TW201106971A

TW201106971A - Antigen-binding proteins

Info

Publication number: TW201106971A
Application number: TW099116880A
Authority: TW
Inventors: Neil James Clarke; Susannah Karen Ford; Paul Andrew Hamblin; Stephen Martin
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2009-05-28
Filing date: 2010-05-26
Publication date: 2011-03-01
Also published as: CA2763488A1; WO2010136482A1; US20120177651A1; UY32663A; EP2435478A1; AR078046A1; JP2012527876A

Description

201106971 六、發明說明：【先前技術】眾所周知’抗體用於治療性應用中。抗體為包含至少兩條重鏈及兩冑冑μ之異源多$體酷蛋白。除IgM以外，完整抗體通常為約15〇 Kda之異源四聚體醣蛋白由兩條相同輕（L)鏈及兩條相同重（H)鏈構成。通常，各輕鍵經由H硫鍵連接至重鏈，而不同免疫球蛋白同型之重鏈之間的二硫鍵聯數目可變化。各重鍵及輕鏈亦具有鏈内二硫橋鍵。各重鏈在一端具有一可變域 (VH)，其後為多個恆定區。各輕鏈在其另一端具有一可變域（VL)及一恆定區；輕鏈恆定區與重鏈第一恆定區對準且輕鏈可變域與重鏈可變域對準。纟自大多數脊椎動物物種之抗體的輕鏈可基於恆定區之胺基酸序列而歸屬於稱為K 及λ的兩種類型之_。視重鏈恆定區之胺基酸序列而定，人類抗體可歸屬於五個不同種類：IgA、IgD、IgE、lg(}及 IgM。IgG及IgA可進-步再分為以下子類：、邮2、 ⑽及收4;及^及心。存在具有至少邮心砂孔之小鼠及大氣的物種變異體。抗體可變域賦予抗體結合特」生#中某些區域顯示特定變異性，稱為互補決定區 (CDR)。f變區之較保守部分稱為構架區㈣）。完整重鍵及輕鏈之可變域各包含由三個CDR連接之四個FR。各鏈中之咖由印區緊接地固持在一起，且與另-鏈之CDR-起 :助於形成抗體之抗原結合位點。恆定區不直接涉及抗體〃机原之結合，但展示各種效應功能諸如參與抗體依賴 148187.doc 201106971 型細胞介導之細胞毒性（ADCC)、經由結合至FcY受體參與吞嗟作用、經由新生兒F c受體（FcRn)參與半衰期/清除率及經由補體級聯之C 1 q組份參與補體依賴型細胞毒性。

IgG抗體之結構性質使得存在兩個抗原結合位點，兩者對相同抗原決定基具有特異性。其因此為單特異性的。雙特異性抗體為對至少兩種不同抗原決定基具有結合特異性之抗體。製備此專抗體之方法在此項技術中為已知的。傳統上’基於兩個免疫球蛋白Η鏈-L鏈對之共表現重組產生雙特異性抗體，其中兩條Η鏈具有不同結合特異性’參見 Millstein等人，Nature 305 537-539 (1983)、 WO 93/08829 及 Traunecker 等人，EMBO，10，1991, 3655- 3 659。由於Η鏈及L鏈之隨機分配，產生十種不同抗體結構之潛在混合物’其中僅一種結構具有所要結合特異性。替代方法涉及將具有所要結合特異性之可變域融合至包含鉸鏈區、CH2區及CH3區之至少一部分的重鏈恒定區。較佳在至少一種融合物中存在含有輕鏈結合所必需之位點的 CH1區。將編碼此等融合物及必要時編碼l鏈之DNA插入各別表現載體中且接著共轉染至適合之宿主有機體中。然而’有可能將兩條或全部三條鍵之編碼序列插入一個表現載體中。在一種方法中，雙特異性抗體由一臂中具有第一結合特異性之Η鏈及另一臂中提供第二結合特異性之h_l 鏈對（chain pair)構成，參見 WO 94/04690。亦參見Suresh 等人 ’ Methods in Enzymology 121，210，1986。其他方法包括如WO 2007/095338中所述之包含單結構域結合位點之 148187.doc 201106971 抗體分子。 HGF(肝細胞生長因子或分散因子（scatter Faet〇i·，SF)) 為多效性細胞激素，其連同其受體MET(間葉細胞上皮轉換因子（Mesenchymal Epithelial Transition factor)，亦稱為 c-MET或肝細胞生長因子受體）能夠在細胞中傳遞促遷移、抗細胞凋亡及促細胞分裂信號之獨特組合。Hgf產生於大多數組織中’經由間葉細胞來源之細胞表現且定位於細胞外基負内，其在細胞外基質中保持其非活性（前驅HGF)形式直至由蛋白酶裂解。在正常生理條件下，此回應於組織損傷或在胚胎發育期間發生。MET由上皮來源之細胞表現且與其組織定位一致，HGF/MET信號轉導之效應在上皮_ 間葉細胞相互作用、細胞移動（cell m〇bilizati〇n)、遷移 (migration)及快速細胞分裂中較為重要，其中快速細胞分裂為成體中之組織修復及胚胎中之器官形成所必需。 HGF/MET信號傳導之活化會協調多種細胞過程，包括增殖、分散/遷移、誘導細胞極性及血管生成，其中該等效應視細胞類型及環境而定。在成年動物中，路徑為相對靜止的，但其對於諸如肝再生、腎損傷之修復、皮膚癒合及 « 腸損傷之過程而言不可缺少，其中在創傷邊緣細胞中由 HGF/MET信號傳導介導之侵襲性生長的協同過程為恢復組織完整性所必需。同時，經調節之HGF/MET連同配合胚胎發育及組織形態形成之協同遺傳程式為正常生理學的基本特徵，癌細胞中不受調節之hgf/met表現為腫瘤贅生性浸染之重要特徵。此不受調節之表現可由於活化突變、基因 148187.doc 201106971 組擴增、轉錄上調及旁分泌或自分泌活化而發生。實際上，已顯示HGF/ΜΕΤ依賴型侵襲性生長信號之傳播為高侵襲性腫瘤之一般特徵，該等腫瘤可產生會遷移且滲入鄰近組織中且在原發腫瘤之遠側部位形成轉移性病灶的細胞。聯合HGF為強力血管生成因子及已知MET由内皮細胞表現之事實，治療性靶向HGF/ΜΕΤ具有抑制癌症發作、腫瘤進展及轉移的重要潛力。生長因子之血管内皮生長因子（VEGF)家族及其受體為血管生成及血管滲透性之主要調節因子。VEGF家族包含 VEGF-A、PIGF(胎盤生長因子）、VEGF_B、VEGF C、 VEGF-E及蛇毒VEGF，且認為各者在血管分佈（vascular patterning)及血官發育（vessei development)中具有不同作用。歸因於自單一第8外顯子基因轉錄之mRNA的替代性剪接’ VEGF-A具有根據信號肽裂解後剩餘胺基酸之數目鑑別的至少9種亞型（同功異型物）^舉例而言，在人類中，最主要之同功異型物為VEGF]65，其以可溶形式與細胞締合形式之間的平衡狀態存在。較長同功異型物（VEGFi83、 VEGF189及VEGF2〇6)具有c端區，該等區域帶有較高正電荷且介導與細胞表面聚糖及調節該等同功異型物生物可用性之肝素的締合。所有VEGF-A同功異型物皆由於發生締合而經由構成受體結合VEGF片段之核心（約no個n端殘基）形成同源二聚體。在正常情況下，及在實體腫瘤之中心， VEGF表現主要由低氧性條件（表示血管供給不足）介導。低氧導致低氧誘導性因子HIF-la與組成性地表現之HIF-Ια二 148187.doc 201106971 聚化，從而形成結合至VEGF基因之啟動子區中之低氧性反應元件的轉錄因子。在氧正常下，HIF-1 α蛋白質由於多個脯胺酸經基化事件而經受泛素介導之降解。其他腫瘤相關VEGF上調歸因於經由致癌基因路徑（亦即ras)藉由發炎性細胞激素及生長因子活化以及藉由機械力而發生。活性VEGF同源二聚體在細胞表面由VEGFR家族之受體結合。VEGF-A之主要血管内皮相關受體為VEGFRl(Fltl) 及VEGFR2(Flk-2 ; KDR)。兩種受體均為酪胺酸激酶家族成員且對活化而言需要配位體介導之二聚化。二聚化之後，激酶結構域經受自體磷酸化，但VEGFR2中之激酶活性程度大於VEGFR1中。已顯示VEGF之血管生成信號傳導主要經由VEGFR2介導，但VEGF對VEGFR1之親和力為約3 倍大（KD為約30 pM，相較而言，對VEGFR2之KD為100 pM)。此已導致VEGFR1主要充當誘餌受體以螯合VEGF且緩和VEGFR2活化程度的提議。儘管VEGFR1表現與一些腫瘤相關，但其主要作用似乎在胚胎發育及器官形成期間。VEGF-A165亦由神經纖毛蛋白（neuropilin)受體NRP1及 NRP2結合。儘管此等受體缺乏TK結構域，但咸信其充當 VEGFR2之共受體（co-receptor)且藉由轉移VEGF至VEGFR2 而增大信號傳導。大量研究已幫助證實VEGF-A為腫瘤血管生成中之關鍵因子。舉例而言，VEGF-A在大多數腫瘤中及在腫瘤相關基質中表現。在缺乏發展良好及擴張血管結構（expanding vasculature)系統支持生長之情況下，腫瘤細胞變得壞死及 148187.doc 201106971 /周亡’藉此對可由連續細胞增殖導致之腫瘤體積（約1 mm3)增加強加限制。VEGF_A在鄰近壞死區之低氧性腫瘤細胞中表現最咼，指示經由低氧誘導生長腫瘤中之a 可改變血管生成之活化劑及抑制劑的平衡，導致腫瘤中生長新血g。與此假設一致，已開發多種抑制或捕捉 A或阻斷其信號傳導受體VEGFR-2之方法，包括作為治療劑之小分子量酪胺酸激酶抑制劑、單株抗體、反義寡核苷酸等。【發明内容】本發明係關於HGF拮抗劑與VEGF拮抗劑之組合用於療法中。、’ 詳言之，本發明係關於一種抗原結合蛋白，其包含連接至一或多個抗原決定基結合域之蛋白質骨架，其中該抗原結合蛋白具有至少兩個抗原結合位點，其中至少一個位點來自抗原決定基結合域且其中至少一個位點來自成對 VH/VL結構域，且其中至少一個抗原結合位點結合至 HGF。本發明進-步提供-種抗原結合蛋白，其包含連接至一或多個抗原決定基結合域之蛋白„架，纟中該抗原結合蛋白具有至少兩個抗原結合位點，其中至少一個位點來自抗原決定基結合域且其中至少—個位點來自成對Μ心士構域，且其中至少一個抗原結合位點結合至卿且至少一個抗原結合位點結合至VEGF。本發明亦提供一種編碼任何本文所述抗原結合蛋白之重 M8187.doc 201106971 鏈的聚核苷酸序列，及一種編碼任何本文所述抗原結合蛋白之輕鏈的聚核苷酸。此等聚核苷酸表示對應於等效多肽序列之編碼序列，然而，應瞭解此等聚核苷酸序列可與起始密碼子、適當信號㈣及終止密碼子-起選殖至表現載體中。本發明亦提供-種重組轉型或轉染之宿主細胞，其包含 -或多種編碼任何本文所述抗原結合蛋白之重鏈及輕鍵的聚核苷酸。本發月進—步提供—種產生任何本文所述抗原結合蛋白之方法，該方法包含在適合培養基（例如無血清培養基）中心養包3第-及第二載體之宿主細胞的步驟，豸第一載體包含編碼任何本文所述抗原結合蛋白之重鏈的聚核苦酸且 -玄第-載體包含編碼任何本文所述抗原結合蛋白之輕鍵的聚核皆酸。本發明進—步提供包含如本文所述之抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。【實施方式] 定義本文斤肖術§吾『蛋白質骨架』包括（但不限於）免疫 :蛋白（Ig)骨架’例如邮骨架，其可為四鏈或兩鏈抗體，或其可能僅包含拍·轉夕Ρ β 抗體之Fc£，或其可能包含抗體之一或個忮定區，該等後定P叮在疋&可為人類或靈長類動物來源复與靈長類動物怪定區之人工嵌合體。除一或多個 “區外，此等蛋白質骨架亦可包含抗原結合位點，例如 148l87.doc 201106971 當蛋白質骨架包含完全IgG時。此等蛋白質骨架將能夠連接至其他蛋白質結構域，例如具有抗原結合位點之蛋白質結構域’例如抗原決定基結合域或ScFv*。「結構域」為摺疊蛋白質結構，其具有獨立於蛋白質之剩餘部分的二級結構。一般而言，結構域負責蛋白質之離散功能性質且在許多情況下可添加、移除或轉移至其他蛋白質而不損失蛋白質及/或結構域之其餘部分的功能。「抗體單可變域」4包含抗體可變域所特有之序列的摺疊多肽結構域。因此’其包括完全抗體可變域及經修飾可變域 (例如其中一或多個環已經不為抗體可變域所特有之序列置換）、或已經截斷或包含端延伸之抗體可變域、以及可變域中至少保留全長結構域之結合活性及特異性的摺片6吾「免疫球蛋白果可4遂A ,b 早了-文域」係私抗體可變域（vH、

Vhh、VL)獨立於不同V恧忐处姐um 小叫或結構域特異性結合抗原或抗原決疋基。免疫球蛋白單可變域可以具有其他不同的可變區或可變域之形式（例如，间尊多聚體）存在，其中該八他^區或可變域不為單免疫球蛋白可變域& 所需(亦即’其中免疫 …抗原結合抗原小當ά <域獨立於額外可變域「dAb」與能多句、结合㈣抗體」或原之免疫球蛋白單可變域，相同。免疫球蛋白單可變域一其他物種之單抗體變、仁亦包括 W〇_29〇04中所揭厂、域邊如替齒動物（例如，如不濩士鯊（nurse shark)及駱駝科 148187.doc 201106971 (。㈣w)Vhh dAb。駱駝科Vhh為源自包括駱駝、美洲駝、羊駝、單峰駝及原駝之物種之免疫球蛋白單可變域多肽，其產生天然缺乏輕鏈之重鏈抗體。可根據此項技術中可用之標準技術人類化此等Vhh結構域，且此等結構域仍然被視為本發明之「結構域抗體」。如本文所用，「Vh」包括駱駝科VHH結構域。NARV為軟骨魚（包括護士鯊）中鑑別之另一類型之免疫球蛋白單可變域。此等結構域亦稱為新穎抗原受體可變區（通常縮寫成V(NAR)或NARV)。對於其他詳情’參見 Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006)及 US 20050043519A。術5吾「抗原決定基結合域」係指一結構域獨立於不同v 區或結構域特異性結合抗原或抗原決定基，此結構域可為免役球蛋白單可變域，例如人類、駱駝科或鯊免疫球蛋白單可變域’或其可為選自由以下組成之群之非免疫球蛋白月架之衍生結構域.CTLA-4(伊維體（Evibody));脂質運載蛋白；蛋白質A衍生分子，諸如蛋白質a之Z結構域（親和抗體（Affibody) ’ SpA)、A結構域（高親和性多聚體/最大抗體（Avimer/Maxibody));熱休克蛋白，諸如Gr〇El及

GroES，轉鐵蛋白（運載體（trans-body));錨蛋白重複蛋白 (DARPin);肽適體（Peptide aptamer) ; C型凝集素結構域 (四連接素（Tetranectin));人類γ-晶狀體球蛋白及人類泛素 (親和素（affilins)) ; PDZ結構域；蠍毒素；人類蛋白酶抑制劑之庫尼兹型結構域（kunitz type domain);及纖維結合蛋白（黏結素（adnectin));其已經受蛋白質工程改造以與除 14S187.doc 201106971 其天然配位體之外的配位體結合。 CTLA-4(細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4)為主要在CD4 + T 細胞上表現之CD28家族受體。其細胞外結構域具有可變域樣Ig摺疊。與抗體CDR對應之環可經異源序列取代以賦予不同結合性質。經工程改造以具有不同結合特異性之 CTLA-4分子亦稱為伊維體（Evibody)。對於其他詳情，參見 Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)。脂質運載蛋白為轉運小疏水性分子（諸如類固醇、後膽色素、類視色素及脂質）之細胞外蛋白質家族。其在錐形結構之開放端具有含多個環之剛性β摺疊二級結構，該結構可經工程改造以結合不同標靶抗原。抗運載蛋白 (八加卜&1丨11)之尺寸介於160-180個胺基酸之間，且源自脂質運載蛋白。對於其他詳情，參見Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、US 7250297B1 及 US 20070224633 ° 親和抗體（Affibody)為源自金黃色葡萄球菌 flwrews)之蛋白質Α的骨架，其可經工程改造以結合至抗原。該結構域由約58個胺基酸之三螺旋束組成。文庫已由表面殘基之隨機化產生。對於其他詳情，參見卩1"(^丨11£叫· Des. Sel. 17, 455-462 (2004)及 EP 1641818A1。

Avimer為源自A結構域骨架家族之多結構域 (multidomain)蛋白質。約35個胺基酸之天然結構域採用確定之二硫鍵結結構。藉由改組A結構域家族所展現之天然變化產生多樣性。對於其他詳情，參見Nature Biotechnology 148187.doc -12- 201106971 23(12), 1556-1561 (2005)^ Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6)，9〇9·917 (2〇〇7年 6月）。轉鐵蛋白為單體血清轉運醣蛋白。轉鐵蛋白可藉由在容。午之表面環中插入肽序列來進行工程改造以結合不同標靶抗原。經工程改造之轉鐵蛋白骨架的實例包括運載體。對於其他 6羊情’參見 j_ Biol. Chem 274，24066-24073 (1999) 〇經設計之錨蛋白重複蛋白（DARpin)源自錨蛋白，錨蛋白為Ή V正合膜蛋白（integral membrane protein)連接至細胞骨架（cytoskeleton)的蛋白質家族。單個錨蛋白重複序列為由兩個α螺旋及一個β轉角（turn)組成之33個殘基的基元。其叮藉由隨機化各重複序列之第一 α螺旋及β轉角中之殘基來進行工程改造以結合不同標靶抗原。其結合界面可藉由增加模組數（一種親和力成熟法）而增加。對於其他詳情，參見 J. Mol. Biol. 332，489-503 (2003)、PNAS 100(4)， 1700-1705 (2003)、及 J. Mol. Biol. 369，1015-1028 (2007) 及 US 20040132028 A1 。纖維結合蛋白為可經工程改造以結合至抗原之骨架。黏結素（Adnectin)由第III型人類纖維結合蛋白（Fn3)之15個重複單元之弟1 0結構域之天然胺基酸序列的主鏈組成。在β 夾層（β-sandwich)之一端之三個環可經工程改造以使黏結素（Adnectin)能夠特異性識別相關治療標靶。對於其他詳情’參見 Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005)、 US 20080139791、WO 2005056764及 US 6818418 B1。 148187.doc 13 201106971 肽適體為由恆定骨架蛋白質組成之組合識別分子，該值定骨架蛋白通常為含有插入活性位點處之限制性可變肽環的硫氧還原蛋白（thioredoxin，TrxA)。對於其他詳情，炎見 Expert 〇pin· Bi〇l· Ther. 5, 783-797 (2005)。微體源自長度為25-50個胺基酸且含有3-4個半胱胺酸橋 (cysteine bridge)之天然存在微蛋白-微蛋白之實例包括 KalataB 1及芋螺毒素（c〇n〇t〇xin)及打結素（knottin)。微蛋白具有可經工程改造以包括多達25個胺基酸而不影響微蛋白之總體摺疊的環。對於經工程改造之打結素結構域之其他詳情’參見W〇 2008098796。其他抗原決定基結合域包括已用作工程改造不同標乾抗原結合性質之骨架的蛋白質，包括Handb〇〇k 〇f

Therapeutic Antibodies 之第 7 章-Non-Antibody Scaffolds (2007, Stefan Dubel編）及 Protein Science 15:14-27 (2006)中所s平述之人類γ_晶狀體球蛋白及人類泛素（親和素）、人類蛋白酶抑制劑之庫尼茲型結構域、Ras結合蛋白AF-6之 PDZ結構域、蠍毒素（卡律蠍毒素（charybd〇t〇xin))、c型凝集素結構域（四連接素）。本發明之抗原決定基結合域可能源自此等替代蛋白質結構域中之任一者。如本文所用，術語「成對VH結構域」、「成對VL結構域」及「成對VH/VL結構域」係指僅當與搭配物可變域成對時才特異性結合抗原的抗體可變域。在任何配對中，總有一個VH及一個VL·，且術語「成對VH結構域」係指搭配物’術語「成對VL結構域」係指VL搭配物，且術語 148l87.doc •14· 201106971 「成對VH/VL結構域」係指兩個結構域合起來。如本文利，術語「抗原結合蛋白」係指抗體、抗體片段，例如結構域抗體（dAb)、ScFv、FAb、⑽，及其他能夠結合至HGF及/或VEGF之蛋白質構築體。抗原結合分子可包含至少- Hg可變域’例如抗體、結構域抗體、 Fab、Fab·、F(ab，)2、Fv、ScFv、雙功能抗體、__、親和抗體（Affibody)、異源結合抗體或雙特異性抗體。在一實施例中，抗原結合分子為抗體。在另一實施例中，抗原結合分子為dAb，亦即免疫球蛋白單可變域，諸如、 VHH或VL，其獨立於不同v區或結構域特異性結合抗原或抗原決定基。抗原結合分子可能能夠結合至兩個標靶，亦即其可能為雙乾向蛋白質（dual targeting pr〇tein)。抗原結合分子可為抗體與抗原結合片段之組合，諸如一或多種結構域抗體及/或一或多種連接至單株抗體之ScFv。抗原結合分子亦可包含非免疫球蛋白結構域，例如選自由以下組成之群之骨架之衍生結構域：CTLA_4(伊維體作“〜#)); 脂質運載蛋白·’蛋白質A衍生分子，諸如蛋白fA《z結構域（親和抗體（Affibody)，SpA)、A結構域（高親和性多聚體/ 最大抗體（Avimer/Maxibody));熱休克蛋白，諸如Gr〇E丨及 Gr〇ES ;轉鐵蛋白（運載體）；錨蛋白重複蛋白（DARpin); U體，C型凝集素結構域（四連接素）；人類丫_晶狀體球蛋白及人類泛素（親和素）；PDZ結構域；蠍毒素；人類蛋白酶抑制劑之庫尼茲型結構域；及纖維結合蛋白（黏結素）；其已經受蛋白質工程改造以與HGF或VEGF結合。如本文 148l87.doc -15- 201106971 所用，「抗原結合蛋白」將能夠拮抗及/或中和人類HGF及/ 或VEGF。此外，抗原結合蛋白可藉由結合至HGF及/或 VEGF及阻止天然配位體結合及/或活化受體而阻斷HGF及/ 或VEGF活性。如本文所用，「VEGF拮抗劑」包括任何能夠降低及或消除VEGF之至少一種活性的化合物。舉例而言，VEGF拮抗劑可結合至VEGF且彼結合可直接降低或消除VEGF活性，或該VEGF拮抗劑可藉由阻斷至少一種配位體結合受體而 .間接發揮作用。如本文所用，「HGF拮抗劑」包括任何能夠降低及或消除HGF之至少一種活性的化合物。舉例而言，HGF拮抗劑可結合至HGF且彼結合可直接降低或消除HGF活性，或該 HGF拮抗劑可藉由阻斷至少一種配位體結合受體而間接發揮作用。在本發明之一實施例中，對各抗原而言，如BiacoreTM所量測，抗原結合位點以至少1 mM之Kd，例如10 nM、1 nM、500 pM、200 pM、100 pM之 Kd結合至抗原。如本文所用，術語「抗原結合位點」係指構築體上能夠特異性結合至抗原之位點，此位點可為單結構域，例如抗原決定基結合域，或其可為如標準抗體上可發現之成對 VH/VL結構域。在本發明之一些態樣中，單鏈Fv(ScFv)結構域可提供抗原結合位點。本文中使用術語「mAb/dAb」及「dAb/mAb」來指本發明之抗原結合蛋白。此兩個術語可互換使用且當用於本文 148187.doc -16- 201106971 中時意欲具有相同含義。本文中使用術語「恆定重鏈1」來指免疫球蛋白重鍵之 CH1結構域。 . 本文中使用術語「恆定輕鏈」來指免疫球蛋白輕鍵之怪定域。 ' 實施方式本發明提供包含HGF拮抗劑及VEGF拮抗劑之组合物。本發明亦提供HGF拮抗劑、VEGF拮抗劑之組合用於療法中。本發明亦提供藉由投與HGF拮抗劑與V]EGf结抗劑組合來治療疾病之方法。HGF拮抗劑及VEGF拮抗劑可分別、依序或同時投與。抑制jk管生成為一種已確立之治療方法，其目的在於使生長腫瘤之血液供給饑餓（且因此限制氧及養分）。多種血官生成抑制劑已在臨床前癌症模型及若干臨床試驗中得到治療學驗證。癌思停（Avastin)(貝伐珠單抗（Bevacizumab))， —種靶向VEGF之單株抗體，已經批准與化學療法組合作為治療轉移性結腸直腸癌（CRC)及非小肺癌（NSCLC)之第一線療法且許多小分子化合物正處於臨床前及臨床開發中。在某些癌症（諸如乳癌及結腸癌）中，諸如此等藥劑當與化學療法組合給予，㈣單獨給予時，彳減緩疾病進程且導致患者存活時間增加數月。實際上，在若干臨床試驗中，僅有貝伐珠單抗之組由於相對於加上化學療法（CT)之組奴肊較差而較早終止。最初，此觀測結果似乎為反常的，因為降低腫瘤血液供給已顯示會限制CT可傳遞至腫瘤 148187.doc 201106971 的程度。合理化此觀測結果之努力係基於貝伐珠單抗之效應將「正常化」腫瘤之特徵性異常血管結構的命題。血管正常化之一假定效應為間質液壓力（IFP)降低，使得血流量增加及CT藥劑滲入腫瘤核心。貝伐珠單抗與^纟且合之有效性之替代理論表明阻斷VEGF會降低養分及氧供給且觸發促細胞凋亡事件，從而增大由CT誘導之有效性。活體内模型中之新近研究已表明在臨床中，當抗血管生成抑制劑在以抑制乂£(5?路徑為目標之單藥療法（mono_ therapy)中使用時，其缺乏長期功效。若干報導證實此類方法之抗腫瘤效應，但亦顯示伴隨的腫瘤適應性（tumour adaptation及向具有升高之侵襲性且在一些情況下具有增加之淋巴轉移及遠端轉移（distant metastasis)之更惡性階段進行。因此，使癌細胞氧『饑餓』（低氧）之結果除了其= 原發腫瘤生長之有益效應外，似乎亦可驅使腫瘤細胞在別處尋找氧。換言之’藉由有效抑制新血管生成來產生抗腫瘤效應及存活益處的抗血管生成療法可另外藉由增加侵襲及轉移而改變腫瘤表型。其他報導已顯示’低氧會誘導癌細胞產生MET及經由HGF/MET介導之路徑的信號傳導增加’而此又使彼等細胞變得具有高度運動性且向遠端部位移動（轉移性分佈）。此外’連續使用單獨VEGF抑制劑可能足進替代f生新血官生成路控之使用’使得當存活率增加時有可能產生藥物抗性。因此’雙特異性分子將以單一藥劑形式組合HGF抗體活【（抑制腫瘤生長、血管生成及轉移）與^£即阻斷之抗血管 148187.doc 201106971 生成效應，且具有與分別使用各組份相比之若干優點。有可能存在協同效應，因為同時中和HGF&¥£(}1?可抑制細胞對低氧之轉移性反應，同時傳遞改良之血管生成控制。此外，此兩種活性之組合可限制當患者存活率增加時對單一藥劑抗血管生成療法產生藥物抗性的可能。此等拮抗劑可為抗體或抗原決定基結合域，例如免疫球蛋白單可變i或。拮抗劑τ以同時投與之各別分子的混合物形式投與，亦即共投與，或彼此在24小時内間隔投與，例如彼此在20小時内，或在15小時内或在12小時内，或在⑺ 小時内，或在8小時内’或在6小時内，或在4小時内，或在2小時内，或在1小時内，或在3〇分鐘内間隔投與。用於本發日月巾之其他HGF拮㈣包含抗c_met抗體，例如描述於WO 2009007427令之抗體。在另-實施例中，拮抗劑作為—種能夠結合至兩種或兩、抗原之77子存在’舉例而言，本發明提供一種雙把向分子’其能夠結合至HGF&VEGF或其能夠結合至HGF 及VEGFR2 ’或其能夠、结合C-MET及VEGF。乂本發明提供一種抗原結合蛋白，其包含連接至一或多個抗原決定基結合域之蛋白質骨架’其中該抗原結合蛋白具少兩個抗原結合位點’其中至少—個位點來自抗原決土口域且其中至少一個位點來自成對几結構域且八中至 >、一個心原結合位點結合至Hop。等抗原結合蛋白包含蛋白質骨架，例如Ig骨架，諸如

IgG ’例如單株括贈，甘_击& π 4 其連接至一或多個抗原決定基結合 148187.doc -】9· 201106971 域’例如結構域抗體，其中該結合蛋白具有至少兩個抗原結合位點’其中至少一個位點來自抗原決定基結合域，且其中至少一個抗原結合位點結合至HGF，及其製備方法及用途，特定言之為療法中之用途。本發明之抗原結合蛋白亦稱為mAbdAb。在一實施例中，本發明之抗原結合蛋白之蛋白質骨架為 Ig骨架’例如IgG骨架或IgA骨架。IgG骨架可包含抗體之所有結構域（亦即CHI、CH2、CH3、VH、VL)。本發明之抗原結合蛋白可包含選自IgGl、IgG2 ' IgG3、IgG4或 IgG4PE 之 IgG骨架。本發明之抗原結合蛋白具有至少兩個抗原結合位點，舉例而δ，其具有兩個結合位點，例如其中第一結合位點對抗原上之第一抗原決定基具有特異性且第二結合位點對同抗原上之第一抗原決定基具有特異性。在另一實施例中，存在4個抗原結合位點，或6個抗原結合位點，或8個抗原結合位點，或1〇個或10個以上抗原結合位點。在一實施例中，抗原結合蛋白對一種以上抗原，例如兩種抗原，或對三種抗原，或對四種抗原具有特異性。在另一態樣中，本發明係關於一種能夠結合至HQF之抗原結合蛋白，其包含至少一種包含式！之兩種或兩種以上結構的同源二聚體： 148187.doc •20- 201106971 (R7)m (R8)m

I I (R6)m (R3)m

I I 恒定恒定輕鏈··++重鏈1 I I (R5)m (R2)m

- I I

(R4)m X

I • (R1)n (I) 其中 X表示包含重鏈恆疋域2及重鍵值定域3之抗體怪定區； R1、R4、R7及R8表示獨立地選自抗原決定基結合域之結構域； R2表示選自由恆定重鏈1組成之群的結構域及抗原決定基結合域； R3表示選自由成對VH及抗原決定基結合域組成之群的結構域； R5表示選自由恆定輕鏈組成之群的結構域及抗原決定基結合域； R6表示選自由成對VL及抗原決定基結合域組成之群的結構域； η表示獨立地選自〇、1、2、3及4之整數； m表示獨立地選自〇及1之整數，其中怪定重鏈1與輕鏈恒定域為締合的；其中存在至少一個抗原決定基結合域； 148187.doc -21 - 201106971 且當R3表示成對VH結構域時，y表示成對乂1結構域，以致兩個結構域合起來能夠結合抗原。在一實施例中’ R6表示成對^^^^立尺3表示成對VH。在另一實施例中，117及R8之一或兩者表示抗原決定基結合域β 在另一實施例中，R1及R4之一或兩者表示抗原決定基結合域。在一實施例中，存在R4。在一實施例中’ R1、R7及R8表示抗原決定基結合域。在一實施例中，R1、R7及R8、及R4表示抗原決定基結合域。在一實施例中’（Ν)η、（R2)m、（以^及（R5)m = 0，亦即不存在’ R3為成對VH結構域，R6為成對VL結構域，R8 為 VH dAb，且 R7 為 VL dAb。在另一實施例中，（R、、（R2)m、（R4)„^ (^一為〇，亦即不存在，R3為成對VH結構域，R6為成對vl結構域，R8為VH dAb，且（R7)m=0，亦即不存在。在另一實施例中，（尺2)«!及（R5)m為〇，亦即不存在，R1 為dAb，R4為dAb，R3為成對VH結構域，R6為成對vl結構域，（R8)„^ (R7)m=〇，亦即不存在。在本發明之一實施例中’抗原決定基結合域為免疫球蛋白單可變域。應瞭解，任何本文所述抗原結合蛋白均將能夠中和一或多種抗原，舉例而言’其將能夠中和HGF且其亦將能夠中 I48187.doc -22- 201106971 和 VEGF。汝本°兒明書通篇關於本發明之抗原結合蛋白所用，術語中和」意謂相較於此等抗原結合蛋白不存在下標乾之活性本發明之抗原結合蛋白存在下標靶的生物活性完全或刀降低。中和可歸因於（但不限於）以下一或多者：阻斷配位體結合、阻止配位體活化受體、下調受體或影響效應功能性。 Γ以若干方式，例如使用如下文實例中所述之任何分析例如以可例如如實例6中所述而進行之量測配位體結合至受體之抑制作用的分析，量測中和程度。藉由評估中和性抗原結合蛋白存在下ΜΕΤ磷酸化（Met磷酸化由hgf刺激）之減J/來量測此分析中之HGF中和。適用於此分析中之HGF蛋白質包括包含NCBI參考序列：NM_〇〇〇6〇1 4 (UmProt ID P14210)之序列的HGF蛋白質。VEGFi中和程度可例如藉由描述於實例14中之分析來量測。適用於此分析中之VEGF蛋白質包括VEGFi65，其包含Ν(：ΒΙ參考 NP_〇〇l〇2〇539.2(UniProt ID: P15692)之序列。 4估中和作用之其他方法，例如評估中和性抗原結合蛋白存在下配位體與其受體之間之結合的減少，在此項技術中為已知的且包括例如BiacoreTM分析。在本發明之替代態樣中，提供抗原結合蛋白，其具有與本文例示之抗原結合蛋白至少實質上等效之中和活性。本發明之抗原結合蛋白對HGF具有特異性，舉例而言，其包含能夠結合至HGF之抗原決定基結合域，及/或其包含 148187.doc -23- 201106971 結合至HGF之成對VH/VL。抗原結合蛋白可包含能夠結合至HGF之抗體。抗原結合蛋白可包含能夠結合至HGF之免疫球蛋白單可變域。在一實施例中，本發明之抗原結合蛋白對一種以上抗原具有特異性，例如其中其能夠結合HGF及VEGF。在一實施例中，本發明之抗原結合蛋白能夠同時結合HGF及 VEGF。應瞭解，例如，如使用適合分析（諸如描述於實例7中者）經由化學計量分析（stochiometry analysis)所測定，任何本文所述抗原結合蛋白均可能能夠同時結合兩種或兩種以上抗原。此等抗原結合蛋白之實例包括具有為HGF拮抗劑之抗原決定基結合域（例如抗HGF免疫球蛋白單可變域）連接至重鏈之c端或η端或輕鏈之c端或η端的VEGF抗體。實例包括包含SEQ ID NO: 34或39中所示之重鏈序列及/或SEQ ID NO: 35中所示之輕鏈序列的抗原結合蛋白，其中重鏈及輕鍵之一或兩者進一步包含一或多個結合至HGF之抗原決定基結合域。此等抗原結合蛋白之實例包括具有為VEGF拮抗劑之抗原決定基結合域連接至重鏈之c端或η端、或c端的HGF抗體。實例包括包含SEQ ID NO: 2、6或10中所示之重鏈序列及/或SEQ ID NO: 4、8或12中所示之輕鏈序列的抗原結合蛋白’其中重鍵及輕鍵之一或兩者進一步包含一或多個能夠例如藉由結合至VEGF或VEGF受體（例如VEGFR2)而 148187.doc -24- 201106971 拮坑VEGF的抗原決定基結合域。此等抗原決定基結合域可選自SEQ ID NO: 25、26、36、37及38中所示者。在一實施例中，抗原結合蛋白包含SEQ ID NO: 2、6或 10中所示之重鏈序列及SEQ ID NO: 4、8或12中所示之輕鏈序列，且進一步包含至少一個能夠拮抗VEGF之抗原決定基結合域，例如抗dAb，例如SEQ ID NO: 25或26中所示者，或例如如SEQ ID NO: 26中所示之抗VEGF抗運載蛋白，或抗VEGFR2黏結素，該抗原決定基結合域連接至重鏈之c端或η端或輕鍵之c端或η端。此等抗原結合蛋白之實例包括具有包含VEGF免疫球蛋白單可變域的抗原決定基結合域連接至重鏈之c端或η端或輕鏈之c端或η端的HGF抗體，例如具有SEQ ID NO: 14、 18或22中所示之重鏈序列及SEQ ID NO: 4 ' 8或12中所示之輕鏈序列的抗原結合蛋白，或具有SEQ ID NO2、6或 10中所示之重鏈序列及SEQ ID NO: 16、20或24中所示之輕鏈序列的抗原結合蛋白，或具有SEQ ID NO: 1 4、1 8或 22中所示之重鏈序列及SEQ ID NO: 16、20或24中所示之輕鏈序列的抗原結合蛋白。在一實施例中，抗原結合蛋白將包含抗HGF抗體連接至為VEGF拮抗劑之抗原決定基結合域，其中該抗HGF抗體具有與以下相同的CDR :具有SEQ ID NO: 2之重鏈序列及 SEQ ID NO: 4之輕鏈序列的抗體、或具有SEQ ID NO: 6之重鏈序列及SEQ ID NO·· 10之輕鏈序列的抗體、或具有SEQ ID NO: 8之重鏈序列及SEQ ID NO: 12之輕鏈序列的抗 148187.doc -25 - 201106971 體。在一實施例中，抗原結合蛋白將包含抗HGF抗體連接至為VEGF拮抗劑之抗原決定基結合域，其中重鏈序列包含 SEQ ID NO: 10且輕鏈序列包含SEQ ID NO: 12，例如包含 SEQ ID NO: 22之重鏈序列及SEQ ID NO: 12之輕鏈序列的 mAbdAb。用於本發明中之HGF抗體之其他詳情在 WO 2005017107、WO 2007/143098及 WO 2007/115049 中給出。. 此等抗原結合蛋白之其他實例包括具有抗VEGF抗原決定基結合域連接至重鏈之c端或η端或輕鏈之c端或η端的抗 HGF抗體，其中該VEGF抗原決定基結合域為選自 WO 20070803 92(以引用的方式併入本文中）中所述之任何 VEGF dAb序列的 VEGF dAb，詳言之為 SEQ ID NO: 117、 119、123、127-198、539 及 540 中所示之 dAb ;或選自 WO 2008 149146(以引用的方式併入本文中）中所述之任何 VEGF dAb序列的VEGF dAb，詳言之為稱作〇01^15-26-501、DOM15-26-555、DOM15-26-558、DOM15-26-589、 DOM15-26-591、DOM15-26-594及 DOM15-26-595 之 dAb ; 或選自WO 2007066106(以引用的方式併入本文中）中所述之任何VEGF dAb序列的VEGF dAb ;或選自 WO 2008149147(以引用的方武併入本文中）中所述之任何 VEGF dAb序列的 VEGF dAb ;或選自 W0 2008149150(以引用的方式併入本文中）中所述之任何VEGF dAb序列的 148187.doc -26- 201106971 VEGF dAb。如同明確寫入本文中一般將W〇 2007080392 、 WC) 2008149146、WO 2007066106、WO 2008149147 及 WO 2008149150中之此等特定序列及相關揭示内容以引用的方式併入本文中，其明確目的在於提供併入本文申請專利範圍中之揭示内容及作為應用於本發明情形中之可變域及拮抗劑的實例。此4抗原結合蛋白亦可能具有一或多個具有相同或不同抗原特異性之其他抗原決定基結合域，其連接至重鏈之c 端及/或η端及/或輕鏈端及/或η端。杜本發明之一貫施例中，提供一種本文所述的本發明抗原結合蛋白，其包含恆定區以使抗體之Adcc及/或補體活化或效應功能性降低。在一此實施例中，重鏈恆定區可包含IgG2或IgG4同型之天然無效恆定區、或突變IgG丨恆定區=適合修飾之實例描述於EP 0307434中。一實例包含位置23 5及23 7(EU索引編號;)處之丙胺酸殘基的取代。在一實施例中’本發明之抗原結合蛋白將保留Fc功能性’例如將能夠保留ADCC及CDC活性之一或兩者。此等抗原結合蛋白可包含位於輕鏈上，例如位於輕鏈(；端之抗原決定基結合域。本發明亦提供藉由將抗原決定基結合域定位於抗體輕鏈上，詳言之藉由將抗原決定基結合域定位於輕鏈之c端，而保持抗原結合蛋白之ADCC及CDC功能的方法。本發明亦提供藉由將抗原決定基結合域定位於抗體重鏈 148187.doc -27- 201106971 上’詳言之藉由將抗原決定基結合域定位於重鏈之c端，而降低抗原結合蛋白之CDC功能的方法。在一實施例中，抗原結合蛋白包含之抗原決定基結合域為結構域抗體（dAb)，舉例而言，抗原決定基結合域可為人類VH或人類Vl '或駱駝科Vhh(奈米體）或鯊 dAb(NARV)。在一實％例中，抗原結合蛋白包含抗原決定基結合域，其係選自由以下組成之群之骨架之衍生物：CTLA 4(伊維體（Evibody))·’脂質運载蛋白；蛋白質A衍生分子諸如蛋白質A之Z結構域（親和抗體（Affib〇dy) , SpA)、A結構域（高親和性户聚體/最大抗體（Avimer/Maxib〇dy));熱休克蛋白，諸如GroEl及GroES;轉鐵蛋白（運載體）；錨蛋白重複蛋白（DARPin);肽適體；c型凝集素結構域（四連接素）；人類γ-晶狀體球蛋白及人類泛素(親和素）；舰結構域；蠍毒素；人類蛋白酶抑制劑之庫尼兹型結構域；及纖唯处合蛋白（黏結素）’·其已經過蛋白質工程改造，以與除了 ^ 天然配位體之外的配位體結合。本發明之抗原結合蛋白可包含連接至抗原決定基結合域黏結素的蛋白f骨架’例如具有黏結素連接至重鏈c端之邮骨架，或其可包含連接至黏結素之蛋白質骨架，例如具有黏結素連接至重鏈11端之IgG骨架，或其可包含連接至黏結素之蛋白質骨架’例如具有黏結素連接至輕鏈e端之邮骨架，或其可包含連接至黏結素之蛋白質骨架，例如具有黏結素連接至輕鏈η端之IgG骨架。 148187.doc -28- 201106971 在其他實施例中，其可包含連接至抗原決定基結合域 CTLA-4的蛋白質骨架，例如IgG骨架，例如具有CTLA-4 連接至重鏈η端之IgG骨架，或其可包含例如具有CTLA-4 連接至重鏈c端之IgG骨架，或其可包含例如具有CTLA-4 連接至輕鏈η端之IgG骨架，或其可包含具有CTLA-4連接至輕鏈c端之IgG骨架。在其他實施例中，其可包含連接至抗原決定基結合域脂質運載蛋白的蛋白質骨架，例如IgG骨架，例如具有脂質運載蛋白連接至重鏈η端之IgG骨架，或其可包含例如具有脂質運載蛋白連接至重鏈c端之IgG骨架，或其可包含例如具有脂質運載蛋白連接至輕鏈η端之IgG骨架，或其可包含具有脂質運載蛋白連接至輕鏈c端之IgG骨架。在其他實施例中，其可包含連接至抗原決定基結合域 SpA的蛋白質骨架，例如IgG骨架，例如具有SpA連接至重鏈η端之IgG骨架，或其可包含例如具有SpA連接至重鏈c端之IgG骨架，或其可包含例如具有SpA連接至輕鏈η端之 IgG骨架，或其可包含具有SpA連接至輕鏈c端之IgG骨架。在其他實施例中，其可包含連接至抗原決定基結合域親和抗體的蛋白質骨架，例如IgG骨架，例如具有親和抗體連接至重鏈η端之IgG骨架，或其可包含例如具有親和抗體連接至重鏈c端之IgG骨架，或其可包含例如具有親和抗體連接至輕鏈η端之IgG骨架，或其可包含具有親和抗體連接至輕鏈c端之IgG骨架。 148187.doc -29- 201106971 在其他實施例中，其可包含連接至抗原決定基結合域 affimer的蛋白質骨架，例如IgG骨架，例如具有affimer連接至重鏈η端之IgG骨架，或其可包含例如具有affimer連接至重鏈c端之IgG骨架，或其可包含例如具有affimer連接至輕鏈η端之IgG骨架，或其可包含具有affimer連接至輕鏈c 端之IgG骨架。在其他實施例中，其可包含連接至抗原決定基結合域 GroEl的蛋白質骨架，例如IgG骨架，例如具有GroEl連接至重鏈η端之IgG骨架，或其可包含例如具有GroEl連接至重鏈c端之IgG骨架，或其可包含例如具有GroEl連接至輕鏈η端之IgG骨架，或其可包含具有GroEl連接至輕鏈c端之 IgG骨架。在其他實施例中，其可包含連接至抗原決定基結合域轉鐵蛋白的蛋白質骨架，例如IgG骨架，例如具有轉鐵蛋白連接至重鏈η端之IgG骨架，或其可包含例如具有轉鐵蛋白連接至重鏈c端之IgG骨架，或其可包含例如具有轉鐵蛋白連接至輕鏈η端之IgG骨架，或其可包含具有轉鐵蛋白連接至輕鍵c端之IgG骨架。在其他實施例中，其可包含連接至抗原決定基結合域 GroES的蛋白質骨架，例如IgG骨架，例如具有GroES連接至重鍵η端之IgG骨架，或其可包含例如具有GroES連接至重鏈c端之IgG骨架，或其可包含例如具有GroES連接至輕鏈η端之IgG骨架，或其可包含具有GroES連接至輕鏈c端之 IgG骨架。 148187.doc -30- 201106971 在其他實施例中，其可包含遠桩匕3運接至抗原決定基結合域 DARPin的蛋白質骨架，例如 g月^，例如具有DARPin 連接至重鏈η端之IgG骨架，或盆可勺 A具可包含例如具有DARPin 連接至重鍵ci而之IgG骨架，或盆可句人如丄又一J包含例如具有DARPin 連接至輕鏈η端之IgG骨架，戎豆河々人忒具可包含具有DARPin連接至輕鏈c端之IgG骨架。其可包含連接至抗原決定基結合域肽例如IgG骨架，例如具有肽適體連接，或其可包含例如具有肽適體連接至或其可包含例如具有肽適體連接至輕在其他實施例中，適體的蛋白質骨架，至重鏈η端之IgG骨架重鏈c端之IgG骨架，键η端之IgG骨架’或其可包含具有肽適體連接至輕鍵c端之IgG骨架。在本發明m例中，存在四個抗原決定基結合域，例如四個結構域抗體，#中兩個抗原決定基結合域可對同一抗原具有特異性，或所有存在於抗原結合蛋白中之抗原決定基結合域可對同一抗原具有特異性。本發明之蛋白質骨架可使用連接子連接至抗原決定基結口域。適合連接子之實例包括長度可為以下的胺基酸序列：1個胺基酸至15〇個胺基酸，或〗個胺基酸至14〇個胺基酉欠例如1個胺基酸至130個胺基酸，或1至1 20個胺基酸，或1至80個胺基酸，或1至50個胺基酸，或1至20個胺基酸，或1至10個胺基酸，或5至18個胺基酸。此等序列可具有其自身三級結構’例如本發明連接子可包含單可變域。在一實施例中，連接子之尺寸等同於單可變域。適合連接 J48I87.doc 201106971 子之尺寸可為1至20埃（angstrom)，例如小於1 5埃，或小於 10埃，或小於5埃。在本發明之一實施例中，至少一個抗原決定基結合域以包含1至150個胺基酸，例如1至20個胺基酸，例如1至10個胺基酸的連接子直接連接至Ig骨架。此等連接子可選自 SEQ ID NO: 27-32中所示之任一者，或此等連接子中之多者。用於本發明之抗原結合蛋白中之連接子可僅包含或除其他連接子外亦包含一或多組GS殘基，例如『GSTVAAPS』或『TVAAPSGS』或『GSTVAAPSGS』。在一實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 28。在一實施例中，抗原決定基結合域藉由連接子『（PAS)n(GS)m』連接至Ig骨架。在另一實施例中，抗原決定基結合域藉由連接子『（GGGGS)n(GS)m』連接至Ig骨架。在另一實施例中，抗原決定基結合域藉由連接子『（TVAAPS)n(GS)m』連接至Ig骨架。在另一實施例中，抗原決定基結合域藉由連接子『（GS)m(TVAAPSGS)n』連接至Ig骨架。在另一實施例中，抗原決定基結合域藉由連接子『（PAVPPP)n(GS)m』連接至Ig骨架。在另一實施例中，抗原決定基結合域藉由連接子『（TVSDVP)n(GS)m』連接至Ig骨架。在另一實施例中，抗原決定基結合域藉由連接子『（TGLDSP)n(GS)m』連接至Ig骨架。在所有此等實施例中，n=l-10，且 m=0-4。此等連接子之實例包括（PAS)n(GS)m，其中n=l且 148187.doc -32- 201106971 m=l(SEQ ID NO: 46); (PAS)n(GS)m，其中 n=2且 m=l(SEQ ID NO: 47); (PAS)n(GS)m，其中 n=3 且 m=l(SEQ ID NO: 48) ; (PAS)n(GS)m，其中 n=4 且 m = l ; (PAS)n(GS)m，其中 n=2 且 m=0 ; (PAS)n(GS)m，其中 n=3 且 m = 0 ; (PAS)n(GS)m，其中n=4且m = 0。此等連接子之實例包括（GGGGS)n(GS)m，其中n=l且 m=l ; (GGGGS)n(GS)m，其中 n=2且 m=l ; (GGGGS)n(GS)m，其中 n=3 且 m=l ; (GGGGS)n(GS)m，其中 n=4 且 m=l ; (GGGGS)n(GS)m，其中 n=2 且 m=0(SEQ ID NO: 49); (GGGGS)n(GS)m，其中 n=3 且 m = 0(SEQ ID NO: 50); (GGGGS)n(GS)m，其中 n=4且 m=0。此等連接子之實例包括（TVAAPS)n(GS)m，其中n = l且 m=l(SEQ ID NO: 32); (TVAAPS)n(GS)m，其中 n=2且 m=l (SEQ ID NO: 64) ; (TVAAPS)n(GS)m，其中 n=3 且 m=l(SEQ ID NO: 65) ; (TVAAPS)n(GS)m，其中 n=4且 m=l ; (TVAAPS)n (GS)m，其中 n=2 且 m=0 ; (TVAAPS)n(GS)m，其中 n=3 且 m=0 ; (TVAAPS)n(GS)m，其中 n=4且 m=0。此等連接子之實例包括（GS)m(TVAAPSGS)n，其中n=l且 m=l(SEQ ID NO: 40) ; (GS)m(TVAAPSGS)n，其中 n=2 且 m=l(SEQ ID NO: 41) ; (GS)m(TVAAPSGS)n，其中 n=3 且 m=l(SEQ ID NO: 42);或（GS)m(TVAAPSGS)n，其中 n=4且 m=l(SEQ ID NO: 43) ; (GS)m(TVAAPSGS)n，其中 n = 5 且 m=l(SEQ ID NO:44) ; (GS)m(TVAAPSGS)n，其中 n=6 且 m=l(SEQ ID NO:45) ; (GS)m(TVAAPSGS)n，其中 n=l 且 148187.doc -33- 201106971 m=0(SEQ ID NO: 32) ； (GS)m(TVAAPSGS)n，其中 n=2 且 m=10 ; (GS)m(TVAAPSGS)n ，其中 n=3 且 m=0 ;或 (GS)m(TVAAPSGS)n，其中 n=0。此等連接子之實例包括（PAVPPP)n(GS)m，其中n=l且 m=l(SEQ ID NO: 51) ; (PAVPPP)n(GS)m，其中 n=2且 m=l (SEQ ID NO: 52) ; (PAVPPP)n(GS)m，其中 n=3且 m=l(SEQ ID NO: 53) ; (PAVPPP)n(GS)m，其中 n=4且 m=l ; (PAVPPP)n (GS)m，其中 n=2 且 m=0 ; (PAVPPP)n(GS)m，其中 n=3 且 m=0 ; (PAVPPP)n(GS)m，其中 n=4且 m=0。此等連接子之實例包括（TVSDVP)n(GS)m，其中n=l且 m=l(SEQ ID NO: 54) ; (TVSDVP)n(GS)m，其中 n=2且 m=l (SEQ ID NO: 55) ; (TVSDVP)n(GS)m，其中 n=3且 m=l(SEQ ID NO: 56) ; (TVSDVP)n(GS)m，其中 n=4且 m=l ; (TVSDVP)n (GS)m，其中 n=2 且 m=0 ; (TVSDVP)n(GS)m，其中 n=3 且 m=0 ; (TVSDVP)n(GS)m，其中 n=4且 m=0。此等連接子之實例包括（TGLDSP)n(GS)m，其中n=l且 m=l(SEQ ID NO: 57) ; (TGLDSP)n(GS)m，其中 n=2且 m=l (SEQ ID NO: 58) ; (TGLDSP)n(GS)m，其中 n=3且 m=l(SEQ ID NO: 59) ; (TGLDSP)n(GS)m，其中 n=4 且 m=l ; (TGLDSP)n(GS)m，其中 n=2 且 m=0 ; (TGLDSP)n(GS)m，其中 n=3 且 m=0 ; (TGLDSP)n(GS)m，其中 n=4且 m=0。在另一實施例中，抗原決定基結合域與Ig骨架之間無連接子。在另一實施例中，抗原決定基結合域藉由連接子『TVAAPS』連接至Ig骨架。在另一實施例中，抗原決定 148187.doc -34- 201106971 基結合域藉由連接子『TVAAPSGS』連接至Igt架。在另貝知例中，抗原決定基結合域藉由連接子『G S』連接至

Ig骨架。在另一實施例中，抗原決定基結合域藉由連接子『ASTKGPT』連接至Ig骨架。在一實施例中’本發明之抗原結合蛋白包含至少一個抗原結合位點’例如至少一個抗原決定基結合域，其能夠結合人血清白蛋白。在一實施例中’存在至少3個抗原結合位點，例如存在4 或5或6或8或10個抗原結合位點，且抗原結合蛋白能夠結合至少3或4或5或6或8或10個抗原，例如其能夠同時結合3 或4或5或6或8或10個抗原。本發明亦提供抗原結合蛋白以供醫學中使用，例如供製造用於治療咸信需要血管生成或與HGF(HGF/Met信號傳導）及/或VEGF之含量升高相關的實體腫瘤之藥劑使用。此等腫瘤包括結腸、乳房、卵巢、肺（小細胞或非小細胞）、前列腺、胰腺、腎、肝、胃、頭及頸部之腫瘤、黑素瘤、肉瘤。亦包括原發及繼發（轉移性）腦腫瘤，包括（但不限於）神經膠質瘤（包括室管膜瘤（epenymomas))、腦膜瘤、少突神經膠質瘤（oligodendromas)、星形細胞瘤 (astrocytomas)(低級、退行性（anaplastic)及多形性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme))、髓母細胞瘤 (medulloblastomas)、神經節瘤（gangliomas)、神經鞘瘤 (schwannnomas)及脊索瘤（chordomas)。其他適於用本發明抗原結合蛋白治療之與不合需要的血管生成相關之疾病包 148187.doc -35- 201106971 括年齡相關之黃斑部變性、糖尿病性視網膜病變、RA及牛皮癬。本發明提供一種治療罹患實體腫瘤（包括結腸、乳房、卵巢、肺（小細胞或非小細胞）、前列腺、騰腺、腎、肝、胃、頭及頸部之腫瘤、黑素瘤、肉瘤）、原發及繼發（轉移性）腦腫瘤（包括（但不限於）神經膠質瘤（包括室管膜瘤）、腦膜瘤、少突神經膠質瘤、星形細胞瘤（低級、退行性及多形性膠質母細胞瘤）、趙母細胞瘤、神經節瘤、神經勒瘤及脊索瘤）、年齡相關之黃斑部變性、糖尿病性視網膜病變、RA或牛皮癬之患者的方法，其包含投與治療量之本發明抗原結合蛋白。本發明之抗原結合蛋白可用於治療實體腫瘤（包括結腸、乳房、卵巢、肺（小細胞或非小細胞）、前列腺、騰腺、腎、肝 '胃、頭及頸部之腫瘤、黑素瘤、肉瘤）、原發及繼發（轉移性）腦腫瘤（包括（但不限於）神經膠質瘤（包括室管膜瘤）' 腦膜瘤、少突神經膠質瘤、星形細胞瘤（低級、退行性及多形性膠質母細胞瘤）、髓母細胞瘤、神經節瘤、神經鞘瘤及脊索瘤）、年齡相關之黃斑部變性、糖尿病性視網膜病變、RA或牛皮癬或任何其他與HGF及/或 VEGF過度產生相關之疾病。本發明之抗原結合蛋白可具有一些效應功能。舉例而 έ ’若蛋白質骨架含有源自具有效應功能之抗體的以區，例如若蛋白質骨架包含IgGl之CH2及CH3。效應功能之程度可根據已知技術而變化，例如藉由CH2結構域中之突 148187.doc -36- 201106971 文例如其中IgGl CH2結構域在選自239及332及330之位置處具有一或多個突變，例如該等突變係選自S239D及 133迮及A33〇L，以致抗體具有增強之效應功能及/或例如籍由改變本發明抗原結合蛋白之糖基化概況，以致Fc區之岩藻糖基化（fUC0sylati〇n)降低。用於本發明中之蛋白質骨架包括包含抗體之所有結構域的元王單株抗體骨架’或本發明之蛋白質骨架可包含非習知抗體結構’諸如單價抗體。此等單價抗體可包含成對重鏈及t鏈，其中重鏈之鉸鏈區經修飾使得重鏈不發生同源一聚，諸如描述於W〇2〇〇7〇59782中之單價抗體。其他單價抗體可包含與缺乏功能可變區及CH1區之第二重鏈二聚的成對重鏈及輕鏈，其令第一及第二重鏈經修飾使得其將形成異源二聚體而非同源二聚體，產生具有兩條重鏈及一條輕鏈之單價抗體，諸如描述於WO 2006015371中之單價抗體。此等單價抗體可提供可連接抗原決定基結合域之本發明蛋白質骨架。用於本發明中之抗原決定基結合域為獨立於不同v區或結構域特異性結合抗原或抗原決定基的結構域，此可為結構域抗體或可為選自由以下組成之群之非免疫球蛋白骨架之衍生結構域：CTLA-4(伊維體（Evibody));脂質運載蛋白；蛋白質A衍生分子，諸如蛋白質八之z結構域（親和抗體（Affibody) ’ SpA)、A結構域（高親和性多聚體/最大抗體 (Avimer/Maxibody));熱休克蛋白’諸如 &〇幻及Gr〇Es; 轉鐵蛋白（運載體）；錨蛋白重複蛋白（DARpin);肽適體； 148187.doc •37· 201106971 C型凝集素結構域（四連接素）；人類γ_晶狀體球蛋白及人類泛素（親和素）；PDZ結構域；蠍毒素；人類蛋白酶抑制劑之庫尼茲型結構域；及纖維結合蛋白（黏結素）；其已經受蛋白質工程改造以與除其天然配位體之外的配位體結合。在一實施例中’此可為結構域抗體或其他適合結構域，諸如選自由以下組成之群的結構域：CTLA-4、脂質運載蛋白、SpA、親和抗體（Affibody)、avimer、GroEl、轉鐵蛋白GroES及纖維結合蛋白。在一實施例中，此可選自免疫球蛋白單可變域、親和抗體（Affib〇dy)、錨蛋白重複蛋白（DARPin)及黏結素。在另一實施例中，此可選自親和抗體（Affibody)、錨蛋白重複蛋白（DARPin)及黏結素。在另一實施例中此可為結構域抗體，例如選自人類、駱駝科或I (NARV)結構域抗體之結構域抗體。抗原決定基結合域可在一或多個位置處連接至蛋白質骨架。此等位置包括蛋白質骨架之c端及1^端，例如之重鏈c端及/或輕鏈c端，或例如IgG之重鏈N端及/或輕鏈N 端。 ^ 在一實施例中，第一抗原決定基結合域連接至蛋白質骨架且第二抗原決定基結合域連接至第一抗原決定基結合域’舉例而言’當蛋白質骨架為IgG骨架日f ’第—抗原決定基結合域可連接至IgG骨架之重鏈㈣，且彼抗原決定基結=域可在其e端連接至第二抗原決定基結合域，或舉例 :吕’第-抗原決定基結合域可連接至IgG骨架之輕鏈c 端，且彼第-抗原決定基結合域可進—步在其㈣連接至 148187.doc •38· 201106971 第二抗原蚊基結合域，或舉例而言，第-抗原決定基結合域可連接至IgG骨架之輕鏈n端，且彼第—抗原決定基結合域可進一步在其η端連接至第二抗原決定基結合域，或舉例而σ，第一抗原決定基結合域可連接至骨架之重鏈η端’幻皮第-抗原決定基結合域可進—步在其n端連接至第二抗原決定基結合域。當抗原決定基結合域為結構域抗體時，一些結構域抗體可適合於骨架内之特定位置。用於本發明中之結構域抗體可連接於習知1§(}之重鏈及/ 或輕鏈的C末端。此外，一些免疫球蛋白單可變域可連接至習知抗體之重鏈及輕鏈的C末端。在免疫球蛋白單可變域之Ν端融合至抗體恆定域（Cd或 CL)的構築體中，肽連接子可有助於免疫球蛋白單可變域結合至抗原。實際上，dAb之N末端位於緊靠涉及抗原結合活性之互補決定區（CDR)處。因此，短肽連接子充當蛋白嘁月杀之抗原決定基結合域與恆定域之間的間隔子，其可允許dAb CDR更容易地到達抗原，因此可以高親和力結合。免疫球蛋白單可變域連接至IgG之環境將取決於其融合至哪條抗體鍵而不同：虽在IgG骨架之抗體輕鏈的c末端融合時，預期各免疫球蛋白單可變域位於抗體鉸鏈及Fc部分之附近。此等免疫球蛋白單可變域將可能彼此遠離定位。在習知抗體中，片段之間的角度及各Fab片段與Fc部分之間的角度可極其 148187.doc •39· 201106971 顯著地變化。就mAbdAb而言，Fab片段之間的角度可能不會迥然不同，同時可觀測到關於各Fab片段與以部分之間之角度存在一些角度限制。虽在IgG骨架之抗體重鏈的c末端融合時，預期各免疫球蛋白單可變域位於Fc部分之Ch3結構域附近。預期此不會影響 Fc 對 Fc 受體（例如 FcyRI、FcyRII、FCYRIII&FcRn)之、-’。合性虞，因為此等受體與Ch2結構域嚙合（對、

FcYrii及fcyriii類受體而言）或與介於Ch2與^^結構域之間的鉸鏈嚙合（例如FcRn受體）。此等抗原結合蛋白之另一特破在於，預期兩個免疫球蛋白單可變域在空間上彼此接近且若藉由供給適當連接子來提供靈活性，則此等免疫球蛋白：可變域可能甚至形成同源二聚物質，因此擴展㈣分之『拉鏈』（zipped)四級結構，從而可增強構築體穩定性。此等、，、。構考慮可有助於選擇最適合位置以將抗原決定基結合域（例如dAb)連接至蛋白質骨架（例如抗體）上。抗原之尺寸、其定位（血液中或細胞表面上）、其四級結構(單體或多聚體)可變化。習知抗體由於存在鉸鏈區而：然設計成充當接附構築體（adapt〇r ，其中在Μ 片丰又頂h之兩個抗原結合位點的定向可廣泛變化且因此適於k原及其^境之分子特徵。相反’連接至抗體或其他蛋月例如包含無叙鏈區之抗體的蛋白質骨架）之免疫球蛋白單可變域可能直接或間接地具有較小結構靈活性。瞭解免疫球蛋白單可變域處結合之溶解狀態及模式亦為 148187.doc 201106971 有益的。累積跡象表明，活體外dAb可主要以呈溶解狀態之單體、同源二聚體或多聚體形式存在（Reiter等人， (1999) J Mol Biol 290，第 685-698 頁；Ewert 等人，（2003) J Mol Biol 325，第 53 1 -553 頁；Jespers等人，（2004) J Mol Biol 337，第 893-903 頁；Jespers 等人，（2004) Nat Biotechnol 22，第 1161-1165 頁；Martin 等人，（1997)

Protein Eng. 10，第 607-614 頁；Sepulvada等人，（2003) J Mol Biol 3；33 ’第355-365頁）。此清楚地使吾人聯想起關於 Ig結構域所觀測之活體内多聚化事件，該等Ig結構域諸如本瓊氏蛋白質（Bence-Jones protein)(其為免疫球蛋白輕键之一聚體（Epp 等人，（1975) Biochemistry 1 4，第 4943-4952 頁，Huan等人，（1994) Biochemistry 33，第 14848-14857 頁，Huang等人，（1997) Mol immunol 34，第 1291-1301 頁））及澱粉狀蛋白纖維（james等人，（2〇〇7) j M〇i Biol 367:603-8) ° 舉例而言，可能需要將傾向於以溶解狀態二聚之dAb連接至Fc部分之C末端，優先於輕鏈之c末端，因為連接至

Fc之C末端將允許彼等dAb在本發明之抗原結合蛋白情形下二聚。本發明之抗原結合蛋白可包含對單—抗原具有特異性之抗原結合位點’或可具有對兩種或兩種以上抗原，或對單 -抗原上之兩個或兩個以上抗原決定基具有特異性之抗原、、。口位點或所存在之抗原結合位點各對相同或不同抗原上之不同抗原決定基具有特異性。 148l87.doc -41 - 201106971 詳言之，本發明之抗原結合蛋白可適用於治療與hgf及 VEGF相關之疾病，例如咸信需要血管生成或與 HGF(HGF/Met信號傳導）及/或VEGF之含量升高相關的實體腫瘤。此等腫瘤包括結腸、乳房1巢、肺（小細胞或非小細胞）、前列腺、騰腺、腎、肝、胃、頭及頸部之腫瘤、黑素瘤、肉瘤。亦包括原發及繼發（轉移性）腦腫瘤，包括（但不限於）神經膠質瘤（包括室管膜瘤）、腦膜瘤、少突神經膠質瘤、星形細胞瘤（低級、退行性及多形性膠質母細胞瘤）、髓母細胞瘤、神經節瘤、神經鞘瘤及脊索瘤。其他適於用纟發明抗原結合蛋白治療之與不合需要的血管生成相關之疾病包括年齡相關之黃斑部變性、糖尿病性視網膜病變、RA及牛皮癖。本發明之抗原結合蛋白可藉由用包含本發明抗原結合蛋白之編碼序列的表現載體轉染宿主細胞而產生。藉由與能夠控制宿主細胞中之複製及表現、及/或自宿主細胞：：泌的習知調節控制序列操作性關聯土也置放抗原、结合蛋白之此等編碼序列來產生表現載體或重組質體。調節序列包括啟動子序列（例如CMV啟動子）及彳源自^已知抗體之信號序列。類似地’可產生具有編碼互補抗原結合蛋白輕鍵或重鏈之DNA序列的第二表現載體。在某些實施例中，除了所關注之編碼序列及可選擇標記外，此第二表現載體與第-表現㈣—致’如此以儘可能確保各多肽鍵功能性表 ^或者，抗原結合蛋白之重鏈及輕鏈編碼序列可存在於單載體上，例如同一載體中之兩個表現卡匣中。 148187.doc •42· 201106971 用第一及第二載體由習知技術共轉染所選宿主細胞（或僅由單一載體轉染），以產生本發明之經轉染宿主細胞，其包含重組或合成輕鏈及重鏈。接著由習知技術培養經轉染細胞以產生本發明之經工程改造的抗原結合蛋白。藉由適當分析’諸如ELISA或RIA，自培養物中篩檢包括重組重鏈及/或輕鏈之締合物的抗原結合蛋白。類似習知技術可用於建構其他抗原結合蛋白。熟習此項技術者可選擇用於本發明之方法及組合物建構中之選殖及次選殖步驟的適合載體。舉例而言，可使用習知PUC系列之選殖載體。一種載體，即puc 1 9，可自諸如

Amiwrsham(Buckinghamshire, United Kingdom)或 Pharmacia (Uppsala，Sweden)之供應室購得。另外，任何能夠輕易地複製、具有豐富選殖位點及可選擇基因（例如抗生素抗性）且易於操作之載體皆可用於選殖。因此，選殖載體之選擇不為本發明之限制因素。表現載體亦可由適於擴增異源DNA序列之表現的基因 (例如，哺乳動物二氫葉酸還原酶基因（DHFR))表徵。其他載體序列包括P〇ly A信號序列’諸如來自牛生長激素 (BGH)及β球蛋白啟動子序列（pgl〇pr〇)。適用於本文中之表現載體可由熟習此項技術者熟知之技術合成。此等載體之組份，例如複製子、選擇基因、強化子、啟動子、信號序列及其類似物，可自商#或天然來源獲得或由用於^導所選伤主中重M⑽蚊產物的表現及/或分泌之已知程序合成。為此’亦可選擇其他適當表現載體，其 148187.doc *43- 201106971 中許多類型在此項技術中已知用於哺乳動物、細菌、昆蟲、酵母及真菌表現。本發明亦涵蓋用含有本發明抗原結合蛋白之編碼序列之重組質體轉染的細胞株。適用於此等選殖載體之選殖及其他操作的宿主細胞亦為習知的。然而，來自各種大腸桿菌 (£. co//)菌株之細胞可用於選殖載體之複製、及本發明抗原結合蛋白之建構中的其他步驟。適用於表現本發明抗原結合蛋白之宿主細胞或細胞株包括哺乳動物細胞（諸如NS0、Sp^/0、CHO(例如DG44)、 COS、HEK)、纖維母細胞（例如3T3)及骨髓瘤細胞，舉例而言，本發明抗原結合蛋白可在CH〇或骨髓瘤細胞中表現。可使用人類細胞，因此使分子能夠經人類糖基化模式修飾。或者’可使用其他真核細胞株。適合哺乳動物宿主細胞及用於轉型、培養 '擴增、篩檢及產物產生及純化的方法之選擇在此項技術中為已知的。參見，例如上文引用之Sambrook等人。細菌細胞可證實適用作適用於重組Fab之表現或本發明之其他實施例.的宿主細胞（參見，例如pmckthun，A， Immunol. Rev.，130:151-188 (1992))。然而，歸因於蛋白質在細菌細胞中以未摺疊或不適當摺疊形式或以非糖基化形式表現的趨勢，須篩檢細菌細胞中產生之任何重組Fab 以保留抗原結合能力。若由細菌細胞表現之分子以適當形式摺疊產生，則彼細菌細胞將為所需宿主，或在替代實施例中，分子可在細菌佰主中表現且隨後經再摺疊。舉例而 148187.doc •44- 201106971 5 ’用於表現之各種大腸桿菌菌株在生物技術領域中作為宿主細胞為吾人所熟知。此方法中亦可使用枯草桿菌（反 iwhiD)、鏈黴菌（Sirepiomyei)、其它桿菌及類似物之各種菌株。必要時’熟習此項技術者已知之酵母細胞菌株，以及昆蟲細胞（例如果蠅（Drosophila)及鱗翅目昆蟲（Lepid〇ptera)) 及病毒表現系統亦可用作宿主細胞。參見，例如MiUer等人，Genetic Engineering, 8:277_298, pienum press (]986) 及其中所引用之參考文獻。可建構載體之一般方法、產生本發明宿主細胞所需之轉染乃法、及自此宿主細胞產生本發明抗原結合蛋白所必需之培養方法可全部為習知技術。通常，本發明之培養方法為無血清培養方法，通常在無血清懸浮液中培養細胞。同樣，一旦產生本發明之抗原結合蛋白，則可根據此項技術中之標準程序，包括硫酸銨沈澱、親和管柱、管柱層析法、凝膠電〉永法及其類似方&，自乡田胞培養内纟物進行純化。此等技術在此項技術之技能内且不限制本發明。舉例而言’ WO 99/58679及W〇 96/1699q中描述了經改變抗體之製備。表現抗原結合蛋白之另一方法可利用轉殖基因動物中之表現，諸如描述於美國專利第4,873,316號中。此專利係關於使用動物路蛋白啟動子之表現系統，當該啟動子以轉殖基因方式併人哺乳動物中時，其允許雌性動物產生其乳汁中所需之重組蛋白質。 148187.doc -45- 201106971 在本發明之另一態樣中，提供一種產生本發明抗體的方法’该方法包含培養經編碼本發明抗體之輕鏈及/或重鏈之載體轉型或轉染的宿主細胞及回收藉此產生之抗體的步驟。根據本發明，提供一種產生本發明之抗原結合蛋白的方法’該方法包含以下步驟： (a) 提供編碼該抗原結合蛋白的重鏈之第一載體； (b) 供編碼該抗原結合蛋白的輕鍵之第二載體； (c) 用該第一及第二載體轉型哺乳動物宿主細胞（例如 CHO); (d) 在有助於該抗原結合蛋白自該宿主細胞分泌至該培養基中之條件下培養步驟（c)之宿主細胞； (e) 回收步驟（d)之分泌性抗原結合蛋白。一旦抗原結合蛋白由所需方法表現，則接著使用適當分析檢驗其活體外活性。目前使用習知ELISA分析形式來評估抗原結合蛋白與其標靶之定性及定量結合。另外亦可使用其他活體外分析來驗證中和功效，接著進行後續人類臨床研究以評估抗原結合蛋白於體内的持久性，即使存在常見清除機制。治療之劑量及持續時間與本發明分子在人體循環中的相對持續時間有關，且可由熟習此項技術者視所治療之病狀及患者之一般健康狀況加以調整。預計可能需要長時期 (例如四至六個月）内重複給藥（例如一週一次或每兩週— 次）以達成最大治療功效。 148187.doc -46- 201106971 本發明治療劑之投藥模式可為任何適合將藥劑傳遞至宿主的途徑。本發明之抗原結合蛋白及醫藥組合物尤其適用於非經腸投與，亦即皮下（s.c.)、勒内、腹膜内、肌㈣ (1.1：11.)、靜脈内（丨^.)或鼻内。本發明治療劑可製備成含有有效量之本發明抗原結合蛋白作為活性成份於醫藥學上可接受之載劑中的醫藥組合物。在本發明之預防劑中，含有抗原結合蛋白的水性雖浮液或溶液可在生理學pH值下經緩衝，呈準備用於注射之形式。用於非經腸投與之組合物通常將包含本發明抗原結合蛋白或其混合物（cocktail)溶於醫藥學上可接受之載劑（例如水性載劑）中的溶液。可使用多種水性載劑，例如㈣生理食鹽水、〇.3%甘胺酸及其類似物。此等溶液可製備為無菌的且一般不含顆粒狀物質。此等溶液可由習知、熟知滅菌技術（例如過濾）進行滅菌。組合物可含有如接近生理條件所需之醫藥學上可接受之輔助物質，諸如阳值調節劑及緩衝劑等。此醫藥調配物中本發明抗原結合蛋白之濃度可廣泛變化，亦即，小於約〇 5重量％(通常為約丨重量％或至少約1重量％)至多達15重量％或20重量％，且將根據所選特定投藥模式，主要基於流體體積、黏度等加以選擇。因此，用於肌肉内注射之本發明醫藥組合物可製備成含有1 mL無菌緩衝水，及約！ ng至約2〇〇mg，例如約5〇叫至約30 mg或約5 mg至約25 mg的本發明抗原結合蛋白。類似地，用於靜脈内輸注之本發明醫藥組合物可製成含有約 250 ml無菌林格氏溶液（Rjnger,s s〇iuti〇n)、及每毫升林格 I48187.doc -47- 201106971 氏溶液約1 mg至約30 mg或約5 mg至約25 mg之本發明抗原結合蛋白。製備可非經腸投與之組合物之實際方法為熟知的，或對於熟習此項技術者將為顯而易知的，且更詳細描述於例如 Remington’s Pharmaceutical Science，第 15 版， Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 中〇對於製備本發明之可靜脈内投與之抗原結合蛋白調配物，參見 Lasmar U及 Parkins D，「The formulation of Biopharmaceutical products」，Pharma. Sci.Tech.today，第 129-137頁，第 3卷 (第 3期，2000年 4月）；Wang, W，「Instability，stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals」，Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188 ; Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B, Ahern T.J.、Manning M.C.編，New York， NY: Plenum Press (1992) ; Akers，. M.J.，「Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations」，J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300 ; Imamura，K等人，「Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state」，J Pharm Sci 92 (2003) 266-274 ; Izutsu, Kkojima，S.，「Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying」，J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039 ; Johnson， R ，「Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization」， J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922 ； Ha,E Wang W, Wang Y.j.，「Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability」，J. Pharm Sci，91，2252-2264,（2002)，其全部内 148187.doc -48- 201106971 容以引用的方式併入本文中且讀者特定參考該等文獻。在一實施例中，當本發明之治療劑於醫藥製劑中時，其以單位劑量形式存在。熟習此項技術者將輕易地確定適當治療有效劑量。可根據患者重量計算對患者適合之劑量，舉例而言，適合劑量可在〇.〇1至約2〇 mg/kg，例如〇丨至2〇 mg/kg ’ 例如 u2〇 mg/kg，例如 1〇至2〇 mg/kg或例如 mg/kg，例如1〇至15 mg/kg2範圍内。為了有效地治療用於本發明之人類病狀，本發明抗原結合蛋白的適合劑量可在0.01至1000 mg，例如0丨至1〇〇〇 mg，例如〇丨至 mg ’ 例如 500 mg，例如〇.u1〇〇 mg，或〇 u8〇叫，或 0·1至60 mg，或0.1至40 mg，或例如1至1〇〇 mg，或1至5〇 mg之範圍内，其可非經腸投與’例如皮下、靜脈内或肌肉内。需要時，可在由醫師酌情選擇之適當時間間隔下重複此劑量。本文所述之抗原結合蛋白可凍乾儲存且在使用之前於適合載劑中復原。此技術已顯示對習知免疫球蛋白有效且可使用此項技術中已知之凍乾及復原技術。此項技術中已知數種方法可用於發現用於本發明中之抗原決定基結合域。術語「文庫」係指異質多肽或核酸之混合物。文庫由各具有單一多肽或核酸序列之成員構成。就此而言，「文庫」與「谱系」同義。文庫成員之間之序列差異導致文庫中存在多樣性。文庫可採用多肽或核酸之簡單混合物形式，或可呈經核酸文庫轉型之有機體或細胞形式，例如細 148187.doc -49· 201106971 菌、病毒、動物或植物細胞及其類似物。在一實例中，各個別有機體或細胞僅含有一個或有限數目之文庫成員。核酸宜併入表現載體中，以允許表現由核酸編碼之多肽。因此’在一態樣中，文庫可採用宿主有機體之群體形式，各有機體含有表現載體之一或多個複本，該表現載體含有呈核酸形式之單一文庫成員，該成員可經表現以產生其相應多肽成員。因此，宿主有機體之群體具有編碼多種多肽之大譜系的潛力。「通用構架」為單一抗體構架序列，其對應於如Kabat (「Sequences 〇f Proteins 〇f Immun〇1〇gical ^如如」，仍

Department of Health and Human Services)所定義之抗體序列保守區域，或對應於如Ch〇thia&Lesk，（1987) ; M〇1

Bi〇1· 196:91G_917所定義之人類生殖系免疫球蛋白譜系或結構。可能存在單一構架或一組此等構架，已發現儘管僅高變區中有變化，但允許衍生出實際上任何結合特異性。在一實施例中，使用演算法BLAST 2 Sequences，使用預設參數來制定及確定如本文所定義之胺基酸及核苷酸序列比對及同源性、類似性或一致性（Tatus〇va，τ A等人， FEMS Microbiol Lett，174:187-188 (1999))。當呈現系統（例如在核酸之編碼功能與由該核酸編碼之肽或多肽之功能特徵之間建立聯繫的呈現系統）用於本文所述之方法中時，例如用於dAb或其他抗原決定基結合域之選擇中時’其經常有利地擴增或增加編碼所選狀或多肽之核酸的複本數目。此為使用本文所述之方法或其他適合 148187.doc •50· 201106971 孰=夕選擇或為製備額外譜系(例如親和力成 :曰系)提供獲得足量核酸及，或肽或多肽的有效方法。因此’在-些實施例中’選擇抗原決定基結合域之方法包含使用呈現系統（例如，其在核酸之編碼功能與由該核酸編碼之肽或多肽之功能特徵之間建立聯繫，諸㈣菌體呈現）’且進—步包含擴增或增加編碼所選肽或多肽之核酸的複本數目。可使用任何適合方法擴增核酸，諸如嗤菌體擴增、細胞生長或聚合酶鏈反應。在貝例中，s亥等方法使用在核酸之編碼功能與由該核酸編碼之多肽之物理、化學及/或功能特徵之間建立聯繫的土現系統。此類呈現系統可包含複數個可複製遺傳封裝 (genetic package) ’諸如噬菌體或細胞（細菌）。呈現系統可包含文庫’諸如噬菌體呈現文庫。噬菌體呈現為呈現系統之實例。多種適合之噬菌體呈現系統（例如單價呈現及多價呈現系統）已經描述。（參見，例如Griffiths等人，美國專利第 6,5 5 5,313 B1號（以引用的方式併入本文中）；j〇hnson等人，美國專利第5,733,743號（以引用的方式併入本文中）； McCafferty等人，美國專利第5,969，108號（以引用的方式併入本文中）；Mulligan-Kehoe，美國專利第5,702,892號（以引用的方式併入本文中）；Winter, G.等人，Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994) ; Soumillion, P. # A 5 Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3):175-189 (1994)； Castagnoli, L.等人，Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2):121- 148187.doc 51 201106971 133 (2001))。呈現於噬菌體呈現系統中之肽或多肽可呈現於任何適合噬菌體上，諸如絲狀噬菌體（例如fd、ΜΠ、 F1)、溶解性噬菌體（lytic phage)(例如Τ4、Τ7、λ)或RNA噬菌體（例如MS2)。一般而言，產生或提供之噬菌體文庫將肽或噬菌體多肽之譜系呈現為與適合的噬菌體鞘蛋白（例如fd ρΙΠ蛋白質）形成之融合蛋白質。融合蛋白質可呈現在噬菌體鞘蛋白之頂端或必要時在内部位置處之肽或多肽。舉例而言，所呈現之肽或多肽可存在於ρ〗〗〗之結構域丨的胺基端位置處。 (pin之結構域丄亦稱為N1。）所呈現之多肽可直接融合至 pin(例如师之結構域WN端）或使用連接子融合至即。 '、、要寺融3可進一步包含標籤（例如myc抗原決定基、 His標籤)。可使用任何適合方法產生包含肽或多肽之譜系呈現為與嗟菌體勒蛋白形成之融合蛋白質的文庫，諸如將馬斤呈現之肽或多肽之噬菌體載體或噬菌粒（phagemid) 載體的文庫引入適合宿主細菌中，且培養所得細菌以產生噬菌體（例如必要時使用適合之辅助嗟菌體（helper phage) 或補償質體（⑶mplementing plasmid))。可使用任何適合方法諸如沈殿及離心，自培養物中回收嗤菌體文庫。 i呈現系統可包含含有任何所要量之多樣性之肽或多肽的曰系舉例而δ ’譜系可含有具有對應於由有機體、有機體，、所需組織或所需細胞類型表現之天然存在多肽之胺 :-夂序列的肽或多& ,或可含有具有隨機或隨機化胺基酸 j之肽或夕肽。必要時，多肽可共有共同核心或骨架。 I48I87.doc 52- 201106971 舉釗而。°晋系或文庫中之所有多肽皆可基於選自以下之骨架：蛋白質A、蛋白質l、蛋白質G、纖維結合蛋白結構域抗運載蛋白、CTLA4、所要酵素（例如聚合酶、纖維素酶）、或來自免疫球蛋白超家族之多肽，諸如抗體或抗體片段（例如抗體可變域）。此類譜系或文庫中之多肽可包含隨機或隨機化胺基酸序列之確定區域及共同胺基酸序列之區域。在某些實施例中，譜系中之所有或實質上所有多肽皆為所要類型，諸如所要酵素（例如聚合酶）或抗體之所要抗原結合片段（例如人類％或人類Vl)。在一些實施例中，多肽呈現系統包含多肽之譜系，其中各多肽包含抗體可變域。舉例而言，譜系中之各多肽可含有VH、火或 Fv(例如單鍵ρν)。 °「使用任何適合方法將胺基酸序列多樣性引入肽或多肽或月架之任何所要區域中。舉例而言，可藉由使用任何適合的大變誘發方法（例如低保真度PCR '寡核苷酸介導之突變誘發或定點突變誘發、使用ΝΝΚ密碼子實現多樣化）或任何其他適合方法製備編碼多樣化多肽之核酸的文庫，將胺基S欠序列多樣性引入靶區，諸如抗體可變域或疏水結構域之互補決定區中。必要時，可隨機化欲多樣化之多肽區域。構成譜系之多肽的尺寸主要與選擇有關，且均一多肽尺寸不合需要。譜系中之多肽可具有至少三級結構（形成至少一個結構域）。選擇/分離/回收 I48187.doc •53- 201106971 可使用任何適合方法自譜系或文庫（例如呈現系統中）選擇、分離及/或回收抗原決定基結合域、或結構域之群體。舉例而言，基於可選特徵（例如物理特徵、化學特徵、功能特徵）選擇或分離結構域。適合之可選功能特徵包括譜系中之肽或多肽的生物活性，例如結合至通用配位體（例如超抗原）、結合至標靶配位體（例如抗原、抗原決定基、受質）、結合至抗體（例如經由表現於肽或多肽上的抗原決疋基）及催化活性。（參見例如Tomlinson等人， WO 99/20749 ; WO 01/57065 ; WO 99/58655。）在一些實施例中’蛋白酶抗性肽或多肽係選自及/或分離自實質上所有結構域共有共同可選特徵之肽或多肽之文庫或譜系。舉例而言’結構域可選自實質上所有結構域結合共同通用配位體、結合共同標乾配位體、結合共同抗體 (或由共同抗體結合）、或具有共同催化活性之文庫或譜系。舉例而言，當進行免疫球蛋白單可變域之親和力成熟時，此類選擇尤其適用於製備基於具有所要生物活性之親本肽或多肽之結構域的譜系。基於結合至共同通用配位體之選擇可產生結構域之集合或群體，其所含之所有或實質上所有結構域均為原始文庫· 或譜系之組份。舉例而言，可藉由淘選加仙㈣或使用適 _親#力基質來選擇、分離及/或回收結合標革巴配位體或，用配位體之結構域，諸如蛋白fA、蛋白^或抗體。藉由添加配位體(例如通用配位體 '標靶配位體)溶液至適合容器（例如管 '皮氏培養皿（petH蝴）中且使配位體沈 148187.doc •54· 201106971 積或塗佈於容器壁上來實現淘選。過量配位體可洗掉且可添加結構域至容器中，且該容器保持在適於肽或多肽結合固定配位體之條件下。未結合結構域可洗掉且可使用任何適合方法’諸如刮擦（scraping)或降低13^1值，來回收結合結構域。適合之配位體親和力基質一般含有共價或非共價連接有配位體的固體支撐物或珠粒（例如瓊脂糖）。親和力基質可使用分批&、管柱法或任何其他適合方法在適於結構域結合至基質上之配位體的條件下與肽或多肽（例如已用蛋白酶培育之§普系）結合。不結合親和力基質之結構域可洗掉且可使用任何適合方法溶離且回收結合結構域，諸如用較低pH值緩衝液、用輕度變性劑（例如尿素）或用競爭結合至配位體之肽或結構域溶離。在一實例中，生物素標記之標靶配位體在適於譜系中之結構域結合該標靶配位體之條件下與譜系結合。使用固定抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素 (例如在珠粒上）回收結合結構域。在些貫她例中，通用配位體或標乾配位體為抗體或其 k原結合片段。結合文庫或譜系之肽或多肽中實質上保守之肽或多肽結構特徵的抗體或抗原結合片段尤其適用作通用配位體。適用作分離、選擇及/或回收蛋白酶抗性肽或多肽之配位體的抗體及抗原結合片段可為單株或多株的且可使用任何適合方法製備。文庫/譜系可使用任何適合方法製備或獲得編碼及/或含有蛋白酶 148187.doc •55- 201106971 抗原決定基結合域之文庫。文庫可設計成編碼基於相關处構域或骨架（例如選自文庫之結構域）之結構域，或可使用° 本文所述之方法選自另-文庫。舉例而言，可使用適合之多肽呈現系統製備富含結構域之文庫。編碼所要類型之結構域之譜系的文庫可輕易地使用任何適合方法產生。舉例而言，可例如藉由使用易出錯聚合酶鏈反應（PCR)系統擴增核酸、藉由化學突變誘發（De吨等人，J· Biol，Chem.，269:9533 (1994))或使用細菌突變菌株 (Low等人，j. M〇i. Bi〇h，26〇:359 (1996))獲得編碼所要類型之多肽（例如免疫球蛋白可變域）之核酸序列且可製備各含有一或多個突變之核酸的集合。在其他實施例中，可靶向核酸之特定區域以獲得多樣化。用於突變所選位置之方法在此項技術中亦為熟知的且包括例如在使用或不使用PCR下，使用錯配寡核苷酸或簡併寡核苷酸。舉例而言，已以抗原結合環突變為目標來產生合成抗體文庫。已將隨機或半隨機抗體H3及L3區附接至生殖系免疫球蛋白V基因區段以產生具有未突變構架區之大文庫（Hoogenboom 及Winter (1992)，同上文；Nissim 等人（1994)，同上文；Griffiths等人（1994)，同上文； DeKruif等人（1995) ’同上文）。此多樣化已延伸包括一些或所有其他抗原結合環（Crameri等人（1996) Nature Med.， 2:100 ; Riechmann 等人（1995) Bio/Technology, 13:475 ;

Morphosys，WO 97/08320，同上文）。在其他實施例中，可由例如使用第一 PCR產物作為「大引子（mega_primer)」之 148I87.doc -56- 201106971 兩步PCR策略靶向核酸 .之特义區域以獲得多樣化。（參男，例如Landt，〇.等人，r 兄仏似％:125_128 〇99〇)。）亦由SOE PCR實現靶向多檨 σ ’ 。（多見’例如Horton, R μ等人，Gene 77:61-68 (1989)。）所選位置處之㈣多樣性可藉由改變指；t多肽序列之編碼序列以使多個可能胺基酸（例如所有2q個胺基酸或並子集）可在彼位置處合併來達成。使用mpAc命名法，最通用密碼子為跳’其編碼所有胺基酸以及TAG终止穷碼子可使用臟密碼子以引人所要多樣性。達到相同目的之其他密碼子亦適用，包括NNN密碼子，其導致產生額外終止在碼子TGA及TAA。&類乾向方法可允許探測乾區域中之完整序列空間。一些文庫包含為免疫球蛋白超家族之成員的結構域（例如抗體或其部分）。舉例而言，文庫可包含具有已知主鍵構形之結構域。（參見，例如Tomlinson等人，W0 99/20749。）可1備適合|體或載體_之文庫。如本文所用，載體係指用於將異源DNA引入細胞中以使其表現及/或複製的離散元件。可使用任何適合載體，包括質體（例如細菌質體）、病毒或噬菌體載體、人工染色體及游離型載體。此等載體可用於單純選殖及突變誘發，或表現載體可用於驅動文庫表現載體及貝體通常含有一或多個選殖位點（例如多酶切點接頭）、複製起點及至少一個可選擇標記基因。表現載體可進一步含有驅動多肽轉錄及轉譯之元件，諸如強化子兀件、啟動子、轉錄終止信號、信號序列及其類似元 1481S7.doc -57- 201106971 件。此等元件可以可操作地連接至編碼多肽之經選殖插入物的方式排列，以致當此類表現載體保持在適於表現之條件下（例如在適合之宿主細胞中）時，表現且產生該多肽。選殖及表現載體一般含有使載體能夠在一或多種所選宿主細胞中複製的核酸序列。通常在選殖載體中，此序列為使載體能夠獨立於宿主染色體DNA而複製之序列且包括複製起點或自主複製序列。針對多種細菌、酵母及病毒，熟知此等序列。質體pBR322之複製起點適於大多數革蘭氏陰性細菌，2微米質體起點適於酵母，且各種病毒起點（例如SV40、腺病毒）適用於哺乳動物細胞中之選殖載體。— 般而言，哺乳動物表現載體不需要複製起點，除非此等表現載體用於能夠複製高含量DNA之哺乳動物細胞，諸如 C 0 s細胞中。選殖或表現載體可含有選擇基因，亦稱為可選擇標記。此等標記基因編碼選擇性培養基中生長之經轉型宿主細月巧之存活或生長所必需的蛋白質。未用含有選擇基因之轉型的宿主細胞將因此不在培養基中存活。典型選擇某因編碼之蛋白質賦予對抗生素及其他毒素（例如安比西林、新黴素、曱胺喋呤或四環素）之抗性，彌補營養缺陷不足或提供生長培養基中不可獲得之關鍵養分。適&之表現載體可含有多種組份’例如複製起、 •、’ 、可選擇標記基因、一或多個表現控制元件，諸如轉錄控制元件 (例如啟動子、強化子、終止子）及/或一或多個轉譯信號、信號序列或前導序列及其類似組份。若存在表現控制元件 148187.doc -58- 201106971 及信號或前導序列，則其可由載體或其他來源提供。舉例而言，編碼抗體鏈之經選殖核酸的轉錄及/或轉譯控制序列可用於直接表現。可提供啟動子詩所要宿主細胞t之表現。啟動子可為組成性的或誘導性的。舉例而言’可將啟動子可操作地連接至編碼抗體、抗體鏈或其部分之核酸，以致其引導核酸轉錄。可獲得多種適合原核（例如針對大腸桿⑽响之 β-内醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酯酶、色胺酸 ⑽）啟動子系統、lac、tac ' Τ3、Τ7啟動子）及真核（例如猿猴病毒4〇早期或晚期啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)長末端重複序列啟動子、細胞巨大病毒 (cytomegalovirus)啟動子、腺病毒晚期啟動子、EG_ia啟: 子）宿主之啟動子。此外，表現載體通常包含用於選擇載有載體之宿主細胞的可選擇標記’且在可複製表現載體之情形下，包含複製起點。編碼賦予抗生素或藥物抗性之產物的基因為常用可選擇& s己且可用於原核（例如β _内醯胺酶基因（安比西林抗由胞（例如新黴素性）、針對四環素抗性之Γ以基因）及真核安比西林或潮黴素抗性 (G41 8或遺傳黴素）、gpt(黴酚酸）基因）中。二氫葉酸還原酶標記基因允許在多種宿主中用曱胺嗓吟進打選擇。編碼宿主營養缺陷標記（例如、圓3、題3)之基因產物之基因f料酵母中的可選擇標記。亦意欲使用病毒（例如桿狀病毒）或噬菌體載體及能= 整合至宿主細胞基因組中之載體，諸如反轉錄病毒載^。° 148187.doc •59· 201106971 適用於原核細胞（例如細菌細胞’諸如大腸桿菌）或哺乳動物細胞中之表現的表現載體包括例如ρΕΤ載體〇jWpET-12a、pET-36、pET-37、pET-39、pET-40，Novagen及其他公司）、嗟菌體載體（例如pCANTAB 5 E，Pharmacia)、 pRIT2T(蛋白質 A 融合載體，Pharmacia)、pCDM8、 pCDNAl.l/amp、pcDNA3_l、pRc/RSV、pEF-l(Invitrogen, Carlsbad, CA)、pCMV-SCRIPT、pFB、pSG5、pXTl (Stratagene，La Jolla，CA)、pCDEF3(Goldman，L.A.等人，Biotechniques，21:1013-1015 (1996))、pSVSPORT (GibcoBRL，Rockville，MD)、pEF-Bos(Mizushima，S.等人，Nucleic Acids Res.，18:5322 (1990))及其類似物。可獲得適用於各種表現宿主（諸如原核細胞（大腸桿菌）、昆蟲細胞（果繩（^Drosop/n’/aOSchnieder S2細胞、Sf9)、酵母（嗜曱醇酵母（P. 、甲醇酵母（户· 、釀酒酵母 (<S. cerevWae))及哺乳動物細胞（例如COS細胞））之表現載體。載體之一些實例為使對應於多肽文庫成員之核苷酸序列能夠表現的表現載體。因此，可藉由表現多肽文庫成員之單一純系的各別增殖及表現來用通用配位體及/或標靶配位體進行選擇。如上所述，特定選擇呈現系統為噬菌體呈現。因此’可使用噬菌體或噬菌粒載體，舉例而言，載體可為具有大腸桿菌複製起點（針‘對雙股複製）以及噬菌體複製起點（以產生單股DNA)之嗟菌粒載體。此等載體之操作及表現在此項技術中為熟知的（Hoogenboom及Winter 148187.doc -60- 201106971 (1992)，同上文；Nissim等人（1994)，同上文）。簡言之，載體可含有職予噬菌粒選擇性之β-内醯胺酶基因、及位於表現卡匣上游之lac啟動子，該表現卡匣可含有適合前導序列、多選殖位點、一或多個肽標籤、一或多個TAG終止密碼子及噬菌體蛋白質pin。因此，使用大腸桿菌之各種抑制因子及非抑制因子菌株且同時添加葡萄糖、異丙基硫代-β-D-半乳橋苷（IPTG)或輔助噬菌體（諸如vCS M13)時，載體能夠作為不表現質體進行複製，僅產生大量多肽文庫成員或產生產物噬菌體，其中一些產物之表面上含有多肽-pill融合物之至少一個複本。抗體可變域可包含標靶配位體結合位點及/或通用配位體結合位點。在某些實施例中，通用配位體結合位點為關於超抗原（諸如蛋白質A、蛋白質L或蛋白質G)之結合位點。可變域可基於任何所要可變域，例如人類VH(例如％ la、VH lb、VH 2、VH 3、VH 4、VH 5、VH 6)、人類 νλ(例如 νλΐ、\an、νλίπ、νλίπν、νλν、νλνι或 VkI)或人類

Vk(例如 Vk2、Vk3、Vk4、Vk5、Vk6、Vk7、Vk8、Vk9 或

VkIO)。另一種技術包括在人工隔室（artificial compartment)中選擇5普系’其允許基因與其基因產物連接。舉例而言， WO 99/02671、w〇 00/40712 及 Tawfik 及 Griffiths (1998)

Nature Biotechnol 16(7)，652-6中描述一種選擇系統，其中編碼所需基因產物之核酸可於油包水乳液所形成之微囊中加以選擇。將編碼具有所要活性之基因產物的遺傳元件劃 148187.doc -61 - 201106971 入微囊中且接著轉錄及/或轉譯以在微囊内產生其各別基因產物（RNA或蛋白質）。隨後撿選產生具有所要活性之基因產物的遺傳元件。此方法藉由々左秸田U夕種方式偵測所要活性來選擇相關基因產物。抗原決疋基結合域之表徵 '、、„構域與其特異性抗原或抗原決定基之結合可由將為熟習此項技術者所熟知之方法測試且包括elisa。在一實例中’使用單株噬菌體ELISA測試結合。噬菌體ELISA可根據任何適合程序進行：下文闡述例示性方案。在各輪選擇下產生之噬菌體群體可由eusa針對與所選抗原或抗原決定基之結合進行篩檢以鑑別「多株」噬菌體抗體。來自此等群體之單感染細菌群落的噬菌體可接著由 ELIS A篩檢以鑑別r單株」噬菌體抗體。亦需要篩檢用於釔合至抗原或抗原決定基之可溶抗體片段，且此亦可使用例如對抗C端或N端標籤之試劑由ELISa進行（參見例如

Winter^ 人 ’（1994) Ann. Rev. Immunology 12，433-55及其中所引用之參考文獻）。所選嗟菌體單株抗體之多樣性亦可藉由PCR產物之凝膠電泳（Marks等人’ 1991 ’同上文；Nissim等人，1994，同上文）、探測（Tomlinson 等人，（1992) J. Mol. Biol. 227, 776)或藉由載體DNA定序來評估。 dAb之結構在dAb係選自例如使用如本文所述的噬菌體呈現技術選 148187.doc •62· 201106971 擇之v基因睹系的情況下，則此等可變域包含通用構架區’以致其可由如本文所定義之特定通用配位體加以識別。通用構架、通用配位體及其類似物之用途描述於 WO 99/20749 中。虽使用V基因譜系時，多肽序列中之變化可位於可變域之結構％内。任一可變域之多肽序列均可藉由DNA改組或藉由突變而改變以增強各可變域與其互補對的相互作用。 DNA改組在此項技術中為已知的且例如由Stemmer，1994,

Nature 370’· 389-391及美國專利第6,297,〇53號教示，此兩篇文獻均以引用的方式併入本文中。其他突變誘發方法為熟習此項技術者所熟知。用於建構dAb之骨架 i.主鏈構形之選擇免疫球蛋白超家族之成員對其多肽鏈而言皆共有類似摺疊。舉例而言’儘管抗體在其一級序列方面極具多樣性，但序列與晶體結構之比較已揭示，與預期相反，抗體六個抗原結合環中之五者（HI、H2、LI、L2、L3)採用有限數目之主鏈構形或正則結構（Chothia及Lesk, (1987) J. Mol. Biol.，196: 901 ; Chothia等人，（1989) Nature，342: 877)。分析環長度及關鍵殘基已因此致能預測發現於大部分人類抗體中之HI、H2、LI、L2及L3之主鏈構形（Chothia等人， (1992) J. Mol. Biol.，227: 799 ; Tomlinson等人，（1995) EMBO J·，14: 4628 ; Williams等人，（1996) J. Mol. Biol·， 264: 220)。儘管H3區在序列、長度及結構方面具有更大多 148187.doc -63- 201106971 樣性（歸因於使用D區段），但其由於環長度較短而亦形成有限數目之主鏈構形’視環及抗體構架中關鍵位置處之特定殘基之長度及存在或殘基類型而定（心㈣人，（1996) J. Mol‘ Biol.，263: 800 ;阳⑻等人，（η%) febs l扣⑽， 399: 1)。 ^宜由結構域文庫，諸如％結構域文庫及/或火結構域文庫組裝。在―態樣巾，設計某些環長度及關鍵殘基已經選擇以確保成M之主鏈構形已為吾人所知的結構域文庫。如上文所論述’此等構形宜為自然界巾發現之免疫球蛋白超家族分子之實際構形，以使此等構形為非功能構形的可能性降至最低。生殖系V基因區段充當一種適用於建構抗體或T細胞受體文庫之基本構架；其他序列亦適用。變化可能以低頻率發生’因此少量功能成員可能具有不影響其功能之改變的主鏈構形。正則結構理論亦適用於評估由配位體編碼之不同主鏈相形之數目、預測基於配位體序列之域構形及選擇不影键正則結構之殘基以獲得多樣化^知在人類\結構域中； L1環可採用四種正則結構之一，^環具有單一正則結構且 9〇%之人類VK結構域採用L3環之四種或五種正職構之一 (T〇mHnS〇n等人，（1"5)，同上文）；因此，在單獨VK結構域中，不同正則結構可組合產生多種不同主鏈構形。已知 w結構域編碼L1、LuL3環之乡種不同正則結構且^及 νλ結構域可與任何可編碼出及112環之數種正則結構的結構域成對’則針對此五個環所觀測到之正則結構組合的9 148187.doc •64· 201106971 數目極A此暗tf主鏈構形多樣性之產生可能為產生多種結合特異性所必需。然而，藉由建構基於單一已知主鏈構形之抗體文庫已發現，與預期相反，無需主鍵構形多樣性來產生足以靶向實質上所有抗原之多樣性。甚至更意外單主鏈構形無需為_致結構（c〇nse讀s structure)·單 7天然存在構形可用作整個文庫之基礎。因此，在一特定態樣中，dAb具有單一已知主鏈構形。所選單—主鏈構形在所論述免疫球蛋白超家族類型之分子中可為普遍存在的。當觀測到大量天然存在分子採用某種構形時，該構形為普遍存在的。因此，在-態樣中，分別考慮免疫球蛋白結構域之各結合環之不同主鍵構形的天然存在形式且接著選擇具有不同環之主鍵構形之所要組合的存在可變域。若無一可變域可用，則可選擇最接近之等效物。可藉由選擇編碼所要主鍵構形之生殖系基因區奴來產生不同環之主鏈構形的所要組合。在一實例中，所選生殖系基因區殺堂太白妙.w ± n 匕奴々在自然界中表現，且詳言之其可為所有天然生殖系基因區段中最常表現者。在°又计文庫時，可分別考慮六個抗原結合環中每一者之不同主鏈構形的發生率（ineide叫。對於Η〗、H2、^^ 及L3而言，選擇由天然存在分子中2〇%與州之間之抗原結合環所採用的既定構形。通常，其觀測發生率在35%以上⑶即介於35%與100%之間），且理想地在5〇%以上或甚、上因為大多數H3^不具有正則結構，故較佳選擇’I 丁正則構之壤中普遍存在的主鏈構形。對各環而 148J87.doc -65- 201106971 言’因此選擇天然譜系中最常觀測到之構形。在人類抗體中，各環之最常見正則結構（CS)如下：Hl-CS 1 (表現譜系之 79%)、H2-CS 3(46%)、VK2L1-CS 2(39%)、L2-CS 1 (100%)、VK2L3-CS 1(36%)(計算假定κ:λ比率為 70:30，

Hood等人，（1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.， 48·· 133)。對具有正則結構之H3環而言，具有鹽橋之七個殘基（殘基94至殘基101)之Cdr3長度（Kabat等人，（1991)

Sequences of proteins of immunological interest, U.S.

Department of Health and Human Services)似乎最常見。 EMBL資料4中存纟&有形成此構形所需之H3長度及關鍵殘基之至少16個人類抗體序列，且蛋白質資料庫中存在可用作抗體模型化之基礎的至少兩種晶體結構（2cgr& hM)。最常表現此正則結構組合之生殖系基因區段為Vh區段3_23 (DP-47)、JH 區段 JH4b、Vk 區段〇2/〇12(DpK9)及區段 JkI。VH區段1)1>45及1)1>38亦適合。此等區段可因此組合用作建構具有所要單一主鏈構形之文庫的基礎。或者替代選擇基於各孤立結合環之不同主鏈構形之然存在形式的單一主鏈構形，使用主鏈構形之組合的天存在形式作為選擇單—主鏈構形之基礎。在抗體情形下舉例而έ，可4定任何兩個、三個、四個、五個或所有個抗原結合環之正則結構組合的天㈣在形式。此處。選構形在天然存在抗體中可為#遍存在的且可在天秋级中最常觀測到。因此，在人類抗體中，舉例而言，卷^ 五個抗原結合細^卜咖之天然組合作^ 148187.doc -66 - 201106971 擇單-主鏈構形之基礎時，確定正則結構之最常見組合真接著與H3環之最常見構形組合。正則序列之多樣化在選擇數種已知主鏈構形或單—已知主鏈構形之後，玎藉由改變分子結合位點來建構d A b以產生具有結構及/或功能多樣性之譜系。此意謂產生變異體，以致其在其結構方面及/或在其功能方面具有足夠多樣性，使得其能夠提供多種活性。 >斤要多樣性通常藉由在一或多個位置處改變所選分子而產生。欲改變之位置可隨機選擇’或其可經選擇。接著，可藉由隨機化達成變化，在此期間駐留胺基酸由任何天然或合成胺基酸或其類似物置換，從而產生大量變異體，或可藉由以確定子集之胺基酸中的一或多者置換駐留胺基酸來達成變化，從而產生較有限數目之變異體。已報導各種引入此多樣性之方法。可使用易出錯 PCR(HawkinS等人 ’（1992) J. Mol. Biol.，226: 889)、化學犬誘發（Deng等人，（1994) J. Biol· Chem.，269: 9533)或細菌犬.菱菌株（L〇w等人，（1996) J. Mol. Biol.，260: 359)將隨機突變弓丨入編碼分子之基因中。突變所選位置之方法在此項技術中亦為熟知的且包括在使用或不使用PCR下，使用錯配寡核苷酸或簡併募核苷酸。舉例而言，已以抗原結合環突變為目標來產生若干合成抗體文庫。已隨機化人類破傷風類毒素結合Fab之H3區來產生多種新結合特異性 (Ba]:bas荨人 ’（1992) Proc. Natl. Acad. Sci· USA, 89: 148187.doc -67- 201106971 4457)。已將隨機或半隨機H3及L3區附接至生殖系V基因區段以產生具有未突變構架區之大文庫（Hoogenboom及

Winter, (1992) >/· Α/ο/. 5ζ·ο/.，227: 381 ; Barbas等人， (1992) Proc. #如/· dcaA 89: 4457 ; Nissim 等人，（1994)五M50 乂，13: 692 ; Griffiths 等人，（1994) EMBO J., 13: 3245 ； De Kruif#A ^ (1995) J. Mol. Biol, 248: 97)。此多樣化已延伸包括一些或所有其他抗原結合環（Crameri 等人 ’（1996) Med., 2: 100 ; Riechmann 等人，（1995)价〇/7^/mo/c^y，13: 475 ; Morphosys， WO 97/08320，同上文）。因為環隨機化具有產生約超過1〇15個單獨H3結構及同樣多的針對其他五個環之變異體的潛力’故無法使用當前轉型技術或甚至藉由使用無細胞系統來產生表示所有可能組合之文庫。舉例而言，在迄今所建構之最大文庫之一中，產生6 X 1 0種不同抗體，其僅為此設計之文庫之潛在多樣性的一部分（Griffiths等人，（1994)，同上文）。在一貫施例中’僅使直接涉及產生或修飾所要分子功能之殘基多樣化。對許多分子而言，其功能將為結合標靶且因此多樣性應集中在標靶結合位點，同時避免改變對分子之總體組裝或維持所選主鏈構形具有重要性的殘基。在一態樣中，使用dAb文庫’其中僅抗原結合位點中之殘基發生改變。此等殘基在人類抗體譜系中極具多樣性且已知在高分辨性抗體/抗原複合物中達成接觸。舉例而吕，在L2中，已知位置5〇及53在天然存在抗體中具有多樣 148187.doc •68- 201106971 性且觀測到與抗原接觸。與此相反，習知方法將使如 Kabat等人（1991，同上文）所定義之相應互補決定區 (CDR1)中的所有殘基多樣化，相較於該兩個殘基，文庫中大約有七個殘基多樣化。此表示在產生多種抗原結合特異性所需之功能多樣性方面存在顯著改良。在自然界中’抗體多樣性為兩個過程之結果：生殖系 V、D及J基因區段之體細胞重組，產生天然初級譜系（所謂的生殖系及接合多樣性及所得重排V基因之體細胞超突 ^對人類抗體序列之分析已顯示，初級譜系中之多樣性集P在k原結合位點的中心，而體細胞超突變將多樣性散佈至抗原結合位點周邊之區域，該等區域在初級譜系中高度保守（參見Tomlinson等人，（1996) j M〇1則〇丨，256: 8 1 3)。此互補性可能已發展為搜尋序列空間之有效策略且儘&表面上為抗體所特有，但其可輕易地應用於其他多肽 ^系。發生改變之殘基為形成標乾之結合位點之殘基的子群。必要時，標靶結合位點中之殘基的不同（包括重疊）子群會在選拔期間之不同階段多樣化。在抗體譜系情形下，產生初始『天然』譜系，其中抗原結合位點中之一些（但非所有）殘基多樣化。如本文在此情形下所用’術t吾「天然」或「假」係指抗體分子無預定標靶。此等分子類似由未曾經過免疫多樣化之個體之免疫球蛋白基因所編碼的分子，胎兒及新生兒個體亦如同此等個體y、免疫系統尚未由多種抗原刺激激發。接著針對多種抗原或抗原決定基選拔此譜系。需要時，可接著在初始譜 148187.doc -69· 201106971 系中之多樣化區域外部弓丨人進—步多樣，卜可針對經修飾之功能、特異性或親和力選拔此成熟譜系。應瞭解，本文所述之序列包括與本文所述之序列實質上一致的序列，例如至少9〇% 一致，例如至少9丨％，或至少 92%，或至少93%，或至少94%，或至少95%，或至少 96%，或至少97%或至少98% ,或至少99%—致之序列。對核酸而言，術語「實質一致性」指示兩個核酸或其指定序列，當以適當核苷酸插入或缺失進行最佳比對及比較時，至少約80°/。核苷酸，通常至少約9〇%至95%，或至少約98 /〇至99.5%核苷酸一致。或者，當區段將在選擇性雜交條件下雜交至股之互補序列時，存在實質一致性。對核苷酸及胺基酸序列而言，術語「一致」指示當兩個核酸或胺基酸序列以適當插入或缺失進行最佳比對及比較時，其間存在的一致性程度。或者，當DNA區段將在選擇性雜交條件下雜交至股之互補序列時，存在實質一致性。兩個序列之間的一致性百分比為該等序列所共有之相同位置數的函數（亦即一致性。/。=相同位置數/總位置數 χΐ 〇〇) ’此情形考慮到為達成兩個序列之最佳比對所需引入之間隙數及各間隙之長度。如下文非限制性實例中所述’可使用數學演算法進行序列比較及確定兩個序列之間的一致性百分比。可使用GCG套裝軟體中之GAP程式確定兩個核苷酸序列之間的一致性百分比，該GAP程式使用NWSgapdna.CMP矩陣及間隙權重4〇、50、60、70或80及長度權重1、2、3、 148187.doc • 70· 201106971 4、5或6。亦可使用已併入ALIGN程式（2.0版）中之E. Meyers 及 W. Miller 之演算法（Comput. Appl. Biosci·, 4:11-17 (1988))確定兩個核苷酸或胺基酸序列之間的一致性百分比，該ALIGN程式使用PAM120權重殘差表（weight residue table)、間隙長度罰分（gap iength penalty) 12及間隙罰分（gap penalty)4。此外，可使用已併入GCG套裝軟體之 GAP 程式中的 Needleman 及 Wunsch(J_ Mol. Biol. 48:444-453 (1970))演算法確定兩個胺基酸序列之間的一致性百分比，該GAP程式使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，及間隙權重（gap weight)16、14、12、10、8、6或4及長度權重 (length weight)l、2、3、4、5 或 6。舉例而言，本發明之多肽序列可與由SEq ID NO: 38編碼之參考序列一致，亦即1 〇〇% 一致，或其相較於該參考序列可包括多達某整數個胺基酸變化，以致一致性％小於 100°/。。此等變化係選自由以下組成之群：至少一個胺基酸缺失、取代（包括保守及非保守取代）或插入，且其中該等變化可存在於參考多肽序列之胺基或羧基端位置處或介於彼等端位置之間的任何位置處，個別地穿插於參考序列之胺基酸中或以一或多個鄰接組形式穿插於參考序列内。對於既定一致性％而言，藉由以各別一致性百分比（除以 100)之數值百分比乘由SEQ ID NO·· 38編碼之多肽序列中的胺基酸總數且接著自由SEQ ID NO: 38編碼之多肽序列中之胺基酸的該總數減去彼乘積來確定胺基酸變化之數目，或： I48l87.doc •71 · 201106971 na<xa-(xa*y) » 其中na為胺基酸變化之數目，xa為由SEQ ID NO: 38編碼之多肽序列中之胺基酸總數，且y例如對於70°/。為0.70 ’對於80%為0.80，對於85°/。為0.85等，且其中xa與y之任何非整數乘積在自xa減去之前向下捨入至最接近之整數。實例實例1-HGF/VEGF抗原結合蛋白之設計及建構建構編碼抗HGF單株抗體之可變區的密碼子優化之DNA 序列且選殖至表現載體中。使用基於PCR之策略及重疊募核苷酸來重新建構可變區序列。PCR引子經設計以合併信號序列（SEQ ID NO: 33)且包括為選殖至哺乳動物表現載體中所需之限制性位點。Hind III及Spel位點經設計以對VH 結構域加框且允許選殖至含有單獨人類γΐ C區或經由 TVAAPSGS連接子在C端融合至 VEGF dAb(SEQ ID NO: 25) 之人類γΐ C區的哺乳動物表現載體中。Hind III及BsiWI位點經設計以對VL結構域加框且允許選殖至含有單獨人類κ C區或經由TVAAPSGS連接子在C端融合至VEGF dAb(SEQ ID NO: 25)之人類kC區的哺乳動物表現載體中。下表1為已建構之抗HGF mAb及抗HGF-VEGF雙特異性抗原結合蛋白之概述。 148187.doc •72- 201106971 表1 抗體ID 替代名稱描述核苷酸序列，SEQ ID NO ：胺基酸序列，SEQ ID NO ： BPC2013 2.12.1 抗 HGF 2.12.1 hlgGlFcWT 重鏈 1 2 抗HGF 2.12.1人類κ輕鏈 3 4 BPC2014 HE2B8-4 抗 HGF LRMR2B8 hlgGlFcWT 重鏈 5 6 抗 HGF LRMR2B8 人類 κ 輕鏈 7 8 BPC2015 HuL2G7 抗HGF HuL2G7 hlgGlFcWT 重鏈 9 10 抗HGF HuL2G7人類κ輕鏈 11 12 BPC2021 抗 HGF-VEGF-2.12.1-H-TVAAPSGS-593 抗 HGF-VEGF-2_12.1-H-TVAAPS-593 重鏈 13 14 抗HGF 2.12.1人類κ輕鏈 3 4 BPC2022 抗 HGF-VEGF- 2.12.1-L- TVAAPSGS-593 抗 HGF-VEGF-2_12_l-L-TVAAPS-593輕鏈 15 16 抗HGF 2.12.1 hlgGlFcWT 重鏈 1 2 BPC2023 抗 HGF-VEGF- HE2B8-4-H- TVAAPSGS-593 抗HGF-VEGF- LRMR2B8-H-TVAAPS-593 重鏈 17 18 抗HGF LRMR2B8 人類κ 輕鏈 7 8 BPC2024 抗 HGF-VEGF- HE2B8-4-L- TVAAPSGS-593 抗 hgf-vegf-lrmrzbs-l-tvaaps-sqs 輕鏈 19 20 抗HGF LRMR2B8 hlgGlFcWT 重鏈 5 6 BPC2025 抗 HGF-VEGF- HuL2G7-H- TVAAPSGS-593 抗 HGF-VEGF-HuL2G7-H-TVAAPS-593 重鏈 21 22 抗HGF HuL2G7人類κ輕鏈 11 12 BPC2026 抗 HGF-VEGF- HuL2G7-L- TVAAPSGS-593 抗 HGF-VEGF-HuL2G7-L-TVAAPS-593 輕鏈 23 24 抗HGF HuL2G7 hlgGlFcWT 重鏈 9 10 148187.doc _73· 201106971 使用 293fectin(Invitrogen，12347019)將編碼 BPC2013、 BPC2014 、 BPC2015 、 BPC2021 、 BPC2022 、 BPC2023 、 BPC2024、BPC2025及BPC2026之重鏈及輕鏈的表現質體短暫共轉染至HEK 293-6E細胞中。24小時後添加胰化蛋白饋入物至細胞培養物中且在另外72-120小時後收集細胞。在一些情況下，上清液材料用作結合分析中之測試物品。在其他情況下，在結合分析中測試之前使用蛋白質A管柱純化雙特異性抗原結合蛋白。

實例2-人類HGF結合ELISA 用100 ng/mL重組人類HGF(R&D Systems)以5 0微升/孔塗佈96孔高結合培養盤且在+4芄下培育隔夜。所有後續步驟皆在室溫下進行。用含有0.05%吐溫-20之Tris緩衝生理食鹽水洗滌培養盤3次。添加80 μΐ^阻斷溶液（1% BS A於含有 0.05%吐溫-20之Tris緩衝生理食鹽水中）至各孔中且在室溫下培育培養盤至少1小時。接著進行另一洗蘇步驟。用阻斷溶液在培養盤上連續稀釋上清液或經純化抗體。培育1 小時後，洗滌培養盤。用阻斷溶液稀釋山羊抗人類κ輕鏈特異性過氧化酶結合抗體（Sigma A7164)至0.75 pg/mL且添加50 μί至各孔中。將培養盤培育1小時。在另一洗滌步驟之後，添加50 μΐ OPD(間苯二胺二鹽酸鹽）SigmaFast受質溶液至各孔中且藉由添加25 pL之3 Μ硫酸終止反應。使用驗性終點方案，使用VersaMax微定量盤式讀取器 (Molecular Devices)在 490 nm下讀取吸光度。圖1展示用經純化mAbdab進行之ELISA之結果且證實所 148187.doc •74· 201106971 有抗原結合蛋白及陽性對照抗體BPC2013-2015及 BPC202 1-2026皆顯示結合至重組人類HGF。陰性對照抗體顯示未結合至HGF。

實例3-人類VEGF結合ELISA 用0·4 gg/mL人類VEGF以50微升/孔塗佈96孔高結合培養盤且在+4°C下培育隔夜。所有後續步驟皆在室溫下進行。用含有0.05%吐溫-20之Tris緩衝生理食鹽水洗滌培養盤3 次。添加80 pL阻斷溶液（1 % BSA於含有0.05°/。吐溫-20之 Tris緩衝生理食鹽水中）至各孔中且在室溫下培育培養盤至少1小時。接著進行另一洗滌步驟。用阻斷溶液在培養盤上連續稀釋上清液或經純化抗體。培育1小時後，洗滌培養盤。用阻斷溶液稀釋山羊抗人類κ輕鏈特異性過氧化酶結合抗體至0.75 pg/mL且添加50 pL至各孔中。將培養盤培育1小時。在另一洗滌步驟之後，添加50 μΐ OPD(間苯二胺二鹽酸鹽）SigmaFast受質溶液至各孔中且藉由添加25 μ!>之 3 Μ硫酸終止反應。使用鹼性終點方案，使用VersaMax微定量盤式讀取器（Molecular Devices)在490 nm下讀取吸光度。圖2展示ELISA結果且證實抗原結合蛋白及陽性對照抗體BPC2021-2026顯示結合至人類VEGF。陰性同型匹配對照抗體（GRITS268 1 6)顯示未結合至VEGF。實例4-結合至人類VEGF之動力學在C 1晶片上使用捕捉表面進行Biacore分析。蛋白質A用作捕捉劑且經由一級胺偶合而偶合至C 1生物感測器晶片。 148187.doc •75· 201106971 在固定表面上捕捉抗體且使確定濃度（256、64、16、4、 1、0.25 nM)之人類VEGF通過此捕捉表面。捕捉抗體表面上之緩衝液注入用於雙重參照。在各VEGF注入之後，使用100 mM氫氧化鈉再生捕捉表面；再生會移除捕捉抗體但不顯著影響表面在後一循環中捕捉抗體的能力。所有操作皆在25°C下使用HBS-EP緩衝液進行。使用Biacore T100(GE Healthcare)產生數據且針對軟體固有之1:1結合模型進行擬合。雙特異性抗原結合蛋白BPC202 1-2026顯示以高親和力結合至人類VEGF，而陰性對照HGF抗體 (3?02013-2015)顯示未結合至人類¥£0尸。表2-結合至人類VEGF之動力學

Ka(M-l.s-l) Kd(s-l) KD(pM) BPC2013 未見結合 BPC2014 未見結合 BPC2015 未見結合 BPC2021 3.74E+5 2.85E-5 76 BPC2022 5.74E+5 1.33E-4 232 BPC2023 4.15E+5 6.43E-5 155 BPC2024 4.88E+5 6.75E-5 138 BPC2025 3.89E+5 5.74E-5 148 BPC2026 4.86E+5 5.44E-5 112 實例5-結合至人類HGF之動力學使用藉由一級胺偶合固定在CM5晶片上之人類HGF(自製）進行Biacore分析。使抗體以確定濃度（500、125、 31.3、7·8、1.95、0.46 nM)通過固定表面。人類HGF固定 148187.doc -76- 201106971 表面上之緩衝液注入用於雙重參照。在各抗體注入之後，使用100 mM磷酸再生固定表面；再生會移除結合抗體但不顯著影響表面在後一循環中結合抗體的能力。所有操作皆在25°C下使用HBS-EP缓衝液進行。使用Biacore T100(GE Healthcare)產生數據且針對軟體固有之1:1結合模型及二價分析物模型進行擬合。雙特異性抗體樣本 BPC202 1-2026及親本HGF抗體BPC20 13-20 15皆顯示以高親和力結合至人類HGF。表3-結合至人類HGF之動力學 1:1結合模型二價模型 Ka(M-l.s-l) Kd(s-l) KD(nM) Ka(M-l.s-l) Kd(s-l) KD(nM) BPC2013 1.399E+5 1.225E-4 0.88 2.42E+05 2.02E-04 0.83 BPC2014 7.138E+4 1.100E-4 1.54 1.26E+05 2.04E-04 1.62 BPC2015 1.857E+5 8.194E-5 0.44 2.28E+05 1.32E-04 0.58 BPC2021 2.028E+5 1.569E-4 0.77 4.38E+05 2.73E-04 0.62 BPC2022 1.066E+5 1.496E-4 1.40 1.83E+05 2.64E-04 1.44 BPC2023 1.063E+5 1.645E-4 1.55 7.62E+04 2.40E-04 3.15 BPC2024 8.232E+4 1.455E-4 1.77 9.17E+04 2.37E-04 2.58 BPC2025 3.688E+5 1.258E-4 0.34 7.01E+05 1.98E-04 0.28 BPC2CI26 2.780E+5 1.035E-4 0.37 3.63E+05 1.58E-04 0.44 實例6-HGF/VEGF抗原結合蛋白對Bx-PC3腫瘤細胞中之 MET磷酸化（pMET)之影響將Bx-PC3細胞以100,000個細胞/毫升接種於Costar 96孑L 培養盤中（10000個細胞/100微升/孔）補充有麩醯胺酸及10% 148187.doc -77- 201106971 FCS之RPMI中且在37°C/50/〇 C02下培育16小時。用100 μΐ PBS洗務細胞且添加100 μΐ無血清RPMI培養基’在 37°C/5% C02下再培育另外16小時。將測.試樣本 BPC2015、BPC2023-BPC2026 或對照（BPC1007 及 BPC1023) 以高達30 pg/ml之各種濃度一式兩份添加至細胞中。15分鐘後，在37°C/5% C02下添加HGF(自製）至最終濃度為200 ng/ml 〇最後，移除培養基，用100 μΐ冰冷PBS洗蘇細胞且用冷溶解緩衝液（由 Cell Signalling Path-Scan Phospho-Met sandwich ELISA套組 7333供應）溶解。使用 Cell Signalling pMET ELISA，根據製造商方案（Cell Signalling Path-Scan Phospho-Met Sandwich ELIS A套組 73 3 3)分析 MET填酸化。圖3A及3B表示兩個實驗，展示各種抗HGF/VEGF mAb-dAb(BPC2023-2026)及抗 HGF mAb(BPC201 5)對 Bx-PC3 細胞中HGF刺激之MET磷酸化（pMET)的影響。結果證實抗 HGF mAb(BPC2015)抑制HGF介導之受體磷酸化，抗 HGF/VEGF mAb-dAb(BPC2023-2026)亦如此。陰性對照樣本BPC1007及BPCl〇23顯示不抑制HGF介導之受體鱗酸化0 隨後，用相同HGF mAb及抗HGF/VEGF mAb-dAb執行此分析。分析條件與先前分析一致。抗HGF mAb及抗HGF/抗VEGF mAbdAb均抑制HGF介導之MET峨酸化。陰性對照對MET填酸化無抑制效應。ic5〇表示抗體對MET磷酸化之影響。三個獨立實驗之平均IC50 展示於表4中。 148187.doc • 78· 201106971 表4 分子 IC50 BPC2013 3.6 BPC2021 6.3 BPC2022 5.4 BPC2014 4.5 BPC2023 6.9 BPC2024 13.3 BPC2015 4.2 BPC2025 3.9 BPC2026 5.7 隨後用 HGF mAb(BPC2015)抗無關物/VEGF mAb-dAb及抗 HGF/VEGF mAb-dAb(BPC2025)執行此分析（自 667 nM 以 4倍稀釋度滴定至0.01 ηΜ)。分析條件與先前分析一致，但細胞與此等測試mAb/mAbdAb —起培育僅1小時，使用 40 ng/ml之 HGF且藉由 MesoScale Discovery 平台（MSD)量測細胞信號傳導。抗HGF mAb及抗HGF/抗VEGF mAbdAb均以劑量依賴方式抑制HGF介導之MET磷酸化。對照mAb及無關mAb-VEGF dAb對MET磷酸化無抑制效應。IC50表示抗體對磷酸MET%-((pMET原始MSD單位/總原始MET單位）χ100)之影響。兩個獨立實驗之平均IC50對於HGF mAb(BPC2015) 為 0.40 ηΜ，且對於 mAbdAb(BPC2025)為 0.34 ηΜ。實例7 抗原結合蛋白之化學計量評估（使用BiacoreTM) 此實例為預示性的。其為進行另一可測試本發明之抗原 148187.doc -79- 201106971 結合蛋白的分析提供指導。藉由一級胺偶合將抗人類IgG固定在CM5生物感測器晶片上。在此表面上捕捉抗原結合蛋白，此後使單一濃度之 HGF或VEGF通過，此濃度足夠飽和結合表面且所觀測到之結合信號達到完全R-max。接著使用既定公式計算化學計量：化學計量=Rmax><Mw(配位體）/Mw(分析物）xR(固定或捕捉之配位體）當計算一種以上分析物同時結合之化學計量時，使不同抗原以飽和抗原濃度依序通過且如上計算化學計量。該研究可在25°C下使用HBS-EP操作緩衝液在Biacore 3 000上進行。實例8

MvlLu增殖分析 TGF-β會抑制Mv 1 Lu細胞增殖。藉由添加HGF克服此抑制。因此，此分析評估HGF中和抗體抑制HGF介導之細胞增殖的能力。CellTiterGloTM分析會產生生物發光信號，其為ATP依賴型且因此與總細胞數目成正比。「+TGF-β+HGF」與「+TGF-p-HGF」之間的差異反映HGF介導之細胞增殖（J. Immunol Methods 1996, 1 月 16 日，第 1 89卷，第 1期；59-64)。在補充有 40 ng/ml 人類 HGF 及 1 ng/ml TGF-P(R&D Systems)之無血清培養基中培育Mvl Lu細胞（ATCC)。適當時自對照孔中省略HGF。所有操作皆在TGFP存在下進行。 148187.doc -80- 201106971 所有操作皆在HGF存在下進行，但表示為『HGF -』之陰性對照操作除外。以 2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.06 或 0.03 pg/ml 之最終濃度添加抗體或mAbdAb構築體。48小時後，使用生物發光信號與活細胞數目成正比之發光ATP依賴型分析 (CellTiterGlo，Promega)來測定總細胞數目。所有條件皆一式三份進行測試。圖4中所展示之數據呈現為平均值+/- SD且表示兩個獨立實驗。抗HGF單株抗體（BPC2015)以劑量依賴方式消除HGF介導之Mvl Lu細胞增殖。為了證實mAbdAb形式中保留此 HGF中和能力，使用包含抗HGF單株抗體部分及抗VEGF dAb部分（BPC2025)之mAbdAb構築體進行直接比較。用 mAbdAb構築體處理會導致HGF介導之MvlLu細胞增殖的劑量依賴型消除，其與mAb反應概況無法區分（圖4a)。為了證實所觀測效應歸因於HGF之特異性中和，以相同劑量滴定法進行平行實驗，比較BPC2025與另一包含靶向分析無關蛋白質之單株抗體部分及抗VEGF dAb之mAbdAb 構築體。未觀測到抗無關物/VEGF mAbdAb之效應（圖 4b)。數據顯示抗HGF mAb以劑量依賴方式消除HGF依賴型細胞增殖且當呈mAbdAb形式時保留此活性。實例9

BxPC3侵襲分析 148187.doc -81 - 201106971 使用Oris細胞侵襲系統評估細胞侵襲且如製造商 (Platypus)所指導來進行。簡言之，將每孔130,000個 BxPC3細胞（ATCC)在孔塞存在下接種於塗佈有細胞夕卜基質之96孔培養盤中以產生環狀非細胞區域。細胞附著之後，移除塞子且用細胞外基質洗滌且覆蓋各孔以提供3維細胞環境。培育培養盤以允許基質聚合且用補充有1 〇%熱失活胎牛血清、麩醯胺酸及青黴素/鏈黴素之含有20 ng/ml人類 HGF的生長培養基（RPMI(Invitrogen))覆蓋各孔。適當時自對照孔中省略HGF。以20、10、5或2.5 pg/ml之濃度範圍添加抗體或mAbdAb構築體。培育培養盤72小時，接著進行影像分析以定量剩餘非細胞區域之像素面積。所有條件皆至少一式三份進行測試。獲得所有孔之影像且進行影像分析以對侵襲進行定性及定量評估。培育72小時後剩餘非細胞區域之定性比較證實 BxPC3細胞的HGF依賴型侵襲性反應，其表現為由細胞外基質降解及細胞侵襲所導致之非細胞面積及不均勻多細胞投影的明顯減少。圖5中所示之定量分析證實相較於未經 HGF處理之孔，經HGF處理之孔中的非細胞面積減少。圖 5展示剩餘無細胞面積之平均值+/· SD且表示兩個獨立實驗。如相較於用同型對照單株抗體處理之孔，非細胞區域之尺寸保留所示，抗HGF mAb(BPC2015)及mAbdAb (BPC2025)在此分析中在每一測試濃度下皆消除HGF介導之BxPC3侵襲。實例10 148187.doc -82- 201106971 血管生成分析

Angi〇kitTM為市售内皮細胞與纖維母細胞之共培養分析且可用於測試推定抗血管生成劑活體外抑制一或多種與内皮網路形成相關之參數的能力。此等參數使用影像分析定量且包括例如總内皮細胞面積（區域面積）、血管分支點數目、平均細管長度等。如製造商（TCS CeHW0rks)所指|進行灰管生成共培養分析（Ang1〇kitTM)。簡言之，自μ孔形式心以〇以頂共培養盤中吸出培養基且用補充有或未補充2〇 ng/m丨人類hgf之完王生長i。養基替換。添加測試化合物以獲得各構築體之可相當的最終莫耳濃“17 μ.在第㈠及9天替換培養基及測·•式化s物。在第π天固定細胞且如製造商所指導藉由抗CD31免疫細胞化學檢驗内皮細胞網路。由光學顯微鏡法記錄影像且使用AngiGSys軟體（TCS進行影像分析。 HGF拮抗作用對各種血管生成過程之影響（Bpc2〇i5)或使用同型對照單株抗體（mAb陰性對照）。接著與抗膽/抗 VEGF mAbdAb(BPC2025)—起在同—分析中操作 HGF mAb (BPC2015)。圖6a&b中所示之數據呈現為四個平行測定孔之平均值 SD且表示兩個獨立貫驗，且展示區域面積及平均細管長度定丨生刀析揭不藉由用抗HGF mAb或抗抗 rnAbdAb處理曰所介導之膽中和導致明顯抑制时網路形成此由疋里刀析所證實，該定量分析證實抗⑺从或 148187.doc -83· 201106971 抗HGF/抗VEGF mAbdAb相較於同型對照處理對包括總區域面積及總細管長度之血管生成參數的抑制效應。實例11 抗 HGF mAb 及抗 HGF/VEGF mAbdAb 對 BX-PC3細胞中之 AKT磷酸化之抑制效應的比較經由c-MET受體之磷酸化進行之信號轉導係藉由結合其配位體HGF而起始。關於MET磷酸化，藉由各種接附蛋白質之募集及活化達成兩條主要的細胞信號傳導路徑之活化。此導致細胞增殖（MAPK/MEK/ERK路徑）及存活（PI3激酶/AKT路徑）之活化。將Bx-PC3胰腺細胞以10,000個細胞/孔塗於無菌96孔細胞培養盤中之RPMI完全培養基中且在37°C/5°/。C02下留置隔夜。接著在RPMI無血清培養基中培育細胞24小時，隨後添加對照mAb、抗HGF mAb、抗無關物/VEGF mAb-dAb 或抗 HGF/VEGF mAb-dAb(BPC2025)(自 667 nM 以 4倍稀釋度滴定至0.01 nM)與40 ng/ml「自製」HGF—起培育1小時。如製造商之說明書中，用MSD溶解緩衝液溶解細胞。冷凍溶胞物且如製造商之說明書中所述使用MSD ρΑΚΤ/總 ΑΚΤ分析（目錄號K11100D-2)評估磷酸化ΑΚΤ之含量。抗HGF mAb及抗HGF/抗VEGF mAbdAb均以劑量依賴方式抑制HGF介導之AKT礎酸化。對照mAb及無關mAb-VEGF dAb對AKT磷酸化無抑制效應。IC50表示抗體對磷酸 AKT%-((p AKT原始 MesoScale Discovery平台（MSD)單位 / 總原始AKT單位）χ100)之影響。 148187.doc -84· 201106971 兩個獨立實驗之平均IC50對於HGF mAb(BPC2015)為 0_63 nM，且對於mAbdAb(BPC2025)為 0.88 nM ° 實例12 抗 HGF mAb 及抗 HGF/VEGF mAbdAb 對 Bx-PC3細胞中之 ERK填酸化之抑制效應的比較使用如實例11中所述之相同方法進行此分析，但細胞與 HG-F及測試mAb/mAbdAb構築體一起培育3小時。如製造商之說明書中所述，使用MSD pERK/總ERK分析 (目錄號Kill 07D-2)評估磷酸化ERK(MAPK/MEK路徑之下游成員）之含量。抗HGF mAb及抗HGF/抗VEGF mAbdAb均以劑量依賴方式抑制HGF介導之ERK磷酸化。對照mAb及無關mAb-VEGF dAb對ERK磷酸化無抑制效應。IC50表示抗體對磷酸 ERK0/〇-((pERK 原始 MesoScale Discovery 平台（MSD)單位）xl00)之影響。兩個獨立實驗之平均IC50對於HGF mAb(BPC2015)為 0.98 nM，且對於 mAbdAb(BPC2025)為 0.92 nM。實例13 抗 HGF mAb 及抗 HGF/VEGF mAb-dAb 對 Bx-PC3細胞中之細胞遷移之抑制效應的比較

AmsbioTM供應〇ris細胞遷移分析，其由各孔中皆具有預插入的聚矽氧接種塞之無菌96孔組織培養盤組成。添加細胞且使其生長至匯合。移除塞子，留下環狀無細胞區域。接著，在添加遷移抑制劑或促進劑之後隨時間監測遷移至 148187.doc -85- 201106971 此區域中之細胞。將Bx-PC3胰腺細胞以100,000個細胞/孔塗於Oris細胞遷移96孔培養盤中之RPMI完全培養基中且培育72小時直至匯合。移除細胞塞以產生無細胞區域。接著使細胞在 RPMI無血清培養基中與對照mAb、抗HGF mAb、抗無關物/VEGF mAb 或抗 HGF/VEGF mAb-dAb(BPC2025)(自 667 nM以4倍稀釋度滴定至0.01 nM)及25 ng/ml HGF—起培育 •24 小時。接著用 CellTracker(Invitrogen CellTracker™ Green CMFDA #C2925)在Envision盤式讀取器上定量遷移至無細胞區域中之細胞。三個獨立實驗之平均IC50對於HGF mAb(BPC2015)為 0·33 nM，且對於 mAbdAb(BPC2025)為 0.32 nM，指示 mAbdAb形式不影響HGF結合部分之活性。實例14-VEGF受體結合分析此實例為預示性的。其為進行另一可測試本發明之抗原結合蛋白的分析提供指導。此實例為預示性的。其為進行另一可測試本發明之抗原結合蛋白的分析提供指導。此分析量測内皮細胞中VEGF 受體VEGFR2之VEGF介導的磷酸化及VEGF結合蛋白抑制此過程之能力。初級内皮細胞（例如人類臍帶内皮細胞， Lonza)以單層形式接種於塗佈有明膠之培養盤上且在完全生長培養基（EGM-2 Bulletkit，Lonza)中培育隔夜。使細胞血清饑餓約4小時，接著用VEGF丨65(例如R&D Systems，目錄號：293-VE-050)或與推定VEGF結合蛋白一起預培育之 148187.doc -86- 201106971 VEGF165處理。20分鐘後產生細胞溶胞物且根據製造商之說明書使用適當方法（例如Mesoscale Discovery目錄號： K111DJD-2)定量磷酸化 VEGFR2。序列描述(胺基酸序列） SEQ ID NO ：胺基酸 DNA 抗 HGF mAb 2.12.1 重鏈 hlgGl 2 1 抗HGF mAb 2.12.1輕鏈1<: 4 3 抗HGF mAb LRMR2B8 重鏈hlgGl 6 5 抗HGF mAb LRMR2B8輕鏈κ 8 7 抗HGF mAb HuL2G7重鏈hlgGl 10 9 抗HGF mAb HuL2G7輕鏈κ 12 11 抗 HGF-VEGF-2.12.1 -H-TVAAPSGS-593 重鏈 14 13 抗 HGF-VEGF-2.12· 1 -L-TVAAPSGS-593 輕鏈 16 15 抗 HGF-VEGF-LRMR2B8-TVAAPSGS-593 重鏈 18 17 抗 HGF-VEGF-LRMR2B8-TVAAPSGS-593 輕鏈 20 19 抗 HGF-VEGF-HuL2G7-H-TVAAPSGS-593 重鏈 22 21 抗 HGF-VEGF-HuL2G7-L-TVAAPSGS-593 輕鏈 24 23 抗VE:GF dAb D0M15-26-593 25 抗VEGF抗運載蛋白 26 連接子 27 連接子 28 連接子 29 連接子 30 連接子 31 連接子 32 信號肽序列 33 抗VEGF抗體重鏈 34 148187.doc -87- 201106971 抗VEGF抗體輕鏈 35 抗VEGFR2黏結素 36 人類化抗HGF奈米體HGF13 37 人類化抗HGF奈米體HGF13hum5 38 替代抗VEGF抗體重鏈 39 GS(TVAAPSGS)i 40 GS(TVAAPSGS)2 41 GS(TVAAPSGS)3 42 gs(tvaapsgs)4 43 gs(tvaapsgs)5 44 GS(TVAAPSGS)6 45 (PAS)iGS 46 (PAS)2GS 47 (PAS)3GS 48 (G4S)2 49 (G4S)3 50 (PAVPPP)!GS 51 (PAVPPP)2GS 52 (PAVPPP)3GS 53 (TYSDVP)iGS 54 (TVSDVP)2GS 55 (TVSDVP)3GS 56 (TGLDSP)iGS 57 (TGLDSP)2GS 58 (TGLDSP)3GS 59 PAS連接子 60 PAVPPP連接子 61 TVSDVP連接子 62 TGLDSP連接子 63 (TVAAPS)2(GS)i 64 (TVAAPS)3(GS)i 65 148187.doc -88 - 201106971 SEQ ID NO: 1(抗HGF mAb 2.12.1 重鏈hlgGl)

CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAACCCTCCGAGACCCTGAGCCTGAC

CTGCACCGTGAGCGGCGGCAGCATCAGCATCTACTACTGGAGCTGGATCAGGCAGCCCCCAG

GMAGGGCCTCGAGTGGATCGGCTACGTGTACTACAGCGGCAGCACCAACTACAACCCCAGC

CTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAA

CTCTGTCACCGCCGCCGATACCGCCGTGTATTACTGCGCCAGGGGCGGCTACGACTTTTGGA

GCGGCTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAG

GGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCT

GGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCC

TGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGC

AGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCA

CAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACA

CCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCC

AAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGT

GAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATG

CCA^GACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACC

GTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCT

GCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGT

ACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTG

AAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAA

CTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGA

CCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCC

CTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCT^AG SEQ ID NO: 2(抗HGF mAb 2·12·1 重鏈hlgGl)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISIYYWSWIRQPPGKGLEWIGYVYYSGSTNYNPS LKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARGGYDFWSGYFDYWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SWTVPSSSLGTQTY工CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 3(抗HGF mAb 2.12.1 輕鏈k)

GAGATCGTGATGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCGTGTCCCCCGGCGAGAGGGCCACCCT

GAGCTGCAGGGCCTCTCAGAGCGTGGACAGCAACCTGGCCTGGTACAGGCAGAAGCCCGGAC

AGGCCCCAAGGCTGCTGATCTACGGCGCCAGCACCAGAGCAACCGGCATTCCCGCCAGGTTT

AGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGAGCGAGGACTT

CGCCGTCTACTACTGCCAGCAGTACATCAACTGGCCCCCCATCACCTTCGGCCAGGGCACCA

GGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAG

CAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGC

CAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCG

AGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGAC

TACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGAC

CAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC SEQ ID NO: 4(抗HGF mAb 2.12.1 輕鏈k) •89- 148187.doc 201106971

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVDSNLAWYRQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARF

SGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYINWPPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDE

QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD

YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 5(抗HGF mAb LRMR2B8重鏈hlgGl)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGCCCGGCGCAGAAGTCAAGAAGCCCGGCACTAGCGTGAAGCTGAG

CTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCG

GACAGGGACTGGAGTGGATTGGCGAGATCAACCCCACCAACGGCCACACCAACTACAACCAG

AAGTTCCAGGGCAGGGCCACACTGACCGTGGACAAGAGCACCTCCACCGCCTACATGGAACT

GAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTATTACTGCGCCAGGAACTACGTGGGCAGCA

TCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCC

AGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTG

CCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCA

GCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTG

GTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCC

CAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCC

CCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCT

AAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCA

CGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGA

CCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTG

CACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGC

CCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCC

TGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGC

TTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAA

GACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGG

ACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCAC

AATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG SEQ ID NO: 6(抗HGF mAb LRMR2B8重鏈hlgGl)

QVQLVQPGAEVKKPGTSVKLSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWIGEINPTNGHTNYNQ

KFQGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYVGSIFDYWGQGTLVTVSSASTKGP

SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV

VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP

KDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL

HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG

FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH

NHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 7(抗HGF mAb LRMR2B8輕鏈k)

GACATCGTGATGACTCAGAGCCCCGACAGCCTGGCTATGTCACTGGGCGAGAGGGTGACCCT

GAACTGCAAGGCCAGCGAGAACGTGGTGAGCTACGTGAGCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCC

AGAGCCCCAAACTCCTGATCTACGGCGCCTCCAACAGGGAGTCTGGCGTCCCCGACAGGTTC

AGCGGCAGCGGAAGCGCCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGGCCGAAGACGT

GGCCGATTACCACTGCGGCCAGAGCTACAACTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGC

TGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAG

CTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAA.CTTCTACCCCCGGGAGGCCAA

GGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGC

AGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTAC

GAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAA

GAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC •90- 148187.doc 201106971 SEQ ID NO: 8(抗HGF mAb LRMR2B8輕鏈κ)

DIVMTQSPDSLAMSLGERVTLNCKASENVVSYVSWYQQKPGQSPKLLIYGASNRESGVPDRF

SGSGSATDFTLTISSVQAEDVADYHCGQSYNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ

LKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY

EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 9(抗HGF mAb HuL2G7重鏈hlgGl)

GAGGTGCAGCTCGTCCAGAGCGGCGCAGAAGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAG

CTGCAAGGTGAGCGGCTACACCTTCTCCGGCAACTGGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCCCCCG

GGAAAGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGCAGCGGCAACACCAACTACAACGAG

AAGTTCAAGGGCAAGGCCACCATGACCGCCGACACCAGCACCGACACCGCCTACATGGAGCT

GAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTACTATTGCGCCAGGGGCGGCCACTACTACG

GCAGCTCTTGGGACTACTGGGGACAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAG

GGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCT

GGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCC

TGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGC

AGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCA

CAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGiyVGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACA

CCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCC

AAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGT

GAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATG

CCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACC

GTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCT

GCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGT

ACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTG

AAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAA

CTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGA

CCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCC

CTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG SEQ ID NO: 10(抗HGF mAb HuL2G7重鏈hlgGl)

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFSGNWIEWVRQAPGKGLEWIGEILPGSGNTNYNE

KFKGKATMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGHYYGSSWDYWGQGTLVTVSSASTK

GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS

SWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP

KPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT

VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV

KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA

LHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 11(抗HGF mAb HuL2G7輕鏈k) -91 - 148I87.doc 201106971

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTCACCAT

CACCTGCAAGGCCAGCGAGAACGTGGTGACCTACGTGAGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGGA

AGGCCCCCAAACTGCTGATCTACGGCGCCTCCAACCGATACACCGGCGTGCCCGACAGGTTC

AGCGGAAGCGGCAGCGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTT

CGCCACCTACTACTGCGGCCAGGGCTACAGCTACCCCTATACCTTCGGCCAGGGCACCAAGC

TCGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAG

CTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAA

GGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGC

AGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTAC

GAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAA

GAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC SEQ ID NO: 12(抗HGF mAb HuL2G7輕鏈k)

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASENVVTYVSWYQQKPGKAPKLLIYGASNRYTGVPDRF

SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQGYSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ

LKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY

EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 13(抗HGF-VEGF-2.12.1-H-TVAAPSGS-593重鏈)

CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAACCCTCCGAGACCCTGAGCCTGAC

CTGCACCGTGAGCGGCGGCAGCATCAGCATCTACTACTGGAGCTGGATCAGGCAGCCCCCAG

GAAAGGGCCTCGAGTGGATCGGCTACGTGTACTACAGCGGCAGCACCAACTACAACCCCAGC

CTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAA

CTCTGTCACCGCCGCCGATACCGCCGTGTATTACTGCGCCAGGGGCGGCTACGACTTTTGGA

GCGGCTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAG

GGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCT

GGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCC

TGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGC

AGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCA

CAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACA

CCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCC

AAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGT

GAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATG

CCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACC

GTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCT

GCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGT

ACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTG

AAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAA

CTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGA

CCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCC

CTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCC

CTCGGGATCCGAGGTGCAGCTCCTGGTCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCAC

TGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTCAGG

CAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTA

CTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGT

ACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCC

AGGAAGCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACTCTGGTGACCGTGAGCAGC -92· 148187.doc 201106971 SEQ ID NO: 14(抗HGF-VEGF-2.12.1-H_TVAAPSGS-593重鏈)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISIYYWSWIRQPPGKGLEWIGYVYYSGSTNYNPS

LKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARGGYDFWSGYFDYWGQGTLVTVSSASTK

GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS

SWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP

KPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT

VLHQDWLNGKEYKCKVSMKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV

KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA

LHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVR

QAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDP

RKLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 15(抗HGF-VEGF-2.12.1-L-TVAAPSGS-593輕鏈）

GAGATCGTGATGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCGTGTCCCCCGGCGAGAGGGCCACCCT

GAGCTGCAGGGCCTCTCAGAGCGTGGACAGCAACCTGGCCTGGTACAGGCAGAAGCCCGGAC

AGGCCCCAAGGCTGCTGATCTACGGCGCCAGCACCAGAGCAACCGGCATTCCCGCCAGGTTT

AGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGAGCGAGGACTT

CGCCGTCTACTACTGCCAGCAGTACATCAACTGGCCCCCCATCACCTTCGGCCAGGGCACCA

GGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAG

CAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGC

CAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCG

AGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGAC

TACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGAC

CAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGAGGTGCAGCTCC

TGGTCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGC

GGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGA

GTGGGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCA

GGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGG

GCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGGAAGCTGGACTATTGGGGCCA

GGGCACTCTGGTGACCGTGAGCAGC SEQ ID NO: 16(抗HGF VEGF-2.12.1-L TVAAPSGS-593輕鏈)

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVDSNLAWYRQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARF

SGSGSGTEETLTISSLQSEDFAVYYCQQYINWPPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDE

QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD

YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTVAAPSGSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAAS

GE'TFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR

AEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 17(抗HGF-VEGF-LRMR2B8-H-TVAAPSGS-593重鏈） -93- 148187.doc 201106971

CAGGTGCAGCTGGTGCAGCCCGGCGCAGAAGTCAAGAAGCCCGGCACTAGCGTGAAGCTGAG

CTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCG

GACAGGGACTGGAGTGGATTGGCGAGATCAACCCCACCAACGGCCACACCAACTACAACCAG

AAGTTCCAGGGCAGGGCCACACTGACCGTGGACAAGAGCACCTCCACCGCCTACATGGAACT

GAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTATTACTGCGCCAGGAACTACGTGGGCAGCA

TCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCC

AGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTG

CCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCA

GCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTG

GTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCC

CAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCC

CCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCT

AAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCA

CGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGA

CCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTG

CACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGC

CCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCC

TGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGC

TTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAA

GACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGG

ACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCAC

AATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGG

ATCCGAGGTGCAGCTCCTGGTCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGC

TGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTCAGGCAGGCC

CCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGC

CGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGC

AGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGGAAG

CTGGACTATTGGGGCCAGGGCACTCTGGTGACCGTGAGCAGC SEQ ID NO: 18(抗HGF-VEGF-LRMR2B8 H-TVAAPSGS-593重鏈）

QVQLVQPGAEVKKPGTSVKLSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWIGEINPTNGHTNYNQ

KFQGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYVGSIFDYWGQGTLVTVSSASTKGP

SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV

VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP

KDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVL

HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG

FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH

NHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQA

PGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRK

LDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 19(抗HGF-VEGF LRMR2B8-L-TVAAPSGS-593人類κ輕鏈) • 94- 148187.doc 201106971

GACATCGTGATGACTCAGAGCCCCGACAGCCTGGCTATGTCACTGGGCGAGAGGGTGACCCT

GAACTGCAAGGCCAGCGAGAACGTGGTGAGCTACGTGAGCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCC

AGAGCCCCAAACTCCTGATCTACGGCGCCTCCAACAGGGAGTCTGGCGTCCCCGACAGGTTC

AGCGGCAGCGGAAGCGCCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGGCCGAAGACGT

GGCCGATTACCACTGCGGCCAGAGCTACAACTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGC

TGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAG

CTG^GAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAA

GGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGC

AGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTAC

GAGi^AGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAA

GAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGAGGTGCAGCTCCTGG

TCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGC

TTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTG

GGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGT

TCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCC

GAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGGAAGCTGGACTATTGGGGCCAGGG

CACTCTGGTGACCGTGAGCAGC SEQ ID NO: 20(抗HGF-VEGF LRMR2B8-TVAAPSGS-593人類 κ輕鏈）

DIVMTQSPDSLAMSLGERVTLNCKASENVVSYVSWYQQKPGQSPKLLIYGASNRESGVPDRF

SGSGSATDFTLTISSVQAEDVADYHCGQSYNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ

LKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY

EKH^YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTVAAPSGSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASG

FTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRETISRDNSKNTLYLQMNSLRA

EDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 21(抗HGF VEGF-HuL2G7-H-TVAAPSGS-593 重鏈）

GAGGTGCAGCTCGTCCAGAGCGGCGCAGAAGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAG

CTGCAAGGTGAGCGGCTACACCTTCTCCGGCAACTGGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCCCCCG

GGAAAGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGCAGCGGCAACACCAACTACAACGAG

AAGTTCAAGGGCAAGGCCACCATGACCGCCGACACCAGCACCGACACCGCCTACATGGAGCT

GAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTACTATTGCGCCAGGGGCGGCCACTACTACG

GCAGCTCTTGGGACTACTGGGGACAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAG

GGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCT

GGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCC

TGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGC

AGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCA

CAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACA

CCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCC

AAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGT

GAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACT^TG

CCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACC

GTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCT •95- I48187.doc 201106971

GCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGT

ACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTG

AAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAA

CTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGA

CCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCC

CTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCC

CTCGGGATCCGAGGTGCAGCTCCTGGTCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCAC

TGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTCAGG

CAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTA

CTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGT

ACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCC

AGGAAGCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACTCTGGTGACCGTGAGCAGC SEQ ID NO: 22(抗HGF-VEGF-HuL2G7-H TVAAPSGS-593 重鏈）

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFSGNWIEWVRQAPGKGLEWIGEILPGSGNTNYNE KFKGKATMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGHYYGSSWDYWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGKTVAAPSGSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVR QAPGKGLEWVSE工SPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDP RKLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 23(抗HGF-VEGF-HuL2G7-L-TVAAPSGS-593輕鏈）

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTCACCAT

CACCTGCAAGGCCAGCGAGAACGTGGTGACCTACGTGAGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGGA AGGCCCCCAAACTGCTGATCTACGGCGCCTCCAACCGATACACCGGCGTGCCCGACAGGTTC'

AGCGGAAGCGGCAGCGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTT

CGCCACCTACTACTGCGGCCAGGGCTACAGCTACCCCTATACCTTCGGCCAGGGCACCAAGC

TCGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAG

CTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAA

GGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGC

AGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTAC

GAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAA

GAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGAGGTGCAGCTCCTGG

TCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGC

TTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTG

GGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGT

TCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCC

GAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGGAAGCTGGACTATTGGGGCCAGGG

CACTCTGGTGACCGTGAGCAGC -96- 148187.doc 201106971 SEQ ID NO: 24(抗 HGF-VEGF-HuL2G7-L-TVAAPSGS-593 輕鏈）

DIVMTQSPSSLSASVGDRVT工TCKASENVVTYVSWYQQKPGKAPKLLIYGASNRYTGVPDRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQGYSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTVAAPSGSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASG FTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 25(抗-VEGF dAb DOM15-26-593)

EVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYAD

SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 26(抗VEGF抗運載蛋白）

DGGGIRRSMSGTWYLKAMTVDREFPEMNLESVTPMTLTLLKGHNLEAKVTMLISGRCQEVKA

VLGRTKERKKYTADGGKHVAYIIPSAVRDHVIFYSEGQLHGKPVRGVKLVGRDPKNNLEALE

DFEKAAGARGLSTESILIPRQSETCSPG SEQ ID NO: 27(G4S連接子）

GGGGS SEQ ID NO: 28(連接子）

TVAAPS SEQ ID NO: 29(連接子）

ASTKGPT SEQ ID NO: 30(連接子）

ASTKGPS SEQ ID NO: 31 (連接子）

GS SEQ ID NO: 32(連接子）

TVAAPSGS SEQ ID NO: 33(例示性信號肽序列） 148187.doc -91 · 201106971

MGW SC11L FLVATATGVHS SEQ ID NO: 34(抗VEGF抗體重鏈）

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAA

DFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDYWGQGTLVTVSSA

STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY

SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL

FPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWS

VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT

CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM

HEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 35(抗VEGF抗體輕鏈）

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRF

SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ

LKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY

EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 36(^uVEGFR2

EWAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTI TVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT SEQ ID NO: 37(抗HGF奈米體HGF13)

EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFRSYPMGWFRQAPGKEREFVASITGSGGSTYYAD

SVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYSCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTQVTV

SS SEQ ID NO: 38(人類化抗HGF奈米體HGF13hum5)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMGWFRQAPGKGREFVSSITGSGGSTYYAD

SVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTV

SS SEQ ID NO: 39(替代抗VEGF抗體重鏈）

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAA

DFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSA

STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY

SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL

FPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWS

VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT

CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM

HEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 40 • 98 - 148187.doc 201106971

GSTVAAPSGS SEQ ID NO:41

GSTVAAPSGSTVAAPSGS SEQ ID NO:42

GSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGS SEQ ID NO:43

GSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGS SEQ ID NO:44

GSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGS SEQ ID NO:45

GSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGS SEQ ID NO:46

PASGS SEQ ID NO:47

PASPASGS SEQ ID NO:48

PASPASPASGS SEQ ID NO:49

GGGGSGGGGS SEQ ID NO:50

GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO:51

PAVPPPGS SEQ ID NO:52 -99- 148187.doc 201106971

PAVPPPPAVPPPGS SEQ ID NO:53

PAVPPPPAVPPPPAVPPPGS SEQ ID NO:54

TVSDVPGS SEQ ID NO:55

TVSDVPTVSDVPGS SEQ ID NO:56

TVSDVPTVSDVPTVSDVPGS SEQ ID NO:57

TGLDSPGS SEQ ID NO:58

TGLDSPTGLDSPGS SEQ ID NO:59

TGLDSPTGLDSPTGLDSPGS SEQ ID NO:60

PAS SEQ ID NO:61

PAVPPP SEQ ID NO:62

TVSDVP SEQ ID NO:63

TGLDSP SEQ ID NO:64 -100 148187.doc 201106971 TVAAPSTVAAPSGS SEQ ID NO:65

TVAAPSTVAAPSTVAAPSGS 【圖式簡單說明】圖1 :如由ELIS A所測定，經純化人類單株抗HGF抗體 (BPC2013-2015)及抗 HGF-VEGF 雙特異性抗體（BPC2021-BPC2026)與人類重組HGF之結合。圖2:如由ELISA所測定，經純化抗HGF-VEGF雙特異性抗體（BPC2021-2026)與 VEGF之結合。圖3a及圖3b :各種HGF/VEGF雙靶向分子（mAb，dAb)對 Bx-PC3細胞中HGF介導之MET填酸化（pMET)的影響。圖4a及圖4b ·· MvlLu增殖分析之結果。相較於mAb，用 mAbdAb構築體處理（圖4a);及相較於無關mAbdab，用 mAbdAb處理（圖 4b) ° 圖5 : BxPC3侵襲分析中各孔之影像的定量分析。圖6a及圖6b :血管生成分析之結果-區域面積（圖6a)及平均細管長度（圖6b)。 148187.doc • 101 - 201106971 序列表 <11〇>英商葛蘭素集團公司 <120>抗原結合蛋白 <130> PB63683 <140> 099116880 <141> 2010-05-26 <150> US61/181881 <151> 2009-05-28 <160> 65 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1350 <212> DNA <213> &人 <220> 同源 <400> 1 caggtgcagc tgcaggagag cggccccggc ctggtgaaac cctccgagac cctgagcctg 60 acctgcaccg tgagcggcgg cagcatcagc atctactact ggagctggat caggcagccc 120 ccaggaaagg gcctcgagtg gatcggctac gtgtactaca gcggcagcac caactacaac 180 cccagcctga agagcagggt gaccatcagc gtggacacca gcaagaacca gttcagcctg 240 aagctcjaact ctgtcaccgc cgccgatacc gccgtgtatt actgcgccag gggcggctac 300 gacttt:tgga gcggctactt cgactactgg ggccagggaa cactagtgac cgtgtccagc 360 gccagcacca agggccccag cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 420 ggcacagccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgaaccggt gaccgtgtcc 480 tggaacagcg gagccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540 ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgacc gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc 600 tacatctgta acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 660 aagagctgtg acaagaccca cacctgcccc ccctgccctg cccccgagct gctgggaggc 720 cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagcct aaggacaccc tgatgatcag cagaaccccc 780 gaggtgacct gtgtggtggt ggatgtgagc cacgaggacc ctgaggtgaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcacaatgcc aagaccaagc ccagggagga gcagtacaac 900 agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaag 960 gagtacaagt gtaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgccc ctatcgagaa aaccatcagc 1020 aaggccaagg gccagcccag agagccccag gtgtacaccc tgccccctag cagagatgag 1080 ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200 ctggacagcg atggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagcagatgg 1260 cagcagggca acgtgttcag ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320 cagaagagcc tgagcctgtc ccctggcaag 1350 <210> 2 <211> 450 <212> FRT <213>智人 <220> <2 2 3>人類化序列 <400> 2 ， Ί

Gin va'l Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly t-eu val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 n n 15

Thr Leu Ser Leu TRr* Cys 丁hr Val Se「Gly Gly Ser lie 托r lie Tyr 20 25 30

Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu T「P de 148187-序列表.doc 201106971 35 40 45

Gly Tyr Val Tyr Tyr Ser Gly 5er Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SO 55 60

Ser Arg Val Thr lie ser Val Asp Thr Ser Lys Asn 6ln Phe Ser Leu 65 70 75 80

Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys Ala 85 90 95

Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Trp ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr val ser ser Ala ser Thr Lys Gly Pro ser val 115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro val Thr Val ser 145 ISO 1S5 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175

Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr ser Leu ser ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190

Ser ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys ser cys Asp 210 21S 220

Lys Thr His Thr Cys Pro pro cys pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu val Thr cys val val val Asp val ser His Glu 260 26S 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300

Val Val ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 30S 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu 32S 330 335

Lys Thr lie ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin val Tyr 340 345 350

Thr Leu Pro pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 355 360 B65

Thr cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro ser Asp lie Ala Val Glu Trp 370 37S 380

Glu ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 丁hr Pro Pro val 38S 390 395 400

Leu Asp ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr val Asp 405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys ser Leu ser Leu ser Pro 435 440 44S

Gly Lys 450 <210> 3 <211> 64S <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人類化抗體序列 <40〇> 3 gagatcgtga tgacccagag ccccgccacc ctgagcgtgt cccccggcga gagggccacc 60 ctgagctgca gggcctctca gagcgtggac agcaacctgg cctggtacag gcagaagccc 120 ggacaggccc caaggctgct gatctacggc gccagcacca gagcaaccgg cattcccgcc 180 aggtttagcg gcagcggcag cggcaccgag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagagc 240 -2- 148187-序列表.doc 201106971 gaggacttcg ccgtctacta ctgccagcag tacatcaact ggccccccat caccttcggc 300 cagggcacca ggctggagat caagcgtacg gtggccgccc ccagcgtgtt catcttcccc 360 cccagcgatg agcagctgaa gagcggcacc gccagcgtgg tgtgtctgct gaacaacttc 420 tacccccggg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaatg ccctgcagag cggcaacagc 480 caggagagcg tgaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag cagcaccctg 540 accctgagca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgtgaggt gacccaccag 600 ggcctgtcca gccccgtgac caagagcttc aaccggggcg agtgc 645 <210> 4 <211> 21S <212> PRT <213>人工序列 <220> <22 3>人類化序列 <400> 4

Glu lie val Met Thr Gin ser Pro Ala Thr Leu ser va飞 set4 Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser cys Arg Ala Ser Gin ser Val Asp Ser Asn 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Arg Gin Lys Pro Gly Gin Ala pro Arg Leu Leu lie

35 40 4S

Tyr Gly Ala Ser Th「A「g Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly 丁hr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin ser 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala val Tyr Tyr cys Gin Gin Tyr lie Asn Trp Pro Pro 85 90 95 lie Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys Arg Thr· val Ala 100 105 110

Ala Pro ser Val Phe lie phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser 115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140

Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser 145 ISO 155 160

Gin Gllu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 17S

Ser ser Thr Leu Thr Leu ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys val 180 185 190

Tyr Ala Cys Glu val Thr m's Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu cys 210 215 <210> 5 <211> 1344 <212> ONA <213>人工序列 <220> <223>人類化序列 <400> 5 caggtgcagc tggtgcagcc cggcgcagaa gtcaagaagc ccggcactag cgtgaagctg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc acctactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120 cccggacagg gactggagtg gattggcgag atcaacccca ccaacggcca caccaactac 180 aaccagaagt tccagggcag ggccacactg accgtggaca agagcacctc caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgag gagcgaggac accgccgtgt attactgcgc caggaactac 300 gtgggcagca tcttcgacta ctggggccag ggcacactag tgaccgtgtc cagcgccagc 360 accaagggcc ccagcgtgtt ccccctggcc cccagcagca agagcaccag cggcggcaca 420 gccgcccrtgg gctgcctggt gaaggactac ttccccgaac cggtgaccgt gtcctggaac 480 agcggagccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttccccgccg tgctgcagag cagcggcctg 540 tacagcctga gcagcgtggt gaccgtgccc agcagcagcc tgggcaccca gacctacatc 600 tgtaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaggtgga gcccaagagc 660 tgtgacaaga cccacacctg ccccccctgc cctgcccccg agctgctggg aggccccagc 720 148187-序列表.doc 201106971 gtgttcctgt tcccccccaa gcctaaggac accctgatga tcagcagaac ccccgaggtg 780 acctgtgtgg tggtggatgt gagccacgag gaccctgagg tgaagttcaa ctggtacgtg 840 gacggcgtgg aggtgcacaa tgccaagacc aagcccaggg aggagcagta caacagcacc 900 taccgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaggagtac 960 aagtgtaagg tgtccaacaa ggccctgcct gcccctatcg agaaaaccat cagcaaggcc 1020 aagggccagc ccagagagcc ccaggtgtac accctgcccc ctagcagaga tgagctgacc 1080 aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtg aagggcttct accccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac 1200 agcgatggca gcttcttcct gtacagcaag ctgaccgtgg acaagagcag atggcagcag 1260 ggcaacgtgt tcagctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaatcacta cacccagaag 1320 agcctgagcc tgtcccctgg caag 1344 <210> 6 <211> 448 <212> PRT <213>人工序列 <220> <22 3>人類化序列 <400> 6 Gin VaT Gin Leu val Gin Pro Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr IS 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser GTy Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 2S 30 Trp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 3S 40 45 Gly Glu lie Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe 50 5S 60 Gin Gly Arg Ala Thr Leu Thr val Asp Lys ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys 85 90 95 Ala Arg Asn Tyr Val Gly Ser lie Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 , Leu Val Thr Val Ser Ser Ala ser Thr Lys Gly Pro Ser val Phe pro 115 120 125 Leu Ala Pro ser ser Lys ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 ISO IS5 160 Ser Gly Ala Leu Thr ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala val Leu Gin 165 170 175

Ser ser Gly Leu Tyr ser* Leu Ser Ser Val Va"I Thr Va"l Pro ser Ser 180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205

Asn Thr Lys val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys ser cys Asp Lys Thr 210 21S 220 n

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro ser 225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie ser Arg 245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr cys val val Val Asp Val ser His Glu Asp Pro 260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg val Val 290 295 300 n n

Ser Val Leu Thr val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Giy Lys Giu Tyr 30S 310 315 320

Lys cys Lys val ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr

325 330 , 33S lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin val Tyr Thr Leu 340 345 350

Pro Pro ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val ser Leu Thr cys 355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser 148187-序列表.doc 201106971 370 375 380

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn fyr Lys Thr Thr pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400

Ser Asp Gly ser phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys ser val Met His Glu Ala 420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 7 <211> 642 <212> DNA <213>人工序列 <220> <22 3>人類化序列 <400> 7 gacatcgtga tgactcagag ccccgacagc ctggctatgt cactgggcga gagggtgacc 60 ctgaactgca aggccagcga gaacgtggtg agctacgtga gctggtatca gcagaagccc 120 ggccagagcc ccaaactcct gatctacggc gcctccaaca gggagtctgg cgtccccgac 180 aggttcagcg gcagcggaag cgccaccgac ttcaccctga ccatcagcag cgtgcaggcc 240 gaagacgtgg ccgattacca ctgcggccag agctacaact acccctacac cttcggccag 300 ggcaccaagc tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgatgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gtctgctgaa caacttctac 420 ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gtgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 8 <211> 214 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類化序列 <400> 8

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Met Ser Leu Giy 1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asa val Val ser Tyr 20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin ser pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Gly Ala ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser ser Val Gin Ala 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Asp Tyr His Cys Gly Gin Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr val Ala Ala 100 105 110

Pro ser Val Phe lie Phe Pro Pro ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin ser Gly Asn ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Gin Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys val Tyr 180 185 190

Ala cys Glu val Thr His Gin Gly Leu Ser ser p「〇 val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 148187-序列表.doc 201106971 210 <210> 9 <211> 1350 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人類化序列 <400> 9 gaggtgcagc tcgtccagag cggcgcagaa gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg tgagcggcta caccttctcc ggcaactgga tcgagtgggt gaggcaggcc 120 cccgggaaag gcctggagtg gatcggcgag atcctgcccg gcagcggcaa caccaactac 180 aacgagaagt tcaagggcaa ggccaccatg accgccgaca ccagcaccga caccgcctac 240 atggagctga gcagcctgag gagcgaggac accgctgtgt actattgcgc caggggcggc 300 cactactacg gcagctcttg ggactactgg ggacagggca cactagtgac cgtgtccagc 360 gccagcacca agggccccag cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 420 ggcacagccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgaaccggt gaccgtgtcc 480 tggaacagcg gagccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540 ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgacc gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc 600 tacatctgta acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 660 aagagctgtg acaagaccca cacctgcccc ccctgccctg cccccgagct gctgggaggc 720 cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagcct aaggacaccc tgatgatcag cagaaccccc 780 gaggtgacct gtgtggtggt ggatgtgagc cacgaggacc ctgaggtgaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcacaatgcc aagaccaagc ccagggagga gcagtacaac 900 agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaag 960 gagtacaagt gtaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgccc ctatcgagaa aaccatcagc 1020 aaggccaagg gccagcccag agagccccag gtgtacaccc tgccccctag cagagatgag 1080 ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200 ctggacagcg atggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagcagatgg 1260 cagcagggca acgtgttcag ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320 cagaagagcc tgagcctgtc ccctggcaag 1350 <210> 10 <211> 450 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類化序列 <400> 10

Glu Val Gin Leu Val Gin ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala IS 10 15

Ser val Lys val ser cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly Asn 20 25 30

Trp lie Glu Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 3S 40 45

Gly Glu lie Leu Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55

Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glii Leu ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly His Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val IIS 120 n 125

Phe Pro Leu Ala Pro ser ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 _ 140

Leu Gly cys Leu Val Lys asp Tyr Phe Pro Glu Pro val Thr Val Ser 145 150 155 160

Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175

Leu Girt Ser Ser Gly Leu Tyr ser Leu Ser Ser Val Val Thr val pro 6· 148187-序列表.doc 201106971 180 185 190

Ser ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205

Pro ser Asn Thr Lys val Asp Lys Lys val Glu Pro Lys ser cys Asp 210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Va.l val val Asp Val Ser His Glu 260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr val Asp Gly val Glu val His 27S 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn ser Thr Tyr Arg 290 29S 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 3X5 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu 325 330 335

Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 355 360 365

Thr c：ys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala val Glu Trp 370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 B95 400

Leu Asp ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val Asp 40S 410 415

Lys Ser Arg Tro Gin Gin Gly Asn val Phe ser cys Ser val Met His 420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu ser Leu ser Pro 435 440 445

Gly Lys 4S0 <210> 11 <211> 642 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人類化序列 <400> 11 gacatcgtga tgacccagtc tcccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga tagggtcacc 60 atcacctgca aggccagcga gaacgtggtg acctacgtga gctggtacca gcagaagccc 120 gggaaggccc ccaaactgct gatctacggc gcctccaacc gatacaccgg cgtgcccgac 180 aggttcagcg gaagcggcag cggcacagac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgcggccag ggctacagct acccctatac cttcggccag 300 ggcaccaagc tcgagatcaa gcgtacggtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgatgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gtctgctgaa caacttctac 420 ccccgiggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gtgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 12 <211> 214 <212> PRT <213>人工序列 <220> <2 2 3>人類化序列 <400> 12

Asp lie Val Met 了hr Gin Ser Pro Ser ser Leu Ser Ala Ser val Gly 148187-序列表.doc 201106971 1 5 l〇 15

Asp Arg val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Glu Ash Val val Thr Tyr 20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 ， 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 , , 6〇 Ί

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gly Gin Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 10S 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys val Gin 丁rp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser val Thr Glu Gin Asp ser Lys Asp ser Thr Tyr Ser Leu ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys val Tyr 180 18S 190

Ala cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser ser Pro Val Thr Lys ser

195 200 20S

Phe Asn Arg Gly Glu cys 210 <210> 13 <211> 1722 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 重鍵mAbdAb <400> 13 caggtgcagc tgcaggagag cggccccggc ctggtgaaac cctccgagac cctgagcctg 60 acctgcaccg tgagcggcgg cagcatcagc atctactact ggagctggat caggcagccc 120 ccaggaaagg gcctcgagtg gatcggctac gtgtactaca gcggcagcac caactacaac 180 cccagcctga agagcagggt gaccatcagc gtggacacca gcaagaacca gttcagcctg 240 aagctgaact ctgtcaccgc cgccgatacc gccgtgtatt actgcgccag gggcggctac 300 gacttttgga gcggctactt cgactactgg ggccagggaa cactagtgac cgtgtccagc 360 gccagcacca agggccccag cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 420 ggcacagccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgaaccggt gaccgtgtcc 480 tggaacagcg gagccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc S40 ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgacc gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc 600 tacatctgta acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 660 aagagctgtg acaagaccca cacctgcccc ccctgccctg cccccgagct gctgggaggc 720 cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagcct aaggacaccc tgatgatcag cagaaccccc 780 gaggtgacct gtgtggtggt ggatgtgagc cacgaggacc ctgaggtgaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcacaatgcc aagaccaagc ccagggagga gcagtacaac 900 agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaag 960 gagtacaagt gtaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgccc ctatcgagaa aaccatcagc 1020 aaggccaagg gccagcccag agagccccag gtgtacaccc tgccccctag cagagatgag 1080 ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200 ctggacagcg atggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagcagatgg 1260 cagcagggca acgtgttcag ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320 cagaagagcc tgagcctgtc ccctggcaag accgtggccg ccccctcggg atccgaggtg 1380 cagctcctgg tcagcggcgg cggcctggtc cagcccggag gctcactgag gctgagctgc 1440 gccgctagcg gcttcacctt caaggcctac cccatgatgt gggtcaggca ggcccccggc 1500 aaaggcctgg agtgggtgtc tgagatcagc cccagcggca gctacaccta ctacgccgac 1560 agcgtgaagg gcaggttcac catcagcagg gacaacagca agaacaccct gtacctgcag 1620 atgaactctc tgagggccga ggacaccgcc gtgtactact gcgccaagga ccccaggaag 1680 ctggactatt ggggccaggg cactctggtg accgtgagca gc 1722 148187-序列表.doc 201106971 <210> 14 <211> 574 <212> PRT <213>人工序列 <220><223> 重鏈mAbdAb <400> 14 Gin Val Gin 1 Thr Leu Ser Tyr Trp Ser Gly Tyr val 50 Ser Arg Val 65 Lys Leu Asn ueu Gin Glu Ser 5 cys Thr Arg Gin

Leu 了hr 20 Trp lie

Tyr Tyr Thr lie

Ser val 8S Arg Gly Gly Tyr Asp 100 val Thr

Gly Thr Leu 115 Phe Pro Leu 1,30 Leu Gly Cys 145 Trp Asn Ser Leu Gin Ser Ser S«r Ser 195 Pro Ser Asn 210 Lys Thr His 225 Pro Ser val ser Arg Thr Asp Pro Glu 275 Asn Ala Lys 290 Val val Ser 305 Glu Tyr Lys Lys Thr lie Thr Leu Pro 35S Thr cys Leu 370 Glu ser Asn 385 Leu Asp Ser Lys ser Arg Glu Ala Leu 435 Gly Lys Thr

Ala Pro Leu Val Gly Ala 165 ser Gly 18 0 Leu Gly Thr Lys Thr cys Phe Leu 245 Pro Glu 260 Val Lys Thr Lys Val Leu Cys Lys B25 Ser Lys 340 Pro ser Val Lys Gly GinAsp f〇ys Trp G"ln 420 His Asn

Ser Gly 55 Ser Val 70 Thr Ala Phe Trp Val Ser Ser Ser 135 Lys Asp ISO Leu Thr Leu Tyr Thr Gin Val Asp 215 pro Pro 230 Phe Pro Val Thr Phe Asn Pro Arg 295 Thr val 310 Val Ser Ala Lys Arg.Asp Gly Phe 375 pro Glu 390 Ser Phe

Gin Gly His 丁yr val Ala Ala Pro

Gly Pro Gly 10 Val ser Gly 25 Pro pro Gly 40 Ser Thr Asn Asp Thr Ser Ala Asp Thr 90 ser Gly Tyr 105 ser Ala ser 120 Lys ser Thr Tyr Phe Pro Ser Gly Val 170 ser Leu ser 185 Thr Tyr lie 200 Lys Lys val Cys pro Ala Pro Lys Pro 250 Cys Val Val 265 Trp Tyr Val 280 Glu Glu Gin Leu His Gin Asn Lys Ala 330 Gly Gin Pro 345 Glu Leu Thr 360 Tyr Pro Ser Asn Asn Tyr Phe Leu Tyr 410 Asn Val Phe 42 S Thr Gin Lys 440 Ser Gly Ser

Leu Val Gly Ser Lys Gly Tyr Asn 60 Lys Asn 75 Ala val Phe Asp Thr Lys Ser Gly 140 Glu Pro 155 His Thr Ser Val Cys Asn Glu Pro 220 Pro Glu 235 Lys Asp Val Asp Asp Gly Tyr Asn 300 Asp Trp 315 Leu Pro Arg Glu Lys Asn Asp lie 380 Lys Thr 395 Ser Lys Ser Cys Ser Leu Glu val

Lys Pro Ser Glu 15 lie Ser lie Tyr 30 Leu Glu Trp lie 45 Pro Ser Leu Lys Gin Phe ser Leu 80 Tyr Tyr Cys Ala 95 Tyr Trp Gly Gin 110 Gly Pro Ser Val 125 Gly Thr Ala Ala Val Thr Val Ser 160 Phe Pro Ala Val 175 Val Thr Val Pro 190 val Asn His Lys 205 Lys Ser .Cys Asp Leu Leu Gly Gly 240 Thr Leu Met lie 255 Val Ser His Glu 270 Val Glu Val His 285 Ser Thr Tyr Arg Leu Asn Gly Lys 320 Ala Pro lie Glu 335 Pro Gin Val Tyr 350 Gin VaT Ser Leu 365 Ala Val Glu Trp Thr Pro Pro Val 400 Leu Thr Val Asp 415 Ser Val Met His 430 Ser Leu ser Pro 445 C；ln Leu Leu Val 148丨87-序列表.doc 9·

S 201106971 450 455 460 Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Gly ser Leu Arg Leu Ser cys 465 470 47S 480 Ala Ala Ser Gly phe Thr Phe Lys Ala Tyr Pro Met Met Trp Val Arg 485 490 495

Gin Ala Pro

Gly Ser

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Glu He Ser Pro Ser S00 505 510

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie T^r Thr Tyr Tyr Ala Asg _ 525 Ser Arg Asp Asn ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu 530 535 540

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Pro Arg Lys 545 550 555 560 Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr val ser ser 565 570 <210> 15 <211> 1017 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 輕鏈mAbdAb

<400> IS gagatcgtga tgacccagag ccccgccacc ctgagcgtgt cccccggcga gagggccacc 60 ctgagctgca gggcctctca gagcgtggac agcaacctgg cctggtacag gcagaagccc 120 ggacaggccc caaggctgct gatctacggc gccagcacca gagcaaccgg cattcccgcc 180 aggtttagcg gcagcggcag cggcaccgag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagagc 240 gaggacttcg ccgtctacta ctgccagcag tacatcaact ggccccccat caccttcggc 300 cagggcacca ggctggagat caagcgtacg gtggccgccc ccagcgtgtt catcttcccc 360 cccagcgatg agcagctgaa gagcggcacc gccagcgtgg tgtgtctgct gaacaacttc 420 tacccccggg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaatg ccctgcagag cggcaacagc 480 caggagagcg tgaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag cagcaccctg 540 accctgagca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgtgaggt gacccaccag 600 ggcctgtcca gccccgtgac caagagcttc aaccggggcg agtgcaccgt ggccgccccc 660 tcgggatccg aggtgcagct cctggtcagc ggcggcggcc tggtccagcc cggaggctca 720 ctgaggctga gctgcgccgc tagcggcttc accttcaagg cctaccccat gatgtgggtc 780 aggcaggccc ccggcaaagg cctggagtgg gtgtctgaga tcagccccag cggcagctac 840 acctactacg ccgacagcgt gaagggcagg ttcaccatca gcagggacaa cagcaagaac 900 accctgtacc tgcagatgaa ctctctgagg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgcgcc 960 aaggacccca ggaagctgga ctattggggc cagggcactc tggtgaccgt gagcagc 1017 <210> 16 <211> 339 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 輕錢mAbdAb <400> 16

Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly IS 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin ser val Asp Ser Asn 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Arg Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly SO 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser ser Leu Gin Ser 65 70 7S 80

Glu Asp Phe Ala Val 丁yr 丁yr Cys Gin Gin Tyr lie Asn Trp Pro Pro 85 90 95

He Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala 10· 】48丨87·序列表.doc 201106971 100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser 115 120 125

Gly Thr Ala Ser val Val cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140

Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser 14S ISO 155 160

Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp ser Lys Asp Ser Thr Tyr ser Leu 165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys val 180 185 190

Tyr Ala cys Glu val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro val Thr Lys 195 200 205

Ser phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr val Ala Ala Pro ser Gly ser Glu 210 21S 220 val Gin Leu Leu val Ser Gly Gly Gly Leu val Gin pro Gly Gly ser 225 230 235 240

Leu Arg Leu ser cys Ala Ala ser Gly Phe Thr Phe Lys Ala Tyr Pro 245 250 255

Met Met Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 260 265 270

Glu lie Ser Pro ser Gly Ser 了yr Thr Tyr 丁yr Ala Asp ser val Lys 27S 280 285

Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 290 295 300

Gin Met Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys Ala 305 310 315 320

Lys Asp Pro Arg Lys Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr 325 330 335

Val Ser Ser <210> 17 <211> 1716 <212> ONA <213>人工序列 <220> <223> 重鍵mAbdAb <400> 17 caggtgcagc tggtgcagcc cggcgcagaa gtcaagaagc ccggcactag cgtgaagctg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc acctactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120 cccggacagg gactggagtg gattggcgag atcaacccca ccaacggcca caccaactac 180 aaccagaagt tccagggcag ggccacactg accgtggaca agagcacctc caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgag gagcgaggac accgccgtgt attactgcgc caggaactac 300 gtgggcagca tcttcgacta ctggggccag ggcacactag tgaccgtgtc cagcgccagc 360 accaagggcc ccagcgtgtt ccccctggcc cccagcagca agagcaccag cggcggcaca 420 gccgccctgg gctgcctggt gaaggactac ttccccgaac cggtgaccgt gtcctggaac 480 agcggiagccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttccccgccg tgctgcagag cagcggcctg 540 tacagcctga gcagcgtggt gaccgtgccc agcagcagcc tgggcaccca gacctacatc 600 tgtaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaggtgga gcccaagagc 660 tgtgacaaga cccacacctg ccccccctgc cctgcccccg agctgctggg aggccccagc 720 gtgttcctgt tcccccccaa gcctaaggac accctgatga tcagcagaac ccccgaggtg 780 acctgtgtgg tggtggatgt gagccacgag gaccctgagg tgaagttcaa ctggtacgtg 840 gacggcgtgg aggtgcacaa tgccaagacc aagcccaggg aggagcagta caacagcacc 900 taccgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaggagtac 960 aagtgtaagg tgtccaacaa ggccctgcct gcccctatcg agaaaaccat cagcaaggcc 1020 aagggccagc ccagagagcc ccaggtgtac accctgcccc ctagcagaga tgagctgacc 1080 aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtg aagggcttct accccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacsiaga ccaccccccc tgtgctggac 1200 agcgatggca gcttcttcct gtacagcaag ctgaccgtgg acaagagcag atggcagcag 1260 ggcaacgtgt tcagctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaatcacta cacccagaag 1320 agcctcjagcc tgtcccctgg caagaccgtg gccgccccct cgggatccga ggtgcagctc 1380 ctggtcagcg gcggcggcct ggtccagccc ggaggctcac tgaggctgag ctgcgccgct 1440 agcggcttca ccttcaaggc ctaccccatg atgtgggtca ggcaggcccc cggcaaaggc 1500 -11 - 148丨87-序列表.doc 201106971 ctggagtggg tgtctgagat aagggcaggt tcaccatcag tctctgaggg ccgaggacac tattggggcc agggcactct cagccccagc ggcagctaca cagggacaac agcaagaaca cgccgtgtac tactgcgcca ggtgaccgtg agcagc cctactacgc cgacagcgtg ccctgtacct gcagatgaac aggaccccag gaagctggac 1560 1620 1680 1716 <210> 18 <211> 572 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 重鏈mAbdAb <400> 18 Gin Val Gin Leu 1 Ser Val Lys Leu 20 Trp Met His Trp 35 Gly Glu lie Asn 50 Gin Gly Arg Ala 65 Met Glu Leu ser Ala Arg Asn Tyr 100 Leu val Thr Val 115 Leu Ala Pro ser 130 C^s Leu val Lys Ser Gly Ala Leu Ser Ser Gly Leu 180 Ser Leu Gly Thr 195 Asn Thr Lys val 210 His Thr Cys Pro 22S Val Phe Leu Phe Thr pro Glu Val 260 Glu val Lys Phe 275 Lys Thr Lys Pro 290 ser val Leu 了hr 305 Lys cys Lys val lie Ser Lys Ala 340 Pro Pro ser Arg 355 Leu val Lys Gly 370 Asn Gly Gin Pro 385 ser Asp Gly ser Arg Trp Gin Gin

Val Gin S Ser Cys Val Arg Pro Thr Thr Leu 70 Ser Leu 85 val Gly ser Ser Ser Lys Asp Tyr 150 Thr Ser 165 Tyr Ser Gin 丁hr Asp Lys Pro Cys 230 Pro Pro 245 Thr Cys Asn Trp Arg Glu Val Leu 310 Ser Asn 325 Lys Gly Asp Glu Phe Tyr Glu Asn 390 Phe Phe 405 Gly Asn

Pro Gly Lys Ala Gin Ala 40 Asn Gly 55 Thr Val Arg Ser Ser lie Ala Ser 120 Ser Thr 135 Phe Pro Gly val Leu Ser Tyr lie 200 Lys Val 215 Pro Ala Lys Pro val val Tyr val 280 Glu Gin 295 His Gin Lys Ala Gin Pro Leu Thr 360 Pro Ser 375 Asn Tyr Leu Tyr val Phe

Lys Lys Thr Phe Gly Leu 45 Tyr Asn 60 Thr Ser Ala Val Trp Gly Pro Ser 12 S Thr Ala 140 Thr Val pro Ala Thr Val Asn His 205 Ser Cys 220 Leu Gly Leu Met Ser His Glu Val 285 Thr Tyr 300 Asn Gly Pro lie Gin Val val ser 365 Val Glu 380 Pro Pro Thr Val val Met

Ala Glu Val 10 ser Gly Tyr 25

Pro Gly Gin

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Glu Asp Thr 90

Phe Asp Tyr 105

Thr Lys Gly ser Gly Gly

Glu Pro Val 155

His Thr Phe 170

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Glu Pro Lys pro Glu Leu 235

Lys Asp Thr 250 val Asp Val 265

Asp Gly Val

Tyr Asn Ser

Asp Trp Leu 315

Leu Pro Ala 330

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Lys asn Gin

Asp lie Ala

Lys Thr Thr 395

Ser Lys Leu 410 ser cys ser pro Gly Thr 15

Thr Thr Tyr 30

Glu Trp lie

Gin Lys Phe

Thr Ala Tyr 80

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Gin Gly Thr 110

Val Phe Pro

Ala Leu Gly

Ser Trp Asn 160

Val Leu Gin 175

Pro Ser Ser 190

Lys Pro Ser

Asp Lys Thr

Gly Pro Ser 240 lie Ser Arg 255

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His Asn Ala

Arg Val Val

Lys Glu Tyr 320

Glu Lys Thr 335

Tyr Thr Leu 350

Leu Thr Cys

Trp Glu ser

Val Leu Asp 400

Asp Lys Ser 415

His Glu Ala -12- 148187-序列表.doc 201106971 420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 4B5 440 445

Thr val Ala Ala Pro Ser Gly ser Glu val Gin Leu Leu val ser Gly 450 455 460

Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu ser Cys Ala Ala 465 470 475 480

Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ala Tyr Pro Met Met Trp Val Arg Gin Ala 485 490 495

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val Ser Glu lie Ser Pro ser Gly ser 500 505 510

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Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 530 535 540

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Asp lie val Met Thr Gin ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 i 5 10 15

Asp Arg \/al Thr lie Thr cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr . 20 25 30 val Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 16- 148】87·序列表.doc 201106971 35 Tyr Gly Ala 50 Ser Gly ser 65 Glu Asp Phe Thr Phe Gly Pro Ser val 115 Thr Ala ser 130 Lys val Gin 145 Glu Ser val Ser Thr Leu Ala Cys Glu 195 Phe Asn Arg 210 Gin Leu Leu 225 Arg Leu ser Met Trp val lie Ser Pro 275 Arg Phe Thr 290 Met Asn Ser 305 Asp Pro Arg Ser Ser

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<210> 26 <211> 152 <212> PRT I48I87-序列表.doc -17- 201106971 <213>人工序列 <220> <22 3>抗運載蛋白

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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser <210> 31 <2X1> 2 <212> PRT <213;>人工序列 <220> <223>連接子 <400> 31 Gly Ser 1 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子 <400> 32

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Ser Leu Arg Leu ser Cys Ala Ala 20

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Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 85

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly 100

Tro Gly Gin Gly Thr Leu val Thr 115 120 pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 130 135

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 145 ISO

Thr val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 165 pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly

Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 10 15

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 25 30

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val 45

Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 60

Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 75 80

Glu Asp 了hr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95

Ser ser His Trp Tyr Phe Asp val 105 110 val ser Ser Ala ser Thr Lys Gly 125

Ser ser Lys Ser Thr ser Gly Gly 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro val 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 170 175

Leu Tyr ser Leu Ser ser val val -22- 148187·序列表.doc 201106971 ISO Thr val Pro ser 195 Α5Π His Lys Pro 210 Ser Cys Asp Lys 225 Leu Gly Gly Pro Leu Met lie ser 260 ser His Glu Asp 275 Glu val His Asn 290 Thr Tyr Arg val 305 Asn Gly Lys Glu Pro 工le Glu Lys 340 Gin Val Tyr Thr 355 Val Ser Leu Thr 370 val Glu Trp Glu 385 Pro Pro val Leu Thr Val Asp Lys 420 Val Met His Glu 43S Leu ser Pro GTy 450 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子 <400> 40 Gly ser Thr Val 1 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr <3ln Thr Tyr lie Cys Asn Val 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 215 220

Thr His Thr cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 230 235 240 ser val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255

Arg Thr pro Glu Val Thr cys val val Val Asp val 265 270 pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly val 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn ser 295 300 val Ser Val Leu Thr val Leu His Gin Asp Trp Leu 310 315 320

Tyr Lys cys Lys Val ser Asn Lys Ala Leu pro Ala 325 330 335

Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin 360 365 cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala 375 380

Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 ser Arq Trp Gin Gin Gly Asn val Phe Ser cys Ser 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 440 445

Lys

Ala Ala Pro Ser Gly Ser 5 10 <210> 41 <211> 18 <212> prt <213>人工序列 <220> <223>連接子 <400> 41 Gly ser Thr val 1 Gly Ser

Ala Ala Gly Ser Thr Val Ala Ala Pro Ser 5 10 15 148187-序列表,d〇c -23· 201106971 <210> 42 <211> 26 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子 <400> 42

Gly Ser Thr val Ala Ala Pro ser Gly Ser Thr Val Ala Ala Pro ser IS 10 15

Gly Ser Thr Val Ala Ala Pro ser Gly Ser 20 25 <210> 43 <211> 34 <212> PRT <213>人工序列號 <220> <223>連接子 <400> 43

Gly Ser Thr Val Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr val Ala Ala Pro ser 1 5 10 15

Gly Ser Thr val Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr val Ala Ala pro ser 20 25 30

Gly Ser <210> 44 <211> 42 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子 <400> 44

Gly ser Thr Val Ala Ala Pro ser Gly ser Thr Val Ala Ala Pro ser 15 10 15

Gly Ser Thr val Ala Ala Pro ser Gly ser Thr val Ala Ala Pro Ser 20 25 30

Gly Ser Thr val Ala Ala Pro ser Gly Ser 35 40 <210> 45 <211> 50 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子 -24- 148187-序列表.doc 201106971 <400> 45

Gly Ser Thr Val Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Val Ala Ala Pro Ser 15 10 15

Gly Ser Thr Val Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Val Ala Ala Pro Ser 20 25 30

Gly ser Thr val Ala Ala Pro ser Gly Ser Thr Val Ala Ala Pro ser 35 40 45

Gly Ser 50 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子 <400;> 46

Pro Ala ser Gly ser 1 5 <210> 47 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 <220 <223ρ·連接子 <400> 47

Pro Ala Ser Pro Ala Ser Gly Ser 1 5 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> 連接子 <400> 48

Pro Ala Ser Pro Ala ser Pro Ala Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 -25- 148187-序列表.doc 201106971 <220> <223>連接子 <400> 49

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子 <400> 50

Gly GTy Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子 <400> 51

Pro Ala val Pro Pro Pro Gly Ser <210> 52 <211> 14 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子 <400> 52

Pro Ala Val Pro Pro Pro Pro Ala Val Pro Pro Pro Gly Ser 1 5 10 <210> 53 <211> 20 <212> PRT <213>連接子 <400> S3

Pro Ala Val Pro Pro Pro Pro Ala Val Pro Pro Pro Pro Ala Val Pro IS 10 15

Pro Pro Gly ser -26· 148187-序列表.doc 20 201106971 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子 <400> 54

Thr Val Ser Asp Val Pro Gly Ser 1 5 <210> 55 <211> 14 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子 <400> 55

Thr Val Ser Asp val Pro Thr Val Ser Asp Val Pro Gly Ser 1 5 10 <210> 56 <211> 20 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子 <400> 56

Thr Veil Ser Asp val Pro Thr Val Ser Asp Val Pro Thr val 5er Asp 15 10 15

Val Pro Gly Ser 20 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子 <400> 57

Th「 Gly Leu Asp ser Pro Gly Ser -27- 148187-序列表.doc 201106971 <210> 58 <211> 14 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子

Thr Glv Leu Asp Ser Pro Thr Gly Leu Asp Ser Pro Gly Ser 1 5 l〇 <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子

Thr Gly Leu Asp ser Pro Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Leu Asp 1 5 l〇 15

Ser Pro Gly Ser 20 <210> 60 <211> 3 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子 <400> 60 pro Ala ser 1 <210> 61 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子 <400> 61

Pro Ala Val Pro Pro Pro 1 5 <210> 62 -28- 148187·序列表.doc 201106971 <211：> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子 <400> 62

Thr Val Ser Asp Val Pro 1 5 <210> 63 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子 <400> 63

Thr Gly Leu Asp Ser Pro 1 5 <210> 64 <211> 14 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子 <400> 64

Thr val Ala Ala Pro Ser Thr val Ala Ala Pro Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 65 <211> 20 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>連接子 <400> 65

Thr Val Ala Ala Pro ser 下hr val Ala Ala Pro Ser Thr Val Ala Ala 1 S 10 15

Pro Ser Gly Ser 20 148187-序列表.doc -29-

Claims

201106971 七、申請專利範圍：

—種抗原結合蛋白，其包含連接至—或多個抗原決定基結合域之蛋白質骨架，其中該抗原結合蛋白具有至少兩個抗原結合位點，其中至少-個位點來自抗原決定基結 T域且其中至少一個位點來自成對Vh/vl結構域，且其中該等抗原結合位點中之至少一者能夠結合HGF。如請求項1之抗原結合蛋白’其中至少一個抗原決定基結合域為免疫球蛋白單可變域。 3 ’如明求項2之抗原結合蛋白，其中該免疫球蛋白單可變域為人類dAb。 4·如請求項2之抗原結合蛋白，其中該免疫球蛋白單可變域為駱駝科dAb(VHH)或鯊dAb(NARV)。 5.如請求項1之抗原結合蛋白，其中至少一個抗原決定基結合域源自非ig骨架’其中該非1§骨架係選自：cTLA_4 (伊維體（Evibody));脂質運載蛋白；蛋白質a衍生分子，諸如蛋白質A之Z結構域（親和抗體（Affib〇dy)， SpA)、A結構域（高親和性多聚體/最大抗體 (Avimer/Maxibody));熱休克蛋白，諸如 GroEl及GroES ; 轉鐵蛋白（運載體（trans-body));錫蛋白重複蛋白 (DARPin);肽適體；C型凝集素結構域（四連接素 (Tetranectin));人類γ-晶狀體球蛋白及人類泛素（親和素 (affilins)) ; PDZ結構域；嫩毒素；人類蛋白酶抑制劑之庫尼茲（kunitz)型結構域；及纖維結合蛋白（黏結素 (adnectin)) 〇 148187.doc 201106971 6.如請求項5之抗原結合蛋白，其中該抗原決定基結合域源自選自親和抗體（Affibody)、錨蛋白重複蛋白 (DARPin)及黏結素（adnectin)之骨架。月求項1至6中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白對一種以上抗原具有特異性。 8·如凊求項1至6中任一項之抗原結合蛋白，其中至少一對 VH/VL結構域能夠結合hgf。 9. 如請求項1至6中任一項之抗原結合蛋白，其中至少一個抗原決定基結合域能夠結合HGF。 10. 如請求項1至6中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白能夠結合HGF及VEGF。 11 _如請求項1至6中任一項之抗原結合蛋白，其中該蛋白質骨架為Ig骨架。 12_如請求項丨丨之抗原結合蛋白，其中該。骨架為IgG骨架。 13.如請求項12之抗原結合蛋白，其中該IgG骨架係選自 !gGl、IgG2、IgG3及 IgG4 » 14·如請求項丨1之抗原結合蛋白，其中該IgG骨架包含抗體之所有結構域。 1 5.如請求項1至6中任一項之抗原結合蛋白，其包含SEq ID N〇: 10之重鏈序列及SEQ ID NO: 12之輕鏈序列。 16_如請求項15之抗原結合蛋白，其包含冗(^ ID NO: 22之重鏈序列及SEQ ID NO: 12之輕鏈序列。 17.如請求項1至6中任一項之抗原結合蛋白，其包含四個抗原決定基結合域。 148187.doc 201106971 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 如請求項17之抗原結合蛋白，其中該等抗原決定基結合域中之兩者對同一抗原具有特異性。如請求項1至6中任一項之抗原結合蛋白，其中該等抗原決定基結合域中之至少-者利用包含丨至⑼個胺基酸之連接子直接連接至該Ig骨架。如請求項19之抗原結合蛋白，其中該等抗原決定基結合域中之至少一者利用包含丨至2〇個胺基酸之連接子直接連接至該Ig骨架。如請求項20之抗原結合蛋白，其中該等抗原決定基結合域中之至少一者利用選自SEQIDNO:3至8t所示任一者或其任何多者或組合的連接子直接連接至該“骨架。如請求項1至6中任一項之抗原結合蛋白，其中該等抗原決定基結合域中之至少一者結合人血清白蛋白。如請求項η之抗原結合蛋白’其包含在輕鏈之N端連接至該ig骨架之抗原決定基結合域。如請求項11之抗原結合蛋白’其包含在重鏈之N端連接至a亥Ig骨架之抗原決定基結合域。如請求項11之抗原結合蛋白’其包含在輕鏈之c端連接至該ig骨架之抗原決定基結合域。如請求項11之抗原結合蛋白，其包含在重鏈之c端連接至該Ig骨架之抗原決定基結合域。如請求項1至6中任一項之抗原結合蛋白，其具有4個抗原結合位點D 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白，其用於醫學中0 148187.doc 201106971 9種如明求項i至28中任—項之抗原結合蛋白之用途，其用於製造供治療癌症、年齡相關之黃斑部變性、糖尿病性視網膜錢、RA或牛皮癬用之藥劑。月求員29之用途，其中該癌症為實體腫瘤、原發或繼發（轉移性）腦腫瘤。 31.如請求項29之用途’其中該等實體腫瘤為結腸、乳房、印巢:肺(小細月包或非小細胞）、前列腺、騰腺、腎、肝、月或頭及頸部之腫瘤、黑素瘤或肉瘤。月求項29之用途’其中該等原發及繼發（轉移性）腦腫瘤為神經膠質瘤、腦膜瘤、少突神經膠質瘤、星形細胞瘤（低級、退行性；5容你α _ 夕开〆性膠質母細胞瘤）、髓母細胞瘤、神經節瘤、神經鞘瘤或脊索瘤。 33. -種聚核苦酸序列，其編碼如請求項】至η中任一項之抗原結合蛋白之重鏈。 34. -種聚核苷酸，其編碼如請求項a”中任一項之抗原結合蛋白之輕鏈。 35· -種重組轉型或轉染之宿主細胞，其包含一或多個編碼如請求項1至27中任—項之抗原結合蛋白之重鏈及輕键的聚核苷酸序列。 36. -種產生如請求項m之抗原結合蛋白的方法，該方法包括培養如請求項35之宿主細胞及分離該抗原結合蛋白之步驟。 37, 種醫藥組合物’其包含如請求項u27中任一項之抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。 148187.doc