TW201100537A - Short-time high temperature treatment generates microbial preparations with anti-inflammatory profiles - Google Patents

Description

201100537 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明概括而言係關於微生物領域°特定言之’本發明 涉及經高溫處理之微生物（例如’益生菌及乳品發酵菌）， • 及此等細菌之應用。本發明一個實施例係關於經高溫瞬時 • 處理之微生物（例如’益生菌及乳品發酵菌），及其等在製 備組合物以治療或防止發炎病症上之用途。 【先前技術】 Ο 益生菌常被定義為「當以充足量投與時可賦予宿主健康 益處之活的微生物」（FAO/WHO Guidelines)。因此’絕大 多數發表文獻係與活的益生菌有關。然而’有數個研究探 ' 討不具繁殖力的細菌（non-replicating bacteria)所賦予之健康 ' 益處，且大多數該等研究顯示益生菌的失活作用（例如， 熱處理）會導致該等細菌所意圖目標之健康效益的損失 (Rachmilewitz，D·,等人，2004，Gastroenterology 126:520-528 ; Castagliuolo，等人，2005，FEMS Immunol.Med.Microbiol. ❹ 43:197-204 ; Gill，H. S.及K. J. Rutherfurd，2001，Br. J. Nutr. 86:285-289 ; Kaila，M·，等人，1995，Arch.Dis.Child 72:51-53。）。 . 然而，一些研究顯示經滅活益生菌仍保留一些健康效益 (Rachmilewitz，D·，等人，2004，Gastroenterology 126:520-528 ; Gill, H. S.^K. J. Rutherfurd > 2001 > Br. J. Nutr. 86:285-289) 〇 益生菌在作為治療或防止發炎性腸病之用途上的策略業 已於文獻中報導，且最近經由Dotan等人综述評論（Dotan, 148231.doc 201100537 I.及 D. Rachmilewitz，2005 ; Curr. Opin· Gastroenterol. 21:426-430)。例如，一種含8種活的益生菌（VSL#3)之高度 濃縮混合劑經證明可有效防止（Gionchetti, P.，等人， 2003，Gastroenterology 124:1202-1209)及治療人類之復發 或頑抗性囊袋炎（pouchitis)(Gionchetti，P·，等人，2000， Gastroenterology 119:305-309 ; Mimura，T.,等人，2004， Gut 53:108-114)。有趣的是，利用DSS-引發結腸炎之小鼠 模型，Rachmilewitz 等人（Rachmilewitz，D·,等人，2004, Gastroenterology 126:520-528)揭示使用活的且經γ-照射之 VSL#3(但未經熱滅活之VSL#3)治療時，可防止結腸炎。 類似地，經熱滅活之鬈曲乳酸桿菌（I. crivaiwj·)無法防止 DSS-引發之結腸炎，然而其活的對應物則明顯地會降低體 重減輕程度及腸道中MPO活性（Castagliuolo，等人， 2005，FEMS Immunol.Med.Microbiol. 43:197-204)。此等 研究推論益生菌相較其等不具繁殖力之對應體更能有效地 存活於腸道炎症情況中。 經發現失活的羅伊氏乳酸桿菌（Z. 經熱滅活及經 γ_照射）無法降低TNFa所引發T84細胞產生之IL-8，然而其 活的對應體則展現出顯著的有益作用（Ma, D_，等人， 2004，Infect.Immun. 72:5308-5314) 〇 明顯地，經失活益生菌在（例如）食品產業中極易處理及/ 或保存。因此，令人鼓舞的是發現經失活益生菌對消費者 具有有益作用，但同時，令人失望的是發現此等作用相較 活的益生菌是降低的或甚至是徹底消失。 148231.doc 201100537 文獻中所述，可使益生菌菌株成為不具繁瘦力的技術通 常係為熱處理' γ·照射、UV光或化學藥劑（福馬林、多聚 曱醛）。幾乎沒有研究比較不同失活方法對該所得不具繁 殖力細菌的生物功能之影響。除前引用之以吮⑹卜…匕的 研究外，有一項此研究揭示經熱處理及7_照射之細菌於活 體外會誘發上皮細胞不同程度的細胞激素分泌（w〇ng，c•及 Z. Ustunol，2006，J.F〇〇d Prot. 69:2285-2288)。 然而，文獻中所述及經測試可使益生菌菌株成為不具繁 殖力之技術一般無法應用或難以在產業環境（特別是食品 產業）中實施。 現今市場上大多數含有益生菌之產品係在該等產品製造 期間就經過熱處理。因此，能夠方便地與所製得之產品一 起或以相似方式將益生菌加以熱處理，同時益生菌仍保留 或改良該等菌株之有益特性，或甚至獲得對消費者而言是 一種新穎的有益特性。 然而’文獻中所採用將細菌失活之熱處理一般係在4〇至 100°C間的溫度變化下長時間（20分鐘至i小時，或更長）處 理，這是不容易在產業規模下實施的。此外，此種熱處理 在技藝中通常會導致至少益生菌活性部分的損失。 於產業規模中，不會使用長時間熱處理，而一般是使用 短時間熱處理，諸如，類&UHT熱處理。此類熱處理可降 低細菌負載量及縮短加工時間，藉此減少營養物質的破 壞。 因此’咸欲期望從活的微生物（例如，益生菌或乳品發 148231.doc 201100537 酵菌）獲知·之可利用細胞製備物，其可依製造加工期間產 m典型相同方式熱處理，且其可產生或改良（諸如）防止及/ 或治療發炎病症之健康益處。 【發明内容】 因此，本發明一個目的係提供本技藝一種包含微生物 (例如益生菌或乳品發酵菌）之組合物，其可以產業方式 <、、、處理，以減少活的細菌細胞，及其因藉此熱處理而產生 或改良健康益處。 本發明者出乎意料地發現，藉由獨立請求項之主題内容 可實現此目的。附屬請求項則可進一步闡述本發明。 本發明者率先證明，藉高溫瞬時熱處理之微生物（例 如，益生菌菌株或乳品發酵菌）可展現出與菌株原有特性 無關之抗發炎免疫作用。.特定言之，藉由此熱處理不是會 發展出新穎的抗發炎作用，就是會增強既有的抗發炎作 用。 因此，現今藉由利用對應於典型產業上所採用熱處理之 特定熱處理參數可產生出具有抗發炎免疫作用之不具繁殖 力的微生物，即使是該活的對應體並非為抗發炎菌株。 例如，數種微生物（例如，以乳酸桿菌及雙歧桿菌為代 表之益生菌）已觀察到此效用’且乳品發酵菌培養物也觀 察到此效用。 不具繁殖力之益生菌微生物具有遠比其活的對應體容易 處理的優點。此外，該等微生物具有更佳的儲存穩定性且 所需求之封裝條件較不嚴苛。 148231.d, 201100537 不具繁殖力之益生菌微生物可以開發出種類繁多的產 〇σ ^亥等產品因其屬性而不允許添加未經額外措施保護之 活的益生菌。此點在供應穀物棒、果汁、UHT-飲料、保久 飲料等是具有重要性的。 此外，例如，在嚴重性免疫缺陷的消費者中，活的益生 菌之使用會因為形成菌血症之潛在風險而受限於例外案 例。此處本發明者提供一種產生非_活細胞之方法，該非_ ❹⑦細胞具有不管其等原有免疫作用為何之抗發炎作用。 t*卜所提供之不具繁殖力益生菌微生物允許（例如）粉 末狀營養組合物進行加熱復水作用，同時仍保留對消 病患的健康益處。 據本發明者所知，過去未曾揭示使用高溫瞬時處理以產 生具有抗發炎作用之不具繁殖力的細菌。 因此，本發明一個實施例係一種包含微生物之組合物， 其中該微生物係經受至少715°c高溫處理達至少1秒鐘。 〇 該微生物較佳地為食品級微生物。若微生物係經核准供 人類或動物消費食用，則其即為食品級。 【實施方式】 從下列貫例及圖形顯而易見本發明其他優點及特徵。 於一個實施例中’該微生物可為益生菌。 就本發明目的而言，益生菌係定義為「對宿主健康具有 有益作用之微生物細胞製備物或微生物細胞組分」。 (Salminen S、Ouwegand A. Benno Y.等人，「Pr〇bi〇tics. how should they be defined」Trends Food Sci. Technol 148231.doc 201100537 1999:10 107-10)= 於另—實施例中’該微生物為乳品發酵菌培養物。 較佳地’該微生物係經受約71·5至l5(rc高溫處理達約i 至120秒短時間。 更佳地’該微生物係經受約90至14〇。〇 (例如，90至 l2〇°C)處理達約1至3〇秒短時間。 於本發明一個實施例中，此高溫處理可使至少部份微生 物成為不具繁殖力的。 不具繁殖力」微生物包括（例如）經熱處理之益生菌或 乳品發酵菌培養物之微生物。此包括失活的、死亡的、 非-活的微生物及/或以諸如DNA片段、代謝物、細胞質化 合物、及/或細胞壁物質呈現者。 不具繁殖力」意指藉由標準塗佈方法並沒有活的細胞 及/或菌落形成單位被檢測到。此等標準塗佈方法係概述 於微生物學書籍：james Monroe Jay、Martin j L〇essner、

David A. Golden ’ 2005，Modern food micr〇bi〇l〇gy ,第 7版， Springer Science，New York，N.Y_ 790 p。一般而言，沒有活 的細胞係如下顯示出來：接種不同濃度之細菌製備物 (「不具繁殖力」樣品）並在適宜條件下（有氧或無氧氛圍持 續至少24小時）培養後，於璦脂平板上沒有可見的菌落， 或於液體生長培養基中濁度沒有增加。 高溫處理可於常壓下實施，然而亦可於高壓下實施。典 型的壓力範圍係介於1至50巴’較佳為1至1〇巴，甚至更佳 2至5巴之間。顯然地，當加熱時，若益生菌於液體或固體 148231.doc 201100537 培養基中經熱處理較佳。因此，所施用之理想氣壓端視提 供微生物之組合物屬性及所用溫度而定。 高溫處理可於約71.5至15〇t溫度範圍實施，較佳地約 90至120°C，甚至更佳約120至14〇。(：。 高溫處理可進行達約丄至！^秒短時間，較佳地約1至3〇 秒，甚至更佳約5至1 5秒。

此指定時間範圍係指微生物（例如益生菌及乳品發酵菌 培養物）經受指疋溫度之時間。應注意，加熱時間可視提 供微生物組合物之屬性與含量，及所用加熱設備之結構而 變化。 然而，一般而言， 溫瞬時（HTST)處理法 處理法加以處理。 本^明組合物及/或微生物係藉由高 、瞬間巴斯德滅菌法或超高溫（UHT) UHT處理法是為超高溫加工過程或超熱處理（兩者的縮 寫均為UHT)，UHT處理法涉及在超過135〇c (275卞）溫度下 (該溫度為殺滅牛乳中細菌孢子所需溫度），短時間加熱約i Q 至1〇秒，以便將組合物至少部份滅菌。例如，依此方式利 用超過135 C溫度處理牛乳，可以持續流動操作下在所要 求保持時間内（達2至5秒）降低細菌負載量。 有兩種主要類型的UHT系統：直接及間接系統。於直接 系‘.先中，產α口係藉由蒸軋注射或蒸氣灌流處理，而於間接 系統中，產品係利用平板熱交換器、管狀熱交換器或刮板 式熱父換器熱處理。在產品製備過程中之任何步驟或多個 步驟中可應用UHT系統之組合。 HTST處理法之定義如下（高溫/瞬時）：所設計之巴斯德 14823I.doc 201100537 滅菌法可使牛乳中活的微生物數減少5個1〇§值、殺滅 99.9999%。此被視為足以破壞幾乎全部的酵母菌、黴菌及 常見腐敗細菌，且亦可確保充分消滅常見耐熱病原性生 物。於HTST加卫中，牛乳係經加熱至71叫⑹^達。 至20秒。 瞬間巴斯德滅菌法係一種針對易腐飲料類（如：果汁及 4菜汁、啤酒及乳製品)之熱滅菌方法。該滅菌過程係在 填充至容器中之前進行，以便殺滅腐敗微生物、以使產品 更女全亚延長產品貨架期。液體係以經控制持續流動的方 式，同時經受71.5t(16昨）至7代（16叫溫度處理達約 15至30秒。 就本發月目的而§，術語「高溫瞬時處理法」應包括例 如，高溫瞬時（HTST)處理法、聰處理法及瞬間巴斯 菌法。 -旦經由高溫短時間處理而成為不具繁殖力後，該所得 不具繁殖力益生菌將會展現上所討論之經改良或新賴的μ 處。 观 如前所討論之不具繁殖力微生物之任何含量均是有效 的。然而，-般較佳地至少9〇%，較佳至少95%，更佳為 至州。/。，最佳至少99%，理㈣至m 有益生囷係不具繁瘦力的。 於本發明-個實施例中，所有微生物係不具繁殖力的。 所有的微生物均可用於本發明範圍内。較佳地，該微兰 物係食品級。典型的食品級微生物係益生菌。 148231.doc 201100537 較佳地，使用益生菌且係選自由雙叉桿菌 (Bifidobacterium)、乳駿得菌（Lactobacillus)、乳來菌 (Zaciococcwi)、鏈球菌（•Sirepiococews)、念珠菌 (0<3«心心）、或其等混合物組成之群。 Ο

例如，益生菌可選自由龍根雙叉桿菌CS(/Vi/ohcieriMW Iongum)、乳酸雙又桿菌（Bifidobacterium lactis)、動物雙 又桿菌（Bifidobacterium animalis)、短型雙叉桿菌 (Bifidobacterium breve)、嬰免雙又桿菌（Bifidobacterium ί«:/α«ίί·5)、青春雙叉桿菌（S(/Wo6acieHwm ado/escewiis)、 嗜酸乳酸桿菌（Z<acio6izcz7/wi 、乾酷·乳酸桿菌 {Lactobacillus casez’）、副乾酷乳酸桿菌 、唾液乳酸桿菌sa/ivar/MS)、羅 伊氏乳酸桿菌rewierz·)、鼠李糖乳酸桿菌 {Lactobacillus r/zamwosws)、約氏乳酸桿菌（Lacio6acz7/M5 、胚芽乳酸桿菌（Zacio办aci/Zwi1 _p/a«iarww)、發酵 乳酸桿菌（[acio^acinw·? /ermeniwm)、雷特氏乳球菌 (Zflciococcws /aci^)、及/或其等混合物組成之群。 乳品發酵菌培養物可選自由丙酸桿菌 (Propionibacterium)、今轉t 連珠議（Streptococcus thermophilus)、 雷特氏乳球菌（i^ciococcw /flC仏）、雙乙醯乳球菌 (Lactococcus diacetylactis)、乳月旨乳球菌(Lactococcus cremorz··?)、保加利亞乳酸桿菌（Zacic^acH/ws ^w/garz'cw·?)、 瑞士乳酸桿菌Zie/veiicMs)、戴白氏乳酸桿菌 (Lactobacillus; delbrueckii)、及其等既合物紙成之群。 148231.doc -11 - 201100537 高溫處理（例如，約h 5至15〇。 是必要的^ ·5至15GC)進仃約mo秒短時間 σ 此處理可應用於活的及/或非活的益生菌。 可乂進仃超過1次高溫處理（例如，約71 5至】 至120秒短時間。 W逹約1 於本：: 月一個實施例中’該益生菌係選自由雙又桿菌 雔礼酸柃菌屬及埃希氏桿屬或其等組合所組成之群。 雙又桿g之典型實例係龍根雙叉桿菌、短型雙 乳酸雙又桿8。乳酸桿菌之典型實例係副乾路乳酸桿I 乾絡乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌或鼠李糖乳酸桿菌。埃希氏 干菌之〜里只例係具有健康益處意義之大腸桿菌菌株。 本發明一個實施你丨φ，令丨σ ϋ a +#· ^ 礼ασ發酵囷培養物係嗜熱鏈球 菌、瑞士乳酸桿g、戴白氏乳酸桿菌及乳酸乳球菌。 此外例如，s亥扭生菌可選自由龍根雙叉桿菌NCC 3_、龍根雙叉桿菌Ncc 27G5、短型雙叉桿菌ncc 、乳酸雙叉桿菌NCC 2818、副乾赂乳酸桿菌ncc 246卜乾酿乳酸桿菌Ncc 4_、乾絡乳酸桿菌aca_dc 6002 (NCC 1825)、鼠李糖乳酸桿菌Ncc 4〇〇7、嗜酸乳酸 桿菌NCC 3009、尼梭大腸桿菌阳—…仏c〇li Nissle)1917或其等組合所組成之群。 此外，例如，乳品發酵菌可選自由嗜熱鏈球菌NCC； 2〇19、嗜熱鍵球菌NCC 2059、€氏乳酸桿菌保加利亞亞種 似心姑r此Cb· subsp 料hCw)Ncc 15及乳 酸乳球菌NCC 2287組成之群。 所有菌株已依據布達佩斯條約寄存如下： 148231.doc 201100537 ATCC BAA-999 CNCM 1-2618 CNCM 1-3865 CNCM 1-3446 CNCM 1-2116 CGMCC 1.3724 CNCM 1-1422 CNCM 1-4153 CNCM 1-4154 CNCM 1-1518 ACA-DC 6002 ATCC 700396 CNCM 1-1198 DSM 6601 龍根雙叉桿菌NCC 3001: 龍根雙叉桿菌NCC 2705: 短型雙叉桿菌NCC 2950: 乳酸雙叉桿菌NCC 2818: 副乾酪乳酸桿菌NCC 2461: 鼠李糖乳酸桿菌NCC 4007: 嗜熱鏈球菌NCC 2019: 嗜熱鏈球菌NCC 2059:

乳酸乳球菌NCC 2287: 乾酪乳酸桿菌NCC 4006: 乾酪乳酸桿菌NCC 1825: 嗜酸乳酸桿菌NCC 3009: 保加利亞乳酸桿菌NCC 15: 尼梭大腸桿菌1917: 本發明組合物包含足以至少部份治療發炎病症及其等併 發症之含量的經高溫瞬時處理之微生物。足以實現此目的 之含量定義為「治療有效劑量」。對此目的有效之含量係 端視熟習本技藝者已知之許多因素（如疾病的嚴重性及消 費者體重及整體健康狀態），及食品基質效用而定。 於預防應用中，將足以至少部份降低形成發炎病症風險 之含量的根據本發明組合物投與易患或處於發炎病症風險 之消費者。此含量定義為「預防有效劑量」。此外，精確 含量端視許多病患特定因素（如病患健康狀態及體重），及 食品基質效用而定。 148231.doc -13- 201100537 熟習本技藝者可適當調整該治療有效劑量及/或預防有 效劑量。 一般而言，本發明組合物含有治療有效劑量及/或預防 有效劑量之經「高溫瞬時」處理之微生物。 典型上，該治療有效劑量及/或預防有效劑量係介於每 日投與約0.005 mg至1000 mg之間之不具繁殖力經「高 溫瞬時」處理之微生物。 就數值量而言，經「高溫瞬時」處理之不具繁殖力微生 物可依相當於1〇4至1〇丨2等量cfu/g乾組合物之量存在於組合 物中。明顯地’因為不具繁殖力微生物不會形成菌落，因 此二應將此術語理解為從Μ至1〇12cfu/g具有繁殖力細菌所 獲得之不具繁殖力微生物之含量。此包括失活的、非活 的或死亡的微生物或以諸如祕片段 '或細胞壁或細胞質 化合物存在之微生物。換言之，組合物微生物含量係以該 ，生物量之菌落形成能力(cfu)表示，其中不論該等微生物 是為片段或該等狀態任—或所有之混合，均假設所有微生 物係活的’事實上該等微生物是為不具繁殖力(諸如失活 的或死亡的）。 ，佳地，該微生物含量係等同1〇4至1〇9他化乾組合物之 含量’甚至更佳地係等同1()5至1()8咖/§乾組合物之含量。 本發明組合物可為任何類型之組合物。該組合物可（例 士）、、’坐口經腸、非經腸（經皮下或經肌肉注射）、經陰道 内、經直腸内’局部或經眼投與。例如，本發明組合物可 為醫藥組合物、營養物質、食品添加劑、化妝用組合物、 148231.doc •14- 201100537 寵物飼料、食品、或飲品。 根據本發明之食物產品包括例如乳製品（諸如，發酵 乳’例如’優格、酪乳）；冰淇淋；煉乳；牛乳；乳製奶 油；調味乳；乳清類飲品；乳霜；奶精；巧克力；乾酪類 產品，湯類；醬汁；濃湯；調料；布丁；牛奶蛋糕；嬰兒 食品；營養調配物（諸如，這些是針對需要完整營養者， Ο

例如，用於嬰兒、兒童、青少年、成人、老年人或病危人 群）；穀類及榖物棒。 飲品包括（例如）以牛乳或優格為基礎之飲品、發酵乳、 蛋白質飲!m、咖啡、茶、能量飲品、大豆類飲品、水果及/ 或蔬菜飲品、果汁及/或蔬菜汁。 化妝用組合物可包括（例如）刮鬍水、洗髮精、滴眼液、 乳霜。 食品添加劑或藥劑可呈（例如）錠劑；膠囊；片劑；藥 囊；凝膠；或液體（例如營養溶液）之形式。 =等組合物進一步含有保護性水膠體（諸如，樹膠、蛋 白質、改質澱粉）、黏著劑、成膜劑、囊封劑/材料、壁/殼 材料、基質化合物、塗層、乳劑、表面活性劑、增溶劑 (油、脂肪、躐、印填脂等）、吸附劑、載劑、填充劑、併 用化口物、分散劑、濁濕劑、加工助劑（溶劑）、流變劑、 遮味劑1重劑、⑽化劑、膠凝劑、抗氧㈣及抗微生 這-亦可含有習去α醫藥添加劑及佐劑、賦形劑及稀 =匕括(但非限於)水、任何來源之凝膠、植物膠、木 酸鹽、滑石、糖、澱粉、阿拉伯膠、植物油、聚伸 148231.doc 201100537 烷二醇、矯味劑、防腐劑、穩定劑、乳化劑、緩衝劑、潤 滑劑、著色劑、潤濕劑、填充劑等。 此外，該等組合物可含有根據政府機構（如usrda)推介 之適宜經口或經腸投與之有機或無機載劑材料，及維生 素、礦物質微量元素及其他微量營養素。 根據組合物目的用途，本發明組合物可進一步包含其他 試劑。例如，可使用疼痛或發燒緩解劑，以盡可能減輕因 發炎病症引起之不適感。 可添加穩定劑，以穩定組合物及其組分。 可添加矯味劑及/或著色劑，以調節風味及賦予組合物 易於辨別及/或感覺宜人之顏色。 可添加益菌助生質。益菌助生質可於益生菌變為不具繁 殖力之前支援其等生長。益菌助生質亦可與存在於組合物 中及/或所添加之活的益生菌協同作用。 「益菌助生質」意指促進對健康有益的微生物及/或益 生菌於腸中生長之非可消化食品物質。其等不會在胃及/ 或上腸部中分解或被攝取其等之人類之胃腸道吸收，然 而，其等係藉由胃腸道微生物及/或藉由益生菌發酵。益 菌助生質係例如，由Glenn R Gibs〇i^Marcel B R〇b打如W ,

Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota:

Introducing the Concept of Prebiotics, J. Nutr. 1995 125： 1401-1412定義。 ‘ 根據本發明可使用之益菌助生質不受具體限制且包括促 進·®•生菌或對健康有益的微生物於腸中生長之所有食物。 148231.doc -16 - 201100537 適宜地，其等可選自由視需要含有果糖、半乳糖、甘露糖 之寡糖；膳食纖維；特定言之可溶性纖維、大豆纖維；菊 糖；或其等混合物組成之群。適宜的益菌助生質係果募糖 (FOS)、半乳寡糖（GOS)、異麥芽寡糖（IMO)、木寡糖 (XOS)、阿拉伯木寡糖（AXOS)、甘露寡糖（MOS)、大豆寡 糖、醣基蔗糖（GS)、乳蔗糖（LS)、乳酮糖（LA)、帕拉金募 糖（PAO)、麥芽寡糖、樹膠及/或其水解產物、果膠及/或其 水解產物。

可將其他益生菌添加至組合物。亦可添加所有益生菌微 生物。適宜地，益生菌係針對此目的選自由雙叉桿菌屬、 乳酸桿菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬、鏈球菌 屬、克魯維拉菌屬、酵母菌屬、 念珠菌屬（Ca«山·☆)、埃希氏菌屬組成之群，特定言之，選 自由龍根雙又桿菌、乳雙叉桿菌、動物雙叉桿菌、短型雙 叉桿菌、嬰兒雙叉桿菌、青春雙叉桿菌、嗜酸乳酸桿菌、 乾酪乳酸桿菌、副乾酪乳酸桿菌、唾液乳酸桿菌、乳酸乳 酸桿菌、羅伊氏乳酸桿菌、鼠李糖乳酸桿菌、約氏乳酸桿 菌、胚芽乳酸桿菌、唾液乳酸桿菌、乳酸乳球菌、屎腸球 菌/aeciwm)、釀酒酵母菌（tSacc/mT-owyce·? cerewWae)、布拉酵母菌（Sacc/zaromj/ce·?办ow/ari/fz·)、大腸 桿菌或其等混合物組成之群，較佳係選自由龍根雙叉桿菌 NCC 3001(ATCC BAA-999)、龍根雙叉桿菌 NCC 2705 (CNCM 1-2618)、龍根雙叉桿菌 NCC 490(CNCM 1-2170)、 乳雙叉桿菌NCC 281 8(CNCM 1-3446)、短型雙叉桿菌NCC 148231.doc -17· 201100537

2950(CNCM 1-3865)、副乾酪乳酸桿菌 NCC 2461 (CNCM I-2116)、約氏乳酸桿菌NCC 533(CNCM 1-1225)、鼠李糖乳 酸桿菌GG(ATCC53103)、鼠李糖乳酸桿菌NCC 4007(CGMCC 1.3724)、屎腸桿菌 SF68(NCc 2768 ; NCIMB1 041 5)、及其等混合物組成之群。 本發明組合物可用於任何哺乳動物，然而較佳係用於人 類或寵物。 該組合物亦可含有於日常膳食中及營養需求量中視為必 需之所有維生素及礦物質。關於特定維生素及礦物質之最 小需求業已建立。_質、維生素及視需要存在於組合物 中之營養物實例包括維生素A、維生素βι、維生素於、維 生素B6、維生素B12、維生素£、維生素κ、維生素維 生素D、葉酸、肌醇、菸酸、生物素、泛酸、膽鹼、鈣、 亞磷、碘、鐵、鎂、銅、鋅、錳、氯、鉀、鈉、硒、鉻、 :牛磧酸、及L-肉鹼。一般係以鹽形式添加礦物質。特 '物質及其他維生素之存在及含量會根據未來消費者變 裡京曰買源 本發明組合物可含有 化合物源及至少一種脂質源 =用任何適宜腾食蛋白f，例如，動物蛋白（諸如， 肉蛋白及印蛋白)；植物蛋白(諸如大豆蛋白、小 或其等組合。 ）’游離細基駄之混合物；

乳蛋白（諸如，酪I 蛋白及礼h )及大豆蛋白是特佳的。就 148231.doc •18- 201100537 乳清蛋白而言，該蛋白質源係以酸乳清或甜乳清或其等混 口物為基礎’且可包括所需之任何比例之乳白蛋白 乳球蛋白。 ~ 然而’特定言之，若組合物係嬰兒用調配物，則該蛋白 貴源係以經改質甜礼清為基礎者較佳。甜乳清係乾酪製造 中很容易取得之副產物’且時常用於製造以牛乳為基礎之 嬰兒用調配物。 ❹ 〇 該蛋白質可為完整或經水解蛋白質，或完整與經水解蛋 白質之此口物。意欲提供部份水解之蛋白質(水解程度介 於2與20%之間）。 若需要經水解蛋白質，則水解方法可如所需般實施且传 為本技藝已知的。例如，乳清蛋白水解產物可藉由一或多 個步驟’以酵素方法水解乳清部份而製成。 若本發明組合物含有蛋白質源，則組合物中之蛋白質或 質等仏物之含里-般係介於16至7 5以⑽仟卡組合物 之間。 人特別就營養調配物而言，該蛋白質源應符合必需胺基酸 含量之最小需求。 若該組合物含有破水化合物源，則所用碳水化合物之類 1不，具體限制。可使用任何適宜碳水化合物，例如，蔗 择乳糖帛萄糖、果糖、玉米糖毁固形物、麥芽糖糊 :、：粉及其等混合物。可使用不同碳水化合物源之組 炭化。物較佳可提供該組合物3 至8⑽之能量。 例如’違組合物之碳水化合物含量可為9錢&⑽仟卡組 148231.d〇, 201100537 合物。 * ^、且a物含有脂質源，則所用脂質之類型不受具體限 。〇、’且σ物包含脂質源，則該脂質源可提供該組合物 5/。至70%之能量。可添加諸如遍、ara及/或職之長鍵 n-3^/或n_6多不飽和脂㈣。可利用菜籽油、玉米油、高 ^向日葵'由及中鏈甘油三酸醋油之掺合物獲得適宜的脂 肪特性。該組合物之脂質源含量可為1.5至7 gmo仟卡組 合物。 亦可添加腾食纖維。膳食纖維是可溶的或不可溶的，而 一般係以兩種腾食纖維之摻合物較佳。膳食纖維之適當來 '原G括大豆、豌豆、燕麥、果膠、瓜耳膠、阿拉伯膠、果 寡糖、半乳寡糖、唾液酸乳糖及衍生自動物乳之寡糖。較 佳纖維摻合物係菊糖與短鏈果寡糖之混合物。 本發明組合物可藉由本技藝已知之任何方式製備。例 如’若該組合物係諸如嬰兒用誠物之營養調配物，則其 可藉由將蛋白質源、碳水化合物源及脂肪源依適當比例換 合一起製備。若使用乳化劑時，則其可包含於該摻合物 中。可在此時添加維生素及礦物質，但通常稍後再添加， 以避免高溫產生降解作用。任何親脂性維生素、乳化劑及 類似物可在摻合之前先溶解至脂肪來源中。隨後可混入水 (較佳係經逆滲透之水）’以形成液體混合物。 隨後熱處理該液體混合物，以減少細菌負載量。例如， 該液體混合物快速地加熱至約12(rc至約14(rc溫度範圍達 約5秒至約30秒。此係藉由蒸氣注射或藉由熱交換器（例 148231.doc •20· 201100537 如’平板式熱交換器）完成。 然後，例如’藉由急速冷卻，將該液體混合物冷卻至約 6〇°C至約85°C。隨後以兩步驟將該液體混合物均質化：第 一步驟中使用約7 MPa至約40 MPa及第二步驟中使用 約2 MP a至約14 MP a。隨後進一步冷卻經均質化混合物， 以添加任何熱敏感組分，諸如，維生素及礦物質。 此時宜調整該經均質化混合物至標準pH及固體含量。將 〇 該經均質化混合物轉移至適宜的乾燥設備（諸如，喷霧乾 燥器或冷凍乾燥器），並轉化為粉末。該粉末應具有小於 約5重量。/。之水含量。 益生菌可根據任何適宜方法培養及製備，（例如）藉由冷 束乾燥或喷霧乾燥法添加至營養組合物中。隨後將益生菌 添加至該組合物中’然後熱處理該組合物，以減少細菌負 載量。此作法會自動使至少一部份益生菌不具繁殖力。 當然’另一種方式是亦可單獨高溫瞬時處理益生菌成為 〇 不具繁殖力益生菌，及隨後以（例如）液體或粉末形式添加 至該組合物中。 所選益生菌可根據任何適宜方法培養及製備，（例如）藉 由冷束乾燥或喷霧乾燥法添加至組合物中。或者，可自專 門供應商購置適宜形式之現成可用之細菌製備物，添加至 食品中。 本發明者藉由分析活的及經「高溫瞬時」處理之益生菌 衣備物之免疫作用，評估益生菌誘發人類血液細胞分泌特 定細胞激素之能力。 148231.doc -21- 201100537 將活的益生菌之免疫作用與經「高溫瞬時」處理之細胞 免疫作用比較。發現經「高溫瞬時」處理之益生_㈣發 與其等活的對應物不同程度之細胞激素分泌。 相較於活的對應物，經「高溫瞬時」處理之益生菌會誘 發較少的促發炎性細胞激素（TNF-a、lFN_Y、IL_12p4〇)， 同時維持或誘發較高的^_10分泌。任何經「高溫瞬時」 處理之益生菌所得之比值均低於活的細 胞。相反，於85。〇處理20分鐘之細菌會比活的細胞誘發更 多促發炎性細胞激素及較少之IL_1〇，而導致較高的比_ 12P40/IL-l〇比值，其表示該熱處理類型係本發明所必需。 藉由PBMC於活體外與益生菌培養所獲之IL l2p4〇/iL_i〇 比值可預測活體内抗發炎效用（F〇lign0，B•等人，2〇〇7，

WorldJ.Gastroenterol. 13:236-243)。 本^明亦係關於用於治療或防止發炎病症之本發明組合 物。 因此，一個實施例係本發明於製備產品供治療或防止發 炎病症上之用途。 利用本發明所製備之組合物可治療或防止發炎病症不受 具體限制。 例如，其等係選自由諸如敗血症之急性炎症；燒傷；及 慢性腸病（諸如，發炎性腸病，例如，克隆氏病、潰瘍性 結腸炎、結腸囊炎）；壞死性小腸結腸炎；皮膚炎症（諸 如，UV或化學物品導致之皮膚炎症、濕疹、反應性皮 膚）’大腸激爍症；眼睛炎症；過敏性哮喘病；肥胖相關 148231.doc -22- 201100537 =炎症；與年齡相關之輕度炎症、及其等組合所組成之 、，本發明亦涵蓋i方法，該方法提供給微生物（例如， 盈生菌及/或乳品發酵菌培養物，特定言之，活性益生菌 及/或活=品發㈣培養物）抗發炎效㈣該方法改良微 t物（特疋51 ’活性益生菌及/或活性乳品發酵菌培養物） 抗么炎效用’該方法包含步驟：於至少715。〇高溫下短時 Ο Ο =處理微生物至少！秒，例如，於贼之高溫下短 時間處理達約1至120秒。 若於此方法中使用活的益生菌及/或乳品發酵菌培養 物，則「高溫瞬時」處理會使至少一部份益生菌及/或乳 品發酵菌培養物不具繁殖力。 該「高溫瞬時」處理會使至少90。/。，較佳至少95%，更 佳至少98%，最佳至少99%，理想地至少μ，。，最理想係 所有益生菌不具繁殖力。 #於本發明較佳實施例中，該方法包含步驟：將活的益生 囷添加至組合物’使含有益生菌之組合物經受「高溫瞬 時」處理。 為微生物亦可先經熱處理，然後補充至產品中。該組合 物可為任何組合物，但為(例如)待補充益生菌之食品或營 養品或飲品。 根據本發明亦涵蓋一種方法，該方法提供給包含微生物 \例如▲生菌及/或乳品發酵菌培養物，較佳為活性益生 菌及/或活性礼品發酵菌培養物）組合物具有抗發炎特性或 14823l.d0< -23. 201100537 該方法改良既有抗發炎特性，該方法包含步驟：將該微生 物經受至少71.5t達至少i秒之高溫處理，例如，約71.5至 150°C下達約1至120秒之短時間高溫處理。 「高溫瞬時」處理步驟可在產業設施中便利地完成，但 亦可利用（例如）蒸鋼在家中完成。如此—來，該抗發炎效 用可在消費前直接賦予產品。 熟習本技藝者將理解，於不脫離本發明所述範圍下，吾 人可任意地組合本文所述之本發明所有特徵。特定言之， 針對本發明用途及方法所描述之特徵可應用於組合物及本 發明之方法，且反之亦然。 本發明之其他優勢及特徵將自以下實例及圖獲知。 圖1A及B顯示經「高溫瞬時」處理之益生菌之抗發炎免 疫作用之增強。 圖2顯示非抗發炎益生菌菌株經由「高溫瞬時」處理後 於活體外變為抗發炎，即，展現明顯的抗發炎免疫作用。 圖3A及B顯示用於市售產品中之益生菌菌株經由「高溫 瞬時」處理後於活體外展現增強或新的抗發炎免疫作用。 圖4 A及B顯示乳品發酵菌菌株（即，Lc 1發酵劑菌株）經由 高温熱處理後於活體外展現增強或新的抗發炎免疫作用。 圖5顯示非抗發炎益生菌菌株經由hTst處理後，於活體 外展現抗發炎免疫作用。 圖6:呈其等活的及經熱處理（14(rc，15秒）形式之益生 菌及乳品發酵菌菌株所產生之PBMC數據（11^12卩40、吓1^-γ、TNF-α、IL-10)之主分量分析法》各點表示藉其ncc編 14823l.doc •24- 201100537 號或名稱確定之活的或經熱處理之菌株。 圖7顯示活的及經熱處理（85。〇，2〇分鐘）菌株之il_ 12p40/IL-10比值。總而言之，85〇C20分鐘之熱處理會導致 IL-12p40/IL-10比值升高，正與本發明之「高溫瞬時」處 理（圖1、2、3、4及5)相反。 實例： 方法 細菌製備物： 〇 以活的益生菌所傳送對宿主免疫系統之健康效益被視為 具有菌株特異性。在活體外（PBMC試驗）可誘發高濃度IL_ 10及/或誘發低濃度促發炎細胞激素之益生菌業經證明係 活體内強力的抗發炎菌株（Folign6，B.，等人，2007 , World J.Gastroenterol. 13:236-243) ° 使用數種益生菌菌株研究經熱處理之益生菌之抗發炎特 性。此等菌株係龍根雙叉桿菌NCC 3001、龍根雙又桿菌 Q NCC 2705、短型雙叉桿菌NCC 2950、乳雙又桿菌NCC 2818、副乾酪乳酸桿菌NCC 2461、鼠李糖乳酸桿菌NCC 4007、乾酪乳酸桿菌NCC 4006、嗜酸乳酸桿菌NCC ' 3009、乾酪乳酸桿菌ACA-DC6002(NCC 1825)、及尼梭大 腸桿菌。數種發酵劑培養物（包括商業上用於產生]siestlS Lcl發酵產物之某些菌株）亦被測試：嗜熱鏈球菌NCC 2019、嗜熱鏈球菌NCC 2059、保加利亞乳酸桿菌NCC 15 及乳酸乳球菌NCC 2287。 將細菌細胞置於5至15L生物反應器中，以針對每一菌株 148231.doc -25- 201100537 最么化的條件培養。所有典型的細菌生長培養基均可使 用。此荨培養基係熟習本技藝者熟知。當要將pH調節至 5.5時’則持續添加3〇%驗性溶液（NaOH或Ca(〇H)2)。當足 量時’無氧條件係以對頂空鼓送C〇2加以維持。大腸桿菌 則是在標準有氧條件下培養。 細菌細胞係以離心法（5〇〇〇xg，4。〇收集，並再懸浮於足量 磷酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS)中，以獲得約1〇9至1〇!❹Cfu/ml 之最終濃度。將一部份製備物混與丨5%甘油冷凍於_8(rc 下。另一部份細胞則經由下列熱處理： - 超高溫：140°C達15秒，藉由間接蒸氣注射； -高溫瞬時（HTST) : 74。(：、90°C 及 120。(：達 15秒，藉 由間接蒸氣注射； - 低溫長時（85°C ’ 20分鐘），於水浴中。 經由熱處理後’立即將樣品凍藏於_80°c下直至使用。 於活體外進行細菌製備物之免疫作用分析： 評估活的及經熱處理之細菌製備物之免疫作用（即，於 活體外誘發人類血液細胞分泌特定細胞激素之能力）。從 滤血器分離出人類外周血液單核細胞（PBmc)。利用細胞 密度梯度分離後，收集單核細胞，並以Hank，s平衡鹽溶液 清洗兩次。隨後將細胞再懸浮於補充丨〇%胎牛血清（法國巴 黎Bi〇Concept)、1% L-榖胺醯胺（sigma)' 1%青黴素/鏈黴 素（Sigma)及0.1%健大黴素（Sigma)之艾氏改良杜氏培養基 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(IMDM > Sigma) 中。隨後，將PBMC(7><106個細胞/孔）與活的及經熱處理之 148231.doc -26 - 201100537 細菌（等同於7xl06 cfu/孔）一起於48孔平板中培養36小時。 測試活的及經熱處理之細菌對來自8個個別供體PBMC(分 成兩組實驗）之作用。培養36小時後，冷凍培養皿並維持 於-20°C直至要測定細胞激素。細胞激素作用分析係以針 對活的細菌及其等經熱處理之對應物同時平行進行（即， 以相同實驗於同一批次PBMC進行）。 培養36小時後，根據製造商說明書，以ELISA測定細胞 培養物上清液中之細胞激素（IFN-γ、IL-12p40、TNF-α及 IL-10)濃度（R&D DuoSet 人類 IL-10、BD OptEIA 人類 IL-12p40、BD OptEIA人類 TNF-a、BD OptEIA人類 IFN-γ)。 IFN-γ、IL-12p40及TNF-a係促發炎細胞激素，而IL-10係 強力抗發炎媒介體。其結果係以4個個別供體之平均 (pg/ml)+/- SEM表示，且結果係代表各藉由4個供體實施之 兩個獨立實驗。針對每一菌株計算出IL-12p40/IL-10比 值，作為活體内抗發炎作用之預測值（FoligM，B.，等 人，2007，World J. Gastroenterol. 13:236-243) ° 將針對每一菌株以ELISA(參見上文）測定之細胞激素數 值輸入 BioNumerics ν5· 10 軟體（Applied Maths，Sint-MartensLatem，比利時）。對此組數據進行主分量分析 (PCA，尺寸標往技術）。此分析中包括減去數字之平均數 及除以數字之方差。 結果 以超高溫（UHT)/高溫瞬時（HTST)類似處理法所產生之抗 發炎作用分析 148231.doc -27- 201100537 將要研究的益生菌菌株經受一系列熱處理（超高溫 (UHT)、咼溫瞬時（HTST)及85°C達20分鐘），並於活體外比 較其等免疫作用與活的細胞免疫作用。當活的微生物（益 生菌及/或乳品發酵菌培養物）與人類PBMC —起培養時， 其會誘發產生不同濃度的細胞激素（圖1、2、3、4及5)。此 荨4政生物之熱處理會隨溫度變化之方式改變PBMe所產生 之細胞激素濃度。「高溫瞬時」處理（120。〇或14〇°c達15秒） 會產生具有抗發炎免疫作用之不具繁殖力細菌（圖1、2、3 及4)。事實上，經UHT-類似處理之菌株（14〇°c，15秒）會 誘發產生較少的促發炎細胞激素（TNF_a、IFN_y、 12p40) ’而同時維持產生il_i〇或誘發額外產生更多化_ 1 〇(相對於活的對應物）。任何經UHT類似處理之菌株所得 的IL-12p40/IL-10比值均低於活的細胞（圖1、2、3及4)。此 結果亦適用於經過HTST類似處理（即，經受12〇。〇達1 5秒 (圖1、2、3及4)，或74°C及9(TC達15秒處理（圖5)之細 菌）。熱處理（UHT-類似處理或HTST-類似處理）對益生菌菌 株（圖1、2、3及5)與乳品發酵菌培養物（圖4)對活體外免疫 作用具有相似影響。對活的及經熱處理（丨4〇它，1 5秒）之益 生囷及乳品發酵菌培養物產生之PBMC數據之主分量分析 顯示，活菌株會沿整個X軸分佈，自低（左側）至高（右側）促 發炎細胞激素誘導物可說明菌株於活體外會展現差異極大 之免疫作用。經熱處理之菌株群集於圖左側，其顯示經熱 處理之菌株所誘發之促發炎細胞激素低得多（圖6)。相反， 於85 C下熱處理20分鐘之細菌比活細胞誘發更多促發炎細 148231.doc -28- 201100537 胞激素及更少IL-10，而導致較高的IL-12p40/IL-10比值（圖 7)。 藉由UHT類似處理及HTST類似處理可增強或產生抗發 炎作用。 經UHT及HTST處理之菌株會展現出具有抗發炎作用， 不論該等微生物各自原有免疫作用（活細胞）為何。已知在 活體内具有抗發炎作用且在活體内展現出抗發炎作用之益 生菌菌株（龍根雙叉桿菌NCC 3001、龍根雙叉桿菌NCC 2705、短型雙叉桿菌NCC 2950、乳雙叉桿菌NCC 2818)已 顯示於「高溫瞬時」處理後，會於活體外展現出增強之抗 發炎作用。如圖1所示，經UHT類似處理之雙叉桿菌菌株 之IL-12p40/IL-10比值低於活的對應物，藉此顯示經UHT 類似處理之樣品具有改良之抗發炎作用。更突顯地，非抗 發炎活的菌株經以UHT類似處理及HTST類似處理後所產 生之抗發炎作用亦已證實。活的鼠李糖乳酸桿菌NCC 4007 及副乾酪乳酸桿菌NCC 2461兩者均會在活體外展現出高 IL-12p40/IL-10比值（圖2及5)。該兩種活的菌株經證明不具 保護小鼠對抗TNBS所誘發之結腸炎。經「高溫瞬時」處 理之鼠李糖乳酸桿菌NCC 4007及副乾酪乳酸桿菌NCC 2461所誘發之IL-12p40/IL-10比值會急劇下降，低至與雙 叉桿菌菌株所得之比值。此等低IL-12p40/IL-10比值係因 為產生低濃度之IL-12p40所致，而且合併出現IL-10分泌無 變化（鼠李糖乳酸桿菌NCC 4007)或急劇誘發（副乾酪乳酸 桿菌 NCC 2461)(圖 2)。 148231.doc -29- 201100537 結果： - 藉由UHT類似熱處理及HTST類似熱處理，可增強活的 微生物（例如，龍根雙叉桿菌NCC 2705、龍根雙叉桿菌 NCC 3001、短型雙叉桿菌NCC 2950、乳雙叉桿菌NCC 2818)的抗發炎作用。 - 非抗發炎活的微生物（例如鼠李糖乳酸桿菌NCC 4007、 副乾酪乳酸桿菌NCC 2461、乳品發酵菌嗜熱鏈球菌 NCC 2019)經UHT類似熱處理及HTST類似熱處理可產 生抗發炎作用。 - 分離自商業販售產品之菌株（包括益生菌大腸桿菌菌 株）亦證實具有抗發炎作用（圖3A及B)。 UHT/HTST類似處理法對所有經測試之益生菌及乳品發 酵菌（例如，乳酸桿菌屬、雙叉桿菌屬及鏈球菌屬）之作用 均類似。 將UHT/HTST類似處理法應用於展現不同活體外免疫作 用之數種乳酸桿菌、雙又桿菌及鏈球菌。經UHT/HTST類 似處理後，所有菌株相較該等活的對應物誘發較少促發炎 細胞激素（圖1、2、3、4、5及6)，此證明UHT/HTST類似 處理法對所得不具繁殖力細菌之免疫特性之效用可推論至 所有益生菌，特定言之，乳酸桿菌及雙叉桿菌及特定大腸 桿菌菌株及所有乳品發酵菌培養物，特定言之，鏈球菌、 乳球菌及乳酸桿菌。 【圖式簡單說明】 圖1A及B顯示：經「高溫瞬時」處理益生菌之抗發炎免 148231.doc -30- 201100537 疫作用之強化現象； 圖2顯示：非抗發炎益生菌菌株經由「高溫瞬時」處理 後’於活體外變為抗發炎，即，展現出明顯的抗發炎免疫 作用； 圖3 A及B顯示：商業販售產品中所用之益生菌菌株經 「高溫瞬時」處理後’於活體外展現出增強或新穎的抗發 炎免疫作用； 圖4A及B顯示：乳品發酵菌菌株（即，Lcl發酵菌菌株）經 高溫熱處理後’於活體外展現出增強或新穎的抗發炎免疫 作用； 圖5顯示：非抗發炎益生菌菌株經HTST處理後，於活體 外展現出抗發炎免疫作用； 圖6 :活的及經熱處理〇4〇°C，15秒）形式之益生菌及乳 品發酵菌菌株所產生之PBMC數據（IL-12p40、IFN-γ、 TNF-α、IL-10)之主分量分析。各點代表以NCC編號或名 稱鑑別之活的或經熱處理之菌株；及 圖7顯示：活的及經熱處理（85°C，20分鐘）菌株之IL-12p40/IL-10比值。總而言之，85°C達20分鐘之熱處理會導 致IL-12p40/IL-10比值升高，正與本發明「高溫瞬時」處 理（圖1、2、3、4及5)相反。 148231.doc • 31-

Claims (1)

1. 201100537 七、申請專利範圍： 1. 一種包含微生物之抗發炎組合物，其中該微生物係經受 至少71.5C之南溫處理達至少1秒。 2·如請求項1之組合物，其中該微生物係選自由食品級微 生物’例如益生菌、乳品發酵菌培養物或其組合所組成 ' 之群。 3.如請求項1之組合物，其中該高溫處理係於約71.5至 150°C高溫處理達瞬時約1至120秒，且較佳係高溫/瞬時 O (HTST)處理或超高溫（UHT)處理。 4·如請求項1至3中任一項之組合物，其中至少90%，較佳 至少95%，更佳至少98%，最佳至少99%，理想地至少 99.9%，最理想地所有該等益生菌是為不具繁殖力的。 5·如請求項1至3中任一項之組合物，其中該等益生菌及/或 乳品發酵菌係選自由雙叉桿菌、乳酸桿菌、丙酸桿菌或 其等組合’例如，龍根雙又桿菌（Bi$dobacterium hngum)、 乳雙叉桿菌/ίκ他）、動物雙又桿菌 〇 {Bifidobacterium animalis)、短型雙又桿菌（Bifdobacterium 6reve)、嬰兒雙叉桿菌（5拆份）、青春雙叉桿 . 菌（执adb/escenfe)、嗜酸乳酸桿菌 aciV/qpMws)、乾酷·乳酸桿菌case/)、副乾絡乳酸 桿菌（Lactobacnius paracasei)、嘴液乳酸桿菌（Lactobacillus saHvarius)、羅伊氏乳酸桿菌（LactobaciHus reuteri)、良李糖乳 酸辑菌（Lactobacillus rhamnosus)、約氏乳後得菌（Lactobacillus 、胚芽乳酸桿菌、發酵乳酸 148231.doc 201100537 择蛰[Lactobacillus fermentum)、乳酸乳球菌 /acfe)、嗜熱鏈球菌（及re/Jiococews 、乳酸乳球菌 (Lactococcus /aci的、雙乙醯乳酸鏈球菌（zaciococcWiS i/iace^y/aciiW)、乳脂乳球菌（Lactococcws cremorz··?)、保加利亞乳 酸桿菌（Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳後桿菌（Lactobacillus helveticus) ' ^ ^ ^ |L Si # ϋ {Lactobacillus delbrueckii) ' Λ B 桿菌（Esc/zer/c/^o co/i·)及/或其等混合物組成之群。 6.如請求項1至3中任一項之組合物，其中該等益生菌及/或 乳品發酵菌係選自由龍根雙叉桿菌NCC 3001、龍根雙叉 桿菌NCC 2705、短型雙叉桿菌NCC 2950、乳雙叉桿菌 NCC 2818、副乾酪乳酸桿菌NCC 2461、鼠李糖乳酸桿 菌NCC 4007、嗜熱鏈球菌NCC 2019、嗜熱鏈球菌NCC 2059、乾酪乳酸桿菌NCC 4006、嗜酸乳酸桿菌NCC 3 009、乾酪乳酸桿菌ACA-DC6002(NCC 1825)、尼梭大 腸桿菌（^c/2ehc/n_a co" Nissle)、保加利亞乳酸桿菌NCC 15、乳酸乳球菌NCC 2287或其等組合所組成之群。 7 _如請求項1至3中任一項之組合物，其中該組合物可經 口、經腸、例如經皮下或經肌肉之非經腸、經陰道内、 經直腸、或局部或經眼投與。 8. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該組合物係意欲 投與人類或寵物。 9. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該組合物每曰劑 量含有約0.005 mg至1000 mg不具繁殖力的微生物。 1 0. —種如請求項1至9中任一項之組合物之用途，其係用於 201100537 製備供治療或防止發炎病症之產品。 11. 如請求項Η)之用途，其中該發炎病症係選自由諸如敗血 病之心生炎症，燒傷；及諸如發炎性腸病之慢性炎症， =如’克隆氏病、潰療性結腸炎、囊袋炎；壞死性小腸 結腸炎；大腸急燥症；諸如υν或化學物品引發之皮膚炎 症濕療、反應性皮膚之皮膚炎症；眼部炎症；過敏反 Ο Ο 應、哮喘病；肥胖相關性炎症；與年齡有關之輕度炎 症、及其等組合所組成之群。 12. -種用以提供給微生物(例％，益生菌及/或乳品發酵菌 培養物）抗發炎效用或用以改良微生物（例如，益生菌及/ 或乳品發酵菌培養物）抗發炎效用之方法，其包含步驟： 將該等微生物經受至少me高溫處理達至少【秒。 13. 如請求項12之方法，其中該「高溫瞬時」處理導致至少 9〇%，較佳至少95%，更佳至少98%，最佳至少㈣，理 想地至少".9%，最理想地所有該等益生菌/或乳品發酵 菌培養物不具繁殖力。 14·如請求項12至13中任-項之方法，其包含步驟：將活性 微：物添加至組合物中’並將該含有微生物之組合物經 受 咼溫瞬時」處理。 15·^用以提供給包含微生物（例如，益生菌及/或乳品發 酵函培養物）組合物抗發炎特性或用以改良其既有抗發炎 特性之方法’其包含步驟：將該等微生物經受至少 71_5 C鬲溫瞬時處理達至少1秒。 148231.doc