TW200817032A - Composition of recombinant or transgenic factor VII, each molecule of factor VII exhibiting two N-glycosylation sites with defined glycan moieties - Google Patents

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200817032 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明是關於以因子VII之組成物形式獲得之重組或 基因轉殖因子VII，因子VII之每一分子具有兩個帶有已界 定聚醣部分之N-糖化作用位置，及其作爲藥劑之用途。 【先前技術】 因子VII(FVII)是一維生素K依賴性糖蛋白，以其已活 化型（FVIIa)在鈣及組織因子存在下參與凝血過程活化因子 X及因子IX。FVII以具有分子量約50 kDa之406個殘基的 單一胜肽鏈形式分泌。FVII含有四個具特色結構區域 (structural domains) : N-端 r _ 羧基區域（Gla)，兩“類上皮 細胞生長因子（EGF-like)”區域，以及絲胺酸蛋白酶區域。 活化FVII爲FVIIa的特徵是Argi52-Ilei53區域（精胺酸152-異白胺酸153)連接之切開。因此，FVIIa爲一化合物具有一 152個胺基酸之輕鏈（分子量約20 kDa)以及一 254個胺基酸 之重鏈（分子量約30.kDa)，以單一二硫橋（Cys135-Cys 2 6 2 )連 接一者至另一者。 血漿FVIIa含有數個轉譯後修飾：前10個麩胺酸是r -羧酸化，Asp63是部分羥基化，Ser52(絲胺酸52)及Ser6G (絲 胺酸60)是0-糖化並分別攜帶葡萄糖（木糖）〇-2及炭藻糖 (Fucose)型態，Asni45(天冬醯胺酸145)及Asn322(天冬醯胺 酸 322)是主要以雙觸唾液酸化複合結構（biantennary bisialylated complex structures)之 N-糖化作用。 FVII是用於治療罹患血友病的病人，其顯示缺乏因子 200817032 VIII(A型血友病）或因子IX(B型血友病），與顯示其他凝血 因子缺乏，例如先天缺乏FVII之病人。因此有需要可獲得 能注射FVIIa之濃縮物。 獲得FVIIa濃縮物之最古老方法是經由分級分餾從血 漿蛋白質純化FVIIa。 爲此目的，文獻EP 0 346 24 1敘述富含FVIIa分劃 (FVIIa-enriched fraction)之製備，獲自吸附作用後溶析血漿 蛋白質分級分餾之第二產物，該血漿蛋白質含有F VII及 FVIIa與其他蛋白質如因子IX(FIX)、X(FX)和II (FII)，特 別是預溶析物PPSB(P =凝血酶原或FII，P =血清凝血酶原 (proconvertin)或 FVII，S =司徒氏因子（Stuart factor)或 FX 以及B=抗血友病因子B或FIX)。此方法之缺點爲所得FVII 仍含有某些微量的其他凝血因子。 同樣地，文獻EP 0 547 932說明高純度之實質上無維生 素K-依賴性因子之FVIIa濃縮物以及FVIII的製造方法。以 此方法獲得之F VII，不論其純度，顯示殘留的血栓形成活性。 因此，這些方法主要之一缺點爲他們僅產生小量產物。 此外，仍難以得到一產物完全不含其他存於血漿的蛋白質。 最後，雖然在製備血漿凝血因子的每一階段已執行一些預防 措施以確保他們的病毒及細菌安全性（後續隨訪血液捐贈 者，已知病毒及細菌污染之偵測試驗，嚴厲純化及病毒去活 性處理以盡可能降低來自血液致病劑傳播的危害），僅管如 此，含有致病劑污染的全部風險並未排除。此外，庫賈氏病 (Creutzfeldt-Jakob disease)新變異種之出現引起對血液產 200817032 品非常規致病劑傳播的恐懼。再者，收集自捐贈者的血漿量 依然是有限的。

因此，自1 9 8 0年代開始單離編碼人類因子V11之DN A (Hagen er α/· (1986); Proc. Natl. Acad. Sci· USA; Apr 83(8):2412-6)並表 現於哺乳動物BHK細胞（幼倉鼠腎）（文獻EP 0 200 42 1 )。縱 使此F V 11製造方法具有控制產生所欲蛋白質用培養基之優 點，但已知倉鼠細胞賦予蛋白質表現Gal a l，3Gal部分 (Gala l,3Gal moieties)( Spiro RG et al, J. Biol. Chem, 1984, vol. 259, N。15，9858 以及 Furukawa K·以 a/·，J· Biol. Chem，1992，vol· 267，N° 12, 8012)，已證明其免疫原性。 已發現1 %之循環的人類B淋巴細胞會引起對抗抗原決 定基 Gal α 1，3Gal 之抗體（Galili 以 a/，Blood，1993, vol· 82, 2485)。 然後該抗原決定基與抗體形成一複合體，活化補體並造成嚴 重的免疫反應，例如異種移植後之急性移植排斥。已顯示1 5 至20%的血友病患者處以倉鼠細胞產生之FVII會發展出免 疫反應（Prowse C.V d a/，Blood Reviews，1998, vol· 12, 99)。此種免疫 反應在血友病患者是悲劇性的，因爲FVII及FVIII已轉爲 具有免疫原性將引起非常難以處理的出血。 因此仍有需要獲得具有降低免疫原性（盡可能的低）之 重組或基因轉殖FVlIa組成物，以及增加病毒安全性爲佳。 【發明內容】 因此本案申請人帶領硏究致力發展FVII之組成物，以 具有增加病毒安全性、展現非常低的免疫原性爲佳。 因此本發明是關於一種重組或基因轉殖因子νπ之組 200817032 成物，組成物之每一因子VII分子展現兩個N-糖化作用位 置，特徵爲組成物之FVII全部分子間Gal a l，3Gal聚醣部分 的比例介於〇及4%之間。 令人訝異的是申請人已發現當用於治療病人時，本發明 如此聚醣部分 Gal a 1，3 Gal於F VII組成物之比例不具免疫 原性。 本發明之FVII是組成物形式。的確，任何FVII不論是 細胞質的、重組或基因轉殖是以FVII之數種蛋白質混合物 取得，這些蛋白質特別差異於他們不展現相同的轉譯後修 飾。此轉譯後處理是隨FVII蛋白質轉移於不同細胞間隔 (cellular compartments)內而由胞器(cellular organites)執 行。這些生化修飾以終蛋白質相當不同於直接由該基因編碼 之分子的方式巧妙地修飾此蛋白質。這些化學修飾提供蛋白 質活性的調節以及定位。故本發明爲此，“ FVII ”以及 “FVII之組成物”之表達是同意義的。 “重組或基因轉殖FVII”是指遺傳工程產生之任何 FVII並具有轉譯後修飾特徵，特別是上述的糖化作用，亦即 兩個N-糖化作用位置具有零或極低比例Gal a 1，3 Gal於FVII 之組成物，或足夠低以致不具免疫原性。相較之下，本發明 之FVII不是血漿FVII，亦即並非純化自人類或動物血漿之 產物。 更特別爲經活化FVII是指遺傳工程產生之任何經活化 FVII，具有上述之轉譯後修飾特徵以及兩個已界定聚醣部分 之〇-糖化作用位置，T ·羧基化及專一二硫橋。 200817032

Gal α 1，3 Gal部分是由兩個α 1，3-連接之半乳糖組成的 結構。其位於N-連接之結構的寡醣觸角末端。此部分已知 具有免疫原性。的確，此聚醣部分在人類及某些猴子中是缺 乏的，因爲其誘發合成酵素（αΐ，3半乳糖基轉移酶）之編碼 基因是去活化的。因此，對人類投與展現此類部分的蛋白質 會誘發提高對抗此糖化蛋白質的抗體出現。 因此高度希望此類免疫原性部分不存在於醫藥蛋白質 中〇 較佳爲組成物特徵是全部存在的因子VII分子中缺乏 聚醣部分Gala l，3Gal。 已瞭解此處提及FVII，其中結構Gal a l，3Gal之比例是 零或極低以致不能與使用目前可得分析裝置測量之背景區 分，或特別是其比例不能藉由凝集素法點墨（lectin-blot)偵 測法在4-氯-1 -萘酚存在下染色被偵測到。此定量法敘述在 “實施例”部分。此表達以同樣態度提及任何重組或基因轉 殖FVn，其中Gal a l，3Gal比例接近血漿FVII。儘管如此， 本發明FVII之組成物中Gal a l，3Gal的比例對人類不具免疫 原性。 相反地，市售重組FVII顯現可偵測比例的Gal a l，3Gal 且因此能與使用分析裝置之背景干擾區分。 如此隨所使用之定量方法，Gal a 1，3 Gal部分可能完全 缺乏，或存在量少於4%或少於3.5%，或量少於3%，此量不 可能從背景干擾區分出。有利爲存在之Gal a 1，3 Gal部分比 例相同於或幾近相同於血漿FVII。 200817032 此外，本發明之FVII呈現優點特徵爲其全部唾液酸包 含α 2,6鍵。 本發明之FVII爲一多肽，其胜肽序列可爲天然的人類 F VII，其爲存在於人類但未顯出與F VII有關係之疾病的序 列。如此序列例如能經由敘述於文獻ΕΡ 0 200 42 1之序列 1 b所編碼。 有助益地，本發明FVII的序列爲序列SEQ ID NO : 1。 在另一具體例中，本發明之FVII能爲天然人類FVII " 之變異體，在此範圍內其免疫原性不會大於天然FVII。如 此，此變異體之胜肽序列能展現至少70%相同性，以及有助 益地至少80%或90%，以及更有助益爲至少99%相同性於天 然人類FVII的序列，如此變異體具有實質相同於天然FVII 的生物活性。

再者，本發明之FVII也關於任何FVII，相較於天然FVII 時，其生物活性經修飾或降低。經由實施例，能提及用於治 療或預防血栓形成之重組人類去活性FVII、FFR-FVIIa(Holst 、 d α/，Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg·，1998 Jun，15(6): 515-520) 〇 如此 FVII 是一具有胺基酸序列經由插入、刪除或置換一個或一個以上 胺基酸之多肽，其不同於天然FVII的序列。 最終，於另一具體例中，本發明之FVII能經活化 (FVIIa)。當後者用於並代表前者與組織因子（TF)交互作用 時，該FVIIa展現比FVII大25至100倍之凝血活性。FVII 活化發生自經由不同蛋白酶（FIXa，FXa，FVIIa)切割酶原爲 以二硫橋聯結之兩鏈。舉例而言，Fv 11 a爲凝血因子與血液 -10- 200817032 循環抗體負責血友病患者的止血。特別有助益方面爲本發明 之FVII是完全經活化。 本發明之FVIIa能包括數種轉譯後修飾：前九個或十個 N-端麩胺酸是r -羧酸化，AsP63爲部分羥基化，Ser52和Ser60 是〇·糖化及分別攜帶葡萄糖（木糖）〇·2及炭藻糖部分，ASn145 和Asn 3 2 2是主要以雙觸唾液酸化複合結構之N-糖化。 本發明FVII之生物活性的定量，能經由使用FVII-缺乏 血漿及促凝血酶原激酶（thromboplastin)來測量FVII之組成 f" \ 物引起血液凝固之能力，例如美國專利第5,997,864號所 述。此專利說明之分析法中，生物活性是以相較於對照樣品 之凝血時間降低來表達，並經由與含有1單位/ml之FVII 活性的人類血清（庫）標準相比轉換爲“ FVII單位”。 本發明之重組FVII之獲得能經由利用熟悉該項技藝者 已知的標準技術，使蛋白質表現於生物系統。 本發明之FVII能表現於賦予上述糖化作用特徵之任何 微生物、植物或動物內，亦即FVII之組成物中Gal a 1，3 Gal 的比例非常低或零。微生物是指任何細菌、真菌、病毒或細 胞系統，該細胞可能是植物或哺乳動物細胞。哺乳動物細胞 能爲動物或人類細胞。亦可使用任何爲α 1，3半乳糖基轉移 Ιδ製作之剔除細胞（knockOut cell)。 本發明之FVII亦能產生於基因轉殖動物或植物中，至 此這些動物或植物賦予FVII或FVII之組成物上述提及之糖 化作用特徵，亦即缺乏或非常低比例之Gal α 1，3 Gal於FVII 之組成物。動物能爲兔子、豬、綿羊、山羊、牛、雞、或任 -11- 200817032 何α 1，3半乳糖基轉移酶之剔除動物，但不限所列者。 本發明之FVII包含類似人類FVII，兩個Ν-糖化作用位 置在位置145及322，以及兩個0-糖化作用位置在位置52 及60。在一 Ν-糖化作用位置，寡醣鏈是連接到天冬醯胺 酸（Ν-連接）。在0-糖化作用位置，寡醣鏈是連接到絲胺酸。 連接到這些胺基酸之部分，對每一組成物之蛋白質將不同。 然而對於整個組成物，定量每一聚醣部分的量或每一糖的量 是可行的。 " 本申請案中所給不同聚醣的百分比未考慮到0-糖化作 用。 較佳爲FVII之組成物特徵爲FVII組成物之全部聚醣部 分中，至少40 %是雙觸、單一唾液酸化聚醣形式。又於一具 體例中，單一唾液酸化形式存在至少5 0%。又在一具體例 中，單一唾液酸化形式存在至少60 %。 有助益地，FVII之聚醣形式大多數爲雙觸單一唾液酸 化聚醣形式。 ί } FVII之組成物特徵爲因子VII之至少某些唾液酸包含 α 2-6連接。 有助益地，FVII之至少65 %的唾液酸包含α 2-6連接。 更有助益地，FVII之至少70%或80%，且更特別至少90% 的唾液酸包含α 2-6連接。 根據本發明之一具體例，因子VII的全部唾液酸包含 α 2 - 6連接，亦即全部唾液酸以α 2 - 6連接鍵結於半乳糖。 本發明之FVII組成物能進一步包括包含α 2-3連接之唾液 -12- 200817032 酸。 事實上FVII組成物之至少65%的唾液酸包含α2,6分 枝，是本發明FVII之一優點。就事實論之，市售重組FVII 的唾液酸只包含α 2,3連接。而血漿FVII爲這兩種異構物 之混合物。然而後者含有較多α 2,6連接，導製本發明之FVII 更接近血漿FVII。根據本發明，FVII的唾液酸中65%到100% 包含α 2,6連接。在一些具體例中，FVII的唾液酸中70%或 8 0 °/。至1 0 0 %包含α 2，6連接。 、 有助益地，FVII的雙觸、單一唾液酸化聚醣形式中大 多數爲非炭藻糖化。 較佳爲這些雙觸、單一唾液酸化、非炭藻糖化之聚醣形 式以大於20%比例存在於本發明之FVII組成物。有助益地， 此比例高於25%，或高於40%。 在一特別有益方面，本發明之FVII組成物的炭藻糖化 比例由介於20%及50%之間所組成。在本發明之一具體例 中，此比例會g少於15%。

% 此特徵爲本發明FVII的優點之一。的確，市售重組FVII 顯示100%的炭藻糖化比例，而血漿FVII具有約16%的炭藻 糖化比例。如此，本發明之FVII的炭藻糖化接近血漿FVII 的炭藻糖化，對本發明之FVII在免疫原性方面給予優點。 有助益地，本發明之FVII爲基因轉殖FVII。因此，本 發明之FVII有助異爲基因轉殖產生之重組FVII產物。 在本發明一特別具體例中，本發明之基因轉殖FVII是 在基因轉殖動物的乳汁中製造。 -13- 200817032 此等蛋白質之製造能經由移植編碼感興趣蛋白質之基 因至負責乳汁蛋白質合成的基因之一的調節區域來進行，其 將主導專一合成於乳腺，然後分泌到乳汁中。 在一特別有助益方面，本發明之FVII是由基因轉殖雌 兔產生。 此物種特別有利，因爲兔子對普利子蛋白（prions)不受 影響，特別是主要公共衛生議題之傳染性亞急性海棉狀腦病 變 〇 f 再者，兔子與人之間的物種障礙是重要的。相反地，人 與倉鼠（其爲製造市售重組FVII之生物系統）之間的物種障 礙較不重要。 因此在兔子製造FVII，就有關致病劑傳染之安全性方 面是有利的。 在本發明之一較佳具體例中，本發明之FVII是在雌兔 乳腺中製造。 對熟悉該項技藝者而言，從乳腺分泌感興趣之蛋白質並 r 使該分泌進入基因轉殖哺乳動物的乳汁是熟知的技術，包含 以組織依賴性方式控制重組蛋白質的表現。 表現之組織控制的進行係因序列主導蛋白質表現朝向 動物的特定組織。這些序列即爲啓動子序列以及胜肽訊息序 列。 在乳腺驅動感興趣之蛋白質表現的啓動子實例是WAP 啓動子（乳清酸性蛋白質），酪蛋白啓動子（例如Θ -酪蛋白啓 動子），Θ -乳球蛋白啓動子，但不限於所列者。 -14- 200817032 重組蛋白質於基因轉殖動物乳汁之製造方法能包括下 列步驟：將含有編碼人類FVII之基因的合成性DNA分子（此 基因是在天然分泌於乳汁之蛋白質的啓動子控制下）接合到 (integrated)非人類之哺乳動物的胚胎。之後將胚胎置入相同 物種之雌性哺乳動物。一旦從胚胎得到之哺乳動物充分的成 長，然後誘發此哺乳動物分泌乳汁並收集乳汁。然後該乳汁 含感興趣之基因轉殖FVII。 於雌性哺乳動物（人類除外）乳汁製備蛋白質之方法實 ^ 例敘述於文獻EP 0 527 063，其教示能作爲本發明感興趣之 蛋白質製造的參考，但不限於此實例。 含有WAP啓動子之質體是經由導入包括WAP基因啓動 子之序列來製備，此質體製備爲某種程度上能接收置於依賴 WAP啓動子控制下的外來基因。接合編碼人類FVII之基因， 並置於WAP啓動子依賴性之控制下。使用含有該啓動子之 質體及編碼感興趣蛋白質之基因，經由顯微注射到兔子雄原 核（m a 1 e p r ο n u c 1 e u s)以得到基因轉殖雌兔。之後將胚胎移到 v # 經荷爾蒙調製之雌兔的輸卵管。從萃取自所得基因轉殖幼兔 的DNA，經由南方點墨法（Southern blot)揭露轉殖基因的存 在。動物乳汁中之濃度物經由專一放射線免疫分析法評估。 經由雌兔於其乳汁所產生基因轉殖FVII是以組成物之 形式獲得，其中因子VII組成物之每一分子顯示兩個N-糖化 作用位置，其特徵爲FVII組成物之全部分子中Gal a l，3Gal 聚醣部分的比例少於4%或甚至零。如此有助益地，由雌兔 製造之基因轉殖FVII不包含Gala l，3Gal聚醣部分。 -15- 200817032 較佳爲本發明之雌兔基因轉殖F VII之組成物特徵爲組 成物之全部聚醣部分中，至少40%是雙觸、單一唾液酸化聚 醣形式。又於一具體例中，單一唾液酸化形式至少有5 0%。 又一具體例中，單一唾液酸化形式至少有60%。 有助益地，大部分聚醣形式爲雙觸、單一唾液酸化聚醣 形式。 FVII組成物之特徵爲因子VII之至少某些唾液酸包含 α 2-6連接。 有助益地，FVII之至少65 %的唾液酸包含α 2-6連接。 更有助益地，FVII之至少70%或80%以及更特別爲至少90% 的唾液酸包含α 2-6連接。 根據本發明之一具體例，因子VII之全部唾液酸包含 α 2-6連接，亦即全部唾液酸經由α 2-6連接鍵結於半乳糖。 本發明之FVII組成物能進一步包括含有α 2-3連接之唾液 酸。 較佳爲雙觸、單一唾液酸化聚醣形式中大部分的聚醣形 ν ^ 式是非炭藻糖化。有助益地，這些雙觸、單一唾液酸化非炭 藻糖化聚醣形式以高於20 %的比例存在於此FVII組成物。 有助益地，此比例高於25 %或高於40%。 較佳爲本發明之此FVII組成物的炭藻糖化比例是介於 2 0 %及5 0 %之間。 在本發明之一具體例中，此比例能少於1 5 %。 本發明之基因轉殖FVIIa能包括數種轉譯後修飾：前九 個或十個N-端麩胺酸是 r -羧酸化，Asp63(天冬醯胺酸63) 200817032 是部分羥基化，Ser52(絲胺酸52)和Ser6G(絲胺酸60)是0-糖 化且分別攜帶葡萄糖（木糖）〇-2和炭藻糖部分，Asri145及 A sn3 2 2爲大部分以雙觸單一唾液酸化複合結構之N-糖化。 本發明之FVII能以熟悉該項技藝者已知的技術從乳汁 純化。舉例而言，從乳汁純化感興趣蛋白質之方法，例如敘 述於美國專利第6,2 6 8,4 87號，能包括下列所組成之步驟： a)將乳汁置於具有足以形成濃縮液（retentate)及濾液 (permeate)之多孔膜上進行正切過濾（tangential filtration)，該濾液（permeate)含有外源性蛋白質；b)將濾液 (permeate)置於捕獲裝置，經由色層分析以置換外源性蛋白 質並獲得流出物；c)合倂流出物及濃縮液（retentate) ; d)重 複步驟a)至〇直到FVII從脂質、酪蛋白微胞（casein micelles) 分開且回收至少75%的FVII。 有助益地，本發明之FVII是經活化的。FVIIa產生自 活體內以不同蛋白酶（FIXa，FXa，FVIIa)切割該酶原爲經由 二硫橋連接之兩鏈。FVIIa本身具有非常低的酵素活性，但 ;·Ι 」 與其輔因子：組織因子（TF)複合則能經由活化FX及FIX而 引發凝血過程。 因此本發明之FVIIa是一化合物，經由單一二硫橋 (Cys135-Cys 2 6 2 )連接一具有分子量約20 kDa之152個胺基酸 之輕鏈以及一具有分子量約30 kDa之254個胺基酸之重鏈 所組成。 因此’本發明之FVII是一具有活性及結構接近血漿 F V11之經活化F V 11。 •17- 200817032 隨FVIIa、FVII與組織因子（TF)之交互作用，FVIIa展 現比FVII高25至100倍的凝血活性。 在本發明一具體例中，FVII能在活體外經由因子Xa， Vila，Ila，IXa 及 Xlla 活化。 本發明之FVII亦能於其純化過程中活化。 令人訝異地，本案申請人已察覺縱使將FVII置於天然 產於抗乳血清之蛋白質的啓動子（例如WAP啓動子）控制 下，FVII仍易於結合乳汁的鈣離子，故此與酪蛋白微粒結合。 f 因此，硏發FVII的萃取及純化方法，展現具乳汁鈣離 子親和力之FVII，將非常有助易於捕獲此蛋白質不論是結合 於抗乳血清複合體中或包含於酪蛋白微粒中。 舉例而言，含於基因轉殖動物乳汁之基因轉殖FVII的 萃取及純化方法，包括由下列所組成之步驟： a)從乳汁萃取FVII(此因子VII已結合於有機及/或無機 鹽及/或該乳汁鈣之複合體），其係沉澱經由添加乳汁可溶性 鹽所得之鈣化合物，其中乳汁可溶性鹽的陰離子是選擇能形 ‘； 成該不溶性鈣化合物者，以於此法中使因子VII從該鹽及/ 或複合體釋放，然後該因子VII出現於液相； b )從鈣化合物之沉澱物分離出富含蛋白質之液相，該液 相進一步分離爲脂肪相及水性含有蛋白質之非脂肪相； c) 使用預定濃度磷酸鹽爲主要成分之溶析緩衝液，將水 性非脂肪相進行親和力色層分析步驟；以及 d) 使用適用於連續溶析留於該管柱之因子VII之緩衝 液’將根據步驟c)所得因子V11之溶析液，於弱驗型陰離子 -18- 200817032 交換管柱進行二或三次色層分析步驟。 令人認異的是申請人已發現如此製法利用FVII結合該 乳汁鈣之有機及/或無機鹽及/或複合體之萃取步驟’其係沉 澱經由添加可溶性鹽至乳汁所得不溶性鈣化合物’可溶性鹽 之陰離子是選擇能形成鈣化合物沉澱者，而FVII則從該乳 汁鈣之此等有機及/或無機鹽及/或複合體及/或有機及/或無 機複合體釋出並再次出現於液相溶液中。 、 FVII結合到該乳汁鈣之有機及/或無機鹽及/或複合 V' 體，此表示FVII對這些鈣的鹽類及/或複合體展現親和力。 因此，FVII展現足夠數量的固定位置給這些將要全部或部分 結合的鹽類及/或複合體。 根據本發明之製法，基因轉殖FVII代表以各種糖化作 用特徵且有助益地爲如前述之本發明FVII爲佳之基因轉殖 FVII 〇 乳汁鈣之有機及/或無機鹽及/或複合體代表與膠體酪 蛋白微粒交互作用之磷質鈣鹽（phosphocalcic salts)。不同的 f \ K J 酪蛋白與存在之磷質鈣鹽形成一膠體微粒複合體，能達到直 徑約 〇·5 μιη，例如磷酸三鈣凝集形式（“簇”），亦即 Ca9(P04)6。此等微粒是形成自酪蛋白次單元，其係由圍繞厭 水核之富含酪蛋白-/C的親水層所構成，磷質鈣鹽是經由親 水層上的靜電作用結合。這些磷質鈣鹽也能未結合酪蛋白而 存在於微粒的內部。這些鹽及/或複合體也以磷酸一鈣及/或 磷酸二鈣形式存在於乳汁中，其視實施之化學及生化反應而 與其他離子形式的鈣達成平衡。這些鈣鹽及/或複合體能存 -19- 200817032 在於酪蛋白微粒内部。 FVII對鈣之有機及/或無機鹽及/或複合體的此等親和 力能產生自未修飾或活體內或活體外經修飾蛋白質（例如經 由轉譯後修飾）之交互作用。 不溶性鈣化合物是指溶解度少於〇 . 5 %於乳汁之鈣鹽或 複合體。 大部分FVII是與酪蛋白微粒的磷質鈣鹽結合。該FVII 展現強親和力於鈣，以及高親和常數，亦即至少70 %至90% ί 的FVII陷入酪蛋白微粒。剩下的FVII展現親和力於上述其 他形式之鈣的有機及/或無機鹽及/或複合體。 不受限於所知機制之任何解釋，本案申請人假定添加可 溶性鹽來取代微粒之磷質鈣鹽平衡，因而造成他們的解構作 用及酪蛋白次單元凝集的沉澱。陷入及/或落在微粒上已結 合磷質鈣鹽之FVII，則隨此解構作用釋出到介質中。此外， 在此時，FVII也從磷質鈣鹽釋出或解離，因爲在本發明製法 所用可溶性鹽的作用下他們以不溶性鈣化合物的形式沉 ' 澱。同樣地，結合鈣之可溶性有機及/或無機鹽及/或複合體 之FVII亦將以相同反應型態解離（參閱第9圖）。 在本發明之範圍中，可溶性鹽爲能得到所欲效果之任何 鹽。 本發明製法使用之可溶性鹽，能以熟悉該項技藝者選擇 之濃度存在於乳汁，以成功從鈣的鹽及/或複合體分離 F V 11。事實上，此濃度足以使至少2 0 %、或有利地至少3 0 % 至50%的FVII分離。特優方式爲濃度足以使至少60%至 -20- 200817032 80%、或至少90%的FVII分離。 本發明之製法特別使酪蛋白次單元之凝集沉澱。此沉澱 是由於上述之酪蛋白微粒解構。應用本發明製法能經由沉澱 使乳汁的膠體狀態不穩定。 因此，本發明之製法是使乳汁從膠體狀態移到液體狀態 «之製法，對應於膠體/液體之直接萃取。 本發明製法也能得到比開始乳汁著色較淡的抗乳血 清。事實上，這是酪蛋白賦予他們的白色於乳汁。一旦沉澱， 他們不再賦予他們的顏色於乳汁。 根據本發明之可溶性鹽是指一鹽具有乳汁溶解度爲每 份乳汁（w/ w)含有至少0 · 5份的鹽。 有助益地，本製法使用之可溶性鹽是磷酸鹽。該鹽能爲 水溶液，隨後被添加於乳汁，或能直接添加到乳汁的粉末形 式。 較佳爲磷酸鹽是選自由磷酸鈉，磷酸鋰，磷酸鉀，磷酸 铷及磷酸絶所組成之群組，且特別是磷酸鈉。 X 另外，本製法使用之可溶性鹽能爲鹼金屬草酸鹽，特別 是草酸鈉或鉀，或鹼金屬碳酸鹽，特別是碳酸鈉或鉀，或其 混合物。 有助益地，製備以進行該製法之可溶性鹽於水溶液的濃 度爲介於100 Π1Μ及3 Μ之間，更佳爲介於200 mM及500 mM之間，特別是介於200 mM及3 00 mM之間。 含有將萃取之FVII的乳汁能爲生全脂乳汁或脫脂乳 汁。應用本發明製法於脫脂乳汁之優點在於其脂肪含量較低 -21 - 200817032 之事實。該製法亦能應用於新鮮或冷凍乳汁。 該製法包括在脂肪相及含有蛋白質之水性非脂肪相中 分離液相之步驟b)，其經由離心進行爲佳。非脂肪性水相實 際爲抗乳血清。此分離步驟也提供酪蛋白微粒次單元之凝集 物和鈣化合物沉澱物的單離。 該製法於分離步驟後能進一步包括非脂肪性水相的過 濾步驟，其係以減少多孔性之濾器連續地進行，較佳爲i μιη，然後0·4 5 μηι。使用這些濾器，例如使用玻璃纖維系， 能降低天然存於乳汁之脂質、脂肪小球及磷脂質含量。濾器 多孔性小於0 · 5 μιη能保持非脂肪性水相及稍後實施之純化 撐體的細菌學上的品質（超過濾器、色層分析管柱等等）（參閱 後文）。脂肪相較佳透過這些濾器過濾，濾器仍完整保留乳 汁的脂肪小球，且濾液是透明的。 此步驟後能接著經由超過濾之濃縮/透析步驟。 濃縮作用能減少非脂肪性水相的體積以保存它。超過濾 膜是由熟悉該項技藝者依據感興趣蛋白質之特徵來選擇。通 ^ 常以孔尺寸小於或等於FVII分子量之多孔性限制能濃縮產 物卻沒有顯著的流失。例如具有孔大小爲5 0 k D a的膜能濃 縮但未流失分子量爲50 kDa的FVII。 透析是爲於含有FVII之非脂肪性水相的作用條件下， 爲後續純化步驟（亦即經由色層分析）作準備。透析也能移除 小分子尺寸的成分，例如乳糖，鹽類，胜肽，小胜肽 (p r 〇 t e 〇 s e s)-腺及任何易損害產物保存的試劑。爲此目的，優 先使用具有50 kDa保留限制之膜，以致FVII未透過膜過濾。 -22- 200817032 較佳爲透析緩衝液是0.025 Μ-0.0 5 0 Μ之磷酸鈉溶液， pH 7.5-8.5。 步驟b)後所得，或若有例如過濾及/或濃縮/透析步驟情 形發生後所得之非脂肪性水相，在進行後續純化步驟之前能 經冷凍及保存在-3 0 °C的溫度。 之後，將根據步驟b)得到之非脂肪性水相置於含有羥 基憐灰石凝膠（hydroxyapatite gel)(CaiG(P〇4)6(〇H)2)或氟磷 灰石（Ca1()(P〇4)6F2)凝膠撐體之色層分析管柱，使用慣用含 " UV偵測器之色層分析裝置有利地進行步驟C)之親和力色層 分析。如此則水相的FVII會保留在撐體上，而排除大部分 未被留住的乳汁蛋白質。 較佳使用經水性緩衝液（主要成分0.025 M-0.03 5 Μ磷 酸鈉，pH 7.5-8.5)平衡之色層分析管柱。注射富含FVII之 水相於管柱，其能保留FVII。未保留之分劃經由緩衝液A 的滲出作用移除直到返回基線（RBL)以確保不想要的化合物 (例如乳汁蛋白質）真正的移除。在280 nm波長（λ )進行吸光 率的測量。 根據步驟c)的FVII之溶析是以磷酸鹽爲主的緩衝液來 進行，例如以預定濃度之磷酸鈉或磷酸鉀或其混合物，較佳 以緩衝液（主要成分0.25 M-0.35 Μ磷酸鈉，pH 7.5-8.5)爲代 表。收集溶析之分劃直至RBL。在280 nm波長（λ )進行吸 光率的測量。 由於此步驟，移除超過90%的全部乳汁蛋白質以及回收 超過90%的FVII。此階段中FVII溶析分劃的純度爲約5%。 -23 - 200817032 純度之定義爲存在於所考慮樣品（分劃或溶析液）之 FVII和總蛋白質間的重量比例。 有助益地，由於FVII對色層分析撐體之親和力使fVII 的專一活性增加1 0至2 5倍。 之後將步驟c)產生之FVII溶析液有利地進行正切過濾 (tangential filtration) ° 正切過濾（tangential filtr at ion)膜是由熟悉該項技藝者 依據F V11的特徵來選擇。一般而言，孔的大小比F V11分子 、、 量大兩倍之多孔性限制容許其過濾。因此，具有孔大小爲1 0 0 kDa的膜容許FVII過濾具有極佳產量。 此過爐步驟之目的是爲減少，尤其是分子量高於FVII 之蛋白質的載量，特別是移除非典型形式之FVII(例如FVII 於聚合形式）以及在某種耽擱時間內易於降解它之蛋白酶。 對此目的，使用具有1 〇〇 kDa化合物之多孔性限制之膜是有 利的。 有助益地，所得FVII之經過濾溶析液進一步經由超過 ^ 濾透過具有50 kDa保留限制之膜濃縮及透析。透析緩衝液 較佳爲0.15 M-0.20 Μ氯化鈉溶液。 在步驟c)結束所得FVII之溶析液，可經過濾、濃縮及 透析，然後進入兩次或三次色層分析步驟（步驟d))，在弱鹼 型陰離子交換管柱使用適當緩衝液對保留在該管柱之因子 VII的後續溶析。這些步驟提供額外的FVII純化。 視下列優先操作條件，有利地使用Q-Sepharose® FF凝 膠型色層分析撐體（其能保留因子VII)來進行第一次陰離子 -24- 200817032 交換色層分析步驟。以〇·〇5 M Tris，pH 7.0-7.5之緩衝液清 洗此撐體。以清洗緩衝液移除未保留之分劃直到返回基線。 以 0.05 M Tris 及 0.020 M-0.05 Μ 氯化鈣（較佳爲 0·05 M)， pH 7.0-8 ·0爲主之水性緩衝液進行FVII溶析，以得到因子 VII的第一溶析液。在280 nm波長（λ )進行吸光率的測量。 此步驟中FVII的回收爲至少70%且此使能移除約80% 的結合蛋白質，特別是乳汁蛋白質。 之後能將FVII之溶析液進行如前所述之透析步驟，使 ' 用0.15-0.20 Μ氯化鈉溶液作爲緩衝液。 視下列優先操作條件，在Q-Sepharose® FF凝膠型色層 分析撐體上有利地進行第二次色層分析步驟，其係在撐體上 注射第一次色層分析步驟在陰離子交換所得之因子VII的第 一溶析液。以〇·〇5 Μ，pH 7.0-7· 5 Tris緩衝液清洗撐體。以 清洗緩衝液疑除未保留之分劃直到返回基線。 以 0.05 M Tris 及 0.005 Μ 氯化鈣，pH 7.0-8.0 爲主之 水性緩衝液進行保留於撐體上之FVII的溶析，以得到高純 I, # ‘ 度因子VII的第二溶析液，其純度高於90%。在2 80 nm波 長（λ )進行吸光率的測量。 第二次色層分析步驟意於限制可能的蛋白質之蛋白分 解性降解。 在此階段，溶析液之純度爲約90%，以及消除超過95% 的剩餘結合蛋白質。之後，將溶析液進行如前所述之透析步 驟，使用0.1 5-0.20 Μ氯化鈉溶液作爲緩衝液。 根據本發明之極佳實施，製法包括三次在弱鹼型陰離子 -25 - 200817032 交換管柱之色層分析步驟，使用適當緩衝液從該管柱後續溶 析因子VII。因此在上述兩次陰離子交換色層分析後，進行 第三次陰離子交換色層分析步驟。此步驟使能調製富含蛋白 質之組成物爲醫藥使用可接受之程度。 視下列優先操作條件，在Q-Sepharose® FF凝膠型色層 分析撐體有利地進行第三次色層分析步驟，其係在撐體上注 射第二次色層分析步驟在陰離子交換所得之FVII之第二溶 析液。 第二次陰離子交換色層分析步驟得到之第二溶析液，較 佳於經1至5體積量注射用純水（WFI)稀釋後注射到裝入 Q-Sepharose® FF型撐體之管柱，該撐體能保留因子VII。 以緩衝液〇.〇5 M Tris，pH 7.0-7.5清洗此撐體。以清洗緩衝 液消除未保留之分劃直至RLB。在2 80 nm波長（λ )進行吸 光率的測量。 以 0·02 M Tris 及 0·20-0·30 Μ 氯化鈉（較佳爲 0·28 Μ)， pH 6.5-7.5爲主要成分之水性緩衝液，進行保留在撐體上之 FVII溶析。在2 80 nm波長（λ )進行吸光率的測量。 如此所得基因轉殖FVII組成物之純度大於95%。非常 有助益地，組成物以FVII之濃縮物形式出現。 本製法之實施導致20至25 %的累積產量，使至少20 mg 的FVII/經處理乳汁（L)純化。 結果三次在陰離子交換凝膠之色層分析步驟提供FVII 的進一步純化。再者，他們使能濃縮及調製爲FVII之組成 物。 -26 - 200817032 FVII的活化發生在製造期間，大部分可能性是在陰離 子交換色層分析之第一步驟期間。 一旦回收溶析液（第三色層分析之陰離子交換溶析 液），該溶析液可在0.22 // m濾器進行過濾步驟，分配於容 器內之步驟，然後冷凍至-3 0°C並保存在此溫度。 本發明之製法也能包括至少一種下列調製步驟，病毒去 活性及安定化作用。大體而言，該製法在親和力色層分析步 驟前能包括抗病毒處理步驟，其能經由溶劑/洗潔劑有利地 ‘ 進行，特別在 Tween® 80(1% w/v)和ΤηΒΡ(三正丁基憐酸） (0.3% ν/ν)混合物存在下導致被膜病毒的去活性。再者，在 陰離子交換得自第二次色層分析步驟之FVII溶析液，較佳 進行奈米過濾步驟以有效消除病毒，特別是無被膜病毒，例 如微小病毒 B19(parvovirus B19)。使用 ASAHI PLANOVA™ 15漉器留住尺寸大於15 nm之病毒是可行的。 本發明之另一目的是使用本發明之FVII組成物作爲藥 劑。 f 本發明之另一目的是根據本發明之FVII組成物於製備 治療罹患血友病病患用藥劑之用途。 本發明之另一目的是根據本發明之FVII組成物於製備 治療多發性出血性創傷（multiple hemorrhagic trauma)用藥 劑之用途。 本發明之另一目的是根據本發明之FVII組成物於製備 治療因手術止血之大量控制不住出血用藥劑之用途。 本發明之另一目的是根據本發明之FVII組成物於製備 •27- 200817032 治療因服用過量抗凝血劑所致之流血或出血用藥劑之用途。 本發明之另一目的是一種醫藥組成物，含有根據本發明 之因子FVII以及醫藥可接受賦形劑及/或載劑。 賦形劑能爲任何溶液，例如生理食鹽水，生理性、等滲 壓性或經緩衝溶液，以及任何懸浮液，凝膠或粉末，同樣地 相容於醫藥用途且爲熟悉該項技藝者已知。根據本發明之組 成物能含有一種或一種以上選自分散劑、助溶劑、安定劑、 界面活性劑以及保存劑之試劑或載劑。另一方面，根據本發 ^ 明之組成物能含有另外試劑或活性構造。 再者’組成物能以不同方式及不同形式投與。投與能以 用於此型治療方法之任何典型路徑提供，尤其例如經由全身 性路徑，特別是經由靜脈內、皮內、腫瘤內、皮下、腹膜內、 肌肉內或動脈內注射。舉例而言，能提及爲腫瘤內注射或注 射於接近腫瘤的地區或沖洗腫瘤。 劑量能隨投與次數，結合其他活性構造，病變進展程度 等等變化。 & 本發明之其他方面及優點將以下列實施例說明，此等是 爲舉例說明之用且不因此限制本發明範圍。 用於實施例之縮寫 FVII-tg = FVIIa-tg:根據本發明之經活化基因轉殖 FVII FVII-;rec = FVIIa-rec:市售之重組經活化FVII FVII-pd = FVIIa-pd :血漿由來之經活化FVII，亦即純化 自人類血漿 MALDI-TOF ：基質輔助雷射脫附游離法-飛行時間 -28- 200817032 (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation - Time of Flight) HPCE-LIF :高效毛細管電泳-雷射誘發螢光 ESI-MS :質譜儀-電噴霧離子化法 LC-ESIMS :液相色層分析-質譜儀-電噴霧離子化法 NP-HPLC : IE丰目胃交女Ί年目€ Μ #丰斤 PNGase F :胜肽：Ν-糖苷酶 F(N-glycosidase F) LC-MS :液相色層分析-質譜儀 【實施方式】 實施例 實施例1 :產生人類FVII蛋白質於其乳汁之基因轉殖雌兔 之製造 首先，經由導入WAP基因之序列Bam Hl-Hind 111(6.3 Kb 片段）（敘述於文獻 Devinoy 以 α/，Nucleic Acids Research，vol· 16, no· 16, 25 August 1988, ρ· 8180)於 p-poly III-I 載體之多連接子（敘 述於文獻 Lathe 以 (1987) 57，193-201)的序歹[J Bam H1 及

Hind III之間以製備質體pi。 在此選殖過程中，Bam H1位置被封鎖並以存在於載體 pi之Cla I位置取代之。因此載體pi是一質體能接收外來 基因置於依賴6.3 Kb WAP啓動子之下。外來基因的導入， 例如能進入多連接子的Sal I位置。在切開位於p-poly III-1 質體之多連接子末端的兩個Not 1位置之後，能從質體單離 出含有全部啓動子及外來基因之插入物。 得自質體pi之質體p2含有兔子WAP基因的啓動子（6.3 -29 - 200817032

Kb)及人類FVII基因。用於得到該基因轉殖雌兔之片段是含 於兩個N 〇 t 1位置之間。 經由特定位突變將Hind III位置導入基因的前導序列 以用於作爲選殖位置。 經由標準顯微注射技術得到基因轉殖雌兔（Brinster α/， Proc. Natl. Acad· Sci· USA (1985) 82, 4438-4442)。將含有 500 個此基 因副本之 1-2 pi注射到老鼠胚胎的雄原核（male pronucleus)。此構築是在p-poly III-I載體中進行（Lathe W a/，Gene (1987) 57, 193-201)。顯微注射含有重組基因之該載體的 Not 1 - Not 1片段。之後，將胚胎轉移到採用荷爾蒙調製之 雌兔輸卵管。經操作之胚胎約1 0 %生出幼兔以及經操作之胚 胎有2-5 %生出基因轉殖幼兔。從兔子尾巴萃取DNA，經由 南方（Southern)轉移技術揭露轉殖基因的存在。經由專一放 射免疫分析法評價動物血液及乳汁中的FVII濃度。 經由添加乳汁到細胞或兔子哺乳動物外植物培養基來 評價FVII的生物活性。 用於得到產生本發明之FVII於其乳汁之基因轉殖雌兔 之技術，更詳細說明於文獻EP 0 527 063。 實施例2 :所得FVII之萃取及純化 a) FVn之萃取 · 取5 0 0 ml生全脂乳汁並以9體積的0.25 Μ磷酸鈉緩衝 液，pH 8.2稀釋。在室溫攪拌30分鐘後，在15°C以l〇〇〇〇g 離心富含 FVII之水相 1小時（離心機 Sorvall Evolution RC - 6700 rpm - rotor SLC-6000)。6 瓶約 835 ml 是必需 -30- 200817032 的。 離心後呈現三相：一脂肪相於表面上（乳脂），一非脂質 水性透明富含FVII之相（多數相）以及一固體白相小九（不溶 性酪蛋白及鈣化合物之沉澱）。 使用蠕動式幫浦（persistaltic pump)於靠近乳脂相收集 含有FVII之非脂肪性水相。分開回收乳脂相。移除固相（沉 澱）。 然而仍含有非常少量脂質之非脂質水相於一連串濾器 過濾（Pall SLK7002U010ZP-具有孔大小爲1 μχη之玻璃纖維 預濾器·然後Pall SLK7002NXP-具有孔大小爲0.45 μιη之 Nylon 6 6)。過濾終了時，脂肪相通過此過濾順序，其能完全 保留住乳汁的脂肪小球，且濾液是透明的。 然後在超過濾膜（Millipore Biomax 50 kDa- 0.1 m2)透 析已過濾之非脂肪性水相以使其適用於色層分析相。具有分 子量約50 kDa之FVII不會濾過此膜，不同於乳汁的鹽類、 糖類及胜肽。第一次濃縮溶液（約5,000 ml)至500 m卜然後 經由超過濾透析維持固定體積，使能移除電解質及使此生物 材料適應色層分析步驟。透析緩衝液爲0.025M磷酸鈉緩衝 液，pH 8.2。 含有FVII之非脂肪性水相能將之比作爲富含FVII-tg-之抗乳血清。在繼續處理之前，將此製備物保存在-30 °C。 此步驟回收FVII之總產量另人非常滿意：90% (91 %以 磷酸萃取+ 99%透析/透析）。 在此步驟結束時，含有FVII之非脂肪性水相較佳爲透 200817032 明的且適用於後續的色層分析步驟。 在此階段萃取約93 000 IU的FVII-tg。此製備物的FVII 純度爲0.2 %等級。 b) FVII之純化 1 .羥基磷灰石凝膠之色層分析 以 BioRad陶性羥基磷灰石第I型（CHT-I)凝膠裝入 Amicon 90 (9 cm 直徑-64 cm2 截面）管柱。 以含有0.025 Μ磷酸鈉及0.04 Μ氯化鈉、pH 8.0混合 / 物之水性緩衝液A平衡凝膠。貯存在-30°C的整個製備物在 3 7 °C水浴中解凍，直到冰團完全融化，然後注射於凝膠（線 形流速1〇〇 cm/小時，亦即105 ml/分鐘）。經由通過含有0.025 Μ磷酸鈉及0.04 Μ氯化鈉、pH 8.2之緩衝液移除未保留之 分劃，直到返回基線（RBL)。在280 nm波長（λ )進行吸光率 的測量。 以含有0.25 Μ磷酸鈉及0.4 Μ氯化鈉、pH 8.0之緩衝 液B進行含有FVII-tg之分劃的溶析。收集溶析之分劃直到 返回基線。在2 80 nm波長（λ )進行吸光率的測量。 此色層分析能回收超過90%的FVII-tg，並消除超過95% 的乳汁蛋白質。將專一活性（S.A·)乘以25。在此階段可得到 約8 5,000 IU具有純度4%的FVII-tg。 2.100 kDaTR 切渦濾（tangential filtration)及 50 kDa 濃 縮/透析 先前步驟的整個溶析液經由正切模式在100 kDa超過 濾膜（Pall OMEGA SC 100K - 0.1 m2)上過濾。通過 100 kDa -32- 200817032 膜來過濾FVII，而分子量高於100 kDa的蛋白質無法濾過。 之後濃縮已過濾之分劃至約5 00 ml，然後在如前已述 之5 0 kDa超濾器透析。透析緩衝液是0.15 Μ氯化鈉。 在此製法階段，產物要通過離子交換色層分析之前保存 在-3 0 °C。 此階段能降低分子量高於1〇〇 kDa之蛋白質的載量，特 別是酵素原。以1〇〇 kDa膜之處理能保留約50%的蛋白質’ 其爲高分子量蛋白質，而過濾95%的FVII-tg，亦即82,000 IU 的 FVII-tg。 此處理能降低下游步驟期間蛋白質水解的風險。 3. 〇-Sepharose® FF凝膠之色層分析 在離子交換凝膠Q-Sepharose® Fast Flow (QSFF)進行 的這3次連續色層分析是爲了純化活性構造，使FVII活化 爲活化FVII(FVIIa)且最終濃縮及調製FVII之組成物。 3. 1 O-Sepharose㊣FF 1步驟-溶析“高鈣” 以 100 ml 的 Q-Sepharose® FF 凝膠（GE Healthcare)塡入 :) 2.6 cm直徑（5.3 cm2截面）管柱。 以0.05 M Tris緩衝液、pH 7.5平衡凝膠。 貯存在-30 °C的整個分劃在37°C水浴中解凍，直到冰團 完全融化。注射到凝膠（流速13 ml/分鐘，亦即線形流速150 cm/小時）之前，以平衡緩衝液稀釋分劃爲Wtv/v]，然後經由 通過緩衝液移除未保留之分劃直到RBL。在280 nm波長（λ ) 進行吸光率的測量。 使用〇 · 〇 5 M Tr i s及0 · 1 5 Μ氯化鈉緩衝液、ρ Η 7 · 5，以 -33 - 200817032 9 ml/分鐘（亦即loo cm/小時）溶析具有低含量FVII之第一蛋 白質分劃，然後移除。 使用〇·〇5 M Tris和〇.〇5 Μ氯化鈉及0.05 Μ氯化鈣緩 衝液、pH 7.5，以9 ml/分鐘（亦即100 cm/小時）溶析第二富 含FVII之蛋白質分劃。在280 nm波長（λ )進行吸光率的測 量。 此第二分劃在如前已述之50 kDa超濾器透析。透析緩 衝液是0.15 Μ氯化鈉。第二次通過陰離子交換色層分析之 前一晚將此分劃保存在+4°C。 此階段會g回收73%的FVII(亦即60000 IU的FVII-tg) ’ 並消除80%的結合蛋白質。其亦使FVII活化爲FVIIa。 3.2 O-Sepharose® FF 2 步驟-滚析“低鈣” 以 30 ml 的 Q-Sepharose® FF(GE Healthcare)凝膠塡入 2.5 cm直徑（4.9 cm2截面）管柱。 以0.05 M Tris緩衝液、pH 7.5平衡凝膠。 保存在+4 °C之先前已溶析分劃（第二分劃）於注射到凝 膠（流速9 ml/分鐘，亦即線形流速100 cm/小時）之前經稀釋。 注射第二分劃後，以平衡緩衝液清洗凝膠以移除未保留 分劃直到RLB。在28 0 nm波長（λ )進行吸光率的測量。 含有非常高純度FVII之分劃以4.5 ml/分鐘（亦即50 cm/小時）溶析於〇·〇5 M Tris，0.05 Μ氯化鈉及0.005 Μ氯化 鈣緩衝液，pH 7.5。在28 0 nm波長（又）進行吸光率的測量。 純化約 23,000 IU 的 FVII-tg，亦即 12 mg 的 FVII-tg。 此步驟能消除超過95%的結合蛋白質（兔子乳汁蛋白 -34- 200817032 質）。 此溶析液具有純度高於90%，展現接近天然人類fvii 分子之結構及功能特徵。其於第三次通過離子交換色層分析 時濃縮及調製。 3.3 O-Sepharose® FF 3 步驟-“鈉”溶析 以 10 ml ofQ-Sepharose® FF 凝膠（GE Healthcare)塡入 2.5 cm直徑（4.9 cm2截面）管柱。 以0.0 5 M Tris緩衝液、pH 7.5平衡凝膠。 ' 溶析液，即先前步驟已純化之分劃注射到凝膠（流速4,5 ml/分鐘，亦即線形流速50 cm/小時）之前以注射用純水（PWI) 稀釋五次。 注射該分劃後，以平衡緩衝液清洗凝膠以移除未保留分 劃直到RLB。在280 nm波長（λ )進行吸光率的測量。 之後以流速3 ml/分鐘（亦即36 cm/小時）使用〇·〇2 Μ Tris及0.28 Μ氯化鈉緩衝液、pH 7.0溶析FVII-tg。在280 nm 波長（λ )進行吸光率的測量。 ^ " 所製備濃縮物形式之FVII-tg組成物的純度高於95%。 該產物適用於靜脈內注射。此製法造成22%的累積產量’能 純化至少20 mg的FVII/所用每公升乳汁。 再者，將FVII-tg之組成物進行不同的結構分析，例如 下列實施例所進展者。 實施例3 : —級序列之硏究 1 .胜肽圖譜

FVII-pd、FVII-rec 及 FVII-tg 樣品經胰蛋白酶及 Asp-N -35- 200817032 分解後（數據未示）得到LC-MS及UV偵測層析圖。 胰蛋白酶分解後所得之胜肽圖譜分析顯示他們的滯留 時間少於6 5分鐘是類似的。此外，對應於重鏈胜肽片段之 種類可見於FVII-rec及FVII-tg，但FVII-pd則無。這些具 有高質量（4 500 Da至8000 Da)之胜肽對應於不完全的切 割。這些胜肽可見於其他FVII-pd批次，因此他們的存在不 可能涉及不同的胰蛋白酶靈敏度。

Asp-N分解後得到之胜肽圖譜類似於從FVII至另一所 P 得者，且此沿著整個連續的滯留時間。觀察到之強度差異只 因注射量變化所致，且無關於結構差異。 2.包含之序列 從經MS及/或MS/MS鑑定之胜肽計算序列的重疊。表 1摘要不同樣品所得結果。考慮胰蛋白酶及Asp-N分解，超 過95%的一級序列能經證實，所得結果是根據文獻所述者 (Thim L. d a/，Biochemistry，1988, 27, 7785-7793)。 表1 :經LC-ESIMS (/MS)分析之不同樣品所得之序列重疊 重疊 重疊 總體的 胰蛋白酶（％) Asp-N (%) 重疊（％) FVII-pd 79.3 97.3 97.3 FVII-rec 97.5 95.8 100.0 FVII-tg - 97.0 97.0 FVII-tg 96.6 91.1 100.0 FVII-tg 95.3 91.1 99.0 爲確認胜肽的同一性，經由MALDI及Edman定序分析 HPLC 分畫[J 〇 經由Edman定序分析的全部HPLC分劃能得到80%的序 -36 - 200817032 列重疊。進行於FVII-tg及FVII-rec於LC-MS之序列確認產 生一級序列> 9 5 %的重疊。 實施例4 :經由ESI-MS之糖化作用位置及糖胜肽特性分析 經由LC-ESIMS(/MS)鑑定FVII-tg的N-糖化作用位置， 經由MALDI-TOFMS確認，以及經由LC-ESIMS決定微觀不 均一性。 第2圖描述含有兩個糖化Asti殘基之糖胜肽的去迴旋 ESI質譜圖。經由MALDI_TOF(/TOF)確認糖化作用位置之方 ' 位並經Edman定序。 血漿 FVII(FVII-pd)具有N-糖化作用位置 Asn145及 ASI1322的分別糖胜肽質譜[Di23-Rl52]及[K31.6-R353]分析，顯 現存在雙觸、唾液酸化、非炭藻糖化結構（A2)(糖胜肽之觀 察質量：5563.8 Da)以及炭藻糖化（A2F)(觀察之質量：5709.8 Da)。也注意到存在三觸、三唾液酸化、非炭藻糖化寡醣（A3) (觀察之質量：6220.0 Da)以及炭藻糖化（A3 F)(觀察之質量： 6 3 66.1 Da)。對於基因轉殖FVII(FVII-tg)，位於Asn145之大 部分寡醣是雙觸、單一唾液酸化、非炭藻糖化或炭藻糖化 (Al，A1F)以及A2，A2F型。三觸形式極少出現。 關於大部分的Asn 3 2 2糖形式，觀察到相同聚醣結構有 不同比例。第2圖顯現存有比在A s η 1 4 5上較少處理形式（較 少觸角及唾液酸化）。例如，對於血漿產物三觸結構在Asn322 上比Asn145少出現，且FVII-tg是缺乏的。亦需注意，Asn 145 及322是100%糖化。雖然是半定量，但這些結果與HPCE-LIF 及NP-HPLC所得定量値是一致的。 -37- 200817032 實施例5:經由HPCE-LIF之N-聚醣定量 寡醣N-連接的鑑定及定量是在以PNGase F去糖化作用 後進行HPCE-LIF。FVII樣品處以外糖苷酶（唾液酸酶（酵素/ 受質比例（FVII) 1 mIU/10 // g)、半乳糖苷酶、窘曲酶 (hexnacase)(Prozyme 套組）、炭藻糖德（E/S 比例·· 1 mIU/10 // g))以確保每一單離結構的鑑定及定量。所得聚醣 以螢光染料（fluorochrome)標識並依據他們的質量及電荷分 離。兩種標準（葡萄糖同聚物及寡糖）能鑑定結構。經由接合 關於整個定量寡糖的每一峰來進行定量。 在此實施例中，使用毛細管電泳ProteoLab PA 8 00裝置 (Beckman-Coulter)。 也使用稱爲“凝膠緩衝液 -N”（Beckman-Coulter)之分離緩衝液。在 20 °C 以 25 kV 進 行此實驗20分鐘。使用雷射進行偵測（激發λ =488 nm ;放 射 λ =520 nm)。 以唾液酸酶、半乳糖苷酶及窘曲酶同時去糖化作用後計 算炭藻糖化比例，以對應於“核心”及炭藻糖化“核心”間 之峰區域比例。 FVII-pd的大部分聚醣是雙觸、雙唾液酸化（A2)以及雙 觸、雙唾液酸化、炭藻糖化（A2F)類型。FVII-tg之此聚醣形 狀（參閱第3圖）顯示存在雙觸、單一唾液酸化、炭藻糖化或 非炭藻糖化類型（A1F，A1)之結構，以及雙觸、雙唾液酸化、 非炭藻糖化或炭藻糖化類型（A2，A2F)之結構。FVII-rec之 形狀顯示非典型遷移時間於不同之所觀察結構（A1F，A2F)。 -38- 200817032 表2 :天然樣品（未去唾液酸化）產生之及不同批次FVII: FVII-pd及FVII-tg去唾液酸化樣品產生之唾液酸化結構的 百分比摘要 百分比 FVII-pd FVII-tg 批次 A FVII-tg 批次 B 无然 A2 41.9 19.3 13.9 A2F 8.9 14.8 21.5 A1 2.6 38.4 25.2 . A1F 11.7 22.2 A2+A2F總計 50.8 34.1 35.4 A1+A1F總計 2.6 50.1 47.4 去唾液酸化 G2 44.5 57.5 37.2 G2F 8.9 18 38.1 G3 25 4.6 3.0 G3F 5.1 1.3 3.0 其他未炭藻糖化種類 12.6 2.9 3.0 其他炭藻糖化種類 2.2 3.6 7.5 * G2FB - - - *雙炭藻糖化種類 G2，G2F :雙觸、雙半乳糖化、非炭藻糖化或炭藻糖化形式· 。 G2FB :雙觸、雙半乳糖化、二等分、炭藻糖化形式 不同聚醣結構的定量分析（表2)顯示FVII-pd具有約 5 1 %雙唾液酸化聚醣（A2及A2F)及30%三觸、唾液酸化、非 炭藻糖化或炭藻糖化形式（G3及G3F)之唾液酸化結構優 勢。FVII-tg(批次A及B)具有3 5%雙觸、雙唾液酸化形式及 只有6 %三觸、唾液酸化形式，比F V 11 - p d有較少的唾液酸 化。大部分形式爲具有50%結構A1及A1F之單一唾液酸化。 FVII-rec也比具有45% A2F結構及只有6%三觸、唾液酸化、 聚醣之FVII-pd有較少唾液酸化（結果未示）。 -39 - 200817032 對於FVII-rec，需注意低比例之非炭藻糖化結構。 表3 :不同FVII的炭藻糖化比例 FVII-pd FVII-tg 批次 A FVII-tg 批次 β FVII-rec 炭藻糖化比例(％) 16.2 23.6 41.8 100 定量分析顯示FVII-pd低比例之炭藻糖化（16%)，對於 FVII-tg的炭藻糖化比例從24至42%，以及對於FVn-rec的 炭藻糖化爲100%。 實施例6:經由NP-HPLC之N-聚醣定量 FVII-pd及FVII-tg之N-糖化作用的定性及定量分析是 經由NP-HPLC檢驗。蛋白質經除垢及乾燥後，此蛋白質被 變性還原。然後經由酵素路徑釋放聚醣（內糖苷酶PNG as e F) 並經由乙醇沉澱純化。如此所得聚醣經由螢光物質 fluorophore: 2-胺基苯甲醯胺（2-AB)標識。使用NP-HPLC (醯 胺-8 0管柱-4，6 / 2 5 0 m m - T 〇 s 〇 h a a s)根據他們的親水性分離經 標識之聚醣。注射之前，以80%乙腈平衡管柱。使用增加梯 度之甲酸銨50 mM、pH 4.5溶析寡醣。以螢光測定法（激發 λ =3 3 0 nm ；放射λ = 42 0 nm)進行偵測。 FVII-pd的層析圖槪廓（第4圖）顯示大部分聚醣是具有 比例至3 9 %之雙觸、雙唾液酸化類型（A2)。也觀察到較低量 之雙觸、雙唾液酸化、炭藻糖化（A2F)，單一唾液酸化（A1) 以及三唾液酸化、炭藻糖化及非炭藻糖化（A3 F及A3)形式。 對FVII-tg進行NP-HPLC分析確認存有類型A1之大部 分寡醣，至多比例27%。較少出現結構A1F、A2及A2F，以 及存由微量三觸形式。此顯露出FVII-pd及較少唾液酸化因 -40 - 200817032 子FVII-tg間之唾液酸化差異。 實施例7:經由MALDI-TOFMS鑑定 爲鑑定存在於 FVII-tg之聚醣結構，於以製備型 NP-HPLC所得溶析分劃進行MALDI-TOF MS分析（第5圖）。 使用熟悉該項技藝者已知的典型裝置及方法進行 MALDI-TOF 分析。亦良口 使用 Bruker Autoflex 2 儀器，以 TOF 及 TOF/TOF 模式（激發 λ : 3 3 0 nm ;放射 λ : 42 0 nm)。 FVII-tg之MALDI-T0F分析能確認鑑定經由NP-HPLC ' 分離之聚醣，亦即多數的單一唾液酸化A 1結構及少數形式 之A1F、A2F及A2類型。 此硏究也能鑑定三觸、雙唾液酸化及三唾液酸化少數形 式、混合形式以及Man5及Man6_P-HexNAc類型之寡甘露糖。 爲進一步鑑定聚醣結構，去唾液酸化後進行因子 FVII-tg 的 MALDI-TOF MS 分析。 去唾液酸化後，觀察到存在分別具有比例35%及2 8 %之 兩主要形式G2及G2F(經由NP-HPLC定量）。這些結果是依 、· 據“天然”產物（未去唾液酸化之產物）的結構鑑定。 其他被鑑定之形式只出現少量且實質上爲寡甘露糖， Man6-P-HexNAc 及 Man7-P-HexNAc 類型，以及混合類型。 注意存有雙炭藻糖化形式。 實施例8:唾液酸-半乳糖連接之HP CE-LIF分析 關於唾液酸-半乳糖連接（“分枝”）硏究的實驗步驟類 似於已說明於實施例5者。以PNGase F去糖化作用後，以 專一外唾液酸酶處理寡醣來確定每一單離結構的鑑定及定 -41 - 200817032 量。所用來自肺炎雙球菌（& 連接專一 性，0.02 IU ， E/S = 0.4 w/w)，產氣莢膜桿菌（C. 2-3 及 α 2-6 連接專一性，〇·〇4 IU，E/S = 0.1 w/w)以及節桿菌株（^. wre/acz·⑼5·)(能水解 α 2-3，α 2-6， α2-8 及 α2-9 連接，〇·〇1 IU，E/S = 0.05 w/w)之唾液酸酶是 重組酵素。 經由分析顯示F V11 -r e c具有大部分A 2 F之雙觸、唾液 酸化、炭藻糖化聚醣結構，以及雙觸、單一唾液酸化、炭藻 糖化（A 1 F)形式。當與這些結構常遇之遷移時間比較時，需 注意這些結構A2F及A1F之非典型遷移時間。意即，相較 於那些FVII-tg，這些寡醣的唾液酸化結構展現非典型遷移 時間於HPCE-LIF及NP-HPLC。另一方面，組成物於單醣類 之分析未展現不同於Neu5 Ac之任何特別唾液酸，且質譜儀 方法展現具有依據雙唾液酸化類型質量之聚醣。最終， FVII-rec的聚醣去唾液酸化能再次發現相當於FVn-tg及 FVII-pd的那些寡醣的層析圖及電泳反應。 因此這些電泳及層析圖反應的差異能解釋爲唾液酸的 不同分枝。經由HP CE-L IF及MS不同方法評估此假設。 結果摘要於以下表4。 表4 :不同批次FVII之唾液酸分枝 唾液酸化(％) a 2-3 (%) a 2-6 (%) a 2-8 (%) FVII-pd 100 41 59 0 FVII-rec 9 1 100 0 0 FVII-tg 批次 C 96 0 100 0 結果顯示這三種FVII在唾液酸水平之特殊異構物。的 -42- 200817032 確，FVII-rec的唾液酸包含α2-3連接，而FVII-tg展現分 枝α 2-6，以及FVII-pd爲這兩異構物之混合物。 相對於FVII-tg及FVII-pd之FVII-rec的聚醣所觀察之 HPCE-LIF及NP-HPLC反應差異，是關係於這些在唾液酸水 平之異構性差異。 實施例9 : Ο-糖化作用之硏究 FVII存在兩個0-糖化作用位置位於Ser52及Ser6()水 平。這些殘基分別含有葡萄糖·（木糖）〇_2及炭藻糖部分。在 ^ 此硏究架構中，經由 LC-ESIMS(/MS)以及類似方法經由 MALDI-TOF(/TOF)硏究0-糖化作用（結果未示）。 第10圖舉例說明樣品FVII-pd、FVII-rec及FVII-tg的 〇·聚醣結構。在m/z 3297.4之峰對應於含有葡萄糖-(木糖）2 部分於Ser52及炭藻糖於Ser6G之胜肽[Leu39-Lys62]。在m/z 3 165.4及3 03 3.3之峰分別對應於減少1及2個木糖於此糖 胜肽。這三類型之FVII —律地炭藻糖化及糖化，但木糖殘 基的數目及對應的糖形式比例不同。如此具有〇、1及2個 ^ 木糖之形式以幾乎相同比例存在於FVII-pd，而FVII-rec及 FVII-tg只含有具有0及2個木糖之形式。 MS分析顯示在m/z 1516.6之二價離子，對應於帶有Fuc 及GlC(Xyl)〇結構之胜肽[Leu39-Lys62]。以MS/MS得到之相 繼質量的減少對應於不同單醣類，確認Ser52及Ser6Q的修飾 分別具有葡萄糖及炭藻糖殘基。就修飾位置而論，Edman定 序能支持這些結果。 在同樣程度上，在m/z 1 648.7之二價離子對應於帶有 -43- 200817032

Fuc 及 Glc(Xyl)2 結構之胜肽[Leu39-Lys62；hMS/MS 所得之不 同離子片段確認木糖部分鍵結於葡萄糖。 實施例10 : r -羧基化之硏究

Fvn-pd的前ίο個麩胺酸是r -羧酸化，而FVII-rec的 第ίο個麩胺酸只是部分r -羧酸化。爲硏究基因轉殖fvii 的7 -竣基化及其比較部分，經由LC-MS分析Asp-N及胰蛋 白酶分解後所得胜肽。這兩酵素的結論是類似的，但只顯示 於Asp-N分解有關之數據。 / 在這些實驗條件中，包含 r -羧基化之三種胜肽 [Alai-Lys32]、[Asp33-Ser45]及[Asp33-Gly47]經鑑定。胜肽 [Alai-Lys^]含有前 9個 r -羧酸（GU)而其他兩胜肽 [Asp33-Ser45]及[Asp33-Gly47]只含有第 10 個 Gla 殘基。因 此，更容易專一硏究第10個Gla殘基的部分修飾。 FVII-pd的質譜分析（第11圖）顯示存在主峰（〜90%)於 4296.8 Da，對應於前9個麩胺酸（Glu)上完全T -羧酸化之胜 肽[AlarLys32]，以及在1658.8 Da有一峰特徵爲在第10個 1 Glu35上完整地 r -殘酸化之胜肽[Asp33-Ser45]。根據文獻 (Jurlander B. d «/，Semin.Thromb.Hemost·，2001，27, 373-384)，這些結果 顯示FVII-pd的前10個Glu殘基是r -羧酸化。 由於在相同實驗條件下得到不同數據，可能是不同批次 FVII的比較硏究（表5)。 第 1 1 圖顯示 FVII-rec 及 FVII-tg 在 4296.8 Da 之峰， 對應於完整7 -羧酸化之胜肽[Ala^Lys^]佔大多數。另一方 面，對於兩FVII發現存在主峰於1614.9，代表在Gla3 5未 -44- 200817032 r-羧酸化之胜肽[AsP33-Ser45]特徵。此結果指出第10個 〇1&的部分7-羧基化估計約有3 5 -40%於？¥11-^〇之情形， 其爲依據已發表之値〜5 0%(Thim L.以 a/，Biochemistry，1988，27, 7785_7793 及 Jurlander Β· α/，Semin.Thromb.Hemost·，2001，27, 373-383)。亦需報告爲存在一具有8個Gla有一非無關緊要強 度於此胜肽[Ala i-Ly s3 2]之形式。此最後觀點指出一個或一個 以上Gla於此胜肽之部分^ -竣基化，存在“微量”具有7 個Gla形式應相當強調涉及單一殘基。 表5 :關於Glu之7 -羧基化數據摘要。這些數據爲LC-ESIMS 分析結果。Gla : γ -羧酸

Gla殘基數目 主要形式(n Gla) FVII-pd 8-10 10 FVII-rec 7-10 9 FVII-tg 7-10 9 FVII-tg 7-10 9 實施例11:二硫橋之硏究 FVII之二硫橋硏究是從無還原劑條件下得到之胰蛋白 酶水解物來進行，亦即仍保留二硫橋。. 包括與碘乙醯胺之反應步驟以阻斷可能的游離半胱胺 酸’且如此以避免在鹼性ρ Η進行步驟期間二硫橋的交換。 在這些條件下’能確認存在有1 2個二硫橋及配對i 〇 個半腕胺酸（表6)。然而’需強調爲相對於此fVII序列部分 所得結果是依照理論配對。這些結論可應用於兩被硏究樣 品：FVII-pd 及 FVII-tg。 -45- 200817032 表6 :二硫橋硏究所得之結果摘要 FVII-pd FVII-tg 確認之二硫橋 12 12 配對之半胱胺酸 Cysn - Cys22 Cysn - Cys22 CysiH - Cysn? Cysiη - Cysi27 Cysi35 - Cys262 Cysi35 - Cys262 Cysi59 - Cysi64 Cysi59 - Cysi64 Cysns - Cysi94 Cysi78 - Cysi94 Cys3io - Cys329 CyS3i〇 - CyS329 Cys34〇 - Cys368 CyS34〇 - CyS368 使用之實驗策略可應用於無任何轉譯後修飾（MPT)之 雙胜肽[Gly354-Ser379]/[Asp338-Lys34i](結果未示）。此策略包 含四個互補方法：i)經由ESI-MS及MALDI-MS於實驗及觀 察質量間之質量的雙重“配對”來鑑定含有二硫橋之雙胜 肽，ii)經由化學還原S-S橋來確認結構，以及從雙胜肽所產 生之兩個胜肽的MS鑑定，以及iii)經由MS/MS及自動Edman 顯微定序來定序雙胜肽。 結果顯示經由“配對”實驗質量（3264.6 Da)與理論質 量（3 264.5 0&)之第一次鑑定包含二硫橋〇7534〇-€73 3 6 8之雙 胜肽[Gly354-Ser379]/[Asp338-Lys34i]。 還原後，對應於含有Cys34G-Cys 3 6 8橋之此雙胜肽 [Gly354-Ser379]/[Asp338-Lys34i]的消失峰，被發現於含有 Cys368 之胜肽[Gly354-Ser379](理論質量：2816.3 Da)在 m/z 28 16.3特徵之較佳峰。經由MS/MS及Edman化學之定序確 認雙胜肽[Gly354-Ser379]/[Asp338-Lys34i]及二硫橋 Cys34G-Cys 3 6 8 之鑑定。 -46 - 200817032 實施例12:天冬胺酸63 yS-羥基化之硏究 胜肽分析是從蛋白質之胰蛋白酶“分解”來進行。經由 MALDI-MS分析胜肽。羥基化胜肽的鑑定是經由相較於理論 質量之觀察質量的測量來進行。使用之儀器爲 Bruker Auto flex 2根據TOF模式運行。 不同結果呈現於表7。需強調爲文獻報導FVII-pd及 FVII-rec 缺乏 /3-經基化（Thim L. er a/，Biochemistry，1988，27, 7785-7793)，而能觀察到這兩樣品之部分修飾，但比不同 f FVII-tg批次以較不充足的方式。 表7 :關於Asp63羥基化之數據摘要。這些數據來自胰蛋白 酶胜肽之LC-E SIMS分析結果 (*)比FVII-tg較不“充足”之0 -羥基 (* * ) Thim L·以 a/，Biochemistry，1988, 27, 7785-7793)中弓丨用之値 羥基化Asp63 FVII-pd 部分* FVII-rec 無** FVII-tg 部分 FVII-tg 部分 FVII-tg 部分 實施例13:Galal，3Gal結構存在之硏究 爲硏究可能存在Gal α 1，3 Gal結構於FVII-tg，使用牛 甲狀腺球蛋白作爲Gal a 1，3 Gal結構的正對照組。 以PNGase F去糖化作用後，產物處以Gal a l，3Gal分 枝-專一唾液酸酶、炭藻糖酶及α -半乳糖苷酶。 第6圖舉例說明在含有天然形狀（“天然”）之超級位 置，去唾液酸化、去炭藻糖化及α -去半乳糖化形狀之超級 -47 - 200817032 位置（〇3丨&1 + 0£\1〇 + 〇8&1〇:(1，3,4,6))之牛甲狀腺球蛋白進行 之硏究。α -去半乳糖化後得到之聚醣形狀顯示在處以酵素 之後此結構完全消失，因此證明所用α -半乳糖苷酶具有絕 對活性。所得17· 8%之Gal a 1，3 Gal結構之比例與預期的比 例一致。 第7舉例說明超級位置，去唾液酸化及去炭藻糖化 FVII-tg產物（Dsial + Dfuc)與去唾液酸化、去炭藻糖化及α-去半乳糖化產物（Dsial + Dfuc + Dgala (1，3,4,6))之電泳圖。 / 需注意兩形狀爲完全地可疊合（superposable)。這些結 果暗示FVII-tg缺乏Gal a l，3Gal結構。應注意存在對應於 聚醣炭藻糖之少數結構（*)並非在近側位置。 實施例14·· Gala l，3Gal糖類部分之定量 10 Ug人類重組及基因轉殖FVII根據二硫橋還原條件 處理，沉積於電泳凝膠並於還原之SDS-PAGE中分離後轉移 到硝化纖維膜。使用牛甲狀腺球蛋白之樣品（Sigma，T1 001， 來自牛甲狀腺之甲狀腺球蛋白）作爲正對照組，因爲其高抗 I / 原決定基 α (1，3)半乳糖基含量。a _Gal部分（半乳糖-α -3 半乳糖-(3)4GlcNAc-R)之存在以經硬柄小皮傘菌（Mαrwmίw oreMa)凝集素過氧化酶標識且 a-Gal α-Gal抗原決定基 專一之純化外源凝集素（lectin)(EY Laboratories，H-900 1， MOA-HRP)來顯露。之後，以產色受質（Fluka，4-氯-1-萘酚） 偵測過氧化酶活性並以訊號數位化來定量（Bio-Rad ’ Quantity-one)。一同樣膜處以 α -半乳糖苷酶（Prozyme，綠 咖啡豆）以確認訊號專一性。在此同時，也經由染色同樣的 -48- 200817032 SDS-PAGE凝膠，以考馬氏藍（Coomassieblue)染色評估蛋 白質總量。 由於觀察到牛甲狀腺球蛋白之強烈訊號及其處以α -半 乳糖苷酶後消失，因此結果顯示硬柄小皮傘菌 0〜以〜）（^4〇八）外源凝集素之專一性。結果以關於^^八訊號 強度除以對應於所分析蛋白質量之訊號強度來表示，證明 FVII-tg樣品的殘留a -Gal訊號（2,3 a 3,7)程度，而重組FVII 展現較高値。 這些結果（參閱第8圖）證明表現於兔子之基因轉殖 FVII上缺乏a -Gal抗原決定基或出現程度非常弱（例如相較 於倉鼠細胞之重組FVII產物）。 表A摘要爲提供本發明之FVII組成物根據本發明較佳 具體例之製法步驟，以及提供每一步驟所得之不同產量，純 度及專一活性

表A

體積㈣ 蛋白質 含量(mg) FVII:Ag (IU)含量 FVII產量 /步驟(％) FVII產量 /累積(％) SA (IU/mg) FVII純度 (%) 乳汁 500 42750 103450 100% 100% 2.4 0.12% 磷酸萃取 4785 ND 93650 91% 91% 濃縮/透析(50 kDa) 667 29610 93233 99% 90% 3.1 0.20% 羥基磷灰石溶析液(CHT-I) 2644 1071 85692 92% 79% 80.0 4.0% 正切過濾(1〇〇 kDa) 459 518 81684 95% 72% 157.6 7.9% 溶析液QSFF1 (高 Ca++) 402 105 59757 73% 58% 572 28.6% 溶析液QSFF2 (低 Ca++) 157 12.8 22447 38% 22% 1749 87% 溶析液QSFF3 (鈉） 42.5 12.7 21929 98% 21% 1727 86% 終產物（消毒，0.2//m) 50 12.4 23197 106% 22% 1878 94% -49 - 200817032 【圖式簡單說明】 第1圖：根據本發明製造於雌兔乳汁之基因轉殖FVII 的萃取及純化/活化方法之一實施例槪述。 第2圖：帶有N-糖化作用位置之胜肽之去迴旋質譜圖 ESI (Deconvoluted mass spectra ESI) 〇 第3圖：FVII經PNGase F去糖化作用後之電泳圖 HPCE-LIF ; 圖例說明：兩中心電泳圖：FVII-tg ; ( <1 )炭藻糖， (_)GlcNAc(N-乙醯葡萄胺），（♦)甘露糖，（鲁)半乳糖，（▲)唾 液酸。 上方電泳圖：FVII-pd 中心電泳圖（2) : FVII-tg 下方電泳圖：FVII-rec 第4圖：FVII-tg (中心之層析圖）、FVII-pd (上方之層 析圖）及FVII-rec(下方之層析圖）經由 NP-HPLC之特性分 析。糖殘基之圖例說明：參閱第3圖。 第5圖：經由MALDI-TOFMS鑑定FVII-tg之主要聚醣 形式。糖殘基之圖例說明：參閱第3圖。 第6圖：經由HP CE-LIF分析甲狀腺球蛋白之寡醣。糖 殘基之圖例說明：參閱第3圖。 第7圖：經由HPCE-LIF分析基因轉殖FVII之寡醣。 糖殘基之圖例說明：參閱第3圖。 第8圖：Gal α 1，3 Gal結構之定量。 第9圖：FVII之萃取機制之實施例。 -50- 200817032 第10圖：帶有〇-糖化作用位置之胜肽的去迴旋質譜圖 ESI。這些胜肽得自以胰蛋白酶分解及LC-ESIMS分析之後。 Fuc :炭藻糖，Glc :葡萄糖，Xyl :木糖。 第1 1圖：帶有r -羧基化位置之胜肽的去迴旋質譜圖 ESI。這些胜肽得自以Asp-N分解及LC-ESIMS分析之後。 所得結果於不同批次FVII-tg是非常類似的。不同胜肽的質 量是單一同位素質量（monoisotopic masses)。Gla: 7 -殘酸。 ϋ -51 -

Claims (1)

1. 200817032 十、申請專利範圍： 1 .一種重組或基因轉殖因子VII (FV II)之組成物，組成物之每 一因子VII分子展現兩個N-糖化作用位置，特徵爲組成物 之FVII全部分子間Gal α ;i，3Gal聚醣部分的比例介於〇及 4%之間。 2·如申請專利範圍第1項之組成物，其中FVII之至少65% 的唾液酸包含α 2 - 6連接。 3·如申請專利範圍第2項之組成物，其中FVII之全部唾液 ί s 酸包含α 2 - 6連接。 4·如申請專利範圍第2項之組成物，其中FVII包括包含（χ2-3 連接之唾液酸。 5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之組成物，其中FVII 組成物之全部聚醣部分中，至少4 0 %是雙觸、單一唾液酸 化聚醣形式。 6. 如申請專利範圍第5項之組成物，其中FVII之雙觸、單 一唾液酸化聚醣形式爲大多數。 ^ ; 7 ·如申請專利範圍第6項之組成物，其中Fv 11的雙觸、單 一唾液酸化聚醣形式中大多數聚醣形式爲非炭藻糖化。 8 ·如申請專利範圍第7項之組成物’其中炭藻糖化比例由介 於20%及50%之間所組成。 9 ·如申請專利範圍第1至8項中任一項之組成物，其特徵爲 其由基因轉殖雌兔產生° 1 0 ·如申請專利範圍第1至9項中任一項之組成物’其中因子 VII是經活化的。 -52- 200817032 Π ·如申請專利範圍第1至1 〇項中任一項之組成物，其係用 於作爲藥劑。 1 2. —種如申請專利範圍第1至1 〇項中任一項之因子ν 11之組 成物之用途’其係於製備治療罹患血友病病患用之藥劑。 13. —種如申請專利範圍第丨至10項中任一項之因子νΐΐ之組 成物之用途，其係於製備治療多發性出血性創傷（multiple hemorrhagic traumas)用之藥劑。 14· 一種如申請專利範圍第1至1〇項中任一項之因子vil之組 ' 成物之用途，其係於製備治療因手術止血之大量控制不住 出血用之藥劑。 1 5 · —種如申請專利範圍第1至1 〇項中任一項之因子VII之組 成物之用途，其係於製備治療因服用過量抗凝血劑所致之 流血或出血用之藥劑。 1 6 · —種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至1 〇項中任 一項之因子VII以及醫藥可接受賦形劑及/或載劑。 1 7 · —種含於基因轉殖動物乳汁之基因轉殖F VII的萃取及純 化方法，包括由下列所組成之步驟： a) 從乳汁萃取F V 11 (此因子V11已結合於有機及/或無機 鹽及/或該乳汁鈣之複合體），其係沉澱經由添加可溶性 鹽於乳汁所得之鈣化合物，其中可溶性鹽的陰離子是 選擇能形成該不溶性鈣化合物者，以於此法中使因子 VII從該鹽及/或複合體釋放，然後該因子VII出現於 液相； b) 從鈣化合物之沉澱物分離出富含蛋白質之液相，該液 -53- 200817032 相進一步分離爲脂肪相及水性含有蛋白質之非 相； 〇使用預定濃度磷酸鹽爲主要成分之溶析緩衝液， 性非脂肪相進行親和力色層分析步驟；以及 d)使用適用於連續溶析留於該管柱之因子VII之 液’將根據步驟〇所得因子VII之溶析液，於弱 陰離子交換管柱進行二或三次色層分析步驟。 1 8 .如申請專利範圍第1 7項之方法，其中可溶性鹽爲磷g 1 9 ·如申請專利範圍第1 7或1 8項之方法，其中磷酸鹽是 由磷酸鈉，磷酸鋰，磷酸鉀，磷酸鉚及磷酸鉋所組成 組，且特別是磷酸鈉。 2〇·如申請專利範圍第1 7項之方法，其中可溶性鹽能爲 屬草酸鹽，特別是草酸鈉或鉀，或鹼金屬碳酸鹽，特 碳酸鈉或鉀，或其混合物。 2 1·如申請專利範圍第17至20項中任一項之方法，其中 性鹽於水溶液的濃度爲介於1 00 mM及3 Μ之間，更 介於200 mM及500 mM之間，特別是介於200 mM 5 mM之間。 22·如申請專利範圍第17至21項中任一項之方法，其中 b)是經由離心進行。 23.如申請專利範圍第17至22項中任一項之方法，其包 分離步驟後一非脂肪性水相的過濾步驟，其係以減少 性之濾器連續地進行，較佳爲1 μιη，然後0.45 μιη ’ 經由超過濾之濃縮/透析步驟。 脂肪 將水 緩衝 鹼型 $鹽。 選自 之群 驗金 別是 可溶 佳爲 〔3 00 步驟 括於 多孔 接著 -54- 200817032 24.如申請專利範圍第〗7至23項中任一項之方法，其中脂肪 相透過具有減少多孔性之濾器過濾，較佳爲1 μηι，然後 0 · 4 5 μ m。 2 5 .如申請專利範圍第1 7至24項中任一項之方法，其中親和 力色層分析在色層分析管柱進行，其撐體爲羥基磷灰石凝 膠（Ca1G(P04)6(0H)2)或氟磷灰石凝膠（Ca1()(P04)6F2)，以及 溶析緩衝液是主要成分爲 0.25 Μ-0.35 Μ磷酸鈉，pH 7.5 - 8.5之緩衝液。 26.如申請專利範圍第17至25項中任一項之方法，其中步驟 c)產生之 FVII之溶析液隨後進行正切過濾（tangential filtration) 〇 27·如申請專利範圍第17至26項中任一項之方法，其中第一 次色層分析步驟在Q-Sepharose® FF凝膠型色層分析撐體 進行。 28. 如申請專利範圍第27項之方法，其中以0·05 M Tris及 0.0 20 Μ-0· 05 Μ氯化鈣，pH 7.0-8.0爲主之水性緩衝液進 行FVII之溶析。 29. 如申請專利範圍第17至28項中任一項之方法，其中第二 次色層分析步驟是在Q-Sepharose® FF凝膠型色層分析撐 體上進行，其係在撐體上注射第一次陰離子交換色層分析 步驟所得之FVII之第一溶析液。 30. 如申請專利範圍第29項之方法，其中以〇·〇5 M Tris及 0.005 Μ氯化鈣，pH 7.0-8.0爲主之水性緩衝液進行FVII 之溶析。 -55- 200817032 3 1 ·如申請專利範圍第丨7至3 0項中任~項之方法，其中第三 次色層分析步驟是在Q-Sepharose® FF凝膠型色層分析撐 體上進行，其係在撐體上注射第二次陰離子交換色層分析 步驟所得之FVII之第二溶析液。 3 2.如申請專利範圍第3 1項之方法，其中以〇.〇2 μ Tris及 0.20-0.3 0 Μ(較佳0·28 Μ)氯化鈉，pH 6.5-7.5爲主之水性 緩衝液進行FVII之溶析。 3 3.如申請專利範圍第17至32項中任一項之方法，其包括至 少一種下列調製步驟，病毒去活性及安定化作用。 3 4 ·如申請專利範圍第1 7至3 3項中任一項之方法，其在親和 力色層分析步驟前能包含經由溶劑/洗潔劑進行之抗病毒 處理步驟。 3 5 ·如申請專利範圍第1 7至3 3項中任一項之方法，其中將得 自第二次陰離子交換色層分析步驟之溶析液進行奈米過 濾步驟。

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