TW202206458A - 靶向介白素-34之化合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於IL-34抗體、包含其之組合物、及使用抗體及/或其組合物用於治療免疫介導之疾病，諸如神經退化性疾病，例如阿茲海默氏症(Alzheimer’s Disease)或Tau蛋白病(tauopathy)之方法。

Description

靶向介白素-34之化合物及方法
本發明係關於化合物、醫藥組合物及方法，該等化合物、醫藥組合物及方法包括針對人類介白素-34 (IL-34)之抗體，預期其可用於神經發炎及急性或慢性發炎性疾病領域。特別地，預期該等實施例可用於與阿茲海默氏症(Alzheimer’s Disease)以及其他Tau蛋白病(tauopathy)有關的治療及/或診斷應用中。
阿茲海默氏症(AD) (癡呆之首要原因)在65歲至69歲人群中有百分之一發展，且在95歲及更老人群中增加至40至50%。AD患者展現明顯臨床症狀，該等症狀包括認知受損及記憶功能缺失。在此等患者中，藉由死後(post-mortem)組織病理學檢查時在大腦皮層中發現的重老年斑負荷及神經纖維纏結(NFT)，證實AD之存在。成熟老年斑由自澱粉樣前驅蛋白之酶促加工衍生之細胞外β-澱粉樣蛋白肽及細胞內神經纖維纏結(NFT)組成，該等NFT自過度磷酸化Tau蛋白長絲衍生。過度磷酸化Tau之聚集物(諸如神經纖維纏結)與阿茲海默氏症之認知受損程度有關。在AD及各種其他Tau蛋白病中，Tau聚集物出現在與疾病風險、發作及/或進展有關的特定腦區域及圖案中，且此等區域及圖案係為熟練技術者已知。
細胞介素調節正常穩態組織功能，且此等細胞介素網路之失調與病理病狀相關。中樞神經系統(CNS) (在此很少血液傳播免疫細胞循環)似乎特別容易受到細胞介素網路失調影響。在神經退化性疾病中，CNS駐存細胞係促發炎細胞介素之主要產生者且可促成失調之細胞介素網路及神經發炎。對CNS之損傷可涉及循環免疫細胞之募集，從而導致先天免疫反應，該先天免疫反應由駐存微神經膠質細胞、周邊衍生之單核細胞、巨噬細胞及樹突細胞組成。微神經膠質細胞及巨噬細胞之活化狀態不是嚴格促發炎或抗發炎的而是可能具有一系列功能狀態。微神經膠質細胞及/或周邊衍生之單核細胞及巨噬細胞可獲得抗發炎表型，其中其移除碎片且促進再生及穩衡。神經元功能障礙或損傷亦可活化微神經膠質細胞以產生促發炎細胞介素且自血流募集白血球。在神經退化性病狀(諸如阿茲海默氏症(AD))中，微神經膠質細胞活化係一頻繁發現且反映組織對細胞外β-澱粉樣蛋白斑塊及過度磷酸化Tau聚集物之累積之反應。神經發炎係神經退化性疾病之重要組分且以藉由CNS細胞提高促發炎細胞介素之產生表徵(Becher, B.、Spath, S.及Goverman, J.，Cytokine networks in neuroinflammation. Nat Rev Immunol 17，49至59 (2017))。咸信，神經發炎及微神經膠質細胞增生為隱伏於神經退化性疾病(諸如阿茲海默氏症之斑塊累積、及帕金森氏症(Parkinson's disease)及亨丁頓氏症(Huntington's disease)之神經元死亡及功能障礙之機轉)。
微神經膠質細胞增生涉及響應於發炎信號之微神經膠質細胞之異常增殖及/或肥大。廣泛而言，IL-34在發炎及免疫過程之調節中充當強效且多效細胞介素且係正常組織體穩衡中CNS駐存微神經膠質細胞生長之關鍵調節細胞介素。IL‑34由皮層、前嗅核及海馬體中之神經元表現。IL‑34與群落刺激因子1 (CSF1；亦稱為M‑CSF)密切相關，且兩種細胞介素結合CSF1受體。IL-34係分泌的同源二聚體細胞介素，其充當CSF1R之兩個活化配位體之一，並觸發受體自磷酸化及二聚化且隨後活化多個信號傳導路徑(參見，例如Structural basis for the dual recognition of helical cytokines IL-34 and CSF-1 by CSF-1R . Structure 20，676-687，及Felix J、De Munck S、Verstraete K、Meuris L、Callewaert N、Elegheert J.等人)。人類及小鼠IL-34多肽揭示於例如美國專利第9,770,486號中。IL-34係人類中242個胺基酸(SEQ ID NO: 41)及小鼠中235個胺基酸(SEQ ID NO: 42)之蛋白質。
已在本技術中描述抗IL-34抗體，及例如WO 2016/196679例示各種抗IL-34抗體及其潛在用途。然而，迄今為止，尚未批准靶向IL-34之抗體用於治療用途。
因此，仍存在對替代及/或改良之抗IL-34抗體、其醫藥組合物及使用其於與涉及IL-34之免疫介導之疾病及/或可用抗IL-34抗體治療之疾病(諸如神經發炎病症及/或阿茲海默氏症)有關之治療應用及/或診斷應用之方法之尚未滿足之需求。此外，有鑑於以下至少一種或多種性質，仍存在對替代及/或改良之抗IL-34抗體之尚未滿足之需求，該替代及/或改良之抗IL-34抗體具有優於先前技術抗IL-34抗體之特別有利性質之組合：1)期望之締合及解離速率，2)中和人類IL-34以達成抗發炎反應及活體內效力之效價，3)足夠有效地作為單藥療法用於治療及/或預防免疫介導之病症及/或發炎病症；4)持續作用時間；5)足夠有限地誘導非所欲細胞介素釋放，6)可接受地低的免疫原性(亦即，人類中之足夠非免疫原性)；7)避免非所需出現的免疫功能不全(immunocompromise)；及/或8)期望之活體內穩定性、物理及化學穩定性，包括但不限於熱穩定性、溶解性、低自締合及藥物動力學特性，此等特性對於開發及/或用於治療發炎或神經發炎病症(例如AD)係可接受的。
本發明之實施例提供新穎抗人類IL-34及抗鼠類IL-34抗體。根據一些實施例，本發明提供包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)之抗體，其中該LCVR包含互補決定區(CDR) LCDR1、LCDR2及LCDR3及該HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2及HCDR3，其等係選自提供於表1中之CDR組合分組。本文使用的序列標識符列於表1中，且該等序列以本文提供的胺基酸及核苷酸序列清單提供。表 1 ：胺基酸及核苷酸序列
抗體 1 抗體 2 抗體 3
SEQ ID HC 1 13 19
SEQ ID LC 2 2 20
SEQID HCVR 3 14 21
SEQID LCVR 4 4 22
SEQID HCDR1 5 15 23
SEQID HCDR2 6 16 24
SEQID HCDR3 7 17 25
SEQID LCDR1 8 8 26
SEQID LCDR2 9 9 27
SEQID LCDR3 10 10 28
SEQ ID: DNA HC 11 18 29
SEQ ID DNA LC 12 12 30
因此，本發明之實施例亦提供包含選自以下之LCVR及HCVR之抗體： a. 具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之LCVR及具有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列之HCVR； b. 具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之LCVR及具有SEQ ID NO: 14之胺基酸序列之HCVR； c. 具有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列之LCVR及具有SEQ ID NO: 21之胺基酸序列之HCVR。
根據其他實施例，本發明亦提供包含如以上在a至c中所述的LCVR及HCVR與選自SEQ ID NO:51及SEQ ID NO: 52之鉸鏈區及Fc區之組合之抗體。
根據其他實施例，本發明亦提供包含選自以下或具有與以下之胺基酸序列具有至少95%同源性之胺基酸序列之LC及HC之抗體： a. 具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之LC及具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之HC； b. 具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之LC及具有SEQ ID NO: 13之胺基酸序列之HC；及 c. 具有SEQ ID NO: 20之胺基酸序列之LC及具有SEQ ID NO: 19之胺基酸序列之HC。
本申請案依35 U.S.C. §119(e)主張2020年4月30日申請之美國臨時申請案序號63/017,748之權益；該案之揭示內容係以引用之方式併入本文中。
如本文所用「抗體1」係指一種抗體，其具有SEQ ID NO: 5之HCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO: 6之HCDR2胺基酸序列、SEQ ID NO: 7之HCDR3胺基酸序列、SEQ ID NO: 8之LCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO: 9之LCDR2胺基酸序列、SEQ ID NO: 10之LCDR3胺基酸序列、SEQ ID NO: 3之HCVR胺基酸序列、SEQ ID NO: 4之LCVR胺基酸序列、SEQ ID NO: 1之HC胺基酸序列、SEQ ID NO: 2之LC胺基酸序列、SEQ ID NO: 11之HC DNA序列及SEQ ID NO: 12之LC DNA序列。除非另作指明，否則使用與North等人，J. Mol. Biol. 2011 : 406: 228-256之方法一致之註釋規則，對本文闡述其序列的各抗體中之框架及CDR序列進行註釋。
如本文所用「抗體2」係指一種抗體，其具有SEQ ID NO: 15之HCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO: 16之HCDR2胺基酸序列、SEQ ID NO: 17之HCDR3胺基酸序列、SEQ ID NO: 8之LCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO: 9之LCDR2胺基酸序列、SEQ ID NO: 10之LCDR3胺基酸序列、SEQ ID NO: 14之HCVR胺基酸序列、SEQ ID NO: 4之LCVR胺基酸序列、SEQ ID NO: 13之HC胺基酸序列、SEQ ID NO: 2之LC胺基酸序列、SEQ ID NO: 18之HC DNA序列及SEQ ID NO: 12之LC DNA序列。除非另作指明，否則使用與North等人，J. Mol. Biol. 2011 : 406: 228至256之方法一致之註釋規則，對本文闡述其序列的各抗體中之框架及CDR序列進行註釋。
如本文所用「抗體3」係指一種抗體，其具有SEQ ID NO: 23之HCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO: 24之HCDR2胺基酸序列、SEQ ID NO: 25之HCDR3胺基酸序列、SEQ ID NO: 26之LCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO: 27之LCDR2胺基酸序列、SEQ ID NO: 28之LCDR3胺基酸序列、SEQ ID NO: 21之HCVR胺基酸序列、SEQ ID NO: 22之LCVR胺基酸序列、SEQ ID NO: 19之HC胺基酸序列、SEQ ID NO: 20之LC胺基酸序列、SEQ ID NO: 29之HC DNA序列及SEQ ID NO: 30之LC DNA序列。除非另作指明，否則使用與根據North等人，J. Mol. Biol. 2011 : 406: 228至256之方法一致之註釋規則，對本文闡述其序列的各抗體中之框架及CDR序列進行註釋。
各HC之羧基端部分限定主要負責效應功能之恆定區，且在本發明之一些實施例中，抗體具有各HC之恆定區中減少效應功能之一或多種修飾。較佳地，本發明之實施例為IgG4抗體，且因此包含IgG4 Fc區或自人類IgG4衍生之Fc區，例如經修飾之IgG4Fc區。
根據一些實施例，將兩個HC之恆定區中減少效應功能之修飾及胺基酸取代引入至IgG4鉸鏈區及Fc區中。因此，一些實施例具有在兩個HC之恆定區中之修飾，該兩個HC在兩個殘基230及231處均包含胺基酸丙胺酸(分別以抗體1之HC、抗體2之HC及SEQ ID NO: 52為例)、及在兩個HC之恆定區中之促進穩定性之進一步修飾，包括在殘基224處之胺基酸脯胺酸(以抗體1之HC、抗體2之HC及例如SEQ ID NO: 51為例)、及殘基443處胺基酸離胺酸之缺失(以SEQ ID NO.1之HC為例)。
咸信，本發明之抗體具有優於先前技術抗IL-34抗體之特別有利性質之組合，包括但不限於一或多種以下性質：1)期望之締合及解離速率，2)中和人類IL-34以達成抗發炎反應及活體內效力之效價，3)足夠有效地作為單藥療法用於治療及/或預防免疫介導之病症及/或發炎病症；4)持續作用時間；5)足夠有限地誘導非所欲細胞介素釋放，6)可接受地低的免疫原性(亦即人體內足夠非免疫原性)；7)避免非所需出現的免疫功能不全；及/或8)期望之活體內穩定性、物理及化學穩定性，包括但不限於熱穩定性、溶解性、低自締合及藥物動力學特性，此等特性對於開發及/或用於治療發炎或神經發炎病症(例如AD)係可接受的。
本發明之實施例使用如本文描述的實施例中所提供的藥理學上有利之抗人類IL-34抗體藉由透過IL-34中和提供可用於預防、下調或改善發炎及/或神經發炎相關病症之組合物及方法來提供優於先前技術之顯著進步。本發明之抗人類IL-34抗體能夠改良免疫及/或發炎病理，或恢復免疫穩衡，較佳地，透過抑制免疫反應之先天隊組，及/或消除微神經膠質細胞增生或其他單核細胞/巨噬細胞譜系細胞活化及/或增殖，由此直接改變根本性疾病病理。臨床上使用此類抗體可導致所治療疾病之持久長期改良。
此外，需要診斷性抗人類IL-34抗體，其對人類IL-34具有特異性，且具有改良之結合親和力，且證實在人類IL-34測定中之增強之敏感性、及改良之酶聯免疫吸附檢定(ELISA)條件，其導致最小干擾及寬廣稀釋線性。根據本發明之一些態樣，提供抗人類IL-34抗體，包括人類IL-34中和抗體，其結合SEQ ID NO: 41所示之人類IL-34。介白素34 (IL-34；亦稱為未經表徵之蛋白C16orf77)經分泌為由39 kDa單體組成之同源二聚體。其不屬於已知細胞介素家族。人類IL-34經合成為包含20 AA信號序列之242個胺基酸(AA)前驅物，且導致222 AA成熟鏈。如本文所用IL-34係指成熟鏈。成熟鏈包含N連接糖基化之一個潛在位點。人類IL-34為在胺基酸層級上與IL-34 71%相同。IL-34在各種組織(包括心臟、腦、肝臟、腎臟、脾臟、胸腺、睾丸、卵巢、小腸、前列腺及結腸)中表現，且在脾臟中係最豐富的。除非另有說明，否則「h IL-34」或「人類IL-34」在本文中關於IL-34多肽使用時係指野生型人類IL-34，且較佳具有SEQ ID NO: 41所示之胺基酸序列，其為移除前導序列之成熟IL-34。(參見，例如Lin等人，Science (2008)，第320卷，Issue 5877，第807頁至第811頁)。
一種示例性人類IL-34 (包含20 AA信號肽序列，將其移除以產生成熟多肽)為：
Figure 02_image001
(SEQ ID NO: 41，參見NCBI參考序列號NP_689669.2，2018年3月1日)。
根據本發明之一些態樣，提供抗鼠類IL-34抗體(包括鼠類IL-34中和抗體)，其結合以SEQ ID NO.42提供之人類IL-34。一種示例性鼠類IL-34 (包含20 AA信號肽序列，將其移除以產生成熟多肽)為：
Figure 02_image003
(SEQ ID NO: 42，參見NCBI參考序列號NP_00l l28572.l，2018年3月1日)。
如本文所用，「人類抗IL34抗體」或「抗人類IL-34抗體」係指結合至人類IL-34之抗體，且在活體外或活體內投與時，導致IL-34活性中和及/或阻斷反應，諸如至少一種顯著降低之期望活性，例如IL-34信號傳導之期望之降低，如藉由IL-34反應分子或細胞終點變化所證明。例如，CNS中之微神經膠質細胞數目、密度或表型係IL-34反應性分子或細胞效應之一個實例。如本文所用，術語「信號傳導」及「信號轉導」及「IL-34介導之」在其關於IL-34時係指由於IL-34之活性所致之細胞及/或細胞間反應。
術語「抗體」如本文所用係指結合抗原之免疫球蛋白分子。抗體之實施例包括單株抗體、多株抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體或結合抗體。該等抗體可係任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA)及任何子類型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。一種示例性抗體為免疫球蛋白G (IgG)型抗體，其包含四條多肽鏈：兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)，其係經鏈間二硫鍵交聯。LC被歸類為κ或λ，其各以特定恆定區表徵。本發明之實施例可包含IgG1或IgG4抗體，且進一步包含κ輕鏈或λ輕鏈。較佳地，本發明之抗體包含為κ恆定區之輕鏈恆定區。
HC被歸類為γ、μ、α、δ或ε，且將抗體之同型物分別定義為IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。四條多肽鏈中各者之胺基端部分包含主要負責抗原識別之約100至125個或更多個胺基酸之可變區。四個多肽鏈中各者之羧基端部分包含主要負責效應功能之恆定區。各重鏈包含重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區。重鏈之恆定區包含CH1、CH2及CH3域。CH1緊隨HCVR之後；該CH1及HCVR形成抗原結合(Fab)片段之重鏈部分，該片段係結合抗原的抗體之一部分。CH2緊隨鉸鏈區之後且在CH3之前。CH3緊隨CH2之後且在重鏈之羧基端處。輕鏈之恆定區包含一個域CL。CL緊隨LCVR之後；該CL及LCVR形成Fab之輕鏈部分。
本發明之抗體包含IgG HC，其可進一步分為亞類，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，及本發明之實施例可包含各HC之恆定區中之一或多個修飾，例如其增強或減少效應功能。術語「Fc區」如本文所用係指抗體之區域，其包含抗體重鏈之CH2及CH3域。視需要，Fc區可包含抗體重鏈之鉸鏈區之一部分或整個鉸鏈區。已知IgG1會誘導抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)，及本文描述的Fc突變可減少聚集，減少或增強ADCC或CDC活性(或其他功能)，及/或修飾抗體之藥物動力學。本文描述的抗人類IL-34抗體之實施例具有對FcγR及C1q受體之減少之結合，藉此減少或消除可由具有野生型IgG Fc區之抗體誘導之細胞毒性。因此，根據一些實施例，在Fc區中於如本文所述的位置處引入突變。患者安全性可以充分降低或消除包含經修飾之Fc區之此類抗人類IL-34抗體之效應功能來改良，且與本文描述的其他性質組合，提供具有改良之可用活性概況之治療劑同時避免非所欲活性。
當在某些生物系統中表現時，抗體在Fc區中進行糖基化。通常，糖基化發生在抗體之Fc區中高度保守之N-糖基化位點處。N-聚醣通常附著至天冬醯胺酸。抗體亦可在其他位置處進行糖基化。本發明之抗體為單株抗體。單株抗體為衍生自單純副本或純系之抗體，包括例如任何真核、原核或噬菌體純系，且不受其產生方法的限定。單株抗體可例如藉由融合瘤技術、重組技術、噬菌體顯示技術、合成技術(例如CDR接枝)或此項技術中已知的此等或其他技術之組合來產生。本發明涵蓋為人類或人類化抗體之本發明抗體。在單株抗體之背景內容中，術語「人類」及「人類化」為熟習此項技術者所熟知(Weiner LJ，J. Immunother. 2006；29: 1至9；Mallbris L等人，J. Clin. Aesthet. Dermatol. 2016；9: 13至15)。本發明之抗體之示例性實施例亦包含抗體片段或抗原結合片段，其包含保留與抗原特異性相互作用之能力之抗體之至少一部分(諸如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、scFv抗體片段、二硫鍵連接之Fv (sdFv)、Fd片段及線性抗體)。
各LC及HC之胺基端部分包含主要經由其中包含的CDR負責抗原識別之約100至120個胺基酸之可變區。VH及VL區可進一步細分為高變區，稱之為互補決定區(CDR)，其間散佈著更為保守之區域，稱之為框架區(FR)。將CDR暴露於蛋白質之表面上且為抗體之針對抗原結合特異性之重要區域。各VH及VL包含三個CDR及四個FR，自胺基端至羧基端以下列順序配置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本文中，重鏈之三個CDR稱為「HCDR1、HCDR2及HCDR3」及輕鏈之三個CDR稱為「LCDR1、LCDR2及LCDR3」。CDR包含大多數殘基，其與抗原形成特異性相互作用。抗體結合特異性抗原之功能能力很大程度上受該六個CDR影響。將胺基酸殘基指派給CDR可根據熟知方案，包括彼等描述於以下中之方案來完成：Kabat (Kabat等人，「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，National Institutes of Health，Bethesda，Md. (1991))、Chothia (Chothia等人，「Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins」，Journal of Molecular Biology，196，901-917 (1987)；Al-Lazikani等人，「Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins」，Journal of Molecular Biology，273，927-948 (1997))、North (North等人，「A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations」，Journal of Molecular Biology，406，228-256 (2011))、或IMGT (可在www.imgt.org可得之國際ImMunoGeneTics資料庫；參見Lefranc等人，Nucleic Acids Res. 1999；27:209至212)。
出於本發明之目的，且除另作說明之處之外，North CDR定義用於本文描述的抗IL-34抗體，且將胺基酸分配至LCVR及HCVR區域內的CDR域。以下為基於North定義之抗體1之CDR序列表格。熟練技術人員亦可應用Kabat、Chothia及/或IMGT之替代定義，以根據本發明之抗體(包括表1中之抗體1至3)之其等約定指定CDR。
抗體 1 之示例性 CDR ( 或本發明之抗體 )
Ab HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
North AASGFTFSSYATS (SEQ ID NO: 5) AISHSGRSTYYADSVKG(SEQ ID NO: 6) ARGRSSLDT (SEQ ID NO: 7) RASQSISSAYLA (SEQ ID NO: 8) YASSIRPT (SEQ ID NO: 9) SQYGDSLS (SEQ ID NO: 10)
本發明之抗體實施例具有幾種藥理學上有用且重要之且在一個態樣中能夠以高親和力且對人類IL-34具有高特異性地結合至人類IL-34之活性之組合、以及其他有用目的。除非另有指示，否則術語「結合(bind/binds)」如本文所用欲指蛋白質或分子與另一蛋白質或分子形成具有吸引力之相互作用之能力，該相互作用導致兩種蛋白質或分子之接近性，由此項技術中已知的常用方法確定。除非另有指示，否則片語「特異性結合」如本文關於抗IL-34抗體對人類IL-34之親和力使用時欲指較佳小於約1 x 10-11 M，甚至更佳約1 x 10-11 M至約1 x 10-12 M之KD ，由此項技術中已知的常用方法來測定，包括藉由使用SPR生物感測器及/或MSD，基本上如本文所述。片語「特異性結合」亦指示與其他抗原相比抗IL-34抗體對人類IL-34之相對親和力，其中該對人類IL-34之親和力導致人類IL-34之特異性識別。
本發明之抗體實施例可藉由此項技術中已知的多種技術自包含本發明實施例之序列之構築體表現及產生。術語「核酸」或「多核苷酸」如本文可互換使用係指多核苷酸之聚合物，包括單股及/或雙股含核苷酸分子，諸如DNA、cDNA及RNA分子，併入天然核苷酸、經修飾之核苷酸及/或核苷酸之類似物。本發明之多核苷酸亦可包括例如藉由DNA或RNA聚合酶或合成反應併入其中之受質。本發明之DNA分子為包含編碼具有本發明之抗體中之至少一個多肽之胺基酸序列之多肽之非天然存在之多核苷酸序列(例如重鏈、輕鏈、可變重鏈及可變輕鏈)之DNA分子。
編碼HCVR或LCVR區之分離的DNA可藉由將各自的HCVR或LCVR編碼DNA以可操作方式連接至另一編碼重鏈或輕鏈恆定區之DNA分子以分別形成重鏈或輕鏈而轉化為全長重鏈基因。此項技術中已知人類之序列以及其他哺乳動物重鏈恆定區基因。包含此等區域之DNA片段可例如藉由標準PCR擴增來獲得。
本發明之多核苷酸可在宿主細胞中於該等序列已以可操作方式連接至表現控制序列之後得以表現。表現載體通常可作為游離基因組(episome)或作為宿主染色體DNA之整合部分在宿主生物中複製。通常，表現載體將包含選擇標記，例如四環素、新黴素及二氫葉酸還原酶，以允許檢測用所期DNA序列轉化之其等細胞。包含所關注的多核苷酸序列(例如編碼抗體之多肽及表現控制序列之多核苷酸)之載體可藉由熟知方法轉移至宿主細胞中，該等方法根據細胞宿主之類型而變化。
本發明之抗體可容易地在哺乳動物細胞中產生，其非限制性實例包括CHO、NS0、HEK293或COS細胞。使用此項技術中熟知的技術來培養宿主細胞。抗體之哺乳動物表現通常導致糖基化。抗體之糖基化通常係N-連接或O-連接的。N-連接糖基化係指碳水化合物部分附接至天冬醯胺酸殘基之側鏈。O-連接糖基化係指將糖(例如N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖)附接至羥基胺基酸。通常，糖基化發生在抗體之Fc區中高度保守之N-糖基化位點(例如根據IMGT或EU索引編號，IgG1中之位置297)處。糖基化位點可經修飾以改變糖基化(例如阻斷或減少糖基化或改變胺基酸序列以產生另外或不同糖基化)。
IgG亞類抗體之哺乳動物表現可導致C端胺基酸自一個或兩個重鏈的截割；例如，IgG1抗體可移除一或兩個C端胺基酸。對於IgG1抗體，若存在C端離胺酸，則其可在表現期間自重鏈截短或剪輯除去。另外，倒數第二個甘胺酸亦可自重鏈截短或剪輯除去。
抗體之哺乳動物表現亦可導致N端胺基酸之修飾。例如，在重鏈或輕鏈之最N端胺基酸為麩醯胺酸之情況下，其可經修飾為焦麩胺酸。
本發明之抗體或包含其之醫藥組合物可藉由非經腸途徑投與，其非限制性實例係皮下投與及靜脈內投與。本發明之抗體可以單劑量或多劑量與醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑一起投與患者。本發明之醫藥組合物可藉由此項技術中熟知的方法來製備(例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy，第22版(2012)，A. Loyd等人，Pharmaceutical Press)且包含如本文所揭示的抗體及一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。本發明之抗體實施例之用途 ：
根據一些實施例，本發明之抗IL-34抗體可用於治療免疫介導之疾病。如本文所用，術語「免疫介導之疾病」或「發炎疾病或病症」可互換使用且係指由於不適當或過度免疫反應而引起之非所欲病狀，其中L-34抑制導致更多穩態且更少之病理反應。術語「免疫介導之疾病」或「發炎病症」意欲包括此類病狀，無論其係由微神經膠質細胞或巨噬細胞細胞免疫反應、或類似組織駐留細胞類型之彼等(諸如組織細胞、庫普弗(Kupffer)細胞、肺泡巨噬細胞、腸道巨噬細胞、巨噬細胞樣滑膜細胞或朗格漢斯(Langerhans)細胞)介導。經考慮藉由本文描述的本發明抗體治療之示例性疾病包括阿茲海默氏症；Tau蛋白病；休格倫氏症候群(Sjogren’s syndrome) (SS)；類風濕性關節炎(RA)；發炎性腸病(IBD)、異位性皮膚炎、腎臟疾病、敗血症及/或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
在一些更特定實施例中，免疫介導之疾病為阿茲海默氏症(AD)。根據本發明之其他實施例，抗IL-34抗體可用於免疫介導之疾病之診斷應用。在一些實施例中，免疫介導之疾病為以下中之至少一者：AD；休格倫氏症候群(SS)；類風濕性關節炎(RA)；發炎性腸病(IBD)、異位性皮膚炎、腎臟疾病、敗血症及/或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
本發明進一步提供醫藥組合物，其包含本發明之抗IL-34抗體及一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。此外，本發明提供一種治療免疫介導之疾病之方法，該疾病諸如以下：AD；休格倫氏症候群(SS)；類風濕性關節炎(RA)；發炎性腸病(IBD)、異位性皮膚炎、腎臟疾病、敗血症及/或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，該方法包括對有此需要的患者投與本發明之醫藥組合物。
另外，本發明提供一種治療免疫介導之疾病之方法。更特定言之，本發明提供一種治療免疫介導之疾病之方法，該疾病包括以下：AD；休格倫氏症候群(SS)；類風濕性關節炎(RA)；發炎性腸病(IBD)、異位性皮膚炎、腎臟疾病、敗血症及/或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，該方法包括對有此需要的患者投與有效量之本發明之抗IL-34抗體。
本發明亦提供用於療法之本發明之抗IL-34抗體。更特定言之，本發明提供一種本發明之抗IL-34抗體，其用於治療免疫介導之疾病，包括AD；休格倫氏症候群(SS)；類風濕性關節炎(RA)；發炎性腸病(IBD)、異位性皮膚炎、腎臟疾病、敗血症及/或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
在某些實施例中，本發明提供一種本發明之抗IL-34抗體於製造用於治療一或多種免疫介導之疾病之藥物之用途，該疾病包括AD；休格倫氏症候群(SS)；類風濕性關節炎(RA)；發炎性腸病(IBD)、異位性皮膚炎、腎臟疾病、敗血症及/或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
本發明之抗體可用於識別免疫介導之病症，其中IL-34可促成該病症之發病機理(etiopathogenesis)。在另外實施例中，本發明提供一種治療患者之免疫介導之疾病之方法。此類方法包括以下步驟：使患者樣品與抗IL-34抗體接觸且檢測患者樣品中人類IL-34與抗體之間的結合；及當檢測到患者樣品中IL-34之存在為高於在未患病個體中觀測到的參考值時，診斷患者為具有與免疫介導之疾病有關之症狀；處在與免疫介導之疾病有關之症狀風險中；需要治療與免疫介導之疾病有關之症狀；及/或處在與免疫介導之疾病有關之症狀風險中(參見例如Xie, H.H.等人，Elevated Serum Interleukin-34 Level in Patients with Systemic Lupus Erythematosus Is Associated with Disease Activity . Sci Rep 8，3462 (2018)。根據本文提供的治療方法之一些更特定實施例，此類方法進一步包括測定參考值之步驟，包括使對照標準品與結合與在接觸患者樣品中所使用相同的IL-34第一抗原決定基區之第一抗體接觸之另外步驟；使對照標準品與具有可檢測之標籤且結合與在接觸患者樣品中所使用相同的IL-34第二抗原決定基區之第二抗體接觸；及檢測藉由可檢測之信號提供之信號。在一些特定實施例中，抗IL-34抗體包含提供於表1中之LC及HC CDR之組合。在其他實施例中，第二抗體包含提供於表1中之LCVR及HCVR之組合。根據一些實施例，例如CNS組織裂解物之參考值為約10至30 pg/mL。在某些實施例中，免疫介導之疾病為以下中之一者：AD；休格倫氏症候群(SS)；類風濕性關節炎(RA)；發炎性腸病(IBD)、異位性皮膚炎、腎臟疾病、敗血症及/或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。在一些實施例中，患者樣品為CSF、血液、血清、組織裂解物或血漿中之一者。根據一些實施例，該方法進一步包括以下步驟：使患者樣品與結合IL-34之第二抗原決定基區且具有可檢測之標籤之第二抗IL-34抗體接觸，及檢測藉由可檢測之信號提供之信號。在其他實施例中，第二抗體包含提供於表1中之LC及HC CDR之組合。在其他實施例中，第二抗體包含提供於表1中之LCVR及HCVR之組合。根據某些實施例，該第一抗IL-34抗體及第二抗IL-34抗體不一起歸入統計堆(bin)。
根據一些實施例，本發明提供一種檢測患者樣品中之IL-34之方法，該方法包括以下步驟：使患者樣品與結合IL-34之第一抗原決定基區之第一抗體接觸；使患者樣品與結合IL-34之第二抗原決定基區且具有可檢測之標籤之第二抗體接觸；及檢測藉由該可檢測之標籤提供之信號。在一些實施例中、患者樣品為血液、血清、組織裂解物或血漿中之一者。根據一些更特定實施例，IL-34之第一抗原決定基區與IL-34之第二抗原決定基區部分重疊。此外，在一些實施例中，與第一抗體及第二抗體接觸之該等步驟同時發生。在一些特定實施例中，第一抗體包含提供於表1中之LC及HC CDR之組合。在另外實施例中，第一抗體包含提供於表1中之LCVR及HCVR之組合。
根據本發明之一些實施例，提供一種量化患者樣品中之IL-34之方法。此類方法包括以下步驟：使患者樣品與結合IL-34之第一抗原決定基區之第一抗體接觸；使患者樣品與結合IL-34之第二抗原決定基區之第二抗體接觸且該第二抗體具有可檢測之標籤；及檢測藉由該可檢測之標籤提供之信號；使對照標準品與結合(與在接觸患者樣品中所使用)相同的IL-34第一抗原決定基區之第一抗體接觸；使對照標準品與結合(與在接觸患者樣品中所使用)相同的IL-34第二抗原決定基區且具有可檢測之標籤之第二抗體接觸；及檢測藉由該可檢測之信號提供之信號。在一些實施例中，患者樣品為血液、血清或血漿或組織裂解物中之一者。根據一些更特定實施例，IL-34之第一抗原決定基區與IL-34之第二抗原決定基區部分重疊。此外，在一些實施例中，與第一抗體及第二抗體接觸之該等步驟同時發生。在一些特定實施例中，第一抗體包含提供於表1中之LC及HC CDR之組合。在另外實施例中，第一抗體包含提供於表1中之LCVR及HCVR之組合。在一些特定實施例中，第二抗體包含提供於表1中之LC及HC CDR之組合。在另外實施例中，第二抗體包含提供於表1中之LCVR及HCVR之組合。
根據一些實施例，提供一種診斷免疫介導之疾病之方法。此種方法包括使患者樣品與抗IL-34抗體接觸及檢測患者樣品中之IL-34與抗體之間的結合之步驟。根據一些特定實施例，該診斷方法包括當檢測到患者樣品中IL-34之存在為高於在未患病個體中觀測到的參考值時，診斷患者為具有與免疫介導之疾病有關之症狀；處在與免疫介導之疾病有關之症狀風險中；需要治療與免疫介導之疾病有關之症狀；及/或處在與免疫介導之疾病有關之症狀。根據一些更特定實施例，此類方法進一步包括測定參考值之步驟，包括使對照標準品與結合與在接觸患者樣品中所使用相同的IL-34第一抗原決定基區之第一抗體接觸之步驟；使對照標準品與具有可檢測之標籤且結合與在接觸患者樣品中所使用相同的IL-34第二抗原決定基區之第二抗體接觸；及檢測藉由可檢測之信號提供之信號。在一些實施例中，第一抗體包含提供於表1中之LC及HC CDR之組合。本文提供的診斷免疫介導之疾病之方法之一些實施例進一步包括以下步驟：使患者樣品與結合IL-34之第二抗原決定基區且具有可檢測之標籤之第二抗IL-34抗體接觸；及檢測由可檢測之標籤提供之信號。在一些特定實施例中，抗IL-34抗體包含提供於表1中之LC及HC CDR之組合。在另外實施例中，抗體包含提供於表1中之LCVR及HCVR之組合。根據特定實施例，IL-34之第一抗原決定基區與IL-34之第二抗原決定基區部分重疊。根據某些實施例，該第一抗體及第二抗體不一起歸入統計堆(bin)。根據另外實施例，參考值近似係CNS組織裂解物之10至30 pg/mL之範圍，及/或如技術人員針對適宜參考組及样品來源所確定。在另外實施例中，免疫介導之疾病為以下中之一者：AD；Tau蛋白病；休格倫氏症候群(SS)；類風濕性關節炎(RA)；發炎性腸病(IBD)、異位性皮膚炎、腎臟疾病、敗血症及/或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
在一個實施例中，本發明提供一種測定體液中人類IL-34含量之方法，該方法包括：(a)使體液與特異性結合至人類IL-34之由SEQ ID NO: 41所示之胺基酸序列組成之抗人類IL-34診斷單株抗體或其抗原結合片段接觸，該抗體或其抗原結合片段包含：輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別包含胺基酸序列(SEQ ID NO: 8)、(SEQ ID NO: 9)及(SEQ ID NO: 10)、及重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別包含胺基酸序列(SEQ ID NO:15)、(SEQ ID NO: 16)及(SEQ ID NO: 17)；(B)視需要，移除任何非特異性結合之單株抗體或其抗原結合片段；及(c)檢測及/或量化特異性結合至人類IL-34之單株抗體或其抗原結合片段之量。較佳地，其中該體液為血液、血清或血漿或腦脊髓液，且該接觸離體發生。
Tau蛋白病包括但不限於：阿茲海默氏症(AD)、皮克氏病(Pick’s disease；PiD)、進行性核上性麻痺(PSP)、皮層基底變性(CBD)、嗜銀顆粒病、唐氏症候群(Down’s Syndrome)、慢性創傷性腦病(CTE)、創傷性腦損傷(TBI)、額顳葉癡呆伴聯繫染色體17之帕金森氏症(FTDP-17)、關島之帕金森氏症-癡呆症候群、C型尼曼匹克症(Niemann-Pick disease type C)、肌強直性營養不良(參見Li, C.、Götz, J.，Tau-based therapies in neurodegeneration: opportunities and challenges . Nat Rev Drug Discov 16，863至883 (2017))。
在本發明之實施例中，患者為人類，其已診斷為具有醫學風險、病狀或病症(諸如本文描述的疾病或病症中之一者)，需要用本文描述的抗體治療。在彼等其中可藉由本發明之方法治療之病症藉由經確立且接受之分類已知之情況下，諸如阿茲海默氏症；Tau蛋白病；休格倫氏症候群(SS)；類風濕性關節炎(RA)；發炎性腸病(IBD)、異位性皮膚炎、腎臟疾病、敗血症及/或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，其分類可見於各種熟知醫學著作中。例如，目前，Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-5)第5版提供用於識別本文描述的某些病症之診斷工具。再者，International Classification of Diseases第十修訂版(ICD-10)提供本文描述的某些疾病之分類。熟練技術人員當知曉，存在本文描述的疾病及病症之替代命名法、疾病分類學及分類系統，包括彼等如DSM-5及ICD-10中所述者，且該術語及分類系統隨著醫學科學進展而變化。
術語「治療(treating)」(或「治療(treat)」或「治療(treatment)」) 係指減慢、中斷、遏制、緩解、停止、減輕或逆轉現有症狀、病症、病狀或疾病之進步或嚴重度。
如本文所用，術語「先天免疫」包括免疫反應之隊組，與免疫反應之繼承隊組相反，其係引發及維持繼承免疫反應(抗體及T細胞反應)所必需的。
「有效量」意指本發明之抗人類IL-34抗體或包含此種抗體之醫藥組合物之量，該量將引起組織、系統或人類之生物或醫學反應或於組織、系統或人類上之所期治療效應，此為治療健康專業人員正在尋求的。如本文所用，術語患者之「有效反應」或患者的對治療之反應性係指在投與本發明之抗體後賦予患者之臨床或治療益處。抗體之有效量可根據因素(諸如個體之疾病狀態、年齡、性別及體重、及抗體在個體中引起所期反應之能力)而變化。有效量亦係其中抗體之任何毒性或有害效應均被治療有益效應所抵消之量。此種益處包括以下中之任何一者或多者：發炎或免疫活化之水平降低，穩定之免疫介導之疾病或病症；或改良免疫介導之病症之徵兆或症狀。或者，此種益處包括以下中之任何一者或多者：移植的器官之免疫耐受性增加；穩定之自體免疫疾病或病症；或改良自體免疫病症之徵兆或症狀。
本文揭示的方法之一個潛在優點係在具有可接受之安全性概況(包括可接受之耐受性、毒性及/或不良事件)使得患者自整體治療方法受益之罹患免疫介導之病症或神經發炎病症的患者中產生明顯及/或延長之緩解之可能性。可藉由通常用於評估針對各種免疫介導之病症之治療之各種終點來測定本發明之治療之功效。可視需要採用測定本發明之任何特定療法之功效之其他方法，包括例如免疫細胞活化標記、發炎之量度、細胞週期依賴性生物標記測量及可視化、及/或透過各種發炎或免疫或組織特異性生物標記評估測定反應。
有效量可由熟習此項技術者使用已知技術，且藉由觀測在類似情況下獲得的結果來輕易地確定。有效量之本發明之抗人類IL-34抗體可以單劑量或多劑量投與。此外，有效量之本發明之抗體可以多次劑量之若不超過一次投與則將小於有效量之量投與。在確定患者之有效量時，主治醫生考慮許多因素，包括但不限於：患者之體型(例如體重或質量)、體表面積、年齡及一般健康；所涉及的特定疾病或病症；疾病或病症之程度，或累及，或嚴重度；個別患者之反應；所投與的特定化合物；投與模式；所投與製劑之生物利用度特徵；所選擇的劑量方案；合併用藥之用法；及醫生已知的其他相關情況。
每週、每兩週、每月或每季度非經腸(包括但不限於皮下、肌肉內及/或靜脈內)劑量可為約0.5 mg/kg至約50 mg/kg。
每週、每兩週、每月或每季度非經腸(包括但不限於皮下、肌肉內及/或靜脈內)劑量可為約0.5 mg/kg至約10 mg/kg、約1 mg/kg至約10 mg/kg、約2 mg/kg至約10 mg/kg、約3 mg/kg至約10 mg/kg、約4 mg/kg至約10 mg/kg、約5 mg/kg至約10 mg/kg、約6 mg/kg至約10 mg/kg、約7 mg/kg至約10 mg/kg、約8 mg/kg至約10 mg/kg、約1 mg/kg至約8 mg/kg、約2 mg/kg至約8 mg/kg、約3 mg/kg至約8 mg/kg、約4 mg/kg至約8 mg/kg、約5 mg/kg至約8 mg/kg、約6 mg/kg至約8 mg/kg、約1 mg/kg至約6 mg/kg、約2 mg/kg至約6 mg/kg、約3 mg/kg至約6 mg/kg、約4 mg/kg至約6 mg/kg、約5 mg/kg至約6 mg/kg、約1 mg/kg至約5 mg/kg、約2 mg/kg至約5 mg/kg、約3 mg/kg至約5 mg/kg、約4 mg/kg至約5 mg/kg、約1 mg/kg至約4 mg/kg、約2 mg/kg至約4 mg/kg、約3 mg/kg至約4 mg/kg、約3.5 mg/kg至約5 mg/kg、或約4 mg/kg至約5 mg/kg。
每週、每兩週、每月或每季度非經腸(包括但不限於皮下、肌肉內及/或靜脈內)劑量可為例如約50 mg至約500 mg、約75 mg至約500 mg、約100 mg至約500 mg、約125 mg至約500 mg、約250 mg至約500 mg、約300 mg至約500 mg、約350 mg至約500 mg、約400 mg至約500 mg、約450 mg至約500 mg、約50 mg至約400 mg、約75 mg至約400 mg、約100 mg至約400 mg、約125 mg至約400 mg、約250 mg至約400 mg、約300 mg至約400 mg、約350 mg至約400 mg、約50 mg至約300 mg、約75 mg至約300 mg、約100 mg至約300 mg、約125 mg至約300 mg、約150 mg至約300 mg、約175 mg至約300 mg、約200 mg至約300 mg、約250 mg至約300 mg、約50 mg至約250 mg、約75 mg至約250 mg、約100 mg至約250 mg、約125 mg至約250 mg、約150 mg至約250 mg、約175 mg至約250 mg、約200 mg至約250 mg、約75 mg至約250 mg、約50 mg至約200 mg、約75 mg至約200 mg、約100 mg至約200 mg、約125 mg至約200 mg、約150 mg至約200 mg、約175 mg至約200 mg、約50 mg至約175 mg、約75 mg至約175 mg、約100 mg至約175 mg、約125 mg至約175 mg、或約150 mg至約175 mg。
然而，亦設想低於或高於本文提及的劑量之劑量，特別是考慮到熟習此項技術者已知及/或本文描述之劑量考量。可藉由定期評估來監測正在進行治療的患者之進展，且在必要時相應地調整劑量。
本文揭示的方法之一個潛在優點係在可接受之安全性(包括可接受之耐受性、毒性及/或不良事件)下，在罹患免疫介導之病症或神經發炎病症的患者中產生明顯及/或延長之緩解之可能性，因此患者總體上從治療方法獲益，且更特定言之，本發明之抗體將提供有效治療同時避免臨床上非所需的免疫抑制及/或免疫相關不良事件，諸如「細胞介素風暴(cytokine storm)」或顯著細胞介素釋放。本發明之抗體可用於治療細胞介素風暴，或者其他不良細胞介素釋放。如本文所用，「顯著細胞介素釋放」係指可測量之細胞介素之顯著增加，其可藉由一般技術者已知的方法來檢測。例如，可藉由ELISA在人類血液樣品中檢測到顯著細胞介素釋放，其中將未經刺激之血液之細胞介素含量與經抗體培養之血液之細胞介素含量進行比較。例如，在一些此類研究中，若經抗體培養之血液中IL-6、或L-8、或IFN-γ之含量比未經刺激之血液中之含量高至少三倍，則可檢測到顯著細胞介素釋放。較佳地，將進行如本文實施例中所述的免疫介導之病症之治療，其中該患者將不會經歷顯著細胞介素釋放。實例
提供以下實例以說明但不限制所主張的本發明。下列檢定之結果證實，本發明之所例示的單株抗體及/或其抗原結合片段結合及/或中和IL-34，且因此可用於治療本文描述的免疫介導之疾病及發炎疾病。實例 1 ：抗體產生、表現及純化
使用人類抗體噬菌體展示庫獲得一組人類抗IL-34抗體且經篩選以識別可為有效IL-34中和抗體之試劑。將突變全身性引入至各抗體之各個互補決定區(CDR)且所得庫經歷多輪降低抗原之濃度及/或增加解離時段之選擇，以便分離具有改良之親和力之純系。各個變異體之序列經測定且用於建構組合庫，該組合庫經歷另一輪增加嚴格性之選擇以識別各個CDR區之間的累加性或協同突變配對。對各個組合純系進行定序，且測定結合特性。為了進一步增加對IL-34之親和力，此等組合純系經歷另外幾輪單誘變及組合誘變。可針對人類或小鼠IL-34進行此種篩選以增加針對所選擇種類(例如對於人類IL-34之抗體1，及對於小鼠IL-34之抗體3)之親和力。亦可誘變所選擇抗體以固定轉譯後修飾，諸如甲硫胺酸氧化，同時保留對IL-34之結合親和力。另外，可對抗體進行框架(FW)取代以將此等FW1序列復原至其生殖系狀態以便降低潛在免疫原性風險。
獲得經工程改造及/或最佳化之抗IL-34抗體，在本文中稱為抗體1、抗體2及/或抗體3，其具有如以下在標題為「胺基酸及核苷酸序列清單」之小節中所列的重鏈及輕鏈之可變區之胺基酸序列、及完整重鏈及輕鏈胺基酸序列、及編碼其之核苷酸序列。下表1中顯示對應於此等片段之SEQ ID NO、以及輕鏈及重鏈CDR胺基酸序列。
可基本上如下表現及純化本發明之所例示的抗IL-34抗體。適宜宿主細胞(諸如HEK 293、NS0或CHO)可使用最佳預先確定之HC:LC載體比(諸如1:3或1:2)或同時編碼HC及LC之單載體系統經表現系統瞬時或穩定轉染以分泌抗體。使用許多常用技術中的任何一種純化已分泌抗體至其中之澄清培養基。例如，可將該培養基施用至蛋白A或G管柱，例如MabSelect®管柱(GE Healthcare))或用於Fab片段之KappaSelect管柱(GE Healthcare)，該等管柱已經可相容緩衝液(諸如磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)平衡。可洗滌管柱以移除非特異性結合組分。可例如藉由pH梯度(諸如20 mM Tris緩衝液，pH 7.0至10 mM檸檬酸鈉緩衝液，pH 3.0或磷酸鹽緩衝鹽水，pH 7.4至100 mM甘胺酸緩衝液，pH 3.0)洗脫所結合之抗體。抗體溶離份可諸如藉由SDS-PAGE檢測，且然後可組併在一起。例如，藉由pH梯度(諸如0.1M磷酸鈉緩衝液pH 6.8至0.1M檸檬酸鈉緩衝液pH 2.5)洗脫所結合之抗體。抗體溶離份諸如藉由SDS-PAGE檢測，且然後組併在一起。進一步純化係可選的，端視預期用途而定。可使用常用技術將抗體濃縮及/或無菌過濾。可溶性聚集體及多聚體可藉由常用技術(包括尺寸排阻、疏水相互作用或離子交換、多峰或羥磷灰石層析)有效移除。在此等層析步驟之後，抗體之純度為大於99%。該產物可在-70℃下立即冷凍，或可凍乾，或在4℃下保存以供立即使用。本發明之所例示人類抗體之胺基酸SEQ ID NO顯示於下表1中。
表現質體包含抗體1之LC及HC基因之cDNA形式(例如編碼呈現於表1中之所例示抗體1之HC之SEQ ID NO: 12之DNA序列、及編碼根據表1之LC胺基酸序列之DNA序列，例如編碼呈現於表1中之所例示抗體1之LC之SEQ ID NO: 13之DNA序列)；且藉由用於此目的之常用且適宜之構築體，諸如基於人類巨大細胞病毒主要即刻早期啟動子之構築體表現。LC及HC基因側接有由轉位酶酵素識別之反向末端重複(ITR)序列。親本細胞系經與表現質體及使得轉位酶酵素能夠瞬時表現之轉位酶mRNA共轉染，以促進抗體1基因表現盒穩定整合至基因組DNA中。
使所選擇的大批培養物經歷使用螢光活化之細胞分選(FACS)技術的單細胞選殖。擴增選殖衍生之細胞系且篩選抗體1產生。選擇且確立選殖衍生之細胞系。此種細胞系係在不含任何動物組分物質下產生且用於生產。
將分泌抗體進入其中的澄清培養基施用至經可相容之緩衝液(諸如磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)或20mM Tris與150 mM氯化鈉(pH 8.0))平衡之蛋白A親和管柱。用1M NaCl洗滌該管柱以移除非特異性結合組分。例如用pH (約) 3.5的檸檬酸鈉洗脫所結合之抗體且用1M Tris緩衝液中和溶離份。抗體溶離份諸如藉由SDS-PAGE或分析型尺寸排阻檢測，且然後組併在一起。可溶性聚集體及多聚體可藉由常用技術(包括尺寸排阻、疏水相互作用、離子交換或羥磷灰石層析)有效移除。使用常用技術將本發明之所例示的抗體IL-34抗體濃縮及/或無菌過濾。在此等層析步驟之後，所例示抗體之純度為大於95%。本發明之所例示的抗IL-34抗體可在-70℃下立即冷凍或在4℃下儲存幾個月。實例 2 ：抗 IL-34 抗體之表徵 對人類 IL-34 之結合親和力
本發明之抗IL-34單株抗體對人類IL-34(包括前導序列或成熟人類IL-34)之結合親和力可藉由此項技術中已知的方法來測定。除了指出的情況之外，所有試劑及材料均可購自Meso Scale Discovery (MSD® )，且可在37℃下進行測量。人類及小鼠IL-34可經製備且使用IMAC及尺寸排阻層析純化或購自商業供應商。人類CSF1R Fc融合蛋白(所例示化合物D)亦經製備，藉由MabSelectTM SuReTM (GE Healthcare)純化，且藉由尺寸排阻層析進一步精細純化(polish)。
簡言之，通常，自40或50或60或80或100或120 nM至100fM之起始濃度製備人類、食蟹獼猴或小鼠IL-34之2倍或3倍稀釋系列；且各系列包括IL-34空白對照。在3% (w/v)阻斷劑A溶液(MSD® ，#R93AA-1)中製備樣品且將表1中之固定最終濃度為5至50 pM之各所例示抗體添加至各樣品。包括僅抗體對照。將體積為50 µl之各蛋白質-抗體樣品添加至96孔微量滴定板(Greiner，EK-20101)之各個孔。用光學膠黏膜(Thermo Fisher Scientific，#4311971)密封板且在37℃下培養1至3天以允許樣品平衡。在分析前一天，使96孔MSD® 標準板(MSD® ，#L15XA)的各行塗佈濃度為1 µg/ml之含在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之30 µl對應IL-34 (如以滴定系列所使用)。在實驗當天，用150 µl PBST (PBS與0.05% Tween)洗滌MSD® 標準板三次且在室溫下在MaxQ 4450臺式振盪器(Thermo Fisher Scientific)上以300 rpm振盪下用150 µl 3%阻斷劑A溶液阻斷60分鐘。用PBST進行三次洗滌後，將50 µl的各蛋白質-抗體樣品(如以上所述製備且培養)添加至MSD® 標準板且在37℃下在以300 rpm振盪下培養150秒。用PBST進行三次洗滌後，將在1% (w/v)阻斷劑A溶液中製備的50 µl 1 µg/ml SULFO-TAG標記之檢測抗體添加至MSD® 標準板且在37℃下在以300 rpm振盪下培養板150秒。用PBST再洗滌板三次，接著添加150 µl/孔之1X讀取緩衝液(MSD® ，#R92TC-2)。使用MESO Quickplex SQ 120/1300儀器(Meso Scale Discovery)讀取MSD®標準板。使用GraphPad Prism 8 (針對Windows，8.0.0版，GraphPad Software，La Jolla California USA，www.graphpad.com)進行資料分析且使用GraphPad Prism 8的積分四參數邏輯曲線模型來測定結合親和力(KD )。結果提供於表2、3及4中。表 2 ：抗體 - 人類 IL-34 複合物 在 37℃ 下之 之結合親和力 (KD )
結合親和力， KD (pM ， 37℃ ，平均值 ± STDEV ， n = 5)
抗體 抗原 ( 成熟人類 IL-34)
所例示抗體1 59 ± 7
所例示抗體2 54 ± 7
所例示化合物D (hCSF1R-Fc) 56 ± 12
表 3 ：抗體 - 食蟹獼猴 IL-34 複合物在 37℃ 下之之結合親和力 (KD )
結合親和力， KD (pM ， 37℃ ，平均值 ± STDEV ， n = 5)
抗體 抗原 ( 食蟹獼猴 IL-34)
所例示抗體1 108 ± 25
所例示抗體2 152 ± 31
表 4 ：抗體 - 小鼠 IL34 複合物在 37℃ 下之之結合親和力 (KD )
結合親和力， KD (pM ， 37℃)
抗體 抗原 ( 小鼠 IL-34)
所例示抗體3 16
IL-34以約50至100 pM親和力結合至人類CSF1R，需要高親和力抗體以有效中和CNS中之此種細胞介素。咸信，阻斷IL-34為疾病改善提供有用手段，同時避免與一些現有免疫調節療法相關之安全性問題。因此，中和IL-34介導之信號傳導代表用於管理神經發炎、微神經膠質細胞增生及神經退化性疾病(諸如阿茲海默氏症及其他Tau蛋白病)及發炎疾病之治療方法。
表2、3及4中之結果顯示，抗體1、2及3對IL-34具有高親和力，且特定言之，抗體1及抗體2顯示與hCSF1R-Fc相當之對人類IL-34之親和力。因此，本發明之抗體具有使得其能有效夠活體內中和IL-34之結合性質。物化 性質 ：
關於治療性抗體產品性質，包括化學穩定性、光穩定性、3X緩慢冷凍/解凍、溶解性，抗體1展現用作人類治療劑之期望之物化性質組合。穩定性樣品製備
為了製備穩定性樣品，在4℃下將抗體水溶液透析至PBS、或10 mM組胺酸/280 mM甘露醇pH 6 (H6M)或10 mM組胺酸/150 mM NaCl pH 6 (H6N)或10 mM組胺酸/17%蔗糖pH 6.0 (H6S)中過夜。必要時，將聚山梨醇酯-80以0.05%添加至最終穩定性樣品(「T」)。使用Amicon旋轉濃縮器將調配的抗體1進一步濃縮至所需濃度。
縮寫：4wk = 4週；H6MT = 10 mM組胺酸/280 mM甘露醇/0.05%聚山梨醇酯，pH 6.0；H6ST = 10 mM組胺酸/17%蔗糖、0.05%聚山梨醇酯，pH 6.0。化學穩定性
以5 mg/ml含在PBS中之抗體1證實四週(4wk)化學穩定性熱點檢查之可接受評級。在35℃下在PBS中儲存四週後且與時間0對照相比，抗體1顯示0.26%聚集體生長，如藉由分析型尺寸排阻層析(aSEC)測得。藉由LC-MS(液相層析-質譜法)肽圖譜分析檢查熱點。與4wk/4℃樣品相比，在35℃下在PBS中報告以下降解/熱點變化：D104之異構化(0.1%)；G93/D94/S95之裂解(0.8%)。CDR降解之總變化為0.9%。高濃度穩定性溫度保持
以100 mg/ml含在H6MT中之抗體1證實4wk高濃度穩定性之可接受評級。在35℃下儲存4wk後且與時間0對照相比，存在1.0%聚集體生長，藉由aSEC測得，及在非還原條件下低分子量片段增加0.9%，藉由CE-SDS (毛細管電泳十二烷基硫酸鈉)測得。藉由LC-MS肽圖譜分析檢查熱點。在35℃下培養4wk後且與在5℃下培養4wk之對照相比，報告H6MT中以下降解/熱點之變化：Q91之脫醯胺化 (0.1%)；D104之異構化(0.1%)；G93/D94/S95之裂解(0.5%)。CDR降解之總變化為0.7%。溶解度
抗體1基於溶解度評估證實可接受評級。該抗體在H6M及H6N調配物中均達成150 mg/ml，在5℃下儲存3天接著在-5℃下儲存一週後沒有觀測到可見沉澱或相分離。光穩定性
抗體1證實可接受之光穩定性等級。將以100 mg/ml含在H6MT中之抗體暴露於UV/VIS光(20% ICH指南)且與黑暗對照樣品進行比較。化學降解藉由LC-MS肽圖分析進行評估。CDR熱點分析之總變化為0.1%。在輕鏈之殘基G93/D94/S95處觀測到裂解之生長為0.1%。在暴露於UV/VIS後，聚集體生長為3.6%，如藉由aSEC測定。高濃度緩慢冷凍 - 解凍穩定性
在緩慢冷凍-解凍中評估抗體1之物理穩定性且證實在H6ST中調配時可接受評級。在架子凍乾機(shelf lyophilizer) (VirTis SP Scientific)中進行3X緩慢冷凍-解凍循環後，與時間0對照相比，抗體1顯示H6ST中0.1%聚集體增加，藉由aSEC測定。實例 3 ：抗人類 IL-34 抗體之 活 體外功能表徵 活 體外 IL-34 之 中和
測試本發明之抗體中和IL-34結合及/或活性之能力。藉由本發明之抗體中和Il-34結合及/或活性可藉由一或多種IL-34/CSF1R受體結合檢定形式以及基於IL-34細胞之活性檢定來評估，例如，如以下所述。
IL-34/CSF1R結合之中和抗體之篩選可最初透過酶促檢定來進行。此類檢定可使用能夠結合至IL-34之重組表現之CSF1R胞外域蛋白。此等蛋白質可結合至ELISA板以便捕獲可溶性IL-34。可然後透過抗原之生物素化及經由鏈黴親和素/中性鏈黴親和素(neutravidin)結合之過氧化物酶或磷酸酶酵素之檢測來檢測IL-34。或者，可使用另一檢測技術，諸如檢測IL-34之經his標記形式之抗體。此類中和檢定涉及在添加至結合檢定(以及其中不涉及靶向IL-34之抗體之對照樣品)之前預培養正在用經標記之IL-34進行評估之抗體(例如1小時)。可使用接近50%結合水平(EC50 )之經標記之IL-34之濃度、以及變化之濃度(例如，在評估抗體諸如約100微莫耳降至約1皮莫耳之劑量反應中)。在一定範圍內所評估之抗體抑制允許測定效價(IC50 )。活 體外抑制 IL-34 誘導之反應
藉由本發明之抗體之IL-34活性的中和可藉由基於IL-34細胞之檢定中之一者或多者來評估，例如，如以下所述。可在NIH-3T3 hCSF1R AP1或293 hCSF1R SRE細胞中評估本發明之抗體中和人類IL-34誘導之螢光素酶報導子活性之能力，該等細胞經cDNA轉染以表現人類CSF1R、小鼠CSF1R或食蟹獼猴CSF1R (人類CSF1R (登錄號：NP_001275634.1)；小鼠CSF1R (登錄號：NM_001037859.2)及食蟹獼猴CSF1R (登錄號：NC_022277)。(術語食蟹獼猴「cyno/cynomolgus/ cynomolgus monkey」在本文中可互換使用。)例如，將穩定表現人類CSF1R (hCSF1R)之293/SRE細胞在0.05%胰蛋白酶-PBS中解離且以70,000個細胞/100 ml平板接種於經組織培養物處理之96孔板中。第二天，移除生長培養基，且用補充有熱滅活之1% FBS (胎牛血清)之DMEM-F12 (杜貝卡氏改良依格培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)：營養素混合物F-12)使細胞飢餓。飢餓24小時後，用100 ng/ml人類IL-34或食蟹獼猴IL-34及多種濃度之hCSF1R-Fc或抗體1處理細胞6小時。培養後，在輕輕攪拌下用50 μl PromegaTM GloTM 裂解緩衝液(PromegaTM E266A)裂解細胞5分鐘。添加50 ml BrightGloTM 發光試劑(PromegaTM E2620)且在經裂解之細胞上培養2分鐘。在Perkin Elmer Wallac 1420 Victor2TM 微板讀取器上讀取發光。顯示於表5及圖1中之相對螢光單位(RFU)之減小反映抗體1中和IL-34及降低螢光素酶活性之能力。抗體1之半數最大抑制濃度(IC50 )值對於hIL-34之中和為385 pM (圖1)，及對於食蟹獼猴IL-34為654 pM。在此檢定中人類CSF1R-Fc用作陽性對照且以560 pM之IC50 抑制螢光素酶活性。
表 5 ：表現 hCSF1R 之 293 SRE 細胞中人類 IL-34 誘導之螢光素酶報導子活性之抗體 1 中和。
hCSF1R-Fc 抗體 1
濃度 [nM] 平均 RFU 標準偏差 平均 RFU 標準偏差
133 1216 93.3 1180 18.4
26.6 995 153.4 1047.5 202.9
5.32 962 33.2 1117.5 38.9
1.064 2209 292.7 1494 70.7
0.213 7342.5 1282.0 7157.5 557.9
0.043 8472.5 727.6 7993 229.1
0.009 8185 459.6 8377.5 463.2
0.002 8253 365.6 8200.5 526.8
IC50 [nM] 95% CI [nM] IC50 [nM] 95% CI [nM]
0.5598 0.4047至0.7743 0.3852 0.3364至0.4412
表5及圖1顯示在以上基於293 hCSF1R細胞之檢定中抗體1可有效中和人類IL-34誘導之螢光素酶報導子活性(IC50 0.3852 nM)，且於此檢定中證實與hCSF1R-Fc至少相當或更佳之效價。此等資料支持抗體1中和人類IL-34介導之信號傳導且治療其中IL-34介導之信號傳導貢獻於發病機理之疾病之能力。PathHunter® eXpress 二聚化 檢 定中抗體 1 中和 CSF1R 之二聚化之能力：
可藉由將U2OS CSF1R/CSF1R細胞(Path Hunter ® eXpress二聚化檢定，DiscoverX)平板接種於96孔板中以評估抗IL-34抗體抑制CSF1R之二聚化之能力來進一步評估人類IL-34中和。此等檢定利用酵素片段互補(EFC)技術，其中b-半乳糖苷酶(b-gal)酵素分為兩個片段ProLink (PK)及酵素受體(EA)。獨立地，此等片段不具有b-gal活性；然而，當透過蛋白質-蛋白質相互作用迫使互補時，其形成活性b-gal酵素。PathHunter ® eXpress二聚化檢定檢測CSF1R受體-二聚體對之兩個次單元之配位體誘導之二聚化。該等細胞已經工程改造以共同表現一個融合至酵素供體(ED)之CSF1R受體次單元及融合至酵素受體(EA)之第二CSF1R二聚體搭配物。使人類IL-34結合至一個受體次單元會誘導其與其二聚體搭配物相互作用，迫使兩個酵素片段互補。此導致形成功能酵素，該功能酵素水解受質以產生化學發光信號。顯示於表6及/或圖2中之相對螢光單位(RFU)之減小反映抗體1中和人類IL-34及減少化學發光之能力。抗體1之半數最大抑制濃度(IC50 )值為226 pM。在此檢定中人類CSF1R-Fc用作陽性對照且以353 pM之IC50 抑制螢光素酶活性。表6及圖2中之資料支持在此檢定中抗體1阻斷人類IL-34與CSF1R之相互作用之能力，藉此抑制CSF1R之二聚化。此類資料支持使用本發明之抗體以中和人類IL-34。
表 6 ： PathHunter® eXpress 二聚化檢定中抗體 1 中和 CSF1R 之二聚化之能力。
hCSF1R-Fc 抗體 1
濃度 [nM] 平均 RFU Stdev 濃度 [nM] 平均 RFU Stdev
0.012 99405 5235.4 0.014 96495.5 3039.8
0.037 99090 1195.0 0.043 94760 1656.0
0.112 85642.5 832.3 0.128 81315.5 4488.0
0.335 68380 427.1 0.384 44394 91.9
1.004 40124 2375.9 1.151 29459.5 9280.7
3.011 29109 2643.2 3.453 27611.5 5296.9
9.033 26071.5 1119.4 10.360 28085.5 1103.8
27.100 34622.5 10704.9 31.080 27261 916.4
81.301 27529.5 3655.0 93.240 28438 1299.7
243.902 32958 973.0 279.720 29827 319.6
IC50 [nM] 95% CI [nM] IC50 [nM] 95% CI [nM]
0.3525 0.2595至0.4629 0.2256 0.1936至0.2630
抗 IL-34 抗體 抑制 NIH-3T3/CSF1R 細胞中 ERK 磷酸化之能力。
或者，可藉由將NIH-3T3/CSF1R細胞平板接種於96孔板中以評估抗IL-34抗體抑制胞外信號調節激酶(ERK)磷酸化之能力來測定IL-34中和。在此種檢定中，在第1天將細胞平板接種於補充10% FBS之DMEM中且在37℃下培養過夜。在第2天，移除培養基，將細胞在無血清DMEM中洗滌且在無血清DMEM中再培養一段24小時時段。在第三天，移除培養基且在存在或不存在抗IL-34抗體下將1 µg/ml IL-34添加至該等細胞5分鐘。藉由全細胞裂解物套組(Meso Scale Discovery，目錄號K15107D-3)評估磷酸化/總ERK1/2。顯示於表7及/或圖3中之相對螢光單位(RFU)之減小反映抗體3中和IL-34及減少化學發光之能力。抗體3之半數最大抑制濃度(IC50 )值為16 nM。在此檢定中人類CSF1R-Fc用作陽性對照且以63 nM之IC50 抑制螢光素酶活性。
表 7 ：抗體 3 抑制 NIH-3T3/CSF1R 細胞中 ERK 磷酸化之能力。
  CSF1R 抗體 3
  濃度 (nM) RFU Stdev 濃度 (nM) RFU Stdev
  0 0.20982427 0.00490388 0 0.20982427 0.00490388
  0.19 0.22678655 0.00463113 0.21 0.21266665 0.01065081
  1 0.22612366 0.00094345 1.067 0.21877016 0.01222609
  4.87 0.1696282 0.01027709 5.33 0.16963485 0.01577903
  24.37 0.13803397 0.01444251 26.27 0.11909114 0.00324742
  121.84 0.08925054 0.0052968 133.33 0.07254438 0.00527854
  609.19 0.03167946 0.00344925 666.67 0.05997649 0.01118308
  IC50 (nM) 63.2 IC50 (nM) 15.7
抗 IL34 抗體抑制人類單核細胞中 IL-34 誘導之 CD163 表現之能力，藉由流動式細胞測量術 測得 ：
亦可藉由流動式細胞測量術測量人類單核細胞在用IL-34處理後細胞表面抗原CD163之表現來評估IL-34中和(參見例如Boulakirba, S.等人， IL-34 and CSF-1 display an equivalent macrophage differentiation ability but a different polarization potential .Sci Rep 8 ， 256 (2018)。用IL-34處理CD14陽性單核細胞72小時且在用針對CD163之抗體染色後藉由流動式細胞測量術評估CD163表現。在描述於圖4中之實驗中，表現CD163之細胞數量右移指示IL-34處理增加單核細胞中此種抗原之表現。藉由添加抗體3來抑制CD163表現之增加。在此實驗中，將同型匹配之IgG4抗體用作陰性對照。
響應於IL-34，藉由抗體3抑制人類單核細胞中CD163表現，證實本發明之抗體調節單核細胞/巨噬細胞數目及/或對IL-34之表型分化反應之能力，且支持使用本發明抗體以治療免疫介導之疾病，諸如神經發炎及其他發炎病狀(參見例如Lelios, I.等人，Emerging roles of IL-34 in health and disease ，J Exp Med (2020) 217 (3): e20190290)。實例 4 ：抗IL-34 抗體之活體內功能表徵 抗體 3 減少小鼠之背側皮層及海馬體中微神經膠質細胞數目之能力
使用小鼠模型檢查本發明之抗IL-34抗體減少微神經膠質細胞數目之能力。簡言之，對FBV雌性小鼠(Envigo，6至8週齡)投與50 mg/kg皮下劑量之抗體3、或同型匹配之IgG對照抗體。在抗體投與後的不同時間(第1、3、7及14天)，用CO2 使動物安樂死且用鹽水灌注腦。灌注後，收集腦組織，在顯微鏡下切下背側皮層及海馬體且在液氮中快速冷凍。自背側皮層及海馬體製備mRNA且用於藉由TaqMan評估抗IL34抗體或對照抗體處理對於微神經膠質細胞標誌物Iba-1及CD11b之表現之影響。將mRNA表現之改變相對於內部GAPDH mRNA對照標準化且呈現為倍數變化。將Iba-1及CD11b mRNA之表現例行用作微神經膠質細胞數目之替代標誌物，及此等標誌物之表現之降低通常被認為反映腦微神經膠質細胞之減少。亦在投與抗體3後評估針對IL-34之受體兩者(CSF1R及PTP ζ)及兩種CSF1R配位體(IL-34及CSF-1)之mRNA之表現。結果提供於表8中(A海馬體及B-皮層)：表 8 ：抗體 3 對 於微神經膠質細胞標誌物之 mRNA 表現之影響
8A 海馬體
1 天 3 天 7 天 14 天  
倍數 SEM 倍數 SEM 倍數 SEM 倍數 SEM  
Iba1 1.16 0.15 0.91 0.06 0.50 0.02 0.74 0.04  
CD11b 0.85 0.06 0.49 0.03 0.74 0.03 0.64 0.04  
CSF-1R 1.01 0.06 0.78 0.04 0.52 0.02 0.79 0.04  
PTPRz 1.01 0.00 0.98 0.00 1.00 0.00 1.00 0.00  
CSF-1 1.01 0.03 0.79 0.05 1.11 0.05 1.03 0.05  
IL-34 1.01 0.00 0.99 0.00 0.99 0.00 0.98 0.00  
  8B 皮層
1 天 3 天 7 天 14 天  
倍數 SEM 倍數 SEM 倍數 SEM 倍數 SEM  
Iba1 1.09 0.06 0.67 0.04 0.82 0.03 0.88 0.04  
CD11b 0.99 0.08 0.69 0.05 0.59 0.02 0.70 0.06  
CSF1R 0.97 0.02 0.59 0.03 0.79 0.02 0.80 0.03  
PTPRz 1.01 0.00 0.98 0.00 1.00 0.00 1.00 0.00  
CSF1 1.22 0.10 1.02 0.06 0.69 0.04 0.90 0.07  
IL34 1.01 0.00 0.99 0.00 0.99 0.00 0.98 0.00  
在小鼠阿茲海默氏症模型 (Tg4510 小鼠 ) 中抗體 3 減少微神經膠質細胞數目之能力：
亦檢查本發明之抗IL-34抗體減少小鼠阿茲海默氏症模型(Tg4510小鼠)中微神經膠質細胞數目之能力。Tg4510小鼠係Tau蛋白病模型，其特徵係前腦中人類Tau之P301L突變體形式之過度表現。此等小鼠用於研究神經纖維纏結之形成作為阿茲海默氏症、神經退化性Tau蛋白病及額顳葉癡呆之模型，且其展現與認知受損相關之神經性病變之年齡依賴性及區域特異性進展。簡言之，連續9週對8週齡的雌性Tg4510小鼠投與5、15及50 mg/kg每兩週劑量之抗IL-34抗體或同種匹配之IgG對照。給藥期結束時，使動物安樂死且用PBS灌注。灌注後，收集腦組織且經由正中矢狀截面(midsagittal section)將兩個海馬體分離且與各半球分開，在顯微鏡下切下背部皮層及海馬體且在液氮中快速冷凍。為了評估抗IL-34抗體對於微神經膠質細胞標誌物之表現之影響，自海馬體製備mRNA，且藉由即時PCR分析針對海馬體之CD11b、Iba-1及CSF1R之表現，如表9中所顯示。表 9 ：藉由即時 PCR 分析 的 抗體 3 對 於微神經膠質細胞標誌物 ( 來自海馬體之 mRNA ， CD11b 、 Iba-1 及 CSF1R) 之表現之影響
           
CD11b Iba1 CSF1R
倍數 SEM 倍數 SEM 倍數 SEM
對照 1.00 0.03 1.00 0.07 1.00 0.07
抗體 3 ， 5mpk 0.87 0.02 0.89 0.04 0.76 0.03
抗體 3 ， 15mpk 0.61 0.02 0.78 0.03 0.63 0.03
抗體 3 ， 50mpk 0.36 0.01 0.65 0.02 0.45 0.02
抗 IL34 抗體減少 Tg4510 小鼠中磷酸化 Tau 之能力：
為了評估抗IL-34抗體是否可降低磷酸化-Tau (與阿茲海默氏症相關聯之Tau之病理形式中之一者)，自經抗IL-34抗體或IgG對照抗體處理之動物之皮層製備蛋白裂解物。簡言之，將抗磷酸化Tau抗體(AT8)用於塗佈96孔板之孔且在4℃下培養24小時。第二天，用0.05% Tween/PBS洗滌板，用SynBlockTM 緩衝液(ImmunoChemistry Technology)阻斷且在4℃下與皮層裂解物培養24小時，接著添加生物素化Tau檢測抗體(CP27)及鏈黴親和素-辣根過氧化物結合物。如表9中所示，抗IL-34抗體治療降低Tg4510小鼠皮層中之磷酸化Tau。表 9 ： FDT248 ： AT8 Tau ELISA P1 皮層 (μg/mg 蛋白質 )
   mIgG1對照 50 mg/kg 抗體3， 50 mg/kg 抗體3， 15 mg/kg 抗體3， 5 mg/kg
值的數 18 17 18 18
平均值 997.4 492.6 531.1 890.8
標準偏差 645.4 281.7 604.1 539.5
平均值標準誤差 152.1 68.3 142.4 127.2
自對照之變化百分比    -51% -17% -11%
胺基酸及核苷酸序列之清單 抗體 1 之輕鏈 (SEQ ID NO: 1)
Figure 02_image005
抗體 1 之輕鏈；抗體 2 之 LC (SEQ ID NO: 2)
Figure 02_image007
抗體 1 之 HCVR (SEQ ID NO: 3)
Figure 02_image009
抗體 1 之 LCVR ；抗體 2 之 LCVR (SEQ ID NO: 4)
Figure 02_image011
抗體 1 之 HCDR1 (SEQ ID NO: 5) AASGFTFSSYATS抗體 1 之 HCDR2 (SEQ ID NO: 6) AISHSGRSTYYADSVKG抗體 1 之 HCDR3 (SEQ ID NO: 7) ARGRSSLDT抗體 1 及抗體 2 之 LCDR1 (SEQ ID NO: 8) RASQSISSAYLA抗體 1 及抗體 2 之 LCDR2 (SEQ ID NO: 9) YASSIRPT抗體 1 及抗體 2 之 LCDR3 (SEQ ID NO: 10) SQYGDSLS編碼抗體 1 之重鏈之 DNA (SEQ ID NO: 11)
Figure 02_image013
編碼抗體 1 之輕鏈之 DNA (SEQ ID NO: 12)
Figure 02_image015
抗體 2 之重鏈 (SEQ ID NO:13)
Figure 02_image017
Figure 02_image019
抗體 2 之 HCVR (SEQ ID NO: 14)
Figure 02_image021
抗體 2 之 HCDR1 (SEQ ID NO: 15) AASGFTFFSYAHS抗體 2 之 HCDR2 (SEQ ID NO: 16) AISHSGRSTYYADAVKG抗體 2 之 HCDR3 (SEQ ID NO: 17) ARGRSSLDT編碼抗體 2 之重鏈之 DNA ( SEQ ID NO: 18)
Figure 02_image023
抗體 3 之重鏈 (SEQ ID NO: 19)
Figure 02_image025
Figure 02_image027
抗體 3 之輕鏈 (SEQ ID NO: 20)
Figure 02_image029
抗體 3 之 HCVR (SEQ ID NO: 21)
Figure 02_image031
抗體 3 之 LCVR (SEQ ID NO:22)
Figure 02_image033
抗體 3 之 HCDR1 (SEQ ID NO: 23) AASGFTFSYYAMS抗體 3 之 HCDR2 (SEQ ID NO: 24) AISHRGGSTLYADSVKG抗體 3 之 HCDR3 (SEQ ID NO: 25) ARGRSSLDG抗體 3 之 LCDR1 (SEQ ID NO: 26) RASTSVSSAYLA抗體 3 之 LCDR2 (SEQ ID NO: 27) YASSHRPL抗體 3 之 LCDR3 (SEQ ID NO: 28) QQYGDSLS編碼抗體 3 之重鏈之 DNA (SEQ ID NO: 29)
Figure 02_image035
編碼抗體 3 之輕鏈之 DNA (SEQ ID NO: 30)
Figure 02_image037
人類 IL-34 (SEQ ID NO: 41)
Figure 02_image039
鼠類 IL-34 (SEQ ID NO: 42)
Figure 02_image041
IgG4PAA 鉸鏈區 (SEQ ID NO: 51) ESKYGPPCPPCPIgG4PAA Fc 區 (SEQ ID NO: 52)
Figure 02_image043
圖 1 顯示表現hCSF1R之293 SRE細胞中人類IL-34誘導之螢光素酶報導子活性之抗體1中和。
圖 2 顯示PathHunter eXpress二聚化檢定中抗體1中和CSF1R之二聚化之能力。
圖 3 顯示抗體1抑制NIH-3T3/CSF1R細胞中ERK磷酸化之能力。
圖 4 顯示藉由流動式細胞測量術測得之抗IL34抗體抑制人類單核細胞中IL-34誘導之CD163之表現之能力。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030

Claims (27)

  1. 一種結合人類IL-34之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區(HCDR) HCDR1、HCDR2及HCDR3，及該VL包含輕鏈互補決定區(LCDR) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中 該HCDR1包含SEQ ID NO: 5， 該HCDR2包含SEQ ID NO: 6， 該HCDR3包含SEQ ID NO: 7， 該LCDR1包含SEQ ID NO: 8， 該LCDR2包含SEQ ID NO: 9，及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 10。
  2. 如請求項1之抗體，其中該VH包含SEQ ID NO: 3及該VL包含SEQ ID NO: 4。
  3. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含包含SEQ ID NO: 1之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO: 2之輕鏈(LC)。
  4. 一種結合人類IL-34之抗體，其包含VH及VL，其中該VH包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，及該VL包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中 該HCDR1包含SEQ ID NO: 15， 該HCDR2包含SEQ ID NO: 16， 該HCDR3包含SEQ ID NO: 17， 該LCDR1包含SEQ ID NO: 8， 該LCDR2包含SEQ ID NO: 9，及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 10。
  5. 如請求項4之抗體，其中該VH包含SEQ ID NO: 14及該VL包含SEQ ID NO: 4。
  6. 如請求項4或5之抗體，其中該抗體包含包含SEQ ID NO: 13之HC及包含SEQ ID NO: 2之LC。
  7. 一種結合鼠類IL-34之抗體，其中該抗體包含VH及VL，其中該VH包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，及該VL包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中 該HCDR1包含SEQ ID NO: 23， 該HCDR2包含SEQ ID NO: 24， 該HCDR3包含SEQ ID NO: 25， 該LCDR1包含SEQ ID NO: 26， 該LCDR2包含SEQ ID NO: 27，及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 28。
  8. 如請求項7之抗體，其中該VH包含SEQ ID NO: 21及該VL包含SEQ ID NO: 22。
  9. 如請求項7或8之抗體，其中該抗體包含包含SEQ ID NO: 19之HC及包含SEQ ID NO: 20之LC。
  10. 一種核酸，其包含編碼選自由以下組成之群中之一者或多者之SEQ ID NO之序列：11、12、18、29及30。
  11. 一種載體，其包含如請求項10之核酸。
  12. 如請求項11之載體，其中該載體包含編碼SEQ ID NO: 11或18之第一核酸序列、及編碼SEQ ID NO: 12之第二核酸序列。
  13. 如請求項11之載體，其中該載體包含編碼SEQ ID NO: 29之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO: 30之第二核酸序列。
  14. 一種包含第一載體及第二載體之組合物，該第一載體包含編碼SEQ ID NO: 11或18之核酸序列及該第二載體包含編碼SEQ ID NO: 12之核酸序列。
  15. 一種包含第一載體及第二載體之組合物，該第一載體包含編碼SEQ ID NO: 29之核酸序列及該第二載體包含編碼SEQ ID NO: 30之核酸序列。
  16. 一種細胞，其包含如請求項12或13之載體。
  17. 一種包含第一載體及第二載體之細胞，該第一載體包含編碼SEQ ID NO: 11或18之核酸序列及該第二載體包含編碼SEQ ID NO: 12之核酸序列。
  18. 一種包含第一載體及第二載體之細胞，該第一載體包含編碼SEQ ID NO: 29之核酸序列及該第二載體包含編碼SEQ ID NO: 30之核酸序列。
  19. 如請求項16至18中任一項之細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。
  20. 一種產生抗體之方法，該方法包括在使得該抗體得以表現之條件下培養如請求項16至19中任一項之細胞且自該培養基中回收所表現之抗體。
  21. 一種抗體，其係藉由如請求項20之方法產生。
  22. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至9及21中任一項之抗體及醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
  23. 一種如請求項1至9及21中任一項之抗體或如請求項22之醫藥組合物之用途，其於製造用於治療免疫介導之疾病之藥物。
  24. 如請求項23之用途，其中該免疫介導之疾病係選自由以下組成之群：阿茲海默氏症(Alzheimer’s Disease)；Tau蛋白病(tauopathy disease)；休格倫氏症候群(Sjogren’s syndrome) (SS)；類風濕性關節炎(RA)；發炎性腸病(IBD)、異位性皮膚炎、腎臟疾病、敗血症及/或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
  25. 如請求項23之用途，其中該免疫介導之疾病為阿茲海默氏症。
  26. 一種測定體液中人類IL-34含量之方法，該方法包括： (a)使體液與特異性結合至由SEQ ID NO: 41所示之胺基酸序列組成之人類IL-34的抗人類IL-34診斷單株抗體或其抗原結合片段接觸，該抗體或其抗原結合片段包含：輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別包含胺基酸序列(SEQ ID NO: 8)、(SEQ ID NO: 9)及(SEQ ID NO: 10)、及重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別包含胺基酸序列(SEQ ID NO: 15)、(SEQ ID NO: 16)及(SEQ ID NO: 17)； (b)視需要，移除任何非特異性結合之單株抗體或其抗原結合片段；及 (c)檢測及/或定量特異性結合至人類IL-34的單株抗體或其抗原結合片段之量。
  27. 如請求項26之方法，其中該體液為血液、血清或血漿或腦脊髓液，且該接觸離體發生。
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