TW200906433A - Therapeutic agent for acute hepatitis or prophylactic and/or therapeutic agent for fulminant hepatitis - Google Patents
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Description
200906433 九、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 白元A-Π作為有效成分 之預防及/或治療劑。 之急 本發明係關於含有脂蛋 性肝炎之治療或猛爆性肝炎 【先前技術】 肝臟係擔負合成身體靈' ^ 要之物質、排泄老廢物等對生 ^動而d目當重要的功能。具有此等功能之肝細胞若被 =、酒精、藥物等破壞,而在肝臟引起發炎 =下降_病’㈣肝炎。肝炎之症狀為呈現倦急感、 L不振、心想吐、發燒、黃疫等。肝炎發生在6個月 内者特別稱為急性肝炎(aeute hepatitis ),絲急性肝炎 之症狀顯現後8週内’由於高度之肝細胞功能障礙而引起 肝性昏迷(hepatic coma) II度以上之腦疾,且顯示凝血酶 原時間(prothnnnbintiine)侧以下的情形,則稱為猛爆 性肝炎(fulminant hepatitis)。 就猛爆性肝炎而言,由於肝細胞之破壞激烈且大量地 發生,結果會使肝細胞來不及增殖及再生,而使預後變得 極度不良。因此,儘早預知急性肝炎演變成猛爆性肝炎之 進展狀況、並快速地開始進行適當之處置是非常重要的。 曰本國之急性肝炎患者數目每年到達3 5萬人,其中 /秀變成猛爆性肝炎之患者數目據稱有數千人。 關於猛爆性肝炎之發病機制,一般認為與生體内之免 疫反應、以及肝局部之各種因素有密切相關,但關於其整 體情形則仍然不清楚。 5 320158 200906433 為了預知急性肝炎演變成猛爆性肝炎之進展狀況,必 須小心注意患者之自覺症狀、及藉由肝功能檢查而得之各 種異常值。 一般而言,從急性肝炎演變成猛爆性肝炎之過程係依 序進行者,首先因肝細胞被破壞而導致肝合成功能之降 低、繼而發生肝解毒代謝功能之降低。肝細胞之大量且激 烈之破壞會造成強烈倦怠感、食慾不振等自覺症狀,及丙 胺酸轉胺酶(alanine transaminase,亦即ALT)及天冬胺 酸轉胺酶(aspartate transaminase,亦即aST)等轉胺酶之 值與乳酸脫氩酶(lactate dehydrogenase,亦即LDH )值的 上升’同時發生黃疸症狀。另外,因為肝解毒代謝功能之 降低,而出現肝性昏迷I或II度之神經症狀,故對診斷而 -言,腦波檢查也相當重要。最近有報告提及對猛爆性肝炎 等肝炎症狀予以預測、診斷的組套及診斷標識(.專利文獻 〇。由於此等症狀之顯現、檢查結果、診斷技術之提升, 、而使得今日能以相當高之準確率預知急性肝炎演變成猛爆 性肝炎之情形。 急性肝炎之治療以靜養為基本,但在疾病進展時, 使用甘草素製劑等肝庇護劑進行對症療法。另外,關於』 性肝炎及猛爆性肝炎之治療劑方面,有提案使用例如W 丙胺酸、賴甘肽(glutathiGne )、鳥㈣(⑽腕此)1 之至少-種的藥劑(專利文獻2)、含有血小板活性因子余 抗劑之藥劑(專利文獻3)、含有似胰島素生長因子或^ 生物之藥劑(專利文獻4) #,但其效果皆不充分,q 320158 6 200906433 能達到貫用化。 關於猛爆ϋ肝炎之治療法,目前係採用血裝交換 =血液透析及其他對症療法。最近亦嘗試如肝臟移植: 療但其預期結果不良,據稱成功救命率為30%左右。 :外·,當病毒為原因時,抗病毒療法係嘗試例如使用干 、(^iterferon)之療法,但是,除了會有發燒、關節痛、 肌A ’甬自血球或血小板數減少、食慾下降、體重減少、 =二t腺功能異常、心肌障礙、糖尿病惡化、蛋白尿 專副作用外,在效果方面也不夠充分。 專利文獻2 專利文獻3 專利文獻4 【發明内容】 (發明欲解決之課題) 專利文獻1 :日本特開2008-17777號公報 曰本特開平5-221858號公報 曰本特開平7-304689號公報 曰本特開平9-143094號公報 在如此之狀況下,急切期盼開發出能預知急性肝炎演 變成猛爆性肝炎之進展情形,並藉由快速地開始進行治療 而防止猛爆性化,又即使是在猛爆性化後亦具有治療效 果’並且副作用少的急性肝炎之治療或猛爆性肝炎之預防 及/或治療劑。 (解決課題之方法) 本發明人等針對血液中之高密度脂蛋白祖(_ ΠΡ°Ρ她⑷成分㈣蛋白元Α_Π (apGlip〇protein A-II)對於生體所造成之作料行各種研究時,偶然地發 320158 7 200906433 現此脂蛋白元Α_π對於急崎炎之 預防及/或治療為有效,且益副作用。其& +目f性肝人4 覆研究,因而完成本發明基於此見解再加以重 之夺、Hi本發明係有關含有脂蛋白元Α_Π作為有效成分 ^ 火之治療或猛爆性肝炎之預防及/或治療劑。 本發明有效成分之脂蛋白元Α_π係高密度脂蛋白 皿:主要構成成分。職之化學組成之約%重量%為 蛋白貝,剩餘之約50重量%係以磷脂質與膽固醇酯 (ch〇lesterol ester )作為主體的月旨質成分。咖之蛋白成 ^中’脂蛋白元Α_Π之含量係僅次於赌蛋白元Μ的含 量’在蛋白成分整體中佔約2〇重量% 。 脂蛋白元m化學結構已相當清楚,係由77個胺 基酸構成之分子量約漏之聚胜肽(polypeptide)。通常, 血液中之HDL已知是由第6個殘基之半胱胺酸以雙硫鍵結 合成二聚物的結構而存在(The Upid V〇1.2, N〇.3 243_249 1991-4) 〇 5 $於脂蛋白元Α-Π在生理上之角色’雖有報告指出在 體外實驗中,脂蛋白元Α-ΙΙ係藉由與脂蛋白元A·〗交換而 活化肝脂酶(hepatic lipase )、抑制 LCAT( lecithin-ch〇lester〇1 acyltransferase,亦即卵磷脂膽固醇醯基轉移酶)活性,亦 有報告指出脂蛋白元A-Π係抑制因VIIa凝固因子所導致 之v凝固因子的活化,但是,關於脂蛋白元Α_π在體内所 扮演之角色仍不明確。 另外,有報告指出高脂血症患者具有血中脂蛋白元 320158 8 200906433 A-II濃度增加之傾向,而肝疾病(例如急性肝炎、慢性肝 火、肝硬化、肝癌等)患者則具有血中濃度降低之傾向(臨 床病理XXDC: 2, 135〜138 ( 1981 ))。然而,僅記載有肝 癌患者之脂蛋白m咸少的事實,而並無記載關於只要 對有罹患肝疾病(尤其是急性肝炎及猛爆性肝炎)之虞之 患者投予脂蛋hA_n即可治療或預防肝炎的敘述。、 關於本發明有效成分的脂蛋白元A_II的調製,可從人 類血漿中藉由通常之蛋白質分離精製手段而單離,亦可藉 由使用生物之基因重組技術而生產。例如,日本特^ =89號公報中揭示:可藉由將編碼腊蛋白元八 .=殖入大腸桿菌、枯草桿菌⑽- 等真:生物:Μ——)等原核生物細胞及酵母 ==胞中而製成基因重組細胞,並將此 胞予以培養,而得以製造脂蛋白元Α_Π。 產者二白二A_I1,不論是動物體内或動物細胞所生 分缺失IS冓^ 成的改質體以及= =修飾為其他胺基酸而 者,皆可使用料脂蛋^肝炎或猛爆性肝炎之效果 1成例如以還原膠電泳又而:-要疋精 可,不需限定精製法或原材不壬早一色卞之程度者即 製造脂蛋白元' 其衍生物中分離、精製 代表例可列舉如從人類血漿或 衣 法(例如 Analytical Biochemistiy 320158 9 200906433 178, 301-305 ( 1989 ))、或使用基因重組技術而製造之方法 等。人類血漿之衍生物可列舉例如人類血漿之以柯恩低溫 乙醇區分法(Cohn cold ethanol fractionation )所得之沉殿 區分IV-1、或以使用Kistler and Nitschmann之低溫乙醇區 分法所得之沉澱區分B等。 其次,關於從人類血漿或衍生之人類血漿區分來製造 脂蛋白元A-II的具體方法,例如有下述之方法。 首先,將含有脂蛋白元A-II之人類血漿或衍生之人類 血漿區分在低溫(例如l〇°C以下)下溶解於緩衝液中。接 著,添加例如乙醇/氯仿溶液並混合,再進行離心分離,去 除下層之脂質成分,回收上清液之蛋白質成分。對回收之 上清液添加乙醇,進行離心分離,將沉澱之高分子蛋白質 去除,回收上清液。進一步,對回收之上清液再次添加乙 醇,進行離心分離,將沉澱之脂蛋白元A-Ι去除,回收含 有脂蛋白元A-II之上清液。將含有脂蛋白元A-II之上清 液在氯化鈉溶液中進行超過濾(ultrafiltration)而去除乙 醇。然後,在構酸緩衝液中進行超過滤,予以濃縮至適當 之濃度。對脫脂不充分之經精製之脂蛋白元A-II ’可添加 乙醇/氯仿溶液並混合,再進行離心分離去除下層之脂質成 分。上清液之脂蛋白元A-II係以上述相同之方法進行超過 濾,去除乙醇後予以濃縮至適當之濃度。藉由如上之操作 可獲得精製之脂蛋白元A-II。 關於脂蛋白元A-II製法之其他較佳例可例舉如使用 基因重組技術之方法。 10 320158 200906433 猎由基因重組技術製造脂蛋白元A-II之方法,首先係 從基因庫(DNA library )獲得編碼人類脂蛋白元A_n基因 之cDNA,再使用適當之引子(primer )擴增基因,而獲得 編碼脂蛋白元A-II之聚核普酸。將該聚核聲酸插入至選殖^ 載體(cloning vector)中並進行選殖後,將編碼脂蛋白元 A-II之聚核苷酸切出,依據本身為周知之方法插入至適當 之表現載體(expression vector )中。將此表現載體導入至 適當之宿主細胞(例如大腸桿菌、枯草桿菌等原核細胞或 酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等真核細胞)中進行轉形 (transformation ),從此轉形細胞之培養物中藉由單離、 精製,而可取得脂蛋白元A-Π。 ' 就宿主細胞而言’較佳例可列舉如短芽孢桿菌似 )等細菌類、裂殖酵母菌( 等酵母菌類。 當從桿菌()屬菌等微生物藉由基因重組技術 生產脂蛋白元A-Π時,係將編碼脂蛋白元A-II之聚核苷 酸予以重組至具有可在微生物中表現之起點(origin )、啟 動子(promoter )、核糖體結合部位、DNA選殖部位、終 結子(terminator )等之載體而作成之表現載體。將此表現 載體轉殖至宿主細胞,培養所得之轉形體,從此培養物針 對目的蛋白質進行單離、精製,而可獲得脂蛋白元A-Π。 此時,若在任意之轉譯區(translated region)之前後處附 加起始密碼子(initiator codon )與終結密碼子(terminator codon )並使其表現,則可獲得含有任意區域之蛋白質片 11 320158 200906433 段。或者亦可輿其他蛋白質形成融合蛋白質( protein )而表現。藉由將此融合蛋白質以適當之蛋白 斷而可取得重組之脂蛋白元Α_π。 、含Τ脂蛋白元Α-ΙΙ之製劑可列舉如水溶液、懸浮劑、 凍結乾燥劑等,此等之製劑化可適當地混合醫藥上容許之 添加劑(稀釋劑、ρΗ調整劑、等張化劑、界面活算 並藉由製劑上常用方法而進行。另外 、 逆盯为外,凍結乾刼製劑可在 使科轉於注射用蒸財等之溶解液中而使用。 將重組之脂蛋白元Α_π以真核細 rg, nt - A ττ " 產 $,,、要將編 碼月曰蛋白凡^之聚核苦酸插入至具有啟動子、剪接區域 載ΓΠΓ::1。11)、聚(A)加成部位等之真核細胞用表現 載體中作成重組載體’將此載體導入至真核細胞内,再從 其培養物中單離、精萝出目的 一 ,料出目的蛋白質即可。就真核細胞而 二一等翁可^*子腎臟細胞C0S7、中國倉鼠印巢細胞 ^摘物培養細胞、出芽酵母菌、分裂酵母菌、家 蠶(⑽bxmorO細胞、非洲爪蟾卵細胞等,只 現重組之脂蛋白元Α·η者即可 疋 矣招普挪道 ^ 種真核細胞均可。將 ,, υ守 可使用電穿孔 =leCtr〇P〇rati〇n)法、磷酸料、核糖體法、DEAE聚葡 萄糖(DEAE-dextran )法等周知方法。 使重組之腊蛋白元A-Π於直仿& 德,A 了 w +立甚。 、/、核、,田胞或原核細胞表現 後為了伙培養物中单離精製出 夕八轴:p a ,, 变曰買可組合周知 之刀離刼作。例如,可列舉如: 虛理匈而、* 稭由尿素專變性劑或界面 處理劑而進狀處理、超音 醇素沩化、鹽析或溶 320158 12 200906433 媒沉澱法、透析、離心分離、超過濾、凝膠過濾、 SDS-PAGE、等電點電泳、離子交換層析、疏水性層析、 親和層析(affinity chromatography )、逆相層析等。 另外,宿主細胞表現之蛋白質在轉譯後於細胞内可能 有=到各種修飾之情形。因此,在本發明中所使用之重組 之脂蛋白元a-π亦包含受到N末端甲硫胺酸脫離、n末端 乙醯化、糖鏈加成、藉細胞内蛋白酶而進行之限定分解、 肉豆蔻醯化(mydSt〇ylatiGn )、異紅職(isGpmiyiati〇n )、 磷酸化等轉譯後修飾的蛋白質。 如此獲得之脂蛋白元越幾乎不含夾雜物。另外,可 筚:理:上令許之擔體均一地混合而製劑化。擔體可根據 越史予型態而從廣泛之範圍適當選擇。視需要,可與 :、胺基敲、有機酸、糖醇、蛋白素(albumin)等 夕元醇等適當之安定化劑一起保存。 、 口,:發Γ之樂劑投予路徑並不特別限定為經口、非經 ,但以靜脈注射、肌肉注射、 經口投予為佳,尤以靜 / 注射等非 只要依據常法將精製之脂蛋劑, 件下與注射用蒸鶴水混合即可 於無菌條 等張化劑、安定劑等為# ^以適篁调配緩衝劑、 檬酸鈉、氣化鈉τ、7。就具體例而言,以磷酸鈉、檸 乳化納、L-麵胺酸等為適當。 關於本發明急性肝炎人 或治療劑的投予量,# 療或猛爆性肝炎之預防及/ 為充足之量,_i U其對施用對象發揮效果而設定 !仁依據劑型、投予方法、每一天之投予次數、 320158 13 200906433 症狀之程度、體重、 進行靜脈内投予時, l〇〇〇mg/kg,較佳為 至3次分別投予。 年齡等而可適當地增減。當對於成人 就脂蛋白元Α_π而言,通常為約1至 3至50〇mg/kg。可將此量以1天1次 (發明之效果) 毛月的急性肝炎之治療或猛爆性肝炎之預防及/或 作為有效成分,_= 肝炎之預防及/或治有錢進仃急性肝炎之治療或猛爆性 【實施方式】 實施列舉實施例及實驗例來具體說明本發明 將經過實質性地去除肝炎病毒以 的人類血漿作為原料,、他扃原微生物 而獲得區分ΠΜ。在^代水柯恩低溫乙醇區分法 在2至8 C之低溫室中,#兮p八 .kg溶解於含有1〇〇mM三(經基 刀- 6M尿素的pH值經調 :▲胺基甲燒與 ^添加與溶解液等量之乙醇 更進 以12_g、4t、雜ϊλ之乙知/乳仿洛液〇:1)並混合, C離心10分鐘進行分離,回收卜、主^ 白λ成分。相對於回收之上 ,月液之蛋 4」L,以12_g、4t添加].2倍量之乙醇 液6.8L。更進_ 、=IG分鐘進行分離,回收上清 離心10分鐘進行分離,回收 320158 14 200906433 含有脂蛋白元A-II之上清液12L。將含有脂蛋白元A-II 之上清液使用區分分子量為10000之超過濾膜(Pall公司 製),藉由注入120L之150mM氯化鈉溶液並進行超過濾 而去除乙醇。接著,藉由注入20L之含有150mM氯化鈉 的20mM磷酸緩衝液(pH7)並進行超過濾,達到溶液之 置換。然後,藉由超過滤而實施濃縮’直至脂蛋白元A-II 成為4mg/mL為止。 其次,添加與脂蛋白元A-Π濃縮液500mL等量之乙 : 醇/氯仿溶液(1 : 1 )並混合,以12000g、4°C、離心10 分鐘進行分離,去除下層而回收上清液75OmL。將上清液 使用區分分子量為10000之超過濾膜(Millipore公司製), 藉由注入25L之15OmM氯化納溶液並進行超過濾而去除 乙醇。接著,藉由注入20L之含有150mM氯化納的20mM 磷酸緩衝液(pH7)並進行超過濾,達到溶液之置換。接 著進行濃縮,直至變成含有22mg/mL之脂蛋白元A-Π為 止。然後,使用孔徑0.22 /z m之無菌過濾器(Millipore公 i 司製)進行無菌過濾,而獲得脂蛋白元A_II製劑。 將脂蛋白元A-Π製劑進行分析,結果如表1所示。 [表1] 脂蛋白元含量(mg/mL ) 21.5 pH值 7.3 滲透壓比率 1.0 内毒素含量(EU/mL) 0.2 構脂質含量(mg/mL) 0.6 性狀 呈現淡黃色之透明液 乙醇濃度(% ) 0.01 如此獲得之製劑可直接作為注射液使用。 15 320158 200906433 實施例2 (1)基因重組之脂蛋白元A-II之表現載體的調製 脂蛋白元A-Π基因係以人類肝臟cDNA基因庫 (TAKARA生物公司製,製品號碼9505 )作為模板 (template ),藉由PCR法而選瘦。此時,前置引子(forward primer )係設為以序列表之序列號碼1所示者,反置引子 (reverse primer )係設為以序列表之序列號碼2所示者。 所得之PCR片段係藉由使用 TOPO TA選殖工具組 (Invitrogen公司製)之TA選殖法而選殖於pCR2.1載體 (Invitrogen 公司製)。 (2 )使用短芽孢桿菌(万△rgvzi )盤作脂蛋白元A-II 表現株 使用含有所得之脂蛋白元A-II基因的載體,將短芽孢 桿菌(万)進行轉形而建構表現株。建構表現 株之方法係依據日本專利公報第3734593號所記載之方法 實施。 首先,依據該專利之實施例1之方法建構質體載體 (plasmid vector ),繼而插入人類脂蛋白元A-II基因而建 構質體載體。接著,依據該專利之實施例5所示之方法, 將短芽孢桿菌H102 (FERM BP-1087 )以電穿孔法進行轉 形。 (3)將此轉形體以TMN培養基於30°C培養3天後,將培 16 320158 200906433 養液離心分離,收集上清液,而獲得培養上清液 為了確認所得之脂蛋白元A-Π之胺基酸序列,將 pCR2.1載體上之鹼基序列以model 3100 DNA定序儀(ABI 公司製)分析,轉換成胺基酸時,可獲得以序列表之序列 號碼3所示者。 此胺基酸序列係與 Swiss-Prot Protein Knowledgebase 所記載之人類脂蛋白元A-II (Primary accession number P02652 )之成熟蛋白質部分為相同之序列。 實施例3 從基因重組之人類脂蛋白元A-II之表現株(短芽孢桿菌) 的培養上清液調製含有脂蛋白元A-Π之製劑 將能夠表現、分泌人類脂蛋白元A-Π之短芽孢桿菌的 培養上清液與含有1M氯化納之20mM鱗酸缓衝液(pH6.6 至7.0 )等量混合,經攪拌後藉由0.45 // m之過濾器 (Millipore公司製)去除沉澱物。將此濾液擔持在預先以 含有0.5M氯化鈉之20mM磷酸缓衝液(pH6.8至7.4)平 衡化的His trap FF ( GE Healthcare公司製)管柱上。其次, 使用與平衡化相同之溶液進行洗淨,再以含有0.5M氯化 鈉及40mM咪唑之20mM磷酸緩衝液(pH7.0至7.5)進行 洗淨。最後,以含有0.5M氣化納及500mM蜂11坐之2〇mM 填酸缓衝液(pH7.0至7.5 )進行His trap FF吸附區分之溶 析。將His trap FF吸附區分之溶析液使用區分分子量為 10000之離心式超過滤膜(Millipore公司製)’藉由注入含 17 320158 200906433 有1 5OmM氯化納之20mM填酸緩衝液實施超過滤而進行 溶液之置換。然後,藉由超過濾實施濃縮,直至含有 13mg/mL之脂蛋白元A-Π為止。繼而,使用孔徑0.22 // m 之無菌過濾器(Millipore公司製)進行無菌過濾,而製得 脂蛋白元A-II製劑。 實施例4 以與實施例3相同之操作方法實施His trap FF管柱區 分,將所得之溶析液使用區分分子量為5000之離心式超過 濾膜(Millipore公司製),藉由注入含有3M尿素及0.5M 氯化鈉之3.3mM磷酸缓衝液(pH6.8至7.4)實施超過濾 而進行溶液之置換。將此含有脂蛋白元A-II之區分擔持在 預先以含有3M尿素及0.5M氯化鈉之3.3mM磷酸緩衝液 (pH6.8 至 7.4 )平衡 4匕的 Macro-prep ceramic hydroxy apatite TypeI40 // m ( BioRad公司製)管柱上,回收直接通 過之區分。 其次’將此通過之區分使用區分分子置為5 0 0 0之離 心式超過濾·膜(Millipore公司製),藉由注入含有150mM 氯化鈉之20mM磷酸缓衝液實施超過濾而進行溶液之置 換。然後藉由超過濾實施濃縮,直至含有脂蛋白元A-II 2mg/mL為止。繼而,使用孔徑0.22 /z m之無菌過遽器 (Millipore公司製)進行無菌過濾,而製得脂蛋白元A-II 製劑。 18 320158 200906433 實施例5 SDS-聚丙嬌醯胺凝膠電泳分析(SDS-PAGE) 將實施例1與實施例4所得之脂蛋白元A-II製劑調整 至具有相同〇D280nm之吸光度的濃度。將本樣品作為非 還原樣品。另外,將本樣品以30mg/mL之DTT (和光純藥 公司製)進行處理,作為還原樣品。對於非還原樣品及還 原樣品,以SDS-聚丙烯醯胺15%均一凝膠進行電泳。其 結果如第1圖所示。 西方墨•點 >去(western blotting ) 對於實施例1與實施例4所得之脂蛋白元A-II製劑調 整至具有相同〇D280nm之吸光度的濃度。將此樣品在進 行SDS-PAGE分析後將凝膠上之蛋白質轉印至PVDF膜 (ATT0公司製),使用山羊抗人類脂蛋白元A-II多株抗體 (SANTACRUZ BIOTECHNOLOGY 公司製)進行一次反 應。其次,使用經HRP標示之兔子的抗山羊免疫球蛋白抗 體(DAK0公司製)進行二次反應,並藉由DAB法使其發 色。其結果如第2圖所示。 如第1圖及第2圖所示,經SDS-PAGE染色之蛋白質 顯示,實施例1之製劑及實施例4之製劑對於抗人類脂蛋 白元A-II抗體均產生反應,故可確認兩者係具有同等之抗 原性。另外,在還原電泳圖中為單一色帶。 又,若將第1圖及第2圖中之實施例1製劑與實施例 4製劑的色帶位置加以比較,則可確認到實施例4之製劑 係位於分子量較大之位置。此係由於增加了附在重組體上 19 320158 200906433 之His-Tag的分子量(6個組胺酸)之故。 實施例6 為了比較實施例1及實施例4所製作之製劑,而作成 胜肽圖(peptide map)進行檢討。 將製劑分別稀釋至脂蛋白元A-Π之含量為200 # g/mL 之溶液,取20/i L分別添加樣品緩衝液(350mM Tris-HC卜 ρΗ6·8、30% 甘油、10% SDS、0.3% BPB、30% 之 2-疏基乙 醇)4/z L,於l〇〇°C處理5分鐘後進行SDS-PAGE分析, 再進行 CBB 染色(PhastGol Blue R,Amer sham Bio sciences 公司製)。 經電泳凝膠分析後,使用lOkDa附近之條帶的全量, 依據下述方法進行膠内消化。 使用切刀切斷凝膠使其成為1 mmx 1 mm左右,在1 mL 之精製水中攪拌、洗淨(20分鐘x2次)。其次,在含有50 之 7M 胍(guanidine)及 10mM 之 EDTA 的 0.5M Tris-HCl緩衝液(pH8.5)中攪拌、洗淨(30分鐘)後, 於含有lmL之50%乙腈及ImM之EDTA的50mM磷酸緩 衝液(pH7.8)中攪拌、洗淨(20分鐘x2次)。更進一步, 在lmL之乙腈中攪拌、洗淨(5分鐘)後,以真空離心濃 縮機(SpeedVac )使凝膠乾固。於乾固之凝膠中,添加10 溶解有内切蛋白酶 Glu-C ( endoproteinase Glu-C ) (V8)之含有2mM EDTA的100mM磷酸缓衝液(pH7.8) (酵素:基質=1 : 10 )。在冰上靜置1小時而使凝膠膨潤 20 320158 200906433 後,添加20至60 " L含有2mM EDTA的1 OOmM鱗酸緩衝 液(pH7.8 )以滲透凝膠,於25°C進行24小時消化。消化 後,以真空離心濃縮機(SpeedVac)進行濃縮至使全量成 為50 // L以下為止。 在經濃縮試料中添加0.1%三氟乙酸而使其成為55/z L,使用其中之50/z L,以下述之條件進行HPLC分析。 HPLC倏件 裝置:LC-lOAvp系統(島津製作所製) 管柱:218TP54 ( 4.6mmI.D.x25cm,Vydac 公司製) 管柱溫度:4(TC 流速· lmL/min 檢測波長:215nm 移動相A : 0.1%三氟乙酸 移動相B : 0.1%三氟乙酸/80%乙腈 梯度條件:0/0—0/5— 75/55— 100/65— 100/75— 0/85 — 0/90 ( % B/分鐘) 實施例1製劑之胜肽圖的結果示於第3圖,實施例4 製劑之胜肽圖的結果示於第4圖。結果顯示,實施例1及 實施例4所調製之製劑除了 His-tag之部分外,顯示相同 之胜肽圖,由此可確認實施例1與實施例4之製劑為同質 物。 21 320158 200906433 實施例7
人類脂蛋白元Α_Π基因係 序列表之序列號碼4所示者。 以人工合成。其鹼基序列如 將所得之人類脂蛋白元純基因插入至表現載體 ΡΤ^Μ5(東田英毅,酵素工學新聞第57號,2〇们年4月) 之夕重選殖位(multiple e丨Gning site ),建構誘導型表現用 載體使用此誘導型表現用載體及白胺酸需求性之互補載 體pAL7,將裂殖酵母菌⑽卿町⑽户⑽心) ATCC38399依據岡崎等人(此池et al , Lc
Res. , 18, 6485-6489, 1990)之方法進行轉形,而建構表現 株。將此表現株在含# G418之液體培養基YELGl〇 (〇5 %細菌培養用酵母萃取物、3%葡萄糖、1〇Ag/mL2G4l8) 5mL中,於32〇C培養7天。將此培養液在YPDG1〇〇 (〇 5 %細菌培養用酵母萃取物、2%細菌培養用蛋白腺、找葡 萄糖、100/zg/mL之G418) 5mL中於3rc培養7天後, 再以離心分離分開菌體與上清液,並回收菌體。將菌體試 料懸浮於〇.8mL之菌體破碎緩衝液(5〇in]V[ Tris-HCL· pH7. 5、0.1M氯化納、蛋白酶抑制劑(R〇che公司製乃後,於 其中放入同容量之破璃珠,以破碎機進行4次破碎,藉此 而調製菌體破碎液。將此菌體破碎液離心分離,回收含有 脂蛋白元A-II之上清液。脂蛋白元Α_π之表現量為2nlg/L。 22 320158 200906433 實施例8 從基因重組之人類脂蛋白元A-II表現株(裂殖酵母菌)培 養菌體來調製脂蛋白元A-Π製劑 將實施例7所製作之表現株在YPDG100培養基(1% 酵母萃取物、2%蛋白脒、2%葡萄糖、0.1mg/mL之G418) 3 OOmL中進行培養。使用3台迷你缸式發酵槽(mini j ar fermenter),於30°C進行培養66小時,而獲得總量14.4g (濕重量)的菌體。將從每台迷你缸式發酵槽回收之菌體 予以懸浮於約16至17mL之破碎緩衝液(50mM Tris-HC卜 pH7. 5、0.1M氣化鈉、蛋白酶抑制劑(Roche公司製)), 一面攪拌,一面添加緩衝液稀釋調製成20mL之菌體懸浮 液。接著,在調製之20mL之各菌體懸浮液中,放入同容 量之玻璃珠(直徑〇.5mnl ),以破碎機進行4次破碎 (2500rpm/60秒破碎),回收13mL之菌體破碎液。將殘餘 的附著於玻璃珠之粉碎菌體重新再以5mL之破碎緩衝液 清洗,將此清洗液加入先前之菌體破碎液中。將其以5000g 進行離心分離10分鐘,收集上清液。脂蛋白元A-II之表 現量為2mg/L。 對於調製之上清液,使用下述2種類之His-Tag管柱 進行精製。首先,將上清液54mL擔持在20mL之TALON Single Step Column ( Clontech 公司製)上,以含有 500mM 啼α坐之溶析緩衝液2mL進行溶析。將此溶析液以D W稀釋 3 倍後,擔持於 0.6mL 之 His Spin Trap Column ( GE Healthcare公司製)上,以含有500mM °米°坐之溶析緩衝液 23 320158 200906433 0.2mL·進行溶析。 其夂,使用〇.5mL之高速離心過濾管柱VIVA spiN5〇〇 (Sartorms公司製)將溶析液予以濃縮及實施pBs緩衝液 父換(PH7.5),而獲得含有脂蛋白元Α_π之製劑。 實施例9 動物實驗1 準備7週齡之雄性Balb/c小鼠(Charles River公司製) 22隻供貫驗用。對其中之8隻,將實施例^所調製之脂蛋 白元A II以4mg/kg之劑量以靜脈投予方式進行單次投予 (A-Π投予群)。10分鐘後,對Α_π投予群之8隻小鼠盘 其他8 f小鼠(對照群)共計16隻’將半乳胺糖鹽酸鹽 (Slgma公司製)700mg/kg與脂多醣(e — 〇⑴,,
Sigma公司製)5〇# g/kg之猛爆性肝炎致病藥劑進行單次 投予於腹腔内。另一方而,肱去机三τ 面將未奴予月曰蛋白元A-II及猛爆 性肝炎致病藥劑的小鼠6隻作為正常群。 在投予脂蛋白元A_n製劑6小時後,於二氧化碳氣體 麻醉下從腹部大動脈採血而獲得血清。測定此血清中之作 為肝功能障礙之指標的丙胺酸轉胺酶(alt)及天冬胺酸 轉胺酶(AST)’分別計算出平均值土標準誤差。从丁及AST 相關之統計學解析,係針對對照群_於正常群之發病、 =A-Π投予群相對於對照群之縣,分料行學檢 定(Student’s t-test)(以 Micr〇s〇n 公司製之軟體 = 行)。 320158 24 200906433 結果如表2所示。 [表2] 實施例1之A-II (4mg/kg)投予群 對照群 正常群 ALT (IU/L) 1053±455* 2896+862## 51+4 AST (IU/L ) 339±99* 698±189## 73+5 * :相對於對照群,p<〇.〇5 ## :相對於正常群,p< 0.01 如表2所示,就對照群而言,將其與正常群比較即可 確認其血中之ALT及AST顯著地上升。然而,在對照群 可確認到的肝功能之高度障礙,在A-Π投予群則被明顯地 抑制。依據此實驗,可嫁認到脂蛋白元A-Π製劑的猛爆性 肝炎之預防效果。在A-II製劑投予群中,未見可能是因 A-II製劑投予而產生之副作用。 實施例10 動物實驗2 準備7週齡之雌性Balb/c小鼠(Charles River公司製) 18隻供實驗用。對其中之8隻,將實施例3所調製之脂蛋 白元A-II以3mg/kg之劑量進行單次靜脈内投予(A-II投 予群)。10分鐘後,對A-II投予群之8隻小鼠與其他6隻 小鼠(對照群)共計14隻,將作為猛爆性肝炎致病劑之伴 25 320158 200906433 刀豆球蛋白 A TypelV ( concanavalin A TypelV ) ( Sigma 公 司製)以15mg/kg之劑量進行單次靜脈内投予。另外,將 既未投予脂蛋白元A-Π製劑、亦未投予伴刀豆球蛋白A的 小鼠4隻作為正常群。 在投予脂蛋白元A-Π製劑8小時後,於二氧化碳氣體 麻醉下從腹部大動脈採血而獲得血清。測定此血清中之作 為肝功能障礙之指標的丙胺酸轉胺酶(ALT )及天冬胺酸 轉胺酶(AST),分別計算出平均值±標準誤差。ALT及AST 相關之統計學解析,係針對對照群相對於正常群之發病、 與A-II投予群相對於對照群之效果,分別進行學生之t檢 定(以Micro sort公司製之軟體Excel進行)。 結果如表3所示。 [表3] 貫施例3之A-II (3mg/kg)投予群 對照群 正常群 ALT (IU/L ) 785+377* 3388±1156# 33±2 AST (IU/L) 668+234* 2450±750# 64±2 * :相對於對照群,p< 0.05 # :相對於正常群,p< 0.05 如表3所示,就對照群而言,將其與正常群比較即可 確認其血中之ALT及AST顯著地上升。然而,在對照群 可確認到的肝功能之高度障礙,在A-Π投予群則被明顯地 26 320158 200906433 抑,依據此實驗,可確認到脂蛋白元Α_π製劑的猛爆性 肝炎之預防效果。纟Α-ΙΙ製劑投予群中,未見可能是因 Α_ΙΙ製劑投予而產生之副作用。 實施例11 準備7週齡之雌性Baib/C小氣(charies River公司製) 18又供實驗用。對其中之8隻,將實施例3所調製之脂蛋 t兀A-II以13mg/kg之劑量進行單次靜脈内投予(m 杈予群)。1〇分鐘後,對Α_π投予群之8隻小鼠與其他6 隻小鼠(對照群)共計14隻,將作為猛爆性肝炎致病劑之 =刀=蛋白ATypeIV⑶啊公司製)以15邮~之劑 置進行單次靜脈内投予。另外,將既未投予脂蛋白元㈣ 製劑、亦未投予猛爆性肝炎致病劑的小鼠4隻作為正常群。 在投予脂蛋白元A - II製齊J 8小時後,於二氧化碳氣體 ί麻醉下從腹部大動脈採血而獲得血清。測定此血清中之作 為肝功能障礙之指標的丙胺酸轉胺酶(ALT)及天冬胺酸 轉鞍酶(AST)’分別計算出平均值土標準誤差。紅丁及 相關之統計學解析,係針對對照群相對於正常群之發病、 ^ A-Π投^群相對於對照群之效果,分別進行學生之{檢 定(以Microsort公司製之軟體Excel進行)。 欢 結果如表4所示。 320158 27 200906433 [表4] 實施例3之A-II (13mg/kg)投予群 對照群 正常群 ALT (IU/L) 214+33* 3388土1156# 33±2 AST (IU/L) 332+28* 2450±760# 64±4 * :相對於對照群,p< 0.05 # :相對於正常群,p< 0.05 如表4所示,就對照群而言,將其與正常群比較即可 確認其血中之ALT及AST顯著地上升。然而,在對照群 可確認到的肝功能之高度障礙,在脂蛋白元A-Π製劑投予 群則被明顯地抑制。依據此實驗,可確認到脂蛋白元A_II 製劑的猛爆性肝炎之預防效果。在A-II製劑投予群中,未 見可能是因A-II製劑投予而產生之副作用。 實施例12 動物實驗4 準備8週齡之雄性Balb/c小鼠(Charles River公司製) 16隻供實驗用。對其中之4隻,將實施例1所調製之脂蛋 白元A-II以300mg/kg之劑量進行單次靜脈内投予(A-II 投予群)。10分鐘後,對A-II投予群之4隻小鼠與其他6 隻小鼠(對照群)共計10隻,將作為猛爆性肝炎致病劑之 Fas 抗體(Becton Dick inson 公司製)以 200 // g/kg 之劑量 進行單次靜脈内投予。將既未投予脂蛋白元A-II製劑、亦 28 320158
I 200906433 未投予Fas抗體的小鼠6隻作為正常群。 在投予脂蛋白元A-Π製劑4小時後,於二氧化碳氣體 麻醉下從腹部大動脈採血而獲得血清。測定此血清中之作 為肝功能障礙之指標的丙.胺酸轉胺酶(ALT )及天冬胺酸 轉胺酶(AST),分別計算出平均值±標準誤差。ALT及AST 相關之統計學解析,係針對對照群相對於正常群之發病、 與A-II投予群相對於對照群之效果,分別進行學生之t檢 定(以Micro sort公司製之軟體Excel進行)。 結果如表5所示。 [表5] 實施例1之A-II (300mg/kg)投予群 對照群 正常群 ALT ( IU/L ) 1433±687** 21199±3389## 58+7 AST (IU/L) 769±226** 5567±878## 59+3 :相對於對照群,p< 0.01 ## :相對於正常群,p< 0.01 如表5所示,就對照群而言,將其與正常群比較即可 確認其血中之ALT及AST顯著地上升。然而,在對照群 可確認到的肝功能之高度障礙,在脂蛋白元A-II製劑投予 群則被明顯地抑制。依據此實驗,可確認到脂蛋白元A-II 製劑的猛爆性肝炎之預防效果。在A-II製劑投予群中,未 見可能是因A-II製劑投予而產生之副作用。 29 320158 200906433 實施例13 動物實驗i 準備7週齡之雌性Baib/C小鼠(ChaHes Riyer公司製) 32隻供實驗用。 -對其中之2 1隻’將伴刀豆球蛋白Α τ·ίν (⑴興 :司衣)以I5mg/kg之用量進行單次靜脈内投予,並不施 订任何處置,而製作猛爆性肝炎表現之肝 對於肝障礙模型小g丨〇隹产仏 ^ 吴! J乳10隻,在伴刀豆球蛋白A投予1小 日T後’將實施例1所調製之脂IΛ 南丨景、隹—α 曰蛋白70 Α-11以100m—g之
月! 1進灯早次靜脈内投予(A 丁 投予群)。對於剩餘之肝 I1早礙拉型小鼠11隻,則不将早一 、不奴予月曰蛋白疋A-II (對日g群)。 將既未投予伴刀豆球蛋白A、亦夫浐早日& … ^ ^ 尤㈡八亦未技予脂蛋白元A-II的小 鼠U隻作為正常群。 在投予脂蛋白元純製劑24小時後,於二氧化碳氣 脸麻醉下從腹部大動脈採血而獲得血清。測定此血清中之 作為肝功能障礙之指標的丙胺酸轉胺酶(alt)及天 酸轉胺酶(AST ),分κ丨丨士+管,τ & 、 ^」刀別5十异出平均值±標準誤差。ALT及 AST相關之統計學解析,係針對對照群相對於 病 '與Α·ΠΗ群相對於對照群之效果,分別進行=生: t檢定(以塗⑽細公司製之軟體Εχ(^進行)。 結果如表6所示。 320158 30 200906433 [表6] 實施例1之A-II (100mg/kg)投予群 對照群 正常群 ALT ( IU/L ) 2387+635* 6582±1598## 33+2 AST (IU/L) 1854±406* 4202±968## 58±2 :相對於對照群,p< 0.05 ## :相對於正常群,p< 0.01 如表6所示,就對照群而言,將其與正常群比較即可 確認到ALT及AST係上升。然而,在對照群可確認到的 肝功能之高度障礙,在脂蛋白元A-Π製劑投予群則被明顯 地抑制。依據此實驗,可確認到脂蛋白元A-Π製劑對猛爆 性肝炎之治療效果。在A-Π製劑投予群中,未見可能是因 A-Π製劑投予而產生之副作用。 實施例14 物實驗6 準備7週齡之雌性Balb/c小鼠(Charles River公司製) 32隻供實驗用。 對其中之.21隻,將伴刀豆球蛋白A TypelV ( Sigma 公司製)以15mg/kg之用量進行單次靜脈内投予,並不施 行任何處置’而製作猛爆性肝炎表現之肝障礙模型小鼠。 對於肝障礙模型小鼠10隻,在伴刀豆球蛋白A投予1小 時後’將實施例1所調製之脂蛋白元A-II以500mg/kg之 31 320158 200906433 劑量進行單次靜脈内投予(A-II投予群)。對於剩餘之肝 障礙模型小鼠Π隻,則不投予脂蛋白元A-Π (對照群)。 將既未投予伴刀豆球蛋白A、亦未投予脂蛋白元a-π的小 鼠11隻作為正常群。 在投予脂蛋白元A-Π製劑24小時後,於二氧化碳氣 體麻醉下從腹部大動脈採血而獲得血清。測定此血清中之 作為肝功能障礙之指標的丙胺酸轉胺酶(ALT )及天冬胺 酸轉胺酶(AST) ’分別計算出平均值土標準誤差。alt及 AST相關之統計學解析’係針對對照群相對於正常群之發 病、與A-II投予群相對於對照群之效果,分別進行學生之 t檢定(以Microsort公司製之軟體Excel進行)。 結果如表7所示。 [表7] 實施例1之Ϊ5 (500mg/kg)投予群 對照群 正常群 ALT (IU/L ) 1473±865** 658211598## 33±2 AST (IU/L) 1257±615* 4202±968## 58±2 * :相對於對照群,p<0.05 :相對於對照群,ρ<0.〇1 :相對於正常群,p< 0.01 如表7所示’就對照群而言,將其與正常群比較即可 確認到ALT及AST係上升。然而,在對照群可確認到的 32 320158 <4 200906433 肝功能之高度障礙,在脂蛋白元Α_π製 地抑制。依櫨I 又予鮮則被明顯 依據此只驗,可確認到脂蛋白元Α_π 性肝炎之治療效果。在 衣別對猛爆 A-Η製·:iL 予群中,未見可能是因 表剎仅予而產生之副作用。 實施例15 動物竇驗7 準備7週齡之雄性Balb/c小鼠(Char丨〜 以隻供實驗用。 hades Rlver公司製) 對其中之16隻,將伴刀豆球蛋 公司掣)w n ^ypeiv ( Sigma ^衣)以15mg/kg之劑量進行單次靜 行任何處置,而製作叁械#*生 又十亚不細 用所調製之㈣白元Α·Π以⑽:= 用里進订早次靜脈内投予( 障礙㈣丨Μ * 群^對於剩餘之肝 丨早械棋型小鼠8隻,則;Η_ _ 蔣既去μ处 蛋白疋Α_Π(對照群)。 將既未叙予伴刀豆球蛋白Α 鼠8隻作為正常群。 越的小 在技予脂蛋白元A-II製南丨f μ 體麻醉下從腹部大動脈採血小時後,於二氧化碳氣 Μ 而獲得血清。測定此血清十之 作為肝功能障礙之指標的丙 酸轉胺酶(AST) ’分別外m )及天冬胺 J刀別计异出平均值±標準誤差。ALT及 統計學解析’係針對對照群相對於正常群之發 病、與Α·Π投予群相料對照群之效果,分別進行學生之 320158 33 200906433 t檢定(以Microsort公司製之軟體Excel進行)。 結果如表8所示。 [表8] 實施例1之A-II (500mg/kg)投予群 對照群 正常群 ALT (IU/L ) 1055±281** 936+198** 4185±736##~ 2831+421## 55+4 129+13 AST (IWL) :相對於對照群,p< 〇.〇l :相對於正常群,p< 0.01 如表8所示,就對照群而言,將其與正常群比較即可 確認到Αγ及AST係上升。然而,在對照群可確認到的 肝功能之高度障礙,在實施例1之月旨蛋白元心製劑投予 群則被明顯地抑制。依據此實驗,可確認到脂蛋白元Μ] 襄J U肝炎之治療效果。在Α_π製劑投^群卜未 可能是因Α·ΙΙ製劑投予而產生之勤作用。 (產業上之可利用性) 近年來’在日本亦有急性肝炎演變成猛爆性 =增加的傾向 '然而,由於患者之自覺症狀、醫師的謹 "吵斷,在醫療機關可預知串者之猛爆@肝火 5 適當之時猛爆,時纽,並藉由 爆性肝炎。另外、,σ癒急性肝炎、並防止演變成猛 ,ρ使例如發病成猛爆性肝炎,藉由投予 320158 34 200906433 « 本發明之藥劑,即可緩和其症狀。 【圖式簡單說明】 第1圖係顯示SDS-PAGE電泳像。圖中 係表示分子量(kDa)。⑴係表示分子量 ,數子 示實施例1之製劑(非還原),( :()係表 (非還原),(4)传表干表不,施例4之製劑 矣- ^ 表不貝轭例1之製劑(還原),(5) # 表不==之製劑(還原係表示分+#_)係 厂製二=^^方墨點電泳。⑴係表示實施例1之 传奢-糸表不貫施例4之製劑(非還原),(3) 係表不貫施例1之製劑(還原) — ^ ; 劑(還原)。 $原)⑷係表不貫施例4之製 第3圖係顯示實施例i之製劑(源自血漿之脂蛋白元 的胜肽圖。 T第4圖係顯示實施例4之製劑(基因重組之脂蛋白元 卜的胜肽圖。在17 &鐘附近檢測出ms_Tag相關之波 V 竽(前頭所指處)。 【主要元件符號說明】 無。 35 320158
Claims (1)
- 200906433 、申请專利範圍: 一種急性肝炎之治療 劑,苴特矜以士 爆’肝火之預防及/或治療 2. 3. :直有脂蛋白元—作為有效成分。 t中請範圍第1項之急性肝炎之治療或猛爆性肝 :之:防及/或治療劑’其中,係非經口投藥者。 一種急性肝炎之治療或猛爆性肝炎之預防及/或治療方 法’其特徵為將含有脂蛋白元Α·ΙΙ作為有效成分之組 成物投藥U性肝炎或猛爆性肝炎患者。 36 320158
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