TW200848425A - Production and use of non-native variants of domain 2 of human placental bikunin designed by directed molecular evolution - Google Patents

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200848425 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明有關具有經增進的表現水準以及適當的絲胺酸 蛋白酶-抑制特性之人類胎盤比庫寧蛋白功能部位2的新穎 5 變異體以及它們的製造及用途。 【先前技術】 人類胎盤比庫寧蛋白（bikunin)，亦被稱為肝細胞生長因 子活化劑抑制劑第 2 型（hepatocyte growth factor activator ίο inhibitor type 2, HAI-2)或SPINT2，屬於庫尼茲型抑制劑家 族（the family of Kunitz type inhibitors) (Marlor et al·，J. Biol

Chem. 272:12202-12208, 1997; Kawaguchi et al.? J. Biol Chem. 272:27558-27564, 1997; Muller-Pillasch et aL? ， Biochim.Biophys· Acta 1395:88-95, 1998)。庫尼茲功能部位 15 是大約56_60個胺基酸長的多肽，以不同的效力來抑制廣泛 的絲胺酸蛋白酶。大多數的家族成員含有三個呈一守怪間 距(conserved spacing)的分子内雙硫鍵。庫尼茲型抑制劑與 絲胺酸蛋白酶活性部位（active site)間的可逆交互作用主要 是受到一位在庫尼茲功能部位N端部分的9個胺基酸長之 -0 玉衣（1〇0Ρ)所调節（Gebhard et al·，Chapter 10 In: Proteinase

Inhibitors，Barrett and Salvesen (eds·)，Elsevier，Amsterdam， 1986，pp· 375-88; Bode and Huber，Eur. J· Biochem. 204:433-51, 1992) 〇 成熟的胎盤比庫寧蛋白含有2個庫尼茲功能部位以及 5 200848425 1個推定的跨膜功能部位，指出比庫寧蛋白是被合成為一與 膜相關聯的形式並且可能像是一蛋白分解截斷形式 (proteolytically truncated form)被脫除。它對於拮抗不同絲 胺酸蛋白酶具有廣泛的抑制範圍，顯示不僅是針對胞漿素 5 (Plasmin)、胰蛋白酶(trypsin)以及血管舒緩素(kamkreins)， 還有針對HGA-活化的蛋白酶肝細胞生長因子活化劑 (HGFA)以及 hepsin 的有效抑制活性(Delaria et al，j Bi〇l. Chem. 272:12209-12214, 1997; Kawaguchi et al. J. Biol

Chem· 272:27558-27564，1997; Kirchhofer et al·，FEBS ίο 27949454950, 2005)。因此，雖然胎盤比庫寧蛋白的確切（病 -)生理功能尚未被定義，該蛋白被推論可能在調節^^^心誘 發組織反應以及與發炎、凝血、纖維蛋白分解(fibrin〇lysis) 以及腫瘤形成（tumorigenesis)有關的蛋白酶活性方面扮演 _ 一個重要的角色。 I5 蛋白分解庫尼茲型抑制劑是以抑肽酶（aprotinin)為代 表’其為一種58-胺基酸的牛蛋白（Dembowsky et al.，Chapter ^ 10? In: Novel Therapeutic Proteins-Selected Case Studies,

Dembowsky et al. (eds)，WILEY-VCH，Weinheim，2001，pp· 225-41)。抑肽酶是一種在藥劑特斯樂(Trasylol)中的活性物 2〇 質，其被核准用於降低CABG患者的手術前後出血。其節 約用血(blood saving)的特性已主要地被歸於抑肽酶受到關 鍵的絲胺酸蛋白酶例如胞漿素、血漿血管舒緩素以及因子 XIa所調控的抗纖維蛋白分解而非抗凝血活性。此外，其抗 發炎活性導致繞道手術後的全身性發炎反應（systemic 6 200848425 inflammatory response，SIRS)的調節（]V[〇jcik and Levy，Ann· Thorac· S_urg· 71:745-754, 2001)。抑肽酶可能在主要手術中 具有節約用血的潛力（鬅:關節置換、脊髓手術、肝臟移植) 並且更適用類似外傷（Samama et al·，Anesth· Analg. 95:287-293, 2002; Porte et al.5 Lancet 355:1303-1309, 2000; Coats et al·，Cochrane Database Syst. Rev. 4:CD004896, 2004)。 然而，因為抑肽酶是來自牛，它帶有一種明顯的免疫 性能力，其於再暴露之後轉換成人類患者的過敏的通報案 例（Dietrich et al·，Anesthesiology 95:64-71，2001; Beierlein et al·，Ann Thorac· Surg· 79:741-748, 2005)。因此，對於一 針對抑肽酶之較低免疫性功能等效物有一高度醫學上需 求。 胎盤比庫寧蛋白因為其人類來源而可以是非-免疫性 的。此外，重組型比庫寧蛋白的一可溶性片段以及其合成 製備的庫尼茲功能部位1與2 (KD1與KD2)之功能特徵顯 示出所有三種蛋白質是血管舒緩素、胞漿素以及因子XIa 的有效抑制劑(Delaria et al·，J Biol· Chem· 272:12209-12214)。有趣 的是’ 一個在KD2具有突變的比庫寧蛋白變異體具有對抗 HGFA的大部分wt_活性，而在KD1的一個點突變顯著地 降低活性。從這些結果總結KD1主要負責比庫寧蛋白之 HGFA抑制活性(Qin et d， FEBS 436:111-114, 1998)。這些 ♦現—起得到的結論是比庫寧蛋白或其分離的KDs可以被 視為一種的治療蛋白，用於那些對於其來說抑肽酶已被顯 不為有益的適效(indications)。 7 200848425 一種用於從哺乳動物細胞培養物製造人類胎盤比庫寧 蛋白或其糖化功能部位i的方法已被Chan等人扩述二 US2〇〇4/〇235715中。不幸的是，比庫寧蛋白重組型部 位2 (hBikD2)的分析在不同表現系統中受限 ^ (Tamburini 等人的 US6583108 ; Delaria et al·，j Biol chem 272:12209-12214)。因此，本發明之一目的在於鑑定出具有 *增進之表現水準以及具有至少類似於抑肽酶之功能活性的 hBikD2衍生物。 10 近來，已報導抑肽酶（Ebbers等人的EP419878)或 hBikD2 (Tamburini等人的US6583108)的N-端修飾可能造 成經正確處理之材料的增進產量。一種用於製備具有天然 N-端序列之經同源處理的分泌重組型抑肽酶的酵母菌表現 ‘ 系統已被Apeler等人揭示於US5707831中。 15 具有推定蛋白酶抑制劑活性的天然庫尼茲型功能部位 的非天然變異體亦已被Dennis等人描述於US5863893以及 " Sprecher 等人於 US5914315。 根據本發明的變異體多肽可透過定向分子進化法而被 設計，其通常允許隨機產生大量的突變體接著根據所欲的 2〇 特性來選擇。有關於這類型的活體外蛋白質工程的策略是 根據像是在 Bloom et al·，Curr. Opin. Struct. Biol. 15:447-452, 2005; Kaur and Sharma，Crit. Rev· Biotechnology 26:165-199, 2006中所回顧的突變誘發(mutagenesis)和/或DNA重組的 各種不同技術為主。 8 200848425 蛋白質功能可以透過各種不同方法而被活體外地修飾 或增進，包括定點誘變（site directed mutagenesis) (Alber et al·，Nature，5; 330:41-46，1987)組合選殖（combinatorial cloning) (Huse et al·，Science，246:1275-1281，1989; Marks et 5 al·，Biotechnology，10:779-783，1992)以及隨機誘變（random mutagenesis)組合適當的選擇系統(Barbas et al·，PNAS. USA， 89:4457-4461，1992)。 隨機誘變的方法還有選擇已被用於在一些例子中以增 4 進蛋白質功能並且有兩種不同的策略存在著。首先，整個 ίο 基因序列的隨機化(randomization)組合選擇一具有所欲特 性之變異（突變）蛋白質，接著又一新回合的隨機誘變與選 擇。這個方法可以接著被重複直到一個被視為是最佳的蛋 白質變異體被找到（Schier R. et al·，J. Mol. Biol· 1996 263:551-567)。這裡，導入突變的習知路徑是透過具有一突 15 變機率為大約為 0.7%的易出錯PCR (error prone PCR)(Leung et al·，Technique，1:11·15, 1989)。其次，該基因 的明確區域可以使用簡併引子（degenerate primers)(其允許 突變機率高達100%)而被誘發突變(Griffiths et al·，EMBO, J， 13:3245-3260, 1994; Yang et al·，J· Mol· Biol. 254:392-403, 20 1 9 9 5) 〇 隨機突變（random mutation)已被廣泛地使用在抗體工 程的領域。活體内形成的抗體基因可以被活體外地選殖 (Larrick et al.? Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250-1256, 1989)並且隨機組合編碼可變重與輕基因的基因可以經過選 9 200848425 擇(Marks et al·，Biotechnology，10:779-783, 1992)。藉由這些 方法而被選出的功能抗體片段可以進一步使用隨機誘變以 及額外回合的選擇而被增進(Schier R· et al·，J. Mol. Biol. 1996 263:551-567) 〇 5 典型地，隨機誘變的策略接著是選擇。具有感興趣之 特性的變異體可以被選出且來自不同變異體的突變DNA區 域，各自具有感興趣之特性，被組合至一編碼序列(Yang et al·，J· Mol· Biol. 254:392-403, 1995)。 基因的組合配對（combinatorial pairing)亦已被用來增 ίο 進蛋白質功能，例如抗體親和力（Marks et al.，Biotechnology， 10:779-783, 1992) 〇 . 有關於蛋白質功能之活體外突變的另一種已知方法， 其通常涉及像是“DNA洗牌(DNA shuffling)”，利用DNA的 隨機片段化（random fragmentation)以及將片段組合至一功 15 能編碼序列（Stemmer，Nature 370:389-391，1994)。DNA 洗 牌方法藉由重組(從個別基因組合有用的突變）而產生多樣 性。它已成功被用於有關於不同蛋白質的人工進化法 (artificial evolution)，例如酵素以及細胞激素（chang et al.，

Nature Biotech. 17:793-797, 1999; Zhang et al. Proc. Natl. 2〇 Acad. Sci. USA 94:4504-4509, 1997; Christians et aL5 Nature

Biotech· 17:259-264, 1999)。基因是使用 DNase I 而被隨機 地片段化並且接著藉由彼此重組而被再組合。起始材料可 以是一個單一基因（首先使用易出錯PCR而被隨機地突變） 或天然存在的同源性序列（被稱為家族洗牌）。 10 200848425 像是由 Borrebaeck 等人在 WO 98/58080，Carlsson 等 人在 WO 02/48351，以及 Furebring 等人在 WO 03/97834 所 揭示的，由Alligator Bioscience AB所發展的片段誘發的多 樣性(£ragment-Induced Qiversity)(FINDTM)技術是一種涉及 單股DNA片段之DNA-洗牌的定向進化法方法。 【發明内容】 本發明之目的在於提供hBikD2的新穎非天然變異 體，其可以像是一功能性蛋白質在一重組型表現系統(例如 酵母菌分泌系統）中以高含量來被生成，且其對絲胺酸蛋白 酶顯示一良好的抑制型態。 本發明根據令人驚訝的發現，藉由定向分子進化法的 方法，展現所欲特性的像是hBikD2以及抑肽酶之庫尼茲一 型蛋白質的嵌合體(chimeras)可以被產生。 a山根據本發明的一個第一方面，它可以藉由hBikD2/抑肽 酶嵌合體3、5與6 (實施例7)的FIND®重組而產生一種具 有該特U之含有hBikD2的核心序列以及抑肽酶之側邊序 列的新變異體(表1中的序列辨識編號:1)。 根據本發明的一個第二方面，由序列辨識編號:工所定

少一種額外的胺基酸置換和/ >泌系統中更為提高的表現 進(實施例8)。突變的蛋白質（表 37)的特徵在於每分子具有至少_ 或月女基酸插入而導致在酵母菌分 200848425 水準同時維持良好的抑制型態。 έ人根據，發明的—個第三方面，提供具有帶有上述突變 、、且口之特彳政的序列辨識編號:1的變異體(序列辨識編號:38 至40)(實施例5及6)。 本發明的較佳實施例的描述如下。 定義： 在本文中’術語“hBikD2的非-天然變異體(non-native variant of hBikD2)”被定義為在 Cys5_Cys55、Cysl4-Cys38， 以及Cys30-Cys51具有雙硫鍵並且相對於人類胎盤比庫寧 蛋白的第二功能部位(]^丨1<：〇2，]\1—021102的丫129至（^186) 具有超過50%的胺基酸序列相同性但帶有至少一個胺基酸 置換的非-天然庫尼茲功能部位。 在本文中，術語增進的表現水準（impr〇Ve(JeXpressi〇n level)”被定義為具有胰蛋白酶抑制活性η〇收編蓄積在經 轉型細胞的分泌中（參照一抑肽酶標準品）。 在本文中’術语良好的抑制型態（fav〇rable ij^ibition profile)”被定義為對抑制胞漿素、血漿血管舒緩素以及胰蛋 白酶具有低於50 nM的IC50數值。 發現以及較佳實施例： 人類胎盤比庫寧蛋白的庫尼茲-型抑制劑功能部位2已 被報導表現類似或經增進之像是抑肽酶所發現到的蛋白酶 專一性，特別是有關於胞漿素與血漿血管舒緩素抑制效 12 200848425 力。再者，其人類來源應允許一以hBikD2為主的藥物在人 颂二者中以降低的有害免疫反應風險來重覆使用。然而， ，官近來努力提高重組型hBikD2的表現水準，該材料的可 ，取性(aCCessibility)維持不足的。因此，本發明之目的在於 提供=BikD2的新穎非·天然變異體，其可赠是_功能性 蛋白貝在i組型表現系、统中以高水準來被生成同時 胺酸蛋白酶維持一良好的抑制型態。 、… 10 當精由蓄積於經轉型細胞之分泌中的騰蛋白酶抑制活 性來分析’使用不同表現系統（例如酵母菌分泌系統）的 ikD2之表現並未超出背景水準ieveis)(表^)。 f第一個最佳化步驟中，hBikD2以及抑肽酶序 F|ND重組是被採用以產生新穎的非天然刚助變異辦 (貝把例7)。因為hBikD2以及抑肽酶的有限同源性(5 ， 重組是利用3 hBikD2/抑肽酶嵌合體來施行：在第 嵌合體(嵌合體#3)巾，胺基酸！至1()以及56至58 抑肽酶而從胺基酸U至55的核心序列是衍生自hBikD2。、 第二個叙合體(嵌合體#5)包含有來自讓kD2__端以 二胺基酸1至39以及來自抑肽酶的〇_端胺基酸4〇至％。 第三個嵌合體（嵌合體#6)由來自抑肽酶的胺基酸丨至妁以 及來自hBikD2的胺基酸40至58所組成。 嵌合體#3、#5以及#6的單股DNA_片段之FmD(E)重会 使得-酵母絲現庫產生。令人驚_地，在條件培養= (conditioned media)中篩選大約此庫的1〇〇〇株有關於胰ς 白酶抑制活性’鑑定出兩株（176Ε9心174Η1〇)帶有择 13 20 200848425 的f現水準。相分_示在絲酸轉方面，兩株均表 n的^非-天然hBikD2變異體，其由胺基酸u至39 1 2核心以及衍生自侧邊殘基1至1〇以及40至 5 10 15 20 =:準的^ 丰方面，兩株在它們的序列上都顯示些微的變異。 176E9 震盧燒瓶-規模中’具有序列辨識編號：1的 胰疋Mi、現水準深度分析確認：由條件培養基所回復的 沪ί掛：中制活性是高於空載體對照組的水準約30_倍。根 照胰^觀點(表2)’34至53 _nl的數值被達到 hBikD2 析中的抑肽酶標準品）。再者，類似於 对六也/、抑肽酶，序列辨識編號：1的純化蛋白質也以高 I右^/㈣胞漿素、血漿血管舒緩素以及胰蛋白酶，亦即 ，、有 IC50 < 5〇 nM(表 3)。 = ί，在一實施例中，本發明提供藉由定向分子進化 比座L疋生的咖的非-天然變異體，相對於人類胎盤 丁束白的第二功能部位（hBikD2，ΝΜ_021102的γ126 至Q186)具有超過5Q%胺基酸序列相同性但是帶有至少一 ，胺基酸置換。在—較佳實施例中，-應用於本發明中之 夕肽的只例具有藉由序韻識編號：丨所界定的胺基 列0 鐵田^二步驟中，由序賴識編號：1所界定的_cD2 二、月:之表現應進—步被最佳化，透過使用*出錯PCR來 f 突變庫（實施例8)。令人驚苛地，在酵母菌分泌系 統，師選生成的大約10,000株中鑑定出帶有增進的表現 14 200848425 之額外非-天然hBikD2變異體(實施例9及1〇)。序列分析 顯示這些突變的變異體的特徵在於每分子具有至少一個胺 基酸置換和/或胺基酸插入(表！中的序列辨識編號至 37)。在具有最高表現水準的株中，一個具有突變的 5 變異體可以被鑑定出（176E9_A07株，序列辨識編號·· 6)， 其知*彳政在於分泌物中的胰蛋白酶抑制活性是高於空載體對 照組的水準約70-倍(63-106 pg/ml，參見表2)。如表3中所 $ ’序列辨識編號：6的純化蛋白質以高效力來抑制胞聚 素、血漿血管舒緩素以及胰蛋白酶，亦即具有ic5〇<5〇nM。 1〇 因此’在—實施财’本發明提供具有序列辨識編號： 2至37的胺基酸序列之hBikD2的非_天然變显體。在一較 佳實施例巾，本發明提供具有序_識編號：6之胺基酸序 列的hBikD2的非-天然變異體。 在-第三回合的表現最佳化中，在先前步驟中所鑑定 15 出之包含在糊序賴峨：2至37的突變被組合。所生 成之具有更為增進的表現水準的變異體序列在表丨中被給 i 予（序列辨識編號：38至40)。 因此，在-實施例中，本發明提供具有所有根據序列 辨識編號.2至37所述之突㈣組合之破伽的非-天然 2〇 、變異體。在-較佳實施财，本發明提供具有㈣辨識編 號.38至40之胺基酸序列的hBikD2的非-天麸變里體。 熟習技藝者將認知到，藉由定向分子進化法的最佳化 的類似方法可以被應用在增加其他人類與非人類來源的天 然與非-天然庫職·型職酸蛋白酶抑制劑的表現水準。 15 200848425 此處所述的hBikD2的非-天然變異體可以使用任何標 準多肽合成方法以及儀器而被合成製出。另擇地，所述的 變異體可以藉由使用以細菌、酵母菌、桿狀病毒或哺乳動 物表現載體以及類似者為主的表現系統之重組方法而被生 5 成。製造所述變異體的一較佳重組型表現系統是酵母菌啤 酒酵母菌（S· cerevisiae)。 實用性： 此處所述的藥劑是應用於治療下列疾病：在手術期間 ίο 具有出血之升高風險的缺血；對血栓性栓塞症 (thromboembolism)的治療干預(例如手術、意外後）；手術後 外科的出血；休克（shock);多外傷（polytrauma);敗jk症 (sepsis);散播性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC);多重器官衰竭（multiorgan failure， 15 MOF);不穩定型心絞痛（unstable angina);心肌梗塞 (myocardial infarction);中風（stroke);栓塞（embolism);深 、 度靜脈血栓（deep venous thrombosis, DVT);發炎性疾病 (inflammatory diseases)(例如氣喘（asthma)、風濕病 (rheumatism));侵襲性腫瘤生長以及轉移；針對疼痛或水腫 2〇 的治療干涉（脊髓的腦水腫）；在透析期間防止止血 (hemostasis)的活化；皮膚老化症狀的治療（彈性纖維增生病 (elastosis)、萎縮（atrophy)、鈹紋（wrinkling)、血管變化 (vascularly changes)、色素變化(pigmentary changes)、光化 性皮膚角化(actinic keratoderma)、黑頭粉刺（blackheads)、 16 200848425 囊腫(cysts));傷口瘡合；黑色素瘤（meian〇ma);黑色素瘤 症狀的治療（光化性皮膚角化、基底細胞癌（basal cell carcinoma)、侵襲性鱗狀上皮細胞瘤(invasive SqUam0US-ceii carcinoma)、惡性黑色素瘤（malignant melanoma));多發性 5 硬化症(multiple sclerosis);纖維化(fibrosis);腦出血(cerebral hemorrhage);脊髓或腦的發炎；腦部感染；肌腱病變 (tendinopathy) 〇 【實施方式】 10 實施例： 本發明在下列未意欲從任何方面限制如所宣稱之本發 . 明範疇的實施例中被進一步說明。 實施例1 ： 15 彼人類胎盤比庫寧基因功能部位2HiBikD2)的選殖 規律選殖作業是根據Sambrook等人（Molecular Cloning Cold Spring Harbor，1989)來被施行。有關於從 Ε· coli 分離質體 DNA (mini- and midipreps)是使用 Qiagen-tips (Qiagen)。被使用於轉型的宿主生物是Ε· coli菌株DH5a 20 (invitrogen)。從瓊脂糖凝膠萃取DNA片段是根據製造商的 操作程序（Qiagen)利用 Qiagen gel extraction kit 來實施。用 於PCR以及定序反應的寡核苷酸是購自於〇peron，合成基 因（最佳化於啤酒酵母菌密碼子-用途）來自Geneart。 有關於來自 Qiagen (Hot Star Mastermix)、Stratagene 200848425 (PfuUltra Hotstart DNA Polymerases)或 Novagen (KOD HiFi， Hot Start and XL DNA Polymerases)的 PCR 實驗套組是根據 各製造商的操作程序而被使用。 所有的載體建構物是使用螢光··標定的終止劑(Big Dye 5 Terminator，Version 1·1，Firma Applied Biosystems)經循環 -DNA 定序而在一 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems)上被確認。 f 包含來自人類胎盤比庫寧蛋白基因（hBikD2， NM一021102)之庫尼茲·型功能部位2的58個胺基酸編碼序 ίο 列(Y129-Q186)是如同合成基因購自於Geneart (最佳化於啤 酒酵母菌密碼子-用途）。相對於編碼序列的5,與3,之額外 寡核苷酸包括限制酵素辨識位址，其被用於hBikD2的框架 内次選殖至酵母菌分泌載體piuio.io.w (Apeler，Chapter 12, In: J. Knablein (ed.)5 Wiley-VCH? Modem Biopharmaceuticals? 15 1021-1032, 2005)。編碼有關於hBikD2的合成基因被選殖 到載體pPCR-Script ’亦講自於Geneart。 1 編碼hBikD2的合成基因的DNA序列如下：

GGGCGAATTGGGTACCGATTCCCATCTATTTTTACTGCTQTTTTGTTTGCTGCTTCTTCT GCTTTGGCTTATGAAGAGTATTGTACTGCTAATGCTGTTACTGGTCCATGTAGAGCTTCT4

TTTCCAAGATGGTATTTTGATGTTGAGAGAAATTCTTGTAACAACTTCATCTATGGTGGT

TGTAGAGGTAAC^AAAATTCTTATAGATCTGAAGAGGCTTGCATGTTGAGATGTTTTAGA

CAATAATAACTCGAGGAGCTCCA6CTTTTGTTCCC 限制酵素辨識位址（5，Kpnl: GGTACC，BsaBI: 2〇 GATnnnnATC; 3’ Xhol: CTCGAG, SacI: GAGCTC)被畫J 上 底線。 18 200848425 hBikD2的推演胺基酸序列如下： YEEYCTMAVTGPC_FPRWFDVERNSCNNFIYGGCRGNKNSYRSE1EACMLRCFRQ hBikD2 實施例2 ·· 5 嵌合體#5的選殖·· 嵌合體#5包含有58個胺基酸(aa)，由人類胎盤比庫寧 蛋白基因的39個aa (hBikD2, aa 1-39)以及牛抑肽酶基因的 # 19 aa (BPTI ’牛騰臟膜蛋白酶抑制劑，aa 40-58， NM一001001554)所組成。嵌合體#5是如同合成基因購自於 1〇 Gennart (最佳化於啤酒酵母菌密碼子-用途）。相對於編碼序 列的5’與3’之額外寡核苷酸包括限制酵素辨識位址，其被 • 用於嵌合體#5的框架内次選殖至酵母菌分泌載體 pIUHUO.W (Apeler，2005)。編碼有關於嵌合體#5的合成基 因被選殖到載體pPCR-Script，亦購自於Geneart。 15 編碼嵌合體#5的合成基因具有下面序列：

GGGCGAATTGGGTACCGATTCCCATCTATTTTTACTGCTGTTTTGTTTGCTQCTTCTTCIT ^ GCTTTGGCTTATGAAGAATATTGTACTGCTAATGCTGTTACTGGTCCTTGTAGAGCTTCT

TTTCCAAGATGGTATTTTGATGTTGASAGAAATTCTTGTAATAACTTCATATATGGTGGT TGTAGAGCTAAAAGAAATAACTTCAAATCTGCTGAAGATTGTATGAGAACTTGTGGTGGT GCTTAATGACTCQAGGGAGCTCCAQCTTTTGTTGCCTT 限制酵素辨識位址(5, Kpnl: GGTACC，BsaBI: GATmumATC：; 3’ Xhol: CTCGAG，SacI: GAGCTC)被劃上底線。 嵌合體#5的推演胺基酸序列(BPTI的aa被劃上底線） 20 如下： YEEYCTMAVTGPCRASFPRWYFDVERNSCNNFIYGGCRAKRNNFKSAEDCMRTCGGA 嵌合體 #5 19 200848425 實施例3 ： 嵌合體#6的選殖· 欲合體#6包含有58個胺基酸(aa)，由牛抑肽酶基因的 39個胺基酸(BPTI ’牛胰臟胰蛋白酶抑制劑，⑽I—%， 5 NM一001001554)以及人類胎盤比庫寧蛋白基因的μ個aa (hBikD2, aa 40-58)所組成。嵌合體#6是如同合成基因購自 於Gennart (最佳化於啤酒酵母菌密碼子_用途）。相對於編碼 序列的5’與3’之額外寡核苷酸包括限制酵素辨識位址，其 被用於篏合體#6的框架内次選瘦至酵母菌分泌載體 ίο pIUlO.lO.W (Apeler, Chapter 12? In: J. Knablein (ed.)5

Wiley-VCH，Modem Biopharmaceuticals，1021-1032, 2005)。編碼 , 有關於嵌合體#6的合成基因被選殖到載體ppeR-Script，亦 購自於Geneart。

編碼嵌合體#6的合成基因的DNA序列具有下面序列： GQGCGAATTGGGTACCGATTCCCATCTATTTTTACTGCTGTTTTGTTTGCTGCTTCTTCT GCTTTGGCTAGACCAGATTTTTGTTTGGAACCACCATATACTGGTCCATGTAAAGCTAGA* ATTATTAGATACTTCTATAATGCTAAAGCTGGTTTGTGTCAAACTTTTGTTTATGGTGGT TGTAGAGGTAACAAAAATTCTTATAGATCTGAAGAGGCTTGTATGTTGCGTTGTTTTAGA 15 CAATAATQACTCGAGGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTT 限制酵素辨識位址(5, Kpnl: GGTACC，BsaBI: GATnnnnATC; 3’ Xhol: CTCGAG，SacI: GAGCTC)被劃上底線。 嵌合體#6的推演胺基酸序列（BPTI的aa被劃上底線） 如下： RPDFCLEPPYTGPCKARIIRYFYNAKAGLCQTFVYGGCRGMNSYRSEEACMLRCFRQ 散合體 20 20 200848425 實施例4 ： 嵌合體#3的選殖： 使用一 PCR反應，實施例1中所提到的合成基因之沁 與C-端胺基酸被置換成BPTI蛋白質序列中的對應胺基酸。 5 用於該PCR反應中的PCR-引子是推演自BPTI，對應 於aa 1-17 (引子A)與aa 56-58 (引子B)。此外，位在5,端 的引子A表現限制酵素BsaBI的辨識位址，引子B是xh〇i 的辨識位址。 所用的引子A與B具有下列序列： ίο 引子A:

S^cacc^attcccatctattttcactgctgtcttgttcgctgcttcttctgctttggctAGACCAGATTTCTGCtTgGAGCCA CCATATACTGGTCCATGTAGAGCTTCT-3r 引子B : 5' - tt actc^ajc t aTTAAGCACCACCACATCTCAACATGCAAGCCTCTTCA- 37 15 BPTI-專一性核苷酸是以大寫字母被印刷，小寫字母是 有關於侧邊序列’限制酵素辨識位址（BsaBI: gatnnnnatc; Xhol: ctcgag)被劃上底線。 PCR混合物含有l〇nghBikD2質體-DNA、ΙΟρΜοΙ引 20 子 A、10 pMol 引子 B、1 mM dNTPs、lxPCR 反應緩衝液 (Novagen)、1 mM MgS04、1 U KOD Hot Start DNA 聚合酶 (Novagen)呈一為50 μΐ的總體積。，循環，-條件是2分鐘於 94°C，25個循環，每個循環中，1分鐘於94。〇，1分鐘於 50°C，1.5分鐘於72。(：以及接著10分鐘培養於68°C。 .200848425 編碼喪合物#3的PCR產物具有下列序列： caccgattcccatctattttcactgctgtcttgttcgctqcttcttctqctttqqctaqa ccagatttctgcttggagccaccatatactggtccatgtagagcttcttttccaagatgg tattttgatgttgagagaaattcttgtaacaacttcatctatggtggttgtagaggtaac aaaa attcttatagatctgaagaggcttgcatgttgagatgtggtggtgcttaatagct cgagtaa 限制酵素辨識位址（5’ BsaBI: GATnnnnATC; Xhol: CTCGAG)被劃上底線。 嵌合體#3的推演胺基酸序列(BPTI的aa被劃上底線) 如下： RPDFCLEPPYTGPCRASFPRWYFDVERNSCNNFIYQGCRGNKNSYRSSEACMLRCQQA 嵌合體 #3 1〇 實施例5 ： 變異體-mutlO、-mutll、-mutl2(序列辨識，編號：38_40)的選殖： 變異體176E9-mutlO、-mutll，以及-mutl2各包含有 5 5個aa (序列辨識編號·· 3 8_4〇)並且是如同合成基因購自於 Gennart (最佳化於啤酒酵母菌密碼子_用途）。相對於編碼序 15 列的5’與3’之額外寡核苷酸包括限制酵素辨識位址，其被 用於變異體的框架内次選殖至酵母菌分泌載體pIXjl〇.10.w (Apeler，Chapter 12，In: J· KnSblein (ed·)，Wiley-VCH， Modern Biopharmaceuticals，1021-1032, 2005)。 編碼變異體176E9-mutlO、-mutl 1，以及-mutl2的合成 20 基因（序列辨識編號：38-40)被選殖到載體ppCR-Script，亦 講自於Geneart。 合成基因序有下列序列（限制酵素辨識位址-5，BsaBI: 22 200848425 GATnnnnATC; 3’ Xhol·· CTCGAG，SacI·· GAGCTC-被劃上 底線）。 . 變異體-mutlO (編碼由序列辨識編號：38所定義的蛋白 質）

GGQCQAATTGGGTACCGATTCCCATCTATTTTTACTGCTGTTTTGTTTGCTGCTTCTTCT

GCTTTGGCAAGACCAGATTTTTGTTCTGAATCTCCATATACAGGTCCTTGTAGAGCTTCT

TTTCCAAGATG6TATTTCGACGTTGAAAGAAATTCTTGCAACAATTTCATTTATGGTGGT

TGTGGTGCTAAAGGTAACAATTTCGAATCTGCCGAAGATTGTATGAGAACTTGTGGTGGT

GCTTAATAACTCGAGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCC 變異體-mutll (編碼由序列辨識編號：39所定義的蛋 白質）

GGGCGAATTGGGTACCGATTCCCATCTATTTTTACTGCTGTTTTGTTTGCTGCTTCTTCT GCTTTGGCAAGACCAGATTTTTGTTTGGAACCACCATATACAGGTCCTTGTAGAGCTTCT TTrCCAAGATGGTATTACGACGTTGAAAGAAATTCTTGCAACAATTTCATTTATGGTGGT TGTGGTGCTAAAGGTAACAATTTTAAATCTGCCGAAGATTGTATGAGAACTTGTGGTGGT - GCTTAATAACTCGAGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCC 變異體-mutl2 (編碼由序列辨識編號：40所定義的蛋 10 白質）

gGGCGAATTGGGTACCGATTCCCRTCTATTTTTACTGCTGTTTTGTTTGCTGCTTCTTCT

GCTTTGGCAAGACCAGATTTTTGTTTGGAATCTCCATATACAGGTCCTTGCAGAGCTTCT

GTTCCAAGATGGTATTTTGACGTCGAATCAAATTCTTGTAACAATTTCATTTATGGTGGT TGTGGTGCTAAGAGAAACAATTTTAAATCTGCCGAAGATTGTATGAGAATTTGCGGTGGT,

GCTTAATGACTCGAGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCC 變異體176E9-mutlO、-mutl 1，以及-mutl2的推演胺基 酸序列如下： RPDFCSESPYTGPCRASFPRWYFDVERNSCNNFIYGGCGMGNNFESAEDCMRTCGGA-mut 10/序列辨識編號·· 38 15 RPDFCLEPPYTGPCHASFPRWYYDVERNSCNNFIYGGCGAKGMFKSAEDCMRTCGGA -mut 11/序列辨識編號：39 Ι^ΡΡΡαΕ$ΡΥΤ(?Ρα^3νΡΙ»ϊΥ?Ι)ν^Ν3αβ^ΙΥΟΟ〇6ΜΙ?ΜΡΚ3ΑΕΙ3α®ΚΟΰΑ _mut 12/序列辨識編號：40 23 200848425 實施例6 :

列辨識編號：39)，以及-mutl2 (序列辨識編^^ 菌分泌載體PIU10.10W中的撰殖 5 E· coli/酵母菌穿梭載體pYES2 (invitrogen)是經修飾的 並且被用於酵母菌分泌載體pIU10· 10·w (Apeler，Chapter 12, In. J. Knablein (ed.)5 Wiley-VCH5 Modem Biopharmaceuticals, , 1021-1032, 2005)的建構。實施例4的PCR反應混合物是使 用一純化套組(Qiagen)被純化，以限制酵素BsaBI以及Xhol ίο 切割並且被接合至酵母菌分泌載體pIUlO.lO.W，其同樣地 以相同限制酵素切割。選殖到pPCRscript中的嵌合體#5及 #6與各變異體-muti〇、_mutii，以及_muti2是以限制酵素 BsaBI以及Xhol切割，對應散入物（inserts)被分離並且各自 被接合到如上所述的酵母菌分泌載體piuio.io.w。來自各 15 轉型事件的質體DNA被分離，以限制酵素BsaBI以及Xhol 切割且陽性株被定序。 < 嵌合體#3、#5、及#6與變異體-111价10(序列辨識編號： 38)、-mutll (序列辨識編號：39)，以及-mutl2 (序列辨識編 號：40)的推演aa序列如下(MFa-前-序列以斜體字排列，衍 20 生自BPTI的aa以及變異體中的突變aa被劃上底線）： mSIFTAl^FAASSAMRPDFMm 嵌合體 3 贈P咖TAVLPM5顯YEEYCTMAVTCPC觀PR卿DVEMSt^IYGGCRA麵FKSASDCMRMA 嵌合體 5 Mi^PSJFrAVLFAAggALMPDFCLEPPYTGPCKARIIRYFYMAKAGLCQTFVYGGCRGMKNSYRSEEACMLRCFRQ 嵌合體 ό 200848425 MFP5IfrAram£fSaMRPDFC^EgPYTGPCRAS；FPRWyFDVERNSCNNFIYGG(^AI^NNF|SAEDCMRTC：GGA 序列辨識編號：38 顺FPSIPrAVLmSSJMPDFCLEPPHGPCSASPPRWYYDVERliSCHNFIYGGCGMGNNPKSAEDCMRTCGGA 序列辨識編號:39 » W 从 ^PSIFrAraFMS^ARPDFCLEgYTGPCRASyPRWYFDVESNSC厕 FIYGGC§A™FKSMDCm^ 5 實施例7 ： FIND®庫的產生 編碼hBik-D2/抑肽酶嵌合體的350個鹼基對DNA片段 f 是藉著聚合酶連鎖反應(PCR)從實施例2至4中所述的嵌合 建構物嵌合體#5、嵌合體#6以及嵌合體#3被擴增，使用順 1〇 向引子 5’-CTGGAATTCCACTGCTGTTTTGTTTGCTGC 以 及反向引子 5’-CTCAAGCTTGACTTCAGGTTGTCTAACTCCTTCC 〇 所有引子是購自於MWG，Ebersberg，德國。 PCR反應含有1 ng的各嵌合建構物、〇,5 μΜ的各引 子、200 μΜ 各 dNTP (New England Biolabs，cat # N0440S，

15 N0441S，N0442S，N0443S)、lx Dynazyme 反應緩衝液、1 U

DynazymellDNA 聚合酶(Finnzymes，cat#F-501L)以及 0,02 ‘ U Phusion DNA 聚合酶(Finnzymes，cat # F-530-S)呈一為 50 μΐ的總體積。PCR程式包含25個循環，15秒於94°C，30 秒分鐘於57°C以及30秒於72°C以及最後延長於72°C下歷 20 時7分鐘。 單股 DNA (ssDNA)，代表意義（sense)與反義（antisense) 股，是被製備如下：PCR產物被分成兩批並且分別以EcoRI 或 Hindlll (各別為 New England Biolabs，cat # R010L 以及 R0104S)分別予以消化，在意義或反義股分別產生一個5’ 25 200848425 磷酸化末端。5’構酸化的股是使用Strandase™ ssDNA Preparation Kit (Novagen，Merck Biosciences，cat # 69199-3) 予以消化，留下完整DNA的非磷酸化股。在兩個例子中， 所得到的ssDNA是透過瓊脂糖凝膠(Cambrex，cat # 50080) 電泳來分析，使用Recochip (TaKaRa, cat # 9039)根據製造 商的建議來純化，並且最後乙醇沉澱。 在由製造商所建議的條件下，FIND®實驗是藉由分別片 段化意義與反義ssDNA，利用外核酸酶(Exonuclease) I (Exo 1)(100 U/g DNA, (New England Biolabs，cat # 0293L))、外核 酸酶 V (Exo V)(50 U/g DNA，（USB，cat # 70040Y))以及外核 酸酶 VII (Exo VII)(5 U/g DNA，（USB, cat # 70082Y))在個別 試管中來開始。 由外核酸酶消化所生成的ssDNA片段是在主要如上面 所述的第一 PCR反應(PCR 1)中被重組，除了所使用的DNA 聚合酶是Phusion (1U)且該PCR混合物含有lx Phusion HF 反應緩衝液，未添加引子且各股60 ng ssDNA，呈一為50 μΐ 的總體積。PCR 1的材料接著在一也是如上述具有5 μΐ PCR 1產物、〇,5 μΜ引子(相同於DNA片段的起始擴增所使用 的）、lx AmpliTaq 反應缓衝液以及 1，25 U AmpliTaq⑧DNA 聚合酶(Applied Biosystems，cat# N8080171)，呈一為 50 μΐ 的總體積的第二PCR反應(PCR 2)中被擴增。被重新組合的 食長基因接著被選殖到pGEM®-T載體系統I (promega，cat 枯 A3610)並且被定序。 在第一 FIND®反應中，來自嵌合體#5的意義ssdnA是 26 200848425 與來自嵌合體#3的反義ssDNA被重組且所產生的庫是在 一第二FIND®回合中被用於製備與來自嵌合體#6的反義 ssDNA重組的意義ssDNA。 5 實施例8 ： 隨機突變庫的產生： 一使用hBikD2/抑肽酶嵌合體176E9 (序列辨識編號： 1)以及174H10 (序列辨識編號：2)作為起始材料的隨機突變 KPI庫是根據製造商的指示透過令這些株的基因之混 10 合物通過 GeneMorphll PCR Mutagenesis Kit (Stratagene，cat #200550)而被產生。為了要獲得足夠數目的突變(每序列丨_2個胺 基酸置換）’三個連續回合的GeneMorphll被施行。在每個回合 中，0.1 ng的模版被使用。被用於GeneMorph II反應的引子是順 向：5’-GCTGCTAGCTCTGCTTTGGCTAGACCAGATTTC 以 15 及反向：5，-GATGCATGCTCGAGCTATTAAGCACCACC。 ‘ 實施例9 ： 變異體的選殖與表現 一個含有MF-前-原-引導序列以及hBikD2的pYES2-20 載體是根據製造商的指示使用Quikchange multisitedirected mutagenesis kit (Stratagene # 200513)而被修飾以移除一在 URA-3之後的Nhel-位址。用於此反應的引子是 5，-GATGAATTGAAAAGCTAACTTATCGATGATAAGCTG 丁C。所生成的載體更進一步根據製造商的指示採用引子 27 200848425 5，-CTGCTGTTTTGTTTGCTGCTAGCTCTGCTTTGGCTTA TGAAGAG 以及 5，-CTCTTCATAAGCCAAAGCAGAGCT AGCAGCAAACAAAACAGCAG 使用 Quikchange II mutagenesis kit (Stratagene，#200524)被修飾以在引導序列中引入一 5 Nhel-位址。從所生成的載體，hBikD2_序列是使用NheI(New

England Biolabs #R0131)以及 SphI (New England Biolabs #R0182) 而被移除並且被取代以一經由接合兩個磷酸化寡順向： 5’P-CTAGCTCTGCTTTGGCTTAACTCGAGCATG 以及反 向 5’P-CTCGAGTTAAGCCAAAGCAGAG 而被產生之編碼 ίο 一停止密碼子的填充片段（stuffer-fragment)。 該庫是被選殖入經修飾的pYES2表現載體，像是上述 產生的，使用 Nhel (New England Biolabs # R0131)以及 SphI (New England Biolabs # R0182)並且根據製造商的指示使用 電穿孔被轉型到五· co/z· ElectroTen Blue 菌株(Stratagene # 15 200159)中。轉型被平盤塗布在具有LB瓊脂(Miller)(Merck

Cat # 1.10283.0500)(含有 50 ng/ml胺苄青黴素(Calbiochem)) 的Q-盤（Q-trays) (Genetix # X6023)上並且在37°C下培育過 夜。所生成的株被刮離平盤並採用HiSpeed Plasmid Midi Kit (Qiagen # 12643)來用以萃取質體DNA。 20 有關於该庫（接合至製備自如上述之ElectroTen Blue的 pYES2中）的表現，1 |Lig的緊密螺旋(superc〇iied)質體是根據 Gietz南效率轉型操作步驟（Methods Enzymol. 2002; 350:87-96)被轉型到啤酒酵母菌的i〇8細胞。因此，啤酒酵 母菌1^1^611{以6〇111〇卬11菌株(八1^^ 201149)是在2\丫？0 28 200848425 (100 g/l YPD_ 肉湯，Sigma #Υ-1500，40 g/l 葡萄糖，Sigma # G7528)補充有 25 yg/ml 氯黴素（chloramphenicol) (Calbiochem，# 220551)中於 30°C 下以及 200 rpm 下生長歷 時16-18小時。此〇/n-培養物是以5_1() χ i〇6細胞/ml的起 5 始濃度被用於接種具有25 Wg/ml氯黴素的50 ml 2xYPD。 此培養物被生長於30°C下，200 rpm直到濃度至少為2xl07 細胞/m卜對這些1〇8的細胞，一由240 μΐ 50% PEG 3500 (Sigma，# P-3640)、36 μΐ 1·〇 Μ 乙酸鐘（Sigma # L-4185)、50 μΐ 2mg/ml I圭魚精子 DNA (Sigma, # D1626)以及 1 pg 要被轉 10 型的dna所組成的轉型混合物被加入。細胞以及轉型混合 物被劇烈地震盪並且被培養於42°c下歷時60分鐘。細胞是 成粒狀並加入1 ml的水且細胞被平盤塗佈在具有sC-Ura 瓊脂(20 g/1 瓊脂（Saveen，# B1000-1)、20 g/1 葡萄糖(Sigma, #G7528) ’ 1.92 g/1酵母囷合成脫離培養基(yeast synthetic 15 drop-out media)(Sigma，# Y-1501)，6.7 g/1 不具有胺基酸的 酵母氮源(yeast nitrogen base)(Fluka, # 51484))的 Q_盤上並 ‘ 且培養於30X：下過夜。 有關於個別突變株的蛋白質表現，由該庫轉型至啤酒 酵母菌的菌株是使用Genetix QPixII而被挑到具有150 μΐ 20 SC5 (20 g/1 Bacto 酵母菌萃取物（BD # 212750)、6.7 g/1 KH2P04 (Merck # 1.04873)、1 g/1 MgS04 X 7H20 (Merck，# 1.05886)、2 gA (NH4)2S04 (Sigma，# A2939)、2%葡萄糖 (Merck，# 1.08337)以及 1 ml/1 微量元素溶液(5 g/l Tritriplex 3(Merck 1.08418)(2 g/1 FeS〇4 x 7H20 (Sigma # F8633)、0.1 29 200848425 g/l ZnS04 x 7H20 (Sigma #Z4750)、0·03 g/l MnCl2 x 4H20 (Sigma #3634)、0.3 g/1 H3B03 (Merck，·#1·〇〇165)、0·2 g/1 CoCl2 x 6H20 (Sigma #C8661)、0.01 g/l CuCl2 x 2H2〇 (Aldrich #22.178-3) ^ 0.02 g/l NiCl2 x 6H20 (Sigma 5 频6136)、0·03 g/l Na2Mo04x2H20 (Merck，1.06521)，ρΗ3·5)) 補充有25 yg/l氯黴素）的96-井平盤(Greiner，#655180)。平 盤被密封以Nunc封閉帶（sealing tape) (#236366)且培養物被 培育在30 C下歷時48小時且樣品上清液被收獲。 ίο 實施例10 ： 胰蛋白酶締選分妍 具有提高之表現水準的hBikD2/抑肽酶株是使用一胰 蛋白酶而被鑑定，其中酵素胰蛋白酶催化受質Να_苯曱醯_l_ 精胺酸4-硝基苯胺(L-BAPA)的裂解，其被計算成在405 nm 15 下的吸光值。胰蛋白酶分析是如下列般在乾淨的，平底的 384-井平盤（Greiner，cat #781186)中於一由 Beckman

Multimek 96 ^ Multidrop 384 Titertek > BMG FluoStar reader 以及 Cytomat incubator 所組成的 Beckmail Couiter robot system上施行。來自牛胰臟的胰蛋白酶(Sigma，cat# T4665, 20 10200 U/ml)以一為 1 mg/nil 的濃度（配於 50 mM Tris，pH 8.4) 被稀釋於緩衝液(〇·2 M三乙醇胺鹽酸鹽、〇.〇2 MNaCl、10 ml 的5% Tween-80，pH達7·8)中達到一為50 U/ml的最終濃 度。胰蛋白酶溶液被加入各井内，接著加入樣品上清液， 以一為7.5或15倍的最終稀釋率，且平盤於23或28°c下 30 200848425 被預培養 10 分鐘。受質 L_BAPA (Sigma，cat # B_3279)(在 一由4% DMSO以及o.ooi% Tween-80所組成的緩衝液中溶 解成2 mg/ml)接著以一最終濃度為0.77 mM被加入平盤。 在10分鐘的培養之後，一於405 nm的第一吸光值讀取被 實施。一最終吸光值讀取在已經另一次培養之後被實施， 不論於23°C下45分鐘，或於28°C下75分鐘且吸光值的改 變被計算。 實施例11 ： 10 在培養基中表現序列辨識編號：1的酵母gj細胞的大規模發_遂 下列培養基被使用於酵母菌細胞的生長與發酵： 培養基 成分 SD2 SC5 Bacto-酵母氮源 6,7 g/1 - Difco Bacto-酵母菌萃取物 - 20,0 g/1 葡萄糖 2〇,〇 g/1 20,0 g/1 KH2P〇4 6,7 g/1 6,7 g/1 (NH4)2S〇4 - 2,0 g/1 MgS04 x 7 H20 - l?〇 g/1 微量元素溶液 - 1，0 ml/1 pH (以NaOH調整） 6 6 微量元素溶液： 15 Titriplex 3 (Merck 8418) 5 g/1 FeS04 · 7H20 (Merck 3965) 2 g/1 ZnS04 · 7H20 (Merck 8883) 0，1 g/1 200848425

MnCl2 · 4h2〇 (Merck 5927) 30 mg/1 H3B〇3 (Merck 165) 0,3 g/1 C〇Cl2 · 6H2〇 (Merck 2533) 0,2 g/1

CuCl2 · 2H20 (Merck 2733) 10 mg/1 5 NiC12 · 6H20 (Merck 6717) 20 mg/1

Na2Mo〇4 . 2H2〇 (Merck 6521) 30 mg/1 酵母型株的儲備培養物（stock cultures)是藉由混合 1 ml。卩刀的植種培養物與} W配於聚丙烯小管的甘油-溶 ίο 液(80%)並儲存於-14〇。匚。

酵母菌發酵是在培養基規模〇〇〇 ml)或大規模（1〇,〇〇〇 至25,000 ml)型式被施行。對於用在培養基規模發效的植種 培養物生產來說，—填充有ml❸SD2培養基之50-ml 搖瓶被接種以儲備培養物並且在—搖動器（謂啊)上於 15 挪則培養歷時2-3天。3 ml的植種培養物被用來接種1-L 搖瓶中之1。00 ml的SC5培養基。隨後的培養是於罵rpm 以及28_3〇C被貫施歷時4天。培養物的pH_值每天一次以 5 N NaOH被调整到5_6且培養物在第i至3天被供給以！ ml的50%-酵母菌萃取物溶液以及4 mi的 #萄糖-溶液。 2〇 對於大規模發酵來說是採用Bioreactor system (Wave BWech，Tagelswange，CH)。生物培養袋作麵_r被 接種以300(用於10,000 ml SD5培養基）至d (用於 25,000 ml SD5培養基)植種培養物且培養是在贼下被施 仃歷日守4天且一搖動頻率為32/分（角度：1〇。，通氣：〇·25 ^ 200848425 分)每天以饋料批次(fed batch)模式連續加入1〇〇_至25(M咅 脰和的上述饋料溶液（feeding soultions)。每夭 、丨、；sxr

NaOH 調整 pH 至 5_6。 A …培養物的生長可以在不同時間點藉由評估〇d6⑽而被 5 監測。在發酵第4天，無細胞上清液的收穫是藉由離心(在 JA14-轉子於6000 rpm下15分鐘）而被施行。 實施例11 : 羡由胰蛋白酶的裊規水準的決宗 10 從培養基到大規模發酵的表現水準基本上是如同實施 例1〇中所描述的胰蛋白酶抑制活性具有些微修飾地來被分 析。100 μ1的胰蛋白酶(來自豬胰臟，Merck ; 5 jLtg/ml配於 〇,〇〇1 N HCl/0,05〇/o Tween 8〇中）被混合以於室溫下預先培 養歷時3G分鐘的·μ1連續稀釋之條件 15 ΒΛΡΛ0

Tecan讀取儀中於405 nm下歷日夺6〇分鐘。對照培養基被刺 ，'突（Spiked)以預定數量的抑肽酶並且用來計算一允許決定分 泌物中的未知胰蛋白梅抑制活性的標準曲線。 2〇 實施例13 ： 在發酵過程中由序列辨識編號：1所定義之重組型蛋白 質是從10，升的酵母菌培養基中被純化。培養基的pH以 1 M NaOH 5周整至pH 7.8。培養基是透過於2,_啊的離 200848425 心（4°C ; 15 分鐘；Beckmann_Allegra6KR centrifuge)而被澄 清(cleared)。上清液以lml/分鐘被施加到1〇ml胰蛋白酶瓊 脂糖管柱(Sigma-T1763)。管柱被洗滌以7〇 ml 50 mM Tris pH 7·8、250 mM NaCl 以及以 50 ml 50 mM Tris pH 7·8、600 5 mMNaCl。蛋白質被洗提以 l〇〇mi50m]VIKCl/10mMHC：l pH 2.0。樣品以2 ml分裝部份(其各個包含有5⑻μι 200 mM Tris/ClpH7.6，2MNaCl以中和洗出物)被收集。蛋白質是 ^ 透過其胰蛋白酶-抑制活性而被偵測。 含有胰蛋白酶-抑制活性的分裝部份被收集並且被施 10 加到一 Source 15 RPC管柱（GE Healthcare)。該管柱被洗滌 以6 ml 0.1% TFA (緩衝液HPLC_A)，且蛋白質接著以25 ml 梯度從0%到50°/〇的緩衝液HPLC-B (〇·1% TFA，，60%乙腈） 以及5 ml梯度從50%至100%的緩衝液HPLC-B洗提。含 有該蛋白質的樣品被冷凍乾燥，溶解於50 mM Tris pH 7.5 15 且儲存於-20°C。 ^ 實施例14 ： 拮抗胰蛋白酶、跑漿素、血漿血營飪緩素的IC50數值的決定 非-天然hBikD2變異體指抗姨蛋白酶、胞裝素、血漿 2〇 血管舒缓素的IC50數值是在於白色384-井微盤上實施之生 化分析中採用預定螢光基質而被決定。分析緩衝液由50 mM Tric/Cl，pH 7·4,100 mMNaCl，5 mM CaC12、0,08 % (w/v BSA)所組成。詳細的分析條件如下： 34 200848425 酵素 酵素的 最終濃度 目錄號碼(供應商） 受 質 受質的 最終濃度 目錄號碼 (供應商） 胰蛋白酶 5 ng/ml T-6424 (Sigma) Boc-Ile-Glu-Gly- Arg-AMC 5μΜ H100 (Bachem) 胞漿素 50 ng/ml Hplas (Enzyme Research) MeOSuc-Ala-Phe- Lys-AMC 50 μΜ 1-1275 (Bachem) jk聚血管 舒緩素 InM 420307 (Calbiochem) Boc-V al-Pro-Arg-AMC 80 μΜ ES-011 (R&D) 每井10 μΐ的連續稀釋測試化合物被混合以20 μΐ的酵 素溶液並且於室溫下被預培養歷時5分鐘。接著，反應是 5 由加入20 0的受質溶液而被起始。反應接著以360 nm的 激發以及465 nm的發射在一 Tecan讀取儀歷時60至90分 - 鐘。劑量-反應曲線以及IC50數值是使用軟體GraphPad

Prism (4.02)而被決定。 10 【圖式簡單說明】 第1圖：相關蛋白質的胺基酸序列。 第2圖：新穎的hBikD2變異體在酵母菌分泌系統中的 表現水準。在2-3個不同實驗的範圍，數值意指一抑肽酶標 準品的胰蛋白晦抑制活性。 15， 第3圖：抑肽酶以及新穎的hBikD2變異體在各種不同 絲胺酸蛋白酶分析中的活性。至少2個實驗的平均數值。 【主要元件符號說明】 3 5

Claims (1)

1. 200848425 十、申請專利範圍： 1· 一種顯示相較於天然hBikD2表現至少2_倍的增進表 現的hBikD2之非-天然變異體。 5 2·如申請專利範圍第1項的hBikD2之非-天然變異體， 其中該等變異體是選自於由序列辨識編號1至序列辨 識編號40所組成的群組。 3·如申請專利範圍第1項的hBikD2之非-天缺變显I#， - 其中該、«體是序_識舰卜 4.—種編碼-如申請專利範圍第1、2或3項的多肽的 核酸。 5·如申明專利範圍第卜2或3項的多肽或如申請專利範 、 圍第4項的核酸，其係作為一藥劑。 6· —種^申請專利範圍第卜2或3項的多肽或如申請 15 專利範圍第4項的核酸用於製備一應用於治療與出血 有關之疾病的藥劑的用途。 v 7· 一種如申請專利範圍第卜2或3項的多肽或如申請 專利範圍第4項的核酸用於製備一應用於治療一選自 於下列疾病所組成群組的藥劑之用途：在手術期間具 2〇 有出血之升高風險的缺血；對血栓性栓塞症的治療干 〇 預；手術後外科的出血，·休克；多外傷，·敗血症，·散 播性血管内凝血(DIC)，·多重器官衰竭(M〇F);不穩定 型心紋痛；心肌梗塞；中風；栓塞；深度靜脈血拴 (DVT);發炎性疾病；氣喘；風濕病，·侵襲性腫瘤生 長以及轉移；針對疼痛或水腫的治療干涉；在透析期 36 200848425 間防止止血的活化；皮膚老化症狀的治療；彈性纖維 增生病；萎縮；皺紋；血管變化；色素變化；光化性 皮膚角化；黑頭粉刺；囊腫；傷口癒合；黑色素瘤； 黑色素瘤症狀的治療；光化性皮膚角；基底細胞癌； 5 侵襲性鱗狀-上皮細胞瘤；惡性黑色素瘤；多發性硬 化症；纖維化；腦出血；脊髓或腦的發炎；腦部感染 以及肌腱病變。 37