TW201004973A - Process for preparing nanoparticles of chitosan in water phase - Google Patents

Description

201004973 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於幾丁聚醣奈米顆粒的製造，尤指一種於水 相中製備幾丁聚醣奈米顆粒之方法。 【先前技術】 奈米技術於現今醫藥領域的應用，著重於醫學預防、診 斷、藥物輸送及疾病治療之相關研究。奈米顆粒可作為藥 物輸送系統之載體，具備諸多優點，例如提高藥物在腸胃 藝道之穩定性，改善口服藥物之吸收性及生物可利用率，減 少藥物之使用劑量，因而降低使用高劑量藥物而產生之副 作用，以及專一性地投藥。然而，基於生物使用之安全性 考置，諸如材料來源及所使用之試劑等因素往往限制奈米 顆粒之應用範圍。 幾丁聚醣是目前公認安全性極高（LDw > 4 g/kg)之藥物 載體《幾丁聚醣通常係製成微球體。例如，CN16989〇〇揭 示一種殼聚糖載藥微球之製備方法，其特徵在於將親水性 ❿ 藥物溶於殼聚糖的醋酸-醋酸鈉緩衝溶液中，將水相用壓 力通過微孔膜麼入油相中’得到尺寸均一的乳滴，然後用 ， 二步驟固化法對乳滴進行交聯固化。前述「二步驟固化 法」係指使用離子型膠凝劑（例如三磷酸鹽（τρρ乃使殼聚糖 發生分子鏈聚集成團’然後利用化學交聯劑使其交聯固 化。此一方法並無法製得奈米級之幾丁聚醣顆粒。 由於幾丁聚醣與相鄰分子以及諸如乳酸等有機酸之間會 產生強的氫鍵，故難以溶解於水中。故幾丁聚醣於水相中

123744.DOC 201004973 之溶解度即為影響其應用範圍能否擴大之一項重要因素。 已知可於特定反應條件下及於有機相中，使幾丁聚醣與酸 酐進行醯基化作用，產生具有不同去醯基化程度的幾丁聚 醣，藉此控制幾丁聚醣之水溶性。此外，技藝人士亦建議 製備幾丁聚醣之奈米顆粒。 US 2005/〇226938 A1揭示一種由幾丁聚醣製備經交聯的 ^ 核心以及核-殼型奈米顆粒聚合物之方法，該方法係使幾 丁聚糖與至少一種其上具有至少兩個羧酸基之羧酸反應， _ 較佳係使用碳二醯亞胺（carb〇diimide)作為反應活化劑。 US 2006/0013885 A1揭示一種用於輸送抗癌藥物之水溶 性幾丁聚醣奈米顆粒以及其製備方法，該方法係使幾丁聚 醣分子與甲基聚（乙二醇）對-氮基苯基碳酸酯鏈接，成為兩 性分子鏈，進而自組裝形成幾丁聚醣奈米顆粒。 JP 2006241321揭示一種製備幾丁聚醣奈米顆粒之方 法，該方法包含將幾丁聚糖溶解於一水性酸溶液中，以獲 得幾丁聚醣之水性酸溶液，並且將此幾丁聚醣之水性酸溶 ® 液加到一鹼性水溶液中，例如，3N之氫氧化鈉水溶液。 CN1686560揭示一種殼聚糖季銨鹽奈米粒子之製備方 ^ 法，其係藉由使殼聚糖和環氧丙烷-三甲基·氯化胺反應以 製備殼聚糖季銨鹽，然後將此殼聚糖季銨鹽、欲包埋之藥 物以及三聚磷酸鈉混合並予交聯，而獲得殼聚糖季銨鹽奈 米粒子。 US 4,996,307揭示一種水溶性乙醯化幾丁聚醣之製備方 法，該方法包括將呈任意共聚物形式且具有至少7〇%去乙

123744.DOC 201004973 。程度之水溶性幾丁聚醣溶解於一水性酸溶液中，以水 或者例如甲醇之水可混溶性溶劑稀釋該溶液，然後添加例 酸酐之乙醯化劑至該溶液中’以產生乙醢化反應。根據 專利之實施例’進行上述乙醯化反應時，係添加甲醇、 . 乙醇或異丙醇等有機溶劑作為有機相。 ^ JP 2000256403揭示一種部分乙醯化幾丁聚醣顆粒之製 備方法，該方法包括將幾丁聚醣溶解於一種水性酸溶液 中’將此溶液分散於一種造粒用溶劑中，擾拌前述分散相 ® :吏之形成顆粒。此外，經由在甲苯或異丙醇之有機相中進 行乙醯化作帛，形I經乙酿化之幾丁聚糖，加人驗並且加 熱，使所得產物部分乙醯化，最後藉由交聯作用使產物安 定。 JP 62079201揭示一種多孔性圓粒狀^^乙醯化幾丁聚醣 之製備方法，該方法包括將低分子量之幾丁聚醣溶解於水 f生酸,谷液中，將此溶液滴入一種驗性溶液中，使幾丁聚醣 :谷液產生凝集作用，進而形成該多孔性圓粒狀N_乙醢化幾 參 了聚醣。前述乙酿化作用係在例如甲醇或苯等有機相中進 行。 CN 1367183揭示一種類玻尿酸幾丁聚醣之製備方法，該 方法包括使幾丁聚醣進行乙醯化作用，然後進行選擇性氧 化作用’以獲得具有類似玻尿酸之結構之幾丁聚醣。前述 乙醯化作用係在例如甲醇之有機相中進行。 此外，ShigehiroHirano 及 RyujiYamaguchi 於 1976 年發表 於BIOPOLYMERS第15版第1685至1691頁中、標題為「N_

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Acetylation Gel: A Polyhydrate of Chitin」之文獻（以下稱 「1976年文獻」）中，比較了幾丁聚醣醋酸溶液分別在甲 醇相及水相中進行乙醯化作用所產生凝膠之間的差異。此 1976年文獻主要在探討幾丁聚醣經過乙醯化後所產生的膠 化現象，並且進一步探討所形成的膠體之基本物理性質， 例如可溶解於何種溶劑中及相關溶解度為何。然此1976年 文獻僅敎示在水相中添加一定量的醋酸酐可以使得幾丁聚 醣由於乙醯化作用而呈水膠化，其所產生之膠體顆粒往往 過大，甚至凝集成團。此1976年文獻之操作條件無法製得 幾丁聚醣奈米顆粒。 另外的相關文獻尚包括Dong-Won Lee等人於2004年發表 於” Carbohydrate Polymers, 58(2004)"中、標題為 「Physicochemical properties and blood compatibility of acylated chitosan nanoparticles」 之文獻，以及，A. Portero 等人於 2002 年發表於 凡St/Z^TYCW， 19(2002)"中、標題為「Reacetylated chitosan microspheres for controlled delivery of anti-microbial agents to the gastric mucosa」之文獻。其全文併入本專利案之說明書中 以供參考。 上述已知幾丁聚醣顆粒之製備方法分別具有一或多種以 下缺點：（1)未能製得奈米級幾丁聚醣顆粒，（2)涉及繁複 的化學修飾步驟，耗時又耗費人力，（3)製造過程中使用之 有機溶劑會殘留於所製得之幾丁聚醣顆粒中，是以，即使 能夠製得奈米級幾丁聚醣顆粒，其於醫療應用之安全性仍

123744.DOC 201004973 堪慮》 目前仍需要-種能夠製備具有良好生物相容性又符合醫 療應用之安全性考量的奈米級幾丁聚醣顆粒之方法。 【發明内容】 . 广發明提供-種滿足上述需求之奈米級幾丁聚醣顆粒之 、 製備方法，其係在水相中進行幾丁聚醣溶液之化學性修 飾，使幾丁聚醣分子鏈成為兩性分子鏈，進而於物理性分 散力之作用下自組裝成為幾丁聚醣奈米顆粒。本發明係在 ❹ 幾丁聚醣經由乙醯化修飾而產生膠體之過程中，透過控制 幾丁聚醣及醋酸酐之濃度，並藉由物理性分散獲得奈米級 之幾丁聚醣顆粒，可避免如同前述1976年文獻般產生大團 塊膠體。 特言之，本發明提供一種於水相中製備幾丁聚醣奈米顆 粒之方法’其包含以下步驟： (a) &供滚度為約〇.〇5 w/v%至約1 w/v%之幾丁聚糖溶液， (b) 將水及無水醋酸酐依序加入該幾丁聚醣溶液中，以進 參 行乙醯化作用，其中，基於整體溶液之體積，該醋酸 軒之濃度為約10 v/v%至約30 v/v%，及 (c) 使步驟（b)之溶液進行物理性分散。 於步驟（a)中所使用之幾丁聚醣係指胺_2_去 氧葡萄哌喃糖，通常具有1〇1〇〇〇 kDa之分子量，以及 介於70%至90%間之去乙醯化程度。幾丁聚醣可由任何已 知來源獲得，包括但不限於軟體動物（例如烏賊），昆蟲外 殼’藻類’甲殼類動物及真菌。甲殼類動物幾丁聚醣較佳

123744.DOC •10- 201004973 為蝦或蟹殼幾丁聚醣，真g幾丁聚醣較佳為心办 似似&幾丁聚醣。根據本發明之幾丁聚醣溶液係指將 幾丁聚醣溶解於溶劑後所形成之溶液，其中該溶劑可為任 何已知可用於溶解幾丁聚醣之溶劑，其包括但不限於醋酸 水溶液，甲酸，丙酸，蘋果酸，琥珀酸及乳酸，其中較佳 為約1 v/v%之醋酸水溶液；且幾丁聚醣溶液之濃度較佳為 * 約 0.05 w/v% 至約 0.6 ，更佳為約（M w/v% 至約 0.3 w/v%。 _ 於步驟（b)中所使用之無水醋酸酐可由商業行為中購 得。基於整體溶液之體積，該醋酸酐之濃度為約10 v/v% 至約30 V/V%，較佳為約12.5 v/v%至約25 v/v%，更佳為約 17.5 v/v°/〇至約 25 v/v0/〇。 本發明中之乙醯化作用係指將幾丁聚醣之胺基與醋酸酐 之叛基形成乙醯基之反應，其可於任何此技藝已知之適當 溫度下進行。 於步驟（c)中所述之物理性分散係指以物理方式使溶液分 ® 子產生分散作用之處理，其可使用任何此技藝已知之方式 進行’其包括但不限於以振盪器（Shaker)、液體喷灑器 k (Spray Sparger)、機械式攪拌及超音波震盪處理。如利用 攪拌方式進行物理性分散時，可將磁石加入該來自步驟（b) 之溶液中，並且以適當攪拌速率攪拌一段超過約24小時之 時間。攪拌速率取決於所反應的溶液體積大小，其可為例 如約150 rpm至約1500 rpm，較佳係約175 rpm至約1300 rpm。如利用超音波震盪進行物理性分散時’根據本發明 123744.DOC -11- 201004973 之一項較佳實施態樣，係利用相立；#' τ巧用超音波振盪器（sonic &

Materials Inc. Mode ： VC n4 n ，Power : 130 w，Vol : 115V ’ 50/60 Hz)於下列條件下、仓y_ _ a 末仵下進行：震盪時間為約5分 鐘’脈衝間距為約4秒，且於震湯办思仏a b ^展盈凡畢後立即將溶液移入 冰浴中。

步驟⑷之物理性分散可心何此技藝已知之適當溫度下 進行’例如約紙至約4Gt，制機械式㈣（如磁石挽 拌）進行物理性分散，較佳係於約3rc下進行，如利用超 音波震盪進行物理性分散，較佳係於室溫下進行。 根據本發明方法獲得之幾丁聚聽奈米顆粒可具有約1〇〇 rnn至約500 nm之平均粒徑，較佳係約1〇〇細至約_ nm，最佳係約10〇 nm至約200 nm。 本發明方法可於溫和條件下獲得幾丁㈣奈米顆粒而 無須使用有機溶劑或者繁複的化學性修飾步驟，其操作方 式相當簡|。由於本發明方法全㈣水相巾輯，、故可避 ΗϋΤ聚㈣粒中有機㈣殘留之問題。根據本發明 方法獲得之幾丁聚糖奈米顆粒更符合醫療應用之安全性考 量，並且具有良好生物相容性。 【實施方式】 以下實施例係用於對本發明作進一步說明，惟非用以限 制本發明之範圍。任何本發明所屬技術領域具有通常知識 者可輕易達成之修飾及改變均包括於本案說明書揭示内容 及所附申請專利範圍之内。 實施例1幾丁聚醣奈米顆粒之製備（磁石攪拌）

123744.DOC -12- 201004973 (i)使用由不同來源獲得並且具有不同平均分子量之幾丁 聚醣 分別將秤重好的0.2 g之獲自蝦蟹殼（購自於台灣世展公 司（Shin Era Technology Co·，Ltd))和真菌（購自財團法人食 品工業發展研究所之菌株）並且具 有不同分子量之幾丁聚醣，加入預先配製之1 v/v%醋酸水 溶液中，以使其溶解，然後將其定量至100 mL，並且取10 mL上述幾丁聚醣溶液進行後續反應。在該10 mL幾丁聚醣 P 溶液中，先加入5 mL Milli Q純水，再加入5 mL 100%無水 醋酸酐（即純水：無水醋酸酐之體積比=1:1)，以進行乙醯 化作用。此反應中，總反應溶液體積為20 mL，基於該整 體反應溶液之體積，該醋酸酐之濃度為25 v/v°/〇。將磁石 加入上述溶液中，於37°C下，以1300 rpm之攪拌速率攪拌 一段超過24小時之時間後，獲得幾丁聚醣奈米顆粒之水溶 液。以奈米粒徑儀分析其中之幾丁聚醣奈米顆粒，結果如 表1所示，其平均粒徑範圍為195〜326 nm。 ❹ 表1 幾丁聚醣來源 平均分子量（kDa) 平均粒徑（nm) CC 68 68 233 CC 72 72 243 CC 95 95 247 FC 24 24 195 FC 190 190 299 FC 340 340 326 註：CC代表獲自蝦蟹殼之幾丁聚醣，FC代表獲自真菌之 幾丁聚醣，數字部分代表平均分子量（kDa) 123744.DOC -13- 201004973 (π)使用不同的幾丁聚醣濃度及醋酸酐濃度 中心混成設計（Central Composite Design(cCD))實驗之 實驗條件是根據Design-Expert 6_0.2軟體設計。首先，依 據此軟體所給的實驗條件以小容器進行搖瓶試驗（shaker test)，然後將§式驗結果輸入此軟體原本設計的實驗表之結 果欄位中，經由軟體分析，便可得到許多探討實驗變因的 具體結論。本發明於實驗過程中使用之Ccd設計實驗是能 於一次實驗中，同時探討所需之多個實驗變因（並非傳統 # 實驗設計，只能一次探討一個變因），再依據Design-Expert 6.0.2軟體所規劃出來探討多變因子，需要實驗的反 應條件及組數，實驗者即依軟體所設計實驗條件進行搖瓶 試驗，將搖瓶實驗結果數據再輸入回軟體原先規劃實驗組 數中，待填寫之結果欄位。經由軟體統計分析，將可知各 單一變因分別對於實驗結果影響程度為何，或亦能探討兩 兩變因之間交互作用對實驗結果之影響。 (1)本實例中選擇獲自蝦蟹殼（購自於台灣世展公3(shin _ Era Technology Co.，Ltd))並且分子量為 95 kDa之幾丁 聚醣（CC 95)進行上述CCD設計實驗。 • 分別將秤重好的〇.〇5〜〇.35g上述幾丁聚醣加入預先配製 之1 v/v%醋酸水溶液中，以使其溶解，然後將其定量至 100 mL，並且取5 mL上述幾丁聚醣溶液進行後續反應。在 該5 mL幾丁聚醣溶液中，先加入2_5 mL Milli Q純水，再 加入2.5 mL 100%無水醋酸酐（即純水：無水醋酸酐之體積 比=1:1)，以進行乙醯化作用。此反應中，總反應溶液體積

123744.DOC -14- 201004973 為10 mL，基於該整體反應溶液之體積，該醋酸酐之濃度 為25 v/v°/。。於上述⑴中所描述之相同條件下進行乙醯化 作用。結果證實於上述條件下均可製得幾丁奈米顆粒之水 溶液。以奈米粒徑儀分析其中之幾丁聚醣奈米顆粒，結果 如表2所示，其平均粒徑範圍為189〜298 nm。 表2 試驗 醋酸酐濃度 (v/v%) 幾丁聚醣濃度 (w/y%) 平均粒徑 (nm) 1 0.05 189 2 25 0.20 245 3 0.35 298 (2)本實例中選擇獲自真菌（購自財團法人食品工業發展研 究所之dcikomMcor iin’waneww)菌株）並且平均分子量 為24 kDa之幾丁聚醣（FC 24)進行上述CCD設計實驗。 分別將秤重好的〇.4g與〇_6g上述幾丁聚醣加入預先配製 之1 v/v%醋酸水溶液中，以使其溶解，然後將其定量至 100 mL，並且取5 mL上述幾丁聚醣溶液進行後續反應。在 該5 mL幾丁聚醣溶液中’先加入2 5 mL Milli Q純水，再 加入2.5 mL 100%無水醋酸酐（即純水：無水醋酸酐之體積比 =1:1) ’以進行乙醯化作用。此反應中，總反應溶液體積為 10 mL，基於該整體反應溶液之體積’該醋酸酐之濃度為25 v/v°/。。將磁石加入上述溶液中，於37<>c下，以175 rpm之攪 掉速率擾拌超過24小時之時間後，獲得幾丁聚醣奈米顆粒 之水溶液。以奈米粒徑儀分析其中之幾丁聚醣奈米顆粒， 結果如表3所示，其平均粒徑範圍為196〜2〇6mn。

123744.DOC -15- 201004973 表3 試驗 醋酸酐濃度 —-_iv/v%) 幾丁聚醣濃度 (w/v%) 平均粒徑（nm) 1 0.4 197 2 0.4 206 25 3 0.6 196 4 ----------- 0.6 196 表2以及3之結果證實，根據本發明方法，反應濃度為 〇·1 w/v%〜〇.6 w/v%之幾丁聚醣，均可製得幾丁聚醣奈米 (3)接續上述實驗方式，將秤重好之〇2g幾丁聚醣（cc 95) ’加入預先配製之1 v/v%醋酸水溶液中，以使其溶 解，然後將其定量至100 mL，並且取5 mL上述幾丁聚 醣溶液進行後續反應。在該5 „^幾丁聚醣溶液中，先 加入不同反應體積Milli Q純水，再加入1〇〇%無未醋酸 酐，以進行乙醯化作用。此反應中，總反應溶液體積 為1〇 mL，基於該整體反應溶液之體積，醋酸酐之濃 Ο 度分別為17·5ν/ν%和25 Wv〇/o。於上述（2)中所描述之 相同條件下進行乙醯化作用並獲得幾丁聚醣奈米顆粒 之水溶液。以奈米粒徑儀分析其中之幾丁聚酶奈米顆 粒，結果如表4所示，其平均粒徑範圍為17〇〜245 nm。故於本發明方法中，醋酸野之漢度為175

Wv。/。〜25 V/V%之條件下，均可用於製得幾丁聚糖奈米 顆粒。 123744.DOC -16· 201004973 表4 試驗 幾丁聚醣濃度 Cw/v%) 醋酸酐濃度 (v/v%) 平均粒徑 (nm) 1 0.2 17.5 170 2 25 245 實施例2 幾丁聚醣奈米顆粒之製備（超音波震盪） (I)使用由不同來源獲得並且具有不同平均分子量之幾丁 ' 聚醣 分別將秤重好之〇.2g獲自蝦蟹殼（購自於台灣世展公司 β (Shin Era Technology Co.，Ltd))和真菌（購自財團法人食品 工業發展研究所之m’wowwcor 菌株）且具有不 同分子量之幾丁聚醣加入預先配製之1 v/v%醋酸水溶液 中，以使其溶解，然後將其定量至100 mL，並且取3·6 mL 上述幾丁聚聽溶液進行後續反應。在該3.6 inL幾丁聚醣溶 液中’先加入不同反應體積Milli Q純水，再加入1〇〇。/0無 水醋酸酐（純水：無水醋酸酐之體積比分別為1:2，2:3及 1:1)’以進行乙醯化作用。此反應中，總反應溶液體積為 ® 7·2 mL，基於該整體反應溶液之體積，該醋酸酐之濃度分

別為16.67 v/v%、20 v/v%和25 v/v%。於反應過程中，同 時利用超音波振盡器（Sonic & Materials Inc. Mode : VC 134)以輸出功率為15W且脈衝間距為4秒之條件下於室溫下 震盪5分鐘（震盪器係置入反應裝置（試管）中），震盪完畢後 立即將溶液移入冰浴中，以獲得幾丁聚醣奈米顆粒之水溶 液。以奈米粒徑儀分析其中之幾丁聚醣奈米顆粒，結果如 表5所示’其平均粒徑範圍為138〜213llin。 123744.DOC , 201004973 表5 醋酸酐濃度（v/v°/〇) 樣本 平均粒徑（nm) 16.67 CC 68 148 ~ FC 90 138 FC 340 180 ------- 198 20 CC 68 CC 72 158 CC 75 140 —FC 90 150 FC 340 FC 24 ' 170 --—----- 213 25 FC 30 170 — 註：表5之樣本編號中，fC代表獲自真菌之幾丁聚醣， CC代表獲自蝦蟹殼之幾丁聚醣，數字部份代表平均 分子量（kDa) 由表5之結果可知，根據本發明方法，使用由不同來源 獲得並且具有不同平均分子量之幾丁聚醣（例如蝦蟹殼幾 丁聚醣及真菌幾丁聚醣）’在添加使醋酸酐之濃度為1667 v/v。/。〜25 v/v%之條件下，藉由超音波振盪，可獲得平均粒 徑範圍為138〜213 nm之幾丁聚醣奈米顆粒。 (II)使用不同的醋酸酐最終濃度 選擇獲自真菌（購自財團法人食品工業發展研究所之 菌株）並且平均分子量為34〇 kDa之 幾丁聚糖（FC 340)進行以下實驗。 將评重〇.2g之上述幾丁聚醣分別加人預先配製之^ 士％ 醋酸水溶液I以使其溶解，然後將其定量至削紅，並

123744.DOC -18- 201004973 且取2 mL上述幾丁聚醣溶液進行後續反應。在該2 幾丁 聚醣溶液中，先加入不同反應體積MiUi Q純水，再加入 100 /。無水酷酸酐（純水：無水醋酸酐之體積比分別為1:1， 3_·5，1:3)，以進行乙醯化作用。此反應中，總反應溶液體 ‘ 積為4 mL ,基於該整體反應溶液之體積，該醋酸酐之濃度 分別為25v/v%、18.75v/v%*125 v/v%。同時以如實施例】 之（I)中所描述之相同方式藉由超音波振盪器進行反應，以 獲得幾丁聚醣奈米顆粒之水溶液。以奈米粒徑儀分析其中 Ο 之幾丁聚醣奈米顆粒，結果如表6所示，其平均粒徑範圍 為 153-170 nm。 表6 醋酸酐濃度（ν/ν%) Π 平均粒徑（nm) 25 170 18.75 165 12.5 153 由表6之結果可知，根據本發明方法，使用真菌幾丁聚 ❿ 醣（FC 340)，在添加使醋酸酐之濃度分別為125 wv%、 • 18.75 _%及25 v/v0/。之條件下，藉由超音波振盘，可獲得 ' 平均粒徑範圍為153〜170 nm2幾丁聚醣奈米顆粒。 綜合上述實施例1及2之結果可知，使用獲自不同來源並 且具有T同平均分子量之幾丁聚骑（例如獲自⑮蟹殼之幾 丁聚醣及獲自真菌之幾丁聚畴），在添加使醋酸肝之濃度 為12·5 ν/ν%〜25 v/v%之條件下’藉由物理性分散（例如授 掉或超音波振盈），確可獲得幾丁聚醣奈米顆粒。 123744.DOC •19·

Claims (1)

1. 201004973 十、申請專利範圍： 1. 一種於水相中製備幾丁聚醣奈米顆粒之方法，其包含以 下步驟： (a) 提供濃度為約〇.〇5 w/v%至約1 w/v%之幾丁聚酶溶 液， (b) 將水及無水醋酸酐依序加入該幾丁聚醣溶液中，以 ’ 進行乙醯化作用，其中，基於整體溶液之體積，酷 酸酐之濃度為約1〇 v/v%至約30 v/v%，及 φ (c)使步驟（b)之溶液進行物理性分散。 2. 如請求項1之方法，其中該幾丁聚醣係獲自甲殼類或真 菌。 3'如請求項1之方法，其中該幾丁聚醣溶液係將幾丁聚醣 溶解於1 v/v%之醋酸水溶液後所形成之溶液。 4·如請求項1之方法，其中該幾丁聚醣溶液之濃度係約0.05 W/V%至約 0.6 w/v%。 5_如请求項4之方法，其中該幾丁聚醣溶液之濃度係約ο」 Φ w/v%至約 0.3 w/v%。 .如请求項1之方法，其中該醋酸酐之濃度為約5 v 至約 25 v/v%。 7.如请求項6之方法，其中該醋酸酐之濃度為約17.5 v/v% 至約 25 v/v%。 8·如叫求項丨之方法，其中步驟（〇之物理性分散係以機械 式授掉或超音波震盪之方式進行。 9-如印求項8之方法，其中該物理性分散係以機械式攪拌 123744.DOC 201004973 之方式進仃，其係藉由將磁石加入該來自步驟（b)之溶液 並且以約I5〇 rpm至約15〇〇卬m之攪拌速率於約Μ它 下攪拌一段超過24小時之時間而進行。 > 如請求項8之方法’其中該物理性分散係以超音波震盪 之方式於室溫下進行。 11·如請求項1之方法，其中舟嫌 。 忒Μ步驟⑷之物理性分散係於約20 C至約401下進行。 12. 如請求項1之方法，豆中該幾 ，、甲涊咸丁聚醣奈米顆粒具有約100 nm至約500 nm之平均粒徑。 13. 如請求項12之方法，其中該幾丁聚糖奈米顆粒具有約 100 nm至約300 nm之平均粒徑。 14. 如請求項13之方法，其中該幾丁聚醣奈米顆粒具有約 100 nm至約200 nm之平均粒徑。

   123744.DOC 201004973 七、指定代表圖·· (一) 本案指定代表圖為：（無）。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：

   (無）〇

   123744.DOC 201004973 77年"月才日修正捕 發明專利說明書 中文說明書替換頁(97年11月） (本說明書格式、順序及粗體字，請勿任意更動，※記號部分請勿填寫） ※申請案號：097128151 ※申請曰期：介7,外 分類：C08B 一、發明名稱：（中文/英文） 於水相中製備幾丁聚醣奈米顆粒之方法 PROCESS FOR PREPARING NANOPARTICLES OF CHITOSAN IN WATER PHASE • 二、申請人：（共1人) 姓名或名稱：（中文/英文） 財團法人食品工業發展研究所 food industry research and development institute 代表人··（中文/英文） 劉廷英 LIU, TIN-YIN 住居所或營業所地址：（中文/英文） 新竹市食品路331號 N0.331, SHIHPIN RD., HSINCHU CITY, TAIWAN, R.O.C. 國籍：（中文/英文） 中華民國R.O.C. 123744-971121.DOC