KR20210043606A - 1,3-프로판디올 및 부티르산 생산이 개선된 미생물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 약화된 글리세롤 키나제 활성을 포함하는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 새로운 돌연변이 균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 적어도 상기 돌연변이 균주, 및 씨. 스포로게네스 및 씨. 스페노이데스 중에서 선택된 클로스트리디움의 적어도 하나의 다른 종을 포함하는 클로스트리디움의 컨소시엄에 관한 것이다. 이 변형된 균주는 글리세롤 함량이 높은 적합한 배양 배지에서 성장 및 1,3-프로판디올의 생산에 적합화될 수 있으므로, 본 발명은 또한 적어도 이 돌연변이 균주를 적합한 배양 배지에서 배양함으로써 1,3-프로판디올 및 부티르산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 1,3-프로판디올을 생산할 수 있고 약화된 글리세롤 키나제 활성을 포함하는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum)의 새로운 돌연변이 균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 적어도 상기 돌연변이 균주, 및 씨. 스포로게네스 (C. sporogenes) 및 씨. 스페노이데스 (C. sphenoides) 중에서 선택된 적어도 하나의 다른 클로스트리디아 (Clostridia)를 포함하는 클로스트리디움 종의 컨소시엄에 관한 것이다. 이 변형된 균주는 글리세롤 함량이 높은 적합한 배양 배지에서 성장 및 1,3-프로판디올의 생산에 적합화될 수 있다. 본 발명은 또한 적어도 이 돌연변이 균주를 적합한 배양 배지에서 배양함으로써 1,3-프로판디올 및 부티르산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
트리메틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜로도 불리는 1,3-프로판디올 (PDO)은 가장 오래된 공지된 발효 산물 중 하나이다. 이는 원래 1881년 초에 클로스트리디움 파스테우리아눔 (Clostridium pasteurianum)을 함유하는 글리세린 발효 배양물에서 오거스트 프레운드 (August Freund)에 의해 확인되었다. PDO는 글리세린 발효의 전형적인 산물이며 다른 유기 기질의 혐기성 전환에서 발견되었다. 오직 극소수의 유기체들 (그들 모두는 박테리아)만이 이를 형성할 수 있다. 그들은 클렙시엘라 (Klebsiella) (케이. 뉴모니아에 (K. pneumoniae)), 엔테로박터 (Enterobacter) (이. 아글로메란스 (E. agglomerans)), 시트로박터 (Citrobacter) (씨. 프레운디이 (C. freundii)), 락토바실리 (Lactobacilli) (엘. 브레비스 (L. brevis) 및 엘. 부크네리 (L. buchneri)), 및 씨. 부티리쿰 (C. butyricum) 및 씨. 파스테우리아눔 (C. pasteurianum)의 클로스트리디아 속 그룹의 박테리아를 포함한다.
이작용성 유기 화합물로서의 PDO는 잠재적으로 많은 합성 반응에, 특히 폴리에스테르, 폴리에테르, 폴리우레탄, 및 특히 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트 (PTT)를 생산하기 위한 중축합용 단량체로 사용될 수 있다. 이들 구조 및 반응 특성은 화장품, 직물 (의류 섬유 또는 바닥재) 또는 플라스틱 (자동차 산업 및 포장 또는 코팅)에서 여러 적용으로 이어진다.
PDO는 상이한 화학 경로로 생산될 수 있지만 극도로 오염된 물질을 함유하는 폐류를 생성하고 생산 비용이 높다. 따라서, 화학적으로 생산된 PDO는 1,2-에탄디올, 1,2-프로판디올 및 1,4-부탄디올과 같은 석유화학적으로 이용가능한 디올과 경쟁할 수 없다. 이러한 경쟁력을 높이기 위해, 듀폰 (DuPont)은 1995년 글루코스를 PDO로 생물학적으로 전환하기 위한 연구 프로그램을 시작하였다. 이 공정은 환경 친화적이지만, i) 매우 비싼 보조인자인 비타민 B12를 사용하고 ii) 생산 균주의 불안정성으로 인해 불연속적인 공정이라는 단점을 갖는다.
바이오-디젤 산업에 의해 생산되는 다량의 글리세롤을 이용할 수 있기 때문에, 보다 높은 탄소 수율을 갖는 연속적인 비타민-B12-무함유 공정이 오히려 유리할 것이다.
PDO는 특히 염 및 물과 혼합된 약 80-85%의 글리세롤을 함유하는 바이오디젤 생산으로부터의 원치 않는 부산물인 글리세린으로부터 생산될 수 있다는 것이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
씨. 부티리쿰은 이전에 배치 및 2-단계 연속 발효에서 산업용 글리세린에 함유된 글리세롤로부터 성장하고 PDO를 생산할 수 있다고 기술되었다 (Papanikolaou et al., 2000). 그러나, 가장 높은 글리세롤 농도에서 수득된 최대 PDO 역가는 0.02 h-1의 희석률에서 48.1 g.L-1이었으며, 이는 0.96 g.L-1.h-1의 생산성을 의미한다. 배양은 90 g.L-1의 페드 배지 (fed medium)에서 글리세린으로부터 유래하는 글리세롤의 최대 농도로, 박테리아 바이오매스 생산 증가를 돕는 것으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 유기 질소를 함유하는 값비싼 화합물인 효모 추출물의 존재 하에서 수행되었다.
출원 WO 2006/128381은 클렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae), 씨. 부티리쿰 또는 씨. 파스테우리아눔과 같은 천연 PDO 생산 유기체를 사용하여 배치 및 유가 배양으로 PDO를 생산하기 위한 이 글리세롤의 사용을 개시한다. 또한, WO 2006/128381에서 사용된 배지는 효모 추출물도 함유한다. 이 특허 출원에서 기재되는 바와 같이, 도달된 최대 생산성은 0.8 내지 1.1 g.l-1.h-1이었다.
"씨. 아세토부틸리쿰 (C. acetobutylicum) DG1 pSPD5" 균주로 불리는, 씨. 부티리쿰으로부터의 비타민 B12-독립적 글리세린-디히드라타제 및 PDO-디히드로게나제를 함유하도록 변형된 씨. 아세토부틸리쿰 균주의 성능은 문헌 (Gonzalez-Pajuelo et al., 2005)에 기재되어 있다. 이 균주는 원래 최대 120 g.l-1의 순수한 글리세롤을 함유하는 페드 배지에서 성장하고 PDO를 생산한다. 또한, 최대 60 g.l-1의 순수 글리세롤 또는 산업용 글리세린에 함유된 글리세롤을 함유하는 페드 배지에서의 분석은 어떠한 차이도 나타내지 않았다. 이들 결과는 효모 추출물의 존재 하에서 수득된 것이었다. 또한, 산업용 글리세린으로부터 유래하는 글리세롤의 60 g.l-1 초과 농도로의 시험은 수행되지 않았다. 야생형 씨. 부티리쿰을 변형된 미생물 "씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5"와 비교 시, 전체적으로 유사한 거동이 관찰되었다.
특허 출원 WO 2010/128070에서, 본 발명자들은 문헌 (Gonzalez-Pajuelo et al. (2005))에 기재된 바와 같은 씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 균주가 산업용 글리세린에 함유된 높은 농도의 글리세롤을 갖고 효모 추출물이 없는 배지에서 성장하도록 적합화시키는 공정을 기재하였다. 씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 적합화된 균주의 생성된 집단은 산업용 글리세린에 함유된 최대 120 g.l-1의 글리세롤을 함유하는 배지에서 PDO를 생산할 수 있었으며, PDO의 역가는 최대 53.5 g.L-1이고, 수율은 최대 0.53 g.g-1이고, 생산성은 최대 2.86 g.L-1.h-1이었다. 특허 출원 WO 2012/062832에서, 본 발명자들은 WO 2010/128070 특허 출원에 기재된 것과 동일한 공정에 의해 수득된 씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 적합화된 균주의 또 다른 집단으로부터 클론의 단리를 기재하였다. 이 제2 집단은 최대 50.45 g/L-1의 PDO 역가, 최대 0.53 g.g-1의 수율 및 최대 3.18 g.L-1.h-1의 생산성으로 산업용 글리세린에 함유된 약 105 g.L-1의 글리세롤을 함유하는 배지에서 PDO를 생산할 수 있었던 반면, 단리된 클론은 최대 51.30 g/L-1의 PDO 역가, 최대 0.50 g.g-1의 수율 및 최대 3.05 g.L-1.h-1의 생산성으로 산업용 글리세린에 함유된 약 105 g.L-1의 글리세롤을 함유하는 배지에서 PDO를 생산할 수 있었다.
부티레이트 (부티르산 또는 부탄산으로도 명명됨, BA로 약칭됨)는 구조식 CH3CH2CH2-COOH를 갖는 카르복실산으로, 휘발성, 무색, 불쾌한 냄새가 있는 유성 액체이며, 물, 및 에탄올 및 에테르와 같은 용매 둘 다와 혼합될 수 있다. 부티레이트는 i) 다른 화학물질의 제조, ii) 동물 영양에서 사료 첨가제 iii) 식품 향미제 또는 식품 보충제, iv) 약제학적 및 화장 조성물을 포함한 다양한 적용에 사용된다. 특히, 부티레이트는 가장 상업적으로 중요한 혼합 에스테르 중 하나인 셀룰로스 아세테이트 부티레이트와 같은 열가소성 중합체의 생산에서 공급 원료로 사용될 수 있다. 실제로, 셀룰로스 아세테이트 부티레이트는 종종 페인트 및 중합체에 존재한다. 부티레이트는 또한 내연기관용 바이오연료 및 가능한 가솔린 대체물인 부탄올의 전구체이다.
현재, 산업 규모의 부티레이트 생산은 주로 화학적 합성을 사용하여, 예컨대 n-부틸 알콜 또는 부티르알데히드를 산소 또는 유기 산화제로 산화시켜 수행된다. 대안적으로, 부티레이트는, 비록 이 방법은 비용이 많이 들고 어렵지만, 추정 2-4%의 부티레이트를 함유하는 버터로부터 추출에 의해 생산될 수 있다. 부티레이트는 또한 클로스트리디움 균주에서 혐기성 조건 하에서 발효하는 동안 대사산물로 생성될 수 있다. 보다 구체적으로, 부티레이트는 2상 아세톤/n-부탄올/에탄올 (ABE) 발효에서 중간체인 아세테이트/부티레이트 혼합물로 생산될 수 있다. 아세테이트/부티레이트의 생산은 높은 성장률 조건 하에 제1 산생성 단계에서 발생하고, 이어서 성장률이 감소하고 ABE 용매가 생산되는 제2 용매생성 단계에서 소비된다. 발효 공정 동안 이산화탄소 및 수소가 생산된다.
본 특허 출원에서, 본 발명자들은 약화된 글리세롤 키나제 활성을 갖도록 돌연변이된, 글리세롤의 존재 하에 PDO를 생산할 수 있는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 균주가 비-돌연변이된 생산자 균주의 성능과 비교하여 PDO 및 BA의 개선된 생산을 제공한다는 것을 알아내었다. PDO 및 BA 생산의 추가 개선은 본 발명에 따른 돌연변이 균주가 추가로 약화된 수소 디히드로게나제 활성 및/또는 강화된 글리세롤 흡수 촉진자 퍼미아제 활성을 보유하는 경우 수득될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 클로스트리디움의 돌연변이 균주의 사용은 단지 글리세롤의 존재 하에 PDO를 생산하도록 적합화된 비-돌연변이된 씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 균주의 사용에 비해 개선된 PDO 및 BA 생산을 수행한다.
본 발명은 씨. 부티리쿰으로부터의 dhaB1, dhaB2 및 dhaT 유전자를 발현하고 약화된 글리세롤 키나제 활성을 포함하는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 돌연변이 균주에 관한 것이다.
특히, 본 발명에 따른 돌연변이 균주에서, 활성이 약화된 글리세롤 키나제는 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824의 유전자좌 CA_C1321에서 유전자 glpK에 의해 코딩된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 돌연변이 균주는 유전자좌 CA_C1321에서 유전자 glpK에 하기 돌연변이 중 적어도 하나를 포함한다:
a. 위치 347의 아미노산 알라닌을 트레오닌으로 대체하기 위한, 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 (Genbank) AE001437의 뉴클레오티드 위치 1462461 내지 1462463에서의 코돈 돌연변이,
b. 위치 22의 아미노산 히스티딘을 티로신으로 대체하기 위한, 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 1461486 내지 1461488에서의 코돈 돌연변이,
c. 위치 466의 아미노산 발린을 메티오닌으로 대체하기 위한, 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 1462818 내지 1462820에서의 코돈 돌연변이.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 돌연변이 균주는 3개의 돌연변이의 조합을 포함한다.
본 발명의 돌연변이 균주는 또한 약화된 수소 디히드로게나제 활성, 바람직하게는 비활성화된 수소 디히드로게나제 활성을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 히드로게나제는 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 유전자좌 CA_C0028에서 유전자 hydA에 의해 코딩된다.
본 발명의 돌연변이 균주는 또한 강화된 글리세롤 흡수 촉진자 퍼미아제 활성을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 글리세롤 흡수 촉진자 단백질은 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 유전자좌 CA_C0770에서 유전자 glpF에 의해 코딩된다.
본 발명의 돌연변이 균주는 또한 약화된 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 알파 활성을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 알파는 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 유전자좌 CA_C2709에서 유전자 etfA에 의해 코딩된다.
본 발명은 또한 상기 개시된 바와 같은 본 발명에 따른 씨. 아세토부틸리쿰의 돌연변이 균주를 포함하는 클로스트리디아 종의 컨소시엄에 관한 것이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 이 컨소시엄은 상기 정의된 바와 같은 돌연변이 균주 클로스트리디움 아세토부틸리쿰, 및 적어도 하나의 클로스트리디움 스포로게네스 (Clostridium sporogenes) 균주 및/또는 적어도 하나의 클로스트리디움 스페노이데스 (Clostridium sphenoides) 균주를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 돌연변이 균주 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 또는 상기 돌연변이 균주를 포함하는 컨소시엄을 적어도 글리세린을 포함하는 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계 및 배양 배지로부터 생산된 PDO 및/또는 BA를 회수하는 단계를 포함하는 PDO 및 BA를 생산하는 방법에 관한 것이다.
제1 측면에서, 본 발명은 비-돌연변이 균주와 비교하여 PDO를 생산할 수 있고 약화된 글리세롤 키나제 활성을 포함하는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 돌연변이 균주에 관한 것이다. 본 발명에서, 글리세롤 키나제는 ATP:글리세롤 3-포스포트랜스퍼라제 또는 글리세로키나제 GK로도 명명되는 효소이다.
특히, 본 발명에 따른 돌연변이 균주에서, 활성이 약화된 글리세롤 키나제 (서열식별번호: 1)는 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824의 유전자좌 CA_C1321에서 유전자 glpK (서열식별번호: 2)에 의해 코딩된다. 본 발명에 따른 돌연변이 균주에서, 글리세롤 키나제 활성은 비-돌연변이 균주에 비해, 특히 유전자 glpK가 돌연변이되지 않은 균주에 비해 약화된다.
본원에서 언급되는 바와 같이, 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC 824, 완전 게놈으로 수탁 번호 진뱅크 AE001437 (AE007513-AE007868), 버젼 AE001437.1 하에 입수가능한 3940880 bp 원형 DNA에 해당한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 돌연변이 균주는 유전자좌 CA_C1321에서 유전자 glpK에 하기 돌연변이 중 적어도 하나를 포함한다:
a. 서열식별번호: 3의 돌연변이된 단백질 및 서열식별번호: 4의 돌연변이된 유전자를 생성하는, 위치 347의 아미노산 알라닌을 트레오닌으로 대체하기 위한, 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 1462461 내지 1462463에서의 코돈 돌연변이,
b. 서열식별번호: 5의 돌연변이된 단백질 및 서열식별번호: 6의 돌연변이된 유전자를 생성하는, 위치 22의 아미노산 히스티딘을 티로신으로 대체하기 위한, 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 1461486 내지 1461488에서의 코돈 돌연변이,
c. 서열식별번호: 7의 돌연변이된 단백질 및 서열식별번호: 8의 돌연변이된 유전자를 생성하는, 위치 466의 아미노산 발린을 메티오닌으로 대체하기 위한, 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 1462818 내지 1462820에서의 코돈 돌연변이.
본 발명의 유리한 실시양태에서, 돌연변이 균주는 유전자좌 CA_C1321에서 적어도, 위치 347의 아미노산 알라닌을 트레오닌으로 대체하기 위한, 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 1462461 내지 1462463에서의 코돈 돌연변이 (서열식별번호: 3 및 서열식별번호: 4)를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 돌연변이 균주는 유전자좌 CA_C1321에서 적어도, 서열식별번호: 9의 돌연변이된 단백질 및 서열식별번호: 10의 돌연변이된 유전자를 생성하는,
(i) 위치 347의 아미노산 알라닌을 트레오닌으로 대체하기 위한, 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 1462461 내지 1462463에서의 코돈 돌연변이, 및
(ii) 위치 22의 아미노산 히스티딘을 티로신으로 대체하기 위한, 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 1461486 내지 1461488에서의 코돈 돌연변이
를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 돌연변이 균주는 유전자좌 CA_C1321에서 적어도, 서열식별번호: 11의 돌연변이된 단백질 및 서열식별번호: 12의 돌연변이된 유전자를 생성하는,
(i) 위치 347의 아미노산 알라닌을 트레오닌으로 대체하기 위한, 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 1462461 내지 1462463에서의 코돈 돌연변이, 및
(ii) 위치 466의 아미노산 발린을 메티오닌으로 대체하기 위한, 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 1462818 내지 1462820에서의 코돈 돌연변이
를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 돌연변이 균주는 유전자좌 CA_C1321에서 적어도, 서열식별번호: 13의 돌연변이된 단백질 및 서열식별번호: 14의 돌연변이된 유전자를 생성하는,
(i) 위치 347의 아미노산 알라닌을 트레오닌으로 대체하기 위한, 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 1462461 내지 1462463에서의 코돈 돌연변이, 및
(ii) 위치 22의 아미노산 히스티딘을 티로신으로 대체하기 위한, 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 1461486 내지 1461488에서의 코돈 돌연변이, 및
(iii) 위치 466의 아미노산 발린을 메티오닌으로 대체하기 위한, 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 1462818 내지 1462820에서의 코돈 돌연변이
를 포함한다.
상술된 모든 특정 및 바람직한 실시양태에서, 돌연변이 각각은 바람직하게는 하기이다:
- 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 1462461에서 G의 A로의 대체,
- 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 1461486에서 C의 T로의 대체;
- 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 1462818에서 G의 A로의 대체.
본 발명의 돌연변이 균주는 또한 약화된 수소 디히드로게나제 활성, 바람직하게는 비활성화된 수소 디히드로게나제 활성을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 히드로게나제 (서열식별번호: 15)는 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 유전자좌 CA_C0028에서 유전자 hydA (서열식별번호: 16)에 의해 코딩된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 돌연변이 균주는 CA_C0028 유전자좌에서 적어도, 서열식별번호: 17의 582개 아미노산 대신 209개 아미노산의 더 짧은 단백질을 생성하는 정지 코돈을 위한, 바람직하게는 뉴클레오티드 위치 39233에서 C 결실에 의한 (서열식별번호: 18의 돌연변이된 유전자), 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 39233 내지 39235에서의 코돈 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 돌연변이 균주는 또한 강화된 글리세롤 흡수 촉진자 퍼미아제 활성을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 글리세롤 흡수 촉진자 단백질 (서열식별번호: 19)은 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 유전자좌 CA_C0770에서 유전자 glpF (서열식별번호: 20)에 의해 코딩된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 돌연변이 균주는 CA_C0770 유전자좌에서 적어도, 위치 13의 아미노산 메티오닌을 이소루이신으로 대체하기 위한 (서열식별번호: 21의 돌연변이된 단백질), 바람직하게는 뉴클레오티드 위치 892875의 G의 A, C 또는 T, 더욱 바람직하게는 A로의 대체에 의한 (서열식별번호: 22의 돌연변이된 유전자), 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 892875 내지 892877에서의 코돈 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 돌연변이 균주는 또한 약화된 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 알파 활성을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 알파 (서열식별번호: 23)는 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 유전자좌 CA_C2709에서 유전자 etfA (서열식별번호: 24)에 의해 코딩된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 돌연변이 균주는 CA_C2709 유전자좌에서 적어도, 위치 105의 아미노산 이소루이신을 발린으로 대체하기 위한 (서열식별번호: 25의 돌연변이된 단백질), 바람직하게는 뉴클레오티드 위치 2833384의 A의 G로의 대체에 의한 (서열식별번호: 26의 돌연변이된 유전자), 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 2833384 내지 2833386에서의 코돈 돌연변이를 포함한다.
본 발명에 따른 돌연변이 균주 씨. 아세토부틸리쿰은 글리세롤의 존재 하에 적합한 배양 배지에서 배양할 때 1,3-프로판디올을 생산할 수 있도록 변형된다. 이 돌연변이 씨. 아세토부틸리쿰 균주는 플라스미드에 의해 과발현되거나 미생물의 염색체에 통합된 씨. 부티리쿰으로부터의 1,3-프로판디올 오페론의 엑스트라 카피를 도입함으로써 씨. 부티리쿰으로부터의 1,3-프로판디올 오페론: dhaB1 (서열식별번호: 27) 및 dhaB2 (서열식별번호: 28) 유전자에 의해 코딩된 비타민 B12-독립적 글리세롤-디히드라타제 및 dhaT (서열식별번호: 29) 유전자에 의해 코딩된 PDO-디히드로게나제를 함유하도록 변형된다. 예컨대, pSPD5 플라스미드는 1,3-프로판디올 오페론의 과발현에 사용될 수 있다. 이 돌연변이 씨. 아세토부틸리쿰 균주는 씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5로 불리며, 문헌 (Gonzalez-Pajuelo et al., 2005 및 Gonzalez-Pajuelo et al., 2006, 참조로 본원에 포함됨)에 완전히 기재되어 있다.
글리세롤 대사를 PDO의 생산으로 유도하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예컨대, WO 2006/128381, Gonzalez-Pajuelo et al., 2006). 또한, 예컨대, 탄소의 유일한 공급원으로서 글리세롤로부터 PDO의 생산을 위해 유전적으로 변형된 씨. 아세토부틸리쿰 균주는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 출원 WO 2001/04324 및 WO 2010/128070에 개시되어 있다.
유리한 실시양태에서, 본 발명의 돌연변이 균주는 높은 글리세롤 함량을 갖는, 특히 산업용 글리세린에 함유된 고농도의 글리세롤을 갖는, 어떠한 유기 질소원도 없는 배양 배지로부터 성장 및 PDO 생산에 적합화된 균주 씨. 아세토부틸리쿰이다.
"적합화된 씨. 아세토부틸리쿰", "이전에 적합화된 씨. 아세토부틸리쿰" 또는 "적합화되는 씨. 아세토부틸리쿰"은 고농도의 산업용 글리세린에서 성장할 수 있도록 변형된 씨. 아세토부틸리쿰을 의미한다.
예컨대, 씨. 아세토부틸리쿰 균주는 WO 2010/128070 특허 출원에 개시된 바와 같이 선택 압력 배양 공정에 의해 높은 글리세롤 함량을 갖는, 특히 산업용 글리세린으로부터 유래하는 고농도의 글리세롤을 갖는 배양 배지에서 성장하도록 적합화될 수 있다. 균주 씨. 아세토부틸리쿰의 적합화는 바람직하게는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 기술인 혐기성 연속 공정에 의해 수행된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 이 공정의 세부 사항 중, 예컨대 페드 배지가 발효기에 연속적으로 첨가되고 미생물로 전환된 영양 용액의 동등한 양이 동시에 시스템으로부터 제거되는 것을 언급할 수 있다. 영양소 교환율은 희석률로 표시된다. 따라서, 희석률은 배양 배지에 적용되며, 미생물의 최대 성장률을 고려하여 배지의 섭취 및 회수 비율에 영향을 미친다. 생산 미생물의 상기 적합화는 미생물을 높은 산업용 글리세린 함량 (90 내지 120 g/L, 바람직하게는 약 105 g/L 포함)을 포함하는 배양 배지에서 낮은 희석률 (0.005 내지 0.1 h-1, 바람직하게는 0.005 내지 0.02 h-1 포함)로 배양하고 산업용 글리세린으로부터 유래하는 고농도의 글리세롤을 갖는 배양 배지에서 성장할 수 있는 적합화된 미생물을 선택함으로써 수득된다.
표현 "유전적으로 변형된"은 균주가 그의 유전적 특성을 변화시키기 위해 변형되었음을 의미한다. 내인성 유전자가 약화, 결실 또는 과발현될 수 있거나, 바람직하게는 외인성 유전자가 도입되거나, 플라스미드에 의해 운반되거나, 균주의 게놈 내로 통합되어 세포로 발현될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "플라스미드" 또는 "벡터"는 종종 세포의 중심 대사의 일부가 아닌 유전자를 운반하는 일반적으로 원형의 이중-가닥 DNA 분자의 형태인 염색체외 요소를 지칭한다.
출원 WO 2008/040387 (이의 내용은 참조로 본원에 포함됨)에 개시된 바와 같은, 클로스트리디움에서의 돌연변이유발 및/또는 유전자 대체의 모든 표준 기술이 높은 글리세롤 함량을 갖는, 특히 산업용 글리세린으로부터 유래하는 고농도의 글리세롤을 갖는 배양 배지로부터 성장 및 1,3-프로판디올의 생산을 위해 씨. 아세토부틸리쿰 균주를 적합화시키는데 사용될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 이들 실험 조건 각각을 관리하고 본 발명에 따라 사용되는 클로스트리디아 균주에 대한 배양 조건을 정의하는 방법을 알고 있다. 특히, 클로스트리디아 균주는 씨. 아세토부틸리쿰의 경우 20℃ 내지 60℃, 우선적으로 25℃ 내지 40℃의 온도에서 발효된다.
본 발명의 돌연변이 균주에서 변형된 본원에 언급된 각각의 효소의 활성은 비활성을 의미하는 것으로 의도된다.
또한, 본 발명의 돌연변이 균주에서 변형된 각각의 효소의 활성은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 비-돌연변이 균주 또는 야생형 균주와 비교하여 정의된다.
효소와 같은 관심 단백질의 "강화된", "발현하는", "과발현하는" 또는 "과발현"이라는 용어는 본원에서 상기 관심 단백질의 발현 수준 및/또는 활성이 변형되지 않은, 특히 유전적으로 변형되지 않은 모 미생물과 비교하여 미생물에서 상기 단백질의 발현 수준 및/또는 활성의 현저한 증가를 지칭한다. 대조적으로, 관심 단백질의 "약화된", "약화시키는" 또는 "약화"라는 용어는 상기 관심 단백질의 발현 수준 및/또는 활성이 변형되지 않은, 특히 유전적으로 변형되지 않은 모 미생물과 비교하여 미생물에서 상기 단백질의 발현 수준 및/또는 활성의 현저한 감소를 지칭한다. 관심 단백질의 발현 수준 및/또는 활성의 완전한 약화는 발현 및/또는 활성이 없어지는 것을 의미한다; 따라서, 상기 단백질의 발현 수준은 영이다. "강화된", "발현하는", "과발현하는", "과발현" "약화된", "약화시키는" 또는 "약화"가 상응하는 관심 유전자 또는 단백질의 돌연변이에 기인하는 경우, 상기 관심 유전자 또는 단백질의 발현 수준 및/또는 활성의 변형은 동일한 비-돌연변이된 관심 유전자 또는 단백질의 발현 수준 및/또는 활성과 비교된다.
본원에 적용된 용어 "발현 수준"은 미생물에서 발현되는 관심 단백질 (또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자)의 양 (예컨대, 상대적인 양, 농도)을 지칭하며, 이는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법, 예컨대, 웨스턴 블롯-면역블롯 (Burnette, 1981), 효소-결합된 면역흡착 검정 (예컨대, ELISA) (Engvall and Perlman, 1971), 또는 정량적 단백질체학 (Bantscheff et al., 2007)에 의해 측정가능하다.
하나 이상의 단백질의 발현 수준을 조정하는 것은 미생물 내에서 상기 단백질을 코딩하는 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 변경함으로써 발생할 수 있다.
따라서, 돌연변이, 특히 glpK 유전자 발현, hydA 유전자 발현, etfA 유전자 및/또는 유전자 glpF를 조정하기 위해 상기 개시된 특정 돌연변이에 추가하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 고전적 수단을 본 발명의 돌연변이 균주에서 상술된 바와 같이 상술된 효소의 유전자 발현을 추가로 약화, 제거 또는 과발현하는데 사용할 수 있다.
특정 활성을 갖는 효소를 코딩하는 내인성 유전자의 발현 수준은 특히 본 발명에 따른 재조합 미생물에서 과발현, 약화 또는 제거될 수 있다. 이러한 변형은, 예컨대 유전 공학에 의해, 미생물에 특정 스트레스를 가하고 돌연변이를 유발하는 방식으로 미생물을 배양하는 적합화에 의해, 및/또는 지정된 돌연변이유발 및 특정 선택 압력 하에서의 진화를 조합함으로써 대사 경로의 발달 및 진화를 강제하는 것에 의해 수행될 수 있다.
용어 "내인성 유전자"는 본원에서 미생물에 자연적으로 존재하는 유전자를 지칭한다.
내인성 유전자는 특히 내인성 조절 요소에 더하여 각각 상향조절 또는 하향조절을 선호하는 이종 서열을 도입함으로써 과발현되거나 약화될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 내인성 조절 요소 자체가 유전자 발현을 조정하는 적합한 이종 서열로 대체될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 내인성 유전자의 하나 이상의 보충 카피가 미생물 내에서 염색체적으로 (즉, 염색체로) 또는 염색체외적으로 (예컨대, 플라스미드 또는 벡터로) 도입될 수 있다. 따라서, 미생물은 서로 상동성인 유전자의 여러 카피를 포함한다. 내인성 유전자의 하나 이상의 보충 카피가 염색체외적으로 발현되는 경우, 그들은 염색체외 외인성 유전자의 도입에 대해 상기에서 열거된 바와 같이 상이한 유형의 플라스미드로 운반될 수 있다.
내인성 유전자의 발현을 과발현하거나 약화시키는 또 다른 방법은 프로모터 (즉, 야생형 프로모터)를 각각 더 강하거나 더 약한 프로모터로 교환하는 것이다. 이러한 목적에 적합한 프로모터는 상동성 (즉, 동일한 종으로부터 유래) 또는 이종성 (즉, 상이한 종으로부터 유래)일 수 있으며, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 실제로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 내인성 유전자의 발현을 조정하기 위한 적합한 프로모터를 쉽게 선택할 수 있다.
내인성 유전자 발현 수준 또는 코딩된 단백질의 활성은 또한 유전자의 코딩 서열 또는 비-코딩 서열에 돌연변이를 도입함으로써 증가되거나 약화될 수 있다. 이들 돌연변이는 해당 아미노산에서 변형이 발생하지 않을 때는 동의적이나, 해당 아미노산이 변형될 때는 비-동의적일 수 있다. 동의적 돌연변이는 해독된 단백질의 기능에 영향을 미치지 않지만, 돌연변이된 서열이 조절 인자에 대한 결합 부위에 위치되는 경우, 해당 유전자 또는 심지어 다른 유전자의 조절에 영향을 미칠 수 있다. 비-동의적 돌연변이는 돌연변이된 서열의 특성에 따라 조절뿐만 아니라 해독된 단백질의 기능 또는 활성에 영향을 미칠 수 있다. 특히, 비-코딩 서열의 돌연변이는 코딩 서열의 상류에 (즉, 프로모터 영역에, 인핸서, 사일런서, 또는 인슐레이터 영역에, 특정 전사 인자 결합 부위에) 또는 코딩 서열의 하류에 위치될 수 있다. 프로모터 영역에 도입되는 돌연변이는 코어 프로모터, 근위 프로모터 또는 원위 프로모터에 있을 수 있다. 돌연변이는, 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용하는 부위-지정된 돌연변이유발에 의해, 예컨대 돌연변이유발제 (자외선 또는 니트로소구아니딘 (NTG) 또는 에틸메탄술포네이트 (EMS)와 같은 화학 작용제) 또는 DNA 셔플링 또는 오류 유발 PCR을 통한 무작위 돌연변이유발 기술에 의해 또는 미생물에 특정 스트레스를 가하고 돌연변이유발을 유도하는 배양 조건을 사용하여 도입될 수 있다. 유전자의 상류에 위치된 영역에 하나 이상의 보충 뉴클레오티드의 삽입은 특히 유전자 발현을 조정할 수 있다.
제2 측면에서, 본 발명은 상기 개시된 바와 같은 본 발명에 따른 PDO 및 BA 생산 돌연변이 균주를 포함하는 클로스트리디아의 컨소시엄에 관한 것이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 이 컨소시엄은 상기 정의된 바와 같은 돌연변이 균주 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 및 적어도 하나의 클로스트리디움 스포로게네스 균주 및/또는 적어도 하나의 클로스트리디움 스페노이데스 균주를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 컨소시엄은, 배양물에 함유된 세포의 총합이 100%에 해당하는 것으로 고려하여, 씨. 아세토부틸리쿰 89% 내지 98%, 씨. 스포로게네스 1% 내지 10%, 및/또는 씨. 스페노이데스 1% 내지 10%를 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 컨소시엄은, 배양물에 함유된 세포의 총합이 100%에 해당하는 것으로 고려하여, 씨. 아세토부틸리쿰 89% 내지 95%, 씨. 스포로게네스 3% 내지 7%, 및/또는 씨. 스페노이데스 1% 내지 5%를 포함한다.
본 발명에 따른 컨소시엄은 바람직하게는 글리세롤의 존재 하에 배양 배지로부터 성장 및 PDO의 생산을 위해 이전에 변형된 PDO 및 BA 생산 돌연변이 균주 씨. 아세토부틸리쿰을 포함한다. 상술된 돌연변이 균주 씨. 아세토부틸리쿰에 관한 모든 바람직한 실시양태는 또한 이 특정 실시양태에 준용된다.
제3 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 돌연변이 균주 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 또는 상기 돌연변이 균주를 포함하는 컨소시엄을 적어도 글리세롤을 포함하는 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계 및 배양 배지로부터 생산된 PDO 및/또는 BA를 회수하는 단계를 포함하는 PDO 및 BA를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에서, 생산은 유리하게는 배치, 유가 또는 연속 공정으로 수행된다. PDO 및 BA의 생산을 위해 산업적 규모로 미생물을 배양하는 것은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 특히 WO2010/128070 및 WO2011/042434 (이들의 내용은 참조로 본원에 포함됨)에 개시되어 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 수득된 PDO 및/또는 BA는 회수 후 추가로 정제될 수 있다.
발효 배지로부터 PDO 또는 BA를 회수하고 궁극적으로 정제하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. PDO는 증류에 의해 단리될 수 있다. 대부분의 실시양태에서, PDO는 아세테이트와 같은 부산물과 함께 발효 배지로부터 증류된 다음 공지된 방법에 의해 추가로 정제된다. 특정 정제 방법이 출원 WO2009/068110 및 WO 2010/037843 (이들의 내용은 참조로 본원에 포함됨)에 개시되어 있다.
BA는 특허 출원 EP350355에 개시된 증류에 의해 또는 예컨대 WO2017/013335에 개시된 액체-액체 추출에 의해 바람직하게는 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산 또는 노난산과 같은 카르복실산 또는 메틸 이소부틸 케톤, 메틸 이소아밀 케톤, 메틸 헵틸 케톤, 메틸 노닐 케톤과 같은 케톤 중에서 선택된 용매를 사용하여 단리될 수 있다.
본 발명에 따른 PDO 및 BA의 생산 방법에 대한 바람직한 실시양태에서, 글리세롤 농도는 배양 배지 중 90 내지 120 g/L, 바람직하게는 약 105 g/L이다.
"적합한 배양 배지" 또는 "배양 배지"는 클로스트리디움 균주 또는 컨소시엄의 성장 및 세포에 의한 관심 산물의 합성에 최적화된 배양 배지를 지칭한다. 발효 공정은 일반적으로 사용되는 클로스트리디움 종에 적합화된 글리세롤을 함유하는 공지된 규명된 조성의 합성, 특히 무기 배양 배지를 사용하여 반응기에서 수행된다.
용어 "합성 배지"는 유기체가 성장하는 화학적으로 규명된 조성을 포함하는 배양 배지를 의미한다. 본 발명의 배양 배지에서, 글리세롤은 유리하게는 단일 탄소원이다. 그럼에도 불구하고, 배양 배지는 탄소원으로서 글리세롤에 더하여 탄수화물을 포함할 수 있다. 탄수화물은 자일로스, 글루코스, 프룩토스 및 수크로스 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다.
특정 실시양태에서, 글리세롤은 적어도 50%의 글리세롤, 바람직하게는 적어도 85%의 글리세롤을 포함하는 글리세린 조성물의 형태로 배지에 첨가된다.
유리하게는, 본 발명의 배양 배지에 사용되는 글리세린은 산업용 글리세린이다. "산업용 글리세린"은 실질적인 정제 없이 산업 공정으로부터 수득되는 글리세린 산물을 의미한다. 산업용 글리세린은 "미가공 (raw) 글리세린"으로도 지정될 수 있다. 산업용 글리세린은 70% 초과, 바람직하게는 80% 초과의 글리세롤, 물, 및 무기 염 및 지방산과 같은 불순물을 포함한다. 산업용 글리세린에서 글리세롤의 최대 함량은 일반적으로 90%, 보다 일반적으로 약 85%이다.
따라서, 본 발명에 따른 PDO 및 BA의 생산 방법은 70% 초과의 글리세롤을 포함하는 산업용 글리세린에 의해 제공되는 글리세롤을 사용하여 수행될 수 있다.
산업용 글리세린이 수득되는 산업 공정은 특히 지방 및 오일, 특히 식물 기원의 지방 및 오일 또는 동물 기원의 지방 및 오일 또는 사용된 식용유가 세제 또는 윤활유와 같은 산업 제품으로 가공되는 제조 방법이다. 이러한 제조 방법에서 산업용 글리세린은 부산물로 간주된다. 특정 실시양태에서, 산업용 글리세린은 바이오디젤 생산으로부터의 부산물이며, 염, 메탄올, 물, 및 지방산과 같은 일부 다른 유기 화합물과 함께 약 80 내지 85%의 글리세롤을 포함하는, 바이오디젤 생산으로부터 수득되는 공지된 글리세린 불순물을 포함한다. 바이오디젤 생산으로부터 수득되는 산업용 글리세린은 지방산을 제거하기 위해 추가로 산성화 단계를 거칠 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 산성화 기술을 알고 있으며, 사용되는 글리세린에 따라 최상의 산성화 조건을 정의할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 PDO 및 BA의 생산 방법은 바이오디젤 생산의 부산물인 산업용 글리세린을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 글리세롤의 농도는 페드 배지에서 90 g.L-1 초과의 글리세롤이다. 바람직한 실시양태에서, 글리세린 용액에 함유된 농도는 90 내지 200 g.L-1의 글리세롤, 더욱 특히 90 내지 140 g/L의 글리세롤, 바람직하게는 약 120 g.L-1의 글리세롤, 더욱 바람직하게는 약 105 g.L-1의 글리세롤로 포함된다.
바람직하게는, 배양 배지는 유기 질소를 첨가하지 않은 합성 배지이다. 따라서, 본 발명에 따른 PDO 및 BA의 생산 방법은 유기 질소가 배제된 배양 배지를 사용하여, 바람직하게는 유기 질소를 첨가하지 않은, 더욱 바람직하게는 효모 추출물이 없는 합성 배지를 사용하여 수행될 수 있다.
이러한 배양 배지는 관련 기술분야, 특히 특허 출원 WO 2010/128070 및 WO 2011/042434 (이들의 내용은 참조로 본원에 포함됨)에 개시되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 PDO 및 BA의 생산 방법은 상기 정의된 바와 같은 상기 돌연변이 균주 클로스트리디움 아세토부틸리쿰을 적어도 하나의 클로스트리디움 스포로게네스 균주 및/또는 적어도 하나의 클로스트리디움 스페노이데스 균주와 함께 탄소원으로서 적어도 글리세롤을 포함하는 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계 및 배양 배지로부터 생산된 PDO 및/또는 BA를 회수하는 단계를 포함한다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 정의된다. 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내지만 단지 예시로서 제공된다는 것을 이해해야 한다. 상기 개시 및 이들 실시예로부터, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 필수 수단을 변형하지 않고 다양한 사용 및 조건에 적합화되도록 본 발명에 다양한 변화를 가할 수 있다.
실시예 1: 유형 174P 집단으로부터 이탈된 하나의 클론에 존재하는 돌연변이의 확인
클론 단리
클론 단리는 특허 출원 WO2012/062832A1에 기재된 바와 같이 씨. 부티리쿰으로부터의 1,3-프로판디올 오페론을 과발현하고 고농도의 산업용 글리세린을 갖는 배양 배지로부터 성장 및 PDO의 생산에 적합화된 집단인 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 유형 174P 균주 집단의 연속 배양으로부터 시작하여 한천 플레이트에서 수행되었다. 한천 플레이트에서 단리에 사용된 합성 배지는 탈이온수 리터당 한천, 25 g; 시판 글리세린, 30 g; KH2PO4, 0.5 g; K2HPO4, 0.5 g; MgSO4, 7H2O, 0.2 g; CoCl2 6H2O, 0.01 g; 아세트산, 99.8%, 2.2 ml; NH4Cl, 1.65 g; MOPS, 23.03 g, 비오틴, 0.16 mg; p-아미노 벤조산, 32 mg; FeSO4, 7H2O, 0.028 g; 레사주린, 1 mg 및 시스테인, 0.5 g을 함유하였다. 배지의 pH는 NH4OH 6N으로 6.5로 조정하였다.
단리된 클론은 한천 플레이트에서 3회의 후속 계대 배양 후 순수한 것으로 간주되었다. 그 중 하나인 클론 PD0557Vc05를 액체 합성 배지로 옮겼다. 이어서, 성장 액체 배양물은 특징규명할 때까지 -80℃에서 글리세린 20%에 보존되었다.
DNA 단리
게놈 DNA는 퀴아젠 (Qiagen) (퀴아젠 에스에이 (QIAGEN SA), 프랑스 쿠르타보프)으로부터의 게놈 DNA 버퍼 및 게놈 팁 500/G 키트를 사용하여 클론 PD0557Vc05의 16 ml의 연속 배양물로부터 추출되었다. 박테리아 샘플은 퀴아젠 게놈 DNA 안내서 (박테리아에 대한 샘플 제조 및 용해 프로토콜)에 기재된 프로토콜에 이어 게놈-팁 프로토콜 (혈액, 배양된 세포, 조직 효모 또는 박테리아로부터의 게놈 DNA의 단리를 위한 프로토콜)에 따라 제조되었다.
시퀀싱 분석
클론 PD0557Vc05의 게놈은 게놈 시퀀서 일루미나 하이세크 (Genome Sequencer Illumina HiSeq) 기술을 사용하여 시퀀싱되었다. 시퀀싱 프로젝트는 GATC (GATC 바이오텍 아게 (GATC Biotech AG), 독일 콘스탄츠 78467 자콥-스타들러-플라츠 7)에 의해 서열 모드 일루미나 하이세크 시퀀싱, 표준 게놈 라이브러리, 판독 길이 2 x 150 bp, 실행 유형: 쌍을 이룬 말단, 판독 길이: 2 x 150 bp, 서열분석된 판독 11,589,200, 서열분석된 염기 3,476,760,000로 수행되었다.
생물정보 분석
생물정보학 분석은 GATC 변형 분석 (VARIANT ANALYSIS) V1.2 워크플로우 및 참조 데이터베이스 ASM876v1을 사용하여 GATC 바이오텍 아게에 의해 수행되었다. 변형 분석은 GATC 바이오텍 아게에 의해 수행되었다: SNP 및 InDel 호출은 GATK의 하플로타입 콜러 (GATK's Haplotype Caller)를 사용하여 수행된다 [McKenna et al., 2010; De Pristo et al., 2011); 검출된 변형은 snpEff를 사용하여 그들의 유전자 컨텍스트를 기반으로 하여 주석이 추가된다 (Cingolani et al., 2012). SnpEff 소프트웨어는, 예컨대 웹사이트 http://snpeff.sourceforge.net에서 이용가능하다. 변형의 품질을 평가하는데 사용되는 여러 측정 기준은 GATK의 변형주석자 (VariantAnnotator) 모듈을 사용하여 주석이 추가된다; 맞춤 필터는 GATK의 변형여과 (VariantFiltration) 모듈을 사용하여 1lter 긍정 오류 (false positive) 변형에 대한 변형에 적용된다.
확인된 돌연변이 검증
PD0557Vc05에서 확인된 돌연변이의 존재를 확인하기 위해, PCR 반응 및 생거 (Sanger) 시퀀싱을 표 1에 기재된 PCR 및 생거 시퀀싱 올리고뉴클레오티드를 사용하여 각각의 유전자 또는 관심 DNA 영역에 대한 DNA에서 수행하였다.
<표 1>
PD0557Vc05에서 수행된 일루미나 및 생거 시퀀싱 분석 둘 다를 기반으로 하여, 표 2에 기재된 바와 같이 여러 돌연변이가 확인되었다.
<표 2>
실시예 2: 유전자
glpK
및
hydA
에서 확인된 돌연변이의 특징규명
A.
단백질 글리세롤 키나제 야생형 (GlpK) 및 돌연변이체 (GlpK*)의 특징규명
H22Y, A347T 및 V466M을 갖는 돌연변이 단백질 GlpK*를 생성하는, 클론 PD0557Vc05의 glpK 유전자에서 3개의 상이한 점 돌연변이가 확인되었다 (상기 표 2). 돌연변이 효과를 더욱 잘 특징규명하기 위해, 그들을 개별적으로 또는 조합하여 시험하였다. 따라서, 돌연변이된 글리세롤 키나제를 코딩하는 대립유전자를 발현 플라스미드 pPAL7 (바이오라드(Biorad)®)에 클로닝하고, 수득된 플라스미드를 이. 콜리 (E. coli) 균주 BL21(DE3)star로 형질전환하여 각각의 돌연변이된 단백질을 정제하고 생화학 실험을 수행하였다.
<표 3>
단백질 과생산
단백질의 과생산을 위한 7개의 균주 1 내지 7의 배양은 5 g/L 글루코스 및 100 mg/L의 암피실린이 보충된 LB 브로스 (Bertani, 1951)를 사용하여 2 L 삼각 플라스크에서 실현되었다. 약 0.15의 OD600nm으로 500 mL 배양물을 접종하기 위해 밤샘 배양물을 사용하였다. 500μM IPTG로 유도하기 전에, 배양물은 먼저 OD600nm가 약 0.5가 될 때까지 37℃ 및 200 rpm에서 쉐이커에 보관되고, 이어서 배양물은 OD600nm가 0.6 - 0.8이 될 때까지 (약 1시간) 25℃ 및 200 rpm에서 제2 쉐이커에 옮겨졌다. 배양물은 OD600nm가 약 4가 될 때까지 25℃ 및 200 rpm으로 보관되고, 이어서 중지되었다. 세포는 7000 rpm, 4℃에서 5분 원심분리되고, 이어서 -20℃에서 저장되었다. 이 프로토콜은 균주 1 내지 7에 대해 동일하였다.
단백질 정제
단계 1: 무세포 추출물 제조
각각의 균주에 대해, 약 250 mg의 이. 콜리 바이오매스를 40 ml의 100 mM 인산칼륨 pH 7.6 및 프로테아제 억제제 칵테일에 현탁시켰다. 세포 현탁액 (원뿔형 튜브당 15 ml)을 30초 간격으로 30초의 8주기 동안 50 ml 원뿔형 튜브 내의 얼음 (반델린 소노플러스 (Bandelin sonoplus), 70W)에서 초음파 처리하였다. 초음파 처리 후, 세포를 5 mM MgCl2 및 1 UI/ml의 DNaseI과 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 4℃에서 30분 동안 12000 g에서 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다.
단계 2: 친화성 정제
단백질은 제조자가 권장하는 프로토콜에 따라 프로피니티 (Profinity) 컬럼 (바이오라드, 바이오-스케일 미니 프로피니티 정밀 카트리지 5 ml)에서 친화성에 의해 조 (crude) 세포-추출물로부터 정제되었다. 조 추출물을 100 mM 인산칼륨 pH 7.6으로 평형화된 5 ml 프로피니티 정밀 카트리지에 로딩하였다. 컬럼을 10 컬럼 부피의 동일한 버퍼로 세척하고, 실온에서 100 mM 인산칼륨 pH 7.6, 100 mM 플루오라이드와 함께 45분 동안 인큐베이션하였다. 단백질은 2 컬럼 부피의 100 mM 인산칼륨 pH 7.6으로 컬럼으로부터 용출되었다. 태그는 수지에 단단히 결합되어 있고 정제된 단백질은 방출되었다. 단백질을 함유하는 분획을 모아 농축시켰다. 단백질 농도는 브래드포드 (Bradford) 단백질 검정을 사용하여 측정되었다.
GlpK 야생형 및 돌연변이체의 반응속도 파라미터 결정
글리세롤 + ATP => 글리세롤-3-포스페이트 + ADP의 반응을 촉매하는 글리세롤 키나제 활성 (GLPK)은 NADH 산화에 대한 효소적 커플링에 의해 ADP 출연을 측정하여 결정되었다. 50 mM 중탄산나트륨 pH 9, 2 mM ATP, 2 mM 포스포에놀피루베이트, 0.2 mM NADH, 5 mM MgCl2, 5 유닛 피루베이트 키나제, 5 유닛 락테이트 디히드로게나제를 함유하는 반응 혼합물 (1 mL)을 30℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 0.01-50 mM 글리세롤을 첨가하여 반응을 시작하였다. 기질 글리세롤은 블랭크에서 생략되었다. NADH의 산화는 분광광도계 (λ340 = 6290 M-1 cm-1)에서 340 nm에서의 흡광도에 의해 30℃에서 모니터링되었다.
1 유닛의 효소 활성은 분당 1 μmol의 NADH 감소를 촉매하는 효소의 양으로 정의되었다. 반응속도 파라미터는 미카앨리스-멘텐 (Michaelis-Menten) 수학식에 피팅하여 시그마플롯 (Sigmaplot)으로 결정되었다. 글리세롤에 대한 정제된 효소의 비활성 및 반응속도 파라미터가 표 4에 제공된다.
<표 4>
각각의 단순 돌연변이는 기질 글리세롤에 대한 비활성 (A347T 및 V466M) 또는 친화성 (A347T)을 감소시킨다. 이 결론은 촉매 활성 및 친화성이 감소된 이중 돌연변이체 (H22Y/A347T 및 V466M/A347T)에도 적용된다.
모든 돌연변이 (A347T/V466M/H22Y)를 조합한 삼중 돌연변이체 GlpK*는 야생형 단백질에 대한 1520 mM-1s-1에 비해 33.9 mM-1s-1의 값으로 강력한 촉매 효율 저하를 나타낸다.
결론은 돌연변이 또는 그들의 조합이 무엇이든 글리세롤 키나제의 촉매 활성이 다소 크게 감소된다는 것이다. 따라서, 균주 PD0557Vc05는 감소된 GlpK 촉매 활성을 갖는다.
B. HydA 돌연변이 특징규명
hydA 유전자에서 확인된 보다 관련성 있는 돌연변이는 하기의 HydA 단백질 정렬에 개시된 바와 같이 아미노산 위치 210에서 정지 코돈의 통합을 이끈다:
HydA 단백질 정렬: CA_C0028: HydA 야생형 단백질 및 CA_C0028*(I210*): 말단절단된 HydA*(I210*)
CA_C0028 (161)
STCSIQFIKKDGQRAVGTVDDVCLDDSTCLLCGQCVIACPVAALKEKSHI
CA_C0028*(I210*) (161)
STCSIQFIKKDGQRAVGTVDDVCLDDSTCLLCGQCVIACPVAALKKNPI―
돌연변이의 표현형을 특징규명하기 위해, 연속 배양 동안 PD0557Vc05 클론의 발효의 수소 및 이산화탄소 생산을 측정하였다 (표 5). 발효 가스 샘플을 수펠(Supel)™-불활성 다층 백에 담아 콰드-랩 (Quad-Lab) 실험실에서 분석하였다. H2 및 CO2는 NFX 20-303에 따라 μGC/μTCD로 정량화되었다.
<표 5>
이들 데이터는 클론 PD0557Vc05가 더 이상 수소를 생산하지 않고 이산화탄소만을 생산한다는 것을 보여준다. 이것은 HydA 활성이 없음을 입증한다.
이 결과는 클론 배양물의 샘플 (세포 추출물)에서 수행된 단백질체 분석에 의해 검증되었다. HydA 단백질은 전혀 검출되지 않는다.
결론적으로, 클론 PD0557Vc05는 더 이상 히드로게나제 활성을 갖지 않는다.
실시예 3: 2개의 생산자 균주; 씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 및 PD0001VE05c08에 의한 PDO 및 BA 생산에 대한 GlpK* 및 HydA 말단절단의 효과
클론 PD0557Vc05에서 확인된 돌연변이의 PDO/BA의 생산에 대한 효과를 확인하기 위해 (실시예 2 참조), glpK* 및 hydA* 대립유전자를 단독으로 또는 조합하여 이들 유전자를 변형하지 않는 2개의 생산자 균주에 도입하였다.
유전자 변형을 위해 선택된 2개의 수용자 균주는 하기와 같다:
- DG1 pSPD5: 씨. 아세토부틸리쿰 균주 DG1 pSPD5는 공개문 (Gonzalez-Pajuelo et al., 2006)에 기재됨
- PD0001VE05c08: 씨. 아세토부틸리쿰 균주 DG1 pSPD5 단리된 클론 및 특허 출원 WO2012/062832에 기재된 바와 같이 고농도의 글리세린에 적합화됨.
상술된 균주 PD0557Vc05에서 확인된 유전자 glpK* (삼중 돌연변이) 및 hydA*의 돌연변이를 DG1 pSPD5 균주에 도입하여 균주 8, 9 및 10을 생성하거나 PD0001VE05c08에 도입하여 균주 11, 12 및 13을 생성하였다.
균주 8 내지 10은 문헌 (Gonzalez-Pajuelo et al., 2006)에 기재된 연속 배양 조건에서 배양되었고, 균주 11 내지 13은 특허 출원 WO2012/062832에 기재된 바와 같이 배양되었다.
<표 6>
각각 GlpK* (H22Y/A347T/V466M)로의 글리세롤 키나제 활성 감소 및 hydA* (I210*)로의 히드로게나제 활성 억제를 발생시키는 glpk 및 hydA 유전자의 돌연변이 시, PDO 및 BA 둘 다의 생산성은 개선된다.
실시예 4: 고농도의 미가공 글리세린을 사용한 연속 배양에서 PD0557Vc05의 성능
박테리아 균주:
- PD0001VE05c08: 씨. 아세토부틸리쿰 균주 DG1 pSPD5 단리된 클론 및 특허 출원 WO2012/062832에 기재된 바와 같이 고농도의 글리세린에 적합화됨
- PD0557Vc05: 특허 출원 WO2012/062832A1에 기재된 바와 같이 고농도의 미가공의 산업용 글리세린에서 씨. 아세토부틸리쿰 균주 DG1 pSPD5 유형 174P의 연속 배양으로부터의 씨. 아세토부틸리쿰 균주 DG1 pSPD5 단리된 클론.
배양 배지:
클로스트리디아 배치 배양에 사용된 합성 배지는 수돗물 리터당 글리세롤, 30 g; KH2PO4, 0.5 g; K2HPO4, 0.5 g; MgSO4, 7H2O, 0.2 g; CoCl2 6H2O, 0.01 g; H2SO4, 0.1 mL; NH4Cl, 1.5 g; 비오틴, 0.16 mg; p-아미노 벤조산, 32 mg 및 FeSO4, 7H2O, 0.028 g을 함유하였다. 배지의 pH는 NH4OH 3N으로 6.3으로 조정되었다. SDS 카를로_에르바 (SDS Carlo_Erba) (순도 99%)에서 구입된 시판 글리세롤을 배치 배양에 사용하였다. 연속 배양을 위한 공급 배지 (feed medium)는 수돗물 리터당 미가공 글리세린으로부터의 글리세롤, 105 g; KH2PO4, 0.45 g; K2HPO4, 0.45 g; MgSO4, 7H2O, 0.2 g; CoCl2 6H2O, 0.013 g; 비오틴, 0.08 mg; p-아미노 벤조산, 16 mg; FeSO4, 7H2O, 0.04 g; 소포제, 0,05 ml; ZnSO4, 7H2O, 8 mg; CuCl2, 2H2O, 4mg; MnSO4, H2O, 20 mg을 함유하였다. 배지 pH는 H2SO4 96%로 3.5 내지 4로 조정되었다. 바이오디젤을 위한 에스테르교환 공정으로부터의 미가공 글리세린은 여러 공급자 (아브릴 (Avril), 카로텍 버해드 (Carotech Berhad))에 의해 제공되었으며, 순도는 80 내지 86% (w/w)였다. 이들 글리세린을 혼합하고 산성화에 의해 전처리하였다.
실험 설정:
연속 배양은 작업 부피가 2000 mL인 5 L 생물반응기 트리톤 (Tryton) (프랑스 피에르 게린)에서 수행되었다. 배양 수준의 자동 조절에 의해 배양 부피를 2000 mL로 일정하게 유지하였다. 배양물을 200 RPM에서 교반하고, 온도를 35℃로 설정하고, NH4OH 5.5 N을 자동으로 첨가하여 pH를 6.5로 일정하게 유지하였다. 혐기성 조건을 생성하기 위해, 용기 내의 멸균 배지를 멸균 O2-무함유 질소로 1시간 동안 60℃에서 플러싱하고, 35℃에 도달할 때까지 다시 플러싱하였다 (2시간 동안 플러싱). 생물반응기 가스 배출구는 피로갈롤 배열에 의해 산소로부터 보호되었다 (Vasconcelos et al., 1994). 멸균 후, 공급 배지는 또한 실온이 될 때까지 멸균 O2-무함유 질소로 플러싱되었고, O2 유입을 방지하기 위해 질소 하에 유지되었다.
배치 및 연속 배양 공정:
100 mL 페니실린 플라스크에서 합성 배지 (배치 배양에 대해 상술된 것과 동일하지만 아세트산, 2.2 g.L-1 및 MOPS, 23.03 g.L-1가 첨가됨)에서 성장하고 지수 성장기 말에 취한 배양물을 접종물 (5% v/v)로 사용하였다.
배양물은 먼저 배치 방식으로 성장되었다. 초기 지수 성장기에서, 미가공 글리세린으로부터의 글리세롤 펄스를 수행하였다: 펄스를 위해, 미가공 글리세린으로부터의 105 g.L-1의 글리세롤을 갖는 합성 배지 (공급 배양 (feed culture)에 대해 기재된 것과 동일)가 3시간 동안 정적 유속으로 첨가되었다 (즉, 18 g.L-1 의 글리세롤 첨가). 이어서, 성장은 배치 방식으로 계속되었고, 지수 성장기가 끝나기 전에 0.035 h-1의 희석률로 연속 공급을 시작하였다. 공급 배지는 미가공 글리세린으로부터의 105 g.L-1의 글리세롤을 함유하였다. 생물반응기 접종 6-13일 후 및 4회의 체류 시간 (RT) 후, 희석률은 5일 내에 0.035 h-1로부터 0.070 h-1로 증가되었다. 그 후, 배양 안정화는 후술되는 HPLC 프로토콜을 사용하여 PDO 생산 및 글리세롤 소비로 이어졌다. 특히, 잔류 글리세린의 농도가 가능한 한 낮을 때까지 기다렸다.
PD0557Vc05의 전반적인 성능이 하기 표 7에 제시되며, B60에 기재된 배양 배지, 배치 및 연속 공정으로 수득된 PD0001VE05c08의 성능과 비교된다. 이들 공정 조건은 0.025 h-1의 희석률에서 시작하여 단지 0.06 h-1의 희석률에 도달하였다. PD0001VE05c08은 이 실시예에서 기재된 공정 조건으로 세척되고, 돌연변이 균주 PD0557Vc05에 대해 더 높은 희석률 (0.035 h-1의 희석률에서 시작하여 0.07 h-1의 희석률에 도달)이 적용되었다.
분석 절차:
세포 농도는 620 nm에서 탁도계로 측정되었으며, 직접 결정된 세포 건조 중량과 서로 관련되었다. 글리세롤, 1,3-프로판디올, 에탄올, 락테이트, 아세트산 및 부티르산 농도는 HPLC 분석에 의해 결정되었다. 분리는 바이오라드 아미넥스 (Biorad Aminex) HPX-87H 컬럼에서 수행되었으며, 검출은 굴절률에 의해 달성되었다. 작동 조건은 하기와 같았다: 이동상 황산 0.5 mM; 유속 0.5 ml/분, 온도, 25℃.
<표 7>
이들 결과는 상기 실시예에서 기술되고 특징규명된 glpK 및 hydA 유전자에 돌연변이를 갖는 클론 PD0557Vc05가 클론 PD0001VE05c08보다 더 높은 생산성으로 PDO 및 BA를 생산함을 보여준다. 두 산물 모두에 대해 생산성이 10% 이상 향상되었기 때문에 이득이 상당하다 (데이터는 굵게 표시됨).
상술된 중요한 사실은 PD0001VE05c08 균주는 PD0557Vc05 균주와 달리 0.07 h-1의 희석률에 도달할 수 없었다는 것이며, 이는 박테리아의 성장률 및 PDO 및 BA 생산성에 대한 주장된 돌연변이의 긍정적 영향을 입증한다.
또한, WO2012/062832에 기재된 배양 조건을 PD0557Vc05 균주에 적용했을 때, 상기 균주의 성능은 PD0001VE05c08 균주보다 우수하였다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 5: 고농도의 미가공 글리세린으로의 연속 배양에서 균주 PD0557Vc05, 씨. 스포로게네스 및 씨. 스페노이데스를 포함하는 미생물 컨소시엄의 성능
새로운 균주 PD0557Vc05로 PDO 및 BA의 생산을 개선하기 위해, 이전에 이러한 생산에 대해 개선을 나타낸 박테리아 컨소시엄을 재현하기로 결정하였다 (데이터는 개시되지 않음). 따라서, 컨소시엄은 PD0557Vc05에 미생물 씨. 스페노이데스 및 씨. 스포로게네스의 추가에 의해 재구성되었다. "PD0557Vc05 컨소시엄"으로 명명되는 이 새로운 컨소시엄은 하기의 "배치 및 연속 배양 공정" 섹션에서 기재되는 바와 같이 연속 배양의 첫 날 동안 만들어졌다.
배양 배지:
클로스트리디아 배치 배양에 사용된 합성 배지는 수돗물 리터당 글리세롤, 30 g; KH2PO4, 0.5 g; K2HPO4, 0.5 g; MgSO4, 7H2O, 0.2 g; CoCl2 6H2O, 0.01 g; H2SO4, 0.1 mL; NH4Cl, 1.5 g; 비오틴, 0.16 mg; p-아미노 벤조산, 32 mg 및 FeSO4, 7H2O, 0.028 g을 함유하였다. 배지의 pH는 NH4OH 3N으로 6.3으로 조정되었다. SDS 카를로_에르바 (순도 99%)에서 구입된 시판 글리세롤을 배치 배양에 사용하였다. 연속 배양을 위한 공급 배지는 수돗물 리터당 미가공 글리세린으로부터의 글리세롤 (순도 80 내지 86% w:w), 105 g; KH2PO4, 0.45 g; K2HPO4, 0.45 g; MgSO4, 7H2O, 0.2 g; CoCl2 6H2O, 0.013 g; 비오틴, 0.08 mg; p-아미노 벤조산, 16 mg; FeSO4, 7H2O, 0.04 g; 소포제, 0,05 ml; CuCl2, 2H2O, 2 mg; MnSO4, H2O, 20 mg을 함유하였다. 배지 pH는 H2SO4 96%로 3.5 내지 4로 조정되었다. 글리세린은 산성화에 의해 전처리되었다.
실험 설정:
연속 배양은 작업 부피가 2000 mL인 5 L 생물반응기 트리톤 (프랑스 피에르 게린)에서 수행되었다. 배양 수준의 자동 조절에 의해 배양 부피를 2000 mL로 일정하게 유지하였다. 배양물을 200 RPM에서 교반하고, 온도를 35℃로 설정하고, NH4OH 5.5 N을 자동으로 첨가하여 pH를 6.5로 일정하게 유지하였다. 혐기성 조건을 생성하기 위해, 용기 내의 멸균 배지를 멸균 O2-무함유 질소로 1시간 동안 60℃에서 플러싱하고, 35℃에 도달할 때까지 다시 플러싱하였다 (2시간 동안 플러싱). 생물반응기 가스 배출구는 피로갈롤 배열에 의해 산소로부터 보호되었다 (Vasconcelos et al., 1994). 멸균 후, 공급 배지는 또한 실온이 될 때까지 멸균 O2-무함유 질소로 플러싱되었고, O2 유입을 방지하기 위해 질소 하에 유지되었다.
배치 및 연속 배양 공정:
100 mL 페니실린 플라스크에서 합성 배지 (배치 배양에 대해 상술된 것과 동일하지만 아세트산, 2.2 g.L-1 및 MOPS, 23.03 g.L-1가 첨가됨)에서 성장하고 지수 성장기 말에 취한 PD0557Vc05 배양물을 접종물 (5% v/v)로 사용하였다.
배양물은 먼저 배치 방식으로 성장되었다. 초기 지수 성장기에서, 미가공 글리세린으로부터의 글리세롤 펄스를 수행하였다. 펄스를 위해, 미가공 글리세린으로부터의 105 g.L-1의 글리세롤을 갖는 합성 배지 (공급 배양에 대해 기재된 것과 동일)가 3시간 동안 정적 유속으로 첨가되었다 (즉, 18 g.L-1 의 글리세롤 첨가). 이어서, 성장은 배치 방식으로 계속되었고, 지수 성장기가 끝나기 전에 0.035 h-1의 희석률로 연속 공급을 시작하였다. 공급 배지는 미가공 글리세린으로부터의 105 g.L-1의 글리세롤을 함유하였다. 생물반응기 접종 8일 후, 생물반응기에서 각각 0.009 uOD 및 0.317 uOD의 광학 밀도 (620 nm)를 갖도록 씨. 스포로게네스 및 씨. 스페노이데스의 미생물 컨소시엄을 첨가하였다. 배양 안정화 후, 희석률은 0.035 h-1로부터 0.070 h-1로 증가되었다. 그 후, 배양 안정화는 후술되는 HPLC 프로토콜을 사용하여 1,3-프로판디올 생산, 부티르산 생산 및 글리세롤 소비로 이어졌다. 특히, 잔류 글리세린의 농도가 가능한 한 낮을 때까지 기다렸다. PD0557Vc05 컨소시엄의 전반적인 성능은 표 8에 제시되며, 씨. 스포로게네스 및 씨. 스페노이데스가 없는 PD0557Vc05의 성능과 비교되었다.
분석 절차:
세포 농도는 620 nm에서 탁도계로 측정되었으며, 직접 결정된 세포 건조 중량과 서로 관련되었다. 글리세롤, 1,3-프로판디올, 에탄올, 락테이트, 아세트산 및 부티르산 농도는 HPLC 분석에 의해 결정되었다. 분리는 바이오라드 아미넥스 HPX-87H 컬럼에서 수행되었으며, 검출은 굴절률에 의해 달성되었다. 작동 조건은 하기와 같았다: 이동상 황산 0.5 mM; 유속 0.5 ml/분, 온도, 25℃.
<표 8>
이들 결과는 PD0557Vc05 컨소시엄이 PD0557Vc05 균주보다 PDO 및 BA 둘 다에서 더 나은 생산 성능을 가지고 있음을 보여준다 (데이터는 굵게 표시됨). 실제로 PD0557Vc05 컨소시엄은 더 높은 PDO 및 BA 역가, 더 높은 PDO 수율 및 더 적은 잔류 글리세린을 나타내며, 이는 기술의 명확한 전반적인 개선을 의미한다.
미생물 컨소시엄 정량화
DNA 단리
게놈 DNA를 프레셀리스(Precellys)®24 라이저/호모게나이저 (버틴 테크놀로지스 (Bertin Technologies), 프랑스 세인트 쿠엔틴 이블린스)를 사용하여 1 mL의 배양물로부터 추출하고, 균질화하고, 유리 비드 튜브 키트 (Glass Bead Tube Kit), 0.1 mm를 갖는 2 mL 튜브로 옮겼다. 프레셀리스®24 설정은 총 2회 주기 동안 6500 rpm, 20 초 주기 지속, 주기 간 5초 지연 시간이었다. 프레셀리스 추출 후, 용해물을 10,000 g에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 마셰리 (Macherey) (마셰리 네이글 (Macherey Nagel), 프랑스 호어트)로부터의 뉴클레오스핀(NucleoSpin)® 겔 및 PCR 클린-업을 사용하여 총 게놈 추출에 사용하였다.
정량적 PCR에 의한 PD0557Vc05 컨소시엄 정량화
PCR 기술과 같은 분자 기술의 최근 발전으로 인해, 예컨대 이 특허 출원에서 발효 생산으로부터의 배양액과 같은 상이한 유형의 환경에서 잠재적인 미생물을 신속하고 특이적이고 민감하게 검출하고 확인할 수 있다.
샘플의 절대 정량화는 에스에스오 어드밴스트 유니버셜 시브르 그린 슈퍼믹스 (Sso Advanced Universal SYBR Green Supermix) (바이오-라드 미트리 모리 (Bio-rad Mitry Mory), 프랑스)를 사용한 정량적 PCR (qPCR)에 의해 결정되었다. qPCR은 CFX96™ 실시간 시스템 (바이오-라드 미트리 모리, 프랑스)이 장착된 바이로-라드 C1000 ™ 열 순환기에서 수행되었다.
반응 혼합물은 1x 에스에스오 어드밴스트 유니버셜 시브르 그린 슈퍼믹스 (바이오-라드 미트리 모리, 프랑스), 6 μL의 각각의 순방향 (F) 및 역방향 (R) 프라이머 (1 μM), 2 μL의 희석된 샘플 (2 ng/μL, 나노드럽 측정) 및 20 μL의 최종 부피에 도달하기 위한 뉴클레아제 무함유 물로 이루어졌다. 증폭은 하기 열 순환 프로그램에 따라 달성되었다: 98℃에서 2분 동안 초기 용융. (1주기) 이후 98℃에서 10초 동안 용융, 프라이머 어닐링 및 60℃에서 30초 동안 연장하는 40주기. (용융 곡선 65 내지 95℃, 5초마다 0.5℃ 증가).
공지된 농도의 게놈 DNA의 연속 희석물에 대한 Cq 값을 사용하여 각각의 미생물에 대한 표준 곡선을 결정하였다. 각각의 웰 (표준 곡선 및 샘플)에 대한 Cq 값은 CFX 매니저(Manager)™ 3.1 소프트웨어에 의해 결정되었다. 샘플을 표준 곡선에 대해 플롯팅하여 핵산의 풍부도를 결정하였다. 절대 정량화는 씨. 아세토부틸리쿰의 경우 세포당 하나의 gapC 유전자 카피, 씨. 스페노이데스의 경우 세포당 하나의 cpn60 유전자 카피, 씨. 스포로게네스의 경우 세포당 하나의 tpi 유전자 카피을 기반으로 하였다. 계산을 위해, 핵산 추출은 추출 효율을 측정할 수 없기 때문에 완벽하다고 가정하였다.
CFX96™ 실시간 시스템이 장착된 바이오-라드 C1000™ 열 순환기에서 에스에스오 어드밴스트 유니버셜 시브르 그린 슈퍼믹스 (바이오-라드 미트리 모리, 프랑스)를 사용하여 정량적 PCR (qPCR)을 통해 샘플 중의 각각의 미생물의 풍부도를 결정하였다. 씨. 아세토부틸리쿰을 표적으로 하는데 사용된 gapC 유전자 기반 프라이머는 gapC_F, 5'-TGCTGCTGTAAGTATCATC-3' (서열식별번호: 42) 및 gapC_R, 5'-GTTGGAACTGGAACTCTT-3' (서열식별번호: 43)였다. 씨. 스페노이데스를 표적으로 하는데 사용된 cpn60 유전자 기반 프라이머는 cpn60_F, 5'-TTATATGTGCACCGATATG-3' (서열식별번호: 44) 및 cpn60_R, 5'-GAGAAGTCTTGCGCCGGAC-3' (서열식별번호: 45)였다. 씨. 스포로게네스를 표적으로 하는데 사용된 tpi 유전자 기반 프라이머는 tpi_F, 5'-CCAGCGGTATTAGAAGAA-3' (서열식별번호: 46) 및 tpi_R, 5'-GTCCTATAATTACATAATGAACTC-3' (서열식별번호: 47)였다.
하기 표에서, PD0557Vc05 컨소시엄에 존재하는 상이한 종의 표현 백분율은 배양물에 함유된 세포의 총합이 100%에 해당하는 것으로 고려하여 제공된다.
<표 9>
비특허 참조문헌
SEQUENCE LISTING
<110> METABOLIC EXPLORER
<120> MICROORGANISMS WITH IMPROVED 1,3-PROPANEDIOL AND BUTYRIC ACID
PRODUCTION
<130> B376540PCT D38115
<150> EP18306099.5
<151> 2018-08-10
<160> 47
<170> PatentIn version 3.5
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Lys Cys Val Leu Cys Gly Arg Cys Val Ala Ala Cys Lys Gln His Thr
145 150 155 160
Ser Thr Cys Ser Ile Gln Phe Ile Lys Lys Asp Gly Gln Arg Ala Val
165 170 175
Gly Thr Val Asp Asp Val Cys Leu Asp Asp Ser Thr Cys Leu Leu Cys
180 185 190
Gly Gln Cys Val Ile Ala Cys Pro Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Ser
195 200 205
His Ile Glu Lys Val Gln Glu Ala Leu Asn Asp Pro Lys Lys His Val
210 215 220
Ile Val Ala Met Ala Pro Ser Val Arg Thr Ala Met Gly Glu Leu Phe
225 230 235 240
Lys Met Gly Tyr Gly Lys Asp Val Thr Gly Lys Leu Tyr Thr Ala Leu
245 250 255
Arg Met Leu Gly Phe Asp Lys Val Phe Asp Ile Asn Phe Gly Ala Asp
260 265 270
Met Thr Ile Met Glu Glu Ala Thr Glu Leu Leu Gly Arg Val Lys Asn
275 280 285
Asn Gly Pro Phe Pro Met Phe Thr Ser Cys Cys Pro Ala Trp Val Arg
290 295 300
Leu Ala Gln Asn Tyr His Pro Glu Leu Leu Asp Asn Leu Ser Ser Ala
305 310 315 320
Lys Ser Pro Gln Gln Ile Phe Gly Thr Ala Ser Lys Thr Tyr Tyr Pro
325 330 335
Ser Ile Ser Gly Ile Ala Pro Glu Asp Val Tyr Thr Val Thr Ile Met
340 345 350
Pro Cys Asn Asp Lys Lys Tyr Glu Ala Asp Ile Pro Phe Met Glu Thr
355 360 365
Asn Ser Leu Arg Asp Ile Asp Ala Ser Leu Thr Thr Arg Glu Leu Ala
370 375 380
Lys Met Ile Lys Asp Ala Lys Ile Lys Phe Ala Asp Leu Glu Asp Gly
385 390 395 400
Glu Val Asp Pro Ala Met Gly Thr Tyr Ser Gly Ala Gly Ala Ile Phe
405 410 415
Gly Ala Thr Gly Gly Val Met Glu Ala Ala Ile Arg Ser Ala Lys Asp
420 425 430
Phe Ala Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn Val Asp Tyr Thr Glu Val Arg
435 440 445
Gly Phe Lys Gly Ile Lys Glu Ala Glu Val Glu Ile Ala Gly Asn Lys
450 455 460
Leu Asn Val Ala Val Ile Asn Gly Ala Ser Asn Phe Phe Glu Phe Met
465 470 475 480
Lys Ser Gly Lys Met Asn Glu Lys Gln Tyr His Phe Ile Glu Val Met
485 490 495
Ala Cys Pro Gly Gly Cys Ile Asn Gly Gly Gly Gln Pro His Val Asn
500 505 510
Ala Leu Asp Arg Glu Asn Val Asp Tyr Arg Lys Leu Arg Ala Ser Val
515 520 525
Leu Tyr Asn Gln Asp Lys Asn Val Leu Ser Lys Arg Lys Ser His Asp
530 535 540
Asn Pro Ala Ile Ile Lys Met Tyr Asp Ser Tyr Phe Gly Lys Pro Gly
545 550 555 560
Glu Gly Leu Ala His Lys Leu Leu His Val Lys Tyr Thr Lys Asp Lys
565 570 575
Asn Val Ser Lys His Glu
580
<210> 16
<211> 1749
<212> DNA
<213> Clostridium acetobutylicum
<400> 16
atgaaaacaa taatcttaaa tggcaatgaa gtgcatacag ataaagatat tactatcctt 60
gagctagcaa gagaaaataa tgtagatatc ccaacactct gctttttaaa ggattgtggc 120
aattttggaa aatgcggagt ctgtatggta gaggtagaag gcaagggctt tagagctgct 180
tgtgttgcca aagttgaaga tggaatggta ataaacacag aatccgatga agtaaaagaa 240
cgaatcaaaa aaagagtttc aatgcttctt gataagcatg aatttaaatg tggacaatgt 300
tctagaagag aaaattgtga attccttaaa cttgtaataa agacaaaagc aaaagcttca 360
aaaccatttt taccagaaga taaggatgct ctagttgata atagaagtaa ggctattgta 420
attgacagat caaaatgtgt actatgcggt agatgcgtag ctgcatgtaa acagcacaca 480
agcacttgct caattcaatt tattaaaaaa gatggacaaa gggctgttgg aactgttgat 540
gatgtttgtc ttgatgactc aacatgctta ttatgcggtc agtgtgtaat cgcttgtcct 600
gttgctgctt taaaagaaaa atcccatata gaaaaagttc aagaagctct taatgaccct 660
aaaaaacatg tcattgttgc aatggctcca tcagtaagaa ctgctatggg cgaattattc 720
aaaatgggat atggaaaaga tgtaacagga aaactatata ctgcacttag aatgttaggc 780
tttgataaag tatttgatat aaactttggt gcagatatga ctataatgga agaagctact 840
gaacttttag gcagagttaa aaataatggc ccattcccta tgtttacatc ttgctgtcct 900
gcatgggtaa gattagctca aaattatcat cctgaattat tagataatct ttcatcagca 960
aaatcaccac aacaaatatt tggtactgca tcaaaaactt actatccttc aatttcagga 1020
atagctccag aagatgttta tacagttact atcatgcctt gtaatgataa aaaatatgaa 1080
gcagatattc ctttcatgga aactaacagc ttaagagata ttgatgcatc cttaactaca 1140
agagagcttg caaaaatgat taaagatgca aaaattaaat ttgcagatct tgaagatggt 1200
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aaatctggaa aaatgaacga aaaacaatat cactttatag aagtaatggc ttgccctggt 1500
ggatgtataa atggtggagg tcaacctcac gtaaatgctc ttgatagaga aaatgttgat 1560
tacagaaaac taagagcatc agtattatac aaccaagata aaaatgttct ttcaaagaga 1620
aagtcacatg ataatccagc tattattaaa atgtatgata gctactttgg aaaaccaggt 1680
gaaggacttg ctcacaaatt actacacgta aaatacacaa aagataaaaa tgtttcaaaa 1740
catgaataa 1749
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<212> PRT
<213> Clostridium acetobutylicum
<400> 17
Met Lys Thr Ile Ile Leu Asn Gly Asn Glu Val His Thr Asp Lys Asp
1 5 10 15
Ile Thr Ile Leu Glu Leu Ala Arg Glu Asn Asn Val Asp Ile Pro Thr
20 25 30
Leu Cys Phe Leu Lys Asp Cys Gly Asn Phe Gly Lys Cys Gly Val Cys
35 40 45
Met Val Glu Val Glu Gly Lys Gly Phe Arg Ala Ala Cys Val Ala Lys
50 55 60
Val Glu Asp Gly Met Val Ile Asn Thr Glu Ser Asp Glu Val Lys Glu
65 70 75 80
Arg Ile Lys Lys Arg Val Ser Met Leu Leu Asp Lys His Glu Phe Lys
85 90 95
Cys Gly Gln Cys Ser Arg Arg Glu Asn Cys Glu Phe Leu Lys Leu Val
100 105 110
Ile Lys Thr Lys Ala Lys Ala Ser Lys Pro Phe Leu Pro Glu Asp Lys
115 120 125
Asp Ala Leu Val Asp Asn Arg Ser Lys Ala Ile Val Ile Asp Arg Ser
130 135 140
Lys Cys Val Leu Cys Gly Arg Cys Val Ala Ala Cys Lys Gln His Thr
145 150 155 160
Ser Thr Cys Ser Ile Gln Phe Ile Lys Lys Asp Gly Gln Arg Ala Val
165 170 175
Gly Thr Val Asp Asp Val Cys Leu Asp Asp Ser Thr Cys Leu Leu Cys
180 185 190
Gly Gln Cys Val Ile Ala Cys Pro Val Ala Ala Leu Lys Lys Asn Pro
195 200 205
Ile
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<212> DNA
<213> Clostridium acetobutylicum
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atgaaaacaa taatcttaaa tggcaatgaa gtgcatacag ataaagatat tactatcctt 60
gagctagcaa gagaaaataa tgtagatatc ccaacactct gctttttaaa ggattgtggc 120
aattttggaa aatgcggagt ctgtatggta gaggtagaag gcaagggctt tagagctgct 180
tgtgttgcca aagttgaaga tggaatggta ataaacacag aatccgatga agtaaaagaa 240
cgaatcaaaa aaagagtttc aatgcttctt gataagcatg aatttaaatg tggacaatgt 300
tctagaagag aaaattgtga attccttaaa cttgtaataa agacaaaagc aaaagcttca 360
aaaccatttt taccagaaga taaggatgct ctagttgata atagaagtaa ggctattgta 420
attgacagat caaaatgtgt actatgcggt agatgcgtag ctgcatgtaa acagcacaca 480
agcacttgct caattcaatt tattaaaaaa gatggacaaa gggctgttgg aactgttgat 540
gatgtttgtc ttgatgactc aacatgctta ttatgcggtc agtgtgtaat cgcttgtcct 600
gttgctgctt taaaaaaaaa tcccatatag 630
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<212> PRT
<213> Clostridium acetobutylicum
<400> 19
Met His Tyr Ser Leu Ala Val Lys Leu Val Cys Glu Met Leu Gly Thr
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Ala Ile Leu Val Leu Phe Gly Asn Gly Ala Val Ala Asn Val Glu Leu
20 25 30
Lys Gly Thr Lys Gly Tyr Arg Asn Gly Trp Ile Ile Ile Ala Ile Gly
35 40 45
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65 70 75 80
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195 200 205
Leu Lys Asn Lys Gly Asn Ser Glu Trp Thr Tyr Ala Trp Ile Pro Val
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Leu Ala Pro Met Phe Gly Ser Ile Ile Ala Ile Phe Leu Phe Asn Lys
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Ile Tyr
<210> 20
<211> 729
<212> DNA
<213> Clostridium acetobutylicum
<400> 20
atgcattata gtttagctgt aaagttagtt tgcgaaatgc ttggtacagc aattttagta 60
ctatttggta acggtgcagt tgctaatgta gaattaaaag gaactaaagg gtatcgcaat 120
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aataaaatta gtggtagtca gacaaatcca gctatgacaa taggattagc agtaaatggg 240
ctttttccgt ggtctgaggt tataccatat atattggctc agtttgtagg tgctataata 300
ggtcaagtta ttctttactt tatatacctt ccgttttata aacaaacaga ggatactaaa 360
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cgtatagtac attcactttt gccacttaaa aataaaggca attctgaatg gacatatgcc 660
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<210> 21
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<212> PRT
<213> Clostridium acetobutylicum
<400> 21
Met His Tyr Ser Leu Ala Val Lys Leu Val Cys Glu Ile Leu Gly Thr
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Ala Ile Leu Val Leu Phe Gly Asn Gly Ala Val Ala Asn Val Glu Leu
20 25 30
Lys Gly Thr Lys Gly Tyr Arg Asn Gly Trp Ile Ile Ile Ala Ile Gly
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Tyr Gly Val Gly Val Met Leu Pro Ala Leu Met Phe Asn Lys Ile Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Phe Pro Trp Ser Glu Val Ile Pro Tyr Ile Leu Ala Gln Phe Val
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Gly Ala Ile Ile Gly Gln Val Ile Leu Tyr Phe Ile Tyr Leu Pro Phe
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Tyr Lys Gln Thr Glu Asp Thr Lys Ser Ile Leu Gly Thr Cys Ser Thr
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Ile Ser Ala Ser Gly Ser His Ile Asn Gly Phe Val Thr Glu Phe Phe
130 135 140
Gly Thr Phe Leu Leu Val Leu Gly Ala Met Phe Ile Leu Asn Ser Thr
145 150 155 160
Gly Val Lys Ser Thr Pro Ala Val Gly Tyr Val Gly Leu Gly Phe Leu
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Leu Lys Asn Lys Gly Asn Ser Glu Trp Thr Tyr Ala Trp Ile Pro Val
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Leu Ala Pro Met Phe Gly Ser Ile Ile Ala Ile Phe Leu Phe Asn Lys
225 230 235 240
Ile Tyr
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<211> 729
<212> DNA
<213> Clostridium acetobutylicum
<400> 22
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ctttttccgt ggtctgaggt tataccatat atattggctc agtttgtagg tgctataata 300
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<213> Clostridium acetobutylicum
<400> 23
Met Asn Lys Ala Asp Tyr Lys Gly Val Trp Val Phe Ala Glu Gln Arg
1 5 10 15
Asp Gly Glu Leu Gln Lys Val Ser Leu Glu Leu Leu Gly Lys Gly Lys
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Glu Met Ala Glu Lys Leu Gly Val Glu Leu Thr Ala Val Leu Leu Gly
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65 70 75 80
Gly Tyr Ala Lys Val Ile Cys Asp Leu Val Asn Glu Arg Lys Pro Glu
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Ile Ala Ala Arg Leu Ser Thr Gly Leu Thr Ala Asp Cys Thr Ser Leu
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Asp Ile Asp Val Glu Asn Arg Asp Leu Leu Ala Thr Arg Pro Ala Phe
130 135 140
Gly Gly Asn Leu Ile Ala Thr Ile Val Cys Ser Asp His Arg Pro Gln
145 150 155 160
Met Ala Thr Val Arg Pro Gly Val Phe Glu Lys Leu Pro Val Asn Asp
165 170 175
Ala Asn Val Ser Asp Asp Lys Ile Glu Lys Val Ala Ile Lys Leu Thr
180 185 190
Ala Ser Asp Ile Arg Thr Lys Val Ser Lys Val Val Lys Leu Ala Lys
195 200 205
Asp Ile Ala Asp Ile Gly Glu Ala Lys Val Leu Val Ala Gly Gly Arg
210 215 220
Gly Val Gly Ser Lys Glu Asn Phe Glu Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Thr Ile Ala Ala Ser Arg Ala Ala Ile Glu Lys Glu
245 250 255
Trp Val Asp Lys Asp Leu Gln Val Gly Gln Thr Gly Lys Thr Val Arg
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Pro Thr Leu Tyr Ile Ala Cys Gly Ile Ser Gly Ala Ile Gln His Leu
275 280 285
Ala Gly Met Gln Asp Ser Asp Tyr Ile Ile Ala Ile Asn Lys Asp Val
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Glu Ala Pro Ile Met Lys Val Ala Asp Leu Ala Ile Val Gly Asp Val
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<212> DNA
<213> Clostridium acetobutylicum
<400> 24
atgaataaag cagattacaa gggcgtatgg gtgtttgctg aacaaagaga cggagaatta 60
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<211> 336
<212> PRT
<213> Clostridium acetobutylicum
<400> 25
Met Asn Lys Ala Asp Tyr Lys Gly Val Trp Val Phe Ala Glu Gln Arg
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Asp Gly Glu Leu Gln Lys Val Ser Leu Glu Leu Leu Gly Lys Gly Lys
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Glu Met Ala Glu Lys Leu Gly Val Glu Leu Thr Ala Val Leu Leu Gly
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Met Ala Thr Val Arg Pro Gly Val Phe Glu Lys Leu Pro Val Asn Asp
165 170 175
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180 185 190
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245 250 255
Trp Val Asp Lys Asp Leu Gln Val Gly Gln Thr Gly Lys Thr Val Arg
260 265 270
Pro Thr Leu Tyr Ile Ala Cys Gly Ile Ser Gly Ala Ile Gln His Leu
275 280 285
Ala Gly Met Gln Asp Ser Asp Tyr Ile Ile Ala Ile Asn Lys Asp Val
290 295 300
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305 310 315 320
Asn Lys Val Val Pro Glu Leu Ile Ala Gln Val Lys Ala Ala Asn Asn
325 330 335
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<211> 1011
<212> DNA
<213> Clostridium acetobutylicum
<400> 26
atgaataaag cagattacaa gggcgtatgg gtgtttgctg aacaaagaga cggagaatta 60
caaaaggtat cattggaatt attaggtaaa ggtaaggaaa tggctgagaa attaggcgtt 120
gaattaacag ctgttttact tggacataat actgaaaaaa tgtcaaagga tttattatct 180
catggagcag ataaggtttt agcagcagat aatgaacttt tagcacattt ttcaacagat 240
ggatatgcta aagttatatg tgatttagtt aatgaaagaa agccagaaat attattcata 300
ggagctactt tcgtaggaag agatttagga ccaagaatag cagcaagact ttctactggt 360
ttaactgctg attgtacatc acttgacata gatgtagaaa atagagattt attggctaca 420
agaccagcgt ttggtggaaa tttgatagct acaatagttt gttcagacca cagaccacaa 480
atggctacag taagacctgg tgtgtttgaa aaattacctg ttaatgatgc aaatgtttct 540
gatgataaaa tagaaaaagt tgcaattaaa ttaacagcat cagacataag aacaaaagtt 600
tcaaaagttg ttaagcttgc taaagatatt gcagatatcg gagaagctaa ggtattagtt 660
gctggtggta gaggagttgg aagcaaagaa aactttgaaa aacttgaaga gttagcaagt 720
ttacttggtg gaacaatagc cgcttcaaga gcagcaatag aaaaagaatg ggttgataag 780
gaccttcaag taggtcaaac tggtaaaact gtaagaccaa ctctttatat tgcatgtggt 840
atatcaggag ctatccagca tttagcaggt atgcaagatt cagattacat aattgctata 900
aataaagatg tagaagcccc aataatgaag gtagcagatt tggctatagt tggtgatgta 960
aataaagttg taccagaatt aatagctcaa gttaaagctg ctaataatta a 1011
<210> 27
<211> 2364
<212> DNA
<213> Clostridium butyricum
<400> 27
atgataagta aaggatttag tacccaaaca gaaagaataa atattttaaa ggctcaaata 60
ttaaatgcta aaccatgtgt tgaatcagaa agagcaatat taataacaga atcatttaaa 120
caaacagaag gccagccagc aattttaaga agagcattgg cattgaaaca catacttgaa 180
aatatcccta taacaattag agatcaagaa cttatagtgg gaagtttaac taaagaacca 240
aggtcttcac aagtatttcc tgagttttct aataagtggt tacaagatga attggataga 300
ttaaataaga gaactggaga tgcattccaa atttcagaag aaagtaaaga aaaattaaaa 360
gatgtctttg agtattggaa tggaaagaca acaagtgagt tagcaacttc atatatgaca 420
gaggaaacaa gagaggcagt aaattgtgat gtatttactg taggaaacta ctattataat 480
ggcgtaggac atgtatctgt agattatgga aaagtattaa gggttggatt taatgggatt 540
ataaatgagg ctaaggaaca attagaaaaa aacaggagta tagatcctga ttttataaag 600
aaagaaaaat tcctaaatag tgttattatc tcatgcgaag ctgcaataac atatgtaaat 660
agatatgcta aaaaggctaa agagattgca gataatacaa gtgatgcaaa aagaaaagct 720
gaattaaatg aaatagcaaa aatttgttca aaagtttcag gagagggagc taaatctttc 780
tatgaagcat gtcaattatt ttggtttatt catgcaataa taaatataga atctaatgga 840
cattctattt ctccagctag atttgatcaa tacatgtatc catattatga aaatgataaa 900
aatataacag ataagtttgc tcaagaatta atagattgta tctggattaa attaaatgat 960
attaataaag taagagatga gatttcaact aaacattttg gtggttaccc aatgtatcaa 1020
aacttaattg ttgggggtca aaattcagaa ggaaaagatg caactaataa agtatcatat 1080
atggcattag aagcagctgt ccatgtaaag ttgcctcagc catctttgtc agtaagaata 1140
tggaataaga ctccagatga atttttgctt agagcagcag aattaactag agaagggtta 1200
ggacttcctg cttattataa tgatgaagtt attattccag cattagtttc tagaggtctt 1260
acattagaag atgcaagaga ctacggaata attggatgtg ttgaaccaca aaagccagga 1320
aaaacagaag gatggcatga ttcagcattc tttaatcttg caagaatagt agagttaact 1380
ataaattctg gatttgataa aaataaacag attggaccta aaactcaaaa ttttgaagaa 1440
atgaaatcct ttgatgaatt catgaaagct tataaagctc aaatggagta ttttgtaaaa 1500
catatgtgct gtgctgataa ttgcatagat attgcacatg cagaaagagc tccattacct 1560
ttcttgtcat caatggttga taattgtatc ggaaaaggaa agagccttca agatggtggt 1620
gcagaatata acttcagtgg accacaaggt gttggagtag ctaatattgg agattcatta 1680
gttgcagtta aaaaaattgt gtttgatgaa aataagatta ctccttcaga attaaagaaa 1740
acattaaata atgattttaa aaattcagaa gaaatacaag ccttactaaa aaatgctcct 1800
aagtttggaa atgatattga tgaagttgat aatttagcta gagagggtgc attagtatac 1860
tgtagagaag ttaataaata tacaaatcca aggggaggaa attttcaacc aggattatat 1920
ccatcttcaa ttaatgtata ttttggaagc ttaacaggtg ctactccaga tggaaggaaa 1980
tccggacaac cattagctga tggggtttct ccatcaagag gctgtgatgt atctggacct 2040
actgcagctt gtaactcagt tagtaaatta gatcatttta tagcttcaaa tggaacttta 2100
tttaatcaaa aattccatcc gtcagcatta aaaggtgata atggattaat gaatttatca 2160
tcattaataa gaagttattt tgatcaaaag ggatttcatg ttcaatttaa tgtaatagat 2220
aaaaaaatat tacttgcagc acaaaaaaat cctgaaaaat atcaagattt aattgttaga 2280
gttgcaggat atagtgcaca gttcatttct ttagataaat ctattcaaaa tgatattatt 2340
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<213> Clostridium butyricum
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cctggaataa gaactatagt attttttaag ggatgttcaa tgtcgtgctt atggtgcagt 120
aatccagaat cccaagatat taaacctcaa gtaatgttta ataaaaattt atgtacaaaa 180
tgtggaagat gtaaatctca atgtaaaagt gcagctattg atatgaattc agaatatagg 240
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cttgttattg aaggaaggaa ttacagtgtt gaagacgtta taaaggaatt gaaaaaagat 360
agtgttcaat atagaagatc aaacggtgga attacactat ctggagggga agtattactt 420
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attggagctg agtaa 915
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<212> DNA
<213> Clostridium butyricum
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atgagaatgt atgattattt agtaccaagt gtaaacttta tgggagcaaa ttcagtatca 60
gtagtaggtg aaagatgcaa aatattaggt ggaaaaaaag cattgatagt tacagataag 120
tttctaaaag atatggaagg tggagctgtt gaattaacag ttaaatattt aaaagaagct 180
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agttcgcatg attgcggtaa gggaatagga attgctgcaa cacatgaagg agatctttat 360
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<223> glpK oligo for PCR reaction and for Sanger sequencing
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<213> artificial
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<213> artificial
<220>
<223> hydA oligo for PCR reaction and for Sanger sequencing
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<223> hydA oligo for Sanger sequencing
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cgtgaggttg acctccacca tttatacatc c 31
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<220>
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<220>
<223> glpF oligo for PCR reaction
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<223> glpF oligo for PCR reaction and for Sanger sequencing
<400> 38
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<220>
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<213> artificial
<220>
<223> etfA oligo for PCR reaction and for Sanger sequencing
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<220>
<223> etfA oligo for PCR reaction and for Sanger sequencing
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<223> gapC primer F
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<223> gapC primer R
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<213> artificial
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<400> 45
gagaagtctt gcgccggac 19
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<211> 18
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<213> artificial
<220>
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<400> 46
ccagcggtat tagaagaa 18
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<211> 24
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<213> artificial
<220>
<223> tpi primer R
<400> 47
gtcctataat tacataatga actc 24
Claims (19)
- 씨. 부티리쿰 (C. butyricum)으로부터의 dhaB1, dhaB2 및 dhaT 유전자를 발현하고 약화된 글리세롤 키나제 활성을 포함하는, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum)의 돌연변이 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 글리세롤 키나제가 씨. 아세토부틸리쿰 (C. acetobutylicum) 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 유전자좌 CA_C1321에서 유전자 glpK에 의해 코딩되는 것인 돌연변이 균주.
- 제2항에 있어서, 유전자좌 CA_C1321에서 유전자 glpK에 하기 돌연변이 중 적어도 하나를 포함하는 돌연변이 균주:
a. 위치 347의 아미노산 알라닌을 트레오닌으로 대체하기 위한, 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 1462461 내지 1462463에서의 코돈 돌연변이,
b. 위치 22의 아미노산 히스티딘을 티로신으로 대체하기 위한, 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 1461486 내지 1461488에서의 코돈 돌연변이,
c. 위치 466의 아미노산 발린을 메티오닌으로 대체하기 위한, 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 1462818 내지 1462820에서의 코돈 돌연변이. - 제3항에 있어서, 적어도 유전자좌 CA_C1321에서, 위치 347의 아미노산 알라닌을 트레오닌으로 대체하기 위한, 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 뉴클레오티드 위치 1462461 내지 1462463에서의 코돈 돌연변이를 포함하는 돌연변이 균주.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 약화된 수소 디히드로게나제 활성, 바람직하게는 비활성화된 수소 디히드로게나제 활성을 추가로 포함하는 돌연변이 균주.
- 제5항에 있어서, 상기 히드로게나제가 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 유전자좌 CA_C0028에서 유전자 hydA에 의해 코딩되는 것인 돌연변이 균주.
- 제6항에 있어서, 적어도 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 유전자좌 CA_C0028에서 유전자 hydA의 뉴클레오티드 위치 39233에서의 뉴클레오티드 C의 결실을 포함하는 돌연변이 균주.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 강화된 글리세롤 흡수 촉진자 퍼미아제 활성을 추가로 포함하는 돌연변이 균주.
- 제8항에 있어서, 상기 글리세롤 흡수 촉진자 단백질이 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 유전자좌 CA_C0770에서 유전자 glpF에 의해 코딩되는 것인 돌연변이 균주.
- 제9항에 있어서, 적어도 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 유전자좌 CA_C0770에서 유전자 glpF의 뉴클레오티드 위치 892875에서의 뉴클레오티드 G의 대체를 포함하는 돌연변이 균주.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 약화된 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 알파 활성을 추가로 포함하는 돌연변이 균주.
- 제11항에 있어서, 상기 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 알파가 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 유전자좌 CA_C2709에서 유전자 etfA에 의해 코딩되는 것인 돌연변이 균주.
- 제12항에 있어서, 적어도 씨. 아세토부틸리쿰 게놈 ATCC824, 진뱅크 AE001437의 유전자좌 CA_C2709에서 유전자 etfA의 뉴클레오티드 위치 2833384에서의 뉴클레오티드 T의 대체를 포함하는 돌연변이 균주.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 균주를 포함하는 클로스트리디움의 컨소시엄
- 제14항에 있어서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 돌연변이 균주 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 및 적어도 하나의 클로스트리디움 스포로게네스 (Clostridium sporogenes) 균주 및/또는 적어도 하나의 클로스트리디움 스페노이데스 (Clostridium sphenoides) 균주를 포함하는 클로스트리디움의 컨소시엄.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 돌연변이 균주 또는 제14항에서 정의된 바와 같은 컨소시엄을 적어도 글리세롤을 포함하는 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계 및 배양 배지로부터 생산된 1,3-프로판디올 및/또는 부티르산을 회수하는 단계를 포함하는, 1,3-프로판디올 및 부티르산을 생산하는 방법.
- 제16항에 있어서, 생산된 1,3-프로판디올 및/또는 부티르산이 추가로 정제되는 것인 1,3-프로판디올 및 부티르산을 생산하는 방법.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 배양 배지 중의 글리세롤 농도가 90 내지 120 g/L, 바람직하게는 약 105 g/L인 1,3-프로판디올 및 부티르산을 생산하는 방법.
- 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 유기 질소가 배제된 것이고, 바람직하게는 유기 질소를 첨가하지 않은, 더욱 바람직하게는 효모 추출물이 없는 합성 배지인 1,3-프로판디올 및 부티르산을 생산하는 방법.
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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