 3.0 IgA/ELISA g/L血漿 <0.001 <0.001 <0.001 IgM/ELISA g/L血漿 <0.001 <0.001 <0.001 MSD(HPLC) -f 、·：-.: < >'·； ·'. 'A.. W 5.::- 1 ·. * ^ 聚集體％ 0.1 0.1 0.1 寡聚體/二聚體％ 4.6 4.5 3.2 單體％ 1^. 95.2 95.4 96.6 片段％ 0.1 0.1 在最終總體層面上，製備物之純度表示為主要雜質之較 低含量’其遠低於總IgG之〇. 1 %。在製程中之此最終階 段’ 20%產物中之分子量分佈與GAmmAGARD® LIQUID/ KIOVIG最終容器類似。此表明濃縮至2〇%對Ig(}分子之完 整性無負面影響。 3.對臨床前批次進行表徵之其他結果 根據以下來界定初步最終容器評估標準：當局對皮下人 類免疫球蛋白之要求、當前皮下投與產品之最終容器規 範、及GAMMAGARD®LIQUID/KIOVIG規範。實施其他品 質控制測試來評估產物及/或製程相關雜質之含量。 此外，對最終容器之相關抗體譜進行表徵並將其與臨床 148623.doc -47- 201107344 前IVIG，10% TVR批料之結果進行比較。 結果展示於下表（表8)中 SUBQ NG 20% IVIG, 10%TVR SC00107NG SC0Q207NG SC00307NG P0010ING P00201NG P0030ING 01C21AN11 0IC21AN21 01D05AN11 測試系統 單位 細菌： 白喉棒桿菌 (Corynebact erium diphtheriae) EUR 何蘭猪 IU/ml 6. 6. 6. 5. 5. 5. 病毒 HAV ELISA IU/ml 14. 14. 27. 14 1 HBV(針對 hep B s Ag之抗體) ELISA IU/ mg TP 40. 47. 43. 35.9 40.1 40. 麻療病毒EUR 富集因子 血凝素 41. 41. 24. n.a. n.a. n.a 麻珍病毒us 血凝素 NIH 176 0.8 0.8 0. 1.001 1.0 1.001 Parvo 619 ELISA IU/ml 718 78 71 567 442 36 脊髓灰質炎 病毒I型 NIHU/ ml 1.4 1.711 1.5 1.0] 1.11 1.21 三個臨床前SUBQ NG 20。/。最終容器與臨床前 GAMMAGARD® LIQUID/KIOVIG批料之抗體效價及f集@ 子之量值具有相同數量級。 148623.doc -48- 201107344 SUBQ NG 20%最終容器之品質控制測試（表9) SC00107NG SC0Q207NG SC00307NG 測試糸統 單位 Fc功能完整性 Be結合 BPR批料3之％ 15.8 138 164 抗補體活性 EP方法 % 41.1 41.5 41.2 抗補體活性 EP方法 CTH50 U/mg 41.4 41.8 41.6 前激肽釋放酶 活化劑活性， EUR 發色體 IU/ml <0.6 1.004 1.237 抗A血凝素， pH. Eur. 血凝素 稀釋度：1 8 16 8 抗B血凝素， pH. Eur. 血凝素 稀釋度：1 4 4 2 抗D 血凝素 符合 符合 符合 排除致熱原 性，pH. Eur· 及CFR 兔 °c升高 無致熱原 無致熱原 無致熱原 細菌内毒素 發色體 IU/ml <1.2 1.8 <1.2 藉由乙酸纖維 素電泳測定 純度 CAE % 99.6 99.8 99.5 分子量分佈 (單體+二聚體） SE-HPLC % 99.2 99.3 99.2 分子量分佈 (聚合物） SE-HPLC % 0.2 0.2 0.3 分子量分佈 (片段） SE-HPLC % 0.6 0.5 0.5 IgA-EUR ELISA pg/ml 20 20 30 IgM ELISA 1.1 1.0 1.2 148623.doc •49- 201107344 SC00107NG SC00207NG SC00307NG 測試系統 單位 IgG 比濁法 mg/ml 177 165 163 蛋白質(總體） UV mg/ml 201 203 202 蛋白質 Autom.N2 mg/ml 202 208 203 甘胺酸 HPLC mg/ml 14.7 14.5 14.7 聚山梨醇酯 80 分光 光度法 Mg/ml <250 <250 <250 TNBP 氣相層析 Mg/ml <0.3 <0.3 <0.3 辛笨昔醇 (Octoxynol) 9 離子層析 pg/ml <3 <3 <3 無菌度 膜過濾 NA 無菌 無菌 無菌 容積滲透濃度 mOsmol/Kg 298 298 299 pH，未稀釋 電位 測定法 5.1 5.2 5.3 外觀 外觀檢查 令人 滿意的 令人 滿意的 令人 滿意的 乙醇 氣相層析 pg/ml <20 <20 <20 異丙醇 氣相層析 Mg/ml <20 <20 <20 ISAAS 光度 測定法 pg/L <50 <50 <50 矽ICP OES 離子電學 方法(Ion Electr.) Pg/L 3466 17270 21180 肝素 IU/ml <0.0075 <0.0075 <0.0075 對於所有三種批料而言，產物及製程相關雜質之移除皆 令人滿意。 148623.doc •50- 201107344 4.結論 成功地以200升之規模製造了 SUBQ NG 20%之三種最終 容器批料。在醇分級分離之前選擇三種吸附途徑以涵蓋眾 多吸附步驟，即： -選項1，us來源之血漿，不實施吸附步驟 選項3 ’ US來源之血_毁’在feiba、AT-ΠΙ吸附後 -選項6，US來源之血漿，在F_IX、F_vn、at-πι吸 附後 在中間體及最終產物之臨床前製造及表徵期間監測之製 私中參數顯示，在二種批料之間無可檢測到之顯著不同。 不論選擇何種起始材料，所有最終容器皆滿足產品相關 初步規範。 實例4 : 20%製備物之儲存研究 1. 介紹 SUBQ NG，20%係用於皮下使用之2〇%(w/v)液體多價人 類免疫球蛋白製備物。SUBQ NG，20%係如上所述來製 造。 此研究概述3種臨床前批料及一種可用批料在2至8它及 28至3〇 C (僅可用批料）下儲存最多6個月之數據。 2. 目的 此研究之目的係評估Sub Q NG 20%最終容器在2至8。 及28至30 C下之儲存穩定性。 3·穩定性指示參數 主要降解模式係變性、聚集及分裂，其導致樣品之分子 148623.doc -51- 201107344 量分佈發生變化。因此，藉由高效尺寸排除層析實施之分 子量分佈分析係主要穩定性指示參數。 4. 所檢驗批次及初級包裝 此報告中所示之穩定性數據係用臨床前批料 SC00107NG、SC00207NG 及 SC00307NG 以及可用批料 IgGSC 62/1 來獲得。 5. 結果 在下表11中展示臨床前最終容器在儲存最多12個月後之 結果。 表10:臨床前SubQ20%批次在2至8°c下之穩定性 MSD (HP-SEC)(%) 批料 月數 聚集體 (>450 KDa) 寡聚體/二聚體+單體 片段(<70kDa) SC00107NG 0 0.3 99.5 0.2 3 0.4 99.5 0.2 4 0.5 99.4 0.2 6 0.5 99.3 0.2 12 0.7 99.1 0.3 SC00207NG 0 0.3 99.5 0.2 3 0.4 99.5 0.1 4 0.5 99.3 0.2 6 0.6 99,2 0.2 12 0.8 99.0 0.2 SC00307NG 0 0.3 99.6 0.1 3 0.5 99.3 0.2 4 0.6 99.2 0.1 148623.doc -52- 201107344 MSD (HP-SEC)(%) 批料 月數 聚集體 (>450 KDa) 寡聚體/二聚體+單體 片段(<70kDa) 6 0.7 99.1 0.2 12 0.9 98.8 0.2 評估標準 <5 >90 <5 表11 :可用批料IgGSC 62/1在2至8°C及28至30°C下之穩定性 MSD (HP-SEC)(%) 批料 °C 月數 聚集體 (>450 KDa) 寡聚體/二聚 體+單體 片段(<70 kDa) 0 0.2 99.5 0.3 1 0.1 99.7 0.2 2至8 3 0.2 99.6 0.2 6 0.3 99.4 0.3 12 0.4 99.3 0.3 18 0.4 99.2 0.4 IgGSC 62/1 0 0.2 99.5 0.3 1 0.2 99.2 0.6 28至 3 0.3 98.7 1.0 30 6 0.6 98.0 1.4 12 1.2 95.6 3.2 18 1.9 93.5 3.8 評估標準 <5 >90 <5 6.結論 數據證實，在2至8°C及28至30°C下儲存長達18個月後， 148623.doc -53- 201107344 產物之所研究參數符合預定規範。 實例5.用於病毒滅活之低pjj處理 目的及原理 介紹 皮下用免疫球蛋白（人類），14%_2〇%，三重病毒清除 (Triple Virally Reduced) (TVR)溶液（其在下文中稱作 心7VG溶液），係自混合人類血漿製造。在實施大規 模捕獲步驟移除凝血因子/抑制劑後，以經修改c〇hn醇分 級分離開始Subcuvia NG之純化，其產生主要中間體沉澱 物G’之後實施下游製程，其含有層析純化以及三個不同 的病毒滅活/移除步驟。在此研究中，詳細研究低pH儲存 最終容器之病毒清除能力。 下游純化製程包含以下步冑：對再m殿物 劑/洗滌劑（S/D)處理、使用快流速羧曱基（CM)_壤脂糖實利 陽離子交換層析並使用快流速ΑΝχ_瓊脂糖⑨實施陰離子沒 換層析、奈米過濾、超濾-透析過濾、ρΗ調節、及無菌这 濾及灌裝。在無菌灌裝後，在最終容器中對如^ 溶液實施低pH儲存（製程之概略闡釋參見下文製程方案） 製程方案 圖2中所展示製程方案A提供自步驟1〇開始㈣⑶心— 溶液之製造方案中之下游部分之概覽。此研究中所用定製 中間體可勝任製程步驟「最終容器，預儲存」。 圖2中所展示製程方案Β提供此研究中所用規模縮減製程 的概覽，其包括採樣用於病毒滴定。 148623.doc -54- 201107344 目的 為針對潛在病毒傳播提供高安全裕度，將三個作用模式 相互補充之專用病毒滅活/移除步驟整合至細⑽以翁溶 液之製程中： 吟 • 溶劑/洗滌劑處理（步驟n) • 奈米過濾（步驟14) •在升高溫度下於最終容器中實施低pH儲存（無菌灌 褒後）。 Z在先前研究過程中研究了於低PH及升高溫度下儲存之 病毒滅活方面之能力及穩固性，纟中使用⑹㈣， 其係等效於⑽謂·α iVG但調節至i 〇%蛋白質以供靜脈内應 用之產物。此研究所獲得結果證f，可使所研究的所有脂 包膜病毒有效且穩固地滅活，其中牛病毒性腹渴病毒 (BVDV)顯示最慢滅活動力學。此外，可證實此製程步驟 另外有利於製程針對非脂包膜小DNA病毒之病毒安全性。 心iVG及/G/F係免疫球蛋白產物，其中 〜係用於皮下投與之變化形式，且/G/F TT7?係用於靜脈内應用之產物變化形式。二者共享相同的 製程直至超濾/透析過濾及調配步驟，其中唯一的差異在 於，將之蛋白質濃度調節至u%至2〇%範圍 内，而非10%。 因此，在〜7VG製造中，藉由將所選關鍵製程參 數設定為製程之指定上下限值（即，時間、溫度：下限； pH :上限）來評估於低pH及升高溫度下之儲存步驟在 148623.doc •55- 201107344 BVDV及MMV滅活方面之能力及穩固性（參見歐洲藥品評 價署人用藥物評價部（The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products Evaluation of Medicines for Human Use) (2001): CPMP生物技術工作組-Note for Guidance on Plasma-Derived Medicinal Products, CPMP/ BWP/269/95(第3修訂版））。此外，為進一步研究此病毒滅 活步驟之穩固性，在規模縮減試驗期間使溫度降低並持續 給定時間段。 如上所述，使用以下包膜及非包膜病毒。 • 牛病毒性腹瀉病毒（BVDV)，其用作肝炎C病毒 (HCV)及其他脂包膜小RNA病毒之模型。 • 小鼠細小病毒（MMV)，其用作人類細小病毒B19 (B19V)及其他非包膜小DNA病毒之模型。 根據CPMP準則268/95(歐洲藥品評價署人用藥物評價部 (1996). CPMP生物技術工作組_Note for Guidance on Virus Validation Studies: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating the Inactivation and

Removal of Viruses，CPMP/BWP/268/95(修訂版）），以相應 製造步驟之規模縮減模型來實施研究。在“kwh 溶 液製造中’藉由比較大規模製程中製造步驟「在低pH及升 高温度下儲存」之指定參數與規模縮減模型中之製程參數 來證實該規模縮減製造步驟在病毒滅活方面所獲得結果之 有效性。另外’監測所選生化參數並將其與大規模製程中 之相應參數進行比較。 148623.doc •56- 201107344 材料、方法及設備 病毒及細胞 使用BVDV之NADL株（以生物方式選殖，ATCC VR-1422)，其得自美國模式培養物保藏所（American Type Culture Collection)(ATCC ; Rockville, Maryland)。根據標 準作業程序使病毒在MDBK細胞（ATCC CCL-22)上繁殖， 並在BT細胞（ATCC CRL-13 90)上滴定。 MMV原型株（ATCC VR-1346)得自美國模式培養物保藏 所（Rockville，Maryland)。根據標準作業程序繁殖該病毒並 在A9細胞（ATCC CCL-1.4)上滴定。 測試項目 在實施「在低pH及升高溫度下儲存」之前，即在製造步 驟無菌灌裝之後，自Baxter之PPD產品服務部門 (Industriestrasse 13 1，Vienna，Austria)獲得以下定製 中間體之批料： •批號1GSC64，蛋白質濃度為13_5% •批號IGSC64，蛋白質濃度為20.9% 材料係在最終容器中於+2°C至+8。(：下運輸並在6個月内 使用。 緩衝液/溶液 pH調節溶液 使用0.5 M NaOH或〇.5 M HC1來調節pH。（兩種溶液皆儲 存在室溫下並在12個月内使用）。 148623.doc -57- 201107344 Q.5 Μ鹽酸（HCI)之製備

組份 每升溶液中之組份 貯存期限 儲存 HC1 37% 41.4±0.4 ml 12個月 23±5〇C 在環境溫度下合併試劑，即蒸餾水及HC1。 0.5 Μ氫氧化鈉（NaOH)之製備

組份 每kg蒸餾水中之組份 貯存期限 儲存 NaOH 20.0士0.2 g 12個月 ±5°C 使相應量之NaOH在環境溫度下溶於蒸餾水中。 pH量測溶液 直接量測pH或根據歐洲藥典（EP)在稀釋溶液中量測 pH。對於根據EP方法量測pH而言，使用0.9% NaCl溶液將 蛋白質濃度稀釋至1 %。 如下所述來製備0.9% NaCl溶液：將9·0±0·9 g NaCl溶於 1000 ml蒸餾水中。將溶液經0.2 μιη濾膜過濾，將其儲存在 室溫下並在12個月内使用。 細胞培養基 根據BVDV及MMV病毒滴定之標準作業程序來製備用於 細胞培養或病毒滴定之培養基。 病毒滴定分析 TCID50分析 藉由TCID5G分析根據標準作業程序來滴定含有病毒之樣 品。簡言之，在相應組織培養基中製備樣品之連續％ log 稀釋液，且將1 〇〇 μΐ各稀釋液添加至經相應指示細胞系接 148623.doc •58- 201107344 種之8孔微量滴定板之各孔中。在36艽士2〇c之溫度下將微 量滴定板儲存在經加濕及C〇2調節之儲存單元中。對致細 胞病變效應之評估係在儲存7天後在顯微鏡下對細胞進行 外觀檢查來完成。 半數組織培養感染劑量（TCID5〇係根據泊松分佈 (Poisson distribution)來計算並表示為 1〇g丨〇[TCID5〇/ml]。 BVDV總體滴定 對摻加MMV樣品進行研究。為降低在低pH儲存2〇及27 天後取自心於wvk 中間體之摻加BVDV樣品之檢出限， 如下所述對該等樣品進行滴定：除標準TCIDm分析外，將 1:3.16稀釋度（0.5 log)及之後的兩個％ 1〇g稀釋度（使用相應 的、·用胞培養基來稀釋）之樣品添加至經相應指示細胞系接 種之96孔微量滴定板之所有孔中（1〇〇 μ1/孔）。如上所述實 施細胞儲存及對各病毒之致細胞病變效應之評估瓜μ 分析）。如下所述計算結果：計算總體滴定中之滴定體積 與常規tciD5〇分析中之滴定體積之比率及。自tciD5〇分 析t所測定之病毒效價減去#之1〇giQ，且將結果表:: 藉由總體滴定測定之病毒效價。 實例： 在微量滴定板上以連續〇·5 log稀釋度（所有12列）分 析樣品（TC1DSQ分析）且發現各孔自稀釋度〇(即未稀 釋）起皆為陰性。根據泊松分料算得出病毒效價 <〇.ii i〇g1〇[TCID5〇/ml]。所分析樣品之相應總體積 為 1.17 ml。 148623.doc -59- 201107344 將相同樣品（稀釋度Q)施加至微量滴定板之所有孔中 (、悤體滴定）。因此，所施加樣品總體積為9 6 ml。 體積比為：R“=9.6:1.17 = 8.21 ; l〇gi〇(R “卜 〇_91 〇 則所叶算病毒效價<〇.U_〇 91 ;即<〇 8Q。以相同方 式s十算病毒效價置信區間之上限。 在連續動力學樣品被評為無感染性時計算病毒效價 倘若在低p Η儲存完成後在連續動力學樣品中直至最終樣 品皆未檢測到病毒感染性，則在計算分析檢出限時計入獲 知明確陰性結果之TCID5〇分析中各孔所用所有連續陰性樣 品之體積。因此使用下式（亦參見附錄1}: Σΐ/10χ, 基於η個陰性連續動力學樣品之病毒效 價[丨0gio(TGCID5〇/mI)] 其中

Xi(l=1 ' 2 ' 3 '……《)係《個連續陰性樣品之個別病毒效 價[l〇gi〇(TCID5〇/ml)]。 右所有陰性樣品皆具有相同效價，即χ，則該式可簡化 為： 基於η個陰性連續動力學樣品之病毒效- 價[l〇g1〇(TGCID50/ral)] = < x — 1〇g丨。⑻ 細胞毒性 用摻加模擬物（mock-spiked)之SwAcuvk tvg中間體（即撸 加有用於感染細胞之BT培養基（5%馬血清）*來代替病毒原 液）以及摻加有模擬物、經pH調節（pH 4 9±〇且經〇 45 148623.doc -60· 201107344 μπι過濾之起始材料在用於測定細胞毒性之各細胞系中測 疋衣私中間體對所用病毒指示細胞系之細胞毒性。以與含 病甘樣品類似之方式來分析各樣品，即將其連續稀釋並與 才曰不細胞系一起儲存。在儲存後，測定最高無細胞毒性濃 度。對於該等生物系統之變化，在比較摻加病毒與摻加模 擬物之樣品中的細胞毒性時，土〇5對數位數（l〇g step)之偏 差不視為顯著偏差。 用於感染細胞之BT培養基之組成如下所述：DMEM (含有4.5 g/1 D-葡萄糖）+i〇/〇(v/v)l_麩胺醯胺（2〇〇 mM)+l%(v/v)硫酸慶大黴素（Gentamicin Sulphate) (10 mg/ml)+l%(v/v)丙 g同酸鈉 +2%(v/v)碳酸氫鈉 (7·5%)+1% (Wv)非必需胺基酸+5%(v/v)馬血清。 干擾 對於具有低病毒效價之樣品而言，需要評價樣品基質對 感染性分析之性能之影響。對於具有高病毒效價之樣品而 吕，系列稀釋液中之相關部分（即，可評為病毒陽性及病 毒陰性孔之部分）在咼樣品稀釋度之情況下出現。因此， 亦稀釋若干log1()位數之樣品基質對病毒感染性檢測之影響 可忽略不計。如下所述來量測對含有心中間體 之樣品的低病毒效價測定之干擾··自摻加有模擬物、經pH 調節（pH 4.9士0.1)且經0.45 μηι過濾之起始材料（(Sw6cmW<i 十間體）取樣，用適宜組織培養基以1:3.16將其稀釋並 以1:1 〇〇摻加預稀釋（在適宜組織培養基中，即在用於bt細 胞/BVDV之BT培養基及用於A9細胞/MMV之A9培養基中預 148623.doc • 61 - 201107344 稀釋）之病毒原液懸浮液至2或3 logl()[TciD5()/ml]之標稱效 價，並如上所述實施滴定。比較所獲得經摻加的製程中間 體之效價與經摻加細胞培養基對照之效價。 病毒清除因數之計算 根據CPMP準則268/95 [3]使用下式來實施對製程之病毒 滅活能力之分析： R = log ’ML、 其中， Λ =病毒清除因數 厂7 =起始材料之體積 起始材料中之病毒濃度[TCID5〇/ini] 厂2 =實施該步驟後材料之體積 實施該步驟後之病毒濃度[TCID5Q/ml] 使用各經摻加樣品在處理之前及之後之體積及效價來計 算Λ »每當檢測不到病毒時，取檢出限作為病毒效價用於 計算。根據標準作業程序，用保留兩個小數位之病毒效價 (logWTCIDso/ml)實施計算；將清除因數舍入至小數點後 一位。 驗證參數之測定 時間、溫度【V] 用計時器來量測儲存時間；用pt_100感測器量測溫度並 連續記錄。 pH值 148623.doc -62- 201107344 根據標準作業程序藉由直接量測以及實施歐洲藥典（EP) 所指定方法（即在用0.9% NaCl溶液稀釋至1%蛋白質後量 測）用標準實驗室pH計來測定pH值。在後者中，pH具有後 綴（EP)意指根據EP方法實施pH量測，而不具有後綴的 「pH」意指直接量測。 其他參數之測定 分子量分佈（MSD) 由分析生物化學部門（Baxter, Vienna，Austria)根據標準 作業程序實施分子量分佈之HPLC-SEC(高效液相層析_尺 寸排除層析）分析。根據此測試對「規模放大」批料（在 產品服務部門（Baxter，Vienna，Austria)製造）之所有樣 品實施HPLC-SEC分析。因此，為確保摻加模擬物之試驗 之樣品（在此研究過程中於規模縮減製程中積累）的測試結 果與「規模放大」批料的測試結果具有可比性，根據在相 同部門的相同測試對摻加模擬物之試驗之樣品實施msd分 析。 乙酸纖維素電泳 由化學部門（Baxter，Vienna，Austria)根據標準作業 程序實施乙酸纖維素電泳（Cae)。 ' 捨入 根據標準實踐實施捨入： •將分析、结果捨入至與針對製程中各參數所述或與分 析精確度所確定相同之小數點後位數。 •在計算時不對分析結果進行拾A，且僅對最終結果 148623.doc •63- 201107344 進行捨入。 設備 • 使用標準實驗室pHW。 •使用 Mettler AT-100分析天平及 sart〇rius BP3 100P 實 驗室天平。 •用PVDF膜過濾器（MUlex_HV，或等效物）實施〇 45 μ m過；慮。 •用實驗室計時器量測製程時間。 • 使用Π類生物安全櫃。 •將細胞儲存在濕度受控之Heraeus C02培育器中。 •使用磁搜拌器/授拌棒來混合。 •藉由Haake或Julabo低溫恒溫器及/或攪拌加熱塊來 控制溫度。 *使用與⑼10〇〇 Y0K0GAWA記錄儀連接之Pt_100感 測器來量測溫度。 研究設計 為研究製造步驟「在低pH及升高溫度下儲存」 在病毒滅活方面之穩固性，如下文所論述來定義病毒 滅活效能之關鍵參數。在適合研究mpH儲存之病毒滅活穩 固性之條件下實施試驗。對大規模製程與規模縮減試驗之 條件的比較展示於表4中。 • 蛋冷貧廣屬：由於7VG係研發中之產品， 故傾向於將經調配總體溶液之蛋白質濃度界定在較 寬範圍内’即約14°/。至20°/。’且可在以後縮小該範 148623.doc • 64- 201107344 圍。因此’為研究低pH處理之穩固性，以可能的蛋 白質濃度的兩個極值實施兩個試驗（試驗設計）。試 驗設計1係以13.5%之蛋白質濃度實施；試驗設計2 係以20.9%之蛋白質濃度實施。 定製材料之蛋白質濃度係由產品服務部門來提 供。定製材料之蛋白質濃度無需再次測定，因數據 已自在製造定製ATG中間體後實施之分析 獲得。由於用於規模縮減製程之材料已經無菌過濾 且在2 C至8。(：下儲存至規模縮減製程開始（即不實施 任何冷凍/解凍程序），故預期最終經調配及無菌過 濾之中間體的蛋白質濃度無變化。 僅.在製造中，指定$Μ6ί?Μν/·β最終容器在整 個低pH儲存期間之ρΗ範圍為4 4_4 9(直接量測）。為 研九在對病毒滅活較不有利之條件下低？11處理之效 能及穩固性，在所指定上限下（即在ρΗ 實 施兩個试驗。若需要，在摻加後量測並將其調節 至上限。在低pH儲存27天±5小時後，藉由直接pH量 測及歐洲藥典之推薦方法（即稀釋至1%蛋白用〇 9% NaCl溶液）再次量測pH。 μ及.在製耘中，將低pH儲存期間之溫度設定為 3〇-32°C。為研究低ΡΗ儲存在對病毒滅活較不有利 之條件下之穩固性，所有規模縮減試驗皆係在溫度 範圍之下限下（即在3G±rc下）實施。為檢驗溫度波 動之潛在影響，每週—次使溫度降低至25±rC並保 148623.doc -65- 201107344 持上6小時（即在儲存之第0、7、14、20天及第27天期 間開始溫度降低；天數編號係指日曆日，即第〇天 係開始儲存之當天）。錯誤的是，在儲存之第一週及 第二週將溫度降低至25±rc並保持6小時且每週實 施兩次’即在低pH處理第一週之儲存第〇天及第4天 期間及在低pH處理第二週之儲存第7天及第丨〇天期 間貫施。 •每激：儲存時間通常在21天（有效使BVDV滅活所需 時間）至28天（因技術/邏輯原因所定之上限）範圍内。 為研究低pH處理在對病毒滅活較不有利之條件下之 效能及穩固性’所有規模縮減試驗皆係以低於上文 所列儲存時間範圍限值之儲存時間來實施；即，短 期選項係儲存20天±4小時且較長期選項係儲存27天 ±5小時。將經摻加中間體在低pH及升高溫度下儲存 27天士5小時，但在儲存20天±4小時後取病毒滴定之 樣品’以研究儲存3週後之病毒清除率（亦參見表 乂）。 概=之’總计貫施4個摻加病毒之試驗（2個摻加b VDv， 且2個摻加MMV)以研究製造步驟「在低pH及升高溫度下 儲存」之病毒滅活能力之穩固性。此外，實施兩個未經摻 加之對照試驗以獲得用於測^生化參數之樣品。此外實 施兩個摻加模擬物之對照試驗並使用自該等試驗獲取之樣 。口來研九製程中間體對病毒滴定分析之潛在影響（即細胞 毒性及干擾）。 148623.doc •66· 201107344 為進一步證實規模縮減製程與大規模製程之對等性，在 低pH儲存之前及之後對最終產物實施以下生化分析：分子 量分佈及乙酸纖維素電泳。 表A : 規模縮減試驗的製程及生化參數，將其與大規 模製程進行對比。範圍與大規模製程不同且適 用於規模縮減製程之參數係以粗體印刷。 參數 大規模製程 規模縮減製程 試驗設計1 試驗設計2 在摻加及pH調節之前 蛋白質濃度[g/l〇〇ml] 14-207 14±1; 20±17 在摻加及pH調節之後 pH(直接量測） 4.4-4.9 4.9 士 0.1 4.9±0.1 低pH儲存 儲存時間[天] 21-282 20 d±4 h3 27 d±5 h5 20 d±4 h3 27 d±5 h3 儲存期間的溫度[°C] 30-32 30±1^ 30±14 在低pH儲存之後 pH(直接量測） 4.4-4.9 量測值 (並非指定值） pH(用0.9%NaCl稀釋至 1%蛋白)EP5 4.6-5.1 量測值 (並非指定值） 由於iVG係研發中之產品，故蛋白質濃度尚未 界定為更窄範圍。因此，以可能的蛋白質濃度的兩個極 值實施兩個規模縮減試驗。 端視病毒清除率研究之結果，儲存時間尚未界定為更窄 148623.doc -67- 201107344 範圍。 3兩個試驗皆實施27 d ± 5 h且在儲存第20天獲取病毒滴 定之樣品’從而使得病毒滅活數據亦可用於儲存2丨至22 天之大規模製程選項。 4在儲存期間每週一次使溫度降低至25 土 TC並保持6小時 (即在第0 ' 7、14、20及第27天期間開始降低溫度；天 數編號係指日曆日，即第〇天係開始儲存之當天）。如部 分4.1.1(「溫犮殍徵」）中所述，在儲存第一週及第二週 使溫度降低至25 ± rc並保持6小時且每週實施兩次係錯 誤的（亦參見DRl_〇4〇7)。 5歐洲藥典之方法。 實驗程序 由於病毒摻加、pH調節及0.45 μηι過濾之步驟序列之複 雜性，故在圖3中所示流程圖中加以闡釋（箭頭粗細指示相 對體積）。 起始材料 對於試驗1而言，採用蛋白質濃度為13 5%之定製材料 (批號IGSC64)。使用此材料以可能的蛋白質濃度之下限、 pH把圍之上限（即BVDV : 4.97且MMV : 4.93)、及溫度範 圍之下限（即在29.4°C下）實施試驗。 對於試驗2而言，採用蛋白質濃度為2〇9%之定製材料 (批號IGSC64)。使用此材料以可能的蛋白質濃度之上限、 pH範圍之上限（即BVDV: 4.92且職乂： 4 86)、及溫度义範 圍之下限（即29.4°C)實施試驗。 148623.doc -68- 201107344 病毒摻加：BVDV、MMV storage 45.5 ml各起始材料摻加有4·5 ml病毒原液懸浮液，且在 授拌1至2分鐘後取1 ml樣品。立即用相應細胞培養基以 1:3.16稀釋樣品（即丨體積樣品加216體積細胞培養基）並進 行滴定。隨後’另外取3 ml樣品並經由〇·45 μηι pVDF膜過 渡。立即用相應細胞培養基以L316稀釋1 ml過濾材料並 加以滴定。 PH調節 使用0.5 M HC1溶液在攪拌下將35 ml等份之摻加病毒之 起始材料調節至pH 4.9±0.1(兩個試驗）。然後將材料分為 兩等份。使用一個30 W之等份進行「低pH儲存」且使用5 ml之等份進行「溫度維持對照」（參見「維持對照」部 分）。 使用0.5 M NaOH溶液將另一 1〇 ml等份之摻加病毒之起 始材料調節至pH 7·0±(Μ，其中使用5 ml之經阳調節材料 進行「pH維持對照」。 使用剩餘5 ml pH經調_之材料用於「組合阳及溫度維 持對照」（參見「維持對照」部分）。 維持對照 為研究病毒滅活機制（及藉由阳或溫度來研究），將三組 維持對照儲存在不同條件下。 將5 ml等伤之摻加病毒之起始材料及經調節'奸 〇二之起始材料各自經由0.45 _ pvDF膜過濾器過濾至冷

;東&中冑㉟等份與經摻加製程材料一起儲存在3㈣。C 148623.doc •69· 201107344 下，且隨後保持在此溫度下直至製程結束（pH維持對照， p// //C」）。將另—等份立即在饥至破下儲存η天 w小時（組合ρΗ及溫度維持對照，rc^c」）。 將5 ml等份之換力σ古、产主 , 力有病毋、經ΡΗ調節（pH 4.9±〇 1)且經 ㈣㈣過遽之起始材料(參見上文「PH調節」）立即健存 在+2 C至+8〇C T直至製程結束（溫度維持對日召，r , HC」）。 ' 在過遽後所有維持對照之最小體積始終大於3 ml，因 此’在儲存階段後可獲得適當體積用於病毒滴定。 低pH儲存 將3〇爪1等份之摻加有病毒且經pH調節（PH 4.9±〇 1)之 練…G中間體經由〇 45 _ ρνΜ膜過濾器過濾至5〇 ml…、菌玻璃幵瓦中。在過渡後⑽⑶Wa g中間體之最小體 積始終大於24 m卜因此’在儲存階段後可獲得足夠體積 用於病’滴疋。隨後’在振盪(前後緩慢運動)下使用水浴 使恤度平衡至30±i c，其中水浴係藉由控制溫度之低溫恒 溫器經由外部溫度感測器來調控。將外部溫度感測器及另 了Pt_100電極置於一個與低PH儲存所用等效之50 ml玻璃 瓶中’該等瓶各自填充有3G爾，此係'在過滤後經推加 製程材料之最大可能量。連續地記錄溫度。一旦材料溫度 達到29 c，立即開始取樣。立即用相應冷細胞培養基（儲 存在价至+8。口）以1:316稀釋各樣品（即！體積樣品加 2,1 6體積細胞培養基）以藉由低pH防止病毒進一步失活， 並進行滴定。在所有試驗中’在27天±5小時之整個製程期 148623.doc 201107344 間，將iVG·中間體在振盪（前後緩慢運動）下儲存 在30±1°C下，在儲存中每週一次使溫度降低至25±1艺並保 持至少6小時h)。錯誤的是，在儲存之第一週及第二週 將溫度降低至25 士 it並保持6小時且每週實施兩次，即在 低pH處理第一週之儲存第〇天及第4天期間及在低pH處理 第二週之儲存第7天及第1〇天期間實施。其論述請參見部 分厂溫彦猙潋」）。根據取樣計劃（參見部分丄幻獲取 其他樣品，立即如上文所述加以稀釋並進行滴定。在3〇t>c ± 1 C下70成低pH儲存後，藉由直接量測及歐洲藥典推薦之 方法（即用0.9% NaCl溶液稀釋至1%蛋白）來測定pH。 無病毒對照試驗 如針對摻加病毒之試驗所述實施兩個對照試驗，其中處 理未經掺加且經0.45 μιη過濾之中間體。分別 如針對摻加病毒之試驗丨及2所述應用相同製程參數，但材 料未經pH調節。根據取樣計劃(參見部分32)獲取用於測定 生化參數之樣品。 測定摻加有模擬物之起始材料（以〇 9:1〇摻加用於感染細 胞之BT培養基*·’如上所述在滴定前過濾樣品）及摻加有模 擬物且經pH調節及〇,45 濾後之斤^中間體之 細胞毒性。根據取樣計劃（參見部分丄2)來獲取用於測定細 胞毒性之樣品。 148623.doc •71- 201107344 *用於感染細胞之BT培養基之組成如下所述： DMEM(含有4_5 g/1 D-葡萄糖）+i〇/0(v/v)l_麵胺醯胺 (200 mM)+l%(v/v)硫酸慶大黴素（1〇 mg/ml)+1% (v/v)丙酮酸鈉 +2%(v/v)碳酸氫鈉（7.5°/。）+1%(¥~)非 必需胺基酸+5%(v/v)馬血清。 潛在干擾 如下所述使用一式兩份之各指示細胞系來研究含有 ⑶vh 7VG中間體之樣品之樣品基質在pH調節（pH 49土 0.1)後對病毒檢測之干擾：用相應冷細胞培養基（儲存在 + 2°c至+8°c下）以1:3.16 (v/v)稀釋取自摻加有模擬物、經 卩1周卽且經〇.45卩〇1過;慮之5>«办（|^/<1_/¥6!中間體的11111樣 品。隨後’向1.8 ml經稀釋材料以ι:10摻加〇 2 mi預稀釋* 病毒原液懸浮液至2.0及3.0 l〇g1G[TCID5()/ml]之計算效價。 在混合後，取樣並立即進行滴定。作為對照，向丨8…相 應冷細胞培養基（儲存在+2°C至+8°C下）以完全相同之方式 摻加預稀釋病毒原液懸浮液，之後進行滴定。 * 使用適宜細胞培養基[用於BT細胞（BVDV)之BT培養 基、用於A9細胞（MMV)之A9培養基]來預稀釋病毒 原液懸浮液。 取樣計劃 病毒滴定 以下驗收範圍適用於採樣：在儲存1天（土 1小時）後、在 儲存2至6天（±2小時）後、在儲存7至13天（土3小時）後、在儲 存14至20天（±4小時）後、及在儲存21至27天（土5小時）後。 148623.doc •72- 201107344 對於樣品編碼，參見部分1.1(製程方案）。 不經額外儲存立即對樣品實施滴定。 對照階段 數量 病毒原液懸浮液 1x0.3 ml 摻加病毒之起始材料 1x2 ml 摻加病毒且經過濾之起始材料 1x3 ml 換加病毒、經pH調節且經過濾之起始材料§ lxl ml 摻加病毒 '經pH調節且經過濾之起始材料，儲存在低pH及 l0irc下’ 一旦溫度達到29<>C立即取樣，即「第〇天」樣 品’且在儲存7天§、14天§ ' 2〇天（僅]^1^1¥)§及27天（僅 MMV)§後取樣 各為lxl ml 摻加产毒、經pH調節且經過濾之起始材料，儲存在低pH及 30±1°C下’在儲存20天及27天（僅BVDV)§後取樣，藉由 TCID50分析以及總體滴定法滴定 各為1x6 ml pH維持對照：pH7.〇±〇.l，在3〇±。(：下 1x5 ml ;度維持對照：ρΗ4·9士0.1 §，在+2°C黾+8°Γ.下 1x5 ml 組合pH及溫度維持對照：pH7〇±(U，在十沈至+代下 1x5 ml 立即以1:3.16用相應冷細胞培養基稀釋樣品，之後進行 滴定。 細胞毒性之測定 -對樣品實施滴定 0 對照階段 —-- 數量（對於各細胞系及各 試驗而言） 病毒原液懸浮液 ---— 1x0.3 ml 才料「卿滅， 1x3 ml t 加模擬物、 「卿开顧」 π -—---- lxl ml 立P以1.3.16用相應冷細胞培養基稀釋樣品，之後進行 滴定。 148623.doc •73· 201107344 干擾之測定 不經額外儲存立即對樣品實施滴定。 對照階段 數量 病毒原液懸浮液 1x0.3 ml 摻加模擬物、經pH調節(pH 4.9±0.1)且經過滤之iVG中 間體，以1:3.16用相應冷細胞培養基稀釋，以1:10掺加預稀釋 VSS至2.0 log10[TCID50/ml]之計算效價 lxl ml 摻加模擬物、經pH調節(ρΗ4·9±0.1 )且經過濾之中 間體，以1:3.16用相應冷細胞培養基稀釋，以1:10摻加預稀釋 VSS至3.0 log10[TCID5()/ml]之計算效價 lxl ml 以1:10摻加冷細胞培養基與預稀釋VSS至2 〇 l〇g1Q[TCID5Q/ml;j之 計算效價 1x2 ml 以1:10摻加冷細胞培養基與預稀釋vss至3 〇 1〇glQ[TCID5〇/ml]之 計算效價 1x2 ml §立即以1:3.16用相應冷細胞培養基稀釋樣品，之後進行 滴定。 生化參數之測定 僅自各未經摻加之對照試驗取樣並將其儲存在+2至+8°C 下直至進行分析。 對照階段 參數 數量 (包括備用 樣品） 摻加前之起始材料/ 分子量分佈 2x1 ml 乙酸纖維素電泳「 CAEj 148623.doc -74- 201107344 iS:力 =¾储存2。天 2x1 ml 2x1 ml 分子量分佈 乙酸纖維素電泳「2仇/-C1E」 分子量分佈「27rf-MSD」 乙酸纖維素電泳「_27心 C4J?」 製造2個「規模放大 在》平估規模縮減製程時亦慮及在 批料以及疋製材料（批號IGSC64)期間獲得之數據。 在°平估規模縮減製程時亦慮及在製造2個「規模放大」 批料期間獲得之數據。 對於產物之研發階段而言，似乎在2 8天之儲存階段後不 可能獲得生化參數之數據。 結果及討論 使用在低pH及升兩溫度下儲存$“心“Wa 之步驟之規 模縮減實驗室模型以B VDV及MMV來研究此步驟之效能及 穩固性，其係、月旨包膜病毒及非脂包膜病毒二者之專用滅活 步驟。在規模縮減製程中界定並量測驗證參數及生化參 數且藉由比車乂結果與製程之條件來確認兩種製程之對等 性。 驗證參數及生化參數之結果 驗證參數 藉由測定病毒滅活之關鍵參數（即製程材料2pH、在低 pH儲存期間之溫度及儲存時間）來驗證規模縮減程序的有 效性。 148623.doc -75· 201107344 在低PH及升高溫度下料之前的邱值 二=所有試驗中量測經摻加製程材料之pH並將其 :X且由此使其處於研究計劃所指定之限值 彳…·2(心録允結)中論述儲存後 測定之pH值。 溫度特徵 為研究在低PH及升高溫度下儲存之步驟針對溫度變化之 穩固性，在健存中每週一次使溫度自3(TC±rC降低至25± 1C並保持6小時。溫度始終在研究計劃所指定之範圍内。 然而，在儲存之第-週及第二週，使溫度降低至25^並 保持6小時且每週實施兩次係錯誤的，即在第-週之第〇天 及第4天期間及在第二週之第7天及第1()天期間實施。由於 此事故會使試驗特徵在病毒滅活方面變為較差情形，故甚 至以比初始既定程度更廣泛地研究病毒滅活之穩固性。 儲存時間 對於之製程，並未指定在低丨沿及升高溫度 下之儲存持續時間。端視此研究之結果有若干選項：儲存 持續時間之-個選項係21至22天；第：選項可為⑽天。 為研究低pH處理在對病毒滅活較不有利之條件下之效能及 穩固性，所有規模縮減製程皆係以低於可能儲存時間之下 限的儲存時間來實施；即第一選項係儲存20天士4小時，且 第一選項係儲存2 7天土5小時。使經摻加中間體在低及升 高溫度下儲存26天+22小時（MMV，兩個試驗）及27天+1小 時（BVDV，兩個試驗）^為研究在儲存3週後之病毒清除 148623.doc -76- 201107344 率，在儲存20天+1小時後（MMV)及在儲存20天+2小時後 (BVDV)取用於病毒滴定之樣品。 在所有試驗中，儲存時間在規模縮減製程之指定限值 内，即2〇天±4小時及27天士 5小時，其低於當前慮及之製造 儲存時間之下限。

其他製程參數及生化參數 低pH儲存後之pH 在低pH儲存後，直接或根據歐洲藥典（EP)之推薦方法 (亦即用0.9% NaCl溶液稀釋至1%蛋白）再次量測pH值。在 處理後直接量測所得之pH接近於低pH儲存之前之pH值； 亦即差值（儲存後pH減去儲存前pH)介於-0.07至+0.04之 間。根據EP方法所量測之pH始終比直接量測方法高0.2至 0.3。在使用EP方法時，此pH值之微幅提高係該兩種不同 pH測定法常見的結果。在生產規模之指定限值中亦考慮此 事實，其中當直接量測時，在低pH處理後pH之限值為4.4 至4.9，且在藉由EP方法測定時，該限值為4.6至5.1。 分子量分佈（MSD) 在兩個未經摻加之對照試驗中，研究在儲存之前及之後 的分子量分佈（藉由HPLC分析來測定）。將測試結果與三個 在7VG之研發階段期間製造之「規模放大」批料 及定製材料IGSC64(蛋白質濃度為14%以及20%)相比較。 在製造中，批料IGSC64(亦命名為「規模放大」批料）不在 低pH及升高溫度下儲存，此乃因無足夠材料用於此步驟。 將所有結果彼此充分對比。分子量分佈值（尤其IgG單體之 148623.doc -77- 201107344 與在「規模放大」試驗中所觀察到者接近。對於 後IgG單體之濃度低數個百分點之第：對照試驗，' =意該材料在儲存前已具有相當低之邮單體濃度 亦適用於在「規模放大」製程中測試之材料。因此分子 -分佈數據證實了規模縮減製程與大規模製程之等效性。 y球蛋白之純度 ::定:自兩個未經摻加對照試驗之樣品中γ球蛋 :(糟由CA電泳來測定)’並將其與自兩個「規模放大」批 料及自定製材⑽SC64(蛋白f濃度為14%以及継，僅在 低PH處理前之數值，詳細内容參見上文）獲得之結果進行 對比。將在規模縮減製程期間測定之γ球蛋白純度之所有 數值與「規模放大」批料所獲得的結果進行充分對比且1 :分析精確度範圍内(相對標準偏差為15%)。該等結果證 貫規模縮減製程與該製程具有可比較性。 病毒滴定之結果 細胞毒性 在對照試驗t，使用如針對摻加病毒之試驗所述接加有 核擬物且調節至相應pH之材料來研究中間體在低pH及升 局溫度下儲存之前獲得之細胞毒性。在所有兩個試驗中， 播加模擬物之製程中間體在阳調節之前及之後僅對所用細 胞顯示極弱細胞毒性效應，但在試驗2中對訂細胞例外， 其中經pH調節之中間體自i .〇 。稀釋度至更大稀釋度皆 未顯示細《性效應。未觀㈣各摻加病毒之試驗之細胞 毒性具有顯著差異。 148623.doc -78- 201107344 干擾測試 干擾測试之結果顯不，樣品基質對低效價BVDV& MMv 之檢測無顯著干擾：經摻加細胞培養基對照與經摻加 中間體之間之病毒效價差異介於_丨〇 1〇§1〇至 0.1 logio之間，其在病毒滴定分析之精確度範圍内。因 此，干擾效應不改變在病毒滅活試驗期間獲得之效價，且 其代表樣品之實際效價。 病毒滅活 用病毒BVDV及MMV之每一者實施兩個試驗，即以 13.5%蛋白質濃度實施試驗！，且以2〇 9%蛋白質濃度實施 試驗2。兩個試驗皆係在pH 4 9士〇丨及扣士丨^下實施，其中 每週一次使溫度降低至25±1。(：並最少保持6小時。對兩個 試驗之結果進行的比較揭示，以之可能的蛋 白質濃度之上限及下限實施之兩個試驗之病毒滅活動力學 之間無顯著差異。 採用對病毒滅活最不有利之條件，即儲存時間及溫度之 下限以及PH之上限，對於BVDV而言，顯示在儲存2〇天±4 小時後BVDV顯著滅活，且所有可摻加至相應 中間體中之病毒在儲存27天±5小時後完全滅活，不論研究 條件如何。在兩個試驗中，可仍在第2〇天檢測bvdv之殘 餘感木性。然而，在27天之儲存結束時所有BVDV皆滅活 至檢出限以下。MMV之清除因數顯#，此製程步驟顯著 有利於產物之病毒安全性，對於非脂包膜病毒而言亦係如 此下文更洋細地論述所用各病毒之個別病毒效價及清除 148623.doc •79· 201107344 因數。此外，在相應結果列表後展示各病毒之病毒滅活動 力學圖示說明。

BVDV 在儲存20天後BVDV滅活至接近檢出限（試驗1}或滅活至 檢出限（試驗2)，從而在試驗！及2中分別提供5 3 1〇gi〇及5 5 iogio之π除因數。在儲存27天天後，兩個試驗皆將摻加至 ⑽νι·« 中間體中之所有BVDV滅活至檢出限以下，在 試驗1及2中清除因數分別為>6.6 1〇§10及>6.5 logl〇e在兩 個試驗之滅活動力學中未觀察到顯著差異。試驗ι(蛋白質 濃度為13.5%)及試驗2(蛋白質濃度為2〇 9%)中之中間體顯 示相當之滅活動力學。 在升高溫度下之低pH處理在儲存2〇天±4小時後顯示對 BVDV之有效滅活，所計算平均清除因數為$ Η%。。在 低PH及升高溫度下儲存27天後，则以全滅活至檢出限 以下’其中平均清除因數經計算〉“㈣丨。。 MMV 在低PH及升高溫度下儲存2()天後，試驗⑷對㈣v之 :月除因數經计算分別為2 9 ❶及3」1。。。。經計算平均 :^因數為3·。丨叫。。在低pH處理27天後，所得清除因數 gy lGgi() ’其中經計算平均清除因數為η gi。該等’月除因數證實’此製程步驟顯著有利於製程 =、病毒方^之病毒安全性特徵，該等病毒對物理-化學 相性性。兩個試驗中之病毒滅活動力學具有二 在别天期間滅活較快，且在之後三週期間滅活摘 148623.doc 201107344 慢。 維持對照 為研究病毒滅活之機制’即是否係由pH或溫度或兩者之 組合來介導’將三個維持對照保持在相應條件下。 對在2 C至8 C下保持27天±5小時之「金合廣择势席」 (ΡΗ 7·0±〇·1)之滴定使所研究兩種病毒之病毒效價皆與摻 加病毒之起始材料相當，但試驗2中之MMV除外，其中觀 察到較小效價損失（1.6 logl〇)。 在30±1 C及pH 7_0±0·1下儲存（「pH維持對照」）顯示， 脂包膜病毒BVDV對在升高溫度下儲存極為敏感。在兩個 試驗中BVDV滅活4.6 l〇gl0。同樣，非脂包膜病毒MMV在 试驗1及試驗2中分別滅活3.3 1〇径10及3.8 l〇g10。 在低pH及2 C至8 C下儲存27天±5小時後對「溫度維持對 照」（t HC)之滴定使所研究兩種病毒之病毒效價與摻加病 毒之起始材料相當。該等結果證實，BVDV以及MMV對在 4.4至4.9範圍内之低pH及低溫下儲存具有抗性。 總之，三個維持對照之結果表明： •溫度係BVDV滅活之最重要因素，同時低pH有一定 作用（基於以下事實：在30士1。(：及中性pH下之對照 在27天後顯著滅活但未完全滅活）。 •對於MMV之滅活而言，溫度似乎係唯一相關因素， 此乃因低pH動力學樣品在27天後之病毒效價實質上 與中性pH及30°C下之對照相同。 總結及結論 148623.doc -81· 201107344 士研九過程中，建立在製造SwAcwvia iVG中於低pH及 升冋1下儲存之規模縮減模型，且藉由測定若干製程參 數來也實其與製造程序之對等性。此外，對规模縮減模型 Ά程中中間體之生化參數的對比進—步證實兩種製程 之對等性，從而表明在規模縮減製程期間獲得之清除因數 對大規模製程亦有效。為研究在病毒滅活方面之穩固性， 研究㈣CWWfl W中不㈤蛋白質濃度之影響，將經摻加起 。材料之pH凋節至相對於製程之上限’並研究溫度週期性 降低之影響。在此研究中獲得之病毒清除因數及滅活動力 子也實’脂包膜病毒BVDV可藉由在低pH及升高溫度下儲 存27天以内來有效且穩固地滅活。同樣’在低？1^及升高溫 度下儲存20天後，BVDV達成顯著滅活，其平均清除因數 經计算為5.4 log1()。細小病毒模型MMV之經計算平均清除 因數（即在儲存20天後為3.0 l〇glQ，且在儲存27天後為3 6 logio)顯示，對於20天以及27天之儲存時間，此製程步驟 另外有利於製程對具有高物理化學抗性之非脂包膜小DNA 病毒之病毒安全性[2]。 所研究兩種蛋白質濃度皆顯示MMV及BVDV具有相同滅 活動力學’此表明對於濃免疫球蛋白溶液及病毒BVdV與 MMV而言，蛋白質濃度對病毒滅活能力之影響不顯著。 應瞭解，本文所述實例及實施例僅出於說明性目的，且 基於其之各種修改或變化應為熟習此項技術者所瞭解且欲 包括在本申請案之精神與範圍内及隨附申請專利範圍之範 疇内。本文所引用之所有出版物、專利及專利申請案皆係 148623.doc -82· 201107344 全文以引用方式併入本文中以用於所有目的。 【圖式簡單說明】 圖1係新超濾/透析過濾系統之圖示說明。 148623.doc -83-

Claims (1)

1. 201107344 七、申請專利範圍： 1. 一種水性組合物， 物，其中卞以〃包含超過約180克蛋白質/升該組合 具中錢白之至少95%_G。 2. 如請求们之組合物， 投與之產物之方法“適合皮下及靜脈内 m 來製造’且其可在最終容器令於升高 3. 4. 5. 6. 7. 8. 二:處理’以使病毒滅活’無論其濃度係在跳至 的蛋白質濃度範圍之間調節。 如:求項1之組合物，其中該igG係人類邮。 农項1之組合物，其中該蛋白質濃度為約2㈣ (w/v)。 如凊求们之組合物，其另外包含約0103M甘胺酸。 如凊求項1之組合物，其pH為約3-0。 如清求項6之組合物，其？11為 約 4-6。 一種自血漿製備濃縮Ig(3組合物之方法，其改良包括以 下步驟： (1) 藉由超濾法，將血漿製備物中之蛋白質濃縮至約 5% (w/v); (2) 藉由透析過濾法，將該製備物中之蛋白質進一步 濃縮至約20% (w/v)， 其中該蛋白質之至少95%係IgG。 9. 如請求項8之方法，其中步驟（1)係使用標稱截留分子量 (NMWC〇)為100 kDa或更低之超濾膜來實施。 10. 如請求項8之方法，其中步驟（2)係相對於PH為4.2±〇.1之 甘胺酸透析過濾緩衝液來實施。 148623.doc 201107344 ιι·如明求項1()之方法’其中該透析過遽緩衝液具有〇a m 甘胺酸且pH為4.0。 12·如5月求項8之方法’其中該步驟（2)後之蛋白質濃度高於 2〇%(w/v)且隨後用透析過據緩衝液將其調節至約2〇% (w/v)。 13.如請求項8之方法，其中該IgG係人類igG。 14_ 一種自血漿製備濃縮Ig(}組合物之方法，其包括以下步 驟： (1) 藉由離心法，自血漿分離液體及沉澱物； (2) 混合預冷卻乙醇與該來自之液體，以形成混 合物，其乙醇濃度為約8%(v/v); (3) 藉由離心法，自該（2)之混合物分離液體及沉澱 物； (4) 將該來自（3)之液體之pH及乙醇濃度分別調節至 約7.0及20-25%(v/v)，由此形成混合物； (5) 藉由離心法’自該（4)之混合物分離液體及沉澱 物； (6) 用緩衝液，依約1至1 5之重量比，使該（5)之沉澱 物再懸浮形成懸浮液； (7) 混合二氧化矽（Si〇2)與該來自（6)之懸浮液並藉由 過濾獲得濾液； (8) 由洗滌劑及冷醇與該（7)之濾液混合，並藉由離 心獲得沉澱物； (9) 使該沉澱物溶於包含溶劑或洗滌劑之水性溶液中 148623.doc 201107344 並將該溶液維持至少6〇分鐘； (10) 使（9)後之溶液流過陽離子交換層析管柱，並將吸 附在s玄管柱上之蛋白洗脫於洗出液中； (11) 使該來自（10)之洗出液流過陰離子交換層析管 柱，獲得流出液； (12) 使該流出液流過奈米過濾器，獲得奈米濾液； (Π)使該奈米濾液流過超濾膜，獲得超濾液； (14) 相對於透析過濾緩衝液，對該超濾液進行透析過 濾，獲得蛋白質濃度為約2〇%(w/v)之溶液；及 (15) 藉由經由〇_2 μιη或更小之過濾器過濾該來自（14)之 溶液，對該溶液進行滅菌，由此獲得濃縮1§(}組合物。 15. 如請求項14之方法，其另外包含將密封容器在約3〇至 32°C下儲存約21至22天之步驟。 16. 如請求項14之方法，其另外包含調配步驟，以使該2〇% IgG產物與相關技術之10〇/〇靜脈内調配物同樣穩定。 17. —種藉由如請求項14至15中任一項之方法製造之水性組 合物，其包含至少18% (w/v)免疫球蛋白。 18. 如請求項17之組合物，其包含至少2〇% (w/v)免疫球蛋 白。 19. 一種治療患有免疫缺陷、自身免疫疾病、或急性感染之 患者之方法，其包括向該患者投與有效量之如請求項i 至6及17至1 8中任一項之組合物。 148623.doc