TW201036627A - Stable antibody compositions and methods for stabilizing same - Google Patents

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Ivan R Correia
Czeslaw H Radziejewski
Wolfgang Fraunhofer
Nicholas W Warne
Angela Kantor
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Abbott Lab
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Description

201036627 六、發明說明： 【先前技術】 介白素-12(IL-12)及相關細胞激素IL-23為細胞激素之IL-12超家族之成員，其共有通用之P40次單元（Anderson等 人，（2006) Springer Semin. Immunopathol. 27: 425-42) ° IL-12主要刺激Thl細胞分化及隨後分泌干擾素-γ，而IL-23 優先刺激天然T細胞分化成效應T輔助細胞（Thl7)，其分泌 IL-17( — 種促發炎介體）(Rosmarin 及 Strober, (2005) J. Drugs Dermatol. 4: 318-25 ; Harrington 等人，（2005) Nature Immunol. 6: 1123-32 ; Park等人，（2005) Nature Immunol. 6: 1132-41)。 人類介白素12(IL-12)為一種具有獨特結構及多效作用之 細胞激素（Kobayashi等人，（1989) J. Exp. Med. 170: 827-845 ; Seder等人，（1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 10188-92 ; Ling 等人，（1995) J· Exp. Med. 154: 116-127 ; Podlaski等人，（1992) Arch. Biochem. Biophys. 294: 230-237)。IL-12為一種包含35 kDa次單元（p35)及40 kDa次單 元（p40)之異源二聚蛋白（稱作「p7〇次單元」），p35與p4〇 次單元係由二硫橋連接在一起。異源二聚蛋白主要由抗原 呈現細胞產生，該等抗原呈現細胞為諸如單核細胞、巨噬 細胞及樹突狀細胞。此等細胞類型亦分泌相對於p7〇次單 元過量的P4〇次單元。p4〇及P35次單元在遺傳上不相關， 且二者均未報導具有生物活性，但p40同源二聚體可充當 IL-12拮抗劑。IL-12在與涉及免疫反應及發炎反應之若干 144870.doc 201036627 疾病相關的病理學方面起關鍵作用。對IL_丨2、其生物活 性及其在疾病中之作用的評述可見於Gately等人，（1998)
Ann. Rev. Immunol. 16: 495-521 中。 . 在力肖匕上’ IL-12在調控主導自體免疫病症之起始及發 展的抗原特異性T輔助1型（Thl)淋巴細胞與2型（Th2)淋巴細 胞之間的平衡方面起核心作用，且在Thl淋巴細胞分化及 成熟之調控方面至關重要。Thl細胞所釋放之細胞激素具 有發炎性且包括干擾素γ(Π?Ν γ)、IL-2及淋巴毒素（LT)。 〇 Th2細胞分泌1L-4、IL-5、IL-6、IL-10及IL-13以有利於體 液免疫、過敏反應及免疫抑制。 人類介白素23(IL-23)為一種包含19 kDa次單元（pi9)及通 用之40 kDa次單元（p40)的異源二聚蛋白，pl9與p4〇次單元 係由二硫橋連接在一起。類似於IL-12，IL-23主要由抗原 呈現細胞產生’ §亥專抗原呈現細胞為諸如單核細胞、巨嗟 細胞及樹突狀細胞。IL-23之主要作用包括刺激CD4+ 丁細 q 胞之子組（亦稱作IL-17 T細胞或Thl7)產生細胞激素IL· 17。繼而，IL-17為建立及延續自體免疫發炎，從而誘導 内皮細胞及巨噬細胞產生促發炎細胞激素之關鍵組份 - (Kastelein等人，（2007) 及ev. /mmimo/· 25: 221-42)。 .與Thl反應在自體免疫疾病中占主導及IFN 丫及江-丨了之 促發炎活性一致’ IL-12及IL-23在與許多自體免疫疾病及 發炎疾病相關之病理學方面起主要作用，該等疾病為諸如 類風濕性關節炎（RA)、多發性硬化症（MS)、牛皮癣、騰島 素依賴性糖尿病及克羅恩氏病（Crohn's disease，CD)。 144870.doc 201036627 與健康對照相比，已在RA患者之滑液中偵測到較高含 量之 IL-12 p70(Morita 等人，（1998) Arthritis and Rheumatism 41: 306-3 14)。RA滑液中細胞激素信使核糖核 酸（mRNA)之表現概況主要鑑別Thl細胞激素（Bucht等人， (1996) Clin. Exp. Immunol. 103: 347-367)。使用缺乏 IL-23 之pl9次單元或IL-12/23之p40次單元的基因靶向小鼠，IL-23顯示對膠原蛋白誘發性關節炎的發展至關重要（Murphy 等人，（2003) «/·五xp. Mec/. 198(12): 1951-1957)。 人類MS患者已展示如急性MS斑塊中之p40 mRNA含量 所證實的IL-12/IL-23表現增加（參見，例如Windhagen等 人，（1995) J. Exp. Med. 182·· 1985-96)。另外，與對照T細 胞相比，用MS患者的表現CD40L之T細胞對抗原呈現細胞 進行離體刺激會增加IL-12產生，此與CD40/CD40L相互作 用為IL-12之有效誘導因子的觀測結果一致。使用缺乏IL-23 之基 因靶向 小鼠， IL-23 顯 示對腦 部自體 免疫發 炎至關 重要（Cua等人，（2003) TVaiwre 421: 7440748)。 在CD患者之腸黏膜中已觀測到IFN γ及IL-12之表現增加 (Fais 等人，（1994) J. Interferon Res. 14: 235-238 ；
Parronchi 等人，（1997) Am. J· Path· 150: 823-832 ； Monteleone 等人，（1997) Gastroenterology 112: 1169- 1178 ;及 Berrebi 等人，（1998) Am. J. Path· 152: 667_ 672)。CD患者之固有層中T細胞之細胞激素分泌概況的特 徵為占主導之Thl反應，包括IFN γ含量大幅升高（Fuss等 人，（1996) J. Immunol. 157: 1261-1270)。此外，CD患者 144870.doc 201036627 之結腸組織切片展示諸多表現IL-12之巨噬細胞及表現IFN γ之 T細胞（Parronchi 等人，（1997) Am. J. Path. 150: 823-832)。在患有克羅恩氏病之患者及發炎性腸病之小鼠模型 中亦已觀測到IL-23之表現增加。在結腸炎之小鼠模型 中，IL-23為T細胞介導之結腸炎所必需且為經由IL-17及 w IL-6依賴性機制促進發炎所必需（參見，例如評述：Zhang 等人，(2007) Intern. Immunopharmacology Ί.. 409-4Ί6)。 牛皮癬性皮膚病變中IL-12/IL-23 p40及IL-23 pl9信使 〇 RNA之過度表現表明用IL-12/23 p40次單元蛋白之中和抗 體抑制IL-12及IL-23可提供有效治療牛皮癣之治療方法 (Yawalkar等人，（1998) J. Invest. Dermatol. 111: 1053-57 ; Lee等人，（2004) J. Exp. Med. 199: 125-30 ; Shaker等人， (2006) Clin. Biochem. 39: 119-25 ; Piskin等人，（2006) J. Immunol. 176: 1 908-1 5 ;亦參見新近評述：Torti等人， (2007) J. Am. Acad. Dermatol. 57(6): 1059-1068 ; Fitch等 人，(2007) 9: 461-467) ° 兩 o 種細胞激素均有助於牛皮癖之1型T輔助細胞（Thl)免疫反 應發展，但各具有獨特作用（Rosmarin及Strober, (2005) J. - Drugs Dermatol. 4: 318-25 ; Hong 等人，（1999) J. _ Immunol. 162: 7480-91 ; Yawalkar等人，（1998) J. Invest.
Dermatol. Ill: 1053-57)。此項技術中顯然需要該等治療牛 皮癖之治療方法。 歸因於人類IL-12及IL-23在多種人類病症中之作用，已 設計出抑制或對抗IL-12/IL-23活性之治療策略。詳言之， 144870.doc 201036627 已尋求結合並中和IL-12/IL-23之p40次單元的抗體作為抑 制IL-12/IL-23活性之方式。一些最早期抗體為由經IL-12 免疫之小鼠的淋巴細胞製備之融合瘤所分泌的鼠類單株抗 體（mAb)(參見，例如Strober等人之PCT公開案第WO 97/15327號；Neurath等人，（1995) J. Exp. Med. 182: 1281-1290 ; Duchmann等人，（1996) J. Immunol. 26: 934-938) ° 此等鼠類IL-12抗體在活體内之使用因與小鼠抗體投與人 類相關之問題而受限，該等問題為諸如血清半衰期較短、 不能觸發某些人類效應功能及在人體内引發針對小鼠抗體 之不當免疫反應（「人類抗小鼠抗體」（HAMA)反應）。 一般而言，對克服與在人類中使用完全鼠類抗體相關之 問題的嘗試涉及將該等抗體進行遺傳工程改造為更「擬似 人類（human-like)」。舉例而言，已製備出嵌合抗體，其中 抗體鏈之可變區源自鼠類且抗體鏈之恆定區源自人類 (Junghans等人，（1990) Cancer Res. 50: 1495-1502 ; Brown 等人，（1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2663-2667 ; Kettleborough等人，（1991) Protein Engineering 4: 773-783)。然而，因為此等嵌合抗體及人類化抗體仍保留一些 鼠類序列，故其仍可能引發不當免疫反應（人類抗嵌合抗 體（HACA)反應），在長期投藥時尤其如此。 與鼠類抗體或其衍生物（例如嵌合抗體或人類化抗體）相 比較佳之IL-12/IL-23抑制劑為完全人類抗IL-12/IL-23抗 體，因為此類藥劑即使長期使用亦不會引發HAMA反應。 已描述以高親和力及緩慢解離動力學結合人類IL-12/IL-23 144870.doc 201036627 之p40次單元且具有中和人類江_12(包括hIL_12誘導之植物 金球凝集素母細胞增殖及hIL-12誘導之人類IFNy產生）之能 力的重組人類抗體（參見美國專利第6,914,128號）。 單株抗體（Mab)對特異性抗原之選擇性使其成為極佳之 治療性候選物。然而，歸因於抗體分子之結構，其易受酶 促降解及非酶促降解損害。舉例而言，抗體在高溫下長期 儲存會使該抗體發生非酶促降解（C〇nneU，G E •及R H. Painter (1966) Can. J. Biochem. 44(3): 371-9 ； Cordoba, A.J.等人 ’（2005) J. chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 818(2): 115-21 ; Cohen，S.L.等人， (2007) J. Am. Chem. Soc. 129(22): 6976-7)。 人類免疫球蛋白Y(IgG)抗體一般由兩條相同輕鏈及重鏈 組成。重鏈為γ型，而輕鏈可為κ型或人型，不同之處為其 羧基末端恆定區。鏈間二硫橋將重鏈固定在一起。子 類中二硫橋之數目不同。舉例而言，對於IgG1，存在兩個 重鏈間二硫橋及一個將各輕鏈與重鏈固定在一起之二硫 橋。
IgG分子由經鉸鏈區連接之Fcg及兩個Fab區組成。鉸鏈 區分為3個部分_上部區、核心區及下部區（圖丨）。上部區將 Fab臂與核心連接，而下部區將卜部分與核心連接。核心 區含有鏈間二硫鍵且具有高脯胺酸含量。IgG子類中鉸鏈 區之長度不同且向Fab臂提供可撓性，使得臂之間的角度 可變且可圍繞其軸自由旋轉。由於其可撓性，鉸鏈區暴露 在外且因此易受溫度及長期儲存所干擾。舉例而言，鉸鏈 144870.doc 201036627 區易由蛋白酶（諸如木瓜蛋白酶及丨ys_c)接近，該等蛋白酶 常規用於產生抗體之Fc及Fab片段。使IgG分子在此區域中 裂解之其他酶包括組織蛋白酶L、纖溶酶及金屬蛋白酶。 液體調配物中之單株抗體當在5°C下長期儲存時經歷非 酶促水解’產生Fab+Fc及Fab片段（Jiskoot，w等人， (1990) Pharm. Res. 7(12)： 1234-41 ； Alexander, A.J.^D.E. Hughes (1995) Anal. Chem. 67(20): 3626-32 ； Cordoba, A.J. 等人 ’（2005) J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 818(2): 115-21 ; Liu，H.等人，（2006) J. Chrom. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 837: 35-43 ;及 Cohen, S.L.等人 ’（2007) j. Am. Chem. Soc. 129(22): 6976-7)。通 常由尺寸排阻層析（SEC)監測之片段化在極端PH值條件及 高溫下增加（Cohen，S.L·等人，（2007) J. Am. Chem. Soc. 129(22): 6976-7)。裂解在整個重鏈區序列Ser-Cys-Asp-
Lys-Thr-His-Thr-Cys上之多個肽鍵處發生。整個重鏈序列 Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys上之裂解產生相應的Fab片段 梯（48 kDa)，而Ser-Cys殘基之間的裂解經由β消除機制發 生且產生重鏈及輕鏈片段（23 kDa)。 重組單株抗體阿來佐單抗（Campath)中展示含有κ輕鏈之 IgG分子之鉸鏈區中發生金屬誘導之片段化（Smith, M.A.等 人，（1996) Int. J. Pept. Protein Res. 48(1): 48-55)。Smith 等人報導弱鹼性pH值下發生銅介導之片段化，且裂解特定 位於重鏈序列 Ser-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys 之鉸鏈區 中離胺酸殘基與蘇胺酸殘基之間。然而，作者並未揭示裂 144870.doc -10- 201036627 解機制，且裂解在pH 5-6之酸性條件下減少 之參數以提供安定組 及儲存期間於其調配 仍然需要確定圍繞抗體分子片段化 合物（例如調配物）及防止抗體在處理 物中裂解之方法。 舉例Μ ’ Μ需要-種包含抗體或其片段之水性醫藥 調配物’其適於治療上使用以抑制或對抗有害之㈣及/ 或IL-23活性’且其在處理及長_存期間安定性增強且 對λ輕鏈片段化之抗性增強。 Ο
【發明内容】 在第一態樣中，本發明提供水性調配物，其包含含入鏈 之抗體或其抗原結合部分（例如適於治療上使用以抑制或 對抗有害之IL-12及/或IL-23活性的抗體）且與此項技術中 公認之調配物相比具有改良之特性。舉例而言，呈例如液 體狀態或固體狀態之本發明調配物具有至少24個月之存放 期。在另一實施例中，本發明調配物在至少5次針對該調 配物之凍融循環之後仍保持安定。 在第二態樣中，本發明基於以下觀測結果提供抑制包含 λ輕鏈之免疫球蛋白片段化之組合物及方法：鐵在組胺酸 存在下使含有λ輕鏈之抗體的片段化因鉸鏈區中之特定裂 解而增加。組胺酸單獨存在於調配物中對片段化無作用。 片#又化之程度與鐵含量及組胺酸含量均成劑量依賴性關 係。在含有κ輕鏈之抗體中未觀測到鐵及組胺酸所致之片 •^又化程度·^加。含χ鍵抗體在存在於欽鍵區中、處於接合 輕鏈與重鏈之二硫鍵附近的殘基處裂解。 144870.doc 201036627 在第一態樣_，本發明提供一種安定調配物，其包含含 至少一部分λ輕鏈之分子及含組胺酸之緩衝系統，其中該 調配物實質上不含金屬。 在一實施例中，金屬為Fe2+或Fe3+。在另一實施例中， 金屬為Cu2+或Cu1+。 在另一實施例中，本發明另外提供一種安定調配物，其 包含於包含組胺酸之緩衝溶液（pH值為約5至約7)中的治療 有效量之包含λ輕鏈之分子，其中金屬係以在組胺酸存在 下不會使λ輕鏈裂解之濃度存在。 在另一貫施例中’本發明另外提供一種安定調配物，其 包含含至少一部分λ輕鏈之分子、含咪唑之缓衝系統及金 屬’其中该分子在金屬存在下不會於鉸鏈區内裂解。 在一貫施例中，在對調配物進行至少一種選自由過濾、 缓衝液父換、層析及樹脂交換組成之群的程序之後，該調 配物實質上不含金屬。在一實施例中，緩衝液交換包含用 選自由以下組成之群的緩衝液進行透析：包含組胺酸之緩 衝液、包含檸檬酸鹽及磷酸鹽之緩衝液及包含咪唑之緩衝 液。 在一實施例中，金屬係以例如小於約5,〇6〇份/十億份 (parts per billion ’ ppb)、小於約 Μ60 ppb、小於約 56〇 _、 小於約310 ppb、小於約160 ppb、小於約11〇 ppb及小於約 70 ppb之濃度存在。在一特定實施例中，金屬係以小於約 160 ppb之濃度且更佳以小於約70 ppb之濃度存在。 在一個實施例中，調配物包含一種包含人輕鏈之分子及 144870.doc -12- 201036627 至少一種選自由多元醇及界面活性劑組成之群的其他賦形 劑。在一個實施例中，調配物進一步包含安定劑。在一個 實施例中，調配物進一步包含甘露糖醇、聚山梨醇酯80及 甲硫胺酸。在一個實施例中，調配物進一步包含擰檬酸鹽 緩衝液或磷酸鹽緩衝液。在一個實施例中，pH為約5或5以 下。在另一實施例中，調配物包含（a)l_l〇〇/0甘露糖醇、 (b)0.001%-〇_l%聚山梨醇酯肋及⑷包含！_!〇〇 mM組胺酸及 1 -50 mM甲硫胺酸之緩衝系統，pH為5至7。在另一實施例 〇 中’調配物包含（a)2-6%甘露糖醇、（b)0.005-0.05%聚山梨 醇醋80及（c)包含5-50 mM組胺酸及5-20 mM甲硫胺酸之緩 衝系統，pH為5至7。在一個特定實施例中，調配物包含 (a)約4°/〇甘露糖醇、（b)約〇 〇1❶聚山梨醇酯8〇及（c)包含約 10 mM組胺酸及約10 硫胺酸之缓衝系統，pH為約 6 〇 在一個實施例中’本發明提供一種水性醫藥調配物，其 Q 包含⑷卜250 mg/mL結合IL-12/IL-23之P40次單元之抗原決 定基的人類抗體、（b)1_1〇%甘露糖醇、（e)〇 〇〇1% 〇 1%聚 山梨醇酯80、（d) 1-50 mM甲硫胺酸及（e) 1_1 〇〇 mM組胺 -酸，pH為5至7，其中該調配物實質上不含金屬。 在一個實施例中，醫藥調配物不具有小於約25 mS/c〇m 之傳導率。在另一實施例中，醫藥調配物不為美國專利第 ό，914,128號之實例9中所用之調配物。 在-個實施例中，分子為單株抗體或其抗原結合部分。 在各種實施例中，抗體或其抗原結合部分之濃度為例如介 144870.doc -13- 201036627 於約1 mg/ml與約250 mg/ml之間、約40 mg/ml與約200 mg/ml之間’或為約mg/ml。 在一個實施例中，抗體為能夠結合IL-12/IL-23之p40次 單元之抗原決定基的人類抗體或其抗原結合部分。在一個 實施例中’當p40次單元與IL-12之p35次單元結合時，人 類抗體或其抗原結合部分能夠結合p40次單元之抗原決定 · 基。在另一實施例中’當？4〇次單元與江_23之卩19次單元 結合時’人類抗體或其抗原結合部分能夠結合p4〇次單元 之抗原決定基。在另一實施例中’當p4〇次單元係與IL_丨2 〇 之P35次單元結合且p4〇次單元亦與IL_23之pl9次單元結合 時’人類抗體或其抗原結合部分能夠結合p4〇次單元之抗 原決疋基。在一特定實施例令，人類抗體或其抗原結合部 分結合IL-12/IL-23之P40次單元之抗原決定基，該抗原決 疋基係與選自由Y61及J695組成之群的抗體結合。 在一特定實施例中，本發明另外提供一種水性醫藥調配 物其包含（&)約100 mg/ml結合IL-12/IL-23之p40次單元之 ^原决疋基的人類抗體、（b)約4%甘露糖醇、⑻約G.G1%❹ 聚山^醇5日8G、⑷約1G mM甲硫胺酸及（d)10 mM組胺酸， 其pH值為約6。 >在實施例中，如表面電漿共振所測定，人類抗體或其 杬原’。σ邛为以1χ1〇-ι〇 乂或卜Μ以下之h或ΐχΐ〇 3 , 或 1 X 10-3 s-i 卜之kQff速率常數自iL_12/IL_23之ρ4〇次單元 解離。 實施例中’人類抗體或其抗原結合部分中和IL- 144870.doc •14· 201036627 12AL-23之P40次單元的生物活性。在一實施例中，人類抗 體或其抗原結合部分中和IL_12之生物活性。在一特定實 施例中’ IL-12功能之中和係藉由人類抗體或其片段與江、 122ρ40次單元的相互作用而達成。在一特定實施例中， 人類抗體或其抗原結合部分在活體外PHA檢定中以1χΐ〇_9 Μ 或1 10 Μ以下之1〇5〇抑制植物血球凝集素母細胞增殖， 或以1χ10·ι。Μ或lxio-1❶Μ以下之IC5。抑制人類Ι]ρΝγ產生。 在另一實施例中，人類抗體或其抗原結合部分中和IL_23 ❹ 之生物活性。在一特定實施例中，IL-；23功能之中和係藉 由人類抗體或其片段與IL-23之p40次單元的相互作用而達 成。 在一實施例中’人類抗體或其抗原結合部分具有包含 SEQ ID NChl之胺基酸序列的重鏈CDR3及包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列的輕鏈CDR3。在另一實施例中，人類 抗體或其抗原結合部分具有包含SEQ ID NO:3之胺基酸序 列的重鏈CDR2及包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列的輕鏈 CDR2。在另一實施例中，人類抗體或其抗原結合部分具 有包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的重鏈CDR1及包含SEQ - ID NO:6之胺基酸序列的輕鏈CDR1。在另一實施例中，人 . 類抗體或其抗原結合部分具有包含SEQ ID NO:7之胺基酸 序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的輕 鏈可變區。在一特定實施例中，人類抗體為抗體J695或其 抗原結合部分。 在一實施例中，調配物具有至少24個月之存放期。在另 144870.doc -15- 201036627 一實施例中，調配物在至少5次針對該調配物之凍融循環 之後仍保持安定。 在一實施例中，調配物進一步包含另一藥劑，例如另一 治療劑。 在一實施例中，另一治療劑係選自由以下組成之群：布 替财德（budenoside);表皮生長因子；皮質類固醇；環抱 素（cyclosporin);柳氮績胺°比。定（sulfasalazine);胺基水楊 酸鹽；6-疏基σ票呤；硫°坐嗓呤（azathioprine);曱石肖噠嗤 (metronidazole);脂肪加氧酶抑制劑；美沙胺（mesalamine); 奥沙拉嗓（olsalazine);巴柳氮（balsalazide);抗氧化劑； 企栓烧抑制劑（thromboxane inhibitor); IL-1受體拮抗劑； 抗IL-Ιβ單株抗體；抗IL-1受體抗體；抗IL-6單株抗體；抗 IL-6受體抗體；生長因子；彈性蛋白酶抑制劑；°比啶基-咪 唑化合物；TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、 IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF 及PDGF之抗體或促效劑；CD2、CD3、CD4、CD8、 CD20 、 CD25 、 CD28 、 CD30 、 CD40 、 CD45 、 CD69 、 CD90或其配位體之抗體；甲胺嗓呤（methotrexate); FK5 06 ;雷帕黴素（rapamycin);黴盼酸嗎琳乙酯 (mycophenolate mofetil);來氟米特（leflunomide)； NSAID ;布洛芬（ibuprofen);潑尼松龍（prednisolone);填 酸二酯酶抑制劑；SIP 1促效劑；bcl-2抑制劑；腺苷促效 劑；抗血栓劑；補體抑制劑；腎上腺素激導劑；IRAK ; NIK ; IKK ; p3 8 ; MAP激酶抑制劑；IL-Ιβ轉化酶抑制 144870.doc -16- 201036627 劑，TNFa轉化酶抑制劑；τ細胞信號傳導抑制劑；金屬蛋 白酶抑制劑；丘管收縮素轉化酶抑制劑；可溶性細胞激素 受體，可/谷性p55 TNF受體；可溶性p75 TNF受體；31[_ 1RI，sIL-lRII ; sil-6R ;抗發炎細胞激素；IL_4 ; IL_l〇 ; IL-11 ; IL-13 ;及 TGFp。 •在另一實施例中，另一治療劑係選自由以下組成之群： 抗TNF抗體及其抗體片段、築體、tace抑制 劑、簡4抑制劑、皮質類固醇、布替财德、地塞米松 〇 (dexamethasone)、柳氮磺胺吡啶、5_胺基水揚酸、奥沙拉 嗪、IL-1 β轉化酶抑制劑、IL_丨ra、酪胺酸激酶抑制劑、 巯基嘌呤及IL-11。 在另一實施例中，另一治療劑係選自由以下組成之群： 曱基潑尼松龍（methylprednisol〇ne)、環磷醯胺、4_胺基吡 啶、替紮尼定（tizanidine)、干擾素_(3la、干擾素#^、共 聚物1、高比例氧（hyperbaric OXygen)、靜脈内免疫球蛋 ❾ 白、克拉屈濱（clabribine)、TACE抑制劑、激酶抑制劑、 SIL-13R、抗p7及p_選擇素醣蛋白配位體（p_selectin glycoprotein ligand，PSGL)。 •在另一實施例中’本發明另外提供一種安定調配物，其 .包含含至少一部分λ輕鏈之分子、含組胺酸之緩衝系統、 及金屬螯合劑’其中該分子不會在鉸鍵區内裂解或在鉸鏈 區内之裂解程度小於在不存在金屬螯合劑之情況下所觀測 到的裂解程度。 在一實施例中，金屬為Fe2+或Fe3+。在另一實施例中， 144870.doc -17· 201036627 金屬為Cu2+或Cu1+。 在一實施例中，金屬螯合劑係選自由以下組成之群：檸 檬酸鹽；嗜鐵素（sider〇ph〇re);杯芳烴（calixerene);胺基 聚羧酸，羥基胺基羧酸；N_經取代甘胺酸；2 (2_胺基-2_ 側氧基乙基）胺基乙烷磺酸（BES);雙牙、三牙或六牙鐵螯 合劑；鋼螯合劑；及其衍生物、類似物及組合。在一較佳 實施例中’金屬螯合劑為去鐵胺（desferrioxamine)。 在第二態樣中，本發明提供抑制或防止含組胺酸調配物 中包含至少一部分人輕鏈之分子裂解的方法，該方法包含 抑制或防止金屬使分子裂解之能力的步驟。在_實施例 中，抑制或防止包含在調配物中包括至少一種金屬螯合 劑。在另一實施例中，抑制或防止包含對分子進行至少一 種選自由過渡(例如超渡及透滤)、緩衝液交換、層析及樹 曰交換 >'且成之群的程；^在—實施例中，緩衝液交換包含 用=自由以下組成之群的緩衝液進行透析：包纟組胺酸之 緩衝液、包含檸檬酸鹽及㈣鹽之緩衝液及包含咪唾之缓 衝液。 在另一實施你】中’抑帝】《防止包含藉由改變人輕鏈或重 鏈中之至少-個胺基酸來抑制或防止裂解。在另—實施例 中’抑制或防止包含藉由改b鏈中之胺基酸序列使得胺 基酸序列麩胺酸-半胱胺酸'絲胺酸發生變化來抑制或防止 在另K施例中’抑制或防止包含使調配物之pH值 =更酸性的程度降低，例如降至…以下之pH值。在另- 貫施例中，抑制或防止包含在調配物中包括另—緩衝液， 144870.doc •18- 201036627 諸如檸檬酸鹽緩衝液或磷酸鹽緩衝液。在一實施例中，調 配物包含約l_10〇 mM組胺酸，例如約10瓜厘組胺酸。 在一實施例中，調配物包含不會使含人鏈抗體在25或 . 4〇°C下6個月之後裂解的一定含量之鐵，例如鐵係以小於 約160 ppb存在。 在一實施例中，分子係以約1 mg/ml至約300 mg/ml範圍 内之濃度存在，例如約2 mg/mi，例如約7 mg/ml，例如約 100 mg/ml。 〇 在實知*例中’分子為免疫球蛋白，例如單株抗體。在 一特定實施例中，分子為抗IL-i2/23抗體，例如J695。在 另一貫施例中’抗體為抗CD-80抗體或抗IGF1，2抗體。 在另一實施例中，分子含有選自由以下組成之群的鉸鏈 區：DVD-IgTM、Fab片段、F(ab，）2片段、嵌合抗體、cdr 移植抗體、人類化抗體、人類抗體、二硫鍵連接之Fv、單 域抗體、多特異性抗體、雙重特異性抗體（dual specific 〇 antibody)及雙特異性抗體。在一實施例中，分子包含至少 邛刀重鏈。在另一實施例中，該部分重鏈包含胺基酸序 列絲胺酸·半胱胺酸-天冬胺酸-離胺酸（SCDK)或至少—個 不會抑制抗體結合之修飾。在另一實施例中，裂解在鉸鏈 區中於絲胺酸殘基與半胱胺酸殘基之間發生。在另一實施 例中’裂解在半胱胺酸殘基與天冬胺酸殘基之間發生。 在一實施例中，金屬為以2+或Fe3+。在另一實施例中， 金屬為Cu2+或Cu1+。 在一實施例中’ λ輕鏈包含麩胺酸_半胱胺酸_綵胺酸 144870.doc 19 201036627 (ECS)之胺基酸序列或至少一個不會抑制抗體結合之修 飾。在另一實施例中，裂解在λ鏈之鉸鏈區中發生。在另 一實施例中，裂解在麩胺酸殘基與半胱胺酸殘基之間發 生。在另一實施例中，裂解在絲胺酸殘基與半胱胺酸殘基 之間發生。 在一實施例中，裂解在約2°C至約25°C，例如約2°C至約 8°C之溫度下發生。在一實施例中，裂解在約4至約8之pH 值下，例如約5至約6之pH值下發生。 在一實施例中，至少一種金屬螯合劑為選自由以下組成 之群的嗜鐵素：需氧菌素（aerobactin)、農用桿菌素 (agrobactin) 固氮菌素（azotobactin)、細菌素 (bacillibactin)、N-(5-C3-L(5-胺基戊基）羥基胺甲醯基）-丙醯胺基）戊基）-3(5-(N-羥基乙醯胺基）-戊基）胺曱醯基）-丙異經月亏酸 （proprionhydroxamic acid)(去鐵敏 (deferoxamine)、去鐵胺或DFO或DEF)、去鐵琉素 (desferrithiocin)、腸 菌素(enterobactin)、赤 菌素 (erythrobactin)、含鐵色素（ferrichrome)、鐵草胺 B(ferrioxamine B)、鐵草胺 E(ferrioxamine E)、氧維菌素 (fluviabactin)、鐮菌胺酸 C(fusarinine C)、分枝桿菌素 (mycobactin)、副球菌素（parabactin)、假單胞菌素 (pseudobactin)、弧菌素（vibriobactin)、創傷孤菌素 (vulnibactin)、耶爾森桿菌素（yersiniabactin)、奥林菌素 (ornibactin)及其衍生物、類似物及組合（Roosenberg，J. M. 等人 5 (2000) Studies and Syntheses of siderophores, 144870.doc -20- 201036627
Microbial Iron Chelators, and Analogs as Potential Drug Delivery Agents. Current Medicinal Chem. 7: 159-197)。在 一較佳實施例中，金屬螯合劑為去鐵胺。 在另一實施例中，至少一種金屬螯合劑為檸檬酸鹽或磷 酸鹽。 _ 在另一實施例中，至少一種金屬螯合劑為選自由以下組 成之群的胺基聚羧酸··乙二胺四乙酸（EDTA)、氮基三乙酸 (nitriloacetic acid，NTA)、反-二胺基環己烧四乙酸 〇 (DCTA)、二伸乙三胺五乙酸（DTPA)、N-2-乙醯胺基-2-亞 胺基二乙酸（ADA)、天冬胺酸、雙（胺基乙基）乙二醇醚 队队；^’,：^'-四乙酸斤0丁入）、麩胺酸及]^,；^'-雙（2-羥基苯曱 基）乙二胺-N，N'-二乙酸（HBED)及其衍生物、類似物及組 合。 在另一實施例中，至少一種金屬螯合劑為選自由以下組 成之群的羥基胺基羧酸：N-羥乙基亞胺基二乙酸 (HIMDA)、Ν,Ν-雙羥乙基甘胺酸（bicine)及N-(參羥甲基甲 ❹ 基）甘胺酸（tricine)及其衍生物、類似物及組合。 在另一實施例中，至少一種金屬螯合劑為N-經取代甘胺 - 酸或其衍生物、類似物或組合。舉例而言，N-經取代甘胺 . 酸係選自由甘胺醯甘胺酸及其衍生物、類似物及組合組成 之群。 在另一實施例中，至少一種金屬螯合劑為2-(2-胺基-2_ 側氧基乙基）胺基乙烷磺酸（BES)或其衍生物、類似物及組 合0 144870.doc -21 - 201036627 在另一實施例中，至少一種金屬螯合劑為杯芳烴，例如 基於酚及醛之羥烷基化產物的巨環或環狀寡聚物或其衍生 物、類似物或組合（Gutsche, C. D. (1989) Calixarenes. Cambridge: Royal Society of Chemistry ； Dharam, P 及
Harjit, S. (2006) Syntheses, Structures and Interactions of Heterocalixarenes，Arcivoc.) ° 在另一實施例中，至少一種金屬螯合劑包含DTPA與 DEF之組合。在另一實施例中，至少一種金屬螯合劑包含 EDTA、EGTA及DEF之組合。 在另一實施例中，至少一種金屬螯合劑為經基D比咬衍生 物、腙衍生物及羥基苯基衍生物或菸鹼基衍生物，諸如 1,2-二甲基-3-經基°比咬-4-酮（去鐵酮（Deferiprone)、DFP或 奥貝安可（Ferriprox)) ; 2-去氧-2-(N-胺甲醯基甲基-[N'-2'_ 曱基-3’-羥基吡啶-4^酮])-D-葡萄哌喃糖（菲瑞思-G(Feralex-G))、吡哆醛異菸鹼基腙（PIH); 4,5-二氫-2-(2,4-二羥基苯基）-4-甲基噻唑-4-甲酸（0丁56-252)、4-[3,5-雙（2-羥基苯基）-[1,2,4]三唑-1-基]苯甲酸（ICL-670) ; N，N’-雙（鄰 羥基苯曱基）乙二胺-N，N'-二乙酸（HBED)、5-氣-7-碘-喹啉-8-醇（氣蛾經啥（clioquinol));或其衍生物、類似物或組 合0 在另一實施例中，至少一種金屬螯合劑為選自由以下組 成之群的銅螯合劑：三伸乙四胺（trientine)、四伸乙五 胺、D-青黴胺（D-penicillamine)、乙二胺、雙°比咬、菲羅 琳（phenantroline)、紅菲羅琳（bathophenanthroline)、新亞 144870.doc -22- 201036627 銅靈（neocuproine)、紅亞銅靈績酸鹽（bathocuproine sulphonate)、銅立榮（cuprizone)、順，順-1，3,5-三胺基環己 烧（TACH)、塔克π比（tachpyr)及其衍生物、類似物及組合。 在另一實施例中，至少一種金屬螯合劑可選自此項技術 中所述，例如「Iron Chelators and Therapeutic Uses」， Bergeron, R.等人，Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery 第 6 版，第 3 卷，Cardiovascular Agents and Endocrines, Abraham，D.J編，John Wiley & Sons, Inc. 2003 〇 中所述之螯合劑、該等試劑之類似物及衍生物。另外，螯 合劑可選自美國專利第6,083,966號、美國專利第6,521，652 號、美國專利第6,525,080號、美國專利第6,559,3 15號、 PCT/US2004/029318、PCT/US2003/022012、WO/2002/043722 及W02004/007520中所述之螯合劑、該等試劑之類似物及 衍生物。 在另一實施例中，調配物包含至少一種選自由胺基酸、 糖、糖醇、緩衝劑、鹽及界面活性劑組成之群的其他賦形 劑。 在另一實施例中，調配物包含至少一種選自由以下組成 . 之群的其他賦形劑：約1 mg/ml至約60 mg/ml甘露糖醇、 約1 mM至約50 mM甲硫胺酸、約0.001 %至約0.5% (w/v)聚 山梨醇酯80、約0.001%至約1% (w/v)泊洛沙姆 188(p〇ly〇xamer 188)、約1 mM至約150 mM氯化鈉、約1 mM 至約30 mM乙酸鹽、約1 mM至約30 mM檸檬酸鹽、約1 mM至 約30 mM磷酸鹽及約1 mM至約30 mM精胺酸。 144870.doc -23- 201036627 在另-實施例中，抑制或防止片段化包含藉由添加酸、 滴定或透析或此項技術中已知用於降低阳值之各種過滤方 法（諸如（但不限於）透析或切向流過濾）使調配物之值向 更酸性的程度變化。 在另-實施例中’抑制或防止片段化包含使用特定緩衝 液，諸如填酸鹽或檸檬酸鹽。 在第二態樣之另一實施例中，本發明提供一種偵測含組 胺酸調配物中包含至少一部分\輕鏈之分子之裂解的方 法，該方法包含以下步驟：在調配物中包括至少—種金屬 螯合劑，及分析至少一部分λ輕鏈之裂解。 【實施方式】 本發明之上述及其他目的、特徵及優勢以及本發明本身 將由以下較佳實施例之描述並與隨附圖式閱覽相結合來更 充分地瞭解。 I·定義 術語「抗體」泛指包含四條由二硫鍵互連之多肽鏈（兩 條重（Η)鏈及兩條輕（L)鏈）的任何免疫球蛋白（Ig)分子，或 保留Ig分子之基本抗原決定基結合特徵的其任何功能片 段、突變體、變異體或衍生物。該等突變型、變異型或衍 生型抗體形式在此項技術中為已知的，其非限制性實施例 論述於本文中。 在全長抗體中，各重鏈包含重鏈可變區（本文中縮寫為 HCVR或VH)及重鏈f亙定區。重鏈‘]·亙定區包含三個域chi、 CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區（本文中縮寫為lCvr 144870.doc •24· 201036627 或VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域CL。VH及 VL區可進一步細分為高變區，稱作互補決定區（CDR)，其 間穿插較保守區域，稱作構架區（FR)〇各VH及VL由3個 CDR及4個FR組成，其自胺基末端至羧基末端按以下順序 與Μ 列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免 疫球蛋白分子可為任何類型（例如IgG、IgE、IgM、IgD、 IgA及 IgY)、類別（例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 及 IgA2)或子類。 術語「Fc區」係指免疫球蛋白重鏈之C末端區，其可藉 由完整抗體之木瓜蛋白酶消化而產生。Fc區可為原生序列 Fc區或變異型Fc區。免疫球蛋白之Fc區一般包含兩個恆定 域CH2域及CH3域，且視情況包含CH4域。置換Fc部分中 之胺基酸殘基以改變抗體效應功能在此項技術中為已知的 (美國專利第5,648,260號及第5,624,821號）。抗體之？〇部分 介導若干重要的效應功能，例如細胞激素誘導、抗體依賴 性細胞介導之細胞毒性（ADCC)、吞噬作用、補體依賴性 細胞毒性（CDC)以及抗體及抗原-抗體複合物之半衰期/清 除率。某些人類IgG同型（特定言之，IgGl及IgG3)分別經 由結合FcyR及補體Clq來介導ADCC及CDC。免疫球蛋白 之兩條相同重鏈之二聚係由CH3域之二聚介導且由鉸鏈區 内之二硫鍵安定（Huber等人，（1976) Nature 264: 415-20 ; Thies等人，（1999) J. Mol. Biol. 293: 67-79)。鉸鏈區内半 胱胺酸殘基發生突變以防止重鏈-重鏈二硫鍵會使CH3域之 二聚不安定。已鑑別對CH3二聚負責之殘基（Dall'Acqua 144870.doc -25- 201036627 (1998) Biochem. 37: 9266-73)。因此，有可能產生單價半 Ig。在自然界中已發現針對IgG與IgA子類之單價半Ig分子 (Seligman (1978) Ann· Immunol. 129: 855-70 ; Biewenga等 人，（1983) Clin. Exp. Immunol. 51: 395-400)。半 ig 分子因 其尺寸小於常規抗體而可能在組織穿透方面具有某些優 勢。在一實施例中，置換本發明結合蛋白之恆定區（例如 Fc區）中至少一個胺基酸殘基以破壞重鏈之二聚，從而產 生半Ig分子。輕鏈可為κ型或λ型。 術語抗體之「抗原結合部分」或「抗體部分」包括保留 特異性結合抗原（例如hIL-12及/或hIL-23)之能力的抗體片 段。該等抗體實施例亦可為雙特異性、雙重特異性或多特 異性抗體’例如其特異性結合兩種或兩種以上不同抗原。
已顯示抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段來執行。 術語抗體之「抗原結合部分」所包涵之結合片段的實例包 括⑴Fab片段，亦即由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片 段’（ii)F(ab')2片段’亦即包含兩個在鉸鏈區由二硫橋連接 之Fab片段的二價片段；（iii)由vh及CH1域組成之Fd片 段；（iv)由抗體單臂之VL及VH域組成之Fv片段；（v)由VH 域組成之dAb 片段（Ward等人，（1989) jVaiwre 341: 544. 546);及（vi)經分離之互補決定區（Cdr)。此外，儘管卜片 段之兩個域VL及VH係由獨立基因編碼，但可使用重組方 法由合成連接子將其接合，該合成連接子能夠使其成為其 中VL區與VH區配對形成單價分子之單一蛋白鏈（稱作單鏈 Fv(scFv);參見，例如Bird等人，（1988) 242_ 423_ 144870.doc -26· 201036627 426 ;及 Huston等人，（1988) Proda". Jcao?· W. C/M 85: 5879-5883)。該等單鏈抗體亦欲涵蓋於術語抗體之「抗原 結合部分」中。其他形式之單鏈抗體（諸如雙功能抗體）亦 涵蓋在内。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中VH及 VL域在單一多肽鏈上表現，但使用過短而無法使同一鏈 上兩個域之間配對的連接子，從而迫使該等域與另一鏈之 互補域配對且產生兩個抗原結合位點（參見，例如H〇iiiger， Ρ·等人，（1993) Jed t/M 90: 6444-6448 ;
Poljak, R.J.等人 ’（1994) Sirwciwre 2: 1121-1123)。該等抗 體結合部分在此項技術中為已知的（Kontermann及Dubel 編 ’（2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New
York.第790頁）。另外，單鏈抗體亦包括包含一對串聯Fvg 段（VH-CH1-VH-CH1)之「線性抗體」，該對串聯Fv區段與 互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區（Zapata等人， (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062 ;美國專利第 5,641，870號）。 此外，抗體或其抗原結合部分可為較大免疫黏附分子之 一部分，其係藉由抗體或抗體部分與一或多種其他蛋白質 或肽共價或非共價結合來形成。該等免疫黏附分子之實例 包括使用抗生蛋白鏈菌素核心區製備四聚scFv分子 (Kipriyanov，S.M.等人，（1995)丑謂⑽ 6: 93-101)及使用半胱胺酸殘基、標記肽及c末 端聚組胺酸標滅製備二價且經生物素標記之SCFV分子 (Kipriyanov，S.M.等人 ’（1994) Μσ/· /www„0/. 31: ι〇47- 144870.doc 27- 201036627 1058)。抗體部分，諸如Fab及F(ab’）2片段可自完整抗體使 用習知技術製備，諸如分別對完整抗體進行木瓜蛋白酶或 胃蛋白酶消化。此外，如本文所述，抗體、抗體部分及免 疫黏附分子可使用標準重組DNA技術獲得。較佳之抗原結 合部分為完整域或數對完整域。 術語「多價結合蛋白」係指包含兩個或兩個以上抗原結 合位點之結合蛋白。在一實施例中，多價結合蛋白經工程 改造以具有三個或三個以上抗原結合位點，且一般不為天 然產生之抗體。術語「多特異性結合蛋白」亦係指能夠結 合兩個或兩個以上相關或不相關標靶之結合蛋白。雙重可 變域（DVD-IgTM)結合蛋白包含兩個或兩個以上抗原結合位 點且為四價或多價結合蛋白。DVD-IgTM可具有單特異性， 亦即能夠結合一種抗原；或具有多特異性，亦即能夠結合 兩種或兩種以上抗原。包含兩個重鏈DVD-IgTM多肽及兩個 輕鏈DVD-IgTM多肽之DVD-IgTM結合蛋白稱作DVD--IgTM。 DVD--IgTM；^每一半包含一個重鏈DVD-IgTM多肽及一個輕 鏈DVD-IgTM多肽及兩個抗原結合位點。各結合位點包含一 個重鏈可變域及一個輕鏈可變域，每個抗原結合位點之抗 原結合總共涉及6個CDR。 術語「雙特異性抗體」係指由以下產生之全長抗體：四 源雜交瘤技術（quadroma technology)(Milstein，C.及 A.C. Cuello (1983) Nature 305(5934): 537-40);使兩種不同單株 抗體以化學方式結合（Staerz, U.D.等人，（1985) Nature 314(6012): 628-31);或在Fc區中引入突變之杵入臼方法 144870.doc -28- 201036627 (knob-into-hole approach)或類似方法（H〇lliger，ρ 等人， (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-8.18)，從而產 生多個不同免疫球蛋白種類’其中僅一種為功能性雙特異 性抗體。對於分子功能，雙特異性抗體在其兩個結合臂之 一（一對HC/LC)上結合一種抗原（或抗原決定基）且在其第 一臂（另一對HC/LC)上結合不同抗原（或抗原決定基）。對 於此定義，雙特異性抗體具有兩個相異的抗原結合臂（在 特異性與CDR序列方面均相異），且對於其所結合之各抗 〇 原為單價的。 術語「雙重特異性抗體」係指兩個結合臂之各臂（一對 HC/LC)可結合兩種不同抗原（或抗原決定基）之全長抗體 (PCT公開案第WO 02/02773號）。因此，雙重特異性結合蛋 白具有兩個特異性相同及CDR序列相同的相同抗原結合 臂’且對於其所結合之各抗原為二價的。 免疫球蛋白恆定域係指重鏈或輕鏈恆定域。人類重 ◎ 鏈及輕鏈恆定域胺基酸序列在此項技術中為已知的。 術語「單株抗體」或「mAb」係指自實質上均質之抗體 群體獲得之抗體，亦即構成該群體之個別抗體除可少量存 -在之可能天然存在之突變以外皆相同。單株抗體具有高度 特異性，其係針對單一抗原。此外，與通常包括針對不同 決定子（抗原決定基）之不同抗體的多株抗體製劑成對比， 各mAb係針對抗原上之單一決定子。修飾語「單株」不應 理解為需要由任何特定方法產生抗體。在一實施例中，單 株抗體係由融合瘤技術產生。 144870.doc •29- 201036627 術語「欲合抗體」係指包含一種物種之重鏈及輕鏈可變 區序列及另一種物種之恆定區序列的拆體，諸如具有與人 類恆定區連接之鼠類重鏈及輕鏈可變區的抗體。 術§吾「CDR移植抗體」係指包含一種物種之重鍵及輕鏈 可變區序列但VH及/或VL之一或多個CDR區之序列經另一 種物種之CDR序列置換的抗體，諸如具有一或多個鼠類 CDR(例如CDR3)經人類CDR序列置換之鼠類重鏈及輕鏈可 變區的抗體。 術語「人類抗體」包括具有對應於人類生殖系免疫球蛋 白序列之可變區及恒定區的抗體’如Kabat等人所述（參見 hbat専尺 ’（199V) Sequences of Proteins of Immun〇l〇gical /WereW，第5版，美國衛生及公眾服務部（u s Department of Health and Human Services)，NIH公開案第 91-3242號）。 本發明之人類抗體可例如在CDR及詳言之CDR3中包括並 非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基（例如 藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體内體細 胞犬變引入之突變）。較佳使用美國專利6,9〗4,〗中所述 之「選擇性突變誘發方法」引入突變，該專利之全部内容 係以引用的方式併入本文中。人類抗體中至少一個位置可 經並非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基 (例如增強活性之胺基酸殘基）置換。人類抗體中至多二十 個位置可經並非人類生殖系免疫球蛋白序列之一部分的胺 基酸殘基置換。在其他實施例中，至多1〇個、至多5個、 至多3個或至多2個位置經置換。在一較佳實施例中，如下 144870.doc -30- 201036627 文詳細描述，此等置換係在CDR區内。然而，如本文所用 之術語「人類抗體」不欲包括其中源自另一哺乳動物物種 (諸如小鼠）之生殖系的CDR序列已移植於人類構架序列上 之抗體。產生人類或完全人類抗體之方法在此項技術中為 已知的，且包括人類B細胞之Ebv轉化，自噬菌體呈現、 酵母呈現、mRNA呈現或其他呈現技術所製備之抗體文庫 以及自小鼠或其他物種選擇人類或完全人類抗體，其中該 等小鼠或其他物種對於包含上文進一步定義之所有或一部 分重鏈及輕鏈基因組區的所有或一部分人類Ig基因座而言 經基因轉殖。所選人類抗體可由此項技術中公認之方法使 之親和力成熟，該等方法包括活體外突變誘發，較佳為 CDR區或鄰近殘基之突變誘發，以增強對預期標靶之親和 力。 紐語「重組人類抗體」包括由重組方式製備、表現、產 生或分離之人類抗體，諸如使用轉染至宿主細胞中之重組 表現載體表現的抗體（下文第Π部分進一步描述），自重 組、組合性人類抗體文庫分離之抗體（下文第m部分進一 步指述）’自對於人類免疫球蛋白基因而言經基因轉殖之 動物（例如小鼠）分離之抗體（參見，例如Tayi〇r，l.d等人， (1992) #此/· 及以.20: 6287-6295) ’或由涉及將人類 免疫球蛋白基因序列拼接至其他DNA序列之任何其他方式 製備、表現、產生或分離之抗體。該等重組人類抗體具有 源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及值定區（參見
Kabat，E.A.等人 ’（1991)㈣_⑽ 〇/ •如 144870.doc -31- 201036627 /mmw⑽/ogica/ 如如，第5版，美國衛生及公眾服務部， NIH公開案第91-3242號）。然而’在某些實施例中，對該 等重組人類抗體進行活體外突變誘發（或者，當使用對於 人類Ig序列而言經基因轉殖之動物時’進行活體内體細胞 突變誘發），且因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列為 如下序列：其儘管源自人類生殖系VH及VL序列且與人類 生殖系VH及VL序列相關，但可能並非天然存在於活體内 人類抗體生殖系谱内。然而，在某些實施例中，該等重組 抗體為選擇性突變誘發方法或回復突變或兩者之結果。 如本文所用之「經分離抗體」欲指實質上不含具有不同 抗原特異性之其他抗體的抗體（例如，特異性結合人類IL-12及/或IL-23(例如結合人類il_12/IL-23之p40次單元）的經 分離抗體實質上不含特異性結合非人類IL_12& IL_23之抗 原的抗體）。然而’特異性結合人類IL-12及/或IL-23之經 分離抗體可對其他抗原（諸如來自其他物種之人類IL_i2及/ 或IL-23分子）具有交叉反應性。此外，經分離抗體可實質 上不含其他細胞物質及/或化學物質。 如本文所用之「中和抗體」（或「中和人類IL_i2及/或 IL-23活性之抗體」或「中和IL-12/IL-23之p40次單元之活 性的抗體」）欲指與人類IL-12及/或IL-23之結合（例如，與 IL-12/IL-23之p40次單元之結合）會抑制人類il-12及/或IL- 23之生物活性（例如il- 12/IL-23之p40次單元之生物活性）的 抗體。此對人類IL -12及/或IL -2 3之生物活性的抑制可藉由 量測人類IL-12及/或IL-23生物活性之一或多個指標來評 144870.doc •32- 201036627 估，該等指標為諸如在植物血球凝集素母細胞增殖檢定 (PHA)中對人類植物血球凝集素母細胞增殖之抑制，或在 人類IL-12及/或IL-23受體結合檢定（例如干擾素_γ誘導檢 定）中對受體結合之抑制。人類IL-12及/或江-23生物活性 之此等指標可由此項技術中已知及美國專利第6,914，128號 (例如第9欄第3 1行至第113攔第55行之實例3)中所述之若干 標準活體外或活體内檢定中之一或多者來評估，其專利之 全部内容係以引用的方式併入本文中。 術語「人類化抗體」係指包含來自非人類物種（例如小 鼠）之重鏈及輕鏈可變區序列，但其中至少一部分VH& /戋 VL序列已經改變而更「擬似人類」（亦即，更類似於人類 生殖系可變序列）的抗體。一種類型之人類化抗體為CDR 移植抗體，其中人類CDR序列經引入非人類vh及VL序列 中以置換相應非人類CDR序列。「人類化抗體」亦為特異 性結合相關抗原且包含實質上具有人類抗體胺基酸序列之 構架（FR)區及實質上具有非人類抗體胺基酸序列之互補決 定區（CDR)的抗體或其變異體、衍生物、類似物或片段。 術語「鉸鏈區」意謂重鏈分子中使CH1域與CH2域接合 之部分。鉸鏈區包含約25個殘基且具有可撓性，由此允許 兩個N末端抗原結合區獨立地移動。鉸鏈區可細分為三個 相異域·上部、中間及下部欽鍵域（Roux等人，（1998) J Immunol· 161: 4083)。已製成一些經改變之抗體分子，其 中鉸鏈區中半胱胺酸殘基之數目減至1個以有利於抗體分 子之組裝’因為僅需要形成單一二硫鍵。此亦提供特異性 144870.doc -33- 201036627 才示把以使叙鍵區與另一欽鍵區或效應分子或報導分子連接 (美國專利第5,677,425號）。亦已增加抗體鉸鏈中半胱胺酸 殘基之數目（美國專利第5,677，425號）。已構築其他經突變 抗體’其中IgGl鉸鏈區及CH2域已經人類IgG3鉸鏈區置換 (WO 97/1137〇)。此等分子含有11個硫氫基（sulfhydryl)a 經由硫氫基（thiol group)取代多個半抗原。
Ig蛋白之輕鏈組份係由2個獨立基因座lgK及1§λ編碼。含 有κ或λ輕鏈之抗體的比例在不同物種之間顯著不同，例如 在小鼠中κ:λ比率為95:5 ’相比之下在人類中為6〇:4〇。在 人類中’雖然幾乎所有λ產生細胞之兩個κ對偶基因均重 排，但κ產生細胞與λ產生細胞之比例為類似的（Hieter等 人 ’（1981) Nature 290: 368-72 ; US 20040231012)。B細胞 表現具有κ或λ輕鍵之表面免疫球蛋白（ig)，一種稱作同型 排斥之選擇。輕鏈V-J重排在前Β-Π轉變為未成熟b細胞時 發生，其中與膜Igg(mu)結合之替代輕鏈經κ*λ輕鏈置換 (Osmond等人 ’（1998) Immunol. Today 19, 65-68)。儘管輕
鏈重排之時序已基本上確定，但活化輕鏈基因座重排之過 程尚未充分瞭解。κ及λ重排為獨立事件（Arakawa等人， (1996) Int· Immunol. 8: 91-99)，其活化可能受其各別強化 子之強度差異影響。已在(：λ7下游約1〇 Kb處鑑別據信對人 類λ基因座之可接近性的調控至關重要之區域（⑴⑽政及 Blomberg, (1996) Mol. Immunol. 33: 427-38 ； AsenbauerA
Klobeck，（1996) Eur. J. Immun〇i. 26: 142-50)。報導基因檢 定中之功能比較鑑別由可急劇降低前B細胞中之強化子活 144870.doc -34- 201036627 1"生之元件側接的核心強化子區（G[〇zak及Blomberg (1996) 卜儘管轉染研究顯示κ&λ 3,強化子區似乎在功能上 等效’但側接核心強化子基元之其他（功能）序列顯著不 同。轉殖基因小鼠中κ 3'強化子之靶向缺失顯示此區域對 於κ基因座重排及表現並非必需，但為確立κ:λ比率所需 (Gorman等人，（1996) Immunity 5: 241-52)。 染色體22qll.2上之人類Ig λ基因座的尺寸為1.1 Mb，且 其通常含有70 νλ基因及7 U-CX基因區段（Frippiat等人， (1995) Hum· Mol. Genet. 4: 983-91 ; Kawasaki 等人， (1997) Genome Res. 7: 260-61)。約半數νλ基因視為功能 基因’且】λ-(：λ 1、2、3及7具有活性。νλ基因組織為3個 含有相異V基因家族群之團簇。存在1〇個乂人基因家族，其 中最大νλΙΙΙ由23個成員表示。在人類外周血液淋巴細胞 中’團簇Α中來自家族I、II及III之大多數鄰近j_c之ν基因 區段優先重排’其中2a2 νλ區段（Giudicelli等人，（1997) Nucl. Acids Res· 25: 206-11)之作用異常得高（ignatovich等 人，（1997) J. Mol. Biol· 268: 69-77)。所有 λ基因區段皆具 有相同極性’此允許進行缺失重排（Combriato及Klobeck， (1991) Eur. J. Immunol· 21: 1513-22)。IgX譜之序列多樣性 主要由νλ-·Γλ組合提供。因V與J接合點處N(非編碼）-核苷 酸添加或P(回文）-核苷酸添加所產生之另一 CDR3多樣性儘 管不如IgH重排中所見般廣泛，但與小鼠相比似乎在人類 中更頻繁使用（Foster等人，（1997) Clin. Invest. 99，1614-27; Ignatovich, PhD thesis, University of Cambridge, 144870.doc -35· hchchch, hchchchc 123 7 123 7 1 1 X 1 X 1 1 1 201036627 1998 ; Bridges等人，（1995) J. Clin. Invest. 96: 831-41 ; Victor 等人，(1994) J. Immunol. 152: 3467-75)，其中 TdT(末端去氧核糖核苷酸轉移酶）活性在輕鏈重排時下 調。下文提供若干λ輕鏈序列之比對，表明存在以下共同 序列： QPKAXPXVTLFPPSSEELQANKATLVCLXSDFYPGAVTVA WKADXSPVKXGVETTXPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWK SHRSYSCXVTHEGSTVEKTVAPXECS ;其中 X 為 A、Ν、 T、S、I、V、G、K、Q或 R。 1 60 (1) QPKRNPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQ (1) QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLXSDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQ (1) QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQ (1) QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQ 61 105
(61) SNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SI) SNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (61) SNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (61) SNNKYAA.SSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS 人類抗體K鏈已基於恆定胺基酸序列而分為四個子群（參 見，例如 Kabat 等人，（1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest (第4版），由美國衛生及公眾服務部 公開）。似乎存在約80個人類VK基因，但在人類基因組中 僅鑑別一個IV子群VK基因（參見Klobeck等人，（1985) Nucleic Acids Research, 13: 6516-6528)。Hum4VL之核皆 酸序列闡述於Kabat等人，（1991)(同上）中。術語「Kabat 編號」、「Kabat定義」及「Kabat標記」在本文中可互換使 用。此項技術中公認之此等術語係指將比抗體或其抗原結 合部分之重鏈及輕鏈可變區中之其他胺基酸殘基更加可變
144870.doc -36- 201036627 (亦即高變）之胺基酸殘基編號的系統（Kabat等人，（1971) Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-391 ; Kabat, Ε·Α·等人， (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版，美國衛生及公眾服務部，NIH公開案第91-3242 號）。對於重鏈可變區，高變區中CDR1在胺基酸位置3 1至 35之範圍内’ CDR2在胺基酸位置50至65之範圍内，且 CDR3在胺基酸位置95至102之範圍内。對於輕鏈可變區， 高變區中CDR1在胺基酸位置24至34之範圍内，CDR2在胺 基酸位置50至56之範圍内，且CDR3在胺基酸位置89至97 之範圍内。 如本文所用之術語「CDR」係指抗體可變序列内之互補 決定區。重鏈及輕鏈可變區中各存在三個CDR，對於各可 變區，以CDR1、CDR2及CDR3表示。此等CDR之確切邊 界已根據不同系統而不同地界定。Kabat(同上）所述之系統 不僅提供適用於抗體之任何可變區的明確殘基編號系統， 而且提供界定三個CDR之精確殘基邊界。此等CDR可稱作 Kabat CDR。Chothia等人發現Kabat CDR内某些子部分採 用幾乎相同之肽骨架構形，但在胺基酸序列含量方面具有 較大差異性（Chothia等人，（1987) Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia等人，（1989) Nature 342: 877-883)。此等子 部分以LI、L2及L3或HI、H2及H3表示，其中「L」及 「Η」分別表示輕鏈區及重鏈區。此等區域可稱作Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊之邊界。與Kabat CDR重 疊的其他界定CDR之邊界已由Padlan (1995) FASEB J. 9: 144870.doc -37- 201036627 133-139及MacCallum (1996) J. Mol. Bi〇i· 262(5): 732-45描 述。雖然其他CDR邊界界定可能不嚴格遵循本文所述系統 之一，但儘管如此仍與Kabat CDR重疊，而鑒於特定殘基 或殘基群或甚至整個CDR不會顯著影響抗原結合之預測或 實驗結果可縮短或延長邊界。雖然本文所用之方法可利用 根據任一此等系統所界定之CDR，但某些實施例使用 Kabat 或 Chothia界定之 CDR。 如本文所用之術語「構架」或「構架序列」係指可變區 減去CDR之剩餘序列。因為CDR序列之確切界定可由不同 系統確定，故構架序列之含義服從於相應不同的釋義。六 個CDR(輕鏈之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3及重鏈之CDR-Hl、CDR-H2及CDR-H3)亦將輕鏈及重鏈上之構架區在各 鏈上分成四個子區（FR1、FR2、FR3及FR4)，其中CDR1位 於FR1與FR2之間，CDR2位於FR2與FR3之間，且CDR3位 於FR3與FR4之間。在未將特定子區指定為FR1、FR2、 FR3或FR4之情況下，他處提及之構架區表示單一天然存 在之免疫球蛋白鏈之可變區内之組合FR。如本文所用之 FR表示四個子區之一，且亦表示構成構架區之四個子區中 之兩個或兩個以上子區。 術語「螯合劑」泛指與金屬離子結合或與金屬離子形成 錯合物之試劑。在一實施例中，該結合或錯合物形成包括 金屬螯合劑之一或多個原子。該結合及錯合物形成可為任 何鍵形式及組合，例如共價鍵、配價鍵或離子鍵。在一實 施例中，螯合劑與金屬離子結合或與金屬離子形成錯合物 144870.doc -38- 201036627 且藉此螯隔金屬離子。金屬螯合劑之衍生物、類似物及組 合形式在此項技術中為已知的’其非限制性實施例論述於 下文。 術語「正常應激批次（normal stressed lot)」意謂已在高 溫（通常25C或40C)下在不存在金屬的情況下培育之批 次。舉例而言，在正常應激批次中，包含至少一部分入輕 鏈之分子（例如抗體）的裂解可在鉸鏈區中發生，諸如在整 個重鏈區序列 Ser-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys上之多個 ❹肽鍵處發生。 短s吾「貫質上不含金屬」或「調配物中金屬之濃度不會 使λ輕鏈裂解」係指調配物中金屬之濃度足夠低（例如，在 例如25 C或40 C之溫度下小於約1 60 ppb、較佳小於約11 〇 ppb且更佳小於約7〇 ppb)使得調配物中所存在之含χ輕鏈抗 體據觀測處於正常或可接受之片段化或裂解程度，例如相 應正常應激批次中所觀測之裂解程度，例如約〇 5%片段 〇 化。舉例而言，調配物中金屬之濃度使得在λ輕鏈（例如λ 鍵之欽鏈區）中僅觀測到小於約0.1%、0.2%、0.3%、〇.4% 或。之片#又化或裂解。調配物中含λ輕鏈抗體之片段化 或裂解程度可由例如SEC、毛細電泳法及/或質譜法測定。 術「個體」欲包括活生物體，例如原核生物及真核生 物個體之實例包括哺乳動物，例如人類、狗、乳牛、 〆豬、'名羊、山羊、書苗、小鼠、兔、大氣及轉殖基因非 人類動物。在本發明之特定實施例中，個體為人類。 術”。「醫藥調配物」係指呈使活性成份之生物活性明確 144870.doc -39- 201036627 有效之形4且不含有對調西己物所投與之個體具有顯著毒性 之其他組份的製劑。「醫藥學上可接受」之賦形劑 ，、添加劑）為彳合理地投與個冑哺乳動物以提供有效劑 篁之所用活性成份的賦形劑。 「安定」調配物為在儲存之後其中之抗體基本上保持其 物里女疋）·生及/或化學安定性及/或生物活性的調配物。量 貝J蛋白貝文疋性之各種分析技術在此項技術中可用且評 述於例如 Peptide and Protein Drug Delivery，247-301, VlnCent Lee編，Marcel Dekker，Inc” New York，N.Y·, Pubs. (991)及 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (19 9 3)中。可在所選溫度下歷經所選時段來量測安定性。 调配物較佳在2。(：與8。(：之間歷經24個月保持安定。此外， 調配物較佳在-20 C與-80。(：之間歷經至少18個月且較佳歷 經24個月保持安定。此外，在對調配物進行冷凍（至例 如-80。〇及融化（例如在乃艺至”它下）（下文稱為「凍融循 % J )之後’該調配物較佳保持安定。調配物較佳在至少5 次凍融循環之後保持安定。 在目測檢查顏色及/或澄清度時或如UV光散射或尺寸排 阻層析所量測，醫藥調配物中之抗體若顯示實質上無凝 集、沈澱及/或變性之徵象，則該抗體「保持其物理安定 性」。 若既定時間處之化學安定性使得抗體被視為仍保持其下 文所定義之生物活性’則醫藥調配物中之抗體「保持其化 學安定性」。化學安定性可藉由偵測及定量抗體之化學變 144870.doc -40- 201036627 化形式來評估。化學變化可包括尺寸改變（例如截短），其 可使用例如尺寸排阻層析、SDS_PAGE及/或基質辅助雷射 脫附離子化/飛行時間式質譜法（MALDI/TOF MS)來評估。 其他類型之化學變化包括電荷變化（例如因去醯胺化產 生）’其可藉由例如離子交換層析來評估。 若醫藥調配物中之抗體對其預期目的而言具有生物活 性，則醫藥調配物中之抗體「保持其生物活性」。舉例而 言，若醫藥調配物中抗體之生物活性處於製備醫藥調配物 時所展現之生物活性的約30%、約20%或約1 〇%(在檢定誤 差内）以内（例如抗原結合檢定中所測定），則生物活性得以 保持。 「等張」可意謂例如相關調配物具有與人類血液基本上 相同之滲透壓。等張調配物一般具有約250至350 mOsm之 滲透壓。等張性可使用例如蒸氣壓滲壓計或冰凍型滲壓計 量測。「張力劑」為促使調配物等張之化合物。 「多元醇」為具有多個羥基之物質，且包括糖（還原糖 及非還原糖）、糖醇及糖酸。本文中較佳之多元醇具有小 於約600 kD(例如在約120至約400 kD範圍内）之分子量。 「還原糖」為含有可使金屬離子還原或與蛋白質中之離胺 酸及其他胺基共價反應之半縮醛基的糖，且「非還原糖」 為不具有還原糖之此等特性的糖。還原糖之實例為果糖、 甘露糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李 糖、半乳糖及葡萄糖。非還原糖包括蔗糖、海藻糖、山梨 糖、松三糖及棉子糖。甘露糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、蘇 144870.doc •41 - 201036627 糖醇、山梨糖醇及甘油盎她 為糖醇之實例。關於糖酸，其包括 L-葡糖一酸及其金屬鹽。多元醇亦可充當張力劑。在本發明 之實施例中’調配物之-種成份為約10至約100 mg/ml(例如1-10%)濃唐夕泰 甘4糖醇。在本發明之一特定實 施例中，甘露糖醇之濃度為3〇至5〇 一(例如3_5%)。在 本毛月之車乂佳實施例中，甘露糖醇之濃度為約 mg/ml(例如 4%)。 如本文所用《、緩冑液」係、指藉由其酸驗結合組份之作 用而抵抗pH值變化的緩衝溶液。本發明所用之緩衝液的 PH值範圍為約4·0至約（5、約4.5至約5·〇、約5.〇至約5 5 ' 約5.5至約6、約6.0至約6.5、約5 7至約6 3、約6 5至約 7.0、約7.5至約8.0。在一實施例中，本發明緩衝液之pH值 為、力5或5以下。在一實施例中，本發明緩衝液之值為約 6將PH值控制在此範圍内之緩衝液的實例包括乙酸鹽（例 如乙酸鈉）、丁二酸鹽（諸如丁二酸鈉）、葡糖酸鹽、組胺 酸、甲硫胺酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽、咪唑及其他有機酸緩 衝液在本發明之一實施例中，缓衝系統包含組胺酸。在 本發明之一特定實施例中，緩衝系統包含組胺酸及甲硫胺 酸°在—實施例中，緩衝系統包含卜50 mM組胺酸（例如5_ 4〇 mM之間、10-30 mM之間或10-20 mM之間），其pH值為 5_7 ’例如約5或約6。在一較佳實施例中，本發明缓衝系 統包含1-50 mM組胺酸（例如5-40 mM之間、10-30 mM之間 或10-20 之間）及1_50 mM甲硫胺酸（例如5-40 mM之 間、10-30 之間或10-20 mM之間），其pH值為5-7，例 144870.doc •42- 201036627 如約5或約6。在—實施例中’緩衝系統包含㈣祕組胺 酸’其PH值為約6。在一實施例中，緩衝系統包含約1〇 mM組胺酸，其pH值為約5或5以下。在本發明之一尤佳實 施例中，緩衝液包含約1〇 mM組胺酸及約1〇 mM甲硫胺 酸，其pH值為約6。在本發明之另一較佳實施例中，緩衝 液包含約10 組胺酸及約1〇 mM甲硫胺酸，其pH值為約 5或5以下。
在本發明之另一實施例中，緩衝系統包含組胺酸及構酸 鹽。在一特定實施例中，緩衝系統包含濃度介於卜5〇 mM 之間（例如5-40 mM之間、10-30 mM之間或1〇_2〇 mM之間） 且較佳為約10 mM之組胺酸，及濃度介於丨_6〇 mM之間（例 如10-50 mM之間、20-40 mM之間）且較佳為3〇 mM之磷酸 鹽（例如磷酸氫二鈉）。在一較佳實施例中，缓衝系統包含 組胺酸、甲硫胺酸及磷酸鹽，例如，緩衝系統包含濃度介 於1-50 mM之間（例如5-40 mM之間、10-30 mM之間或10- ❹ 20 mM之間）且較佳為約10 mM之組胺酸、濃度介於1-5〇 mM之間（例如5-40 mM之間、10-30 mM之間或10-20 mM之 間）且較佳為約1〇 mM之甲硫胺酸，及濃度介於uo mM之 •間（例如10-50 mM之間、20-40 mM之間或20-30 mM之間） 且較佳為約3 0 mM之填酸鹽。 在另一實施例中，緩衝系統包含組胺酸及擰檬酸鹽。在 一特定實施例中，緩衝系統包含濃度介於1_50 mM之間（例 如5-40 mM之間、10-30 mM之間或10-20 mM之間）且較佳 為約10 mM之組胺酸，及濃度介於卜60 之間（例如10- 144870.doc -43- 201036627 50 mM之間或20-40 mM之間）且較佳為約30 mM之檸檬酸 鹽。在一較佳實施例中，緩衝系統包含組胺酸、甲硫胺酸 及檸檬酸鹽’例如’緩衝系統包含濃度介於^” mM之間 (例如5-40 mM之間、10-30 mM之間或10-20 mM之間）且較 佳為約10 mM之組胺酸、濃度介於丨-咒mM之間（例如5_4〇 mM之間、10-30 mM之間或10-20 mM之間）且較佳為約1〇 mM之曱硫胺酸，及濃度介於16〇 mM之間（例如10_5〇 mM 之間或20-40 mM之間）且較佳為約3 〇 mM之摔檬酸鹽。 在另一實施例中，緩衝系統包含咪唑。在一實施例中， 緩衝系統包含濃度介於1_5〇 mM之間、5-40 mM之間、5_ 30mM之間、l〇-30mM之間、1〇_2〇mM之間且較佳為例如 10 mM之咪唑。在一較佳實施例中，緩衝系統包含咪唑及 曱硫胺酸，例如濃度介於UO mM之間（例如5_4〇 之 間、5-30 mM之間、1(M0 mM之間或1〇_2〇 mM之間）且較 佳為10 mM之咪唑，及濃度介於1-50 mM之間（例如5_4〇 mM之間、10-30 mM之間或1〇_2〇福之間）且較佳為約1〇 mM之甲硫胺酸。 在另一實施例中，缓衝系統包含磷酸鹽及檸檬酸鹽，例 如濃度介於1-50 mM之間（例如5_4〇 mM之間、5-30 mM之 間、10-20 mM之間）且較佳為1〇爪厘之磷酸鹽（例如磷酸氫 二鈉），及濃度介於1-50 mM之間（例如5-40 mM之間、5_30 mM之間、10-20 mM之間）且較佳為約10 mM之檸檬酸鹽 (檸檬酸）。 在任一上述緩衝系統中，pH值較佳介於約2與7之間約 144870.doc 201036627 與之間，、勺4與7之間，例如約5或5以下（例如約2與5之 間、約2.撕之間、約3與5之間、約35與5之間、約4、.〇與 5之間或約4.5與5之間）或約6。 -在藥理于意義上’在本發明之情形t ’抗體之「治療有 量」或有效畺」係'指有效預防或治'療抗體治療有效之 :疒的量病症」為將受益於抗體治療之任何病狀。其 包括慢性及急性病症或疾病，包括使個體易患所述病症之 病理學病狀。 〇 r 「防腐劑」為可包括於調配物中以基本上減少其中之細 菌作用，由此例如有利於產生多用途調配物的化合物。潛 在防腐劑之實例包括氯化十八烧基二甲基苯甲基錄、氯化 /、羥季銨（hexamethonium chloride)、氯化苯甲烴銨 (benzalkoniimi chl〇ride)(氯化烷基苯甲基二甲基銨之混合 物，其中烷基為長鏈化合物）及苄索氯銨（benzeth〇nium chloride)。其他類型之防腐劑包括芳族醇，諸如苯酚、丁 ❹ 醇及本曱醇，對經基苯曱酸烧酯，諸如對經基苯甲酸甲酯 或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3_戊 醇；及間曱酚。 冶療」係指治療性處理與預防性措施。需要治療者包 . 括已患病症者以及欲預防病症者。 如本文所用之短語「非經腸投藥」及「非經腸投與」意 謂除腸内及局部投藥以外的通常藉由注射達成之投藥模 式’且包括（但不限於）：靜脈内、肌肉内、動脈内、鞘 内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、經氣管、皮下、 144870.doc -45- 201036627 脊椎内及胸骨内注射 表皮下1節内、囊下、蛛網膜下 及輸注。 如之短語「全身投藥」、「全身投與」、「外周投 =中Γ投與」意謂化合物、藥物或其他物質並非直 神經系統中’而使其進人患者系統且因此經歷 代谢及其他類似過程之投藥，例如皮下投藥。 短語「醫藥學上可接受之載劑」經此項技術公認且包括 適於投與嗜乳動物之醫藥學上可接受之物質、組合物或媒 d。δ亥等載劑包括將本發明藥劑自身體之一個器官或一部 分載運或輸送至身體之另—個器官或—部分所涉及的液體 或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或囊封物質。各載 劑必須在與調配物之其他成份相容且對患者無害之意義上 為「可接受的」。 如本文所用之短語「人類介白素12」或「人類IL_12」 (本文中縮寫為hIL-12或IL-12)包括主要由巨噬細胞及樹突 狀細胞分泌之人類細胞激素。該術語包括包含3 5 kD次單 元（p35)及40 kD次單元（P40)之異源二聚蛋白，p35與p4〇次 單元係由二硫橋連接在一起。該異源二聚蛋白稱作「p 7 〇 久早元」。人類IL-12之結構進一步描述於例如κ〇 b ay a s h i等 人，（1989) J. MeA 170: 827-845 ; Seder等人，（1993) Proc. iVa". <Sci. 90: 10188-10192 ; Ling等人，（1995) J. Exp Med. 1 54: 116-127 ; Podlaski 等人，（i992) jrc/z. 5z_oc/zem· 294: 230-237 ;及 Y〇〇n 等人，（2000) 五 MSO «/owma/ 19(14): 3530-3541 中。術語人類 il-12 欲包 144870.doc •46- 201036627 括重組人類IL-12(rh IL-12)，其可由標準重組表現方法來 製備。 如本文所用之短語「人類介白素23」或「人類iL_23」 (本文中縮寫為hIL-23或IL-23)包括主要由巨噬細胞及樹突 狀細胞分泌之人類細胞激素。該術語包括包含19 kD次單 元（pl9)及40 kD次單元（P40)之異源二聚蛋白，pl9與p40次 早元係由~一硫橋連接在一起。異源二聚蛋白稱作 「p40/pl9」異源二聚體。人類il-23之結構進一步描述於 例如 Beyer 等人，（2008) J. Mo/.別〇/. 382: 942-955 ; Lupardus等人，（2008) «/· Mo/· 5b/. 382: 931-941 中。術語 人類IL-23欲包括重組人類lL-23(rhIL-23)，其可由標準重 組表現方法來製備。 如本文所用之短語「人類IL-12/IL-23之p40次單元」或 「人類IL-12及/或IL-23之p40次單元」或「p40次單元」欲 指人類IL-12及人類IL-23所共有之p40次單元。IL-12/IL-23 之p40次單元之結構描述於例如γοοη等人，（2000)五 19(14): 3530-3541 中。 術語「活性」包括以下活性··諸如抗體對抗原之結合特 異性/親和力’例如抗P40抗體結合IL-12及/或IL-23抗原； 及/或抗體之中和效能，例如抗p40抗體與人類IL-12及/或 人類IL-23之結合抑制人類IL-12及/或人類IL-23之生物活 性，例如抑制PHA母細胞增殖或在人類IL-12受體結合檢定 中抑制受體結合（參見，例如美國專利第6,914，128號之實 例3)。 144870.doc -47· 201036627 短語「表面電漿共振」包括允許藉由例如使用BIAcore 系統（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway，NJ)偵測生物感測器基質内蛋白質濃度變化來 分析即時生物特異性相互作用的光學現象。對於進一步描 述，參見J6nsson，U.等人，（1993) 3狀· C7z’《. 51: 19- 26 ； Jonsson, U.^ A > (1991) Biotechniques 11: 620-627 ；
Johnsson，B.等人，（1995) 乂 Mo/· 8: 125-131 ; 及 Johnnson，B.等人，（1991) B/oc/zem· 198: 268- 277 ° 如本文所用之術語「k^f」欲指抗體自抗體/抗原複合物 解離之解離速率常數（off rate constant)。 如本文所用之術語「Kd」欲指特定抗體_抗原相互作用 之解離常數。 II·本發明之組合物及方法 使用尺寸排阻層析（SEC)、質譜法（MS)及毛細電泳法 (CE)監測片段化，發現組胺酸與金屬（鐵或銅）共同起作用 以使含有λ輕鏈之分子片段化所採用的降解路徑。鐵與組 胺酸均為加速4(TC下抗體分子鉸鏈區中片段化之動力學所 需。單獨之鐵或組胺酸對加速IgG分子片段化之動力學具 ^極小作用或無作用。以多種不同金屬進行之金屬外加研 究（metal spiking study)顯示抗體調配物中鐵或銅之存在以 劑量依賴性方式使抗體裂解。鐵與去鐵胺(一種 螯合劑）之螯合作用阻斷此片段化。對具〇鏈或κ鏈之砂 分子的研究顯示此片段化機制對含有λ鏈之分子具有特異 144870.doc •48· 201036627 J·生。κ輕鏈與λ輕鏈之C末端區域不同，且χ輕鏈在半胱胺酸 殘基之後具有額外絲胺酸殘基。 SEC用於監測凝集物及片段且部分分離在高溫下長時間 培育之後抗體之片段。CE-SDS不僅用於精確定量片段， 而且定量其他降解物質。正常應激批次2MS譜圖展示片 k 2(Fab+Fc)上之主要裂解位點在重鏈之殘基C/D、d/k、 K/T、T/Η及Η/T之間（圖4)。含有鐵及組胺酸之調配物中重 鏈之絲胺酸-2 17殘基與半胱胺酸_21 8殘基（S/C)之間的裂解 增加，且因此在MS譜圖中觀察到HC片段1-21 7之含量升高 (圖6)。類似於正常應激批次，未發現起始於cys_2丨8之相 應Fab+Fc片段。實情為，觀測到起始於天冬胺酸之Fab+Fc 片段（在C/D之間裂解）及據展示向天冬胺酸片段添加27 Da 之物質的增加。在MS譜圖中未觀測到游離(殘基i _ 217)，但偵測到在殘基E/C之間裂解產生終止於麩胺酸之 片段1-215的LC之含量升高。此等結果顯示鐵誘導之裂解 侷限於將HC及LC固定在一起之二硫鍵周圍的殘基。 金屬離子據知以不同方式催化蛋白質之氧化及降解。其 與半胱胺酸殘基之硫氫基直接反應（位點特異性）以產生自 由基或其可與氧反應以產生多種反應性氧物質，諸如超氧 自由基陰離子、髮基自由基及過氧化氫（Li，s等人， (1995) Biotech· and Bioeng. 48: 490-500 ; Li S 等人， (1993) Pharm. Res. 10(11): I572_i579 ; K〇cha，T.等人， (1997) BBA U37: 319-326)。在金屬離子及還原環境 (DTT、抗壞血酸鹽）存在下產生之反應性氧物質（R〇s)將使 144870.doc -49· 201036627 蛋白質骨架裂解（Kim，R.等人，（1985))。在不希望受任何 特定理論束缚之情況下，銅與組胺酸之螯合物有可能催化 多種氧化。鐵與組胺酸之螯合物已有報導（Davis〇n，A. (1968) J. Biol· Chem. 243(22): 6064-6067 ; Lavanant，Η.等 人，（1999) Int. J· Mass Spectrom. 185/186/187: 11-23)。λ 輕鏈具有κ鏈上不存在之游離絲胺酸殘基。新近報導已顯 示終止於C末端絲胺酸殘基之肽在金屬存在下有效水解 (Yashiro, Μ.等人，（2003) Org, Biomol. Chem. 1: 629-632)。 在一實施例中，過濾方法包括透濾、超濾或其組合。在 一實施例中，緩衝液交換方法包括透析。在另一實施例 中，緩衝液交換包括使用脫鹽管柱。在一實施例中，層析 方法包括使用親和層析（諸如蛋白質A層析或弱陽離子交換 層析）來捕捉抗體。 在一實施例中，樹脂交換方法包括使用Chelex_丨〇〇來結 合並剝離金屬。 在一實施例中，LC及HC中之胺基酸經取代或缺失以抑 制金屬及組胺酸相關之裂解。可經取代或缺失之胺基酸包 括λ輕鏈上所存在之c末端絲胺酸殘基。其他殘基包括與重 鏈上之半胱胺酸殘基相鄰之絲胺酸殘基。 III·適用於本發明調配物之抗艘 本發明提供包含於組胺酸緩衝溶液（pH值介於約5與約7 之間）中之抗體且例如在2-8°C之溫度下或在_2〇°c與_丨8〇。〇 之間的溫度下具有增強之安定性、較佳至少約24個月之安 定性的調配物。在本發明之另一實施例中，所主張之調配 144870.doc -50- 201036627 物在至少5次凍融循環之後仍保持安定。在一較佳實施例 中，調配物中金屬之量足夠低以防止抗體裂解，例如抗體 λ輕鏈裂解。所主張之調配物較佳不含金屬。在另—較佳 實靶例中，調配物包含金屬螯合劑，其中在金屬存在下， 抗體在例如1輕鏈之鉸鏈區内不會裂解或較少裂解。在另 實施例中’本發明之醫藥調配物適於以皮下注射單次使 用。 調配物中可用之抗體包括多株抗體、單株抗體、重組抗 體、單鏈抗體、雜交抗體、嵌合抗體、人類化抗體或其片 段。亦可使用含有一或兩個抗原結合位點及免疫球蛋白之 Fc部分的類抗體分子。在本發明之一較佳實施例中，調配 物中所用之抗體包含至少一部分λ輕鏈。本發明調配物中 所用之較佳抗禮為人類抗體。在一較佳實施例中，調配物 含有如下抗體：其為經分離之人類重組抗體或其抗原結合 部分。在另一特定實施例中，抗體為含人鏈抗體或其抗原 結合部分。 在本發明之一態樣中，調配物含有結合IL-12/IL-23之 ρ40次單元之抗原決定基的人類抗體’例如包含九鏈之人類 抗體。在一實施例中，當ρ4〇次單元係與il- 12之ρ3 5次單 元結合時，該抗體結合ρ40次單元。在一實施例中，當ρ4〇 次單元係與IL-23之ρ 1 9次單元結合時，該抗體結合ρ4〇次 單元。在一實施例中，當ρ40次單元係與IL-12之ρ35次單 元結合且ρ4〇次單元亦與IL-23之ρ 19次單元結合時，該抗 體結合ρ40次單元。在一較佳實施例中，抗體或其抗原結 144870.doc •51· 201036627 合部分為如美國專利第6,914，128號所述之抗體，該專利之 全部内容係以引用的方式併入本文中。舉例而言，在一較 佳實施例中，抗體結合IL-12之p40次單元之抗原決定基， 該抗原決定基係與選自由Y61及J695組成之群的抗體（如美 國專利第6,914，128號所述）結合。如美國專利第6,914，128 號所述，人類抗體尤佳為J695。如美國專利第6,902,734號 所述’結合IL-12及/或IL-23且可用於本發明調配物中之其 他抗體包括人類抗IL-12抗體C340，該專利之全部内容係 以引用的方式併入本文中。 在一實施例中’本發明調配物包括抗體（兩種或兩種以 上抗體）之組合或抗體之「混合物（cocktail)」。舉例而言， 調配物可包括抗體J695及一或多種其他抗體。 在一態樣中，本發明調配物含有J695抗體及抗體部分、 J695相關抗體及抗體部分及具有等效於j695之特性（諸如以 較低解離動力學結合hIL-12/IL-23之高親和力以及高中和 能力）的其他人類抗體及抗體部分。舉例而言，在本發明 之一實施例中，如表面電漿共振所測定，調配物含有以 1.34X10·10 Μ 或 1.34ΧΗΓ10 Μ 以下之 KdlxlO—3 s-丨或 lxl〇-3 , 以下之K〇ff速率常數自人類IL-12/IL-23之p40次單元解離的 人類抗體或其抗原結合部分。抗體或其抗原結合部分較佳 以lxlO·4 s·1或lxl0_4 s·1以下之kdf速率常數且更佳以lxl〇·5 s-i 或lxlO·5 s」以下之1<;。打速率常數，或以ΐχΐ〇-ι〇 M或1χ1〇-ι〇 Μ以下之〜且更佳以9.74Χ10·11 Μ或9.74Χ10·11 Μ以下之Kd 自人類IL-12/IL-23之p40次單元解離。 144870.doc •52· 201036627 IL-12/IL-23抗體之解離速率常數（K(jff)可由表面電漿共 振來測定。一般而言，表面電漿共振分析係藉由使用 BIAcore 系統（Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)進行表 面電漿共振（SPR)來量測配位體（固定於生物感測器基質上 之重組人類IL-12)與分析物（溶液t之抗體）之間的即時結 . 合相互作用。表面電漿分析亦可藉由固定分析物（生物感 測器基質上之抗體）且提供配位體（溶液中之重組il_12/il_ 23)來進行（參見，例如us 6,914，128之實例5中所述之檢 〇 定，該專利之内容係以引用的方式併入本文中）。IL- 12/IL-23抗體或其抗原結合部分之中和活性可使用若干適 宜之活體外檢定中之一或多種檢定（參見，例如US 6,914，128之實例3中所述之檢定，該專利之内容係以引用 的方式併入本文中）來評估。 在本發明之另一實施例中，調配物含有中和人類乩_ 12/IL-23之P40次單元之生物活性的人類抗體或其抗原結合 0 部分。在一實施例中，抗體或其抗原結合部分中和游離 p40(例如單體p4〇)或P40同源二聚體（例如含有兩個相同P40 二單元之—I體）之生物活性。在較佳實施例中，當次 •單元係與IL-12之P35次單元結合時及/或當p4〇次單元係與 IL-23之pl9次單元結合時，抗體或其抗原結合部分中和 P40-人單疋之生物活性。在各種實施例中，抗體或其抗原 結合部分在活體外PHA檢定中以1><1〇_7河或1><1〇_7 m以下 之IC5〇、較佳以lxl〇-8厘或1χΐ〇.8 M以下之、更佳以 1x10 Μ或lxio 9 M以下之心、甚佳以1〇 Μ或卜1〇 1〇 Μ 144870.doc •53· 201036627 以下之ICso且最佳以lxl〇-U 1^1或1><1〇-11 M以下之IC5G抑制 人類IL-12誘導之植物血球凝集素母細胞增殖。在其他實 施例中’抗體或其抗原結合部分以丨χ丨〇-ιο Μ或1 X 1 Ο·10 μ 以下之IC5。、較佳以1χ1〇-ιι μ或ΐχΐ〇-π μ以下之IC5〇且更 佳以5x10 12 Μ或5xl〇-12 μ以下之IC5〇抑制人類IL-12誘導 之人類IFNy產生。 在本發明之另一實施例中，調配物含有人類抗體或其抗 原結合部分’該人類抗體或其抗原結合部分具有包含Seq ID ΝΟ:1之胺基酸序列的重鏈cdr3及包含SEQ ID ΝΟ··2之 胺基酸序列的輕鏈CDR3。在一實施例中，人類抗體或其 抗原結合部分另外具有包含SEq ID NO:3之胺基酸序列的 重鏈CDR2及包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列的輕鏈 CDR2。在一實施例中，人類抗體或其抗原結合部分另外 具有包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的重鏈CDR1及包含 SEQ ID NO:6之胺基酸序列的輕鏈cdri。在一尤佳實施例 中，抗體或其抗原結合部分具有包含SEQ ID NO:7之胺基 酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的 輕鏈可變區。本發明調配物之抗體或其抗原結合部分可包 含選自由 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA及 IgE怪定 區組成之群的重鏈恆定區。抗體重鏈恆定區較佳為IgG工。 在各種實施例中’抗體或其抗原結合部分為Fab片段、 F(ab’)2片段或單鏈Fv片段。 含λ鏈抗體之實例’例如可包括於本發明調配物中之含λ 鏈抗體在此項技術中已為熟知且應理解為由本發明所涵 144870.doc •54- 201036627 蓋。含λ鏈抗體之實例包括（但不限於）如國際申請案wo 2007/149032(其全部内容係以引用的方式併入本文中）所述 之抗 IL-17抗體 Antibody 7(Cambridge Antibody Technology)、 抗 IL-12/IL-23 抗體 J695(Abbott Laboratories)、抗 IL-13 抗 體 CAT-354(Cambridge Antibody Technology)、抗人類 CD4 抗體 CE9y4PE(IDEC-151，克立昔單抗（clenoliximab))(Biogen IDEC/Glaxo Smith Kline)、抗人類 CD4 抗體 IDEC CE9.1/SB-210396(凱利昔單抗（keliximab))(Biogen IDEC)、 抗人類CD80抗體IDEC-114(加利昔單抗（galiximab)) (Biogen IDEC)、抗狂犬病病毒蛋白抗體CR4098(弗瑞維如 單抗（foravirumab))及抗人類TNF相關細胞凋亡誘導配位體 受體2(TRAIL-2)抗體HGS-ETR2(來沙木單抗 (lexatumumab))(Human Genome Sciences, Inc.) 〇 IV.調配物製備 本發明提供與此項技術中公認之調配物相比具有改良之 特性的調配物（例如蛋白質調配物及/或抗體調配物）。舉例 而言，與此項技術中公認之調配物相比，本發明調配物具 有改良之存放期及/或安定性。在一實施例中，呈例如液 體狀態或固體狀態之本發明調配物具有至少1 8個月之存放 期。在另一實施例中，呈例如液體狀態或固體狀態之本發 明調配物具有至少24個月之存放期。在一較佳實施例中， 本發明調配物在2-8°C之溫度下具有至少24個月之存放 期。在一較佳實施例中，本發明調配物在約-20°C與-80°C 之間的溫度下具有至少18個月或至少24個月之存放期。在 144870.doc •55- 201036627 另一實施例中，本發明調配物在至少5次針對該調配物之 凍融循環之後仍保持安定。在一較佳態樣中，本發明調配 物包含含至少一部分λ輕鏈之分子（例如抗體），其中與此項 技術中公認之調配物相比，該調配物提供對λ輕鏈片段化 之抗性增強，例如λ輕鏈之裂解減少。 在一較佳態樣中’本發明調配物實質上不含金屬。在一 較佳實施例中，本發明調配物實質上不含選自由Fe2+及 F e 、、且成之群的金屬。在另一較佳實施例中，本發明調配 物實質上不含選自由Cu2+及Cu1 +組成之群的金屬。在一較 佳實施例中，本發明調配物包含足夠低以減少或防止在組 胺酸存在下λ鏈裂解之量的金屬，例如，金屬係以以下濃 度存在：小於約5,060 ppb、小於約L060 ppb、小於約56〇 ppb、小於約500 ppb、小於約450 ppb、小於約400 ppb、 小於約350 ppb、小於約3 10 ppb、小於約3〇〇 ppb、小於約 250 ppb、小於約200 ppb、小於約16〇 ppb、小於約150 ppb、小於約140 ppb、小於約130 ppb、小於約120 ppb、 小於約110 ppb、小於約1〇〇 ppb、小於約9〇 ppb、小於約 80 ppb、小於約70 ppb、小於約6〇 ppb、小於約5〇 ppb、小 於約40 ppb、小於約30 ppb、小於約20 ppb、小於約10 ppb 或小於約1 ppb。在一較佳實施例中，金屬係以小於約16〇 ppb之濃度存在。在一較佳實施例中，金屬係以小於約11〇 ppb之濃度存在。在一尤佳實施例中，金屬係以小於約7〇 ppb之濃度’例如以約60 ppb之濃度存在。最大濃度介於 上述濃度之間的濃度（例如小於約65 ppb)亦欲為本發明之 144870.doc 56- 201036627 -部分。另外’使用上述任何值之組合作為上限及/或下 限之值的範圍（例如約5〇 ppb與約7〇 _之間的濃度）亦欲 包括在内。 在一較佳實施例中，在對本發明調配物進行至少一種移 除金屬之程序(諸如過濾、緩衝液交換、層析或樹脂交換) 之後，該調配物實質上不含金屬。適用於自本發明調配物 中移除金属之程序為熟習此項技術者所知，且在本文中 (例如以下實例中)進一步描述。在另一較佳實施例中，本 發明調配物包含金屬螯合劑，例如使得分子不會在欽鍵區 内裂解或在鉸鏈區内之裂解程度小於不存在金屬螯合劑之 情況下所觀測到的裂解程度。在本發明調配物中，金屬螯 合劑可為例如嗜鐵素；杯芳烴；胺基聚羧酸；羥基胺基羧 S欠，N-經取代甘胺酸；2_(2-胺基_2-側氧基乙基）胺基乙烷 石頁酸（BES);雙牙、三牙或六牙鐵螯合劑；銅螯合劑；及 其何生物、類似物及組合。在一實施例中，金屬螯合劑為 去鐵胺。適用於本發明調配物之金屬螯合劑為熟習此項技 術者所知，且非排他性實例描述於下文。 適用於本發明調配物之特定嗜鐵素包括（但不限於）需 氧菌素、農用桿菌素、固氮菌素、細菌素、n_(5_C3_l(5_ 胺基戊基）羥基胺甲醯基）_丙醯胺基）戊基）_3(5(Ν_羥基乙 醯胺基）-戊基）胺甲醯基）_丙異羥肟酸（去鐵敏、去鐵胺 或DFO或DEF)、去鐵硫素、腸菌素、赤菌素、含鐵色素、 鐵草胺Β、鐵草胺Ε、氟維菌素、鐮菌胺酸c、分枝桿菌 素、副球菌素、假單胞菌素、弧菌素、創傷弧菌素、耶爾 144870.doc -57- 201036627 森桿菌素、奥林菌素及其衍生物、類似物及組合。 適用於本發明調配物之胺基聚羧酸包括（但不限於）氮基 三乙酸（NTA)、反-二胺基環己烷四乙酸（DCTA)、二伸乙三 胺五乙酸（DTPA)、N-2-乙醯胺基-2-亞胺基二乙酸（ada)、 天冬胺酸、雙（胺基乙基）乙二醇趟n,n，n'，n'-四乙酸 (EGTA)、麩胺酸及N,N’_雙（2_經基苯甲基）乙二胺_N，N，_二 乙酸（HBED)及其衍生物、類似物及組合。 適用於本發明調配物之羥基胺基羧酸包括（但不限於）N_ 羥乙基亞胺基二乙酸（HIMDA)、N，N_雙羥乙基甘胺酸 ❹ (bicine)及N-(參羥曱基曱基）甘胺酸（tricine)及其衍生物、 類似物及組合。N-經取代甘胺酸（例如甘胺醯甘胺酸）以及 其衍生物、類似物或組合亦適用作本發明調配物中之金屬 螯合劑。亦可使用金屬螯合劑2_(2_胺基_2_側氧基乙基）胺 基乙烧確酸（BES)及其衍生物、類似物及組合。 適用於本發明調配物之特定杯芳烴包括（但不限於）基於 酚及醛之羥烷基化產物的巨環或環狀寡聚物及其衍生物、 類似物或組合。適用於本發明之特定銅螯合劑包括三伸乙 〇 四胺（trientine)、四伸乙五胺、D_青黴胺、乙二胺、雙吡 啶、菲羅啉、紅菲羅啉、新亞銅靈、紅亞銅靈磺酸鹽、銅 立榮、順，順-1，3,5-三胺基環己烷（TACH)、塔克吡及其衍 生物、類似物及組合。 ' 可用於本發明調配物中之其他金屬螯合劑包括檸檬酸 鹽、羥基吡啶衍生物、腙衍生物及羥基苯基衍生物或菸鹼 基付生物，諸如1,2-二甲基_3_羥基吡啶_4_酮（去鐵酮、 144870.doc -58- 201036627 DFP或奥貝安可）；2-去氧-2-(N-胺曱醯基甲基_[n'-2，-甲基_ 3’-羥基吡啶-4'-酮])-D-葡萄哌喃糖（菲瑞思_G)、吡哆醛異 於驗基腙（PIH)，4,5-二氫-2-(2,4-二經基苯基）-4-甲基嘆唾_ 4-甲酸（GT56-252)、4-[3,5-雙（2-羥基苯基卜以二糾三唑_卜 基]苯甲酸（ICL-670) ; N，N，-雙（鄰羥基苯曱基）乙二胺_N,N，_ 二乙酸（HBED)、5-氯-7-碘-喹啉-8-醇（氯碘羥喹）；及其衍 生物、類似物及組合。 應瞭解，在本發明調配物中可組合使用兩種或兩種以上 上述任何金屬螯合劑之組合。舉例而言，在本發明之一特 定實施例中，調配物包含DTPA與DEF之組合。在另一實施 例中，調配物包含EGTA與DEF之組合。 在一較佳態樣中，本發明調配物包含高蛋白質濃度，包 括例如大於約45 mg/ml之蛋白質濃度、大於約5〇爪“…之 蛋白質濃度、大於約100 mg/ml之蛋白質濃度、大於約11〇 mg/ml之蛋白質濃度、大於約12〇 mg/ml之蛋白質濃度、大 於約130 mg/ml之蛋白質濃度、大於約14〇 mg/mi之蛋白質 遭度、大於約150 mg/ml之蛋白質濃度、大於約16〇 mg/ml 之蛋白質濃度、大於約170 mg/mi之蛋白質濃度、大於約 180 mg/ml之蛋白質濃度、大於約19〇 mg/ml之蛋白質濃 度、大於約200 mg/ml之蛋白質濃度 '大於約21〇 mg/ml2 蛋白質濃度、大於約220 mg/ml之蛋白質濃度、大於約23〇 mg/ml之蛋白質濃度、大於約240 mg/ml之蛋白質濃度、大 於約250 mg/ml之蛋白質濃度或大於約300 mg/ml之蛋白質 /辰度。在本發明之一較佳實施例中，蛋白質包含至少一部 344870.doc •59- 201036627 分λ輕鏈。在本發明之一較佳實施例中，蛋白質為抗體， 】 匕3至少一部分λ輕鏈之抗體。在本發明之一較佳實 施例中’該抗體結合IL-12/IL-23之ρ40次單元。在另一較 佳實施例中，該抗體為J695，例如如美國專利第6,914，128 號所述’该專利之全部内容係以引用的方式併入本文中。 相關抗體之製備係根據此項技術中已知之標準方法進 行。在本發明之一較佳實施例中，於細胞（諸如cH〇細胞） 中表現《周g己物中所用之抗體且由一系列標準層冑步驟純化 3玄抗體。在另一較佳實施例中，抗體係針對IL-12/IL-23之 P40次單元，且根據美國專利第6,914，128號所述之方法製 備’該專利之全部内容係以引用的方式併入本文中。 製備相關抗體之後，製備包含該抗體之醫藥調配物。調 配物中所存在之抗體的治療有效量係例如藉由考慮所要劑 里體積及投藥模式來確定。在本發明之一實施例中，調配 物中抗體之濃度介於每毫升液體調配物約〇 J mg至約25〇 mg抗體之間。在本發明之一實施例中，調配物中抗體之濃 度介於每毫升液體調配物約1 mg至約2〇〇瓜§抗體之間。在 各種實施例中’調配物中抗體之濃度介於約3〇至約14〇 mg/ml之間、約40至約120 mg/mi之間、約5〇至約11〇 mg/ml之間或約60至約1〇〇 mg/ml之間。調配物尤其適於超 過15 mg/ml之大抗體劑量。在各種實施例中，調配物中抗 體之濃度為約 1、10、20、30、40、50、60、70、80、 90 、 100 、 11〇 、 120 、 130 、 14〇 、 150 、 160 、 170 、 180 、 190、200、210、220、230、24〇 或 25〇 mg/ml。在一較佳 144870.doc ~ 60 - 201036627 貫施例中，抗體之濃度為50 mg/ml。在另一較佳實施例 中’抗體之濃度為100 mg/ml。在一較佳實施例中，抗體 之濃度為至少約1 〇〇 mg/ml、至少約110 mg/ml或至少約120 mg/ml。 在本發明之各種實施例中，調配物中抗體之濃度為約 0.1-250 mg/mi、0.5-220 mg/ml、1-210 mg/ml、約 5-200 mg/ml、約 ι〇_195 mg/ml、約 15-190 mg/ml、約 20-185 mg/ml、約 25_180 mg/ml、約 30-175 mg/ml、約 35-170 、約 40-165 mg/ml、約 45-160 mg/ml、約 50-155 mg/ml、約 55_i5〇 mg/mi、約 60-145 mg/ml、約 65-140 mg/ml、約 70J35 mg/ml、約 75_13〇 mg/mi、約 80-125 mg/ml、約 85-120 mg/ml、約 90-115 mg/ml、約 95-110 mg/ml、約95_i〇5 mg/mi或約1〇〇 mg/ml。在上述濃度之間 的範圍（例如約3 1 -174 mg/ml)亦欲為本發明之一部分。舉 例而s ’使用上述任何值之組合作為上限及/或下限之值 的範圍欲包括在内。 在一實施例中，本發明提供一種具有改良之安定性或較 長之存放期的調配物，其包含活性成份（較佳為抗體）以及 多兀醇、界面活性劑及緩衝系統（pH值為約5至7) ^在一實 施例中，調配物進一步包含安定劑。在一實施例中，該調 配物不含金屬。在一較佳實施例中，歷經較長存放期具有 改良之安定性的調配物包含活性成份（較佳為抗體）及甘露 糖醇、組胺酸、甲硫胺酸、聚山梨醇酯80、鹽酸及水。在 另一貫施例中，呈液體狀態之本發明調配物在約2它與81 144870.doc -61- 201036627 有至少約24個月之較長存放期。亦可冷凌本發明調 *進-步延長其存放期。在另—實施例中，本發明調 :物在至少5次針對該調配物之凍融循環之後仍保持安 定。 製備包含於pH值緩衝溶液中之抗體的水性調配物。本發 明緩衝液之PH值範圍為約4至約8，較佳為約4·5至約7,/ 更佳為約5至約7,更佳為約5·5至約6,5,且最佳ρΗ值為約 至約6.2。在一尤佳實施例中，緩衝液之值為約6。 在另一較佳實施例中，緩衝液之ΡΗ值為約5或5以下，例如 2.5 至 5·〇、3.〇 至 5·0、3·5 至 5·0、4.0 至 5_0及 4.5 至 5.0。在上 述ΡΗ值之間的範圍亦欲為本發明之一部分。舉例而言，使 用上述任何值之組合作為上限及/或下限之值的範圍欲包 括在内。將pH值控制在此範圍内之緩衝液的實例包括乙酸 鹽（例如乙酸鈉）、丁二酸鹽（諸如丁二酸鈉）、葡糖酸鹽、 且胺酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽、咪唑及其他有機酸緩衝液。 在本發明之一較佳實施例中，調配物含有包含組胺酸之緩 衝系統。在本發明之一較佳實施例中，缓衝液為組胺酸， 例如L-組胺酸。在較佳實施例中，本發明調配物包含如下 緩衝系統：其包含約UOO mM組胺酸、較佳約5_5〇 mM組 胺酸且最佳10 mM組胺酸。在另一實施例中，調配物包含 含組胺酸及檸檬酸鹽之緩衝系統或含組胺酸及填酸鹽之緩 衝系統。在另一實施例中，調配物包含含咪唑之緩衝系 統。在另一實施例中’調配物包含含檸檬酸鹽及磷酸鹽之 緩衝系統。熟習此項技術者應瞭解，對於液體劑型，可使 144870.doc -62- 201036627 用濃度為例如1-300 mM且最佳150 mM之氯化鈉調節溶液 之毒性。 充當張力劑且可安定抗體之多元醇亦包括於調配物中。 將多元醇以可隨調配物之所要等張性而變之量添加至調配 物中。水性調配物較佳為等張的。所添加之多元醇的量亦 可隨多元醇之分子量而變。舉例而言，與雙醣（諸如海藻 糖）相比’可添加較少量之單醣（例如甘露糖醇）。在本發明
〇 之一較佳實施例中，在調配物中用作張力劑之多元醇為甘 露糖醇。在一較佳實施例中’組合物包含約丨0至約1⑽ mg/ml或約20至約80、約20至約7〇、約3〇至約6〇、約川至 約50 mg/ml甘露糖醇，例如約1〇、約2〇、約3〇、約4〇、約 5〇、約60、約70、約80、約9〇及約1〇〇叫化丨甘露糖醇。 在較佳實施例中，調配物包含約40 mg/ml甘露糖醇（對 應於約4%甘露糖醇）。在一較佳實施例中，組合物包含約 1%至約1〇%之間的甘露糖醇、更佳約2。/。至約6%之間的甘 露糖醇且最佳約4%甘露糖醇。在本發明之另一實施例 中’多元醇山梨糖醇包括於調配物中。 亦可將安定劑或抗氧化劑添加至本文所述之抗體調配物 中。可使用液體劑型與;東乾劑型之安定劑。本發明調配物 可包含甲硫胺酸（例如"硫胺酸）作為安定劑。舉例而 :所氧化形式，甲硫胺酸可起作用以加強調配物 中:存在之其他緩衝液之安定㈣。然而，在本發明之某 i實施例中，在某些情況下，甲硫胺酸： -部分而非作為安定劑存在於調配物中’例如，甲= 144870.doc -63 - 201036627 可以不足以充當安定劑之量存在於調配物中。適用於本發 明調配物之其他安定劑為熟習此項技術者所知且包括（但 不限於）甘胺酸及精胺酸。凍乾劑型可包括低溫保護劑， 主要為蔗糖（例如1-10%蔗糖且最佳0H 〇%蔗糖）。其他適 宜之低溫保護劑包括海藻糖及乳糖。 亦將清潔劑或界面活性劑添加至抗體調配物中。例示性 清潔劑包括非離子型清潔劑，諸如聚山梨醇酯（例如聚山 梨醇酯20、聚山梨醇酯8〇等）或泊洛沙姆（例如泊洛沙姆 188)。所添加之清潔劑的量使得其減少經調配抗體之凝集 及/或使調配物中微粒之形成降至最低及/或減少吸附。在 本發明之一較佳實施例中，調配物包括界面活性劑聚山梨 醇S曰在本發明之另一較佳實施例中，調配物含有清潔劑 I山梨醇酯80或Tween 80。Tween 80為用於描述聚氧乙稀 (20)脫水山梨糖醇單油酸酯之術語（參見FiedUr，卜说⑽ der Hifsstoffe，Editio Cantor Verlag Aulendorf,第 4版， 1996)。在一較佳實施例中，調配物含有0.001%至約0.1% 之間的聚山梨醇酯80或約0.005%與0.05%之間的聚山梨醇 酿80 ’例如約0 001%、約〇 005%、約〇 〇ι%、約〇 或 約〇· 1 °/。聚山梨醇酯80。在一較佳實施例中，本發明調配物 中存在約0.01%聚山梨醇酯80。 如本文之實例所述，可在不會不利地影響抗體分子之安 定性’例如不會促進或增加抗體分子之片段化的情況下使 某些調配物組份包括或存在於調配物中。舉例而言，可在 不會促進或增加抗體片段化之情況下將界面活性劑添加至 144870.doc -64- 201036627 調配物中，該等界面活性劑為例如聚山梨醇酯（例如聚山 梨醇酯80)或泊洛沙姆（例如泊洛沙姆丨88)。可在不會促進 或增加抗體片段化之情況下將多元醇（例如甘露糖醇）添加 至調配物中。亦可在不會促進或增加抗體片段化之情況下 將胺基酸（例如精胺酸）添加至調配物中。可在不會促進或 增加抗體片段化之情況下將有機基緩衝液（例如乙酸鹽）添 加至調配物中。因此，可在不會不利地影響抗體分子之安 定性的情況下使用乙酸鹽（乙酸）以例如降低調配物之 值。此外’可將鹽（諸如NaCl)添加至調配物中，因為調配 物之離子強度對抗體分子之安定性（例如片段化）無影響。 在本發明之一較佳實施例中，調配物為含有下表1所示 之成份之容器中的1 .〇 mL溶液。在另一實施例中，調配物 為容器中之0.8 mL溶液。 表1 :供注射用之1.0 mL J695調配物溶液υ 成份名稱 量 功能 活性物質： 抗體(J695)2) 50.0*100.0mg 活性物質 賦形劑： 甘露糖醇 40 mg 張力劑 聚山梨醇酯80 0.10 mg 清潔劑/界面活性劑 組胺酸 1.55 mg 緩衝劑 ~ 曱硫胺酸 1.49 mg 緩衝劑 注射用水 至1 ml 溶劑 鹽酸 η、一 - 足量 pH值調整至6.0 ^容液密度：1.0398 g/mL 以濃縮物形式使用 在一個實施例中，調配物含有以上鑑別之試劑（亦即抗 體、多元醇/張力劑、界面活性劑及緩衝劑），且基本上不 144870.doc -65· 201036627 諸如笨甲醇、苯酚、間曱酚、氯丁醇 ‘實施例中，防腐劑可包括於調配物 含一或多種防腐劑 及苄索氣按。在另 中，尤其在調配物為多劑量調配物的情況下。—或多種其 他醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或安定劑（諸如
Remington’s Pharmaceutical ，第 16版，〇s〇i a 編’（1980)中所述者）可包括於調配物中，p艮制條件為彼等 不會顯著不利地影響調配物之所要特徵。可接受之載劑、 賦形劑或安定劑在所用劑量及濃度對接受者無毒，包括：
其他緩衝劑；共溶劑；抗氧化劑，諸如抗壞血酸；螯合 劑，諸如EDTA ;金屬錯合物（例如Zn_蛋白質錯合物）；生 物可降解聚合物，諸如聚酯；及/或形成鹽之相對離子， 遠如納離子。 本發明組合物可呈多種形式。此等形式包括例如液體、 半固體及固體劑型’諸如液體溶液(例如可注射溶液及可 輸注溶液）、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、粉劑、脂質 體及栓劑。較佳形式視所欲投藥模式及治療應用而定。典 型較佳之組合物呈可注射溶液或可輸注溶液之形式，諸如ϋ 相似於以其他抗體對人類進行被動免疫所用之組合物。較 佳投藥模式為非經腸(例如靜脈内、皮下、腹膜内、肌肉· 内）在㈤較佳實施例中，抗體係由靜脈内輸;主或注射 =與。在另-較佳實施例中’抗體係由肌肉内或皮下注射 杈一因此，較佳將抗體製備成可注射溶液形式。該可注 射冷液可由液體劑型或凍乾劑型於燧石玻璃小瓶(flint 叫或琥則、瓶、安瓶或預填充注射器中組成。在本發明 144870.doc -66 - 201036627 之-個較佳實施例中，在預填充注射器中製備包含抗體之 安定調配物。 本文之調配物亦可視所治療之特定適應症的需要而與一 4多種其他治療劑組合，該一或多種其他治療劑較佳為具 有不會不利地影響調配物抗體之互補活性的治療劑。該^ •治療劑適宜以有效達成預期目標之量存在於組合中。=等 組合療法宜利用較低劑量之所投與之治療劑（例如經由使 用組合療法可達成協同治療效應，其繼而允許使用較低劑 ° 量之抗體來達成所要治療作用），由此避免與各種單—療 法相關之可能毒性或併發症。在本發明之較佳實施例中， 將結合IL-12/IL-23之P40次單元的抗體與一或多種適用於 治療IL-12/IL-23之p40次單元之活性有害之病症的其他治 療劑一起共同調配及/或共同投與。舉例而言，本發明調 配物之抗體或抗體部分可與一或多種結合其他標靶之其他 抗體（例如結合其他細胞激素（例如IL_丨7)或結合細胞表面 Q 分子之抗體）一起共同調配及/或共同投與。此外，本發明 調配物之抗體可與兩種或兩種以上上述治療劑組合使用。 可與本發明調配物組合之其他治療劑進一步描述於例如美 國專利第6,914,128號第76攔第1〇行至第78攔第53行中。美 . 國專利第6,914,128號之全部内容係以引用的方式併入本文 中〇 欲用於活體内投藥之調配物必須無菌。此易於藉由在製 備調配物之前或之後經由無菌濾膜過濾來實現。 V·調配物投藥 144870.doc -67- 201036627 本發明調配物可用於類似於美國專利第6,914,128號所述 且在下文進一步詳述之適應症’該專利之全部内容係以引 用的方式併入本文中。 在本發明之一態樣中’本發明之安定調配物包含結合 IL-12及/或IL-23(例如結合IL-12及/或IL-23之p40次單元）且 抑制IL-12及/或IL-23之活性（例如抑制il- 12及/或IL-23之 p40次單元之活性）的抗體。如本文所用之術語「抑制IL_ i 2 及/或IL-23活性之調配物」欲包括包含結合〗]^ 12及/或IL-23(例如結合IL-12及/或IL-23之p40次單元）且抑制il-12及/ 或IL-23之活性（例如抑制IL-12及/或IL-23之p40次單元之活 性）之抗體的調配物。 用語調配物之「有效量」為抑制IL-12及/或IL-23活性 (例如抑制IL-12/IL-23之p40次單元之活性），例如預防有害 IL-12及/或IL-23活性相關病況之各種形態症狀及身體症狀 所必需或足夠之量。在另一實施例中，調配物之有效量為 達成所要結果所必需之量。在一實例中，調配物之有效量 為足以抑制有害IL-12及/或IL-23活性（例如IL-12/IL-23之 P40次單元之有害活性）之量。在另一實例中，如表1所 述’調配物之有效量為含有50 mg/ml或100 mg/ml抗體（例 如40 mg或80 mg抗體）之〇.8 mL調配物。在另一實例中， 如表1所述，調配物之有效量為含有50 mg/ml或1〇〇 mg/ml 抗體（例如50 mg或100 mg抗體）之1() mL調配物。有效量可 視諸如個體體型及體重或疾病類型之因素而變。舉例而 吕，抑制IL-12及/或IL-23活性之調配物的選擇可影響構成 144870.doc -68· 201036627 有效量」之物質。一般熟習此項技術者應能夠不經過度 實驗而研究上述因素且對抑制IL-12及/或IL_23活性之調配 物的有效量作出判定。 投藥方案可影響構成有效量之物質。可在有害比_12及/ 或IL-23活性開始作用之前或之後向個體投與抑制〖2及/ ^江-23活性之調配物。此外，可每日或依序施與分次給 樂以及交錯給藥，或給藥可經連續輸注或可經快速注射。
G ❹ 此外，抑制IL-12及/或IL-23活性之調配物的劑量可如治療 或預防情況之緊急性所指示按比例地增加或減少。 術語「治療」&括減輕或緩和至少一種與所治療病況、 病症或疾病相關或由所治療病況、病症或疾病所致之症 狀。舉例而言’治療可減輕病症之_或多種症狀或完全根 除病症。 可改變本發明醫藥調配物申活性成份(抗體)之實際劑量 以獲得有效達成特定患者、組合物及投藥模式所要之治療 反應而對該患者無毒的活性成份之量。 所選劑量將視多種因素而^，該等因素包括調配物中所 存在之抗體的活性；投藥途徑；㈣時間；所用特定化合 物之排泄速率：治療持續時間；與所用特定化合物組合使 用之其他㈣、化合物及/或物f •’所治療患者之年齡、 ^別體重、病狀、-般健康狀況及先前病史；及醫學技 術中所热知之類似因素。 -般熟習此項技術之醫師或獸醫可易於確定及指定所需 本發明醫藥組合物之有效量。舉例而言，醫師或獸醫可以 144870.doc -69 - 201036627 低於達成所要治療作用所需之量開始醫藥調配物中所用之 本發明化合物的給藥，且逐漸增加劑量直至達成所要作用 為止。 一般而言，本發明調配物之適宜日劑量應為該調配物有 效產生治療作用之最低劑量。此類有效劑量一般將視上述 因素而疋。本發明調配物之有效量為抑制罹患IL_丨2及/或 IL-23活性有害之病症的個體之活性（例如 IL-12/IL-23之P40次單元之活性）的量。在一較佳實施例 中，調配物在每次注射時提供4〇 mg、5〇 mg、8〇 或1〇〇 mg之有效劑量的活性成份（抗體）。在另一實施例中調配 物提供約0.1 mg至250 mg範圍内之有效劑量的抗體。必要 時’醫藥調配物之有效日劑量可分2次、3次、4次、5次、 6次或更多子劑量來投與，該等子劑量係在全天以適當時 間間隔、視情況以單位劑型獨立地投與。 在本發明之一實施例中，調配物中抗體之劑量介於約i mg至約200 mg之間。在一實施例中，調配物中抗體之劑量 介於約30 mg與約140 mg之間、約40 mg與約12〇 mg之間、 約50 mg與約11〇 mg之間、約6〇 mg與約1〇〇 mg之間或約7〇 mg與約90 mg之間。在另一實施例中，組合物包括劑量為 例如約 1、10、20、30 ' 40、50、60、70、80、90、100、 110 ' 120 、 130 、 140 、 150 、 160 、 170 、 180 、 190 、 200 、 210、220、230、240 或 250 mg之結合 IL-12及/或 IL-23 之抗 體或其抗原結合片段（例如結合IL-12及/或IL-23之p40次單 元之抗體或其抗原結合片段，例如J695)。 144870.doc -70- 201036627 在上述劑量之間的範圍（例如約2139 mg)亦欲為本發明 之一部分。舉例而言，使用上述任何值之組合作為上限及/ 或下限之值的範圍欲包括在内。 應注意，劑量值可隨有待緩和之病狀的嚴重度而變。應 進一步瞭解，對於任何特定個體，特定給藥方案應根據個 體需要及施與或監督組合物投藥之人員的專業判斷而隨時 間調整，且本文所述之劑量範圍僅為例示性的且不欲限制 所主張之組合物的範_或實施。 本發明提供一種具有較長存放期之醫藥調配物，在一實 施例中，該醫藥調配物用於抑制罹患比_12及/或江_23活性 有害之病症之個體的IL-12及/或IL-23活性（例如IL-12及/或 IL-23之p40次單兀之活性），其包含向該個體投與本發明之 抗體或抗體部分使得個體之比_12及/或IL_23活性得到抑 制。IL-12及/或IL-23較佳為人類IL_12&/4IL_23，且個體 較佳為人類個體❹或者，個體可為表現本發明抗體與之交 叉反應之IL-12及/或IL-23的哺乳動物，此外，個體可為已 引入IL-12及/或IL-23(例如藉由投與比—^及/或江-^或藉 由表現IL-12及/或IL-23轉殖基因）之哺乳動物。可出於治 療目的將本發明調配物投與人類個體（下文進一步論述）。 在本發明之一實施例中，液體醫藥調配物可易於投與，其 包括例如可由患者自我投與之調配物。在一較佳實施例 中，本發明調配物係經由皮下注射投與，較佳單次使用。 此外可出於獸^學目的或作為人類疾病之動物模型將本 發明調配物投與表現抗體與之交又反應之IL_12&^tiL_23 144870.doc •71 - 201036627 的2人類哺乳動物(例如靈長類動物、豬或小鼠)。就後者 而言’該等動物模型可適用於評估本發明抗體之治療功效 (例如測試投藥劑量及投藥時程）。 如本文所用之術語「IL-12及/或比-^之p40次單元之活 性有害之病症」或「IL_12及/或IL-23活性有害之病症」欲 包括如下疾病及其他病症：其中罹患該病症之個體中IL-12及/或a-23(例如其p4〇次單元）之存在已顯示或疑似對該 病症之病理生理學負責或為促使該病症惡化之因素。因 此，IL-12及/或IL_23活性有害之病症為如下病症：其中抑 制IL-12及/或il-23之活性（例如抑制IL_12及/或IL-23之p40 次單7L之活性）預期緩和該病症之症狀及/或減緩其發展。 该等病症可例如藉由罹患該病症之個體的生物流體中IL_ 12及/或IL-23之濃度增加，例如IL_12及/或化—23之p40次單 元之濃度增加（例如個體血清、血漿、滑液等中IL_丨2及/或 IL-23之濃度增加，例如IL_i2及/或il-23之p40次單元之濃 度增加）來證貫’該濃度增加可例如使用上述抗〇 il-12 及/或IL-23抗體偵測。 存在IL-12及/或IL-23活性（例如IL-12及/或IL-23之p40次 單元之活性）有害之病症的諸多實例。該等病症之實例描 述於美國申請案第60/126,603號中，該案係以引用的方式 併入本文中。IL-12及/或IL-23活性（例如IL-12及/或IL-23 之P 4 0次早元之活性）有害之病症的實例亦描述於例如美國 專利第6,914,128號第81攔第9行至第82欄第59行中，該專 利之全部内容係以引用的方式併入本文中。 144870.doc -72- 201036627 下文進一步論述包含結合IL-12及/或IL-23(例如IL-12及/ 或IL-23之ρ40次單元）之抗體的本發明調配物治療特定病症 之用途： 類風濕性關節炎： 介白素-12及介白素-23已暗示在諸如類風濕性關節炎之 發炎疾病方面起作用。已在類風濕性關節炎患者之滑液中 偵測到誘導性IL-12p4〇訊息’且il- 12已顯示存在於類風濕 性關卽炎患者之滑液中（參見’例如M〇rjta等人，（1998) 及/iew則"·㈣ 41: 306-314)。IL-12陽性細胞已 發現存在於類風濕性關節炎滑膜之襯裏下層（subHning layer)中。在類風濕性關節炎之膠原蛋白誘發性關節炎 (CIA)鼠類模型中，在關節炎之前用抗IL_12 mAb(大鼠抗 小鼠IL-12單株抗體，Cl7.15)治療小鼠顯著抑制發作，且 降低疾病之發生率及嚴重度。在關節炎發作之後較早用抗 IL-12 mAb治療降低嚴重度，但在疾病發作之後較晚用抗 IL-12 mAb治療小鼠對疾病嚴重度具有極少作用。使用缺 乏11^-23之|)19次單元或11^12/23之？40次單元的基因靶向小 鼠，IL-23顯示對膠原蛋白誘發性關節炎的發展至關重要 (Murphy等人，（2003) 乂办尸.198(12): 1951 1957)。 因此，本發明之人類抗體及抗體部分可用於治療例如類 風濕性關節炎、青少年類風濕性關節炎、萊姆關節炎 (Lyme arthritis)、類風濕性脊椎炎、骨關節炎及痛風性關 節炎。通常，抗體或抗體部分係全身投與，但對於某些病 症而言，局部投與抗體或抗體部分可為有益的。本發明之 144870.doc -73- 201036627 抗體或抗體部分亦可與一或多種適用於治療自體免疫疾病 之其他治療劑一起投與。 3 ·克羅恩氏病 介白素-12及介白素-23亦在例如克羅恩氏病及潰瘍性結 腸炎之發炎性腸病方面起作用。在克羅恩氏病患者之腸黏 膜中IFN-γ及IL-12之表現增加（參見，例如Fais等人， (1994) 乂 «及es. 14: 235-238 ; Parronchi等人， (1997) Xwer. «/· Ραί/ζο/. 150: 823-832 ; Monteleone等人， (1997) 112: 1169-1178 ; Berrebi等人， (1998) j咖r.丄户—0/· 152: 667_672)。抗几_12抗體已顯示 抑制結腸炎之小鼠模型（例如TNBS誘發性結腸炎IL-2基因 剔除小鼠及新近IL-10基因剔除小鼠）之疾病。在克羅恩氏 病患者中及發炎性腸病之小鼠模型（例如TNBS誘發性結腸 炎及RAG1基因剔除小鼠）中亦觀測到IL-23之表現增加。在 結腸炎之小鼠模型（例如IL-10基因剔除小鼠）中，il_23已 顯示為T細胞介導之結腸炎所必需且為經由 賴性機制促進發炎所必需（參見，例如評述：zhang等人， (2007) Intern. Immunopharmacology 7： 409-416) ° 0 jtb » 本發明之抗體及抗體部分可用於治療發炎性腸病。 C.多發性硬化症 ”白素-12及介白素-23已暗示為多發性硬化症之關鍵介 體。多發性硬化症患者之病變中可展示誘導性IL_12卩4〇訊 息或IL-12本身之表現（Windhagen等人，（1995) 乂五尤/?. 182: 1985-1996 ; Drulovic等人，（1997) 乂^謂， 144870.doc -74· 201036627 147: 145-150))。慢性進行性多發性硬化症患者之IL- 12循環含量升高。對多發性硬化症患者之T細胞及抗原呈 現細胞（APC)之研究揭示一系列自我延續之免疫相互作用
為進行性多發性硬化症之基礎，其引起Thl型免疫反應。T 細胞中IFN-γ之分泌增加會使APC產生IL-12增加，此使循 ' 環得以延續，從而產生Thl型免疫活化及疾病之慢性病況 (Balashov 等人，(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 599- 603)。已使用多發性硬化症之小鼠及大鼠實驗性過敏腦脊 〇 髓炎（EAE)模型來研究IL-12及IL-23在多發性硬化症中之作 用。在小鼠多發性硬化症之復發-緩解型EAE模型中，用抗 IL-12 mAb預先治療會延緩麻痹且降低臨床記分，且在麻 痹處於峰值時或在後續缓解期間用抗IL-12 mAb治療會降 低臨床記分。在EAE小鼠模型中，用針對IL-23之pl9次單 元之抗體治療亦預防誘發EAE且逆轉既定疾病（Chen等 人，2006 «/· TVzveW/gai/on 1 16(5): 1317-1326)。使 用缺乏IL-23之基因靶向小鼠，IL-23顯示對腦部自體免疫
Q 發炎至關重要（Cua等人，（2003) TVaiwre 421: 7440748)。針 對IL-12/IL-23之p40次單元之抗體顯示在多發性硬化症之 - 非人類靈長類動物模型（例如普通絨猿之EAE)中具有有益 活性（Hart等人，2008 Db. 5: 38-52)。 (亦參見評述：Gran等人，2004 Οζ·ί. /mmw/to/· 24: 111-128 ; McKenzie等人，2006 /mmwwo/ 27: 17- 23)。因此，本發明之抗體或其抗原結合部分可用以緩和 人類之多發性硬化症相關症狀。 144870.doc -75- 201036627 腺島素依賴性糖尿病 介白素-12已暗示為胰島素依賴性糖尿病（idDM)之重要 介體。藉由投與IL-12在NOD小鼠中誘發IDDM，且在 IDDM之授受性轉移模型（adoptive transfer model)中抗IL-12抗體具有保護性。早期發作之idDM患者常經歷所謂的 「蜜月期」’在此期間某種殘餘胰島細胞功能保持。此等 殘餘胰島細胞產生騰島素且比所投與之騰島素更好地調控 血糖含量。用抗IL-12抗體治療此等早期發作之患者可預 防騰島細胞遭受進一步破壞，從而維持騰島素之内源性來 源。基於以下觀測結果已暗示IL-23使糖尿病惡化：IL-23 若與低於致糖尿病劑量的多次低劑量之鏈佐黴素 (streptozotocin)共同投與，則會誘發小鼠之糖尿病（參見， 例如評述.Cooke 2006 Dz'aftei. SYmc?· 3(2): 72-75)。因 此，本發明之抗體或其抗原結合部分可用以緩和糖尿病相 關症狀。 ♦ 足·牛皮癖 介白素-12及介白素-23已暗示為牛皮癬之關鍵介體。牛 皮癬包括急性及慢性皮膚病變，其與TH1型細胞激素表現 概況相關（Hamid 等人，（1996) j. AUergy CHn lmmun〇i ι: 225-231 ; Turka等人 ’（1995) Mol. Med 1: 69〇-699)。在小 鼠中，過度表現IL-12/IL-23之P4G次單元與注射重組m 均引起發炎性皮膚病’且將抗江]2 p4〇抗體投與鼠類牛皮 癬模型使牛皮癖病變消解。在患病人_膚#品中制到 IL]2 P35及P4〇 mRNA。在其他研究中，在人類牛皮癣病 144870.doc -76- 201036627 變中觀測到IL-12/IL-23iP4〇次單元與IL_23之pl9次單元 的表現礼加，且在牛皮癖療法之後觀測到比_12及之 表現減少。IL-12之P40次單元之遺傳多形王見象與對牛皮癖 之易感性增加相關聯（參見，例如評述：Torti等人，（2007) •/版h以.細編57(6): 1〇591〇68 ;仙心等人， (2007) 心請加ο/〇π ~〇他 9: 461 467)。亦已鑑 別IL-12及IL-23為牛皮癖性關節炎之關鍵因素（參見，例如 «平述.Hueber 等人，2007 /；«/ηΜ„0/0幻；i 14: 59_ 65)。因此，本發明之抗體或其抗原結合部分可用以緩和 諸如牛皮癬之慢性皮膚病，以及牛皮癣性關節炎。 $ ·其他病症 介白素12及/或介白素23在與涉及免疫要素及發炎要素 之多種疾病相關的病理學方面起關鍵作用。此等疾病包括 (但不限於）類風濕性關節炎、骨關節炎、青少年慢性關節 炎、萊姆關節炎、牛皮癖性關節炎、反應性關節炎、脊椎 Q 關節病、全身性紅斑狼瘡、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、 發炎性腸病、騰島素依賴性糖尿病、甲狀腺炎、哮喘、過 敏性疾病、牛皮癖、皮膚炎、硬皮病、異位性皮膚炎、移 ' 植物抗宿主疾病、器官移植排斥反應、器官移植相關之急 . 性或慢性免疫疾病、類肉瘤病、動脈粥樣硬化、瀰漫性血 管内凝jk、川崎氏病（Kawasaki's disease)、格雷氏病 (Gravis disease)、腎病症候群、慢性疲勞症候群、韋格納 氏肉芽腫病（Wegener's granulomatosis)、亨保-絲奇恩賴紫 癜（Henoch-Schoenlein purpurea)、顯微鏡下腎血管炎、慢 144870.doc -77· 201036627 性活動性肝炎、㈣膜炎、敗血性休克、中毒性休克症候 群'敗血症候群、惡病質、傳染病、寄生蟲病、後天免疫 缺乏症候群、急性橫貫性脊髓炎、亨廷頓氏舞蹈病 (Huntington's chorea) > ^ 4 ^ 3^ (Parkinson's disease) > 阿茲海默氏病（Alzheimer’s disease)、中風、原發性膽汁性 肝硬化、溶血性貧血、惡性疾病、心臟衰竭、心肌梗塞、 艾狄森氏病（Addison’s disease)、偶發性多腺體分泌不 足症及II型多腺體分泌不足症、施密特氏症候群（Schmids syndrome)、成人（急性）呼吸窘迫症候群、禿頭症斑形脫 髮、血π陰性關節病、關節病、雷特氏病（Reiter，s disease)、牛皮癖性關節病、潰瘍性結腸關節病、腸病性 滑膜炎、披衣菌（chlamydia)相關關節病、耶爾森氏菌 (yersinia)相關關節病及沙門氏菌（saim〇neUa^g關關節 病、脊椎關節病、動脈粥樣化病/動脈硬化、異位性過敏 症、自體免疫水皰病、尋常天疱瘡、落葉型天疱瘡、類天 疱瘡、線性IgA疾病、自體免疫溶血性貧血、庫姆氏陽性 /谷血性負血（Coombs positive haemolytic anaemia)、後天惡 性貧血、青少年惡性貧血、肌痛性腦炎/皇家自由疾病 (Koyal Free Disease)、慢性黏膜皮膚念珠菌病、巨細胞動 脈炎、原發性硬化性肝炎、隱源性自體免疫肝炎、後天免 疫缺乏疾病症候群、後天免疫缺乏相關疾病、C型肝炎、 常見變異型免疫缺乏（常見可變型低γ球蛋白血症）、擴張型 心肌症、女性不孕症、卵巢功能衰竭、早發性卵巢功能衰 竭、纖維化肺病、隱源性纖維化肺泡炎、發炎後間質性肺 144870.doc -78· 201036627 病、間質性肺炎、結締組織疾病相關間質性肺病、混合性 結締組織疾病相關肺病、全身性硬化症相關間質性肺病、 類風濕性關節炎相關間質性肺病、全身性紅斑狼瘡相關肺 病、皮肌炎/多肌炎相關肺病、休格連氏病（Sj6grenls disease)相關肺病、僵直性脊椎炎相關肺病、血管炎彌漫 性肺病、血黃素沈積相關肺病、藥物誘發性間質性肺病、 放射性纖維化、阻塞性細支氣管炎、慢性嗜伊紅血球肺 炎、淋巴球性浸潤性肺病、感染後間質性肺病、痛風性關 節火、自體免疫肝炎、1型自體免疫肝炎（經典自體免疫肝 炎或狼瘡性肝炎）、2型自體免疫肝炎（抗LKM抗體肝炎）、 自體免疫介導之低血糖症、B型抗胰島素症伴有黑棘皮 病、副甲狀腺機能減退症、器官移植相關之急性免疫疾 病、器官移植相關之慢性免疫疾病、骨關節炎、原發性硬 化性膽管炎、特發性白血球減少症、自體免疫嗜令性白血 球減少症、NOS腎病、絲球體腎炎、顯微鏡下腎血管炎、 萊姆病（lyme disease)、盤狀紅斑狼瘡、特發性或N〇s男性 不育症、精子自體免疫、多發性硬化症（所有子型）、胰島 素依賴性糖尿病、交感性眼炎、因結缔組織疾病繼發之肺 循環血壓過高、古德巴斯德氏症候群（G〇〇dpasture,s syndrome)、結節性多動脈炎之肺部表現、急性風濕熱、 類風濕性脊椎炎、斯蒂爾氏病（Stiu，s disease)、全身性硬 化症、高安氏病（TakayasU，s disease)/動脈炎、自體免疫血 小板減少症、特發性血小板減少症、自體免疫甲狀腺病、 甲狀腺機能亢進症、甲狀腺腫性自體免疫曱狀腺低能症 144870.doc -79- 201036627 (橋本氏病（Hashimoto's diseau、、 « A e))、萎縮性自體免疫甲狀腺 低此症 '原發性黏液陆 .「玍鄉履水腫、晶狀體源性葡萄膜炎 (phacogenic uveitis)、肩發极 & 於 、發生血官炎及白斑症。本發明之 人類抗體及抗體部分可用於治療自體免疫疾病、尤其與炎 症相關之自體免疫疾病，包括類風濕性脊椎炎、過敏症、 自體免疫糖尿病、自體免疫葡萄骐炎。 本發明之實施將自以下實例 「爲列更充分地瞭解，本文所提供 之该等實例僅供說明之用且 不應視為以任何方式限制本發
明。 本申請案通篇可引用之所有引用參考文獻（包括參考文 獻曰目、4利、專利申請案及網站)之内容皆以引用的方 式月確併人本文中。除非另外說明，$則本發明之實施應: 採用此項技術中所熟知之習知蛋白質分析技術。 例證 貫例1提供用於執行本發明之方法及物質，例如如實例 2 6所用之方法及物質。實例2描述例示性液體π%抗體調 配物之製備。實例3提供展示在_8〇它與251之間反覆凍融◎ 循環期間液體J695調配物之安定性的實驗。實例4提供展 不在各種溫度下長期儲存期間處於冷凍狀態之液體Μ%調 配物之安定性的實驗。實例5提供展示在-801與37。(：之間 反覆凍融循環期間液體J695調配物之安定性的實驗。實例 6提供展不在各種溫度下加速及長期儲存期間液體J695調 配物之安定性的實驗。實例7提供用於執行本發明之方法 及物質’例如如實例8_9所用之方法及物質。實例8展示在 144870.doc -80 - 201036627 組胺酸及金屬（例如銅或鐵）存在下含λ輕鏈之抗體的裂解。 實例9針對抗體調配物及溶液組份之各種參數展示抗體片 段化及其防止。此等參數包括（但不限於）溶液pH值；抗體 濃度；調配物之離子強度；調配物緩衝劑、界面活性劑及 ‘ 安定賦形劑之類型及濃度。實例10展示在各種鐵含量下及 • 不同溫度下J695(100 mg/mL及2 mg/mL)之片段化。
實例1 :用於監測J695安定性之分析方法 實例1.1 :陽離子交換HPLC 〇 陽離子交換HPLC用於使用弱陽離子交換高效液相層析
(具有SPD UV/VIS偵測器之Shimadzu 10AD HPLC或等效儀 器）確定J695藥物之身分及純度。在弱陽離子交換固定相 (Dionex ProPac WCX-10, 4 mmx250 mm ； Dionex Corporation, Sunnyvale，CA)上基於電荷對物質進行解析。以1 mg/mL之 濃度注射100微升物質，且在磷酸鹽緩衝系統中利用漸增 之鹽（氣化鈉）梯度及漸減之pH值梯度（移動相A : 10 mM磷 酸氫二鈉，pH 7.5 ;移動相B : 20 mM磷酸氫二鈉，20 mM 〇 乙酸納，400 mM氯化納，pH 5.0)以1.0 mL/min之流動速 率對樣品組份進行解析。在整個分析中使管柱溫度保持於 - 25°C下，且在注射之前使樣品保持於2-8°C下。藉由將樣 _ 品之相關主峰的相對滯留時間（在280 nm下經由吸光度偵
測）與參考標準物質作比較來確定峰的身分。將測試樣品 層析圖之異質性圖譜與參考標準層析圖譜作比較。各報導 樣品之主要同功異型區、酸性區及鹼性區之峰面積之總 和。除非有不同說明，否則所有試劑皆購自JT 144870.doc -81 - 201036627
Baker(Phillipsburg NJ)。
實例 1.2 : J695結合ELISA 結合ELISA用於相對於參考標準來量測抗IL-12抗體J695 樣品與IL-12之相對結合能力。在此檢定中，經由在2-8°C 下隔夜培育，使rhIL-12蛋白（ABC)結合至96孔微量滴定板 (VWR International, West Chester，PA)。用含有 50%於PBS 中之 Superblock 阻斷缓衝液（Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL)及 0.05% Surfactamp-20(Pierce Biotechnology Inc，Rockford，IL)的50% lx PBS將標準品及樣品自160 ng/mL連續稀釋至0.625 ng/mL，且將其負載至96孔微量滴 定板中塗布有rhIL-12之孔中。隨後用山羊抗人類1经0-HRP(Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL)識別所捕捉之 J695。使用 TMB 受質套組（Pierce Biotechnology Inc， Rockford，IL)作為比色讀出（colorimetric readout)之受質。 以針對標準品及樣品之4參數曲線擬合的「C」值比率來計 算相對結合能力百分比。
實例1.3 :尺寸排阻HPLC 尺寸排阻HPLC用於確定J695之純度（具有SPD UV/VIS偵 測器之Shimadzu 10AD HPLC或等效儀器）。將10微升2,0 mg/mL蛋白質溶液（保持於2-8°C下）注射於管柱上以獲得足 夠信號進行分析。使用Superdex凝膠過濾管柱（GE Healthcare Bio-Sciences Corp，Piscataway，NJ)或類似固定 相及移動相 211 mM Na2S04/92 mM Na2HP04(pH 7.0)以 0.75 mL/min之流動速率將物質等濃度沖提分離。在分析期間使 144870.doc • 82· 201036627 官柱溫度保持於環境溫度下。一式二份注射測試樣品，且 在214 nm下由吸光度偵測單體J695及其他物質。藉由將 J695抗體之面積與樣品中214 nm下吸收性組份之總面積 (緩衝劑相關峰除外）作比較來確定純度。該方法能夠自完 整J695解析出高分子量凝集物及抗體片段。 實例1·4 :膠體藍（Co丨丨〇idai Blue)染色之還原性及非還原 性SDS PAGE凝膠 膠體藍染色之還原性及非還原性SDS pAGE凝膠用於確 〇 定1695之純度。在還原性及非還原性條件下，藉由分別使 用添加或未添加巯基乙醇之樣品緩衝液（2 x tris_甘胺酸 SDS ’ Invitrogen Corp. Carlsbad，CA)來製備樣品。對於還 原性及非還原性凝膠，初始分別用MUliQ水將樣品及標準 η口稀釋至0.4 mg/mL及〇· 1 mg/mL。用樣品緩衝液以丨：i稀釋 樣品，且在約6(TC下將樣品與結合蛋白質並使蛋白質變性 之SDS起加熱約3〇分鐘。結合蛋白質之sds之量與其分 Q 子大小成正比。將分子量標記（標記12，未經染色之]^臀標 記；Invitrogen Corp· Carlsbad，CA)、測試樣品及標準品 (還原性及非還原性）負载於12%(還原性）及816%(非還原 • 性）tns-甘胺酸市售凝膠（Invitr〇gen c〇rp.。小〜七ca)之 獨立色帶上。於lx tris_甘胺酸操作緩衝液中，在前分鐘 使用60 V恆定電壓，且隨後使用125 v恆定電壓直至染料 前沿到達凝膠底部為止來完成蛋白質物質之分離。用膠體 藍染色（InV1tr0gen Corp· Carlsbad，CA)偵測蛋白質。藉由 比較非還原性凝膠十測試樣品與⑽5參考標準之純度概況 144870.doc _83 - 201036627 來達成純度之定性評估。使用掃描密度測定法（具有 Ph〇retix iD密度測定軟體之υΜΑχ掃描儀或等效儀器）以自 還原條件下操作之凝膠上所偵測之重鏈與輕鏈之總和來確 定樣品之純度百分比。 實例1.5 :蛋白質濃度（A280) 分光光度量測法量測J695藥物之蛋白質濃度。一式三份 稀釋樣品以在Λ·下獲得0.3 AU與1.5 AU之間的OD值。使 用Mettler Toledo分析天平以重量分析方式（以重量計）於水 中製備稀釋液。在280 nm下對分光光度計（Beckman DU800或等效儀器）作空白處理。在28〇11111下讀取各樣品及 對照之吸光度，且將所得值針對稀釋度進行校正且除以消 光係數以獲得蛋白質濃度。對於j695，消光係數值 (AU/mg/mL)為 1.42。 實例1.6 : J695生物檢定 基於J695細胞之生物檢定量測j695樣品相較於參考標準 之相對活性。用指定濃度之IL-12刺激NK-92細胞，且將該 等細胞與不同濃度之抗IL-12抗體J695混合。在培育期間， NK-92細胞分泌干擾素_y(IFN_Y)，其與溶液中江_12之量成 比例。使用市售ELISA套組定量IFN-γ之量。使用非線性回 歸计算樣品及參考標準之IC5〇值。以參考標準之活性（平均 ICm值）之百分率來表示個別樣品之活性。 實例2 :製備J695調配物 根據以下方案製備醫藥調配物。 調配物中所用之物質包括：甘露糖醇、組胺酸、曱硫胺 144870.doc •84- 201036627 酸、聚山梨醇酯80、注射用水及鹽酸（其以丨〇%溶液形式使 用以調整pH值）及蛋白質濃縮物（亦即抗體濃縮物）。 實例2.1 ·製備1〇 l緩衝液（等效於10.133 kg -溶液密度： 1.0133 g/mL) 稱出如下成份：400.00 g甘露糖醇、15.5〇 g組胺酸、 14.90 g甲硫胺酸、！ 〇〇 g聚山梨醇酯8〇及9 7〇1呂注射用 藉由將54.80 g鹽酸（37%)與145.2〇 g注射用水組合來製備 10°/。鹽酸溶液。 藉由將以下預稱重成份（上述）溶解於約90%注射用水中 來製備緩衝液：甘露糖醇、組胺酸、甲硫胺酸及聚山梨醇 酯80。緩衝液組份之添加順序不影響緩衝液品質。 添加所有緩衝液組份之後，用1〇%鹽酸將溶液之pH值調 整至約pH 6，且添加最末重量之水。 實例2.2:製備l〇L調配物（等效於1〇 398 kg) 將實例2 · 1中所製備之緩衝溶液依以下方式添力口至經融 化且視^況經彙集之抗體濃縮物中：在製備醫藥調配物之 月j於水冷中融化J695抗體濃縮物。使用約m 抗體濃縮 物乂每毫升蛋白質濃縮物約125 mg蛋白質計其等效於約 〇 kg蛋白夤。濃縮物之密度為約1叫67 。在攪拌下 添加：衝液’直至達到本體溶液之最終重量為止。 、：3有所有成份之最終調配物經由兩個無菌ο”，膜 慮益（親水性聚偏二氟乙埽，孔徑m㈣過慮至經滅菌容 器中使用氮虱對所用過據介質進行過滤滅菌。滅菌之 144870.doc -85· 201036627 後’將調配物包裝以在小瓶或預填充注射器中使用。 熟習此項技術者應瞭解，可使用此項技術中公認之所述 成份分子量將本文所述之重量及/或重量體積比轉化為莫 耳及/或莫耳濃度。本文所例示之重量（例如g或kg)係針對 所述體積（例如緩衝液或醫藥調配物之體積）。熟習此項技 術者應瞭解’當需要不同調配物體積時，可按比例調整重 量。舉例而言’ 32 L、20 L、5 L或1 L調配物應分別包括 320%、200°/。、50%或10%之所例示重量。 實例3 :反覆凍融研究（-肋乞…以期間經安定之液體^% 調配物之物理化學分析 選擇J695抗體之調配物緩衝液之後，在與成品相同之基 質中調配藥物。蛋白質調配之主要目的在於長期保持呈原 生、醫藥活性形式之既定蛋白質的安定性以確保醫藥蛋白 質藥物之存放期為可接受的。通常，藉由以冷凍形式（例 如在-8(TC下）儲存蛋白質或藉由對蛋白質進行凍乾處理（亦 即藉由以凍乾形式儲存蛋白質且在臨用前使其復原）來達 成較長存放期。然而，熟習此項技術者熟知，冷凍及融化 處理常常影響蛋白質安定性，其意謂即使以冷凍形式儲存 醫藥蛋白質仍可能與冷凍及融化步驟所致之安定性損失相 關聯。又，康乾之第-處理步驟包括冷;東，其可能^利地 影響蛋白質安定性。因為已熟知遭遇蛋白質不安定現象之 風險隨蛋白質濃度增加而增加，故在高蛋白質濃度下達2 保持蛋白質安定性之調配條件為一項具有挑戰性之工作。 藉由使藥物在冷凍狀態與液體狀態之間循環夕 * 144870.doc * 86 - 201036627 评估蛋白質濃度為138 mg/mL之J695抗體之凍融行為。藉 助於-80°C控溫冷凍器進行冷凍，且藉助於乃艽控溫水浴 進行融化。將約30 mL J695溶液各填充於30 mL· PETG儲器 中以進行此實驗。表2提供對測試時間間隔及所進行之凍 融循壞次數的概述。定義用於此研究之J695抗體之理想品 質及安定性的準則列於表3中。 表2 :測試時間間隔：所用之冷凍(8〇。〇及融化(251)(：水浴)循璜攻數 測試時間間隔 __ 及測試用本 凍‘循環次數 1品之要求 Γ〇 1 3 5 2* ---- 1* 1* 2*
II
應激測試之儲存溫度 •80°C/25°C循環研究 *數字表示進行取樣及測試之儲器編號 定義用於此研究之J695抗體之理想品質及安定性的準則 與表3所列相同。 表3 .定義用於各種應激研究之J695抗體之理想品質及安定性的參數
測試 ---- 檢驗規格 澄清度 <EP參考懸浮液IV 顏色 <參考溶液BY4 pH值 -- 5.5-6.5 活性ELIS A —_ 70%-130%相對結合能力百分比 SEC HPLC 純度：2 98.0%單體 <2%凝集物 CEX-HPLC ^__一主要層析圖案與參考物質之層析圖案相符 - 主要同功異型物之總和> 85% 1 酸性區之總和< 15% ^ 鹼性區之總和< 1 〇% 膠體還原性SDS-PAGE ---主要條帶圖案與參考標準之條帶圖案相符 ------ 純度：重鏈+輕鏈之總和> 97% 勝體非還原性SDS-PAGE ___^主要條帶圖案與參考標準彳备帶*[§1宏}日錄 *内毒素 —-— <0.2 EU/mg *生物負荷 _________< 1 CFU/mL *此等測試係在零時及研究結束時進行。 144870.doc •87- 201036627 表4中報導評估5次凍融循環之影響的實驗結果，其中 J695係在pH值約6(6.2)下以至少110 mg/mL調配。表4顯示 當如實例2所述調配成本發明之醫藥組合物時，可對J695 抗體進行至少5次反覆凍融循環，而不會對化學特性（陽離 子交換HPLC、尺寸排阻hplc、顏色、pH值）、物理化學 特性（澄清度、還原性及非還原性SDS PAGE)或生物活性 (活性ELISA檢定）產生任何有害影響。 表4 :如實例2所述以138 研究的測試結果 mg/mL調配成調配物之J695抗體之凍融 測試準則 顏色 所比較之安^^5^| 存放期規格 凍融循環次數 數據 ^爹号;1 谷液BY6 S ΕΡ參考溶液Β7 初始測試 <ΒΥ5 ----- ----—^ 1 <ΒΥ5 -----〜 3 <ΒΥ5 澄清度 5 <ΒΥ5 和對芡爹号 >容液/ 懸浮液之報導佶 ~----- 幺ΕΡ參考懸浮液IV 初始測試 <11 — 1 <11 ----— 3 <11 pH值 —— ς ςζΓΓϊ——— 5 <11 >•5 至 6.5 5.0 至 5.4 初始測試 1 6.2 6 2 —^ 3 6.2 活性ELISA (QCA-260) 5 6.2 >70%所觀測之 蛋白質濃度 65% 至 130% 初始測試 89 ---- 1 3 93 99 SEC HPLC 5 101 ： > 90.0% -—---- 純度：單體^ 99% 初始測試 99.5 -- 1 99.4 --- 3 99.4 CEX-HPLC 5 99.4 土晋層析圖案與參考 圖案相符 離胺酸變異體2 80% 初始測試 相符 — 1 相符 ---- 3 相符 ~~----— 5 相符 144870.doc
-88- 201036627 測試準則 所比較之安定性參數 存放期規格 凉·融循環次數 數據 CEX-HPLC 峰1相對滯留時間 0.95-1.05 第一酸性區：S6% 初始測試 1.00 1 1.00 3 1.00 5 1.00 膠體藍染色 還原性SDS-PAGE 主要條帶圖案與參考 標準之條帶圖案相符 N/A 初始測試 相符 1 相符 3 相符 5 相符 膠體藍染色 非還原性 SDS-PAGE 主要條帶圖案與參考 標準之條帶圖案相符 N/A 初始測試 相符 1 相符 3 相符 5 相符 生物負荷 < 1 CFU/mL < 1 CFU/mL 初始測試 0 1 NP 3 NP 5 0 内毒素 < 0.2 EU/mg < 0.2 EU/mg 初始測試 <0.1 1 NP 3 NP 5 <0.1
實例4 :在各種溫度下長期儲存期間處於冷凍狀態之經安 定液體J695調配物的物理化學分析 為順應最終藥品之存放期以及藥品製造策略、最終藥品 之運銷及運輸，將本體蛋白質（亦即藥物、活性醫藥成 份、API)調配成在冷凍狀態中長期保持醫藥蛋白質之安定 性的調配物。理論上，處於冷凍狀態之蛋白質調配物在各 種溫度（例如-80°C、-40°C及-20°C)下保持安定以順應本體 蛋白質製造與藥品填充-成型之間本體蛋白質儲存場所之靈 活性。熟習此項技術者應瞭解，此為極具挑戰性之工作。 144870.doc -89- 201036627 在-20°C與-80°C範圍内之各種溫度下評估蛋白質濃度為 121 mg/mL之J695抗體在控溫條件下之長期儲存安定性。 在指定儲存期之後，將本體蛋白質融化，且評估儲存時間 及儲存溫度對J695安定性的影響。將約1600 mL J695溶液 各填充於2 L聚對苯二甲酸伸乙酯共聚酯（PETG)儲器中。 表4提供對此實驗中所用之測試時間間隔及J695抗體之各 別儲存溫度的概述。 表5中報導評估儲存時間及儲存溫度之影響的實驗結 果，其中J695係在pH值約6(6.2)下以至少110 mg/mL調配。 表5 :測試時間間隔：安定性實驗期間所用之儲存溫度及取樣點 測試# f間間隔(月） 儲存溫度(標稱） 0 0.25 0.50 1 3 6 9 12 18 -80°C 2** 1 1 1 1 1 1 2 1 -40。。* NP NP NP NP 1 NP 1 NP 1 -35。。* NP NP NP NP 1 NP 1 NP 1 -30〇C* NP NP NP NP 1 NP 1 NP 1 -25〇C* NP NP NP NP 1 NP 1 NP 1 -20°CA NP NP NP NP 1 NP 1 NP 1 *數字表示進行取樣及測試之儲器編號 NP=未進行 表6顯示可將J695抗體在-20°C與-80°C範圍内之各種溫度 下儲存至少18個月而不會對物理及化學安定性產生有害影 響。舉例而言，經18個月之儲存時間，J695抗體樣品對於 冷凍抗體溶液所儲存之所有溫度皆展現至少98%之單體含 量。類似地，活性ELISA之數據顯示所測試之J695抗體樣 品展現高活性而與冷凍J695抗體溶液所儲存之溫度無關。 144870.doc •90- 201036627 關於陽離子交換HPLC所監測之J695之化學安定性，數據 顯示當以冷凍形式儲存在-20°C與-80°C之間的溫度下時， J695抗體之化學安定性經至少1 8個月不受影響。總而言 之，數據顯示當如實例2所述調配成醫藥組合物時，可將 J695抗體在-20°C與-80°C範圍内之各種溫度下儲存至少18 •個月，而不會對化學特性（陽離子交換HPLC、尺寸排阻 HPLC、顏色、pH值）、物理化學特性（澄清度、還原性及 非還原性SDS PAGE)或生物特性（活性ELISA檢定、生物負 〇 荷、内毒素含量）產生不利影響。 ❹ 144870.doc -91 - 201036627 蜣雄铖茛銮铖tM*^你 wryrf/饀^s69fw*2gwls/SUITHfst^^^zf#^^*^?l·^獾«^5F綠：9啭 φ^ $ dKslvl fe ·. <ST po<N_
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144870.doc -93- 201036627 α.1 a, w fi. α； 〇.}& 街 cu:珠 Z| 12' 要· Z 要 i.ai： o.i a- g1 要 街 要 耍.萆要 街 要 $ 街要 珠耍 街要
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81 %εvl:$cdcploo(N< wovd-sass 货另 笈¥苯存 ^^00£7S %妹铽MB#-ff 哋州
-95- 201036627 實例5 :反覆凍融研究（_80。(：/37。(：）期間經安定液體J695調 配物之物理化學分析 選擇J695抗體之調配物緩衝液之後，在與成品相同之基 質中調配藥物。
藉由將兩個不同藥物批次（如實例2所述進行調配）自冷 凍狀態至液體狀態循環5次來評估蛋白質濃度為至少1 〇〇 mg/mL之J695抗體藥物的凍融行為。出於此目的，使用2L PETG瓶，其含有於實例2所述之調配物中的約丨6 l J695。 測試準則 初灰 i值 1x2 2x/j L融 3x?| t融 It融 批號 #1 #2 #1 #2 #1 #2 #1 #2 #1 #2 #1 澄清度NTU 5.07 7.72 5.14 7.78 5.03 7.82 4.64 7.63 4.78 7 go A ^ 7 71 Z平均PCS [nml 1.06 1.55 1.07 1.57 1.06 1.54 1.07 1.54 1.08 1.55 1.06 1.52 顯徵銳下可見粒子/ 1.0 mL > 1 μιη 344 39 139 106 94 87 72 76 66 72 78 107 > 25 μιη 尺寸排阻HPLC 0 U 0 υ 0 1 0 1 0 1 〇 0 0 1 0 1 0 1 0 2 0 1 0 凝集物丨％] 0.44 0.69 0.44 0.72 0.44 0.73 0.47 0.75 0.49 0 77 n 單艘1%] 99.42 99.12 99.42 99.09 99.42 99.08 99.40 99.08 99.35 QQ f)S QO U.oZ 片段【％] 0.14 0.19 0.14 0.19 0.14 0.19 0.12 0.18 0.16 0.18 0.15 0.17 表7展示評估於調配物緩衝液中以-8〇。〇起始進行$次珠 融循環之影響的實驗結果。使溶液在調整為37〇c之水浴中 融化’且在完全融化之後立即移出溶液以進行樣品測試。 表7 ·如實例2所述進行調配之J695抗體之;東融研究的測試結果* 表7顯示如澄清度量測、PCS、顯微鏡下可見粒子量測 及尺寸排阻HPLC所監測’可對調配物緩衝液中之J695抗 體藥物進行至少5次凍融而不會對物理化學特性產生任何 有害影響。 舉例而言，經一系列的5次凍融循環，所測試之所有 •96· 144870.doc 201036627 J695抗體樣品皆展現至少98%之單體含量。 殿而言，對 抗體溶液之凍融處理已知具有誘導蛋白質不a 只+女定之高風 險，該不安定可由凝集物增加及顯微鏡下可見教子數目增 多反映。當如實例2所述調配成醫藥組合物時，奸一曰 、左"—系列 Ο
的5次凍融處理循環，監測到凝集物含量幾乎無變化（在所 有測試樣品中之含量皆低於1%)，片段含量無變化（在所有 測試樣品中之含量皆遠低於0.5%)，且顯微鏡下可見粒子 之數目無變化（在整個凍融研究中數據幾乎不變）。 實例6 :加速及長期儲存期間經安定液鱧J69s調配物之物 理化學分析 當在控溫條件下儲存J695藥品時’在各種溫度下評估蛋 白質濃度為100 mg/mL之J695抗體之長期儲存安定性。在 指定儲存期之後，對樣品進行取樣’且評估儲存時間及儲 存溫度對J695安定性之影響。 將約1 mL J695溶液各填充於1 mL玻璃注射器（内包 (primary packing)SFlF007A:與Fluorotec活塞播圈 4023/50組合 之SCF注射器（Becton Dickinson))中以進行此實驗。表8提供 對測試時間間隔及J695抗體之各別儲存溫度的概述。 mg/mL· J695藥品之安定性實驗期間所
間間隔(月) 〜3 /: 1.5 β X X X X X X X X
12_24 X X 表8 :測試時間間隔·· 1〇〇 用之儲存溫度及取樣點 儲存條件
X
+5°C
25〇C/60%RH 40〇C/75% RH X表示對J695樣品進行取樣及分析之時間點 144870.doc •97- 201036627 用广平估液體藥品之安定性的分析測試為經開發之方法 或樂典方法1等方法係如上文針對⑽5液體藥品之測試 所述來應用且如所弓丨用之藥典所述而進行。 表9中報導評估儲存時間及儲存溫度之影響的實驗結 果，其中J695係在PH值約6下以100 mg/mL調配。表9顯示 可將·5抗體在與之間的溫度範圍下儲存至少24個 月而不會對物理及化學安定性產生有害影響。舉例而言， 經24個月之儲存時間，所測試之所有J695抗體樣品在澄清 度、顏色、外觀、顯微鏡下可見粒子含量及1)11值方面皆 保持幾乎不變。此外，經至少24個月，如實例2所述以 100 mg/mL調配之J695展現至少98%之單體含量，其片段 含量运低於0.5%。即使在加速儲存條件下，j695仍高度 安定；即使在40°C下儲存6個月之後，其單體含量仍超過 90%。 關於化學安定性，在2-8°C下歷經至少24個月，如實例2 所述以100 mg/mL調配成組合物之J695抗體展現至少80% 之主要同功異型物含量，其驗性試樣含量遠低於1 〇%，且 酸性試樣含量遠低於20%。即使在加速儲存條件下，J695 仍高度安定；對於冷凍抗體溶液所儲存之所有溫度，甚至 在25t下儲存6個月之後，其主要同功異型物含量仍超過 80%，驗性試樣含量仍遠低於1且酸性試樣含量仍遠低 於 20%。 總而言之，數據顯示當如實例2所述調配成醫藥組合物 時，可將J695抗體在2至8°C下儲存至少24個月，而不會對 -98- 144870.doc 201036627 化學特性（陽離子交換HPLC、尺寸排阻HPLC、顏色、pH 值）、物理化學特性（澄清度、顯微鏡下可見粒子含量、尺 寸排阻HPLC)或其他特性（活性ELIS A檢定、蛋白質濃度） 產生不利影響。 表9 :如實例2所述進行調配之J695抗體之加速及長期安定性研 究的測試結果
測試準則 品質參數 測試持續時間 [月] 儲存 條件[°C/%RH] +5 +25/60 40/75 外觀 無色至淺黃色 溶液 初始 相符 1.5 相符 相符 相符 3 相符 相符 相符 6 相符 相符 相符 12 相符 - - 24 相符 - - 澄清度 乳色至多等同於 參考懸浮液IV ; <RS IV 初始 < RS III 1.5 = RSII < RS III < RS III 3 =RS II < RS III < RS III 6 =RS II =RS II =RS III 12 =RS II - - 24 <RS II - - 顏色(與顏色參考溶液進 行目測比較，EP) 顏色深度至多等 同於參考溶液 BY4 ； < BY4 初始 <BY6 1.5 <BY6 <BY6 <BY6 3 <BY6 <BY6 <BY6 6 <BY6 <BY6 <BY5 12 <BY6 - - 24 <BY6 - - PM 5.55.6.5 初始 6.2 1.5 6.1 6.1 6.1 3 6.2 6.2 6.2 6 6.2 6.2 6.2 12 6.2 - - 24 6.2 - - 144870.doc 99- 201036627 測試準則 品質參數 測試持續時間 [月] 儲存條件[°C/% RH] +5 +25/60 40/75 微粒污染 報導結果 初始 0 可見粒子 (目測評分） 1.5 0.2 0 0 3 0 0 0.3 (根據德國藥典 6 0 0.2 0 進行目測評分） 12 0.1 - - 24 3.1 - - 微粒污染 > 10 μπι : < 6000 初始 > 10 μιη 75 顯微鏡下可見粒子 個粒子/注射器 > 25 μηι 7 2 25 μπι : < 600個 1.5 > 10 μιη 68 158 147 粒子/注射器 > 25 μιη 12 7 7 3 > 10 μιη 88 107 117 > 25 μιη 8 6 15 6 > 10 μιη 169 168 454 > 25 μιη 39 36 56 12 > 10 μηι 112 > 25 μιη 16 24 > 10 μηι 39 > 25 μηι 9 尺寸排阻HPLC 單體：2 90% 初始 Α1 0.9 凝集物：S5% Μ 99.0 F 0.1 1.5 A 1.0 1.3 2.3 Μ 98.9 98.5 96.8 F 0.1 0.2 0.9 3 A 1.0 1.5 3.1 Μ 98.8 98.1 95.1 F 0.2 0.4 1.8 6 A 1.1 1.8 4.4 Μ 98.7 97.6 92.3 F 0.2 0.6 3.3 12 A 1.1 Μ 98.6 - - F 0.3 24 A 1.4 Μ 98.4 - - F 0.2 144870.doc 100- 201036627 1 A:凝集物；Μ:單體；F :片段 測試準則 品質參數 測試持纔時間 [月] 儲存條件[°C/%RH]; +5 +25/60 40/75 陽離子交換HPLC 主要層析圖案與參考 物質之層析圖案相符 主要同功異型物2 80% 鹼性物質S 10% 酸性物質<20% 初始 與參考相符 88.5 0.5 11.1 1.5 相符 88.0 0.6 11.4 相符 86.6 0.6 12.8 不相符 79.6 0.7 19.8 3 相符 87.7 0.7 11.6 相符 85.2 0.8 14.0 不相符 73.3 0.9 25.8 6 相符 88.0 0.6 11.4 相符 83.5 0.7 15.8 不相符 64.1 1.0 34.9 12 相符 87.5 0.5 12.0 24 相符 89.4 0.1 10.4 生物活性ELISA 70-143% 初始 94 1.5 108 101 90 3 95 94 71 6 87 83 63 蛋白質濃度 (OD 280 nm) 90-110 mg/mL 初始 95 1.5 96 96 93 3 97 96 98 6 98 98 99 12 99 24 98
實例7:裂解研究之方法及物質 實例7.1 :物質 最高等級之甲硫胺酸、組胺酸、精胺酸、甘露糖醇、聚 山梨醇酯80、泊洛沙姆188、氣化鈉、磷酸鹽、乙酸鹽、 144870.doc -101 - 201036627 去鐵胺、EDTA、檸檬酸鈉、tris-鹽酸鹽、去鐵硫素、超 氧化歧化酶及丁基羥基甲苯皆購自Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)。N-聚糖酶購自 Prozyme(San Leandro， C A)。硫酸鐵（II)-7H20、硫酸鎂、硫酸鎳（II)、硫酸鈷（II) 及硫酸锰（II)皆購自 Sigma-Aldrich(St. Louis，MO，USA)。 氯化鐵-6H2O購自 Mallinckrodt(Phillipsburg，NJ，USA)。硫 酸銅-5H2〇賭自 EMD Chemicals(Gibbstown, NJ, USA)。硫 酸鋅-7H20購自 JT Baker(Phillipsburg，NJ, USA)。C18捕集 柱（C18 trap)購自 Michrom BioResources(Auburn, CA, US A)，且毛細管：未經塗布之空毛細管（内徑5 0 μιη，總長 3 0 cm)及SDS MW樣品缓衝液皆購自Beckman Coulter(Fullerton，CA, USA)。 實例7.2 :方法 實例7.2.1 :對抗體脫除糖基 使用N-聚糖酶將樣品以酶促方式脫除糖基來簡化質譜。 將約30 μΐ各樣品（濃度約1 mg/mL)添加至2 μΐ 10% w/w正辛 基糖苷及2 μΙΝ-聚糖酶中，且在37°C下培育樣品19小時。 實例7.2.2 :尺寸排阻層析 藉由使用下述兩種方法中之任一方法來進行SEC。（a)使 用 Pharmacia Superdex 200(10/300 GL)管柱（GE Healthcare, Piscataway，NJ)使抗體片段及凝集物與單體分離。在等濃 度沖提條件下使用211 mM Na2s〇4與92 mM Na2HP04(pH 7.0)進行分離。在214 nm下進行偵測，且使流動速率保持 為 0.5 mL/min。通常，將約 1〇〇 μΐ 1 mg/ml溶液（100 pg 負 144870.doc -102- 201036627 荷）注射於管柱上。濃縮自管柱上部分分離之物質，且使 用 10 kD Amicon Ultra-15離心過濾器裝置（Millipore，USA) 將其換至50 mM碳酸氳銨中。通常使用相同方法將經部分 分離之物質再注射於SEC管柱上，但使用較小注射體積（20 μΐ 1 mg/m卜 20 pg 負荷）。（b)或者，使用 TSK Gel G3000 ' SWXL(Tosoh Bioscience)監測抗體之凝集物及片段。在等 濃度沖提條件下使用211 mM Na2S04與92 mM Na2HP04(pH 7·〇)進行分離。在214 nm下進行偵測，且使流動速率保持 〇 為 0.25 mL/min。通常，將約 10 μΐ 2 mg/ml溶液（20 pg 負荷） 注射於管柱上。 實例7.2.3 :質譜法 在耦接至Agilent 1100毛細管HPLC系統（Agilent Technologies, Santa Clara, CA，USA)之API QSTAR pulsar QTOF 質譜儀（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)上 分析樣品。將樣品引入質譜儀中且使用購自Michrom 61〇尺63〇111*063之（^18微捕集柱（八1113111'11，匸八，178八）使之脫 〇 鹽。在水性條件（0.02% TFA，0.08%曱酸，於水中）下負載 樣品歷時前5分鐘以移除鹽，且隨後在有機條件（0.02% • TFA，0.08%甲酸，於乙腈中）下溶離。以約1 mg/mL之濃 度操作樣品，對於1〇 pg負荷注射10 μΐ。為幫助簡化質 譜，在室溫下用50 mM二硫蘇糖醇（DTT)處理樣品30分鐘 以還原二硫鍵且釋放輕鏈及重鏈組份。或者，樣品在未經 還原及脫除糖基以簡化質譜的情況下進行操作。向30 μΐ(近似濃度=1 mg/mL)各樣品中添加2 μΐ 10% w/w正辛基 144870.doc -103- 201036627 糖苷及2 μΐ N-聚糖酶（prozyme)，且在37t下培育19小 時。將質譜儀設定為以正離子模式操作，其毛細管電壓為 4500，m/z掃描範圍對於未經還原樣品為15〇〇_35〇〇且對於 經還原樣品為500至2500。使用腎素受質肽（Sigma目錄號 R-8129)將儀器調諧並校準。使用Bi〇Analyst軟體丨丨版進 行ESI質譜之解卷積（deconvo丨uti〇n)。 實例7.2.4 :毛細電泳法 所有研究皆在Proteomelab PA800 CE系統或P/ACE MDQ 系統（Beckman Ccniher，Inc，Fullerton，CA)上進行，且在 214 nm下進行偵測。使用未經塗布之空毛細管進行分離， 其尺寸為内位50 μιηχ總長30 cm(Beckman Coulter，件號 33 845 1)’且偵測器窗為〇 2微米β在非還原性條件下進行 樣品製備。將約1〇〇 樣品添加至〇 5 mL小瓶中，且添加 適當體積之Milli-Q水，得到100卜丨最終體積。隨後依續添 加 5 μΐ 500 mM 碘乙醯胺、50 μ1 5〇 mM 乙酸鹽（pH 4)、1% SDS緩衝液，得到丨mg/mL最終濃度。將樣品充分混合且 在60C下培育1〇分鐘。最後將樣品轉移至自動進樣器小瓶 中且置於丨〇 c自動進樣益中等待分析。毛細管預操作調 即之方法參數為（使用逆流）在70卩“下鹼沖洗（〇丨N氫氧化 鈉）3分鐘，繼而在7〇 psi下酸沖洗（〇丨N鹽酸）3分鐘，接著 在7〇 psi下水沖洗（Milli_Q水μ分鐘，隨後在7〇 psi下進行 SDS-凝膠填充（SDS MW凝膠緩衝液，目錄號 391163)10分鐘’繼而以MiUi_Q水浸潰來清潔毛細管。在 15 kV下以電動方式注射樣品歷時1〇秒，繼而以水 144870.doc -104- 201036627 浸潰來清潔毛細管。在15 kV下進行電壓分離35分鐘。毛 細管溫度為20-25°C，且樣品儲存溫度為10°C。
實例 7.2.5 : ICP-MS 對樣品進行QTI-Intertek之低解析度ICP_MS(Whitehouse， NJ，USA)及 AQura GmbH之高解析度ICP-MS(Rodenbacher Chaussee 4, D-63457 Hanau，Germany)。對於低解析度ICP-MS，使用Perkin Elmer Elan ICP-MS光譜儀；而對於高解 析度 HR-ICP-MS，使用 Thermo Element XR。 〇 實例7.2.6 :過濾 實例7.2.6.1 :超濾（UF)為一種膜濾類型，其中靜液壓迫使 液體與半透膜相抵壓。抗體保留，而水及低分子量溶質 (諸如鐵鹽）穿過膜。按照Millipore之說明安裝Millipore 30 K Pellicon 2再生纖維素膜。保持製造商之扭矩規格，且 UF系統設有適當壓力計、管及泵。隨後打開適當閥門以開 始超濾。使入口（饋入）壓力及保留物壓力保持在指定範圍 内，且密切監測滲透物流動速率及壓力。每15-30分鐘記
Q 錄數據。超濾完成之後，記錄最終重量且由A28G測定濃 度。 • 實例7.2.6.2 :透濾（DF)為一種與過濾操作（通常為UF)聯合 . 進行之切向流過慮方法，其中添加缓衝液以替換穿過過遽 器損失之溶液量以保持恆定體積。DF用於移除金屬且用新 緩衝液替換原始溶液。沿膜（Millipore 30 K Pellicon 2再生 纖維素膜，按照Millipore之說明）之表面切向泵入流體。 施加穩定壓力以迫使一部分流體穿過膜至濾液一側。如同 144870.doc •105- 201036627 UF —般，IgG分子過大而不能穿過膜孔且保留於上流一 側。所保留之組份不會在膜表面堆積。實情為，其由切向 流沖走。使用至少8倍透渡體積（diavolume)以移除鐵。 實例8 :片段化分析 實例8.1 : IgG分子（J695)在鉸鏈區中之片段化 SEC通常用於監測層析圖中單體峰之減少及其他峰之出 現。圖2展示在40°C下儲存約6個月之後，單株抗體之典型 SEC圖譜。收集四個分離部分（fraction)(分離部分1-4)且隨 後由SDS-PAGE、MS及CE-SDS分析。分離部分1及2分別 表示凝集物及單體抗體。分離部分3含有缺失Fab臂所形成 之100 kDa物質（Fab+Fc或片段2)及低百分率之由重鏈（HC) 與輕鏈（LC)之間的硫醚鍵組成之不可還原（NR)物質（Tous, G.I.等人，（2005) Anal. Chem. 77(9): 2675-82)。分離部分4 含有 Fab 臂（Cordoba，A.J.等人，（2005) J. Chromatogr· B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 818(2): 115-21)。 在還原性條件下由SDS-PAGE對凝集物及單體（圖3’色 帶1及2)之分析展示表觀質量為100 kDa之HC、LC及NR物 質。不可還原之較高有序凝集物存在於分離部分1中且少 量存在於分離部分2中。在還原性條件下對分離部分3(色 帶3)之分析展示HC、LC、NR物質及重鏈之Fc片段（HC-Fc)。對分離部分4(色帶4)之分析展示LC以及HC之Fab片段 (HC-Fab) 〇 亦由ESI/LC-MS分析分離部分3及4。圖4展示在對分離 部分3脫除糖基之後所獲得之譜圖。在IgG分子之重鏈鉸鏈 144870.doc -106· 201036627 區中觀測到使Fab臂缺失之多個裂解位點（峰a-e，概述於表 9中）。在峰a中觀測到主要裂解位點介於殘基His-222與 Thr-223(H/T)之間，且在峰e中觀測到主要裂解位點介於殘 基 Cys-218與 Asp-219(C/D)之間。在 T/H、K/T及 D/K之間存 在少量裂解位點。未發現如Cohen等人，（2007) J· Am. Chem. Soc. 129(22): 6976-7先前所報導在較高pH 8下介於 Ser-217與Cys-218(S/C)之間的裂解位點以及向HC上之天冬 胺酸殘基添加70 Da。 圖5展示由分離部分4獲得之MS譜圖，該分離部分4含有 相應Fab物質（峰f-j，概述於表10中）。 o
表10 :由SEC分離之後不同片段之ESI/LOMS譜圖的概述 麵醯胺酸理論質量~焦麩胺酸理論質量~觀測質量裂解位點 a b c d e f sh 1 jk 1 HC: 223-444 96804.1 96770.1 96781.0 H/T HC: 222-444 96941.2 96907.2 96914.0 T/H HC: 221-444 97042.3 97008.3 97022.1 K/T HC: 220-444 97170.5 97136.5 97157.3 D/K HC: 219-444 97285.6 97251.6 97268.0 C/D HC: 1-218 - 46377.9 46380.2 C/D HC: 1-219 - 46493.0 46492.9 D/K HC: 1-220 - 46621.1 46623.2 K/T HC: 1-221 - 46722.2 46725.0 T/H HC: 1-222 - 46859.4 46861.0 H/T LC: 1-215 - 22927.5 22927.9 E/C HC: 1-217 23159.0 23159.3 S/C 在峰（f)中亦觀察到主要裂解位點介於C/D殘基之間，且 在峰⑴中觀察到主要裂解位點介於Η/T殘基之間。相較於 片段2譜圖，D/K及T/Η之間存在少量裂解位點，且K/T之 間存在較大程度之裂解。圖6中亦展示（峰k及1，概述於表 10中）分離部分4中存在游離輕鏈片段（峰（k)-殘基1-215)及 144870.doc •107- 201036627 重鏈片段（峰（1)-殘基1-217)。如上所述，未觀察到如Cohen 等人，（2007) J. Am. Chem. Soc. 129(22) 6976-7所報導含 有片段21 8-444之相應片段2物質以及向Asp-219殘基添加 70 Da。 亦由CE-SDS分析分離部分3及4。圖7展示分離部分3之 電泳圖及片段2物質（缺失Fab臂）之遷移位置。如完整抗體 之電泳圖中所觀測到，片段2自主要單體峰以及其他峰完 全解析出，因此為後續分析提供對此片段含量之精確評 估。分離部分4展示完整Fab以及LC及HC片段。 實例8.2-在組胺酸存在下，鐵或銅之存在以劑量依賴性方 式使IgG分子裂解 在一實施例中，當鐵及組胺酸存在於調配物中時，在 40°C下培育含λ輕鏈抗IL-12抗體J695第1批次加速該抗體於 鉸鏈區中之片段化（表11)。 表11 : SEC分析顯示在40°c下J695第1批次之片段化及凝集增強 時間點 單體百分比 凝集物百分比 片段百分比 Mab-第1批次 初始 99.4 0.43 0.17 正常批次 初始 99.5 ? 0.05 0.4 ? 0.07 0.1 ? 0.01 Mab-第1#次 1M 99.2 0.58 0.20 正常批次 1M 99.5 ? 0.05 0.5 ? 0.06 0.1 ? 0.01 Mab-第1批次 正常批次 1M 1M 98.6 99.0 ? 0.08 1.09 0.8 ? 0.08 0.2 0.31 ? 0.01 Mab-第1批次 1M 93.1 2.22 4.73 正常批次 1M 98.1 ? 0.1 1.4 ? 0.08 0.5 ? 0.04 在40°C下，相較於5個正常批次所獲得之平均值0.5%， J695第1批次之片段化程度高達4.73°/。。使用CE-SDS精確 144870.doc -108· 201036627 估算片段2(Fab+Fc)之含量，且展示在J695第1批次中其含 量高達3倍（表12)。 表12:對不同降解物質之CE-SDS分析 LC/HC片段 HC/FAB 片段2 正常批次 Mab-第1批次 正常批次 Mab-第1批次 正常批次 Mab-第1批次 40°C 0.45 1.11 0.58 0.86 1.59 4.20 25〇C 0.16 0.33 0.30 0.33 0.84 1.05 5°C 0.17 0.28 0.28 0.24 0.74 0.69 由CE-SDS定量其他降解物質，且Fab片段之含量升高。 〇 片段（LC/HC片段）之含量亦顯著升高。 所進行之許多研究並不支持蛋白酶活性為J695第1批次 之片段化增加的原因。舉例而言，與蛋白酶抑制劑混合物 一起培育並不降低片段化程度，且在移除單株抗體之後， 宿主細胞蛋白質之二維凝膠電泳及鑑別亦未顯示存在污染 性蛋白酶之證據（結果未示）。 在40°C下使用10,000 MWCO膜針對檸檬酸進行透析之後 恢復至正常片段化程度（圖8)，其表明金屬涉及於J695第1 ❹ 批次之片段化增強。隨後進行許多實驗以評估金屬在片段 化中之作用。由ICP-MS分析J695第1批次以及其他批次中 64種不同元素之存在。使用高解析度icp_ms，此等研究 顯示J695第1批次相較於5個正常批次具有十倍鐵含量（5〇〇 * ppb)(表 13)。 表13:由高解析度ICP-MS對鐵含量之分析 一 鐵(PPb) ~
Mab-第1批次 500 其他批次 63 ? 1〇 144870.doc • 109- 201036627 於正常批次中向抗辦媒53 t 几體樣。°外加不同含量之金屬鹽(2.5、 1 0及50 ppm)且在4(Tr下i立女 . L下均月。如圖9所示，含氧化態之鐵 或銅的調配物顯示片段化（片段2)以劑量依賴性方式增加。 所測試之其他金屬對片段化無影響。外加5〇〇 ppb^(2 5 ppm鐵鹽）所觀測到之片段化程度類似於：695第丄批次所觀 測到之片段化程度。表14概述如CE_SDS所分析由不同金 屬誘導之抗體降解的概況。分析之前，將抗體樣品在4〇。〇 下儲存1個月。在鐵或銅存在下Fab、游離LC/HC片段及片 段2(Fab+Fc)之含量皆升高，且在其他金屬存在下無變化。 表14:在不同金屬存在下之片段化概況的CE-SDS分析 LC/HC片段 HC/FAB 片段2
10 ppm
Fe
Fe: 3+ 2+
1.40 0.72 3.02 1.41 0.72 3.07 1.26 0.72 3.04 0.62 0.60 1.54 0.65 0.60 1.58 0.68 0.62 1.54 0.65 0.59 1.54 0.65 0.62 1.66 1.96 0.82 4.20 2.45 0.92 5.20 2.08 1.00 4.78 0.66 0.61 1.59 0.69 0.61 1.66 0.68 0.59 1.52 0.68 0.60 1.52 0.78 0.62 1.86 2.22 0.92 4.50 2.67 1.06 5.28 2.56 1.21 5.37 0.59 0.59 1.56 0.66 0.60 1.58 0.58 0.62 1.50 0.53 0.34 1.00 0.76 0.63 1.72
Mg2+ Ni?+ Co2+ Mn2+ 50 ppm Fe3+ Fe2+
Mg2+
Ni?+
Co2+
144870.doc 110- 201036627 實例8·3:鐵與去鐵胺(鐵特異性整合劑)之餐合阻斷片段化 將1695第1批次與1蝴去鐵胺（鐵特異性聲合劑）-起培 育。在40。(：下培育1個月之後顴丨 便規測到正常片段化程度（圖 10)。外加鐵（500 ppb)之正當 一 ^ ; *抗體批次顯示片段含量升 南’藉由與去鐵胺一起預培育作兮玺μ饥人 σ月便该等片段含量恢復至正常 含量（圖10)。 實例8.4:組胺酸與鐵催化之片段化增強
研究組胺酸對金屬誘導之片段化的作用（圖u)。將正常 批，之單株抗體針騎水進行透析q獨添加鐵⑼ppm) 或單獨添加組胺酸（10 mM)，或將鐵（50 ppm)與不同濃度 (2、5及10 mM)之組胺酸在恆定pH 6〇下一起添加至單株 抗體中，且在4(TC下培育一週。如圖u所示，與對照含量 相比，組胺酸抑或鐵之單獨存在均不會使抗體片段化顯著 增加。然而，當抗體與鐵及組胺酸一起培育時，觀測到片 段化以劑量依賴性方式增加，此表明調配物中所添加之組 胺酸含量可對鐵誘導之片段化起顯著作用。 實例8.5 :正常應激批次與』695第1批次中金屬催化之片段 化之間的MS譜圖比較展示相異的裂解概況 圖12展示在對片段2(Fab+Fc)脫除糖基之後MS譜圖之比 較。J695第1批次中鉸鏈區序列SCDKTHTC中之Cys-218與
Asp-219(C/D)之間的裂解顯著增加，而該分子上其他裂解 位點處之裂解並未增加。然而，對Fab物質之分析（圖13)顯 示J695第1批次中此裂解位點處相應Fab片段（殘基1-218)之 含量與正常應激批次相當，而在Ser-217與Cys-218(S/C)之 144870.doc -111 - 201036627 間裂解之游離HC片段顯著增加，產生殘基1-217之HC片段 (圖 14)。Cohen 等人（(2007) J. Am. Chem. Soc. 129(22) 6976-7)新近展示S/C鍵之間的裂解經由β消除機制發生。此 機制在較高pH值（pH 8)下普遍存在，且在於首先LC-HC二 硫鍵斷裂，隨後去氫丙胺酸殘基水解，得到終止於絲胺酸 醯胺（添加1 Da質量）之Fab片段及具有丙酮醯基（向天冬胺 酸殘基添加70 Da質量）之C末端Fc片段。結果表明殘基C/D 之間的裂解位點增加及向天冬胺酸殘基添加27 Da(表14中 之峰C)，此表明水解機制不同。在J695第1批次中觀測到 在E/C之間裂解之游離輕鏈（殘基1-2 15)之含量增加（圖 14)。表15概述所收集之用於比較不同MS譜圖的數據。 表15:不同片段之ESI/LC-MS譜圖之概述
峰 殘基 麩醯胺酸理論質量 焦麩胺酸理論質量 觀測質量裂解位點 A HC: 223-444 96804.1 96770.1 96777.0 H/T B HC: 219-444 97285.6 97251.6 97257.3 C/D C HC: 219-444 97284.2 C/D D HC: 1-218 46377.9 46377.7 C/D E HC: 1-219 46493.0 46494.4 D/K F HC: 1-220 46621.1 46623.6 K/T G HC: 1-222 46859.4 46859.4 H/T Η LC: 1-215 22927.5 22926.7 E/C I HC: 1-217 23159.0 23159.5 S/C 實例8.6:裂解機制特定針對含λ鏈分子 研究鐵及組胺酸催化具有κ或λ輕鏈之抗體分子水解的能 力。兩個具有λ LC之IgG分子因鐵及組胺酸而裂解，而具 有κ LC之IgG分子不會裂解（圖15)。圖16展示在周圍觀測 到IgG分子水解之殘基的序列。 實例9 :加速安定性研究 144870.doc -112- 201036627 在一貫施例中，當鐵及組胺酸存在於調配物中時，在 40°C下培育含λ輕鏈抗IL_12抗體J695加速該抗體在鉸鏈區 中之片段化。因此，選擇40〇c之培育溫度進行此等研究。 為明確區分溫度本身誘導之抗體片段化與鐵及組胺酸之存 在所誘導之片段化，所有加速安定性研究皆以用參考調配 物（亦即含有組胺酸而缺乏鐵之各別調配物）對陽性對照（亦 即含有鐵及組胺酸之抗體調配物）作空白處理之方式來設 計及進行。 於無菌、無熱原質之聚丙烯低溫小瓶中填充實例9·丨至 9.15所列實驗中測試之所有各種；695調配物，且在4〇1下 培育長達3個月。在預定時間點（亦即在τ〇時，在4〇〇c /75〇/〇 RH下儲存T1個月之後及丁3個月之後），對所有調配物之樣 品進行取樣，且如7.2_2所述由SEC測定各種調配物中之抗 體片段化程度。 實例9.1 :在鐵存在下、於溶液pH 5下J695之片段化 在pH 5.0下於以下組合物中以2 mg/mL調配抗體J695 : a) 10 mM甲硫胺酸、1〇瓜厘組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 ;及 b) 10 mM甲硫胺酸、1〇 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80及0.5 ppm鐵。 另外，在pH 5.0下於以下組合物中以1〇〇 mg/mL調配抗 體J695 : c) 10 mM曱硫胺酸、1〇 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01°/。（m/v)聚山梨醇酯80 ;及 144870.doc 113 201036627 d) 10 mM曱硫胺酸、l〇 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0·01°/〇 (m/v)聚山梨醇酯 80、0.5 ppm鐵。 此等研究之結果列於表15.1中。該等結果顯示在2 mg/mL 下，與對照（亦即缺乏鐵之調配物）相比’ J695調配物中鐵及組 胺酸之存在促進J695片段化。然而，該等結果亦顯示pH值降至 5使J695免於經歷鐵-組胺酸介導之片段化。在pH 6.0或pH 7.0 下未觀測到此片段化減少（參見，例如下表15.2及下表15.3)。 表15.1 :在加速安定性研究期間不同調配物中J695之片段含量 —配物組成 TO, TH固月， 40°C T3個月，_ 40°C pH 5，2 mg/mL J695、10 mM 甲硫胺酸、 10mM組胺酸' 40 mg/mL甘露糖醇、 0.01 % (m/v)聚山梨醇酯80 3.9 4.5 11.4 pH5，2mg/mLJ695、10mM甲硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80、0.5 ppm鐵 4.3 6.1 18.9 pH5，100mg/mLJ695、10mM甲硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01 % (m/v)聚山梨醇酯80 3.2 5.6 14.1 pH5，100mg/mLJ695、10mM曱硫胺酸、 10mM組胺酸、40mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80、0.5 ppm鐵 3.2 5.8 14.8 實例9.2 :在鐵存在下、於溶液pH 6下J695之片段化 在pH 6.0下於以下組合物中以2 mg/mL調配抗體J695 : a) 10 mM甲硫胺酸、1 0 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 ; b) 10 mM甲硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80及0.5 ppm鐵；及 c) 10 mM甲硫胺酸、1〇 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01。/。（m/v)聚山梨醇酯8〇及2.5 ppm鐵。 144870.doc • 114* 201036627 另外’在pH 6.0下於以下組合物中以loo mg/mL調配抗 體J695 : d) 10 mM曱硫胺酸、1〇 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 ; e) 10 mM曱硫胺酸、1〇 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 . 0.01% (m/ν)聚山梨醇酯80、0.5 ppm鐵；及 f) 10 mM曱硫胺酸、1 〇爪河組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯 80、2.5 ppm 鐵。
〇 此等研究之結果列於表15.2中。該等結果顯示在2 mg/mL 與100 mg/mL J695下，與對照（亦即缺乏鐵之調配物）相比， J695調配物中鐵及組胺酸之存在引起實質性J695片段化。該 等結果另外顯示鐵含量增加使得J695片段含量增加。 表15.2 :在加速安定性研究期間不同調配物中J695之片段含量 ::調配物組成 .. . .. ........ ..... · ... :. ' ... TO, 5°C T1個月， 40°C T3個月， 40°C pH6 ’ 2mg/mLJ695、10mM曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 3.3 4.2 11.0 pH6 ’ 2mg/mLJ695、10mM曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80、0.5 ppm鐵 3.5 14.0 27.9 pH6，2mg/mLJ695、10mM甲硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80、2.5 ppm鐵 3.5 15.0 28.6 pH6 ’ 100mg/mLJ695、10mM 曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 3.1 3.9 10.8 pH6 ’ 100mg/mLJ695、10mM曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯 80、0.5 Dnm铖 3.6 7,2 18.4 pH6 ’ 100mg/mLJ695、lOmM甲硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80、2.5 ppm@ 3.1 9.3 23.7 144870.doc -115- 201036627 實例9·3 :在鐵存在下、於溶液pH 7下J695之片段化 在pH 7.0下於以下組合物中以2 mg/mL調配抗體J695 : a) 10 mM曱硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 ;及 b) 10 mM甲硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇醋80及0.5 ppm鐵。 另外，在pH 7.0下於以下組合物中以100 mg/mL調配抗 體J695 : c) 1 0 mM甲硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0_01°/〇 (m/v)聚山梨醇酯80 ;及 d) 1 0 mM曱硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇醋 80、0.5 ppm鐵。 此等研究之結果列於表1 5.3中。該等結果顯示在廣泛蛋 白質濃度範圍（亦即2 mg/mL至100 mg/mL)内，與對照（亦 即缺乏鐵之調配物）相比，J695調配物中鐵及組胺酸之存 在促進J695片段化。該等結果另外顯示因鐵-組胺酸介導 之片段化所致之J695片段化取決於調配物之pH值。如表 15.3所示，pH值高於6.0之調配物（表15.3)更傾向於片 段化。在100 mg/mL及pH 7.0下片段化處於平穩狀態，而 在2 mg/mL及pH 7.0下片段化繼續增加。 144870.doc -116- 201036627 表15.3 ·在加速安定性研究期間不同調配物中J695之片段含量 調配物組成 _5偏_| T1個月， :_购::::: T3個月， 40°C pH7，2mg/mLJ695、10mM甲硫_酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01 % (m/v)聚山梨醇酯8〇 3.5 6.1 15.4 pH 7 ’ 2 mg/mL J695、10 mM 曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80、0.5 ppm鑪 3.2 25.6 49.8 pH7 ’ 100mg/mLJ695、10mM甲硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 3.3 4.9 13.9 pH7 ’ 100mg/mLJ695、10mM甲硫胺酸、 10mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇醋80、0.5 ppm鐵 2.9 10.6 24.0 實例9.4:各種離子強度條件下J695之片段化 在pH 6·0下於以下組合物中以2 mg/mL調配抗體J695 : a) 10 mM甲硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 ; b) 10 mM甲硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80及0.5 ppm鐵； c) 10 mM甲硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯 80及 150 mM NaCl ;及 d) 10 mM曱硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯 80、0.5 ppm 鐵及 15〇 mM NaCl。 另外，在pH 6.0下於以上所列之組合物（a)至（d)中以1〇〇 mg/mL調配 J695。 此等研究之結果列於表15.4中。該等結果顯示在2 mg/mL與1〇〇 mg/mL J695下’與對照（亦即缺乏鐵之調配 144870.doc • 117- 201036627 物）相比，J695調配物中鐵及組胺酸之存在引起實質性J695 片段化。該等結果另外顯示離子強度不影響鐵-組胺酸介 導之J695片段化。 表15.4 :在加速安定性研究期間不同調配物中J695之片段含量 調配物組成 το, 5°C T1個月， 40°C T3個月， 40°C pH 6，2 mg/mL J695、10 mM 甲硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 3.3 4.2 11.0 pH 6，2 mg/mL J695、10 mM 曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇S旨80、0·5 ppm鐵 3.5 14.0 27.9 pH6，100mg/mLJ695、10mM甲硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01 % (m/v)聚山梨醇酯80 3.1 3.9 10.8 pH6，100mg/mLJ695、10mM曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇醋80、0.5 ppm鐵 3.6 7.2 18.4 pH6，2mg/mLJ695、10mM甲硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01%(m/v)聚山梨醇S旨80、150mMNaCl 2.9 4.9 13.5 pH6，2mg/mLJ695、10mM曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、. 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80、0.5 ppm鐵、 150 mMNaCl 2.6 9.6 20.2 pH6，100mg/mLJ695、10mM 甲硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80、150 mMNaCl 2.7 4.2 11.9 pH 6，100 mg/mL J695、10 mM 甲硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇S旨 80、0.5 ppm鐵、 150 mMNaCl 2.6 6.7 18.0 實例9.5 :在鐵及組胺酸存在下、於溶液pH 6下在精胺酸 緩衝液中調配之J695的片段化 在pH 6.0下於以下組合物中以2 mg/mL調配抗體J695 : a) 3 0 mM精胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 144870.doc -118· 201036627 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 ;及 b) 30 mM精胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80及0.5 ppm鐵。 另外，在pH 6.0下於以下組合物中以mg/mL調配 J695 ： c) 30 mM精胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 ;及 d) 30 mM精胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 〇 0.01% (m/v)聚山梨醇酯 80、0.5 ppm鐵。 此等研究之結果列於表15.5中。該等結果顯示與對照（亦 即缺乏鐵之調配物）相比，J695調配物中鐵及組胺酸之存 在引起J695片段化，且其他有機基緩衝液及基於胺基酸之 緩衝液（諸如精胺酸）的存在不影響鐵-組胺酸介導之J695片 段化，而與蛋白質濃度（例如2 mg/mL或100 mg/mL)無關。 表15.5 :在加速安定性研究期間J695調配物之片段含量 調配物組成 T0, 5V T1個月， 40°〇 T3個月， 40°C pH ό，2 mg/mL J695、30 mM精胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01 % (m/v)聚山梨醇酯80 3.2 7.1 15.0 pH 6，2 mg/mL J695、30 mM精胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (mA〇聚山梨醇酯80、0.5 ppm鐵 3.3 10.3 23.2 pH 6，100 mg/mL J695、30 mM精胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨酵酯8〇 2.2 4.7 13.8 pH ό ’ 100 mg/mL J695、30mM精胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01%(111~)聚山梨醇酯8〇、〇51)1}111鐵 2.5 7.7 20.5 144870.doc -119- 201036627 實例9.6 :在鐵及組胺酸存在下、於溶液pH 6下在磷睃鹽 緩衝液中調配之J695的片段化 在pH 6.0下於以下組合物中以2 mg/mL濃度調配抗體 J695 ： a) 30 mM磷酸鹽、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 ;及 b) 30 mM磷酸鹽、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01 % (m/v)聚山梨醇醋80及0.5 ppm鐵。 另外，在pH 6·0下於以下組合物中以1〇〇 mg/mL調配抗 體J695 : c) 30 mM構酸鹽、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 ;及 d) 30 mM鱗酸鹽、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯 80、0.5 ppm鐵。 此等研究之結果列於表15.6中。該等結果顯示在2 mg/mL與100 mg/mL下，J695調配物中鐵及組胺酸之存在 未引起J695片段化。該等結果另外顯示在抗體調配物中麟 酸鹽之使用減少鐵-組胺酸介導之抗體片段化，而與蛋白 質濃度（例如2 mg/mL或100 mg/mL)無關。 I44870.doc -120· 201036627 表15.6 :在加速安定性研究期間不同調配物中J695之片段含量 調配物組成 爾ί:參:::::: '丨:¾ 輸:::::¾.. T1個月， :::.::::::::4〇爲;::::::::::: T3個月， 40°C pH 6，2 mg/mL J695、30 mM鱗酸鹽、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 2.5 9.3 20.5 pH 6，2 mg/mL J695、30 mM石离酸鹽、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇醋80、0.5 ppm鐵 2.2 9.3 21.8 pH6，100mg/mLJ695、30mM磷酸鹽、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 2.0 4.4 12.6 pH 6，100 mg/mL J695、30 mM填酸鹽、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇S旨80、0.5 ppm鐵 2.1 4.8 13.6 實例9.7 ··在鐵及組胺酸存在下、於溶液pH 6下在乙酸鹽 缓衝液中調配之J695的片段化 在pH 6.0下於以下組合物中以2 mg/mL調配抗體J695 : a) 3 0 mM乙酸鹽、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 ;及 b) 3 0 mM乙酸鹽、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇S旨80及0.5 ppm鐵。 另外，在pH 6.0下於以下組合物中以1 00 mg/mL調配 J695 ： c) 30 mM乙酸鹽、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 ;及 d) 30 mM乙酸鹽、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.0 1 % (m/v)聚山梨醇醋 80、0.5 ppm 鐵。 如實例9.1所概述進行各種温度下之培育、取樣及所得 四種調配物中之片段化分析。 144870.doc -121 - 201036627 表15.7中提供此等研究之結果。該等結果顯示與對照（亦 即缺乏鐵之調配物）相比，J695調配物中鐵及組胺酸之存 在引起J695片段化，且其他有機基緩衝液（諸如乙酸鹽）的 存在不影響鐵-組胺酸介導之J695片段化，而與蛋白質濃 度（例如2mg/mL或100mg/mL)無關。 表15.7 :在加速安定性研究期間不同調配物中J695之片段含量 調配物組成 TO, 5°C T1個月， 40°C T3個月， 40°G pH6，2mg/mLJ695、30mM乙酸鹽、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01 % (m/v)聚山梨醇酯80 2.4 5.7 17.2 pH6，2mg/mLJ695、30mM乙酸鹽、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇醋80、0.5 ppm鐵 2.4 12.5 26.4 pH6，100mg/mLJ695、30mM 乙酸鹽、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 1.9 5.1 14.7 pH6，100mg/mLJ695、30mM 乙酸鹽、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇S旨80、0.5 ppm鐵 2.0 7.6 20.7 實例9.8 :在聚山梨醇酯80存在下J695之片段化 在pH 6下於以下組合物中以2 mg/mL調配J695 : a) 1 0 mM曱硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇； b) 1 0 mM曱硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇及 0.5 ppm鐵； c) 1 0 mM甲硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 ; d) 1 0 mM曱硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇醋80及0.5 ppm鐵。 144870.doc -122- 201036627 另外’在pH 6.0下於以上所列之組合物（a)至（d)中以1 〇〇 mg/mL調配J695。此實驗之結果於表15.9中提供且於以下 實例9.9中論述。 實例9.9 :在泊洛沙姆188存在下J695之片段化 在pH 6.0下於以下組合物中以2 mg/mL調配J695 : a) 10 mM甲硫胺酸、1 〇 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇； b) 10 mM曱硫胺酸、1〇 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇及 0.5 ppm鐵； c) 1 0 mM曱硫胺酸、1 〇 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.1 % (m/v)泊洛沙姆1 8 8 ;及 d) 1 0 mM甲硫胺酸、1 〇 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.1% (m/v)泊洛沙姆 188，及 0.5 ppm鐵。 另外’在pH 6.0下於以上所列之組合物（a)至（幻中以10〇 mg/mL調配 J695。 表15.9中提供實例9 8及9 9中所述之實驗的結果。該等 結果顯示與對照（亦即缺乏鐵之調配物）相比，j695調配物 中鐵及組胺酸之存在引起J695片段化，且界面活性劑（諸 如聚山梨醇酯80或泊洛沙姆丨88)之存在與否不影響鐵_組胺 酸介導之J695片段化，而與蛋白質濃度（例如2 mg/mL或 100 mg/mL)及界面活性劑之類型及濃度無關。 144870.doc -123- 201036627 表15.9 :在加速安定性研究期間不同調配物中J695之片段含量 調配物組成 TO, 5°C T1個月， 40°C T3個月， 40°C pH 6，2 mg/mL J695、10 mM曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇 2.1 4.8 13.4 pH 6，2 mg/mL J695、10 mM曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、0.5 ppm鐵 2.1 9.7 26.2 pH6，100mg/mLJ695、10mM 曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇 1.9 5.2 14.4 pH6，100mg/mLJ695、10mM甲硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、0.5 ppm鐵 2.3 7.8 21.7 pH 6，2 mg/mL J695、10 mM甲硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、1 mg/mL泊 洛沙姆188 2.0 4.7 13.0 pH 6，2 mg/mL J695、10 mM 曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、0·5 ppm 鐵、1 mg/mL泊洛沙姆188 2.1 9.0 24.4 pH6，100mg/mLJ695、10mM甲硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、1 mg/mL泊 洛沙姆188 2.0 5.1 15.0 pH 6，100 mg/mL J695、10 mM 曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、0.5 ppm 鐵、1 mg/mL泊洛沙姆188 2.1 8.0 21.4 實例9.10 :在甘露糖醇存在下J695之片段化 在pH 6.0下於以下組合物中以2 mg/mL調配J695 : a) 10 mM甲硫胺酸、10 mM組胺酸、0.01%(m/v)聚山梨醇 酯80 ; b) 10 mM曱硫胺酸、10 mM組胺酸、0.01% (m/v)聚山梨醇 i旨 80及 0.5 ppm鐵； c) 10 mM曱琉胺酸、10 mM組胺酸、1 50 mg/mL甘露糖 醇、0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 ;及 d) 1 0 mM甲硫胺酸、10 mM組胺酸、150 mg/mL甘露糖 醇、0.01 % (m/v)聚山梨醇醋80及0.5 ppm鐵。 144870.doc -124- 201036627 另外，在pH 6.0下於以上所列之組合物（a)至（d)中以100 mg/mL調配J695。如實例9.1所概述進行各種溫度下之培 育、取樣及所得八種調配物中J695片段化之分析。 此等研究之結果列於表15.10中。該等結果顯示與對照 (亦即缺乏鐵之調配物）相比，J695調配物中鐵及組胺酸之 •存在引起J695片段化，且此片段化過程不受糖及糖醇（諸 如甘露糖醇）之各種濃度（例如0及150 mg/mL)及蛋白質濃 度（例如 2 mg/mL及 100 mg/mL J695)影響。 〇 表15.10 :在加速安定性研究期間不同調配物中J695之片段含量
調配物組成.... TO, 5°C T1個月， 40°C T3個月， 40°C pH 6，2 mg/mL J695、10 mM 甲硫胺酸、 10 mM組胺酸、0 mg/mL甘露糖醇、 0.1 mg/mL聚山梨醇醋80 2.1 4.9 15.8 pH 6，2 mg/mL J695、10 mM 曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、0 mg/mL甘露糖醇、 0.1 mg/mL聚山梨醇醋80、0.5 ppm鐵 2.0 13.9 30.0 pH 6，2 mg/mL J695、10 mM甲硫胺酸、 10 mM組胺酸、150 mg/mL甘露糖醇、 0.1 mg/mL聚山梨醇醋80 2.0 4.6 14.0 pH 6，2 mg/mL J695、10 mM 甲硫胺酸、 10 mM組胺酸、150 mg/mL甘露糖醇、 0.1 mg/mL聚山梨醇酯80、0.5 ppm鐵 2.0 13.5 29.1 pH6，100mg/mLJ695、10mM 曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、0 mg/mL甘露糖醇、 0.1 mg/mL聚山梨醇醋80 1.8 5.1 14.7 pH6，100mg/mLJ695、10mM 曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、0 mg/mL甘露糖醇、 0.1 mg/mL聚山梨醇醋80、0.5 ppm鐵 1.8 8.2 22.0 pH 6，100 mg/mL J695、10 mM曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、150 mg/mL甘露糖醇、 0.1 mg/mL聚山梨醇酯80 1.8 4.4 12.8 pH6，100mg/mLJ695、10mM曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、150 mg/mL甘露糖醇、 0.1 mg/mL聚山梨醇醋80、0.5 ppm鐵 1.8 7.6 21.5 144870.doc -125- 201036627 實例9.11 :在去鐵胺存在下J695之片段化 在pH 6.0下於以下組合物中以2 mg/mL調配J695 : a) 10 mM曱硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 ; b) 10 mM甲硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80及0.5及2.5 ppm鐵； c) 10 mM曱硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80及1 mM去鐵胺；及 d) 1 0 mM甲硫胺酸、1 0 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80、0.5及2_5 ppm鐵及1 mM去 鐵胺。 另外，在pH 6.0下於以上所列之組合物（a)至（d)中以100 mg/mL調配J695。如實例9.1所概述進行各種溫度下之培 育、取樣及所得十二種調配物中J695片段化之分析。 此等研究之關鍵結果列於表15.11中。該等結果顯示與 對照（亦即缺乏去鐵胺之調配物）相比，J695調配物中去鐵 胺之存在不會不利地影響J695之安定性。該等結果另外顯 示在廣泛鐵濃度及廣泛蛋白質濃度（例如2 mg/mL及100 mg/mL J695)範圍内，去鐵胺減少J695調配物中組胺酸-鐵 介導之片段化。 144870.doc -126- 201036627 表15.11 :在加速安定性研究期間不同調配物中j695之片段含量 調配物組成 TO, 5°C τι個月， 40°C T3個月，. 40°C pH6，2mg/mLJ695、10mM甲硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.1 mg/mL聚山梨醇酯80、1 mM去鍇胺 1.8 4.7 12.0 pH ό ’ 2 mg/mL J695、10 mM 曱硫胺酸、__ 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.1 mg/mL聚山梨醇酯80、1 mM去鐵胺， 0.5 ppm鐵 1.9 4.7 12.2 pH 6，2 mg/mL J695、10 mM曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.1 mg/mL聚山梨醇醋80、1 mM去鐵胺， 2.5 ppm鐵 1.8 4.6 12.3 pH6 ’ 100mg/mLJ695、10mM甲硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.1 mg/mL聚山梨醇酯80、1 mM去鐵胺 1.8 4.7 12.3 pH6 ’ 100mg/mLJ695、10mM甲硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.1 mg/mL聚山梨醇S旨80、1 mM去鐵胺， 0.5 ppm鐵 1.6 4.9 12.4 pH6，100mg/mLJ695、10mM甲硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.1 mg/mL聚山梨醇酯80、1 mM去鐵胺， 2_5 ppm鐵 1.7 4.9 12.6 實例9.12 :在擰檬酸鹽存在下J695之片段化 Ο 在pH 6 ·0下於以下組合物中以2 mg/mL調配J695 : a) 10 mM曱硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 ; b) 10 mM曱硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80及0·5 ppm鐵； c) 10 mM曱硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80及30 mM檸檬酸鹽；及 d) 10 mM曱硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 144870.doc -127- 201036627 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80、0·5 ppm鐵及30 mM檸檬酸 鹽。 另外’在pH 6.0下於以上所列之組合物（a)至（d)中以100 mg/mL調配J695。如實例9.1所概述進行各種溫度下之培 育、取樣及所得八種調配物中J695片段化之分析。 此等研究之關鍵結果列於表15.12中。該等結果顯示與 對照（亦即缺乏檸檬酸鹽之調配物）相比，J695調配物中檸 檬酸鹽之存在不會不利地影響J695之安定性。該等結果另 外顯示在廣泛蛋白質濃度（2 mg/mL及100 mg/mL J695)範圍 内，檸檬酸鹽減少J695調配物中組胺酸-鐵介導之片段 化。 表15.12 :在加速安定性研究期間不同調配物中J695之片段含量 觸配物組成 TO, 5°C T1個月， 40°C T3個月， 40Ό pH 6 ’ 2 mg/mL J695、10 mM 曱硫胺酸、 10mM組胺酸' 40mg/mL甘露糖醇、 0.1 mg/mL聚山梨醇酯80、30 mM檸檬酸鹽 1.8 4.4 12.5 pH 6，2 mg/mL J695、10 mM曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.1 mg/mL聚山梨醇酯80、30 mM擰檬酸鹽， 0.5 ppm鐵 1.7 4.6 12.5 pH6，100mg/mLJ695、10mM曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.1 mg/mL聚山梨醇酯80、30 mM檸檬酸鹽 1.6 4.6 13.1 pH 6，100 mg/mL J695、10 mM 曱硫胺酸、 10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.1 mg/mL聚山梨醇酯80、30 mM檸檬酸鹽， 0.5 ppm 鐵 1.7 4.9 13.0 實例9.13 :在去鐵硫素存在下J695之片段化 在pH 6·0下於以下组合物中以2 mg/mL調配J695 : 144870.doc • 128· 201036627 a) 10 mM甲硫胺酸、1 0 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 ; b) 10 mM甲琉胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01 % (m/v)聚山梨醇S旨80及0.5 ppm鐵； c) 1 0 mM甲硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0_01°/〇 (m/v)聚山梨醇酯80及0.1 mM去鐵硫素；及 d) 10 mM甲硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80、0.5 ppm鐵及0.1 mM去鐵硫 〇 素。 另外，在pH 6.0下於以上所列之組合物（a)至（d)中以100 mg/mL調配J695。如實例9.1所概述進行各種溫度下之培 育、取樣及所得八種調配物中J695片段化之分析。 實例9.14 :鉸鏈區中殘基之突變 在pH 6下於以下組合物中以2 mg/mL調配在鉸鏈區中特 定殘基發生突變之J695 : a) 10 Mm甲硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、
Q 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 ;及 b) 10 mM甲硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 - 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80及0.5 ppm鐵。 另外，於以上所列之組合物（a)至（b)中以1 00 mg/mL調配 J695。如實例9.1所概述進行各種溫度下之培育、取樣及所 得四種調配物中J695片段化之分析。 實例9.15:組胺酸自調配物移除 在pH 6.0下於以下組合物中以1 7 mg/mL調配J695 : 144870.doc -129- 201036627 a) 1 0 mM甲硫胺酸、10 mM米'1坐、4 0 mg/mL甘露糖醇；及 b) 10 mM曱硫胺酸、10 mMw米°坐、40 mg/mL甘露糖醇及 100 ppm琉酸鐵（II)。 在40°C下培育組合物2週，且如實例7.2.4所述由非還原 性CE-SDS進行分析。 此等研究之關鍵結果列於下表15.13中。該等結果顯示 在鐵存在下移除組胺酸且用咪唑替換不會引起J695片段 化。此等結果顯示在鐵存在下組胺酸之移除抑制或防止 J695之片段化。 表15.13 :在調配物中無組胺酸之情況下且在加速安定性研究之 後J695之片段含量。如以上a)及b)所指定在pH 6.0下以17 mg/mL 調配J695。 LC 及其他 HC/FAB (HCLC) 片段2 (2)HC ⑴ LC 完整 10 mM甲硫胺酸、10 mM 。米11坐、40 mg/mL甘露糖醇 1.16 0.46 0.21 1.29 3.24 93.65 10mM甲硫胺酸、10mM 咪σ坐、40 mg/mL甘露糖醇及 100 ppm硫酸鐵(II) 0.95 0.49 0.42 1.25 3.14 93.76 實例9.16 :經由超濾/透濾或藉由透析移除鐵 將含鐵（500 ppm)之J695及作為對照之不含鐵（60 ppm)之 J695透析至調配物緩衝液（1 0 mM組胺酸、10 mM甲硫胺 酸、4%甘露糖醇，pH 6.0)或檸檬酸鹽/磷酸鹽緩衝液（10 mM磷酸氫二鈉、10 mM檸檬酸，pH=6.0)中。隨後在40°C 下培育樣品1個月。培育之後由非還原性CE-SDS分析樣品 以測定所存在之片段量。 下表15.14中提供結果。該等結果顯示針對調配物緩衝 144870.doc -130- 201036627 液或檸檬酸鹽/磷酸鹽缓衝液進行透，析使片段化減少。與 針對調配物緩衝液進行透析相比，透析至擰檬酸鹽/填酸 鹽緩衝液中使片段化減少之程度更大，此表明檸檬酸鹽/ 磷酸鹽在結合鐵並使鐵自蛋白質剝離方面可能起作用。 表15.14 :在透析及加速安定性研究之後J695之片段含量 LC 及其他 HC/FAB (HCLC) 片段2 (2)HC ⑴ LC 完整 在40°C下1個月之後， 含60 ppm鐵之J695 0.62 0.6 0.23 1.51 2.55 94.48 在40°C下1個月之後， 含500 ppm鐵之J695 1.65 0.91 0.3 3.41 3.97 89.66 在40°C下1個月之後， 含500 ppm鐵且用檸檬酸 鹽缓衝液進行透析之J695 0.57 0.6 0.21 1.45 2.69 94.48 在40°C下1個月之後， 含500 ppm鐵且用調配物 缓衝液進行透析之J695 1.02 0.78 0.22 2.1 3.21 92.66
實例10 :在各種鐵含量及不同溫度下J695之片段化 由SEC分析顯示在25°C及40°C下隨著鐵含量增加，J695 之片段化增強。在5°C下儲存6個月之後，未觀測到外加至 10,000 ppb之鐵產生影響。 〇 實例10.1 :在各種鐵含量及不同溫度下J695(100 mg/mL) 之片段化 選擇J695抗體之調配緩衝液之後，在與成品相同之基質 中調配藥物。蛋白質調配之主要目的在於長期保持呈原 ‘生、醫藥活性形式之既定蛋白質的安定性以確保醫藥蛋白 質藥物之存放期可接受。經J695預填充之注射器（PFS)之 推薦儲存溫度為2-8°C，且在各種批次之J695中所量測之 正常鐵含量為約60 ppb(表16)。在5°C之推薦儲存溫度以及 144870.doc -131 - 201036627 25°C及40°C之高溫下儲存PFS長達6個月之後，評估外加不 同含量之鐵對片段化的影響。 在預填充注射器（PFS)中，在pH值保持為6.0下，於以下 標稱組合物中以100 mg/mL調配抗體历95: 1 · 1 0 mM甲硫胺酸、1 0 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80 2. 10 mM曱硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80及10 ppb呈硫酸鐵（II)形式之鐵 3. 1 0 mM甲硫胺酸、1 0 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80及50 ppb呈硫酸鐵（II)形式之鐵 4· 1 0 mM曱硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80及100 ppb呈硫酸鐵（II)形式之鐵 5. 10 mM甲硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80及250 ppb呈硫酸鐵（II)形式之鐵 6· 1 0 mM曱琉胺酸、10 mM組胺酸、40 .mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80及500 ppb呈硫酸鐵（II)形式之鐵 7. 1 0 mM甲硫胺酸、1 0 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80及1 ppm呈硫酸鐵（II)形式之鐵 8. 10 mM甲硫胺酸、10 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80及5 ppm呈硫酸鐵（II)形式之鐵 9. 1 0 mM曱硫胺酸、1 0 mM組胺酸、40 mg/mL甘露糖醇、 0.01% (m/v)聚山梨醇酯80及10 ppm呈硫酸鐵（II)形式之鐵 將所得調配物填充至預填充注射器（PFS)中且在5°C、 25°C及40°C下培育長達6個月。在預定時間點，對所有調 144870.doc -132- 201036627 配物之樣品谁仁& ^ 。進仃取樣，且由SEC測定各種調配物中抗體片 /之私度。如表16所示，在推薦儲存條件下儲存6個月 :後、未觀測到鐵(外加至1〇，_ _)對片段化產生影 曰 等研九表明在推薦儲存條件下，J695調配物長期保 :原生邊藥'舌性形式之既定蛋白質的安定性，以為醫 藥蛋白質藥物提供可接受之存放期。 Ο 亦藉由向J695預填充注射器中外加不同含量之鐵及在 25t及4Gt下儲存來評估在高溫下對片段化之影響。如表 所丁如SEC所评估，外加超過約16〇 ppb之鐵（對應於 60 ppb正$ Fe含夏+為外加實驗所添加之i〇〇 ppb)使得25。匸 及40 C下之片段化增加。
表16
144870.doc -133- 201036627
片段化 另外，在pH 6.0於以上所列之標稱組合物（1)至（9)中以2 mg/mL調配J695。將所得9種調配物填充至無菌、無熱原 質之聚丙烯低溫小瓶中且在、25t&4〇t下培育長達6 個月。另外，將所有9種調配物在2_8t之推薦儲存溫度下 儲存長達12個月。在預定時間點，對所有調配物之樣品進 订取樣，且由SEC測定各種調配物中抗體片段化之程度。 援引併入 本申凊案通篇可引用之所有引用參考文獻（包括參考文 獻書目、專利、專利申請案及網站）及其中所引用之參考 文獻的内容皆以全文引用的方式明確地併入本文中。除非 144870.doc -134- 201036627 另外說明’否則本發明之實施應採用此項技術中所熟知之 習知蛋白質調配技術。 等效物 在不脫離本發明之精神或基本特徵的情況下，本發明可 以其他特定形式體現。因此，上述實施例在所有方面皆應 視為說明性的，而非限制本文所述之本發明。因此，本發 明之範疇係由隨附申請專利範圍而非上述描述指定，且由 此預期處於申請專利範圍之等效含義及範圍内的所有變化 皆涵蓋於本文中。 【圖式簡單說明】 圖1展示抗體分子之较鍵區； 圖2展示在尺寸排阻層析（SEC)之後J695中不同物質的份 化（分離部分1-4); 圖3展示由SDS-PAGE分析之自圖2之SEC所得之不同分 離部分的s平估結果，其展示分離部分3中之不可還原（NR) 物質、重鏈（HC)、輕鏈（LC)及HC片段（HC-Fc)以及分離部 分4中之LC及HC-Fab ; 圖4展示脫除糖基之後由lc/ESI-MS對圖2之分離部分3 的分析，其展示鉸鏈區中於Hc上之多個裂解位點。自（a) 至（e)對峰進行標記，且表丨中提供峰之身分及裂解位點； 圖5展示由MS對圖2之分離部分4的分析，其展示此分離 部分中之相應Fab片段。自⑴至⑴對峰進行標記’且表 提供峰之身分及裂解位點； 圖6展示由MS對圖2之分離部分4的分析，其展示胺基酸 144870.doc -135- 201036627 殘基1-2 15之游離LC及胺基酸殘基1-217之游離HC ; 圖7展示由CE-SDS對圖2之分離部分3的分析，其展示片 段2(Fab+Fc)，而分離部分4含有Fab及LC及HC片段。完整 抗體中之片段2自其他峰完全解析出； 圖8展示使用10,000 MWCO膜針對擰檬酸緩衝液對含500 ppb鐵之J695(Mab-第1批次）進行之透析； 圖9展示外加至J695之正常對照批次中、在40°C下培育1 個月且由CE-SDS分析之不同含量的金屬鹽（2.5、10及50 ppm); 圖10展示含500 ppb鐵之J695與1 mM去鐵胺在40°C下一 起培育1個月之後由CE-SDS進行之分析； 圖11展示針對水進行透析且與組胺酸、鐵抑或鐵與組胺 酸一起培育之後不含鐵之J695的正常批次； 圖12展示由ESI/LC-MS對含500 ppb鐵之應激J695與正常 應激批次之圖2片段進行的比較； 圖13展示相應Fab物質之分析，其揭示當將含鐵之應激 J695與正常應激批次作比較時，其裂解位點類似； 圖14展示對LC及HC片段之分析，其揭示較高含量之重 鏈片段（1-217)及輕鏈片段（1-215); 圖15展示對鐵誘導之含λ輕鏈或κ輕鏈之IgG分子片段化 的研究；及 圖16展示λ或κ輕鏈上殘基之序列及經裂解之鍵。 144870.doc -136-

Claims (1)

  1. 201036627 七、申請專利範圍： ι_ 一種抑制或防止含組胺酸調配物中包含至少一部分入輕 鏈之分子裂解的方法，該方法包含抑制或防止金屬使該 分子裂解之能力的步驟。 2.如請求们之方法，其中該抑制或防止包含在該調配物 中包括至少一種金屬螯合劑。 3_如請求们之方法’其中該抑制或防止包含對該調配物 進仃至少-種選自由過濾、緩衝液交換、層析及樹脂交 換組成之群的程序。 4.如請求項3之方法，其中該過渡係選自由超滤及透滤 (diafiltration)組成之群。 5·如:月求項3之方法，其中該緩衝液交換包含用選自由以 I組成之群的緩衝液透析：包含組胺酸之緩衝液、包含 #檬酸鹽及填酸鹽之缓衝液、及包含咪唾之緩衝液。 月求項1之方法，其中該抑制或防止包含在該調配物 中包括檸檬酸鹽緩衝液或磷酸鹽緩衝液。 二求項1之方法’其中該抑制或防止包含藉由改變該λ Ik鏈中之至少—個胺基酸來抑制或防止裂解。 月长項1之方法，其中該抑制或防止包含藉由改變該入 鏈中之胺基酸序列以使胺基酸序㈣㈣·半胱胺酸'絲 胺酸改變來抑制或防止裂解。 月求項1之方法，其中該調配物包含約1 〇 mM組胺酸。 月长項1之方法，其中該調配物包含約丨_丨〇〇 組胺 酸。 144870.doc 201036627 11 如睛求項1之方法’其中該裂解發生於該λ鏈之鉸鏈區 中〇 12 _如凊求項1之方法，其中該至少一部分λ輕鏈包含魏胺酸_ 半胱胺酸-絲胺酸之胺基酸序列或至少一個不抑制抗體結 合之修飾。 13. 如請求項12之方法，其中該裂解發生於該麩胺酸與該半 胱胺酸之間。 14. 如請求項丨之方法’其中該分子包含至少一部分重鏈。 15. 如請求項i之方法，其中該部分重鏈包含胺基酸序列 SCDK或至少一個不抑制抗體結合之修飾。 16_如請求項1〇之方法，其中該裂解發生於絲胺酸與半胱胺 酸之間。 17_如凊求項1〇之方法，其中該裂解發生於半胱胺酸與天冬 胺酸之間。 18.如請求項}之方法，其中該金屬為以2+。 19_如s青求項i之方法，其中該金屬為Fe3+。 20·如請求項i之方法，其中該金屬為Cu2+。 21.如請求項i之方法，其中該金屬為Cul+。 士月求項1之方法，其中該分子係以約1 mg/ml至約 mg/ml範圍内之濃度存在。 23 士 β月求項1之方法，其中該分子係以約2 之濃度存 在。 24.如請求項丨之方法，其中該分子係以約7 ^^/…之濃度存 在。 144870.doc 201036627 25. 如請求項1之方法，其中該分子係以約100 mg/ml之濃度 存在。 26. 如請求項1之方法，其中該分子為免疫球蛋白。 27‘如請求項1之方法，其中該分子為單株抗體。 Ο 〇 28.如請求項1之方法，其中該分子係選自由以下組成之 群：DV〇-IgTM、Fab片段、F(ab，)2片段、嵌合抗體、 CDR移植抗體、人類化抗體、人類抗體、二硫鍵連之 Fv、單域抗體、多特異性抗體、雙重特異性抗體（dual specific antib〇dy)及雙特異性抗體（bispeciHc antibody) 。 29·如請求項1之方法，其中該分子為抗IL-12/23抗體。 30·如請求項1之方法，其中該分子為J695。 3 1.如清求項1之方法，其中該分子為抗CD80抗體或抗 IGF1，2 抗體。 32. 如請求項1之方法 溫度。 33. 如請求項1之方法 溫度。 34. 如請求項1之方法 3 5 ·如清求項1之方法 36. 如請求項1之方法 或5以下。 37. 如請求項2之方法 由以下組成之群： 其中該裂解發生於約2°C至約25。(：之 ，其中該裂解發生於約2。(：至約8。(：之 其中該裂解發生於約4至約8之pH。 其中該裂解發生於約5至約6之pH。 其中該抑制或防止包含使pH降至約5 ，其中該至少一種金屬螯合劑係選自 檸檬酸鹽；嗜鐵素（siderophore);杯 144870.doc 201036627 芳煙（cahxarenes);胺基聚羧酸；羥基胺基羧酸；N經 取代之甘胺酸；2-(2-胺基側氧基（〇χ〇)乙基）胺基乙烷 石黃酸（BES);雙牙、三牙或六牙鐵螯合劑；及其衍生 物、類似物及組合。 38. 如請求項2之方法，其中該至少一種金屬螯合劑為選自 由以下組成之群的嗜鐵素：需氧菌素（aer〇bactin)、農用 桿菌素（agrobactin)、固氮菌素（az〇t〇bactin)、細菌素 (bacUlibactin)、N-(5-C3-L(5-胺基戊基）羥基胺曱醯基）-丙醯胺基）戊基）-3(5-(N-羥基乙醯胺基）_戊基）胺甲醯基）_ 丙異經月亏酸（proprionhydroxamic acid)(去鐵敏 (deferoxamine)、去鐵胺（desferrioxamine)或 DFO 或 DEF)、 去鐵硫素（desferrithiocin)、腸菌素（enterobactin)、赤菌 素（erythrobactin)、含鐵色素（ferrichrome)、鐵草胺 B(ferrioxamine B)、鐵草胺E(ferrioxamine E)、氟維菌素 (fluviabactin)、鐮菌胺酸 C(fusarinine C)、分枝桿菌素 (mycobactin)、副球菌素（parabactin)、假單胞菌素 (pseudobactin)、弧菌素（vibriobactin)、創傷弧菌素 (vulnibactin)、耶爾森桿菌素（yersiniabactin)、奥林菌素 (ornibactin)，及其衍生物、類似物及組合。 39. 如請求項38之方法，其中該金屬螯合劑為去鐵胺。 40. 如請求項2之方法，其中該至少一種金屬螯合劑為擰檬 酸鹽。 41. 如請求項2之方法，其中該至少一種金屬螯合劑為選自 由以下組成之群的胺基聚羧酸：乙二胺四乙酸（EDTA)、 144870.doc 201036627 氮基三乙酸（nitriloacetic acid，ΝΤΑ)、反-二胺基環己烷 四乙酸（DCTA)、二伸乙三胺五乙酸（DTPA)、ν-2-乙醯胺 基-2-亞胺基二乙酸（ADA)、天冬胺酸、雙（胺基乙基）乙 二醇謎N，N，N'，N’ -四乙酸（EGTA)、麵胺酸及n，N，-雙（2-經 基苯甲基）乙二胺-N，N'-二乙酸（HBED)，及其衍生物、類 似物及組合。 42. 如請求項2之方法，其中該至少一種金屬螯合劑為選自 由以下組成之群的羥基胺基羧酸：N_羥乙基亞胺基二乙 酸（HIMDA)、N，N-雙羥乙基甘胺酸（仏丨㈣及叫三羥甲 基曱基）甘胺酸（tricine)，及其衍生物、類似物及組合。 43. 如請求項2之方法，其中該至少一種金屬螯合劑為N—經 取代之甘胺酸或其衍生物、類似物或組合。 44. 如凊求項43之方法，其中該N_經取代之甘胺酸係選自由 甘胺酿甘胺酸及其衍生物、類似物及組合組成之群。 45. 如請求項2之方法，其中該至少一種金屬螯合劑為2_(2_ 胺基-2-側氧基乙基）胺基乙烷磺酸（BES)及其衍生物類 似物及組合。 46. 如請求項2之方法，其中該至少一種金屬螯合劑包含 DTPA與DEF之組合。 47. 如請求項2之方法，其中該至少一種金屬螯合劑包含 EDTA、EGTA及DEF之組合。 48. 如請求項2之方法，其中該至少一種金屬螯合劑為選自 由以下組成之群的杯芳烴：基於酚及醛之羥烷基化產物 的巨裱或環狀寡聚物及其衍生物、類似物及組合。 144870.doc 201036627 49. 如請求項2之方法，其中該至少一種金屬螯合劑為經基 °比啶衍生物、腙衍生物、及羥基苯基衍生物、或於鹼基 衍生物’諸如1，2-二曱基-3-羥基吡啶-4-酮（去鐵_ (Deferiprone)、DFP 或奥貝安可（Ferriprox)) ; 2-去氧-2- (N-胺甲醯基曱基-[N，-2，-甲基_3，-羥基吡啶_4，_酮])_D_葡 萄°底°南糖（菲瑞思-G(Feralex-G))、》比哆酸·異終驗基腙 (PIH) ; 4,5-二氫-2-(2,4-二羥基苯基）-4-曱基噻唑_4-曱酸 (GT56-252)、4-[3,5-雙（2-經基苯基）-[1，2,4]三唾-1-基]苯 曱酸（ICL-670) ; N，N，-雙（鄰羥基苯甲基）乙二胺_Ν，Νι_二 乙酸（HBED)、5-亂-7-破-哇琳-8-酵（氯块經哇 (clioquinol));及其衍生物、類似物及組合。 50. 如請求項2之方法，其中該至少一種金屬螯合劑為選自 由以下組成之群的銅螯合劑：三伸乙四胺（trientine)、四 伸乙五胺、D-青徽胺（D-penicillamine)、乙二胺、雙η比 咬、菲羅琳（phenantroline)、紅菲羅琳（batho-phenanthroline)、新亞銅靈（ne0CUpr〇ine)、紅亞銅靈石黃酸 鹽（bathocuproine sulphonate)、銅立榮（cuprizone)、順， 順1,3,5-二胺基;展己院（tach)、塔克0比（tachpyr)，及其 衍生物、類似物及組合。 51. 如清求項1之方法，其中該調配物包含至少一種選自由 胺基酸、糖、糖醇、緩衝劑、鹽及界面活性劑組成之群 的其他賦形劑。 5 2.如印求項i之方法，其中該調配物包含至少一種選自由 以下組成之群的其他賦形劑：約1至6〇 mg/ml甘露糖醇、 144870.doc 201036627 約1至約50 mM甲硫胺酸、約〇.〇〇ι〇/0至約〇.5%(w/v)聚山 梨醇酯（polysorbate) 80、約0.001%至約i%(w/v)泊洛沙姆 188(polyoxamer 188)、約1至約15〇 氯化鈉、約1至約 30 mM乙酸鹽、約1至約30 mM檸檬酸鹽、約1至約30 mM攝酸鹽及約1至約30 mM精胺酸。 5 3 · —種偵測含組胺酸調配物中包含至少一部分χ輕鏈之分 子裂解的方法，該方法包含以下步驟：在該調配物中包 括至少一種金屬螯合劑，及分析該分子之該至少一部分 的裂解。 54· —種安定調配物’其包含一種包含至少一部分人輕鏈之 分子及一種包含組胺酸之緩衝系統，其中該調配物實質 上不含金屬。 55.如請求項54之調配物，其中該金屬為Fe2+或Fe3+。 56·如請求項54之調配物’其中該金屬為Cu2+或Cu1+。 57.如請求項54之調配物’其中在對該調配物進行至少一種 選自由過濾、缓衝液交換、層析及樹脂交換組成之群的 程序之後，該調配物實質上不含金屬。 5 8.如請求項57之調配物，其中該緩衝液交換包含用選自由 以下組成之群的緩衝液進行透析：包含組胺酸之緩衝 液、包含檸檬酸鹽及磷酸鹽之緩衝液、及包含味°坐之緩 衝液。 59.如請求項54之調配物，其中該金屬係以選自由以下組成 之群的濃度存在··小於約5,060 ppb、小於約1，〇60 ppb、 小於約560 ppb、小於約3 10 ppb、小於約160 ppb、小於 144870.doc 201036627 約110 ppb及小於約70 ppb。 60. 如請求項59之調配物’其中該金屬係以小於約丨6〇 ppb之 濃度存在。 61. 如請求項59之調配物’其中該金屬係以小於約7〇 ppb之 濃度存在。 62. 如請求項54之調配物，其進一步包含至少一種選自由多 元醇及界面活性劑組成之群的其他賦形劑。 63. 如請求項62之調配物，其進一步包含安定劑。 64. 如請求項54之調配物’其進一步包含甘露糖醇、聚山梨 醇酯80及曱硫胺酸。 6 5.如凊求項5 4之調配物’其中該緩衝系統進一步包含擰檬 酸鹽或磷酸鹽。 66. 如請求項54之調配物，其中pH為約5或5以下。 67. 如請求項64之調配物，其包含： (a) 1-10%甘露糖醇， (b) 0.001-0.1%聚山梨醇酯 80， (c) 包含1-100 mM組胺酸及1-50 mM甲硫胺酸之緩衝 系統，pH為5至7。 68. 如請求項64之調配物，其包含： (a) 2-6%甘露糖醇， (b) 0.005-0.05%聚山梨醇酯 80， (c) 包含5-50 mM組胺酸及5-20 mM甲硫胺酸之緩衝系 統，pH為5至7。 69. 如請求項64之調配物，其包含： 144870.doc 201036627 (a) 約4%甘露糖醇， (b) 約0.01%聚山梨醇酯80， (c) 包含約10 mM組胺酸及約10 mM曱硫胺酸之緩衝系 統，pH為約6。 70.如請求項54至69中任一項之調配物，其中該分子為單株 '抗體或其抗原結合部分。 7 1 ·如請求項70之調配物，其中該抗體或其抗原結合部分之 濃度介於約1 mg/ml與約250 mg/ml之間。 〇 72.如請求項70之調配物，其中該抗體或其抗原結合部分之 濃度介於約40 mg/ml與約200 mg/ml之間。 73·如請求項7〇之調配物’其中該抗體或其抗原結合部分之 濃度為約100 mg/ml。 74.如請求項70之調配物，其中該抗體為能夠結合 23之P40次單元之抗原決定基的人類抗體或其抗原結合 部分。 Q 75.如請求項74之調配物，其中該人類抗體為抗體J695或其 抗原結合部分。 76.如請求項74或75之調配物，其具有至少24個月之存放 . 期。 • 77.如請求項74或75之調配物，其在至少5次凍融循環之後 仍保持安定。 78. 如請求項74或75之調配物，其進一步包含另一藥气 79. 如請求項78之調配物，其中該另一藥劑為治療劑: 8〇.如請求項79之調配物，其中該治療劑係選自由以下組成 144870.doc 201036627 之群：布替财德（budenoside);表皮生長因子；皮質類固 醇；環孢素（cyclosporin)； 柳氮磺胺0比0定 (sulfasalazine);胺基水楊酸鹽；6-疏基σ票吟；硫。坐嗓吟 (azathioprine);甲硝璉吐（metronidazole);脂肪加氧酶 抑制劑；美沙胺（mesalamine);奥沙拉°秦（olsalazine); 巴柳氮（balsalazide);抗氧化劑；血栓烧抑制劑 (thromboxane inhibitor) ; IL-1 受體拮抗劑；抗 IL-1 β 單株 抗體；抗IL-6單株抗體；生長因子；彈性蛋白酶抑制 劑；吡啶基-咪唑化合物；TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、ΕΜΑΡ-ΙΙ、GM-CSF、FGF 及 PDGF 之抗體或促效劑（agonist) ; CD2、 CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、 CD45、CD69、CD90或其配位體之抗體；甲胺喋呤 (methotrexate) ; FK506 ;雷帕徽素（rapamycin);徽紛酸 嗎 π林乙醋（mycophenolate mofetil);來氟米特（leflu-nomide) ; NSAID ;布洛芬（ibuprofen);潑尼松龍 (prednisolone);填酸二S旨酶抑制劑；腺普促效劑；抗血 栓劑；補體抑制劑；腎上腺素激導劑；IRAK ; NIK ; IKK ; p3 8 ; MAP激酶抑制劑；IL-Ιβ轉化酶抑制劑； TNFct轉化酶抑制劑；T細胞信號傳導抑制劑；金屬蛋白 酶抑制劑；血管收縮素轉化酶抑制劑；可溶性細胞激素 (cytokine)受體；可溶性p55 TNF受體；可溶性p75 TNF 受體；sIL-lRI ; sIL-lRII ; SIL-6R ;抗發炎細胞激素； IL-4 ; IL-10 ; IL-11 ; IL-13 ;及 TGFP。 144870.doc -10- 201036627 81. 如請求項79之調配物’其中該治療劑係選自由以下組成 之群：抗TNF抗體及其抗體片段、TNFR-Ig構築體、 TACE抑制劑、PDE4抑制劑、皮質類固醇、布替财德、 地塞米松（dexamethasone)、柳氮磺胺吡啶、5 -胺基水楊 酸、奥沙拉嗪、IL-Ιβ轉化酶抑制劑、IL_lra、酪胺酸激 酶抑制劑、6-巯基嘌呤及IL-11。 82. 如請求項79之調配物，其中該治療劑係選自由以下組成 之群：甲基潑尼松龍（methylprednisolone)、環填醯胺、 4-胺基°比咬、替紮尼定（tizanidine)、干擾素_βΐα、干擾 素-βlb、共聚物1、高比例氧（hyperbaric oxygen)、靜脈 内免疫球蛋白、克拉屈濱（clabribine)、TACE抑制劑、激 酶抑制劑、sIL-13R、抗P7及p-選擇素醣蛋白配位體②― selectin glycoprotein ligand，PSGL)。 83. —種安定調配物，其包含一種包含至少一部分人輕鏈之 分子、一種包含咪唑之緩衝系統及金屬，其中該分子在 金屬存在下不於鉸鏈區内裂解。 84. —種安定調配物，其包含一種包含至少一部分人輕鏈之 分子、一種包含組胺酸之緩衝系統、及金屬螯合劑，其 中該分子不在鉸鏈區内裂解，或在鉸鏈區内之裂解程度 小於該金屬螯合劑不存在下所觀測的裂解程度。 85. 如請求項83或84之調配物，其中該金屬為以^+或以^。 86. 如請求項83或84之調配物，其中該金屬為（：112+或（：111+。 87. 如s青求項之調配物，其中該金屬螯合劑係選自由以下 組成之群：嗜鐵素；杯芳烴；胺基聚羧酸；羥基胺基羧 144870.doc -11 - 201036627 酸；N-經取代之甘胺酸；2-(2-胺基-2-側氧基乙基）胺基 乙烷磺酸（BES);雙牙、三牙或六牙鐵螯合劑；銅螯合 劑；檸檬酸鹽；及其衍生物、類似物及組合。 88. 如請求項87之調配物’其中該金屬螯合劑為去鐵胺。 89. 如請求項83或84之調配物，其進一步包含至少一種選自 由多元醇及界面活性劑組成之群的其他賦形劑。 90. 如請求項89之調配物，其進一步包含安定劑。 91. 如請求項84之調配物，其進一步包含甘露糖醇、聚山梨 醇酯80及曱硫胺酸。 92. 如請求項84之調配物，其中該緩衝系統進一步包含棒檬 酸鹽或麟酸鹽。 93. 如請求項83或84之調配物，其中該調配物之pH為約5或5 以下。 94. 如請求項91之調配物，其包含： (a) 1-10%甘露糖酵， (b) 0·〇〇1%-〇.1%聚山梨醇酯 80， (c) 包含1-100 mM組胺酸及1-50 mM曱硫胺酸之緩衝 系統，pH為5至7。 95. 如請求項91之調配物，其包含： 0) 2-6%甘露糖醇， (b) 0.005-0.05%聚山梨醇酯 80， (c) 包含5-50 mM組胺酸及5-20 mM曱硫胺酸之緩衝系 統，PH為5至7。 96. 如請求項91之調配物，其包含： 144870.doc -12- 201036627 (a) 約4%甘露糖醇， (b) 約0.01 %聚山梨醇酯80， (c) 包含約l〇mM組胺酸及約10mM甲硫胺酸之缓衝系 統，PH為約6。 97. 如請求項84至96中任一項之調配物，其中該分子為單株 抗體或其抗原結合部分。 98. 如請求項97之調配物，其中該抗體或其抗原結合部分之 濃度介於約1 mg/ml與約250 mg/ml之間。 〇 上 99. 如請求項97之調配物，其中該抗體或其抗原結合部分之 》辰度介於約40 mg/ml與約200 mg/ml之間。 100. 如請求項97之調配物，其中該抗體或其抗原結合部分之 濃度為約1 〇〇 mg/ml。 101·如請求項97之調配物，其中該抗體為能夠結合IL-12/IL· 23之P4〇次單元之抗原決定基的人類抗體或其抗原結合 部分。 q 102.如請求項101之調配物，其中該人類抗體為抗體J695或其 抗原結合部分。 103.如請求項101或102之調配物’其具有至少24個月之存放 * 期。 • 104·如請求項101或102之調配物’其在至少5次凍融循環之 後仍保持安定》 105.如請求項101或1〇2之調配物，其進一步包含另一藥劑。 106·如請求項1〇5之調配物，其中該另一藥劑為治療劑。 107.如請求項1 〇6之調配物，其中該治療劑係選自由以下級 144870.doc -13- 201036627 成之群：布替耐德；表皮生長因子；皮質類固醇；環孢 素；柳氮磺胺吡啶；胺基水楊酸鹽；6-酼基嘌呤；硫唑 嘌呤；甲硝噠唑；脂肪加氧酶抑制劑；美沙胺；奥沙拉 嗪；巴柳氮；抗氧化劑；血栓烷抑制劑；IL-1受體拮抗 劑；抗IL-lf|單株抗體；IL-1受體抗體；抗IL-6單株抗 體；IL-6受體抗體；生長因子；彈性蛋白酶抑制劑；吼 啶基-咪唑化合物；TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF及PDGF之抗體或促效劑；CD2、CD3、CD4、 CD8、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、 CD69、CD90或其配位體之抗體；曱胺喋呤；FK506 ;雷 帕黴素；黴酚酸嗎啉乙酯；來氟米特；NSAID ;布洛 芬；潑尼松龍；磷酸二酯酶抑制劑；腺苷促效劑；抗血 栓劑；S1P1促效劑；bcl-2抑制劑；補體抑制劑；腎上腺 素激導劑；IRAK ; NIK ; IKK ; p38 ; MAP激酶抑制劑； IL_1P轉化酶抑制劑；TNFa轉化酶抑制劑；T細胞信號傳 導抑制劑；金屬蛋白酶抑制劑；血管收縮素轉化酶抑制 劑；可溶性細胞激素受體；可溶性p55 TNF受體；可溶 性p75 TNF受體；sIL-lRI ; sIL-lRII ; SIL-6R ;抗發炎細 胞激素；IL-4 ; IL-10 ; IL-11 ; IL-13 ;及 TGFP。 108.如請求項106之調配物，其中該治療劑係選自由以下組 成之群：抗TNF抗體及其抗體片段、TNFR-Ig構築體、 TACE抑制劑、PDE4抑制劑、皮質類固醇、布替耐德、 地塞米松、柳氮續胺°比咬、5 -胺基水楊酸、奥沙拉嗪、 144870.doc -14- 201036627 IL-Ιβ轉化酶抑制劑、IL_lra、酪胺酸激酶抑制劑、心甘 基嘌呤及IL-11。 服如請求項106之調配物，其中該治療劑係選自由以下叙 成之群·· f基潑尼松龍、環磷醯胺、本胺基吡啶、替紮 =疋、干擾素-pla、干擾素_plb、共聚物}、高比例氧了 靜脈内免疫球蛋白、克拉屈濱、ΤΑ_制劑、激酶抑制 劑sIL_13R、抗P7及p-選擇素醣蛋白配位體（ps(}L)。 ❹110. 一種安定調配物’其包含治療有效量之包含人輕鏈之抗 體於PH約5至約7之包含組胺酸之緩衝溶液中，其中金屬 係以在組胺酸存在下不使該1輕鏈裂解之濃度存在。 出.如請求項UO之調配物’其中該裂解發生於該m之鼓鍵 區中。 112. 如請求項110之調配物，其中該金屬為Fe2+或以3+。 113. 如請求項11〇之調配物，其中該金屬為丨+。 114. 如請求項110之調配物，其中該金屬係以選自由以下組 〇 成之群的濃度存在：小於約5,〇60 ppb、小於約1060 PPb、小於約560 ppb、小於約3 10 ppb、小於約16〇 ppb、 小於約110 ppb及小於約70 ppb。 115·如吻求項i丨〇之調配物，其中該金屬係以小於約16〇 之濃度存在。 116•如請求項110之調配物，其中該金屬係以小於約7〇卩沖之 濃度存在。 117.如明求項11 0之調配物，其包含至少一種選自由多元醇 及界面活性劑組成之群的其他賦形劑。 144870.doc -15- 201036627 118. 如請求項117之調配物’其進一步包含安定劑。 119. 如請求項11()之調配物’其進一步包含 ^ 路糖醇、聚山 梨醇酯8〇及甲硫胺酸。 120·如請求項11〇之調配物，其中該緩衝溶液進一步包人磷 酸鹽或檸檬酸鹽。 121·如請求項110之調配物，其中該pH為約5或5以下。 122·如請求項110之調配物，其中該抗體為能夠結合il_12/ IL-23之p40次單元之抗原決定基的人類抗體或其抗原結 合部分。 123. 如請求項122之調配物，其中該人類抗體或其抗原結合 部分結合IL-12/IL-23之p40次單元之抗原決定基，該抗 原決定基與選自由Y61及J695組成之群的抗體結合。 124. 如請求項123之調配物，其中該人類抗體為抗體j695或其 抗原結合部分。 125. 如請求項11〇至124中任一項之調配物，其具有至少24個 月之存放期。 126. 如請求項11〇至124中任一項之調配物，其在至少5次凍 融循環之後仍保持安定。 127. —種水性醫藥調配物，其包含： (a) 1-250 mg/ml結合IL-12/IL-23之p40次单元之机原決 定基的人類抗體， (b) 1-10%甘露糖醇， (c) 0,001%-0.1%聚山梨醇酯 80， (d) 1-5 0 mM曱硫胺酸，及 144870.doc -16 - 201036627 (e) 1-100 mM組胺酸，pH為 5至 7 ’ 其中該調配物實質上不含金屬。 Π8.如請求項127之調配物，其中該金屬係以選自由以下組 成之群的濃度存在：小於約5,060 ppb、小於約1,060 Ppb、小於約560 ppb、小於約3 10 ppb、小於約160 ppb、 '小於約11 〇 ppb及小於約70 ppb。 129.如請求項128之調配物，其中該金屬係以小於約160 ppb 之濃度存在。 ^ Π0•如請求項128之調配物，其中該金屬係以小於約70 ppb之 濃度存在。 131_如請求項127之調配物，其中該人類抗體或其抗原結合 部分結合IL-12/IL-23之p40次單元之抗原決定基，該抗 原決定基與選自由Y61及J695組成之群的抗體結合。 132.如請求項13 1之調配物，其中該人類抗體為抗體J695或其 抗原結合部分。 q 133.如請求項127至132中任一項之調配物，其具有至少24個 月之存放期。 134·如請求項127至132中任一項之調配物，其在至少5次凍 ' 融循環之後仍保持安定。 - 135. —種水性醫藥調配物，其包含： (a) 約1〇〇 mg/ml結合IL-12AL-23之p40次單元之抗原 決定基的人類抗體， (b) 約4%甘露糖醇， (b)約0.01%聚山梨醇酯8〇， 144870.doc -17- 201036627 (c) 約10 mM曱硫胺酸，及 (d) 約10 mM組胺酸，pH為約6。 136•如請求項13 5之調配物，其中該人類抗體或其抗原結合 部分結合IL-12/IL-23之p40次單元之抗原決定基，該抗 原決定基與選自由Y61及J695組成之群的抗體結合。 137. 如請求項136之調配物，其中該人類抗體為抗體J695或其 抗原結合部分。 138. 如請求項135至137中任一項之調配物，其實質上不含金 屬。 139·如請求項135至137中任一項之調配物，其進一步包含金 屬螯合劑。 140·如請求項135之調配物，其中該金屬係以選自由以下組 成之群的濃度存在·♦小於約5,060 ppb、小於約Low ppb、小於約560 ppb、小於約3 1 0 ppb、小於約160 ppb、 小於約110 ppb及小於約70 ppb。 141·如請求項140之調配物，其中該金屬係以小於約160 ppb 之濃度存在。 142·如請求項14〇之調配物，其中該金屬係以小於約70 ppb之 濃度存在。 143.如請求項135至137中任一項之調配物，其具有至少24個 月之存放期。 144.如請求項135至137中任一項之調配物’其在至少5次凍 融循環之後仍保持安定。 144870.doc • J8-
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