ES2340889T3 - Procedimiento para la obtencion de la (4s)-3,4-dihidroxi-2,6,6-trimetil-ciclohex-2-enona y derivados de la misma con empleo de la feniletanol dehidrogenada de azoarcus. - Google Patents
Procedimiento para la obtencion de la (4s)-3,4-dihidroxi-2,6,6-trimetil-ciclohex-2-enona y derivados de la misma con empleo de la feniletanol dehidrogenada de azoarcus. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para la obtención de derivados ópticamente activos de la (4S)-4-hidroxi-2,6,6-trimetilciclohex-2-en-1-ona de la fórmula (I)# **(Ver fórmula)** en la que#R1 significa hidrógeno, alquilo con 1 hasta 10 átomos de carbono, arilalquilo con 7 hasta 14 átomos de carbono, un metal alcalino M1 o un fragmento de un metal alcalinotérreo M21/2 o (M2)+X-, donde M significa Li, Na, K, Rb o Cs y M2 significa Mg, Ca, Sr o Ba y X- significa un anión cargado de manera sencilla,# que comprende una etapa de reacción,# en la que se incuba en un medio, que contiene un derivado de la trimetil-ciclohex-2-en-1,4-diona de la fórmula (II),# **(Ver fórmula)** en la que R2 es igual o diferente de R1 y significa hidrógeno, alquilo con 1 hasta 10 átomos de carbono, arilalquilo con 7 hasta 14 átomos de carbono, un metal alcalino M1 o un fragmento de metal alcalinotérreo M21/2 o (M2)+X-, donde M1 significa Li, Na, K, Rb o Cs y M2 significa Mg, Ca, Sr o Ba y X- significa un anión cargado de manera sencilla, por incubación de un enzima (E), que tiene una secuencia de polipéptidos, que es o bien (i) la SEQ ID NO: 2, o bien (ii) en la que hasta el 25% inclusive de los restos de los aminoácidos están modificados con respecto a la SEQ ID NO: 2 por medio de una deleción, de una inserción, de una substitución o de una combinación de los mismos y que presenta todavía al menos el 50% de la actividad enzimática de la SEQ ID NO: 2, en presencia de equivalentes de reducción, reduciéndose por vía enzimática el compuesto de la fórmula (II) para dar el compuesto de la fórmula (I), y los equivalentes de reducción, que son consumidos en el transcurso de la reacción son regenerados de nuevo por medio de la conversión de un agente reductor (RM) para dar el correspondiente producto de la oxidación (OP) con ayuda del enzima (E) o con otro enzima (E2) y, de manera opcional, el producto de la oxidación (OP) se elimina, al menos en parte, del medio de la reacción o del equilibrio de la reacción, y se aísla el producto (I) formado.
Description
Procedimiento para la obtención de la
(4S)3,4-dihidroxi-2,6,6-trimetil-ciclohex-2-enona
y derivados de la misma con empleo de la feniletanol dehidrogenasa
de Azoarcus.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la obtención de derivados ópticamente activos de
la
(4S)-4-hidroxi-2,6,6-trimetil-ciclohex-2-en-1-ona
de la fórmula (I) y a un procedimiento para la obtención de (3S,
3'S)-astaxantina de la fórmula (III) que abarca el
procedimiento que ha sido citado en primer lugar.
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Como consecuencia de sus dos centros de
quiralidad en la posición 3 y en la posición 3', la astaxantina
(3,3'-dihidroxi-\beta,\beta'-carotin-4,4'-diona)
puede presentarse en forma de los siguientes isómeros de
configuración: (3S, 3'S), (3R, 3'R), (3S, 3'R) y (3R, 3'S). Los dos
isómeros de configuración que han sido citados en último lugar son
idénticos y representan una forma meso (Carotenoids Handbook, 2004,
Main List Nr. 405).
Las tres formas se encuentran en fuentes
naturales (Carotenoids Handbook, 2004, Main List Nr. 404, 405, 406).
La síntesis química total, a partir de productos de partida
racémicos, conduce a una mezcla 1:2:1 constituida por la (3S,
3'S)-astaxantina, la
meso-astaxantina y la (3R,
3'R)-astaxantina (The EFSA Journal, 2005, 291, 12,
Deutsche Lebensmittel-Rundschau, 2004, 100, 437,
Helvetica Chimica Acta, 1981, 64, 2436).
Sin embargo, el isómero con la configuración
(3S, 3'S) tiene un significado especial. Este isómero es
biosintetizado por las algas verdes (Haematococcus
pluvialis) en forma enantiómeramente pura (J. Applied Phycology,
1992, 4, 165; Phytochemistry, 1981, 20, 2561).
La (S,S)-astaxantina de las
algas verdes es empleada como complemento alimenticio con efectos
positivos para la salud de los seres humanos (J. Nat. Prod., 2006,
69, 443). Por otra parte, es adecuado bloquear por completo el
efecto prooxidante inconveniente del Rofecoxib (Vioxx) (J.
Cardiovasc. Pharmacol., 2006, 47 Suppl 1, página 7).
Sin embargo, teniendo en consideración la baja
concentración de la (S,S)-astaxantina en las algas
verdes (J. Agric. Food Chem., 1998, 46, 3371), la disponibilidad de
este principio activo está muy limitada. Por otra parte, el
principio activo se presenta en las algas en una mezcla formada por
monoésteres y por diésteres de ácidos grasos así como por la
astaxantina libre, lo cual provoca un coste considerable para llevar
a cabo el aislamiento y la purificación (véanse entre otras las
publicaciones Phytochemistry, 20, 11, 2561 (1981); J. Applied
Phycology, 4, 2, 165 (1992)). Con objeto de poner a disposición la
(S,S)-astaxantina en mayores cantidades y con
elevada pureza, la síntesis química total representa la tecnología
elegida.
En la literatura han sido descritas diversas
síntesis de la (S,S)-astaxantina. Una estrategia
consiste en la disociación de los productos precursores racémicos
en los antípodas ópticos, para lo cual se han empleado las sales
diastereómeras (Helvetica Chimica Acta, 1981, 64, 2447) o los
ésteres diastereómeros (Helvetica Chimica Acta, 1981, 64, 2419).
También se ha informado sobre la disociación microbiana del racemato
de los productos precursores racémicos. En estos procedimientos es
especialmente inconveniente el que el enantiómero, que conduciría a
la (R,R)-astaxantina no puede ser empleado o bien
únicamente puede ser recuperado de una manera muy costosa.
Otra estrategia de síntesis consiste en el
acceso a los elementos estructurales de la síntesis enantiómeramente
puros por medio de procedimientos microbianos o bien enzimáticos
(Helvetica Chimica Acta, 1978, 61, 2609, Helvetica Chimica Acta,
1981, 64, 2405). Puesto que estos elementos estructurales presentan
un estado de oxidación demasiado bajo, tuvieron que ser
transformados en síntesis con muchas etapas para dar los productos
precursores de la (S,S)-astaxantina.
La publicación WO 2006/039685 describe, por un
lado, en el esquema II una hidrogenación enantioselectiva en dos
etapas de la cetoisoforona para dar un diol con 9 átomos de carbono
enantiómeramente puro, a partir del cual se accede a los productos
precursores de la (S,S)-astaxantina tras una
reoxidación de un grupo hidroxi de conformidad con el procedimiento
descrito en la publicación Helv. Chim. Acta,1978 61, 2609, en una
síntesis que abarca múltiples etapas. Por otra parte, la
publicación WO 2006/039685 describe una hidrogenación por
transferencia catalítica enantioselectiva de un enoléter con 9
átomos de carbono de la fórmula (IIa) para dar el correspondiente
alcohol enantiómeramente puro de la fórmula (Ia).
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Como catalizadores para la hidrogenación han
sido descritos metales con ligandos quirales, preferentemente
catalizadores de rutenio con aminas ópticamente activas a título de
ligandos. El inconveniente de este procedimiento consiste en que se
emplea un derivado O-protegido de un producto
intermedio industrial de la fórmula (IIb),
\vskip1.000000\baselineskip
lo cual requiere un coste adicional
para la síntesis. Por otra parte los catalizadores ópticamente
activos necesarios son muy costosos de tal manera, que su empleo
queda dificultado en los procedimientos industriales desde el punto
de vista
económico.
De igual modo, se ha descrito la reducción
biocatalítica de un enol con 9 átomos de carbono de la fórmula
(IIb) con levaduras. Sin embargo, en este caso se obtuvo únicamente
un exceso en enantiómeros del 65%, lo cual hace que este proceso no
pueda ser empleado en procedimientos industriales. (Helv. Chim.
Acta, 1981, 64, 2447).
En principio se sabe que las dehidrogenasas son
adecuadas como biocatalizadores para la obtención de compuestos
hidroxi ópticamente activos. Se trata de biocatalizadores
perfectamente caracterizados que han sido empleados ya en una serie
de procesos industriales (Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 43, 788,
Tetrahedron, 2004, 60, 633, Chiral
catalysis-asymmetric hydrogenation supplement to
Chemistry Today, 2004, 22, 26, Current Opinion in Chemical Biology,
2004, 8, 120, Organic Process Research & Development, 2002, 6,
558, Tetrahedron: Asymmetry, 2003, 14, 2659, Chiral
catalysisasymmetric hydrogenation supplement to Chemistry Today,
2004, 22, 43).
Se describe en la publicación WO 2005/108590 un
procedimiento para la obtención de determinados alcanoles
ópticamente activos, tal como, por ejemplo, el
(1S)-3-metilamino-1-(2-tienil)-propan-1-ol
o el
(1S)-3-cloro-1-(2-tienil)-propan-1-ol,
por medio de una reducción enzimática de la cetona correspondiente.
No se ha tratado la extensión en la que puede ser aplicado el
enzima utilizado para la reducción de cetonas estructuradas de otra
manera.
Los procedimientos descritos para la
introducción de ambos centros de quiralidad en uno de los productos
precursores para la síntesis de la S,S'-astaxantina
o bien son complejos y abarcan múltiples etapas o bien no son
económicos de tal manera, que estos procedimientos parece que son
poco adecuados para una realización a escala industrial.
La tarea de la presente invención consistía en
desarrollar un procedimiento sencillo y económicamente eficiente, a
partir de productos de partida industrialmente disponibles, para la
obtención de un producto intermedio ópticamente activo, en forma lo
más enantiómeramente pura posible, para la síntesis de la
(S,S')-astaxantina, que pudiese ser integrado sin
problemas en la síntesis total industrial existente de la
astaxantina "racémica" (Carotenoids Vol.2, 1996, 259; Pure and
Applied Chemistry, 2002, 74, 2213).
\newpage
Esta tarea se resuelve por medio de un
procedimiento para la obtención de derivados ópticamente activos de
la
(4S)-4-hidroxi-2,6,6-trimetil-ciclohex-2-en-1-ona
de la fórmula (I)
en la
que
- R^{1}
- significa hidrógeno, alquilo con 1 hasta 10 átomos de carbono, arilalquilo con 7 hasta 14 átomos de carbono, un metal alcalino M^{1} o un fragmento de un metal alcalinotérreo M^{2} _{1/2} o (M^{2})^{+} X^{-}, donde M significa Li, Na, K, Rb o Cs y M^{2} significa Mg, Ca, Sr o Ba y X^{-} significa un anión cargado de manera sencilla,
que comprende una etapa de reacción,
en la que se incuba en un medio, que contiene un
derivado de la
trimetil-ciclohex-2-en-1,4-diona
de la fórmula (II),
en la
que
- R^{2}
- es igual o diferente de R^{1} y significa hidrógeno, alquilo con 1 hasta 10 átomos de carbono, arilalquilo con 7 hasta 14 átomos de carbono, un metal alcalino M^{1} o un fragmento de metal alcalinotérreo M^{2}_{1/2} o (M^{2})^{+}X^{-}, donde M^{1} significa Li, Na, K, Rb o Cs y M^{2} significa Mg, Ca, Sr o Ba y X significa un anión cargado de manera sencilla,
un enzima (E), en presencia de equivalentes de
reducción, reduciéndose por vía enzimática el compuesto de la
fórmula (II) para dar el compuesto de la fórmula (I), y los
equivalentes de reducción que se consumen en el transcurso de la
reacción son regenerados de nuevo por medio de la conversión de un
agente reductor (RM) para dar el correspondiente producto de la
oxidación (OP) con ayuda del enzima (E) o de otro enzima (E ) y, de
manera opcional, el producto de la oxidación (OP) se retira al menos
en parte del medio de la reacción o del equilibrio de la reacción y
se aísla el producto (I) formado,
teniendo el enzima (E) una secuencia
polipéptida, que es o bien
- (i)
- la SEQ ID NO: 2, o bien
- (ii)
- en la que hasta el 25% inclusive de los restos de los aminoácidos están modificados con respecto a la SEQ ID NO: 2 por medio de una deleción, de una inserción, de una substitución o de una combinación de los mismos y que presenta todavía al menos el 50% de la actividad enzimática de la SEQ ID NO: 2.
\vskip1.000000\baselineskip
En el procedimiento, de conformidad con la
invención, se preparan compuestos de la fórmula (I), en la que
R^{1} significa hidrógeno, alquilo con 1 hasta 10 átomos de
carbono, tal como por ejemplo metilo, etilo,
n-propilo, iso-propilo o
n-hexilo, arilalquilo con 7 hasta 14 átomos de
carbono, tal como por ejemplo bencilo, un metal alcalino M^{1} o
un fragmento de metal alcalinotérreo M^{2}_{1/2} o
(M^{2})^{+}X^{-}, donde M^{1} significa Li, Na, K,
Rb o Cs, de manera preferente significa Na o K, de manera especial
significa Na y M^{2} significa Mg, Ca, Sr o Ba, de manera
especial significa Mg y X^{-} significa un anión cargado de
manera sencilla, tal como por ejemplo halogenuro, acetato o
dihidrógenofosfato. De manera preferente R^{1} significa
hidrógeno, metilo, Na o K, de manera especialmente preferente
significa hidrógeno, metilo o Na, de manera especial significa
hidrógeno o sodio.
En los compuestos de partida de la fórmula (II),
que son transformados en el procedimiento de conformidad con la
invención, el resto R^{2} es igual o diferente de R^{1} y
significa hidrógeno, alquilo con 1 hasta 10 átomos de carbono, tal
como por ejemplo metilo, etilo, n-propilo,
iso-propilo o n-hexilo, arilalquilo
con 7 hasta 14 átomos de carbono, tal como por ejemplo bencilo, un
metal alcalino M^{1} o un fragmento de metal alcalinotérreo
M^{2}_{1/2} o (M^{2})^{+}X^{-}, donde M^{1}
significa Li, Na, K, Rb o Cs, de manera preferente significa Na o
K, de manera especial significa Na y M^{2} significa Mg, Ca, Sr o
Ba, de manera especial significa Mg y X^{-} significa un anión
cargado de manera sencilla, tal como por ejemplo halogenuro,
acetato o dihidrógenofosfato. De manera preferente, R^{1}
significa hidrógeno, metilo, Na o K, de manera especialmente
preferente significa hidrógeno, metilo o Na, de manera especial
significa hidrógeno o
sodio.
sodio.
Otros enzimas (E) adecuados de la clase de las
óxidorreductasas, es decir de manera especial enzimas con actividad
de dehidrogenasa son, especialmente, los enzimas de la familia de
las aldo-ceto-reductasas de la
superfamilia de las
aldo-ceto-reductasas (K. M. Bohren,
B. Bullock, B. Wermuth und K. H. Gabbay J. Biol. Chem. 1989, 264,
9547-9551) y de las alcoholdehidrogenasas de cadena
corta/reductasas (shortchain alcohol dehydrogenases/reductases
[SDR]). El grupo de enzimas citado en último lugar ha sido descrito
detalladamente, por ejemplo, por los autores H. Jornvall, B.
Persson, M. Krook, S. Atrian, R. Gonzalez-Duarte, J.
Jeffery y D. Ghosh, Biochemistry, 1995, 34, páginas
6003-6013 o por los autores U. Oppermann, C.
Filling, M. Hult, N. Shafqat, X. Q. Wu, M. Lindh, J. Shafqat, E.
Nordling, Y. Kallberg, B. Persson y H. Jornvall,
Chemico-Biological Interactions, 2003, 143, páginas
247-253. Dentro de estas clases de enzimas, que han
sido citadas, son adecuadas de una manera especialmente buena las
alcoholdehidrogenasas, especialmente las alcoholdehidrogenasas de
cadena corta. Entre las alcoholdehidrogenasas son adecuadas
especialmente los enzimas que reduzcan al compuesto de la fórmula
(II) para dar el compuesto de la fórmula (I) con NADH o con NADPH
como equivalente de reducción.
Los enzimas (E) adecuados con actividad de
óxidorreductasa, especialmente con actividad de dehidrogenasa, que
abarcan una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 2, así como
los "equivalentes funcionales" o análogos de los enzimas (E)
divulgados de manera concreta con actividad de óxidorreductasa,
especialmente con actividad de dehidrogenasa, que puedan ser
empleados igualmente en el procedimiento, han sido descritos
detalladamente en la publicación WO 2005/108590, páginas 11 hasta
16, a cuya publicación se hace aquí referencia expresa.
De manera preferente, en el procedimiento de
conformidad con la invención, se emplea un enzima (E), teniendo el
enzima (E) una secuencia de polipéptidos, que es o bien
- (i)
- la SEQ ID NO: 2, o bien
- (ii)
- en la que hasta el 25% inclusive de los restos de los aminoácidos están modificados con respecto a la SEQ ID NO: 2 por medio de una deleción, de una inserción, de una substitución o de una combinación de los mismos y que presenta todavía al menos el 50% de la actividad enzimática de la SEQ ID NO: 2,
que puede ser obtenida a partir de
microorganismos de los géneros Azoarcus, Azonexus, Azospira,
Azovibrio, Dechloromonas, Ferribacterium, Petrobacter,
Propionivibrio, Quadricoccus, Rhodocyclus, Sterolibacterium, Thauera
y Zoogloea.
\vskip1.000000\baselineskip
De manera especialmente preferente, en el
procedimiento de conformidad con la invención se emplea un enzima
(E), en el que el enzima (E) tiene una secuencia de polipéptidos,
que es o bien
- (i)
- la SEQ ID NO: 2, o bien
- (ii)
- en la que hasta el 25% inclusive de los restos de los aminoácidos están modificados con respecto a la SEQ ID NO: 2 por medio de una deleción, de una inserción, de una substitución o de una combinación de los mismos y que presenta todavía al menos el 50% de la actividad enzimática de la SEQ ID NO: 2,
que se elige entre los enzimas procedentes de
microorganismos del género Azoarcus, de manera especial procedente
de la bacteria Azoarcus sp.EbN1.
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a su secuencia de aminoácidos puede
asociarse a la feniletanol-dehidrogenasa procedente
de Azoarcus sp EbN1 con las alcoholdehidrogenasas/reductasas de
cadena corta (shortchain alcohol dehydrogenases/reductases [SDR]).
El grupo de enzimas ha sido descrito detalladamente, por ejemplo, en
las publicaciones H. Jörnvall, B. Persson, M. Krook, S. Atrian, R.
Gonzalez-Duarte, J. Jeffery y D. Ghosh,
Biochemistry, 1995, 34, páginas 6003-6013 o U.
Oppermann, C. Filling, M. Hult, N. Shafqat, X. Q. Wu, M. Lindh, J.
Shafqat, E. Nordling, Y. Kallberg, B. Persson y H. Jornvall,
Chemico-Biological Interactions, 2003, 143, páginas
247-253. Dentro del grupo de las SDR pueden
diferenciarse fuertemente entre sí las secuencias de aminoácidos de
los representantes individuales. Sin embargo se sabe que
determinados aminoácidos o regiones de aminoácidos se conservan en
gran medida dentro del grupo de las SDR. En las publicaciones C.
Filling, K. D. Berndt, J. Benach, S. Knapp, T. Prozorovski, E.
Nordling, R. Ladenstein, H. Jornvall y U. Oppermann, Journal of
Biological Chemistry, 2002, 277, páginas 25677-25684
se han regiones conservadas importantes de las SDR.
Ejemplos de especies de Azoarcus son Azoarcus
anaerobius, Azoarcus buckelii, Azoarcus communis, Azoarcus evansii,
Azoarcus indigens, Azoarcus toluclasticus, Azoarcus tolulyticus,
Azoarcus toluvorans, Azoarcus sp., Azoarcus sp. 22Lin, Azoarcus
sp. BH72, Azoarcus sp. CC-11, Azoarcus sp. CIB,
Azoarcus sp. CR23, Azoarcus sp. EB1, Azoarcus sp. EbN1, Azoarcus
sp. FL05, Azoarcus sp. HA, Azoarcus sp. HxN1, Azoarcus sp. mXyN1,
Azoarcus sp. PbN 1, Azoarcus sp. PH002, Azoarcus sp. T y Azoarcus
sp. ToN1.
De manera especialmente preferente, en el
procedimiento de conformidad con la invención se emplean a título
de enzimas (E), las dehidrogenasas procedentes de la bacteria
Azoarcus sp.EbN1, teniendo el enzima (E) una secuencia de
polipéptidos, que es o bien
- (i)
- la SEQ ID NO: 2, o bien
- (ii)
- en la que hasta el 25% inclusive de los restos de los aminoácidos están modificados con respecto a la SEQ ID NO: 2 por medio de una deleción, de una inserción, de una substitución o de una combinación de los mismos y que presenta todavía al menos el 50% de la actividad enzimática de la SEQ ID NO: 2.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento de conformidad con la invención
se lleva a cabo, de manera preferente, en presencia de un enzima
(E), codificándose el enzima de una secuencia de ácidos nucleicos de
conformidad con la SEQ ID NO:1 o de un equivalente funcional de la
misma.
Las secuencias de ácidos nucleicos, que pueden
ser empleadas para la codificación del enzima (E), que puede ser
empleado en el procedimiento, con actividad de dehidrogenasa, han
sido descritas detalladamente en la publicación WO 2005/108590,
página 16 hasta 22, haciéndose referencia aquí expresamente a dicha
publicación.
En una forma de realización especialmente
preferente del procedimiento, el enzima con actividad de
dehidrogenasa se elige entre aquellos enzimas que abarquen una
secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 2 o una secuencia
derivada de la misma, en la que se haya modificado hasta el 25%
inclusive, de manera preferente hasta el 20% inclusive, de manera
especialmente preferente hasta el 15% inclusive, de manera especial
hasta el 10, el 9, el 8, el 7, el 6, el 5, el 4, el 3, el 2,1%
inclusive de los restos de aminoácidos por medio de una deleción,
de una substitución, de una inserción o de una combinación formada
por una deleción, una substitución y una inserción, teniendo
todavía las secuencias de polipéptidos modificadas con respecto a la
SEQ ID NO:2, al menos el 50%, preferentemente el 65%, de manera
especialmente preferente el 80%, de manera especial más del 90% de
la actividad enzimática de la SEQ ID NO:2. En este contexto debe
entenderse por actividad enzimática de la SEQ ID NO:2 la capacidad
para reducir las cetonas de la fórmula (II), de manera especial con
R^{1} = H o Na de manera enantioselectiva para dar el alcohol (S)
con la fórmula general (I).
El procedimiento, de conformidad con la
invención, se lleva a cabo por medio del aporte de equivalentes de
reducción, de manera especial de NADH o de NADPH, que sirven como
fuente de hidruro. Puesto que el NADH o el NADPH son compuestos muy
caros, estos equivalentes de reducción son empleados de manera usual
sólo en cantidades catalíticas. Para llevar a cabo la regeneración
de los equivalentes de reducción que se consumen durante la
reacción pueden ser empleados como agentes reductores (RM) en
principio compuestos inorgánicos o compuestos orgánicos, tales
como, por ejemplo, los fosfitos o los alcoholes, o incluso los
procedimientos electroquímicos, tal como la reducción sobre un
cátodo. De manera preferente se emplea en el procedimiento, de
conformidad con la invención, como agente reductor (RM) un
compuesto orgánico, que contenga, al menos, una función alcohol
primaria o secundaria CH(OH), tal como por ejemplo el
isopropanol, el 2-butanol, el
2-pentanol, el 2-hexanol, el
3-hexanol o azúcares reductores tal como la glucosa,
de manera especial el isopropanol o la glucosa. El agente reductor
(RM) se transforma con ayuda del enzima (E) o de otro enzima
(E^{2}) para dar el producto de la oxidación (OP), eliminándose
el producto de la oxidación (OP) al menos en parte del medio de la
reacción o del equilibrio de la reacción. Cuando el agente reductor
(RM) esté constituido por un alcohol secundario, éste se designa
también con frecuencia como alcohol de sacrificio y el
correspondiente producto de la oxidación (OP), formado, se designa
como cetona de sacrificio.
En una forma preferente de realización de la
invención no solamente es empleado el alcohol de sacrificio aportado
para la regeneración de los equivalentes de reducción consumidos
sino que también es empleado a modo de
co-disolvente. Se puede trabajar en un sistema
líquido monofásico, bifásico o incluso polifásico, estando
constituida de manera usual una fase por agua y/o por un disolvente
miscible con agua.
Los equivalentes de reducción son empleados, de
manera preferente, en una cantidad comprendida entre 0,001 y 100
mmoles, de manera especialmente preferente en una cantidad
comprendida entre 0,01 y 1 mmol de equivalentes de reducción por
mol de derivado empleado de la
trimetil-ciclohex-2-en-1,4-diona
de la fórmula (II).
En el procedimiento, de conformidad con la
invención, el producto de la oxidación (OP), formado, puede ser
separado, al menos en parte, del medio de la reacción o del
equilibrio de la reacción. En el caso de los alcoholes secundarios
tal como el isopropanol como agente de la reducción (RM) puede
llevarse a cabo la eliminación de la denominada cetona de
sacrificio, formada, que es la acetona cuando el alcohol de
sacrificio sea el isopropanol, de diversas maneras, por ejemplo a
través de membranas selectivas o por medio de procedimientos de
extracción o de destilación. De manera preferente, es empleada la
destilación para la eliminación de una cetona tal como la acetona.
De manera usual, se separa de manera concomitante en el caso de la
separación por destilación de la cetona, también una parte del
alcohol de sacrificio y, en parte, también una parte de la fase
acuosa. Estas pérdidas provocadas por destilación son compensadas,
por regla general, por medio de una dosificación ulterior del
alcohol de sacrificio y, en caso dado, de agua. Las velocidades de
destilación se encuentran, de manera usual, en el intervalo
comprendido entre un 0,02%/min y un 2%/min, de manera preferente
entre un 0,05%/min y un 1%/min referido al volumen de la reacción.
Las temperaturas de la camisa del reactor se encuentran
comprendidas entre 5 y 70 Kelvin, de manera preferente se encuentran
comprendidas entre 10 y 40 Kelvin por encima de la temperatura
interna del reactor.
En el caso en que no sea volátil el producto de
la oxidación (OP), como ocurre en el caso de la oxidación de la
glucosa para dar ácido glucónico, este último se elimina del
equilibrio de la reacción entre el agente de la reducción (RM) y el
agente oxidante (OM) por medio de una ciclación para dar la
gluconolactona. Mientras que la oxidación es posible para muchos
alcoholes de sacrificio por medio del mismo enzima (E), que cataliza
también la reducción de los compuestos de la fórmula (II) para dar
los compuestos de la fórmula (I), la oxidación de la glucosa tiene
que llevarse a cabo en un segundo enzima (E^{2}) tal como por
ejemplo la glucosadehidrogenasa.
En el caso en que sean volátiles los productos
de la oxidación, se lleva a cabo la destilación de una manera
especialmente buena en un intervalo de presiones comprendido entre 1
y 500 mbares, de manera preferente comprendido entre 10 y 200
mbares.
Una forma de realización preferente del
procedimiento de conformidad con la invención consiste en que la
conversión del compuesto de la fórmula (II) para dar el compuesto
de la fórmula (I), se lleva a cabo en presencia de un
microorganismo, que se elige entre las bacterias de las familias
Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae,
Lactobacillaceae, Streptomycetaceae, Rhodococcaceae, Rhodocyclaceae
y Nocardiaceae. El microorganismo puede ser, de manera especial, un
microorganismo recombinante, que esté transformado con un constructo
de ácido nucleico, que codifica un enzima, teniendo el enzima (E)
una secuencia de polipéptidos, que es o bien
- (i)
- la SEQ ID NO: 2, o bien
- (ii)
- en la que hasta el 25% inclusive de los restos de los aminoácidos están modificados con respecto a la SEQ ID NO: 2 por medio de una deleción, de una inserción, de una substitución o de una combinación de los mismos y que presenta todavía al menos el 50% de la actividad enzimática de la SEQ ID NO: 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Los constructos de expresión, que contienen una
secuencia de ácidos nucleicos bajo el control genético de
secuencias reguladoras de ácidos nucleicos, que codifican una
proteína que puede ser empleada en el procedimiento, es decir que
codifican un enzima (E), así como los vectores correspondientes, que
abarcan al menos uno de los constructos de expresión, han sido
descritos detalladamente en la publicación WO 2005/108590, página 22
hasta 25, a cuya publicación se hace aquí referencia expresa.
Los microorganismos recombinantes, que están
transformados con un vector adecuado o con un constructo adecuado,
y que pueden ser empleados para la producción de los polipéptidos
que pueden ser empleados en el procedimiento, es decir de un enzima
(E), han sido descritos detalladamente en la publicación WO
2005/108590, página 25 hasta 27, a cuya publicación se hace aquí
referencia expresa.
Los procedimientos para la obtención
recombinante de polipéptidos o de fragmentos funcionales,
biológicamente activos de los mismos, que cumplen en el
procedimiento la función del enzima (E), cultivándose un
microorganismo productor de polipéptidos, en caso dado la inducción
de la expresión de los polipéptidos y el aislamiento de estos a
partir del cultivo, han sido descritos detalladamente en la
publicación WO 2005/108590, página 27 hasta 29, a cuya publicación
se hace aquí referencia expresa. Los polipéptidos pueden ser
producidos también de acuerdo con los métodos indicados a escala
industrial.
Los enzimas (E), que son empleados de
conformidad con la invención, teniendo el enzima (E) una secuencia
de polipéptidos, que es o bien
- (i)
- la SEQ ID NO: 2, o bien
- (ii)
- en la que hasta el 25% inclusive de los restos de los aminoácidos están modificados con respecto a la SEQ ID NO: 2 por medio de una deleción, de una inserción, de una substitución o de una combinación de los mismos y que presenta todavía al menos el 50% de la actividad enzimática de la SEQ ID NO: 2,
pueden ser empleados en el procedimiento de
conformidad con la invención como enzima (E) libre o
inmovilizado.
\vskip1.000000\baselineskip
Una forma preferente de realización del
procedimiento de conformidad con la invención abarca, al menos, las
etapas a), b) y d) de las etapas que han sido citadas a
continuación:
- a)
- se aísla a partir de una fuente natural, o se prepara de manera recombinante, un microorganismo, que produce un enzima, teniendo el enzima (E) una secuencia de polipéptidos, que es o bien
- (i)
- la SEQ ID NO: 2, o bien
- (ii)
- en la que hasta el 25% inclusive de los restos de los aminoácidos están modificados con respecto a la SEQ ID NO: 2 por medio de una deleción, de una inserción, de una substitución o de una combinación de los mismos y que presenta todavía al menos el 50% de la actividad enzimática de la SEQ ID NO: 2,
- b)
- se multiplica este microorganismo,
- c)
- en caso dado, se aísla el enzima a partir del microorganismo o se prepara una fracción proteica que contenga a este enzima, y
- d)
- se transfiere el microorganismo de conformidad con la etapa b) o el enzima de conformidad con la etapa c) a un medio que contiene un compuesto de la fórmula I.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento, de conformidad con la
invención, se lleva a cabo de manera ventajosa a una temperatura
comprendida entre 0ºC y 95ºC, de manera preferente comprendida
entre 10ºC y 85ºC, de manera especialmente preferente comprendida
entre 15ºC y 75ºC.
El valor del pH en el procedimiento de
conformidad con la invención se mantiene de manera ventajosa entre
pH 4 y 12, de manera preferente se mantiene entre pH 4,5 y 9, de
manera especialmente preferente se mantiene entre pH 5 y 8.
En el procedimiento, de conformidad con la
invención, se entiende por productos enantiómeramente puros o bien
quirales o bien por alcoholes ópticamente activos aquellos
enantiómeros que muestren un enriquecimiento en enantiómeros. En el
procedimiento de conformidad con la invención se alcanzan de manera
preferente enriquecimientos en enantiómeros de, al menos, 70% ee,
de manera preferente de al menos 80% ee, de manera especialmente
preferente de al menos 90% ee, de una manera muy especialmente
preferente de 98% ee.
Para el procedimiento, de conformidad con la
invención, pueden ser empleadas células en crecimiento, que
contengan ácidos nucleicos adecuados, constructos de ácidos
nucleicos adecuados o vectores adecuados. Así mismo pueden ser
empleadas células en reposo o células digeridas. Se entiende por
células digeridas, por ejemplo, aquellas células que se han vuelto
permeables por medio de un tratamiento con, por ejemplo,
disolventes, o aquellas células que hayan sido fracturadas por
medio de un tratamiento enzimático, por medio de un tratamiento
mecánico (por ejemplo prensa de French o ultrasonidos) o por medio
de otros métodos. Los extractos en bruto, obtenidos de este modo,
son adecuados de una manera ventajosa para el procedimiento de
conformidad con la invención. Así mismo pueden ser empleados para
el procedimiento los enzimas (E) purificados o enriquecidos. De la
misma manera, son adecuados aquellos microorganismos o enzimas
inmovilizados, que puedan encontrar aplicación ventajosamente en la
reacción.
Cuando se utilicen para el procedimiento, de
conformidad con la invención, organismos o enzimas libres, éstos
serán separados convenientemente como paso previo a la extracción,
por ejemplo por medio de una filtración o por medio de una
centrifugación.
Los compuestos de la fórmula (I), que son
preparados en el procedimiento de conformidad con la invención, por
ejemplo la
(3S)-3,4-dihidroxi-2,6,6-trimetil-ciclohex-2-enona,
pueden ser obtenidos ventajosamente a partir de la solución acuosa
de la reacción por medio de una extracción o de una precipitación.
De manera ventajosa se filtra en primer lugar la solución del
producto para llevar a cabo la separación del material biológico no
disuelto, de manera preferente por medio de la adición de un agente
auxiliar de la filtración tal como Celite.
La separación del producto (con R_{1} =
alquilo) se lleva a cabo a continuación por medio de una extracción
con un disolvente orgánico no miscible con agua. Ejemplos de
disolventes adecuados son el tolueno u otros hidrocarburos cíclicos
o de cadena abierta, los hidrocarburos clorados tal como por ejemplo
el cloruro de metileno, el acetato de etilo o el acetato de butilo,
así como los éteres tal como el MTBE o el diisopropiléter.
El aislamiento del compuesto de la fórmula I
(con R^{1} = H o metal alcalino o metal alcalinotérreo) a partir
de la solución de la reacción puede llevarse a cabo en principio tal
como se ha descrito en la publicación Helv. Chim. Acta 64, 2436,
1981. La solución del producto se ajusta en primer lugar a un pH
comprendido entre 1 y 3, de manera preferente se ajusta a pH 1. La
acidificación se lleva a cabo, de manera preferente, con ácidos
minerales tales como, por ejemplo, el ácido clorhídrico o el ácido
sulfúrico, de manera especialmente preferente con ácido sulfúrico.
En este caso precipita el producto y puede ser separado.
Sin embargo, la solución ácida del producto se
extrae preferentemente varias veces con un disolvente orgánico.
Como disolventes son adecuados en este caso los hidrocarburos
clorados, especialmente el cloruro de metileno, los éteres tal como
por ejemplo el MTBE o el diisopropiléter así como el acetato de
etilo. Esta extracción puede llevarse a cabo de manera discontinua
o de manera continua. La extracción del producto puede favorecerse
por medio de la concentración de la fase acuosa como paso previo a
la acidificación o por medio de una "separación por
salificación"; sin embargo estas operaciones no son esenciales
para llevar a cabo la separación del producto a partir de la
solución de la reacción.
En los procedimientos, que han sido citados para
la elaboración, puede ser aislado el producto de la fórmula (I) del
procedimiento de conformidad con la invención en rendimientos
comprendidos entre un 60 hasta > 95%, de manera preferente
comprendidos entre un 80 y un 95%, referido al substrato de la
fórmula (II), empleado para la reacción (tal como, por ejemplo, con
R^{2} = Na). El producto tiene una elevada pureza en enantiómeros
de > 98% ee. En caso deseado, puede purificarse por medio de una
cristalización, de conformidad con la publicación Helv. Chim. Acta
64, 2436, 1981, sin embargo se emplea preferentemente sin otra
operación de purificación en la síntesis ulterior de la
S,S-astaxantina de conformidad con la publicación
Helv. Chim. Acta 64, 2447, 1981.
El procedimiento, de conformidad con la
invención, puede llevarse a cabo por tandas, en forma de semitandas
o de manera continua.
La realización del procedimiento, de conformidad
con la invención, puede llevarse a cabo, de manera ventajosa, en
biorreactores, tales como, por ejemplo, los que se describen en la
publicación Biotechnology, tomo 3, 2ª edición, Rehm et al
Hrsg., (1993) especialmente en el capítulo II.
Otro objeto de la presente invención consiste en
un procedimiento para la obtención de la (3S,
3'S)-astaxantina de la fórmula (III) que comprende
el procedimiento que ha sido descrito precedentemente para la
obtención de los derivados ópticamente activos de la
(4S)-4-hidroxi-2,6,6-trimetil-ciclohex-2-en-1-ona
de la fórmula (I) como una etapa de la reacción del conjunto de la
síntesis de la (3S, 3'S)-astaxantina. Tanto las
etapas de la síntesis para la obtención de los compuestos de
partida de la fórmula (II) así como, también, las etapas de la
síntesis para la conversión del compuesto de la fórmula (I),
enantiómeramente puro, a través de varias etapas, para dar la (3S,
3'S)-astaxantina de la fórmula (III) son conocidas
en principio por la literatura. La transformación del compuesto
ópticamente activo de la fórmula (I), en la que R^{1} significa
hidrógeno, que se obtiene por medio de la reducción de
enantioselectiva de (II), donde R^{2} significa preferentemente
Na, en la (3S, 3'S)-astaxantina se lleva a cabo en
ausencia de racemización tal como en las diversas maneras que han
sido descritas en la literatura (WO 2006/039685; Helv. Chim. Acta,
1981, 64, 2447; ibid., 1981, 64, 2405).
Este procedimiento corresponde a la síntesis
industrial de la astaxantina (Carotenoids, Vol.2, 1996, 259; Pure
and Appl. Chem., 2002, 74, 2213) y ofrece un acceso industrial así
como económicamente ventajoso a la (3S,
3'S)-astaxantina.
La presente invención se refiere también al
empleo de un enzima (E) con una secuencia de polipéptidos, que es o
bien
- (i)
- la SEQ ID NO: 2, o bien
- (ii)
- en la que hasta el 25% inclusive de los restos de los aminoácidos están modificados con respecto a la SEQ ID NO: 2 por medio de una deleción, de una inserción, de una substitución o de una combinación de los mismos y que presenta todavía al menos el 50% de la actividad enzimática de la SEQ ID NO: 2,
para llevar a cabo la obtención de los
compuestos de la fórmula (I). Es preferente el empleo del enzima,
que ha sido descrito precedentemente, para la obtención de los
compuestos de la fórmula (I) en un procedimiento para la obtención
de (3S, 3'S)-astaxantina, transformándose el
compuesto de la fórmula (I) en otras etapas de la reacción para dar
la (3S, 3'S)-astaxantina de la fórmula (III).
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La ventaja del procedimiento de conformidad con
la invención reside en la obtención de compuestos de la fórmula (I)
con una elevada pureza en enantiómeros relacionada con buenos
rendimientos en estos compuestos.
La invención se explica por medio de los
ejemplos siguientes.
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Definiciones:
- Compuesto 1: 2-hidroxi-3,5,5-trimetil-ciclohex-2-en-1,4-diona (fórmula (II) significando R^{2} hidrógeno)
- Compuesto 1a: 3,5,5-trimetil-1,4-dioxo-ciclohex-2-en-2-olato de sodio (fórmula (II) significando R^{2} sodio)
- Compuesto 1b: 2-metoxi-3,5,5-trimetilciclohex-2-en-1,4-diona (fórmula (II) significando R^{2} metilo)
- Compuesto 2: (4S)-3,4-dihidroxi-2,6,6-trimetil-ciclohex-2-enona (fórmula (I) significando R^{1} hidrógeno)
- Compuesto 2b: (4S)-4-hidroxi-3-metoxi-2,6,6-trimetil-ciclohex-2-enona (fórmula (I) significando R^{1} metilo).
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Se cultivó E. coli LU11558, preparado
como se ha descrito en la publicación WO 2005/108590, ejemplos 1 y
2, en 20 ml de LB-Amp/Spec/Cm (100 \mug/l de
ampicilina; 100 \mug/l de espectinomicina; 20 \mug/l de
cloroanfenicol), 0,1 mM de IPTG, 0,5 g/l de ramnosa en 100 ml de
matraces de Erlenmeyer (trampas de vapor) durante 18 horas a 37ºC,
se centrifugó a 5.000*g/10 min, se lavó una vez con 10 mM TRIS*HCl,
pH 7,0 y se volvió a suspender en 2 ml del mismo tampón. Se preparó
un extracto de proteínas exento de células sometiéndose a digestión
pasta celular de E. coli LU11558 con 0,7 ml de bolas de
vidrio (d = 0,5 mm) en un molino vibratorio (3 x 5 min con
enfriamiento intermedio sobre hielo).
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Se incubaron, bajo vibración, 10 \mul del
extracto en bruto exento de células (ejemplo 1; aproximadamente 10
mg/ml de proteína total) durante 480 min en una mezcla constituida
por 770 \mul de tampón de fosfato de K 50 mM (con 1 mM de
MgCl_{2}, pH 6,5), 100 \mul de i-propanol, 100
\mul de solución de NADH (0,5 M) y 20 \mul del compuesto 1 (1 M
en DMSO). Las cargas se analizaron de manera análoga a la del
ejemplo 3. Se formaron, en media, 0,13 mM de la
3,4-dihidroxi-2,6,6-trimetil-ciclohex-2-enona.
En ensayos de control sin adición de ramnosa durante el cultivo no
pudo detectarse ningún tipo de conversión.
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Tabla pasa a página
siguiente
\newpage
La concentración del educto y del producto puede
determinarse por medio de la HPLC. Según la elección de la fase
estacionaria y de la fase móvil puede determinarse, además de la
concentración, también el valor ee.
Se establece una serie de calibración con
material auténtico, por medio de la cual puede determinarse la
concentración de pruebas desconocidas y es posible la asignación de
los enantiómeros.
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Para llevar a cabo la regeneración del cofactor
puede ser empleada glucosa-dehidrogenasa. El enzima
puede ser adquirido comercialmente (por ejemplo Jülich Fine
Chemicals Order-No. 22.10 o 19.10) o en fuentes
propias. En este último caso se trata de un clon de E. coli
XL10 Gold que contiene en el plásmido pUC19 el gen de la
glucosa-dehidrogenasa procedente de Bacillus
subtilis (número de acceso a la genoteca M12276) (este
constructo porta la denominación E. coli LU11293).
Para la fermentación de E. coli LU11293
se utilizó el medio siguiente:
Se esterilizaron, respectivamente, 150 ml de
medio en dos matraces de Erlenmeyer de 1 litro y se completó con 5
ml de solución salina estérico. Una vez realizada la inoculación de
una placa de agar LB-ampicilina se incubaron los
cultivos previos durante 12 horas a 37ºC y a 200 revoluciones por
minuto y se aportaron al medio de fermentación. La fermentación se
inició a 37ºC, con una presión interna de 0,1 bar, pH 7,0
(regulación con ácido fosfórico al 20% y con NaOH al 25%) con una
velocidad de gasificación de 7,5 l/min y a 300 revoluciones por
minuto (regulación pO_{2} entre 20 y 50% con 10-20
l/min de aire fresco y a 500-1.500 revoluciones por
minuto). Al cabo de 2 horas se aportó 0,1 mM de IPTG para llevar a
cabo la inducción y se concluyó la fermentación al cabo de 13 horas
en total. Tras la recolección y el lavado de las células (1,3 kg)
éstas se almacenaron a -20ºC hasta el momento de su
utilización
(2-20 g/l por carga).
(2-20 g/l por carga).
La regeneración del cofactor puede llevarse a
cabo también por medio de la
feniletanol-dehidrogenasa. En este caso no se
requiere el aporte de un enzima de regeneración especial. La
feniletanol-dehidrogenasa acepta diversos alcoholes
sencillos como agente de la reducción. Éstos son oxidados para dar
los correspondientes compuestos de carbonilo. Un alcohol sencillo
que es adecuado para llevar a cabo la regeneración del NADH con
feniletanol-dehidrogenasa es el
iso-propanol. Si en lugar de la glucosadehidrogenasa
y de la glucosa se emplea un 10% de iso-propanol en
la carga de la reacción, puede determinarse la actividad de la
feniletanol-dehidrogenasa como se indicado en el
ejemplo 2.
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Se cultivó E. coli LU11558 como se ha
indicado en el ejemplo 1, se recolectó y se transformó para dar un
extracto en bruto exento de células. Este extracto se combinó con
0,2 mM de NAD+ y con 5,4 ml de una solución 1,68 M de
3,5,5-trimetil-1,4-dioxo-ciclohex-2-en-2-olato
de sodio (compuesto 1a) y se incubó durante 48 horas a 30ºC.
Al cabo de 4,75 horas se aportaron 5,4 ml o bien
al cabo de 6 horas se aportaron 16,2 ml de la solución del
substrato. La reacción se mantuvo a pH 6,0-7,0 por
medio de titulación con NaOH 5 M y con HCl 1 M y se siguió por
medio de análisis realizado con HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivó E. coli LU11558 como se ha
indicado en el ejemplo 1, se recolectó y se transformó para dar un
extracto en bruto exento de células. Este extracto se combinó con
0,2 mM de NAD+ y con 5,4 ml de una solución 1,68 M de
3,5,5-trimetil-1,4-dioxo-ciclohex-2-en-2-olato
de sodio y se incubó durante 48 horas a 30ºC.
La reacción se siguió por medio de un análisis
realizado con HPLC. Al cabo de 7 horas se completó la cantidad del
educto por medio de la adición de 3,6 g de la
2-metoxi-3,5,5-trimetilciclohex-2-en-1,4-diona.
Al cabo de 75 horas se había consumido el educto en una proporción
mayor que el 60%.
La figura I representa la SEQ ID NO:1, que
corresponde a la secuencia de ácidos nucleicos de la
feniletanol-dehidrogenasa procedente de Azoarcus sp
EbN1 (genoteca ID 25956124, región: 25073 hasta 25822).
La figura II representa la SEQ ID NO:2, que es
la secuencia de aminoácidos de la
feniletanol-dehidrogenasa procedente de Azoarcus sp
EbN1 (proteína de la genoteca ID CAD58337).
Claims (9)
1. Procedimiento para la obtención de derivados
ópticamente activos de la
(4S)-4-hidroxi-2,6,6-trimetilciclohex-2-en-1-ona
de la fórmula (I)
en la
que
- R^{1}
- significa hidrógeno, alquilo con 1 hasta 10 átomos de carbono, arilalquilo con 7 hasta 14 átomos de carbono, un metal alcalino M^{1} o un fragmento de un metal alcalinotérreo M^{2}_{1/2} o (M^{2})^{+}X^{-}, donde M significa Li, Na, K, Rb o Cs y M^{2} significa Mg, Ca, Sr o Ba y X^{-} significa un anión cargado de manera sencilla,
que comprende una etapa de reacción,
en la que se incuba en un medio, que contiene un
derivado de la
trimetil-ciclohex-2-en-1,4-diona
de la fórmula (II),
en la
que
- R^{2}
- es igual o diferente de R^{1} y significa hidrógeno, alquilo con 1 hasta 10 átomos de carbono, arilalquilo con 7 hasta 14 átomos de carbono, un metal alcalino M^{1} o un fragmento de metal alcalinotérreo M^{2}_{1/2} o (M^{2})^{+}X^{-}, donde M^{1} significa Li, Na, K, Rb o Cs y M^{2} significa Mg, Ca, Sr o Ba y X^{-} significa un anión cargado de manera sencilla,
por incubación de un enzima (E), que tiene una
secuencia de polipéptidos, que es o bien
- (i)
- la SEQ ID NO: 2, o bien
- (ii)
- en la que hasta el 25% inclusive de los restos de los aminoácidos están modificados con respecto a la SEQ ID NO: 2 por medio de una deleción, de una inserción, de una substitución o de una combinación de los mismos y que presenta todavía al menos el 50% de la actividad enzimática de la SEQ ID NO: 2,
en presencia de equivalentes de reducción,
reduciéndose por vía enzimática el compuesto de la fórmula (II)
para dar el compuesto de la fórmula (I), y los equivalentes de
reducción, que son consumidos en el transcurso de la reacción son
regenerados de nuevo por medio de la conversión de un agente
reductor (RM) para dar el correspondiente producto de la oxidación
(OP) con ayuda del enzima (E) o con otro enzima (E^{2}) y, de
manera opcional, el producto de la oxidación (OP) se elimina, al
menos en parte, del medio de la reacción o del equilibrio de la
reacción, y se aísla el producto (I) formado.
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2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el enzima es codificado por una secuencia de ácidos
nucleicos según la SEQ ID NO:1 o de un equivalente funcional de la
misma.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que se emplea como agente
reductor (RM) un compuesto orgánico, que contiene al menos una
función alcohol primaria o secundaria CH(OH), especialmente
el isopropanol o la glucosa.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que se lleva a cabo la
conversión del compuesto de la fórmula (II) en presencia de un
microorganismo, que se elige entre las bacterias de las familias
Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae,
Lactobacillaceae, Streptomycetaceae, Rhodococcaceae, Rhodocyclaceae
y Nocardiaceae.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que el microorganismo es un
microorganismo recombinante, que está transformado con un
constructo de ácido nucleico, que codifica un enzima de conformidad
con la definición de la reivindicación 1.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que R^{1} en la fórmula (I)
significa hidrógeno, metilo o sodio, de manera especial significa
hidrógeno o sodio.
7. Procedimiento para la obtención de (3S,
3'S)-astaxantina que comprende un procedimiento
según una de las reivindicaciones precedentes como una etapa de
reacción de la síntesis total de la (3S,
3'S)-astaxantina.
8. Empleo de un enzima (E) con una secuencia de
polipéptidos
- i.
- SEQ ID NO: 2 o
- ii.
- en la que hasta el 25% inclusive de los restos de aminoácidos está modificado con respecto a la SEQ ID NO:2 por medio de una deleción, de una inserción, de una substitución o de una combinación de las anteriores y que presenta todavía, al menos, el 50% de la actividad enzimática de la SEQ ID NO:2,
para la obtención de un compuesto de la fórmula
(I).
9. Empleo según la reivindicación 8, en el que
el compuesto de la fórmula (I) se convierte en otras etapas de la
reacción para dar (3S, 3'S)-astaxantina de la
fórmula (III).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP06123814 | 2006-11-10 | ||
| EP06123814 | 2006-11-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2340889T3 true ES2340889T3 (es) | 2010-06-10 |
Family
ID=39321502
Family Applications (1)
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