TW200914040A - Compositions and methods for increasing vascularization - Google Patents

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200914040 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於蛋白質化學、分子生物學及血管生物學。 【先前技術】 神經胚素（Neublastin)，亦稱為阿特明（artemin)及因諾文 (enovin)，為24 kDa同源二聚分泌型蛋白質，其促進周邊 及中樞神經系統之神經元之外生長及存活（Baudet等人， 2000, Development, 1 27:433 5 ; Masure 等人，1999, Eur. J. 5z.oc/7em·，266:892 ; Rosenblad 等人，2000, Mo/· Ce" ，1 5(2): 1 99)。神經胚素 mRNA主要在胚胎腎及 肺中表現，且在成年人中，在腦下垂體、氣管及胎盤中表 現最高（Baudet等人，2000, Deve/opweni，127:4335)。 神經胚素為神經膠質細胞系來源神經營養因子（GDNF) 配位體家族之成員。GDNF配位體藉由接合膜結合型c-RET 受體酪胺酸激酶來活化Ras及磷脂醯肌醇-3-激酶信號轉導 路徑。該c-RET介導之信號傳輸需要另一輔助受體，糖基 磷脂醯基肌醇（GPI)錨定GDNF家族受體a(GFRa)蛋白，其 賦予對c-RET之配位體特異性。已鑑別出4種GFRa輔助受 體蛋白（GFRa 1 -4)。神經胚素在活體外對GFRa3展示最高 親和力，然而在使用人類纖維母細胞之研究中，神經胚素 可經由GFRa3或GFRal刺激c-RET依賴性信號傳輸（Baudet 等人，2000，Development, 127:4335 ; Masure 等人，1999, Eur, J. Biochem. 266:892 ； Rosenblad 等人，2000, Mol. Cell Neurosci·，15(2):199)。 131199.doc 200914040 神經胚素及其他GDNF家族成員為轉化生長因子p(TGF β)超家族之成員且因此’其特徵為存在七個具有類似間距 之保守性半胱胺酸殘基，其形成半胱胺酸節結構 (structure of a cysteine knot)(Saarma, 1999, Microsc. Res. ?>〜·，45:292)。各單體含有2個二硫鍵，其環繞第三個二 硫鍵形成閉環結構，以形成緊密節結構。含於各單體内部 之第七個半胱胺酸形成分子間二硫鍵，其將單體共價連接 以形成最終二聚體產物（Rattenh〇ll等人2000, 乂 Mo/.价〇/.， 305:523)。 【發明内容】 本發明至少部分基於以下發現：向哺乳動物投與神經胚 素促進動脈閉塞後缺血性肌肉組織之新血管生成及企流增 加0 在一態樣中，本發明之特徵為增進組織中血管形成之方 法，該方法包括以下步驟：選擇在組織（例如，諸如缺血 性肌肉組織之缺血性組織）中顯示減少或不足血流之喃乳 動物；及向該哺乳動物投與一定量之有效增進組織中血管 形成之多肽’其中該多肽含有與SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸Μ-ΐ 13 至少 80% —致 之胺基 酸序列 ’且其 中當二 聚時， 該多肽 與含有GFRa3及RET之複合物結合。亦揭示含有與seq ID NO: 1之胺基酸1 5-11 3至少80% —致之胺基酸序列的多肽用 於製備增進顯示減少或不足血流之哺乳動物組織中的血管 形成之醫藥組合物之用途’其中當二聚時，該多肽與含有 GFRa3及RET之複合物結合。 131199.doc 200914040 本文中所述之方法及用途之多肽中所含之胺基酸序列可 視需要與SEQ ID NO: 1之胺基酸15-113至少90%(例如，至 少95°/〇或98°/〇) —致。在一些實施例中，多肽含有以下部分 或由以下部分組成：SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸10-113、SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸 15-113、SEQ ID NO:2之胺基酸 15-113、 SEQ ID NO:3之胺基酸 15-113、SEQ ID NO:4之胺基酸15-113、SEQ ID NO:5之胺基酸 15，113、SEQ ID NO:8之胺基 酸15-113或SEQ ID NO:9之胺基酸15-113。舉例而言，多 肽可含有以下部分或由以下部分組成：SEQ ID NO: 1之胺 基酸序列、SEQ ID NO:2之胺基酸序列、SEQ ID NO:3之 胺基酸序列、SEQ ID NO:4之胺基酸序列、SEQ ID NO:5 之胺基酸序列、SEQ ID NO:8之胺基酸序列或SEQ ID NO:9之胺基酸序列。 多肽可（例如）經由全身性投藥（例如皮下或靜脈内投藥） 或局部投藥投與至哺乳動物。 具有減少或不足血流之組織可視需要位於哺乳動物之肢 :(例如手或足)中。在一些實施例中，具有減少或不足血 流之組織含有皮膚病變（例如，與糖尿病潰瘍相關之皮膚 病變’諸如糖尿病足潰瘍）。 根據本文中所述之方法及用途治療之喷乳動物可為⑼ 士）人類、小鼠、大鼠、牛、豬、犬、貓或猴。 在本文中所述之方法及用途之—些實施例中哺乳動物 ，心臟顯示減少血流且投與多肽增進心臟之血管形成，哺 礼動物遭受中風且由於中風而在組織中顯示減少或不足血 I31199.doc 200914040 流，哺乳動物遭受心肌梗塞且由於心肌梗塞而在組織中顯 示減少或不足血流，哺乳動物具有冠狀動脈疾病且由於冠 狀動脈疾病而在組織中顯示減少或不足血流，及/或哺乳 動物已接受移植器官（例如心臟或皮膚）且投與多肽增進移 植器官中之血管形成。 根據本文中所述之方法及用途治療之哺乳動物可具有諸 如缺血性疾病、心血管疾病及/或糖尿病之疾病或病症。 本文中所述之方法及用途可另外包括向哺乳動物投與抗 血栓劑、不同於神經胚素之增進血管形成之因子、降膽固 醇劑、β阻斷劑、抗高血壓劑或免疫抑制劑中之一或多 者。 本文中所述之方法及用途可另外包括確定在投與多肽 後’增進之血管形成是否已發生。 在本文中所述之方法及用途之一些實施例中’哺乳動物 尚未^斷具有神經學病症及/或尚未診斷具有眼睛病症。 除非另外疋義，否則本文中使用之技術及科學術語具有 與一般熟習本發明所屬技術之技術者通常所理解相同2含 義。儘管與本文中所述類似或等效之方法及材料可用於實 施或測試本發明，但下文描述例示性方法及材料。本文中 提及之所有公開案、專利巾請案、專利及其他參考文獻以 引用之方式全部併入本文中。在有衝突之狀況下，本申請 案匕括定義將起支配作用。材料、方法及實例僅為說明 性的且不欲加以限制。 本發月之其他特徵及優點將因以下實施方式及自申請專 131199.doc 200914040 利範圍而明顯。 【實施方式】 本發明提供用於在顯示減少或不足血流之組織中增進血 管形成之組合物及方法·，如隨附實例中所揭示，發現投與 神經胚素促進哺乳動物之缺血性肌肉組織之新血管生成及 血流增加。 神經胚素多肽 成熟野生型人類神經胚素長度為113個胺基酸且具有以 下胺基酸序歹彳：AGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRAL GLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALR PPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATA CGCLG(SEQ ID ΝΟ:1)。具有 SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸序歹ij 之 多肽或其生物學活性變異體可用於本文中所述之方法中。 如以下部分所詳述，變異型神經胚素多肽可含有一或多個 添加、取代及/或缺失。野生型神經胚素多肽及其生物學 活性變異體在本文中統稱為”神經胚素多肽”。 變異型神經胚素多肽之長度可不同於相應野生型多肽。 儘管成熟人類神經胚素多肽（SEQ ID ΝΟ:1)由前初神經胚 素（SEQ ID NO:10)之羧基末端113個胺基酸組成，但達成 適用神經胚素生物活性並非需要所有該等11 3個胺基酸。 可容許胺基酸末端截斷。因此，變異型神經胚素多肽可含 有（例如）SEQ ID ΝΟ:1 之羧基末端 99、100、101、102、 103、104、105、106、107、108、109、110、111、112 或 113個胺基酸（亦即，其長度可為99、100、101、102、 131199.doc -10- 200914040 103、104、l〇5、106、107、108、109、110、U1、112 或 Π3個胺基酸）。 ’支異型神經胚素多肽之序列亦可不同於相應野生型多 肽。詳言之，可將某些胺基酸取代引入神經胚素序列中而 無神經胚素生物活性之可觀損失。在例示性實施例中’變 異型神經胚素多肽⑴含有一或多個胺基酸取代，且（丨丨）與 SEQ ID NO: 1 至少 70〇/〇、8〇%、85%、90%、95%、98% 或 99%—致（或與SEQ id n〇:1之胺基酸15_113具有7〇%、 80%、85%、90%、95%、98%或99°/〇—致性）。在序列上不 同於SEQ ID ΝΟ:1(或在序列上不同於SEq id n〇:1之胺基 酸1 5- 11 3)之變異型神經胚素多肽可包括一或多個胺基酸取 代（保守性或非保守性）、一或多個缺失及/或一或多個嵌 入0 圖1為野生型人類、小鼠及大鼠前初神經胚素多肽之比 對。圖1十之垂直線指示神經胚素之成熟113個胺基酸形式 (左側垂直線）及104個胺基酸形式（右側垂直線）之起始。 RRXR肝素結合基元係以加框表示。天然存在生物活性形 式之神經胚素之該比對指示可經取代而不消除生物活性之 特定例示性殘基（亦即在人類、小鼠及大鼠形式之間不具 保守性之彼等殘基）。 可使用BLAST 2_0程式測定胺基酸序列之間的一致性百 分比。可使用無間隙對準且使用預設參數（Bl〇ss〇m 62矩 陣，間隙存在扣分（gap existence⑺叫為丨丨，每殘基間隙 扣分（per residue gap cost)為1χλ比率為〇 85)執行序列比 131199.doc 11 200914040 較。BLAST程式中所用之數學算法描述KAhschui等人， 1997, TVwc/e/c dc/心 25:3389-3402 中。 保守性取代為用一種胺基酸取代具有類似特徵之另一種 胺基酸。保守性取代包括以下群組内之取代：纈胺酸丙 胺酸及甘胺酸；白胺酸、纈胺酸及異白胺酸；天冬胺酸及 麩胺酸；天冬醯胺及麩胺醯胺；絲胺酸、半胱胺酸及蘇胺 酸；離胺酸及精胺酸；及苯丙胺酸及酪胺酸。非極性疏水 性胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺 酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸。極性中性胺基酸包括 甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸' 酪胺酸、天冬醯胺 及麩胺醯胺。帶正電之（鹼性）胺基酸包括精胺酸、離胺酸 及組胺酸。帶負電之（酸性）胺基酸包括天冬胺酸及麩胺 酸。上述極性、鹼性或酸性群組中之一成員經同一群組之 另一成員的任何取代均可視為保守性取代。 非保守性取代包括彼等取代’其中⑴具有正電性側鏈之 殘基（例如Arg、His或Lys)取代負電性殘基（例如Glu或Asp) 或經負電性殘基（例如Glu或Asp)取代；（u)親水性殘基（例 如Ser或Thr)取代疏水性殘基（例如Ala、Leu、以、phe或 Val)或經疏水性殘基（例如Ala、Leu、Ile、Phe或Val)取 代，（111)半胱胺酸或脯胺酸取代任何其他殘基或經任何其 他殘基取代；或（iv)具有龐大疏水性或芳族側鏈之殘基（例 如Val、lle ' Phe或Trp)取代具有較小側鏈之殘基（例如 Ala、Ser)或無側鏈之殘基（例如Giy)或經具有較小側鏈之 殘基（例如Ala、Ser)或無側鏈之殘基（例如GIy)取代。 I3I199.doc -12- 200914040 當二聚時，生物學活性變異型神經胚素多肽與含有 GFRa3及RET之三元複合物結合。用於㈣與該複合物結 合之任何方法可用以評估變異型神經胚素多肽之生物活 性。用於偵測變異型神經胚素多肽之三元複合物結合能力 之例示性檢定描述於W0 〇〇/〇1815中（其内容以引用之方式 併入本文中）。 亦可評定變異型神經胚素多肽以評估其觸發神經胚素信 號傳輸級聯之能力。舉例而言，可使用激酶受體活化 (Kinase Receptor Activati〇n’ KIRA)檢定來評估變異型神 經胚素多肽誘導RET自體磷酸化之能力（亦參見，等 人 ’ 1996, Jwa/· 5z-〇c^ew，235(2):2〇7)。 在以下胺基酸殘基中之一或多者處之取代預期產生與野 生型神經胚素相比，具有降低或缺乏肝素結合能力之變異 型神經胚素多肽：Arg 48、Arg 49、Arg 5 1、Ser 46、Ser 73 ' Gly 72、Arg 39、Gin 21、Ser 20、Arg 68、Arg 33、

His 32、Val 94、Arg 7、Arg 9 或 Arg 14。以位置編號提及 神經胚素胺基酸殘基係指將殘基相對於SEQ ID ΝΟ:1之編 號。關於取代指定之神經胚素胺基酸殘基（例如，在位置 48、49及/或5 1處之精胺酸殘基）可經非保守性胺基酸殘基 (例如麵胺酸）或保守性或胺基酸殘基取代。可在本文所鑑 别之殘基（例如位置48、49及/或5 1)處經取代之例示性胺基 酸包括麩胺酸、天冬胺酸及丙胺酸。 顯示降低或缺乏肝素結合之變異型神經胚素多肽之實例 揭示於表1及WO 2006/023 781(其内容以引用之方式併入本 131199.doc 13 200914040 文中）中。如與相應野生型位置相比經突變之變異型神經 胚素多肽之胺基酸殘基在表1中以粗體表示且加下劃線。 另外，用作取代之背景之神經胚素多肽（例如，長度為 1 1 3、99或1 04個胺基酸）描繪於表1中。 表1:變異型神經胚素多肽

SEQ ID NO 所取代之位 置 多肽長 度 胺基酸序列 2 Arg 48 113 AGGPGSRARAAGARGCRLRSQL VPVRALGLGHRSDELVRFRFCSG SCERARSPHDLSLASLLGAGALR PPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSF MDVNSTWRTVDRLSATACGCLG 3 Arg 49 113 AGGPGSRARAAGARGCRLRSQL VPVRALGLGHRSDELVRFRFCSG SCREARSPHDLSLASLLGAGALR PPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSF MDVNSTWRTVDRLSATACGCLG 4 Arg 51 113 AGGPGSRARAAGARGCRLRSQL VPVRALGLGHRSDELVRFRFCSG SCRRAESPHDLSLASLLGAGALR PPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSF MDVNSTWRTVDRLSATACGCLG 5 Arg 48 及 Arg 49 113 AGGPGSRARAAGARGCRLRSQL VPVRALGLGHRSDELVRFRFCSG SCEEARSPHDLSLASLLGAGALR PPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSF MDVNSTWRTVDRLSATACGCLG 6 Arg 48 及 Arg 49 99 GCRLRSQLVPVRALGLGHRSDEL VRFRFCSGSCEEARSPHDLSLAS LLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRP TRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLS ATACGCLG 7 Arg 48 及 Arg 49 104 AAGARGCRLRSQLVPVRALGLG HRSDELVRFRFCSGSCEEARSPH DLSLASLLGAGALRPPPGSRPVS 131199.doc -14- 200914040

SEQ ID NO 所取代之位 置 多肽長 度 胺基酸序列 QPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWR TVDRLSATACGCLG 8 Arg 49 及 Arg 51 113 AGGPGSRARAAGARGCRLRSQL VPVRALGLGHRSDELVRFRFCSG SCREAESPHDLSLASLLGAGALR PPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSF MDVNSTWRTVDRLSATACGCLG 9 Arg 48 及 Arg 51 113 AGGPGSRARAAGARGCRLRSQL VPVRALGLGHRSDELVRFRFCSG SCERAESPHDLSLASLLGAGALR PPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSF MDVNSTWRTVDRLSATACGCLG 視需要可使神經胚素多肽與一種聚合物（例如聚伸烷二 醇部分，諸如聚乙二醇部分）偶合。在一些實施例中，使 該聚合物與該神經胚素多肽在該肽N端之一個位點偶合。 在一些實施例中，變異型神經胚素多肽包括至少一個胺基 酸取代於SEQ ID ΝΟ:1(或於SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸Μ-ΐ 1 3) ， 其提 供一個 内部聚 合物接 合位點 ，可 接合一 種聚合 物。在一些實施例中，該聚合物與變異型神經胚素多肽在 一個選自由位置14、位置39'位置68及位置95組成之群之 殘基（根據SEQ ID NO: 1之序列編號）偶合。提供内部聚合 物接合位點之例示性神經胚素變異體描述於WO 02/ 060929及WO 04/069176(其内容以引用之方式併入本文 中）。 除神經胚素多肽之外’多肽亦可視需要含有異源胺基酸 序列。在提及胺基酸序列時’所使用之”異源”係指來源自 對特定宿主細胞而言為外來來源之序列，或若來自相同宿 131199.doc -15- 200914040 主細胞，則為其原始形式經修飾之序列。例示性異源序列 包括異源信號序歹彳（例如天然大鼠白蛋白信號序列、經修 飾之大鼠信號序列、或人類生長激素信號序列）或用於純 化神經胚素多肽之序列（例如組胺酸標籤）。

神經胚素多狀可使用此項技術中已知之方法分離。天然 存在或重組產生之神經胚素多肽可使用標準蛋白質純化技 術自細胞或組織來源分離。或者，突變型神經胚素多肽可 使用標準狀合成技術化學合成。短胺基酸序列之合成在肽 技術中已充为建立。參見例如Stewart，等人，s〇lid抑狂“

Peptide Synthesis(第 2版，1984)。 在一些實施例中，神經胚素多肽係藉由重組DNA技術產 生。舉例而言，可將編碼神經胚素多肽之核酸分子嵌入例 如表現載體之載體中’且可將該核酸引入細胞中。適合細 胞包括例如哺乳動物細胞(諸如人類細胞或ch〇細胞）、真 菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及細菌細胞（例如大腸桿菌 ⑷响）。當在重組細胞中表現時，較佳將細胞在允許表 現神經胚素多肽之條件下培養。若 而要’則可自細胞懸浮 液回收神經胚素多肽。如本文中所使用，”回收 變型多肽自回收處理前多肽存在於 牧％其中之細胞或培養基之 彼等組分移除。回收處理可包括— m ^ , 或多個再摺疊或純化步 驟。用於誘導變性神經胚素多肽摺最 於（例如）WO 2006/023782中。 H及方法描述 已知之若干方法 突變誘發，其中 變異型神經胚素多肽可使用此項技術中 中之任何方法來建構。一種該方法 — 點 13ll99.doc 16 200914040 改變一特定核苷酸（或必要時少量特定核苷酸）以改變所編 碼變異型神經胚素多肽中之單個胺基酸（或必要時少量預 疋胺基酸殘基）。許多定點突變誘發套組可購得。一種該 套組為由Clontech實驗室（Palo Alto, CA)出售之"轉型體定 點突變誘發套組（Transformer Site Directed Mutagenesis)'，。 醫藥組合物 可將神經胚素多肽併入含有治療有效量之多肽及一或多 種佐劑、賦形劑、載劑及/或稀釋劑之醫藥組合物中。可 接受之稀釋劑、載劑及賦形劑通常不會不利地影響受者之 内穩定（例如電解質平衡）。可接受之載劑包括生物相容 性、惰性或生物可吸收性鹽、緩衝劑、募醣或多醣、聚合 物、黏度改良劑、防腐劑及其類似物。一種例示性載劑為 生理鹽水（0.15 M NaC卜pH值為7.0至7.4)。另一種例示性 載劑為50 mM磷酸鈉、100 mM氣化鈉。關於調配及投與醫 藥組合物之技術之其他細節可見於（例如）REMINGT〇N，s PHARMACEUTICAL SCIENCES(Maack Publishing Co., Easton, Pa.)中。 含有神經胚素多肽之醫藥組合物之投藥可為全身性或局 部投藥。醫藥組合物可經調配以使得其適用於非經腸及/ 或經腸投藥。特定投藥模式包括皮下、靜脈内、肌肉内、 腹膜内經皮、鞘内、經口、經直腸、頰内、局部、經 鼻、經眼、關節内、動脈内、蛛網膜下、經支氣管、經淋 巴、經陰道及子宮内投藥。 技藥可藉由定期快速注射醫藥組合物或可藉由自外部 131199.doc -17- 200914040 (例如ιν袋）或内部（例如生物可姓性植入物、生物人造器官 或植入神經胚素產生細胞之群落）儲集器來靜脈内或腹膜 内才又藥而更連續地進行。參見（例如）美國專利第4,4〇7,957 號、第5,798，113號及第5,800,828號，其各自以引用的方式 併入本文中。醫藥組合物之投藥可使用諸如以下方式之適 «傳遞方式來達成：泵（參見（例如）Annals 〇f Pharmacotherapy, 27:912 (1993) ； Cancer, 41:1270 (1993)； Cancer Research，44:1698 〇984)’其以引用之方式併入本 文中）；微膠囊化（參見（例如）美國專利第4,352,m ; 4,353,888 ;及5,084,350號，其以引用之方式併入本文 中）’連續釋放聚合物植入物（參見（例如，美國專利 第4,883,666號，其以引用之方式併人本文中）；巨膠囊化 (參見（例如）美國專利第 5,284,761、5，158,881、4,976,859 及4,968,733號及公開之pcT專利申請案w〇92/i9i95、w〇 95/05452，各自以引用夕古斗你 ,x 弓丨用之方式併入本文中皮下、靜脈 内、動脈内、肌肉内注射或注射至其他適合部位；或以膠 囊液體It劑、丸劑或延長釋放調配物經口投藥。 非經腸傳遞系統之實例包括乙烯_乙酸乙烯®旨共聚_ 粒參透泵、可植入輸液系統、栗傳遞、囊封細胞傳遞、 月曰貝體傳遞、針傳遞注射、無針注射、喷霧器、霧化器、 電穿孔及經皮貼片。

適用於非經腸投藥$ ^苗t, A 朵之°周配物適宜地含有神經胚素多狀之 無菌水性製劑，其較佳與受者之血液等張(例如生理鹽水 溶液）。調配物可以單位劑量或多劑量形式存在。 131199.doc 200914040 例示性調配物含有本文 m m ^ ^ ^ 述之神經胚素多肽及以下緩 衡削組分·琥珀酸鈉（例如 ^ L… ⑴如1〇，； NaC1(例如75mM);及 L-積私酸（例如1 〇〇 。 :用於經π投樂之調配物可以各自含有預定量之神經胚 夕月太之離散單元（諸如膠囊、藥包、錠劑或含片广或以 於水性液體或非水性液體一 〆 乳液或飲劑)之形式提供。…(诸如糖聚、酿劑、 適合於局部投藥之神經柩音玄B4_ 1 ^ r A胚素多肽可以（例如）乳膏、喷 務、泡沫、凝膠、斂臺、，、丄主丄、& , ’膏或乾燥摩擦劑（rub)形式投與 至哺乳動物（例如人類患者）。乾^ ^ ^ ^ ^ ^ }乾森厚擦劑可在投藥部位處 =水合。神經胚素多肽亦可直接注入（例如渗入且乾燥）端 可：紗布或貼片中，其可隨後局部應用。神經胚素多肽亦 :以半液體、凝膠或完全液態維持於用於局部投藥之繃 可布或貼片中（參見（例如）美國專利第4,3〇7,717號其 内容以引用之方式併入本文中）。 〜療有效里之醫藥組合物可以可藉由熟習此項技術者確 定之給藥方案投與至需要其之個體中。舉例而言，組合物 可以每劑每公斤個體體重㈣至侧叫之劑量（例如） 全身性投與至個體。在另一實例中，劑量為每劑每公斤個 體體重1 Mg至100叩。在另一實例中，劑量為每劑每公斤 個體體重1叫至3 0 ，例如，每劑每公斤個體體重3 Μ至 1 0 〇 為優化治療功效，可首先以不同給藥方案投與神經胚素 多狀。單位劑量及方案視包括（例如）哺乳動物物種、其免 131199.doc •19- 200914040 疫狀態、哺乳動物之體重之因素而定。通常，使用 檢檢定作為臨床測試程序之部分監控組織中之蛋白質二旦 (例如）以測定給定治療方案之功效。 、3里 神經胚素多肽之給藥頻率在醫師之技術及臨床判斷之 通常，藉由可建立最佳投藥參數之臨床試驗建：： 桌*。然而，行醫者可根據個體之年齡、健康狀況、體 重、性別及醫學狀態改變該等投藥方案。給藥頻率可根據 治療為預防性或是治療性而變化。 治療方法 ，本文中所述之神經胚素多肽可用於增進在組織中顯示減 >、或不足血流之喷乳動物之血管形成。舉例而言，神妹胚 素多肽可用以治療具有、懷疑具有以下病症或處於發展以 下病症之風險中之哺乳動物(例如人類）：缺血性病症，諸 肉局邛缺血、缺血性心臟(例如因心肌梗塞而產生）、 褥瘡潰癌、因靜脈曲張產生之局部缺灰、糖屎病之缺金性 併發症（例如諸如^病變之皮膚病變）、缺血性腎、缺血性 腦（例如因中風而產生）或缺血性肝。另外，神經胚素多肽 可用以增進已接受移植器官且需要器官之血管形成之哺乳 動:的灰官形成。可藉由投與神經胚素多狀來治療或預防 之特疋醫學病狀的實例在以下部分中回顧。 (〇中風 中風（例如缺血性中 身性灌注μ巾風、VIZ 風、栓塞性中風、全 膜下出錢中風）為特η Γ 腦内出血性中風或蛛網 特徵為腦之一或多個區域之血流減少 mi99.doc -20- 200914040 或不足的病症。灌注之擾動可為靜脈性，但最通常為動脈 性。至腦之血流之損失或減少產生對缺血區域之破壞，其 可厭重減少局部或整體腦功能。可將本文中所述之神經胚 素多肽投與（例如靜脈@、皮下、鼻内或藉由顧内局部傳 遞）至個’以便增進腦之_或多個區域之血流以進而預 防或降低由中風導致之損傷。在個體處於患中風之風險中 (例如，個體經診斷為具有腦中動脈之部分小管形成）時， 可將神經胚素投與至個體以預防中風之發生或減輕中風之 嚴重性。 產生中風之風險因素包括（例如）中風之家族病史、年長 之年齡、種族、高血壓' 高膽固醇含量（尤其高LDL)、 煙、糖尿病及肥胖。 中風可藉由（例如）個體所呈現之症狀之嚴重性及/或數量 來診斷或Μ。巾風之症狀可視受影響之腦之特定區域而 變化。中風症狀包括（例如）虛弱（偏癱），麻木，感覺或振 動感覺降低，感覺變化(例如嗅覺、味覺、聽覺或視覺(總 體或部分）），目艮驗下垂（下垂症），反射降低（例如受塞 (gag)、吞咽），面部之感覺降低及肌肉虛㈣，平衡問題， 呼吸改變’心率改變’失語症（不能說話或理解語言），精 神性運動不能（自主移動改變），眩晕及/或失衡。 中風亦可使用包括電腦軸向斷層攝影術(CAT)、電腦斷 層攝&術(CT)或磁共振成像(MR”掃#之多種定量技術來 移斷及#估（例如，診斷及評估中風之嚴重性或腦受影塑 之程度）°醫學專家亦可使用更定性之診斷以診斷或評二 131199.doc •21 - 200914040 患有中風之個體，例如藉由評估個體微笑之能力，舉起— 或兩個肢體、連貫地說㈣單及/複雜句子、行走或維持 平衡之能力或本文中所述之令風之任何其他症狀來診斷或 評估。 除本文中所述之投與神經胚素多肽之外，中風亦可根據 個體及病狀之性質以多種技術來治療。常用治療包括機械 血栓切除術或投與組織纖溶酶原活化劑（tPA)或血栓溶解之 其他方法。 (ii)缺血性心臟病 缺血性心臟病特徵在於心臟肌肉之減少或不足之血流， 且可由（例如）一或多個冠狀動脈之動脈粥樣硬化（冠狀動脈 疾病）、心律不整、急性心肌梗塞、心肌活性損失或缺陷 I·生〜臟瓣膜引起。心臟之血流之損失或減少導致對缺血性 肌、、且織之損害，其可引起對心臟之永久性損害及/或受 影響個體之死亡。可將本文中所述之神經胚素多肽投與 (例如靜脈内、皮下’或藉由心肌或心外隐射局部投與） 至個體’以便增進心臟之—或多個缺血性區域之血流以進 而預防或降低由局部缺血導致之損害。在個體為處於發展 缺血性心臟病之風險下之個體之情況下，可投與神經胚素 以預防心臟局部缺血之發生线輕^臟局部缺血之嚴重 性。 ,發展缺血性心臟病之風險因素包括（例如）不良飲食、肥 “吸煙回應力及/或長期應力、家族病史（例如遺傳傾 向）、久坐生活方式、高膽固醇含量及/或糖尿病。 131199.doc •22· 200914040 缺血1·生〜臟病可藉由(例如)個體所呈現之缺血性心臟病 之症狀的嚴重性及/或數量來診斷或評估。缺金性心臟病 症狀在嚴重性方面變化且在—定範圍㈣化，且包括（但 不限於）以下症狀中之一戎容..队士 -乂夕者.胸疼痛、左臂疼痛、頜 疼痛、頸疼痛、背痛、 希頰似於月灼熱之感覺、氣短、蒼白 皮膚、大量出汗、虛弱、輕微頭痛…惡心、。區吐、心俘及 :或疲勞。缺血性心臟病可使用此項技術中已知之多種技 術包括〜電圖（ECG)、冠狀動脈管造影術（c〇r〇nary angiog叫、胸放射線"、超音心動圖及/❹㈣㈣ 制採集（multiple eateH ·· · acquisition，MUGA)掃描來診斷或 評估。缺血性心臟病亦可使用生物標$，㈣_血” 之或夕種。臟酶（例如肌酸激酶、肌約蛋白工及乳酸脫氯 酶同功異型物）之含量夾分齡^ 术％斷或砰估。診斷或評估患有缺 血性心臟病之個體之装 具他方法包括運動應力測試，其中監 控個體之心臟同時個體運動。可監控個體之心率、呼吸及 血壓。亦可執行ECG(上文）。 2本文中所述之投與神經胚素多肽外，對患有或懷疑患 性頻狀㈣^㈣^純與氧、乙酿水楊 酸（阿司匹靈（aspirin))、—妯缺1 )—々酸甘油酯及疼痛舒解劑。可 向j於發展缺血性心_之駿巾之患者投與町各物中 :二…：降膽固醇劑(例如士他汀( — η)"阻斷劑 或抗南血壓劑（例如利尿 # ⑷血s收細素轉化酶抑制劑、 血官舒張劑或α阻斷劑）。 (iii)潰瘍 131199.doc -23- 200914040 :為受影響區域(例如足)血流減少或不足導致之皮膚 該等潰癌可為糖尿病之血管併發症(例如足之糖尿 ’丙/·生項4)、靜脈機能不全（腿（⑽叫潰瘍）或過大麼力（例 如褥瘡潰瘍或褥蒼） ，）、，、Q果。皮膚區域之血流損失或減少 —致:亥皮膚區域及周圍組織之損壞及/或死亡。可將本文 中所=之神經胚素多肽投與至個體（例如局部投盘至個體 之潰癌)，以增進潰瘍或周圍組織部位之血流，進而降低 =之嚴重性或持續時間。在個體處於發展潰癌之風險時 ，列如長期俯伏或仰臥姿勢之痛疾個體或患有歸因於糖尿 病之。血官併發症之個體），可將神經胚素投與至個體（例 如藉由局部投藥至糖尿病患者之腿及足）以預防潰癌之發 生或減輕潰癌之嚴重性。 發展皮膚潰瘍之風險因素包括例如長期坐或躺(例如仰 臥或俯臥姿勢）、糖尿病、靜脈曲張(參見下文)、感染及/ 或衛生不良。 “ 用於診斷及/或評估個體之潰瘍之方法包括目視檢查， 例如潰瘍自身之外觀、發紅、酸痛或疼痛。目視檢查亦可 用：檢查顯示發展潰瘍之症狀’包括例如出汗減少、皮膚 乾燥及龜裂形成’及受影響區域發展感染之傾向。足之血 流減少之症狀（及發展足潰癌之風險，例如通常因糖尿病 0發症產生）包括脆性指甲、老萌及鍵狀趾。目視檢查 亦可包括評估潰瘍之大小及’或潰瘍是否受感染。醫學專 家可施用-或多種測試以破定懷疑具有血流減少或不足之 區域之血流含量’包括經皮之氧測量（tc〇m)及耐倫單絲 131199.doc 24· 200914040 列式。TCOM需要將電極直接置放於所懷疑之皮膚區域 上。通常測得小於4〇 mm Hg之氧壓為該區域缺乏血流之指 不。耐倫單絲測試為感覺測試，其涉及使用丨〇量規耐倫單 絲來輕刺受影響皮膚„若當僅僅以使艮絲彎曲之足夠壓力 對足施壓時，個體不能感覺到單絲之觸及，則測試為異常 的。 除本文中所述之投與神經胚素多肽外，用於皮膚潰瘍之 治療亦可包括手術以移除死亡或受感染組織且在需要時投 與抗生素。 (iv)靜脈曲張 靜脈曲張（靜脈機能不全）為特徵在於靜脈（通常為腿之靜 脈)不能將去氧血液運送回心臟之病纟。靜脈機能不全可 因靜脈瓣之血栓（血凝塊）或損壞，或靜脈瓣之彈性喪失而 產生。可將本文中所述之神經胚素多肽投與（例如局部投 與至個體之腿，皮下或靜脈内投與至受影響靜脈）至個 體二以便增進腿中返回至心、臟之血流，進而降低靜脈曲張 之嚴重性或減少歸因於靜脈曲張之併發症。在個體處於發 展靜脈曲張之風險中時（例如，具有靜脈曲張之一或多種 風險因素之個體），可將神經胚素投與至個體以預防靜脈 曲張之發生或減輕靜脈曲張之嚴重性。 發展靜脈曲張之風險因素包括（例如）老齡、個體性別（婦 女比男性更可能發展靜脈曲張）、家族病史(例如遺傳傾 向）、肥胖及/或涉及長期站立之職業。 靜脈機能不全可在個體中藉由（例如）個體所呈現之症狀 131199.doc -25- 200914040 之嚴重性及/或數量來”及/或評估，該等症狀包括（例 如）腿、足及踝之疼痛或沉重感，腫服，皮膚上之潰癌或 靜脈受損情況下之n Φ i 重出血。VI可在個體中使用多種技術 來診斷或評估，該等技術包括雙向（dupiex)或多普勒超音 (D〇Ppler Ult⑴Gund)，其為—種使㈣音來觀測血管中之 凝塊或其他異常之非侵襲性技術。診斷/評估靜脈機能不 全之其他方法包括CT掃描、靜脈造影術、諸如X射線或磁 共振血管攝影術（MRA)之血管攝影術。 除本文中所述之投與神經胚素多肽外，詩靜脈機能不 全之治療可包括（例如）雷射外科手術、硬化注射療法 (SCler〇theraPy)/微硬化注射療法 〇nicrosclerotherapy)、外 科靜脈剝離、鉤取式靜脈切除術（ambulatory

Phlembect0my)及内窺鏡靜脈外科手術。非外科療法包括 在腿中發生靜脈機能不全時，使腳高舉、壓迫療法（壓迫 襪或裹腿褲）、運動、減輕體重及皮膚護理。 (v)移植器官 器官移植為將完整或部分器官自一個個體轉移至另一個 體之方法。移植器官包括(例如)心臟、肺、肝、腎、小 胰腺、手、指(手指或腳趾)或皮膚(例如，皮膚移植， — 見下文）對成功之器官移植而言，血 官形成必須在移植器官與宿主之間發生。因此，可將本文 H2神經胚素多肽投與至個體以便促進移植器官與宿 的血管形成且增進移植器官之金流，進而預防移植 I31199.doc -26- 200914040

系見器官移植為皮膚移植，其中將部分皮膚自人體之一 區域外科移除且移植至另一者。皮膚移植物可為自體的 (來自同一個體）或可為異源性的（來自不同個體）。在一些 情況下’皮膚組織可自與受者個體不同物種之動物獲得 (例如異種移植）。皮膚移植物可對已（例如）遭受大面積燒 傷或具有皮膚感染並具有皮膚區域損失之個體執行。在該 等狀況下，通常使用皮膚移植物以使皮膚損失部位處之細 菌濃度最小及/或防止體液損失。皮膚移植物亦用於化妝 外科手術中，諸如選擇性外科手術或諸如乳房切除術或胸 壁重建之彼等伴隨外科程序。皮膚移植可為大面積移植， 諸如整體或部分面部移植。如上文所討論，對成功之皮膚 移植而5，血管形成必須在移植部位與所移植組織之間發 生。因此，可將本文中所述之神經胚素多肽投與至個體以 便促進移植皮膚與宿主之間的血管形成且增進移植皮膚之 血流’進而預防移植物失效。 對皮膚移植成功之監測可以多種方式執行，包括目視檢 查，例如檢查所移植皮膚之顏色，監控所移植區域之感覺 回復，或監控所移植皮膚之溫度。所移植皮膚之區域中之 血流可（例如）使用雷射多普勒（D〇ppler)灌注監測技術直接 量測（參見下文）。 如本文中所使用，懷疑具有特徵為減少或不足血流之病 症之個體為具有特徵為減少或不足血流之特定病症之一或 多種症狀（諸如本文中所述之任一者）的個體。舉例而言， 懷疑患有中風之個體可為具有—或多種以下中風症狀之個 131199.doc •27· 200914040 體：諸如（但不限於）虛弱、麻木、眼瞼下垂（下垂症）、反 射降低（例如哽塞、吞咽）、面部之感覺降低及肌肉虛弱、 失語症、精神性運動不能或本文中所述之任何其他症狀。 如本文中所使用，處於發展特徵為減少或不足血流之病 症之風險中的個體為具有一或多種特徵為減少或不足血流 之特定病症之風險因素的個體。舉例而言，處於發展缺血 性心臟病之風險中之個體可為具有一或多種發展:血性心 臟病之風險因素的㈣，包括（例如）不良飲食、肥胖、吸 f、高應力及/或長期應力、久坐生活方式、高膽固醇含 量、糖尿病或本文中所述之任何其他風險因素。 神經胚素多肽可以種方式投與至個體，其至少部分視 所治療之病症類型及人體中減少或不足血流之位置而:。 3即裾：：症本質上為皮膚病症之實施例中，諸如皮膚病 、褥瘡4或糖尿病性潰綠糖尿 經胚素多肽可局部投盥。舉例而…“疋神 春 扠一舉例而$，神經胚素多肽可以乳 用、油嘗或軟膏投與至個體。本 物亦可u ^ 胃本文巾所奴相胚素組合 j /主入細帶、紗布或貼片中 4 307 71 7策、 、片中見（例如）美國專利第 ，，7 1 7 5虎）。在個體中特徵為減少或不足血# 内部病症（例如中風、缺‘ w 小疋血机之病症為 中風缺血性心臟病或器官移植）的實 中，神經胚素可經靜脈内、皮:直）的實她例 部位處局部投*至個體-要增進血管形成之 術期間投〜務I ’神經胚素可在移植手 組合療法 植之腎或心臟及/或周圍宿主組織。 本文中所述之神經胚素 夕狀了作為单一療法或作為多重 I3I199.doc -28- 200914040 治療方案之部分結合一或多種向患有特徵為減少或不足血 SlL之病症之個體提供治療盈處的其他藥劑一起投與至個 體。舉例而言，神經胚素多肽可與另一血管生成因子共同 投與，諸如血管生長素（Angiogenin)、促血管生成素_ UAngiopoietin-l)、DeM、纖維母細胞生長因子（例如 aFGF、bFGF或FGF2)、卵泡抑制素（Follistatin)、顆粒球群 落刺激因子（G-CSF)、肝細胞生長因子（HGF)、介白素_ 8(IL-8)、瘦素中期因子（Leptin Midkine)、胎盤生長因子、 血小板衍生内皮細胞生長因子（PD_ECGF)、血小板衍生生 長因子-BB(PDGF-BB)、多效生長因子 (piei〇tr〇Phin)(PTN)、前顆粒蛋白（Pr〇granuIin)、增殖蛋白 (ProHfedn) '轉型生長因子α(Τ(}ρ_α)、轉型生長因子 β(Τ.β)、腫瘤壞死因子a(TNF_a)及/或血管内皮生長因子 (VEGF)。另外，神經胚素多肽可與—或多種不增進血管形 成但以其他方式有益於患有特徵為減少或不足血流之病症 之個體的治療劑組合投與。舉例而言，神經胚素多肽可與 以下各物中之任一者共同投與：抗血栓劑（例如阿司匹靈 (asplrin)、鏈激酶⑽柳恤咖卜尿激酶&她㈣e卜组 織纖溶酶原活化劑、肝夸 各, 肝素或水蛭素），疼痛藥物，抗生 素’降膽固醇劑「你丨& ^ (. /Τ ) , Ρ阻斷劑及/或抗高血壓劑

(例如利尿劑、血管收 门 H 阻斷劑）。在使用、“ 劑、血管舒張劑h ' 在使用神經胚夸客日+水 器官（例如，所務枯 增進已移植至受者中之 體或皮膚）之血管形成時腎、肺、諸如手指之肢 、中，、’呈胚素多肽可視需要與一或 13H99.doc •29- 200914040 多種免疫抑制劑共同投與。 神經胚素多肽及—戋多籀盆 主々 飞夕種其他樂劑可同時投與，神經胚 素夕肽可在第一時間首先投盥 — 又，、且或多種其他藥劑在第二 時間隨後投盥，戎—式之括甘^ /、次、夕種其他樂劑可在第一時間首先投 與且神經胚素多肽在第二時間隨後投與。 神經胚素可視需要替換或增強先前或當前所投與之療 法。舉例而言’用神經胚素多肽治療後，可停止或減少一 或多種其他藥劑之投藥（例如，以較低含量投與）。在一些 情況下，可維持先前療法直至神經胚素含量（例如劑量或 時程）達到足以向個體提供治療效應之含量。在先前療法 尤其具毒性或個體不良耐受之情況下，可使用神經胚素多 肽之投藥來抵消及/或減少先前療法（例如血管生成療法）之 量達到足以給予相同或改良治療益處但無毒性之含量。 在個體對第-療法不反應之„些情況τ，可向個體投與 神經胚素。舉例而言，若個體（例如人類患者）對諸^ VEGF(或本文中所述之另一血管生成因子）之第一治療不反 應，則可將神經胚素多肽投與至個體。如本文中所使用， ”對治療不反應之個體”係指單獨用一或多種血管生成療法 治療（亦即不與神經胚素組合）不產生顯著臨床改良，更特 定言之不產生用以量測血管生成功效之參數（諸如（但不限 於）運動跑步機測試（ΕΤΤ或運動應力測試）、絞痛時間及絞 痛頻率）之顯著（及較佳長期）改良之患者（參見（例如）Fam等 人（2003) Circulation 108:2613)。對 VEGF 血管生成療法不 反應之此類個體群之一實例由Henry等人（2003) Circulation 131199.doc -30- 200914040 107:1359 1365描述。 評估治療功效 神經胚素治療之功效可藉由本文中所述之任何方法評估 (例如藉由直接監測新血管生長之程度或評估特徵為減少 或不足血流之病症之特定特徵或症狀來評估）。舉例而 言，個體腦中血管結構之量或密度可使用MRI(參見（例 如）DUnn 等人（2004) Magn Reson. Med· 51⑴：55_61)或超音 技術，諸如 Fosberg 等人（2004) Ultrasonics 42(1):325-330 所述技術之改適來量測（例如在治療前及治療後量測）。神 經胚素治療在促進新血管形成中之效應亦可藉由使用（例 如）如（例如）Freccero 等人（2003) Micr〇vasc Res 66(3):183· 9;及Rendell 等人（1989) Diabetes 38(7):819824 中所述之 雷射多普勒（Doppler)技術監測血流之增加來評估。適用於 藉由田射夕普勒（D〇ppier)技術量測皮膚血流之例示性裝置 為 DRT4(Moor lnstruments, Dev〇n，υκ)。另外神經胚素 促進移植器官(例如所移植t腎、心、臟或皮膚)之血管形成 之功效可藉纟以治療後所移植器官功能之增加或器官健康 狀態之增加(例如藉由活組織檢查)之形式來量測。 二口療功效可藉由在治療前及治療後評估個體（例如比較 =或治療後受影響區域中之氧張力）來評定。在欲評 3、夕人神，,、i胚素治療後病症改良之 :申經-素治療後之多個時間點評估(例如，丨天、2天二 二、週1個月及6個月評估；1個月、ό個月及1年評 131199.doc -31 - 200914040 在使用神經胚素之投藥來預防特徵為減少或不足血 病症（例如，諸如歸因於糖尿病之血管併發症之足潰“ 病變）之發生時，功效可以病症之-或多種症狀之延遲= 現或不能呈現形式來評估。在改善病症之—或多 中，治療隨時間之功效可藉由評估（例如）治療後多個 點之一或多種症狀之數量或嚴重性來確定。舉例而言，個 體可具有其病症之嚴重性之初始評估，可經投與治療，且 隨後在治療之後評估兩次或兩次以上（例如，在i週及上個 月時’·在丨個月、在2個月時；在2週、〗個月及6個月時. 或6週、6個月及4時評估）。在將一或多次神經胚素治療 ，與至個體歷時有限時間段（例如預定持續時_投藥數 買時’治療對改善特徵為減少或不足金流之病症之一或多 種症狀的效應可在最終治療後之各個時間點來許估。舉例 而言’在神經胚素劑量之最後一次投藥後，可在最終治療 後1個月時（例如，在2個月、在6個月、在丨年、在2年、在 5年或5年以上時）評估患者症狀之數量或嚴重性。 特徵為減少或不足金流之病症之動物模型 以下實例描述適用於研究神經胚素治療對缺*性病症之 >文應之/¾體内動物模型系統。該治療之功效可藉由直接分 析缺企性組織，例如，#由使用免疫組織化學技術量測缺 血性肌肉中之毛細血管密度及/或量測缺血性肌肉中之血 流來評估。為評估對特徵為減少或不足血流之病症之預防 或發作延遲’亦可在誘發病症之前將神經胚素多肽投與至 動物適用於°平估神經胚素治療增進無管形成之功效的其 131199.doc -32- 200914040 他動物模型（例如小鼠模型）包括以下文獻中所述之彼等動 物模型：例如 Couffinhal 等人（1988) Am J. path〇l 152(6):1667-1679: Cao 等人（1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(24):14389-14394 ;及 Salven 等人（2002) rASEB J. 16:1471-1473。糖尿病患者中創口癒合減少之動物模型描 述於（例如）Tsuboi 等人（1992) J. Dermatol. 19(1 1):673_75 中〇 以下為實施本發明之實例。其不欲理解為以任何方式限 制本發明之範疇。 實例 實例1 :神經胚素促進缺血後新血管形成 使用後肢局部缺血之鼠類模型來確定神經胚素投藥是否 增進哺乳動物中之A管形成1小鼠後肢之右側股骨動脈 外科、纟。古。神經胚素以每公斤i毫克或0 i mg/kg之 劑里’ it皮下投與3次。或者，對—組小鼠單獨投與媒 劑（無神經胚素）作為對照。各組中評估1〇隻小鼠。21天（3 週）以後，處死小鼠且移除腓腸肌肌肉。 如^州⑽等人（2005) Nat. Med. 1 1(5):499-506 中所述， ^療月、、°束時，藉由高清晰度微血管造影術評估血管 1 =之將小鼠麻醉（異氟烧吸入）且經由引入腹部 主動脈中之導官注入對比介質(硫酸鋇，^ g，mi)。將藉由 數位=射線傳感n獲得之影像（每隻動物2個）組合以獲得後 ^之70正圖。血官密度表示為每個影像由定量區域中之血 斤佔像素之百分比。定量區由結紮物在股骨動脈上之位 131199.doc -33- 200914040 置、膝、股骨邊緣及腿之外部限界勾畫出。與僅具媒劑之 對照相比，兩種劑量之神經胚素增進來自缺金性後肢之肌 肉中之血管攝影計分（圖2)。該等結果表明，神經胚素投藥 誘發缺血性組織中之血管形成。 實例2 :神經胚素促進缺血後皮膚血流 為確定神經胚素治療是否增加缺血性組織（例如皮膚）中 之血流’如上所述將小鼠股骨動脈結紮。將大鼠神經胚素 (蛋白質之成熟U3個胺基酸之形式）以1 ^/“或" mg/kg，一週皮下投與3次歷時3週。作為對照，將一組小 鼠用媒劑單獨治療。 在7 14及21天，自缺血性後肢皮膚之小表面移除毛髮 且如（例如）HiSaka 等人（2004) j· Am. Cou. Cardi〇1 43(10):1915-22中所述’使用雷射多普勒（D〇ppler)灌注監 測來評估所暴露組織之血流。僅在爪中執行量測。在丨斗及 2 1天，偵測到用神經胚素治療之缺血性肢體中皮膚血液灌 注增加（圖3)。言亥等結果表曰月’神經胚素投藥使得缺血性組 織中之血流增加。 其他實施例 雖’’、：本毛明已結合其實施方式力口以描述’但上文描述欲 說明本發明且並非限制本發明之範疇，該範疇係由隨附申 請專利範圍之範疇界定。其他態樣' 優點及修改形式係在 以下申請專利範圍之範疇内。 【圖式簡單說明】 圖1為野生型人類（SEQ ID NO: 1 0)、小鼠（SEQ ID N〇: J J) 131199.doc -34- 200914040 及大鼠（SEQ ID NO: 12)前初神經胚素多肽之比對。左側及 右側垂線分別指示成熟i i 3胺基酸形式及丨〇4胺基酸形式之 起始。RRXR肝素結合基元係以加框表示。 圖2為描繪神經胚素投藥對小氣後肢中之缺血後血管形 成之效應的條形圖。γ軸對應於毛細血管密度，其經量測 為缺血性腿中之毛細血管數量與正常非缺血性腿比較之比 率。SEM係指標準誤差平均值。小於〇 〇5之口值（與媒劑 對照相比）由"*"指示。 圖3為描料經胚素投藥對缺企後皮膚&流之效應之條 形圖。Y軸指示如由缺血性腿巾之灌注與正f非缺血性腿 相比之比率來量測的血流。”SEM，，係指標準誤差平均值。 小於0·01之P值由” 指示，且小於〇〇〇1之卩值由指 示。 131199.doc -35· 200914040 序列表 <110>美商生物基因艾迪克MA公司 <120>增進血管形成之組合物及方法 <130> 13751-085WO1 <140> 097116137 <141> 2008-05-01 <150>IJS 60/915,29^ <151> 2007-05-01 <160> 12 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 113 <212> PRT <2]3>智人 <400> 1

Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys 1 5 10 15

Arg Leu Arg Ser Gin Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His 20 25 30

Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg 35 40 45

Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala 50 55 60

Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gin Pro Cys 65 70 75 80

Cys Arg Pro Thr Arg 丁yr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser 85 90 95

Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu 100 105 no

Gly <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成產生之肽 <400〉 2

Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys 15 10 15

Arg Leu Arg Ser Gin Leu Va! Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His 20 25 30

Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Scr Cys Glu 35 40 45

Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala 50 55 60

Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gin Pro Cys 65 70 75 80

Cys Arg Pro Thr Arg 丁yr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn $er 85 90 95

Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu 100 105 110

Gly <210> 3 <2Π> 113 <212> PRT <2丨3>人工序列 <220> <223>合成產生之肽 131199.doc 200914040 <400〉 3

Ala Gly Gly Pro Giy Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys 15 10 15

Arg Leu Arg Ser Gin Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His 20 25 30

Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg 35 40 45

Glu Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala 50 55 60

Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Scr Arg Prc Val Ser Gin Pro Cys 65 70 75 80

Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser 85 90 95

Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu 100 105 110

Gly <210> 4 <211> 113 <212> PRT <213>人工序列 <220>

<223>合成產生之肽 <400> 4

Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys 15 10 15

Arg Leu Arg Ser Gin Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His 20 25 30

Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg 35 40 45

Arg Ala Glu Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala 50 55 60

Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Va) Ser Gin Pro Cys 65 70 75 80

Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Va! Asn Ser 85 90 95

Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu 100 105 110

Gly <210> 5 <211> 113 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成產生之肽 <400〉 5

Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys 15 10 15

Arg Leu Arg Ser Gin Leu Val Fro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His 20 25 30

Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Scr Gly Scr Cys Glu 35 40 45

Glu Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala 50 55 60

Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gin Pro Cys 65 70 75 80

Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Va! Ser Phe Met Asp Val Asn Ser 85 90 95

Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu 100 105 110

Gly <210> 6 •2- 131199.doc 200914040 <211> 99 <212> PRT <2]3>人工序列 <220> <223>合成產生之肽 <400〉 6

Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gin Leu Va) Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu ] 5 ]〇 ]5

Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser 20 25 30

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Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Va] Ser Gin 50 55 60

Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val 65 70 75 80

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Cys Leu Gly

<2】0> 7 <211> 104 <212> PRT <2]3>人工序列 <220> <223>合成產生之肽 <400> 7

Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gin Leu Val Pro Val 15 10 15

Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg 20 25 30

Phe Cys Ser Gly Ser Cys Glu Glu Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser 35 40 45

Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser 50 55 60

Arg Pro Va) Ser Gin Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val 65 70 75 80

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Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly 100 <210> 8 <211> 113 <212> PRT <2〗3>人工序列 <220> <223>合成產生之肽 <400> 8

Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys 15 10 15

Arg Leu Arg Scr Gin Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His 20 25 30

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Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gin Pro Cys 65 70 75 80

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Gly 131199.doc 200914040 <210> 9 <211> 113 <212> PRT <2]3>人工序列 <220> <223>合成產生之肽 <400> 9

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Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gin Pro Cys 65 70 75 80

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Gly

<210> 10 <211> 220 <212> PRT <213>智人 <400> 10

Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp 15 10 15

Pro Arg Arg Gin Pro Ala Leu Trp Pru Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu 20 25 30

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Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu 130 135 140

Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser G\y Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro 145 150 155 160

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Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gin Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg 180 185 190

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Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly 210 215 220 <210> 11 <211> 224 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 11

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Pro Arg Trp Gin Ser Ala Trp Trp Pro Thr Leu Ala Val Leu Ala Leu 20 25 30

Leu Ser Cys Val Thr Glu Ala Ser Leu Asp Pro Met Ser Arg Ser Pro 4- 131199.doc 200914040 35 40 45

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Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro lie Ser Gin Pro Cys Cys 180 185 190

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Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly 210 215 220

<210> 12 <211> 224 <212> PRT <213>褐鼠 <400> 12

Met Glu Leu Gly Leu Gly Glu Pro Thr Ala Leu Ser His Cys Leu Arg 15 10 15

Pro Arg Trp Gin Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu 20 25 30

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Ala Ser Arg Asp Val Pro Ser Pro Val Leu Ala Pro Pro Thr Asp Tyr 50 55 60

Leu Pro Gly Gly His Thr Ala His Leu Cys Ser Glu Arg Thr Leu Arg 65 70 75 80

Pro Pro Pro Gin Ser Pro Gin Pro Ala Pro Pro Pro Pro Gly Pro Ala 85 90 95

Leu Gin Ser Pro Pro Ala Ala Leu Arg Gly Ala Arg Ala Ala Arg Ala 100 105 110

Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Ala Thr Asp Ala Arg Gly Cys Arg 115 120 125

Leu Arg Ser Gin Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His Ser 130 135 140

Ser Asp Glu Leu lie Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg 145 150 155 160

Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly 165 170 175

Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro lie Ser Gin Pro Cys Cys ISO 185 190

Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr 195 200 205

Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly 210 215 220 131199.doc

Claims (1)

1. 200914040 十、申請專利範圍： 1. 一種增進組織中血管形成之方法，該方法包含： 選擇組織中顯示血流減少或不足之哺乳動物；及 向該哺乳動物投與有效增進組織中血管形成之量的多 狀’其中該多肽包含與犯卩ID ΝΟ:1之胺基酸15-113至 v 80/〇 —致之胺基酸序列，且其中該多肽在二聚時與一 種包含GFRa3及RET之複合物結合。 2 ’如求項1之方法，其中該組織為缺血性組織。 3.如清求項2之方法’其中該缺血性組織為缺血性肌肉組 織。

   如求項1之方法’其中該哺乳動物之心臟顯示血流減 夕且该多肽之投與增進該心臟之血管形成。 如味求項1之方法，其中該哺乳動物已遭受中風，且由 於該中風而在該組織中顯示血流減少或不足。 士咕求項1之方法’其中該哺乳動物已遭受心肌梗塞， 且由於s亥心肌梗塞而在該組織中顯示血流減少或不足。 如喷求項1之方法，其中該哺乳動物具有冠狀動脈疾 病且由於該冠狀動脈疾病而在該組織中顯示血流減少 或不足。 8 士 口士主 Φ 用、項1之方法，其中該哺乳動物已接受移植器官， 且δ亥多狀之投與增進該移植器官中之血管形成。 9·如明求項8之方法，其中該移植器官為心臟。 1 〇_如明求項8之方法，其中該移植器官為皮膚。 U.如請求項1之方法，其中該嗜乳動物具有缺血性疾病。 131199.doc 200914040 12 ·如請求項 ".如請求項二：其中該哺乳動物具有心血管疾病。 中。 其中該組織位於該哺乳動物之肢體 14·如請求们2或13之方法，其中 15 ·如請求項 、 礼動物具有糖尿病。 方去，其中該組織包 16.如請求们 〜皮膚病變。 關。 八中該皮膚病變與糖尿病性潰瘍相 1 7.如請求項 潰瘍。、 其中該糖尿病性潰瘍為糖尿病性足 18·如請求項1-17中 動物投與以下之一進一步包含向該哺乳 或夕者·抗血栓劑、非神經胚素 (neuMastin)之增進血管形 一 目开/成之因子、降膽固醇劑、β阻 ^抗尚血壓劑或免疫抑制劑。 19 ^求，1·18中任—項之方法，其進-步包含確定是否 2〇·如請求項Η”任-項之方法 性投藥投與至該哺乳動物。 21·如請求項丨_19中任一項之方法 投藥投與至該哺乳動物。 22·如請求項卜19中任一項之方法 投藥投與至該哺乳動物。 23.如請求項丨·22中任一項之方法，其中該胺基酸序列與 SEQ ID N〇:l之胺基酸 15-113至少 90〇/〇—致。 24·如清求項丨_22中任一項之方法，其中該胺基酸序列與 增進血f形成已在投與該多肽後發生。 其中該多肽係經由全身 其中該多肽係經由皮下 其中該多肽係經由局部 131199.doc 200914040 SEQIDNO:l之胺基酸15-113至少95%—致。 25. 如請求項1-22中任一項之方法，其中該胺基酸序列與 SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸15-113至少98%—致。 26. 如請求項1-22中任一項之方法，其中該多肽包含SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸 15-113、SEQ ID NO:2之胺基酸 15-113、 SEQ ID NO:3 之胺基酸 15-113、SEQ ID NO:4 之胺基酸 一 15-113、SEQ ID NO:5之胺基酸 15-113、SEQ ID NO:8之 胺基酸15-113或SEQ ID NO:9之胺基酸15-113。 C; 27.如請求項1-22中任一項之方法，其中該多肽包含SEQ ID N0:l之胺基酸序列、SEQ ID NO:2之胺基酸序列、SEQ ID NO:3之胺基酸序列、SEQ ID NO:4之胺基酸序列、 SEQ ID NO:5之胺基酸序列、SEQ ID NO:8之胺基酸序列 或SEQIDN0:9之胺基酸序列。 28，如請求項1 _22中任一項之方法，其中該多肽包含SEQ ID NO:1之胺基酸10-113。 29·如請求項丨_28中任一項之方法，其中該哺乳動物未診斷 、 有神經學病症。 30·如請求項丨_29中任一項之方法，其中該哺乳動物未診斷 有眼晴病症。 3 1.如凊求項1 - 3 0中任一項之方法，其中該哺乳動物為人 類。 131199.doc 200914040 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（1)圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： (無元件符號說明） 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無） 131199.doc