TW200846473A - Method for preparing (4S)-3,4-dihydroxy-2,6,6-trimethylcyclohex-2-enone and derivatives thereof - Google Patents
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Description
200846473 九、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於製備式⑴之光學活性(4S)-4_羥基-2,6,6·三 甲基環己·2-烯-卜酮衍生物之方法及製備式(ΠΙ)之(3S,3’S)· 蝦紅素之方法,後者方法包含首先提及之方法。
【先前技術】 由於蝦紅素(3,3’-二羥基-β,β’_胡蘿蔔素二酮)在位置 3及3,存在兩個對掌性中心,因此其可以如下構型異構體形 式存在:(3S,3,S)、(3R,3,R)、(3S,3,R)及(3R,3,S)。最後提 及之兩種構型異構體相同且表示内消旋體(Carotenoids Handbook,2004, Main List 第 405 號)。 所有三種形式均可見於天然來源中(Carotenoids Handbook,2004, Main List第 404號、第 405 號、第 406號)。 以外消旋前驅體起始之總化學合成產生(3S,3’S)_蝦紅素、 内消旋-蝦紅素及(3R,3fR)-蝦紅素之1:2:1混合物(The EFSA Journal,2005,291,12,Deutsche Lebensmittel-Rundschau, 2004,100,437,Helvetica Chimica Acta,1981,64,2436)。 125930.doc 200846473 然而,(3S,3’S)構型異構體尤其重要。其由綠藻(雨生紅 球藻(Haematococcus pluvialis))以對映純形式生物合成(J·
Applied Phycology,1992,4,165; Phytochemistry,1981,20, 2561) 〇 將來自綠藻之(S,S)-蝦紅素用作膳食增補劑對於人類健 康具有有益作用(J· Nat· Prod.,2006,69,443)。其另外適 合於完全阻斷羅非考昔(rofecoxib ; Vioxx)之有害促氧化效 應(J. Cardiovasc. Pharmacol” 2006,47增子,j 1,S. 7) 〇 然而,鐾於綠藻中(S.S)·蝦紅素之低濃度(J· Agric. Food Chem·,1998, 46,3371),該活性物質之可用性極其有限。 此外,該活性物質係以單脂肪酸酯與二脂肪酸酯加游離蝦 紅素之混合物存在於海藻中,導致分離及純化相當複雜 (尤其參見 Phytochemistry,20,11,2561 (1981); J.Applied Phycology,4,2,165 (1992))。為能夠以較大量及高純度提 供(S,S)-蝦紅素,選用總化學合成技術。 (s,s)-蝦紅素之各種合成法已描述於文獻中。一種策略 係由以下組成:使用非對映異構體鹽(Helvetica Chimica Acta,1981,64, 2447)或非對映異構體酯(Helvetica Chimica Acta,1981,64, 2419)將外消旋前驅體拆分成光學對映體。 亦已報導外消旋前驅體之微生物外消旋體拆分。該等方法 之特定缺陷在於將生成(R,R)·蝦紅素之對映異構體無法利 用且僅可用極為複雜之技術使其再循環。 另一種合成策略係由以下組成:藉由微生物或酶促方法 獲得對映純之合成基本組份(Helvetica Chimica Acta,1978, 125930.doc 200846473 61,2609,Helvetica Chimica Acta, 1981,64,2405)。由於該 等基本組份之氧化態過低,因此必需以多階段合成將其轉 化為(S,S)-蝦紅素前驅體。
WO 2006/039685首次在流程II中描述酮基異佛爾酮 (ketoisophorone)之兩階段對映選擇性氫化以得到對映純C9 二醇,基於 Helv.Chim.Acta,1978, 61,2609 中所述之方法, 在將對映純C9二醇之羥基再氧化後,以多階段合成法自其 獲得(S,S)·蝦紅素前驅體。WO 2006/039685進一步描述式 (Ila)之C9烯醇醚之對映選擇性催化轉移氫化作用以得到式 (la)之相應對映純醇。
所述氫化催化劑為具有對掌性配位體之金屬,較佳為具 有光學活性胺作為配位體之釕催化劑。此方法之一種缺陷 在於使用式(lib)之工業級中間物的經0保護衍生物,
(丨丨b) 〇、H 因此需要額外之合成研究。此外,所需光學活性催化劑 成本極高,以致其在工業方法中之使用因經濟方面之考量 而受阻。 亦已描述用酵母生物催化還原式(lib)之C9烯醇。然而, 125930.doc 200846473 在此情況下,獲得僅65%之對映異構體超量,導致此方法 無濟於工業方法(Helv.Chim.Acta,1981,64, 2447)。 原則上已知脫氫酶適用作製備光學活性羥基化合物之生 物催化劑。其為具有優良特徵之生物催化劑,已用於許多 工業方法中(Angew· Chem· Int·編,2004,43,788, Tetrahedron,2004,60,633,Chiral catalysis-asymmetric hydrogenation supplement to Chemistry Today,2004,22, 26,Current Opinion in Chemical Biology, 2004,8,120, Organic Process Research & Development, 2002,6,558, Tetrahedron: Asymmetry,2003,14, 2659, Chiral catalysis-asymmetric hydrogenation supplement to Chemistry Today, 2004, 22, 43)° WO 2005/108590描述一種藉由酶促還原相應酮來製備某 些光學活性烷醇之方法,該等烷醇諸如(lS)-3-曱基胺基-1-(2-噻吩基)丙-1-醇或(lS)-3-氣-1-(2-噻吩基)丙-卜醇。所用 酶可用於還原具有不同結構之酮的程度未作論述。 所述將兩個對掌性中心引入用於合成S,S’-蝦紅素之前驅 體中之一者的方法為複雜且多階段的任務或不經濟的任 務,以致該等方法似乎幾乎不適於以工業規模實施。 【發明内容】 本發明之一目標為研發一種以工業上可利用之起始物質 起始製備用於合成(S,S’)-蝦紅素之光學活性中間物(若可 能,對映純形式)的簡單而經濟有效之方法,該方法可毫 不困難地整合至”外消旋”蝦紅素之現有工業總合成法中 125930.doc -10- 200846473 and Applied (Carotenoids 第 2 卷,[996,259; pUre Chemistry,2002,74,2213)。 2, 該目標可藉由一種製備式(i)之光學活性羥基_ 6,6-三甲基環己-2-浠-1-酮衍生物之方法達成·
(Ο 其中: R1為氫、CVC^烷基、(VCm芳基烷基、鹼金屬以或鹼 土金屬片段M21/2或(Μ2)+χ-,其中M1為Li、Na、K、或 Cs且M2為Mg、Ca、Sr或Ba且χ-為單價陰離子; 該方法包含以下反應步驟: 其中在逛原等效物之存在下,將選自氧化還原酶類別之 酶(Ε)培育於包含式(11)之三甲基環己j-烯_丨,心二酮衍生物 之培養基中:
〇、R2 〇
J 其中R2與R1相同或不同且為氫、Ci_Ci〇烷基、Crew芳基 烷基、鹼金屬M1或鹼土金屬片段M21/2或(M2)+X-,其中M1 為 Li、Na、K、Rb 或 Cs且 Μ2為 Mg、Ca、Sr 或 Ba,且 χ·Α 單價陰離子; ^ 其中式(Π)化合物經酶促還原為式⑴化合物,且反應過程 期間所'肖耗之還原等效物又藉由藉助於酶(Ε)或另一種酶 125930.doc -11 - 200846473 (E2)使還原劑(rm)轉化為相應氧化產物(〇p)而再生,且視 情況將該氧化產物(OP)至少部分地自反應培養基或自反應 平衡中移除,且分離所形成之產物(I)。 本發明之方法為製備式⑴化合物,其中Ri為氫、Ci_Ci〇 烧基(諸如甲基、乙基、正丙基、異丙基或正己基)、c7_ Cm芳基烷基(諸如苄基)、鹼金屬Μι或鹼土金屬片段皿2^ 或(Μ2)+Χ·,其中Μι為Li、Na、K、Rb或Cs,較佳為Na或 K、尤其為Na,且Μ2為Mg、Ca、Sr或Ba,尤其為Mg,且 X為單價陰離子,諸如鹵離子、乙酸根或鱗酸二氫根。r1 較佳為氫、甲基、Na或K,尤其較佳為氫、甲基或Na,尤 其為氣或納。 在本發明之方法中反應之式(11)起始化合物中,基團R2 與R1相同或不同且為氫、Cl_Cl〇烷基(諸如甲基、乙基、正 丙基、異丙基或正己基)、C7-Cl4芳基烷基(諸如苄基)、鹼 金屬M1或鹼土金屬片段Μ2ι/2或(Μγχ-,其中Ml為Li、 Na、K、Rb或Cs,較佳為Na或κ,尤其為Na,且M2為 Mg、Ca、Sr或Ba,尤其為Mg,且X-為單價陰離子,諸如 齒離子、乙酸根或磷酸二氫根。R1較佳為氫、曱基、Na或 κ’尤其較佳為氫、甲基或Na,尤其為氫或鈉。 氧化還原酶類別之酶(E)(尤其意謂具有脫氫酶活性、適 用於本發明之酶)尤其為醛酮還原酶超家族中之醛酮還原 酶家族中之酶(K.M.B〇hren,B.Bullock,B.Wermuth 及 K.H.Gabbay J.Bi〇l· Chem. 1989, 264, 9547-9551)及短鏈醇 脫氫酶/還原酶(SDR)之酶。後者酶群組例如詳述於 125930.doc -12- 200846473 H.Jornvall, B.Persson, M. Krook, S.Atrian, R.Gonzalez-Duarte,Jf.Jeffery及 D.Ghosh,Biochemistry,1995,34,第 6003-6013 頁,或 U.Oppermann, C.Filling, M.Hult, N.Shafqat, X.Q. Wu5 M.Lindh, J.Shafqat, E.Nordling, Y.Kallberg, B、Persson 及 HLJornvall, Chemico-Biological Interactions,2003, 143,第 247-253 頁。 在所提及之該等酶類別中,醇脫氫酶(尤其短鏈醇脫氫 酶)尤其適用。醇脫氫酶中較佳之酶尤其為以NADH或 NADPH作為還原等效物將式(II)化合物還原為式(I)化合物 之彼等酶。 本發明方法之尤其合適實施例由具有多肽序列之酶(E) 組成,該多肽序列: (i) 為 SEQ ID NO: 2 ;或 (ϋ) 其中與SEQ ID NO: 2相比,至多25%之胺基酸殘基 因缺失、插入、取代或其組合而改變,且仍具有 SEQ ID NO: 2之至少50%的酶活性。 具有氧化還原酶活性(尤其脫氫酶活性)之包含如SEQ ID NO: 2中所示之胺基酸序列的合適酶(E)以及特定揭示之具 有氧化還原酶活性(尤其脫氫酶活性)之同樣可用於本發明 方法中之酶(E)的”功能等效物”或類似物詳述於WO 2005/108590第11至16頁中,該專利以引用的方式併入本 文中。 適用於本發明方法中之具有氧化還原酶活性(尤其脫氫 酶活性)之酶(E)可由以下各屬之微生物來製備:固氮弧菌 125930.doc -13- 200846473 屬(dzoarcws)、紅環菌屬(izonexws 、、 jzovArbj、脫氣單胞菌屬(Dec/iioromo谓s)、鐵桿菌屬 (FerriZmcier/wm)、嗜氫菌屬(PeiaZmcier)、丙酸桿菌屬 (Propionivibrio)、四瓣讓屬(Quadricoccus)、k 環菌屬 (及、史特拉桿菌屬、陶厄氏 菌屬(77mwera)及動膠菌屬(Z(96^/oea)。
尤其適佳用於本發明方法中之具有氧化還原酶活性(尤 其脫氫酶活性)的酶(E)係選自來自固氮弧菌屬之微生物(尤 其來自固氮弧菌屬細菌EbNl)之酶。 依據其胺基酸序列,短鏈醇脫氫酶/還原酶(SDR)可包括 獲自固氮弧菌屬EbNl之苯基乙醇脫氫酶。該等酶之群組 詳述於例如 H.J6rnvall,B.Persson, M.Krook, S.Atrian, R.Gonzalez-Duarte,J.Jeffery及 D.Ghosh之 ’’Biochemistry”, 1995,34,第 6003-6013 頁或 U.Oppermann,C.Filling,
M.Hult, N.Shafqat, X.Q.Wu, M.Lindh, J.Shafqat, E.Nordling,Y.Kallberg,B.Persson及 H.Jornvalli"Chemico-Biological Interactions’’,2003,143,第 247-253 頁中。SDR 群組中之個別代表的胺基酸序列彼此間可廣泛不同。儘管 如此,仍已知SDR群組中高度保留某些胺基酸或胺基酸區 域。SDR之重要保留區域描述於C.Filling,K.D.Berndt, J.Benach, S.Knapp, T.Prozorovski, E.Nordling, R.Ladenstein, H.Jornvall 及 U.Oppermann, Journal of Biological Chemistry,2002, 277,第 25677-25684頁中。 固氮孤菌屬物種之實例為厭氧固氮弧菌(dzoarcws 125930.doc •14- 200846473 anaerobius) 、 Azoarcus buckelii 、 Azoarcus communis 、 Azoarcus evansii 、 Azoarcus indigens 、 Azoarcus toluclasticus 、 Azoarcus tolulyticus 、 Azoarcus ίο/評似、固氮弧菌屬、固氮5瓜菌屬22Lin、固氮孤菌屬 BH72、固氮弧菌屬CC-11、固氮弧菌屬CIB、固氮弧菌屬 CR23、固氮弧菌屬EB1、固氮弧菌屬EbNl、固氮弧菌屬 FL05、固氮弧菌屬HA、固氮弧菌屬HxNl、固氮弧菌屬 mXyNl、固氮弧菌屬PbNl、固氮弧菌屬PH002、固氮弧菌 屬T及固氮弧菌屬ToNl。 以獲自固氮弧菌屬細菌EbNl之脫氫酶尤其適佳用作本 發明方法中之酶(E)。 本發明之方法較佳在酶(E)(其中該酶係由如SEQ ID NO: 1中所示之核酸序列或其功能等效物編碼)之存在下進行。 可用於編碼可用於本發明方法中之具有脫氫酶活性之酶 (E)的核酸序列詳述於WO 2005/108590中第16至22頁中, 該專利以引用的方式併入本文中。 在該方法之一尤其較佳實施例中,該具有脫氫酶活性之 酶係選自包含如SEQ ID NO: 2中所示之胺基酸序列或自其 衍生之序列的酶,其中至多25%、較佳至多20%、尤其較 佳至多 15%、尤其至多 10%、9%、8%、7%、6%、5%、 4%、3%、2%、1%之胺基酸殘基已因缺失、取代、插入或 缺失、取代與插入之組合而改變,其中與SEQ ID NO: 2相 比已改變之多肽序列仍具有SEQ ID NO: 2之至少50%、較 佳至少65%、尤其較佳80%、尤其90%以上的酶活性。就 125930.doc -15- 200846473 此而言,SEQ ID NO:2之酶活性旨在意謂使式(η)之酮、尤 其其中R1=H或Na的式(II)之酮對映選擇性地還原為具有通 式⑴之(S)醇的能力。 本發明之方法經由添加還原等效物、尤其Nadh或 NADPH作為氫化物來源而進行。由於nadh&Nadph為極 其昂責之化合物,因此該等還原等效物一般僅以催化量使 用。原則上可用於使反應中所消耗之還原等效物再生的還 原劑(RM)為無機或有機化合物(諸如亞磷酸鹽或醇),或為 電化學方法,諸如在陰極處還原。較佳用於本發明方法中 之還原劑(RM)為包含至少一個一級醇或二級醇官能性 CH(〇H)之有機化合物,諸如異丙醇、2_丁醇、戊醇、 已醇、3·已醇或還原糖,諸如葡萄糖,尤其為異丙醇或葡 萄糖。還原劑(RM)藉助於酶(E)或另一種酶(E2)而轉化為氧 化產物(OP),該氧化產物(〇p)係經至少部分地自反應培養 基或自反應平衡中移除。若還原劑(RM)包含二級醇7 =其 亦常稱為犧牲醇且相應地形成作為犧牲酮之氧化產物 (OP)。 在本發明之—較佳實施例中,所添加之犧牲醇不僅用於 使㈣耗之還原等效物再生,而且用作共溶劑。可能在液 體單相m多相系統中進行操作,單相通常由水及/ 或水可混溶性溶劑組成。 ▲以所用每莫耳式(„)之三甲基環己_2_稀-m-二綱衍生物 計較佳以0.001至100麵〇卜尤其較佳以〇 〇iH軸〇1還 原等效物之量使用還原等效物。 125930.doc -16- 200846473
反之方法中所形成之氧化產物(OP)可至少部分地自 =養基或自反應平衡中移除。在二級醇(諸如異丙醇) 遇原劑(RM)之情況下,可能將所形成之所謂犧牲酮 ,、丙醇作為犧牲醇之情況下為丙酮)以各種方式(例如經 由:擇性膜或藉由萃取或蒸镏方法)移除。較佳採用蒸餾 法來移除酮,諸如丙在藉由蒸顧移除㈣中,通常亦存 在移除部分犧牲醇,^在有些情況下,亦存在移除部分水 ^ °該等蒸鶴損耗-般藉由隨後計量補充犧牲醇及(若適 當)水來補償。蒸鶴速率以反應體積計通常在〇.〇2。偏η至 /min之範圍内,較佳在〇〇5o/o/min之範圍 内反應為之夾套溫度在反應内部溫度以上5-70克耳文 (kelvm)之間,較佳ι〇_4〇克耳文之間。 在不揮發性氧化產物(〇p)之情況下,如在將葡萄糖氧化 為葡萄糖酸之情況下,後者藉由環化為葡萄糖酸内酯而自 還原劑(RM)與氧化劑(0M)之間的反應平衡中移除。儘管 可能藉由亦催化式(Π)化合物還原為式⑴化合物之相同酶 (E)進行多種犧牲醇之氧化作用,但仍必需添加二級酶 (E2)(例如葡萄糖脫氫酶)用以葡萄糖之氧化作用。 在揮發性氧化產物之情況下,蒸餾在1-5〇〇毫巴(mbar)、 較佳10-200毫巴之壓力範圍下進行尤其適宜。 本發明方法之一較佳實施例為在微生物之存在下進行式 (II)化合物轉化為式(I)化合物,該微生物係選自以下菌 科·腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、假單胞菌科 (Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、乳桿菌科 125930.doc -17- 200846473 (Lactobacillaceae)、鏈黴菌科(Streptomycetaceae)、紅球菌 科(Rhodococcaceae)、紅環菌科(Rhodocyclaceae)及諾卡氏 菌科(Nocardiaceae)。該微生物尤其可為經核酸構築體轉 移之重組微生物,該核酸構築體編碼具有氧化還原酶活 性、較佳脫氫酶活性、尤其如上定義之醇脫氫酶活性的 酶。 在調控核酸序列之遺傳控制下包含編碼可用於本發明方 法中之蛋白(亦即酶(E))之核酸序列的表現構築體及包含該 等表現構築體中之至少一者的相應載體詳述於w〇 2〇05/108590第22至25頁中,該專利以引用的方式併入本 文中。 經合適載體或構築體轉化且可用於產生可用於本發明方 法中之多肽(亦即酶(E))的重組微生物詳述於w〇 2005/108590第25至27頁,該專利以弓丨用的方式併入本文 中。 與本發明方法中之酶(E)功能一致之多肽或其具有生物 學活性之功能片段的重組製備方法(其中培養產生多肽之 微生物,若適當誘導多肽之表現且將其自培養物中分離) 詳述於WO 2005/108590第27至29頁中,該專利以引用的方 式併入本文中。多肽亦可藉由所述方法以工業規模生產。 根據本發明使用之具有氧化還原酶活性、尤其脫氫酶活 性的酶(E)可作為游離酶或固定化酶(E)而用於本發明之方 法中。 本發明方法之較佳實施例包含下述步驟中之至少勾、b) 125930.doc -18- 200846473 及d): a) 自天然來源中分離或重組產生可產生具有脫氫酶活性 之酶的微生物; b) 繁殖該微生物; 若適當自微生物中分離具有脫氫酶活性之酶,或製備 包含該酶之蛋白溶離份;及 d)將來自階段b)之微生物或來自階段c)之酶轉移至包含 式I化合物之培養基中。
本發明之方法有利地在〇。(:與95。(:之間,較佳在1〇。〇與 85 C之間,尤其較佳在^艽與乃它之間的溫度下進行。 本發明方法中之pH值有利地保持在?]^ 4與1)11 12之間, 較佳保持在ΡΗ 4·5與pH 9之間,尤其較佳保持在pH 5與阳 8之間。 本發明之方法中’對映純或對掌性產物或光學活性醇 意謂展示對映異構體富集之對映異構體。本發明之方法較 佳達成至少7G%對映異構體超量㈣、較佳最少8G%對映異 構體超量、尤其較佳最少90%對映異構 ;: 最少燃對映異構體超量之對映純^ 體方法可能使用包含合適核酸、核酸構築體或载 細胞。亦可使用休眠細胞或瓦解之細胞。瓦 戈“例如因經例如溶劑處理而變成可通透之細胞 或⑽處理、機械處理(例如一 =處理一裂之細胞。《此方式所獲得:== 地適用於本發明之太& h τ平取物有利 方法。經純化或經部分純化之酶⑻亦 125930.doc 200846473 可用於該方法。可有利地用於該反應之固定化微生物或酶 同樣合適。 若本發明之方法使用游離生物體或酶,則其在萃取之前 宜例如藉由過濾或離心而移除。 以本發明方法所製備之式⑴化合物(例如(3 3,‘二經 基2’6,6-二甲基環己烯酮)可有利地藉由萃取或沈澱而 自反應水溶液中分離。初始時有利地將產物溶液過濾以移 除不溶解之生物物質,較佳經由添加諸如寅氏鹽(Celite)之 助濾劑。隨後將產物(其中r1 =烷基)藉由經不可與水混溶 之有機溶劑萃取而移除。合適溶劑之實例為甲苯或其他環 烴或開鏈烴、氯化烴(諸如二氯甲烷)、乙酸乙酯或乙酸丁 酯及醚(諸如MTBE或二異丙醚)。 式I化合物(其中R^H或驗金屬或驗土金屬)原則上可如 Helv.Chim.Acta 64, 2436,1981中所述自反應混合物中分 離。初始時將產物溶液調整為1至3之PH值,較佳為pH丄。 較佳以諸如鹽酸或硫酸之無機酸進行酸化,尤其較佳以硫 酸進行酸化。在此情況下,可移除產物沈澱物。然而,酸 性產物溶液較佳經有機溶劑萃取數次。適用於此之溶劑為 氯化烴(尤其為二氯甲烷)、醚(諸如MTBE或二異丙及乙 酸乙酯。此萃取可分批進行或連續進行。產物萃取可藉由 在酸化之前濃縮水相或藉由“鹽析”來促進;然而該等操 作對於自反應溶液中移除產物而言並非必需的。 以用於該反應之式(II)之受質(諸如,其中R2=Na)計,在 該等處理方法中可能以60%至>95%之產率、較佳8〇%至 125930.doc -20- 200846473 95%之產率分離本發明方法之式(I)產物。該產物具有>98% 之對映異構體超量的高對映純度。若需要,則可如Helv. Chim. Acta 64, 2436, 1981中所揭示藉由結晶來純化,但較 佳如Helv· Chim· Acta 64, 2447,1981中所揭示無需進一步 純化操作即用於S,S-蝦紅素之進一步合成。 本發明之方法可分批操作、半分批操作或連續操作。 可如Biotechnology第3卷,第2版,Rehm等人編, (1993),尤其第II章中所述,有利地在生物反應器中進行 本發明之方法。 本發明進一步係關於製備式(III)之(3S,3’S)-蝦紅素之方 法,該方法包含上述製備式(I)之光學活性(4S)-4-羥基-2,6,6-三曱基環己-2-稀-1-酮衍生物作為(3S,3,S)-蝦紅素之 總合成中之一個反應步驟的方法。製備式(II)之起始化合 物之合成步驟與藉由複數個階段將式⑴之對映純化合物轉 化為式(III)之(3S,3’S)-蝦紅素之合成步驟原則上由文獻中 已知。式(I)之光學純化合物(其中R1為氫且藉由(R2)之對映 選擇性還原作用(其中R2較佳為Na)所獲得)轉化為(3S,3’S)-蝦紅素可如文獻(WO 2006/039685 ; Helv.Chim.Acta,1981, 64,2447 ;如上,1981,64,2405)中之各種描述發生,而不 發生外消旋作用。 該等方法對應於工業蝦紅素之合成(Carotenoids,第2 卷,1996, 259; Pure and Appl· Chem·,2002, 74, 2213)且提 供工業上及經濟上有利之(3S,3’S)_蝦紅素合成途徑。 本發明亦係關於具有多肽序列之酶(E)用於製備式(I)化 125930.doc -21 - 200846473 合物之用途,該多肽序列·· (i)為 SEQ ID NO: 2 ;或 (11)其中與SEQ ID NO·· 2相比,至多25%之胺基酸殘基 因缺失、插入、取代或其組合而改變,且仍具有 SEQ ID NO: 2之至少50%的酶活性。上述酶較佳在 用於製備(3S,3fS)-蝦紅素之方法中用於製備式(^化 合物,其中式(I)化合物係在其他反應步驟中轉化 為式(III)之(3S,3’S)-蝦紅素。 本發明方法之優勢在於式(I)化合物係在該等化合物之優 良產率下以高對映純度獲得。 【實施方式】 本發明藉由以下實例闡明,但該等實例不限制本發明。 實例 定義: 化合物1 : 2-羥基-3,5,5-三曱基環己_2·烯],4_二酮(其中R2 等於氫之式(II)) 化合物la ·· 3,5,5·三甲基-1,4-二側氧基環己_2_烯_2_醇鈉 (其中R2等於鈉之式(Π)) 化合物lb : 2-甲氧基-3,5,5-三曱基環己二酮(其 中R2等於曱基之式(π)) 化合物2 ·· (4S)-3,4-二羥基-2,6,6-三甲基環己_2·烯酮(其中 Rl等於氫之式(I)) 化合物2b : (4SM-羥基-3-甲氧基-2,6,6-三甲基環己冬烯 _ (其中R1等於甲基之式(I)) 125930.doc -22- 200846473 實例1 : 製備重組苯基乙醇脫氫酶 在100 ml艾儉美氏燒瓶(Erlenmeyer flasks)(隔板)中,在 37°C下將如WO 2005/108590實例1及2中所述製備之大腸桿 菌 LU1 1558於 20 ml 之 LB-Amp/Spec/Cm (1〇〇 M<g/1安比西林 (ampicillin)、100 με/1 大觀黴素(spectinomycin)、20 /1
氣黴素(chloramphenicol))、〇·1 mM之 IPTG、0·5 g/L之鼠 李糖(rhamnose)中培養18小時,以5000 g/10 min離心,用 10 mM TRIS * HCl(pH 7·0)洗滌一次,且再懸浮於2 ml相 同緩衝液中。 藉由在振動研磨機(3x5 min,中間物於冰上冷卻)中用 〇·7 ml玻璃珠粒(d=〇.5 mm)將大腸桿菌LU1 1558細胞糊狀物 磨碎來製備無細胞粗蛋白萃取物。 實例2 :測定獲自大腸桿菌LU1 1558之重組脫氫酶之活性 伴隨震盪將10 μΐ無細胞粗萃取物(實例丨;約1〇 蛋 白總量)培育於770 μΐ之50 mM磷酸鉀緩衝劑(具有!爪河 MgCl2, ρΗ 6·5)、1〇〇 μ1異丙醇、1〇〇 此_聰液㈣ Μ)及20 μΐ之化合物1(1 Μ,於DMS〇中)之混合物中。類似 於實例3分析混合物。形成平均〇13 mM之3,4_二羥基_ 2,“-三甲基環己_2_烯_。在培養液中未添加鼠李對 照實驗中,不可偵測到轉化。 實例3 : 分析化合物1及化合物2 及產物濃度 ’亦可能測 。除濃度之 定對映異構 可藉由HPLC來測定前驅體濃度 外,視固定相及移動相之選擇而定 體超量。 125930.doc -23- 200846473 固定相·· Chiralpak AS-RH,150*4·6 mm,Daicel,已在 40°C下平衡
移動相:溶離劑A : 10 πιΜ ΚΙΤΡΟΙ 溶離劑Β : CH3CN 梯度:時間[min] A[%] B[%]流動速率[mL/min] 0 90 10 0.5 10 90 10 0.5 11 60 40 0.5 20 60 40 0.5
流速: 0.5 ml/min 偵測: 於260 nm下之UV偵測 滯留時間: (+)-3,4-二羥基-2,6,6-三甲基環己_2_烯酮:約9.3 min (ϋ4·二羥基-2,6,6_三甲基環己_2_烯酮:約9 8 min 、工土 3,5,5-一曱基環己烯-i,4-二酮:約17.6 min 經由可信物質建構校準系列,以容許測定未知樣本之濃 度’且使得可能分配對映異構體。 實例4:製備用於輔因子再生之葡萄糖脫氮酶 葡萄糖脫氫酶可用於辅因子再生。該酶可獲自商業來源 ^綠心eChemieals,訂購號第22观或第i9 i〇 就)或獲自内部來源。後者包含大腸桿菌襲咖純系, 125930.doc -24 - 200846473 該純系在質體pUC 19(此構築體稱為大腸桿菌LUl 1293)中 包含來自枯草桿菌(Bacillus subtilis)(Genbank寄存編號 M12276)之葡萄糖脫氫酶基因。 配製以下培養基用於大腸桿菌LU11293之醱酵: β 560 g 酵母萃取物(65%) 448 g 胰化蛋白腺(Difco) 42 g KH2PO4 84 g Na2HP04 _ 644 g 甘油(99%) 100 mL SL4溶液(5 x) 1 g Tegosipon 3062 用水將培養基配至13·51,將pH值調整至 7.0,移除約300 ml用於預培養物,且接著在 122°C下滅菌歷時30 min。 添加無菌鹽溶液* ^ *鹽溶液 ·· 2.1 g CaCl2 * 2 H20 3.5 g MgS04 * 7 H20 14 g NH4CI 14 ml 安比西林溶液(100 mg/ml) 溶解於500 ml水中且藉由過濾滅菌。 將150 ml部分培養基在兩個1 1艾倫美氏燒瓶中滅菌且補 充5 ml無菌鹽溶液。自LB-安比西林瓊脂板接種後,將預 培養物在37°C及200 rpm下培育12小時,且添加至醱酵培 養基中。在37°C、0,1巴内部壓力、pH 7.0(用20%磷酸及 125930.doc -25- 200846473 25% NaOH控制)下,以7.5 l/min之氣化速率及3〇〇 rpm(以 10-20 Ι/min供風及 500-1500 rpm將 p02控制在 20%與 5〇%之 間)開始醱酵。2 h之後,添加〇·ι mM IPTG用於誘導,且 總計13 h之後,醱酵終止。收穫細胞(1·3 kg)並洗滌且接著 在-20°C下儲存直至使用(2-20 g/Ι,於混合物中)。 實例5 : 輔因子再生 輔因子之再生亦可藉由苯基乙醇脫氫酶來進行。在此情 況下,不必要添加單獨之再生酶。苯基乙醇脫氫酶接受多 種簡單醇作為還原劑。其經氧化為相應羰基化合物。適合 於以苯基乙醇脫氫酶再生NADH之簡單醇為異丙醇。若在 反應混合物中使用1〇%之異丙醇而非葡萄糖脫氫酶及葡萄 糖,則可如實例2中所示測定苯基乙醇脫氫酶之活性。 實例6 :使用獲自固氮弧菌屬EbNl之重組苯基乙醇脫氫 酶製備(4S)-3,4-二羥基-2,6,6-三甲基環己-2-烯酮(化合物2) 如實例1中,將大腸桿菌LU1 1558培養、收穫且轉化為 無細胞粗萃取物。將該萃取物與0·2rnMNAD+及5.4ml之 1·68 Μ 3,5,5-三甲基-i,4-二側氧基環己_2-烯_2_醇鈉溶液 (化合物la)混合且在30°C下培育4811。 獲自LU11558之無細胞粗萃取物(々250 mg蛋白總量) 19.8 g葡萄糖 0.072 g NAD,Na鹽 GDH粗萃取物(二180 mg蛋白總量) 450 ml 缓衝溶液(50 mM鱗酸卸、1 mM MgCl2,pH 6.5) 5·4 ml 2-羥基-3,5,5-三甲基-4-侧氧基環己_2_烯醇鈉溶液 125930.doc -26 - 200846473 (1.68 Μ)在4·75 h之後,添加5.4 ml受質溶液,且在6 h之 後,添加16.2 ml。藉由用5 M NaOH及1 M HC1滴定使反應 物pH值保持在6.0-7.0,且繼而進行HPLC分析。 實例7 : 使用獲自固氮弧菌屬EbNl之重組脫氫酶製備 (4S)·4·羥基-3-曱氧基·2,6,6·三甲基環己-2-烯酮 如實例1中,將大腸桿菌LU1 1558培養、收穫且轉化為 無細胞粗萃取物。將該萃取物與0.2 mM NAD+及5.4 ml之 1·68 Μ 3,5,5-三曱基-l,4-二側氧基環己-2·烯-2-醇鈉溶液混 合且在30°C下培育48 h。 獲自大腸桿菌LU1 15 5 8之無細胞粗萃取物(义20 mg蛋白 總量) 19.8 g 葡萄糖 0.014 g NAD,Na鹽 10 ml 異丙醇
450 ml 緩衝溶液(50 mM磷酸鉀、1 mM MgCl2,pH 6.5) 1.822 g 2-曱氧基_3,5,5-三甲基環己·2_烯-1,4-二酮(化合 物lb) 反應之後進行HPLC分析。在7 h之後,藉由添加3·6 g 2-甲氧基-3,5,5…三曱基環己_2_烯-i,4-二酮補足前驅體之量。 在75小時之後,消耗60%以上之前驅體。 【圖式簡單說明】 圖I描繪SEQ ID ΝΟ:1,其為獲自固氮弧菌屬EbNl之苯 基乙醇脫氫S#之核酸序列(Genbank ID 25956124,區域: 125930.doc -27- 200846473 25073至25822)。 圖II描繪SEQ ID NO: 2,其為獲自固氮弧菌屬EbNl之苯 基乙醇脫氫酶之胺基酸序列(Genbank蛋白ID CAD58337)。
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Claims (1)
- 200846473 十、申請專利範圍··(I) 其中: 為氫、Ci-Cw烷基、c7_C14芳基烷基、鹼金屬 _ 驗土金屬片段或(MYx-,其中M、Li、Na、K、^ 或Cs且μ2為Mg、Ca、^或以,且『為單價陰離子;b 該方法包含以下反應步驟: 其中在遷原等效物之存在下,將選自氧化還原酶類別 酶(E)培育於包含式(11)之三甲基環己-2-烯-1,4-二_扩之 物之培養基中: 竹生 〇^C° <"> 〇 〇、2 , 其中R2係與R1相同或不同且為氫、Ci_C⑼烷基、芳 % 基烷基、鹼金屬M1或鹼土金屬片段M',2或(Μ2)+χ-,其 中 M1 為 Li、Na、K、Rb 或 Cs 且 M2 為 Mg、Ca、Sr 或 Ba, , 且X·為單價陰離子; 其中該式(II)化合物經酶促還原為該式化合物,且該 反應過程期間所消耗之該等還原等效物又藉由藉助於該 酶(Ε)或另一種酶(Ε2)使還原劑(Rm)轉化為相應氧化產物 (OP)而再生,且視情況將該氧化產物(〇p)至少部分地自 125930.doc 200846473 該反應培養基或自反應平衡中移除,且分離所形成之該 產物(I)。 2·、如請求項1之方法,其中該酶(E)為醇脫氫酶。 3·如請求項2之方法,其中該醇脫氫酶在以NADH或 NADPH作為還原等效物下將該式(II)化合物還原為該式 (I)化合物。 4.如請求項1至3中任一項之方法,其中該酶(E)具有多肽序 列,該多肽序列: (i) 為 SEQ ID NO: 2 ;或 (ϋ) 其中與SEQ ID NO: 2相比,至多25%之胺基酸殘基 因缺失、插入、取代或其組合而改變,且仍具有 SEQ ID NO: 2之至少50%的酶活性。 5·如請求項1至3中任一項之方法,其中該酶(E)係選自獲自 固氮孤菌屬(Azoarcus)之微生物的酶,尤其為獲自固氮 弧菌屬細菌EbNl之酶。 6. 如請求項1至3中任一項之方法,其中該酶係由如SEQ ID NO: 1中所示之核酸序列或其功能等效物編碼。 7. 如請求項1至3中任一項之方法,其中將包含至少一個一 級醇或二級醇官能基CH(OH)的有機化合物、尤其異丙醇 或葡萄糖用作還原劑(RM)。 8 ·如請求項1至3中任一項之方法,其中該式(II)化合物之 轉化係在選自以下菌科之微生物存在下發生:腸桿菌科 (Enterobacteriaceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、 根瘤菌科(Rhizobiaceae)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)、 125930.doc 200846473 鏈黴菌科(Streptomycetaceae)、 紅球菌科 (Rhodococcaceae)、紅環菌科(Rhod〇cyclaceae)及諾卡氏 菌科(Nocardiaceae)。 9. 如請求項1至3中任一項之方法,其中該微生物為經核酸 構築體轉化之重組微生物,該核酸構築體編碼如請求項 1至4中任一項所定義之酶。 10. 如請求項1至3中任一項之方法,其中式⑴中之“為氫、 甲基或鈉,尤其為氫或鈉。 ’ 11· 一種製備(3S,3’S)-蝦紅素之方法,其包含如請求項丨至⑺ 中任一項之方法作為(3s,3,s)_蝦紅素之總合成中之一反 應步驟。 12· —種具有多肽序列之酶(£)用於製備式⑴化合物之用途, 該多肽序列: i.為 SEQ ID N〇:2 ;或 11其中與SEQ ID N0: 2相比,至多25%之胺基酸殘基因 缺失、插入、取代或其組合而改變,且仍具有SEQ ID NO: 2之至少50%的酶活性。 13·如請求項12之用途,其中該式⑴化合物係在其他反應步 驟中經轉化為式(II]t)之(3S,3,S)_蝦紅素。 125930.doc
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