TW200815469A - Compounds - Google Patents

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Duncan Cochrane
Caroline Russell
Matthew Sleeman
Fraser Welsh
Caroline Langham
Maurice Needham
Patrick Dufner
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Astrazeneca Ab
Cambridge Antibody Tech
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Description

200815469 九、發明說明： 【發明所屬技術領域】 本發明係有關介白素17 (IL-17也稱作為IL_17A)之結 合成員，特別為抗體分子及其治療用途例如用於治療與 5 IL_17相關聯之病症諸如類風濕性關節炎之用途。 IL-17A為T細胞衍生之細胞激肽，其具有多效性前發炎 活性。於試管内，IL-17A調節由纖維母細胞及滑液細胞製 造發炎媒介物質，可與其它前發炎細胞激肽協力合作，可 10 促進軟骨的分解及破骨細胞的骨質再吸收。 IL-17A為由兩個155胺基酸鏈所組成之同質二元體。夂 個多胜肽鏈包括23胺基酸N-端胜肽，該N-端胜肽經過裂解 來製造成熟132殘基之成熟多胜肽。il-ΠΑ係透過il-π受 體A及C的活化來結合且發揮其功效(T〇y等人2〇〇6)。存在有 15 5種1L-17A之同系物，命名為IL-17B至IL-17F，全部都具有 分歧不同的生物角色。IL-17同系物之Swissprot存取號碼為 IL-17B Q9UHF5 ； IL-17C Q96P0M4 ； IL-17D Q8TAD2 ； IL-17E Q9H293 ; IL-17F Q96PD4。IL-17B及IL_17C有寬廣 組織表現，蛋白質之細胞來源為未知，但IL-17B轉錄本可 20 以高濃度出現於神經系統（Moore等人2002)。IL-17B及 IL-17C可由單核細胞系THP-1誘生TNFa (Li等人2000)，當 注射入小鼠研究模型時可誘生嗜中性血球增多（Shi等人 2000)。IL-17D可於多種組織檢測，係於靜止的CD4+T細胞 及CD19+B細胞表現(Starnes等人2002)。IL-17E (IL-25)可提 5 200815469 引出Th2型反應，諸如呼吸道反應過度及嗜伊紅血球增多， 且具有與家族中的其他成員不同的性質（F〇rt等人2001)。 IL-17F係呈兩種同質異形體存在，IL_17F具有與IL-17A之最 大的同源性(55%及40%同源性），且共享多種類似的功能性 5質，諸如於肺臟誘生嗜中性血球增多，及誘生前發炎細胞 激肽類包括IL-8 (Hymowitz等人2001 ; Hurst等人2002，Oda 等人2005)。IL-17家族成員於天生免疫力及後天免疫力上扮 演某種角色，因此只鎖定目標於IL-17A之抗體將可確保於 IL-17A的表現領域，IL-17A發訊之特定效果受抑制。 10 家族成員與IL-17受體家族間的結合尚未完全了解。已 知IL-17E係透過IL-17RB發訊，但也曾報告IL-17B以較低的 親和力結合(Lee等人2001)。除了 IL-17RA之外，曾經報告 11^17人結合11^1711(：(11^171^);同理，11^17尸共享結合至 此等受體(Toy等人2006，Kuestner等人2005)。有額外受體 15 IL-17RD及IL-17RE，但尚未識別其内生性配體。對il_17RC 及IL-17RD存在有多個剪接變異株（Haudenschild等人 2002 ; Haudenschild等人2006 ; Moseley等人2003)。 IL-17A結合至其受體可能誘導受體的募聚合反應，結 果導致受體的活化。IL-17RA被IL-17A活化，活化多個前發 20 炎信號徑路諸如胞外信號調節蛋白質激酶(ERK1/2)徑路、 c-jun N-端激酶(JNK)徑路及p38 MAP激酶徑路。此等徑路 的活化透過多種尚未完全明瞭的機轉而觸發一定範圍之前 發炎基因和前發炎蛋白質的表現程度的改變。 IL-17A主要係由CD4+ T細胞和CD8+ T細胞分泌 200815469 5 (Lubberts等人2001)。IL-17A呈其RNA形式或胞内蛋白質形 式也可於嗜中性細胞、嗜伊紅細胞及人類血液單核細胞中 檢測得(Molet等人2001 ; Ferretti等人2003)。IL-6及TGFP晚 近已經提示涉及初次使用的T細胞分化成為製造IL-17之T 細胞(Betteli等人2006)，又有兩種細胞激肽涉及類風濕性關 V 節炎，以及IL-15及IL-23調節由T淋巴細胞釋放IL-17A。 IL-17A向上調節由滑液纖維母細胞製造發炎細胞激肽 及製造前列腺素，IL-17A促進由滑液纖維母細胞製造MMP • 10 及關節軟骨細胞，IL-17A可能於破骨細胞骨質再吸收上扮 演某種角色。於類風濕性關節炎RA組織之發炎環境方面， IL-17A與其它前發炎細胞激肽值得注意者為TNF_a&IL_ip 協同增效上扮演特殊角色。 15 • 若干系列證據提示IL-17於類風濕性關節炎(RA)的病 因上扮演要角。比較2/12 OA外植體及0/3正常滑液外植 體，功能性IL-17A由16/18 RA滑液外植體所自生分泌。ra 滑液的免疫染色，顯示於T細胞豐富區有製造il-ΠΑ的細胞 (Chabaud等人1999)。IL-17A於RA病人血清濃度比正常對照 組血清濃度升高（Cho等人2004)。 業已顯示IL -17 A可刺激一定範圍之前發炎細胞激肽的 20 釋放。IL-17A偶爾與其它細胞激肽協同增效發揮作用，促 進由滑液纖維母細胞製造IL-1、IL-6及LIF (Katz等人2001 ; Chabaud等人1998)。此外，顯示IL-17A可向上調節發炎細 胞中的COX-2的表現。 IL-17A於人軟骨細胞、滑液纖維母細胞及巨嗟細胞及 7 200815469 人滑液外植體誘生COX-2基因表現(例如Faour等人2003 ; Le Grand等人2001)。重組IL-17A向上調節滑液細胞之COX-2 表現’且促進TNFoc-刺激的滑液細胞COX-2表現(Stamp等人 2⑽4) 〇 5 除了此等「典型」前發炎活性之外，IL-17A也於RA關 節提引出其它功效，諸如促進軟骨分解。已經顯示IL-17涉 及MMP的向上調節及對軟骨的影響qL-pA提高由人類RA 滑液細胞自發製造ΜΜΡ14Ι^17Α協力向上調節牛關節軟骨 細胞中的MMP3、MMP13及ADAMTS4基因（Sylvester等人 10 2004)。IL-17A為基質分解的強力誘導劑及關節軟骨外植體 的基質合成抑制劑(Cai等人2001)。IL-17A抑制關節軟骨細 胞合成基質的一項機轉係透過促進NO的製造(Lubberts等 人）。腺〔病毒IL-17A注射入II型膠原蛋白免疫接種小鼠之膝 關節’加速滑液發炎的起點，惡化滑液的發炎，且促進此 15 一部位的關節破壞(Lubberts等人2001)。IL-17A也涉及於類 風濕性關節炎之破骨細胞骨質再吸收(Kotake等人1999)。 IL-17A生物學之一個重要態樣為其可與其它細胞激肽 協同增效。舉例言之，IL-17A促進於滑液纖維母細胞中 TNF-α誘導IL-1、IL-6及IL-8之合成(Katz等人2001)。此外， 20 於成骨細胞細胞系中，MC-3T3、IL-17及TNF-α於媒介IL-6 分泌有強力協同增效性(Ruddy等人2004)。IL-17A可增強由 IL-1 β所誘導的由RA滑液細胞製造il-6及LIF (Chabaud等人 1998) 〇 IL-17A於RA所扮演的角色進一步可由疾病的動物研 200815469 究模型之活體内證據獲得證實。IL-17A過度表現於缺乏 IL_1之小鼠，於鏈球菌（streptococcal)細胞壁（SCW)誘生關節 炎中誘導軟骨損壞(Koenders等人2005b)。於膠原蛋白講生 關節炎CIA研究模型中，IL-17A之過度表現促進關節炎 一 5 (Chabaud & Miossec 2001)。此外，CIA於IL-17A缺陷小氣 w 或於使用anti-IL-17 mAb處理小鼠受抑制（Nakae等人 2003 ; Lubberts 等人2001 ; Lubberts 等人2004)。 IL-17A除了於RA中所扮演的角色之外，IL-17A之活性 ^ 已經與多種其它病理鏈結，包括： 1〇 -骨關節炎（例如Honorati等人2002 ; Malemud等人 2004)； 骨質流失（Lubberts等人2003)及骨植體的鬆脫（vail Bezooijen等人 1999); -呼吸道的過度敏感，包括過敏性呼吸道疾病，諸如氣 15 喘（Molet等人2001 ; Wong等人2001 ; Linden 2006)及ARDS ; -脫髓鞘病症，包括多發性硬化(Lock等人2002 ; Touil Φ 等人2006); -乾癣(Teimissen等人1998)及乾癬性關節炎； -皮膚過敏，包括異位性皮膚炎(Toda等人2003); 20 -急性移植排斥（Antonysamy等人1999 ; Yoshida等人 2006 ; Tang等人2001); -同種異體移植片排斥（Hsieh等人2001); -移植片對宿主病； •系統性硬化(Kurasawa等人2000); 9 200815469 _系統性紅斑性狼瘡(Wong等人2000); -自體免疫性發炎性腸病，包括潰瘍性大腸炎(Nidsen 等人2003 ; Fujino等人2003 ; Yen等人2006)及克隆氏病； •尿路發炎病症，包括良性攝護腺肥大（Kramer & 5 Marberger 2006)； 心血管病，包括動脈粥狀硬化（Csiszar & Ungvari 2004)、川崎病（s〇hn等人2003)、缺血性心臟病（Csiszar 2003) 及中風； -血管床炎’包括貝歇特氏病（Hamazoui等人2002); 10 -週期性發燒，包括家族性地中海型發燒(Haznedaroglu 等人2005); -葡萄糖代謝’包括第1型和第2型糖尿病（Fisman 2003)； 肺疾，包括慢性阻塞性肺疾（31^11等人2004&;31^11等 15 人2004b)、支氣管炎、肺氣腫、閉塞性細支氣管炎症候群 (Vanaudenaerde等人2003)及肺纖維化； -癌症，包括淋巴瘤（Maggio等人2002)及腫瘤（Numasaki 等人2005); 牙周病（Vernal等人2005 ; Takahashi 2005); 2〇 -由病毒感染所引發的疾病，包括疱疹性基質角膜炎 (Maertzdorf等人2002); -其它IL-17媒介之發炎病症，例如包括過敏、反應性關 節炎、發炎性疼痛、脊椎關節病變，包括僵直性脊椎炎、 皮膚和角膜發炎病、發炎性肌肉病症； 10 200815469 -其匕IL-17媒介之急性發炎反應，諸如感染，包括敗血 病、敗血性休克及内毒性休克、腦膜炎及創傷（手術）； 其匕IL-17媒介之自體免疫病，例如包括自體免疫性血 液病、阿茲海默氏病、肉狀瘤病、肝硬化、膽囊病及肝病 識 5 包括肝炎、腎絲球體腎炎； ’ -其它IL-17媒介之代謝病症，例如包括血脂異常。 於活體内IL-17A的受到阻斷，於多種關節炎研究模型 中可抑制發炎、關節受損及疾病的進行。使用il_17RFc— _ 合蛋白質驗證可於小鼠CIA之巨觀層面抑制關節受損 10 (Lubberts等人2001)，於大鼠的輔劑誘生關節炎(MA)的關節 炎研究模型中也可由組織學分析獲得證實（Bush等人 2002)。使用市售抗IL_17 (大鼠抗小鼠)&IL_17R (大鼠抗小 鼠）之中和抗體已經驗證可於關節炎感染研究模型中抑制 關節的腫脹和關節炎的發作(Burchill等人2003)。兔抗小鼠 、15多株抗體已經用於鼠關節炎研究模型，驗證關節損傷和軟 ， 骨破壞嚴重程度的減低，及前發炎媒介物質包括RANKL·、 馨 IL-1P及1L-6濃度的降低(Lubberts等人2004 ; Koenders等人 2005a) 〇 IL-17的中和於一定範圍之疾病的其它動物研究模型 20中也驗證有功能效果。IL-17RFC融合蛋白質於小鼠同種異 體移植片研究模型中可延長存活(Ant〇nysamy等人1999)。 IL-17R IgG融合蛋白質於三硝基苯磺酸(TNBS)誘發大腸炎 的小鼠研究模型中也可減輕大腸發炎(zhang等人2〇〇6)。市 售單株anti-IL-17經由降低於卵挑釁之支氣管嗜中性細胞， 11 200815469 而於小鼠氣喘研究模型中證實有效(Hellings等人2003)。於 大鼠手術沾黏的研究模型中，兔多株IL-17中和抗體也可以 劑量相依性方式來減少沾黏的生成(Chimg等人2002)。 曾經說明抗IL_17A之抗體。例如由R&D系統公司（R& 5 D Systems)製造小鼠anti-IL-17單株抗體MAB317。此種 IgG2B抗體係由以經過純化之重組人IL-17 (大腸桿菌（E· Coli)衍生）免疫接種的小氣提引出之小氣融合瘤發展出。此 外，已經開發另一種小鼠anti-IL_17抗體53.159.16 (生物來 源公司（Biosource Inc·))其具有中和性質。此種IgGIK抗體係 10 由以經過純化之重組人IL-17免疫接種小鼠（Balb/c)提引出 小鼠之融合瘤發展出。此等抗體可辨識天然人IL-17及重組 人 IL-17。 W02006/054059 (UCB細胞技術公司（UCB CellTech)) 說明IL-17A之中和抗體分子。PEG化抗體片段經描述，該 15 片段係由原先分離自融合瘤之anti-IL-17抗體之生殖系列版 本衍生而得。該文件陳述使用BIAcore，判定該抗體片段具 有133_365 pM範圍之對IL-17之親和力。 W02006/013107 (諾華藥品公司（Novartis Pharma GmbH))說明IL-17A之結合成員，特別為分離自融合瘤定名 20 為 AIN457之人anti-IL-17 IgGl抗體。W02006/013107報告重 組AIN457與得自人(0.227 nM)、狨猿（1·2 nM)、恆河猴（9 nM) 及馬來猴（6 nM)之IL-17間之交互作用之BIAcore親和力測 量值(Kd)，指示對人IL-17與對馬來猴IL-17間之親和力差異 約為25倍。 12 200815469 L發明内容】 發明概要 此處說明對IL-17A之結合成員也稱作為IL-17A-结合 成員。本發明之結合成員可為IL-17A之抗體分子，尤其 5 IL-17A之人抗體分子。 結合成員可用於治療與IL-17A相關聯之病症，例如本 文所述之IL-17相關病症中之一種或多種病症，諸如類風濕 性關節炎。 此處說明於成熟人IL-17A之位置71-87該區内部結合 1〇 之結合成員。位置 71-87具有序列 Cys-Arg-His-Leii-Gly-Cys-Ile-Asii-Ala-Asp-Gly-Asn-Val-As p-Tyr-His-Met (SEQ ID NO : 199)。 本發明之結合成員 也結合 Cys-Arg-His-Leu-Gly-Cys-Ile-Asn-Ala-Asp-Gly-Asn-Val-As 15 p-Tyr_His-Met (SEQ ID NO : 199)之至少一個殘基。例如可 結合SEQIDNO : 199中之1、2、、4、5或多於5個殘基。 本發明之結合成員可於殘基Leu74、Tyr85及/或His86 結合成熟人IL-17A(SEQ IDNO : 198)。結合成員結合全部 3個殘基。經由檢測或觀察結合成員與IL-17 A殘基間之特異 20 性交互作用，例如於結合成員IL-17A複體結構中之特異性 交互作用，例如可使用X光晶相學測定，可判定結合。使用 X光晶相學測定與人IL-17A結合之抗體7之結構式4曰出抗體 7結合成熟序列（SEQ ID NO : 198)之殘基74 (Leu)、85 (Tyr) 及 86 (His)。 13 200815469 任選地，除了結合SEQIDNO : 199内部的一個或多個 殘基之外，結合成員可結合於IL-17A分子中之旁出殘基或 結構相鄰殘基。 任一種適當方法皆可用來測定由結合成員所結合之殘 5 基之序列，該等方法例如氫-氘交換、位置導向突變發生、 質譜術、NMR及X光晶相學。 胜肽醯胺氫交換是一種用來研究蛋白質經過徹底描述 的方法(Englander等人1994)。更為晚近，進一步發展出使 用經過氘標記的蛋白質，可交換質子，將其偶合至質譜術 10 來測定跨全蛋白的交換速率（Pantazatos等人2004)。此種氫/ 氘交換(Η/D交換)速率可顯著藉利用溶劑來修改，故當部分 蛋白質涉及結合至另一個分子時，交換速率顯著減慢。此 種辦法曾經用來映射涉及與抗體交互作用之蛋白質各區 (Lu等人2005)，且用來研究涉及本發明之結合抗體之 15 IL_17A區，如此處實例7.1之詳細說明。質譜術結合Η/D交 換’用來識別與結合成員接觸的IL_17A各區。也驗證當 IL-17A結合至本發明之結合成員時，於SEqIDN〇 : 199内 部殘基之Η/D交換顯著減慢。 蛋白質之單一胺基酸及各區的突變發生來讓結構式與 20活性交互關聯，為熟諳技藝人士眾所周知，用來定義蛋白 質與抗體結合的各區（Lu等人2005)。此等技術用於本發明 之結合成員之用途實例顯示於實例7·2。 結合至及/或中和具有胺基酸序列SEQIDNO:201之突 變人IL-17A ’可用來評估結合成員是否結合於成熟人 14 200815469 IL-17A之位置71-87各區内部。比較野生型IL-17A，不存在 有結合或中和或與突變IL-17A的結合或中和顯著降低，指 示結合成員係結合SEQ ID NO : 199之至少一個殘基。 本發明之結合成員視需要可未結合及/或未中和具有 * 5 胺基酸序列SEQIDNO : 201之突變人IL-17A。例如，本發 • 明之結合成員並未抑制突變人IL-17A結合至其受體。 IL-17A之中和可藉多項檢定分析測定，其實例說明於本文。 本發明之結合成員可能並未抑制於HT1080細胞中由 • 突變人IL-17A誘導之IL-6之釋放。使用濃度2 nM之突變 10 IL-17A (SEQ ID NO : 201)，本發明之結合成員於HT1〇8〇 細胞的IL-6釋放檢定分析中，並未顯示顯著中和強度。 於HT1080細胞的IL-6釋放檢定分析中’並未顯示顯著 中和強度。 於HT1080細胞的IL-6釋放檢定分析中比較於使用1 nM ， 15 或2nM成熟人ΙΙ^17Α(8Ε(5Π>ΝΟ : 198)之檢定分析，本發 明之結合成員於使用1 nM突變人IL-17A(SEQ IDNO : 201> _ 之檢定分析中具有Κ：5〇高10倍以上、高20倍以上、高50倍以 上、或高100倍以上。實例·3 (表20b)所示實例資料，顯示比 較成熟人IL-17A，抗體7對突變IL-17A具有遠較低的強度 20 (較高的ICso)。發現於使用突變IL-17A之檢定分析中，對抗 體7無法測定ICso值，如此指示IC5〇值高於本檢定分析所能 測量的IC50值。 如文中它處所述，結合成員結合至IL-17可使用表面電 漿子共振例如BIAcore測定。本發明之結合成員於表面電漿 15 200815469 子共振檢定分析中顯示與具有胺基酸序列SEq ID NCK 2〇1 之突變人IL-17A並無顯著結合’例如低於約i〇RU。 表面電漿子共振資料匹配二價被分析物模型（同時ka kd)，由速率常數比kdl/kal求出親和常數Kd。本發明之結 5合成員具有對結合成熟人IL-17A (SEQ ID NO : 198)之親和 力比對結合突變人IL-17A (SEQ ID NO : 201)更高5倍以 上，例如10倍以上或50倍以上。 堵如X光晶相學專技術也可用來識別由結合成員所結 合的IL-17A殘基，可用來驗證及/或精製其它技術的結果， 10 例如識別由結合成員所接觸的殘基。蛋白質之X光晶相學用 來測定二次、三次及四次結構為熟諳技藝人士眾所周知， 先前曾經用來映射與抗體交互作用之蛋白質部分 (Padavattan等人，2007 ; Karpusas 等人2001) 〇 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 199之離體多胜肽或胜肽 15 或由胺基酸序列SEQ ID NO : 199所組成之離體胜肽可用於 根據本發明生成、分離、及/或測試IL-17A之額外結合成員 之方法。 如此，本發明之進一步態樣係有關成熟人IL_17A序列 SEQ ID NO: 198之離體片段、包含或由胺基酸序列SEQ ID 20 NO : 199所組成之片段。片段長度高達20、25、30、50或 100胺基酸。一個或多個片段可含於較長的離體胜肽或多胜 肽序列内部，該序列非為IL-17A胺基酸序列，例如非為前 驅物或成熟IL-17A，例如非為SEQ IDNO: 198。包含IL-17A 胺基酸序列之離體片段之胜肽或多胜肽可包含額外胺基酸 16 200815469 廣· 5 殘基，其中該等額外殘基並非與IL-17A胺基酸序列連續。 例如SEQ ID NO : 199之後方或前方可接著一個或多個非與 SEQ ID NO : 198連續之殘基。此種多胜肽或胜肽之結合成 員例如抗體分子屬於本發明之態樣。 活體内之内生性IL-17A經過糖化，因此糖化人IL-17A 為人治療之治療目標抗原。雖然由細菌所衍生（例如於大腸 桿菌表現）且未經糖化的重組人IL-17A可用於本文說明之 檢定分析，但發明人也驗證本發明之結合成員可結合糖化 • 人IL-17A，諸如人T細胞或人胎腎(HEK) EBNA細胞所製造 10 的IL-17A。如此表示本發明之結合成員的一大優點，原因 在於糖化人IL-17A為活體内人類用途之標靶抗原。本發明 之結合成員對糖化IL-17A及非糖化IL-17A之親和力及/或 強度約略相等。 _ 15 • 如實施例中詳細說明，根據本發明之結合成員以高強 度中和IL-17A。中和表示抑制IL-17A之生物活性。本發明 之結合成員可中和一種或多種IL-17A之活性。受抑制之生 物活性典型為IL-17A結合至其結合伴侣或受體中之—者或 多者，例如結合至IL-17RA。 20 IL-17結合至其受體之中和可以於生物檢定分析中，細 胞釋放生物分子例如MMP13、PGE2或細胞激肽諸 IL-8測定，原因在於IL_17A結合至受體誘導細胞釋故此等 分子，可使用適當檢定分析例如於HT1080細胞（以 Ν〇·85Π1505獲得）、軟骨細胞或其它適當細胞類型或级織 類型測定。 17 200815469 生物活性之抑制可為部分或全部。於特定實施例中， 提供結合成員，可抑制IL-17生物活性達於無結合成員存在 下之IL-17之生物活性之至少95%、至少9〇%、至少85%、至 少80%、至少75%、至少70%、至少60% :或至少50%。結 5 合成員中和IL-17A之程度稱作為其中和強度。強度可使用 熟諳技藝人士已知之一種或多種檢定分析測定或測量及/ 或如本文所述。例如強度可於下列檢定分析中測量。 -HTRF (均質時間解析螢光)受體-配體結合檢定分析 -HTRF抗原決定部位競爭檢定分析 1〇 -HT1080 IL-6釋放檢定分析 -使用回應於IL-17及TNFa之協同增效性IL-6釋放之 HT1080細胞檢定分析 軟骨細胞IL-6/IL-8/MMP13/PGE2-釋放檢定分析 -於軟骨外植體之IL-6釋放檢定分析 -例如使用對IL-17及TNFa之協同增效性IL-6反應，於 滑液纖維母細胞(例如得自RA病人或ΟA病人)之IL-6釋放檢 定分析。 檢定分析方法說明於實例。 使用得自第一種屬（例如人類）之IL-17於檢定分析求出 20 之一結合成員之中和強度可與使用得自第二種屬（例如馬 來猴）之IL-17於檢定分析求出之一結合成員之中和強度比 較，俾便評估對兩種種屬之IL-17之結合成員之交叉反應性 程度。 本發明之結合成員結合人IL-17A及馬來猴IL_17A，例 18 200815469 如於HT1080 IL-6釋放檢定分析中測定，對中和人IL-17A及 馬來猴IL-17A之強度差異低於30倍，例如低於25倍、20倍、 15倍、10倍、5倍或2倍。 例如此處資料指出抗體第1-4號及7-16號於此處所述 ^ 5 HT1080 IL-6釋放檢定分析中對中和人IL-17A及馬來猴 • IL_17A之強度差異少於20倍。資料顯示於實例2。如此，於 若干實施例中，本發明之結合成員對人IL-17A及馬來猴 IL-17A之中和強度係在20倍以内。於若干實施例中，本發 _ 明之結合成員對人IL_17A及馬來猴IL-17A之中和強度係約 10 略相等或相等強度，亦即於1〇倍以内。 除非另行陳述，否則強度通常係以IC5G值以nM表示。 於功能檢定分析中，IC5G為可降低生物反應達其最大值之 50%之結合成員濃度。IC5G可經由將最大生物反應百分比呈 結合成貝？辰度之對數之函數作圖’使用軟體程式諸如 - 15 Prism(葛拉派公司（GraphPad))或Origin(歐瑞貞實驗室 (Origin Labs))來將S形函數帶入資料而產生IC5〇值計算。 ⑩ 本發明之結合成員於如此處所述之人IL-17A HTRF檢 定分析中，具有中和強度或IC50高達15 nM。本檢定分析可 用來於scFv格式測定結合成員之ic50。IC50例如高達10.0、 20 5.0、4.0、3.0、2.0或1·〇 nM。IC50資料實例示於實例2 (參 考表5)。終濃度0·75 nM人IL_17A用於HTRF受體-配體結合 檢定分析，方法細節列舉於實例。 本發明之結合成員於人IL-Π HT1080 IL-6釋放檢定分 析中具有中和強度或IC5〇高達40 nM。IC5〇例如高達35、25、 19 200815469 20、15、10或5 nM。本發明之結合成員於人IL_n Ητι〇8〇 IL-6釋放檢定分析中具有中和強度或π%高達3 〇、2 〇或1〇 nMalQc資料實例顯示於實例2(參考表6A)。本檢定分析係 回應於1 nM人IL-17A測定IL_6之釋放，方法細節陳述於實 5 例中。 本發明之結合成員於人IL-17 HT1080 IL-6釋放檢定分 析中具有pA2值約為10或小於1〇。pA2分析方法述於實例章 節。實例資料示於實例3 (參考表如）。 本發明之結合成員於測量回應於丨25 pm人IL-17A及25 10 PM TNFa之協同增效性釋放IL-6之HT1080細胞檢定分析 中’具有中和強度或IC5〇不超過1 nM。本發明之結合成員 於本檢定分析中具有中和強度或IC50不超過1、〇·5、或〇.3 nM。ICso資料實例示於實例2 (參考表6b)。 本發明之結合成員於藉得自人T細胞之糖化il-ΠΑ刺 15激HT1080細胞中，具有抑制IL-6釋放之IC50不超過1 nM， 例如不超過0.9、0·8、0·7、0.6、0·5、0.4、0·3、0.2或0·1 nM。 實例資料示於實例2 (表6c)。此等資料指出本發明之抗體可 結合及中和天然人IL-17A。 較佳，高中和強度可組合良好種屬交叉反應性。如此， 20 例如，結合成員於使用人IL-17A之IL-6釋放HT1080檢定分 析中具有IC%不超過1 nM，其中於人IL-17AHT1080檢定分 析中之IC%與於馬來猴IL-17A HT1080檢定分析中之IC50之 差異係不超過10倍。對人IL-17A之中和強度可大於馬來猴 IL-17A之中和強度。 20 200815469 本發明之結合成員具有於馬來猴IL-17 ΗΤ108Ό IL-6釋 放檢定分析例如於IgGl格式中之中和強度IC5〇高達15〇 nM。IC5〇例如高達 150、1〇〇、50、40、30、25、20、15、 10或5nMdC5G資料實例示於實例2(參考表6A)。1 nM馬來 ▲ 5猴IL-17A之終濃度用於HT1080細胞之IL-6釋放檢定分析， • 方法細節顯示於實例。 抑制IL-6、IL-8、MMP13及/或PGE2之釋放之抑制強度 可使用如本文所述之檢定分析，於人類一次軟骨細胞測 • 定。本發明之結合成員於此等檢定分析中之資料實例顯示 10於實例4。本發明之結合成員於使用濃度〇·2 nM之IL-17之軟 骨細胞IL-6釋放檢定分析中，具有ic%高達3·〇ηΜ，例如高 達2·0、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0·3或0·2 nM。 本發明之結合成員於使用濃度2 nM之IL-17之軟骨細胞IL-6 釋放檢定分析中，具有IC5〇高達20 nM，例如高達10、5.0、 ^ 15 4·0、3.0或2.0 nM。 • 本發明之結合成員於使用濃度0·2 nM之IL-17之軟骨細 ® 胞1L_8釋放檢定分析中，具有IC5〇高達3·0 nM，例如高達 2·5、2·3、1·0、0·5、0·4、0.3 ' 0.2或0·1 nM。本發明之結 合成員於使用濃度2 ηΜ之IL-17之軟骨細胞IL-8釋放檢定分 20 析中，具有IC50高達8 nM，例如高達5、4、3、2、1.8、1.6、 1·5、1.0或0.8 nM 〇
本發明之結合成員於使用濃度0.2 nM之IL-17之軟骨細 胞MMP13釋放檢定分析中，具有ic5()高達5 nM，例如高達 4、3、2、1或0·5 nM。本發明之結合成員於使用濃度2 nM 21 200815469 之IL-17之軟骨細胞MMP13釋放檢定分析中，具有IC5G高達 40 nM，例如高達30、20、10或5 nM。 本發明之結合成員於使用濃度2 nM之IL-17之軟骨細 胞PEG2釋放檢定分析中，具有1C%高達6nM，例如高達5、 5 4、3、2、1 或0·5 nM 〇 本發明之結合成員於屍體軟骨外植體檢定分析中於使 用1奈克/毫升TNFa於協同增效性反應中，於使用1〇奈克/ 毫升濃度之IL-17A於IL-6釋放檢定分析具有抑制活性例如 至少80%或90%抑制或1〇〇%抑制。於使用1〇奈克/毫升濃度 10之IL-17A於與1奈克/毫升TNFa之協同增效性反應之屍體 軟骨外植體IL-6釋放檢定分析中，本發明之結合成員具有 IC50不超過5 nM ’例如不超過4、3、2、1或0·5 nM。實例資 料顯示於實例6.1 (表15a及表15b)。 於OA滑液纖維母細胞之lL-17/TNFa協同增效檢定分 析中，本發明之結合成員具有抑制活性，例如至少50%、 60%或65%抑制，如此處所述(例如於與TNFa及協同增效反 應中，於使用10奈克/毫升或1奈克/毫升IL-17之IL-8釋放檢 定分析中，此處最大反應含有IL-17成分及TNFa成分）。實 例資料顯示於實例6.2 (表16a及表16b)。 2〇 於使用2 nM濃度IL-17之RA滑液纖維母細胞IL-8釋放 檢定分析中’本發明之結合成員具有IC%不超過5 nM，例 如不超過4、3或2 nM。資料實例顯示於實例6.3 (表17)。 於使用1 nM濃度IL-17及0.1奈克/毫升TNFa之協同增 效IL-17A加TNFa RA滑液纖維母細胞IL-8釋放檢定分析 22 200815469 中，本發明之結合成員具有IC50不超過5 nM，例如不超過 4、3或2 nM。資料實例顯示於實例6.3 (表17)。
於此處所述預混合小鼠氣袋檢定分析中，本發明之結 合成員可抑制IL-17A (與結合成員預先混合)誘導IL-6之釋 5 放達至少25%，例如至少30、35、40、45、50、55、或60%。 抑制作用可為約100%。本檢定分析中，結合成員例如具有 1〇50高達1〇微克，例如高達5、4、3、2、1或0.5微克。此外， 於此處所述預混合小鼠氣袋檢定分析中，本發明之結合成 員可抑制IL-17A誘導白血球的流入達至少80%，例如至少 1〇 85、90、95、98或99%。本檢定分析中，結合成員例如具 有Π)50高達5、4、3、2、或1微克。使用CDR之抗體2和抗體 7集合之本發明之結合成員之資料實例示於實例5 (參考表 13a及表 14a)。 於此處所述系統性給藥小鼠氣袋檢定分析中，本發明 15之結合成員可抑制IL-17A (系統性給藥結合成員接著 IL-17A給予氣袋）誘導之IL-6釋放達至少70%，例如至少 75、80或85%。於本檢定分析中，結合成員可具有ID5〇高達 1微克，例如高達0.5、'〇·4、〇·3、0.2、0.1或〇·〇5微克。此外， 於此處所述小鼠系統性給藥氣袋檢定分析中，本發明之結 20 合成員可抑制IL-17A誘導白血球的流入達至少70%，例如 至少75、80、85、90或95%。抑制約為1〇〇%。於本檢定分 析，結合成員例如具有1〇5〇高達2微克，例如高達1.5、1、 0.9、0·8、0·7或〇·6微克。使用CDR抗體7集合，本發明之結 合成員之資料實例顯示於實例5 (參考表13b及表14b)。 23 200815469 實例5所述之氣袋檢定分析所得資料驗證當局部投藥 或系統性投藥時，結合成員抑制IL-17A誘導反應之能力。 資料指出投予本發明之結合成員可有效治療於局部發炎位 置與IL-17A相關聯之病症，如此經由抑制於滑液關節之 5 IL-17A誘導之反應，可用於治療諸如類風濕性關節炎病 症。發現系統性投予本發明之結合成員可有效抑制 IL-17A，局部投藥並非有效抑制所需。此於結合成員之臨 床用途例如用於人體時特別有利，此處可使用系統性投 藥’此處投藥位置經常係與病症的表現位置分開，例如發 1〇 炎位置諸如滑液關節分開。 此外’ IL-17A結合成員對il_17A之結合動力學和親和 力（以平衡解離常數Kd表示）例如可使用表面電漿子共振諸 如BIAcore測定，或Kd可由pA2分析估計。 於人IL-17HT1080 IL-6釋放檢定分析中，由pA2分析計 15算，本發明之結合成員例如具有對人IL-17A之Kd小於1000 pM，例如小於6〇〇、500、400、300或200 pM。 如文中它處所述，表面電漿子共振涉及液相中之被分 析物通過附接至撐體之配體，測定被分析物與配體間之結 合。例如可進行表面電漿子共振，藉此IL -17A於液相通過 20附接至撐體之結合成員。表面«子共振資料可配合二價 被分析物資料模型或_價被分析物資料模型。如本文實例 顯不’發現二價被分析物模型特別適合用於測定結合成員 對二-17之親和力。親和常數Kd可由如使用二價被分析物模 型藉表面電漿子共振測定之速率常數比kdl/kal求出。 24 200815469 使用表面電漿子共振求出結合IL-17之KD值估值之實 例示於實例3 (參考表8b)。此等資料驗證抗體7對於大腸桿 菌細胞或HEK EBNA細胞中表現重組製造的人il]7A具有 良好結合性質。結合至得自HEK EBNA細胞之IL-17A，驗 5證抗體可結合天然糖化人IL-17A。天然糖化形式由抗體7結 合，指出抗體1至抗體16皆可結合天然糖化人il-ΠΑ，只要 全部此等抗體皆係由單一親代抗體(抗體丨)所導出即可，如 此相信全部皆結合IL -17 A之相同抗原決定部位或高度類似 的抗原決定部位。
10 本發明之結合成員對於結合於人細胞表現之人IL-17A (例如HEK EBNA導出之IL-17A)之親和力比較對結合於細 菌細胞表現之人IL-17A (例如大腸桿菌衍生正—^八)之結合 親和力差異小於5倍，例如小於2·5倍或小於2倍。 如使用二價被分析物資料模型，藉表面電漿子共振測 15定，本發明之結合成員具有對人IL-17A之Kd約為2·5 ιιΜ或 小於2·5 nM ’係由速率常數比kdi/kai求出。例如如使用二 價被分析物資料模型，藉表面電漿子共振測定，本發明之 結合成員具有對人IL-17A之Kd小於2.5 nM、2 nM、1.5 nM、 1·0ηΜ或〇·5ηΜ係由速率常數比kdl/kal求出。 20 如使用一價被分析物資料模型，藉表面電漿子共振測 疋，本發明之結合成員具有對人IL_17A之親和力約為〇·3 nM或小於〇·3 nM。例如如使用一價被分析物資料模型，藉 表面电漿子共振測定，本發明之結合成員具有對人 之親和力小於300 pM，例如小於2〇〇 pM。 25 200815469 如使用二價被分析物資料模型，藉表面電漿子共振測 定，本發明之結合成員具有對馬來猴IL_ 17A之Kd約為1 5 nM或小於1 · 5 nM ’係由速率常數比kd 1 /ka 1求出。 例如使用一價模型或二價模型來帶入資料，使用表面 5電漿子共振測定，本發明之結合成員對人IL-17A及馬來猴 IL-17 A之結合親和力差異小於10倍。如此，如使用表面電 漿子共振測定，本發明之結合成員結合馬來猴IL-17A之Kd 與結合人IL-17A之Kd差異小於10倍，例如小於5倍或小於3 倍。如文中它處所述，使用二價被分析物資料模型如藉表 10面電漿子共振測定，親和力可為有速率常數比kdl/kal算出 的Kd。如實例3及表8b所述，與人IL-17A及馬來猴IL-17A 結合間之良好交叉反應性係對抗體7測定。 對抗體7所得交叉反應性資料可用來代表對抗體丨至抗 體16全部之交叉反應性，但全部此等抗體皆係由單一親代 15抗體(抗體1)所導出，如此，相信全部抗體皆係藉和IL_17之 相同或高度相似的抗原決定部位。 此處報告之資料指出本發明之結合成員並未與IL_i7 同系物 11^176、11^17〇11^170、11^17£或11^17?交叉反應。 某些情況下，觀察到與IL-17F有微弱結合。交又反應性例 如可使用如本文所述之HTRF抗原決定部位競爭檢定分 ’每由測定由IL-17同系物il-ΠΑ結合至本發明之結合成 貝之抑制程度來測定。如此處所述，IL-17同系物B至E於此 ^疋分析中並未顯著抑制IL-17A之結合至本發明之結合 貝’驗證本發明之結合成員並未與IL_17同系物B至E交叉 26 200815469 反應。 ic50值可如此處所述於用於正_17八、、江_17匸、 ΙΙ^170、Π^17Ε或IL-17F與IL-17A競爭結合至一結合成員之 抗原决疋部位競爭檢定分析中測定。於使用結合成員及加 5心°己的IL-17A之抗原決定部位競爭檢定分析中，
(1)經由與 IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E 或 IL-17F 競爭所得之IC5G ;對
(⑷經由與未加標記之IL_ 17 A競爭所得冗別之比可大於 200倍，例如大於500倍。 10 本發明之結合成員於與IL-17F (例如其中IL-17F之濃 度為1 μΜ或以上)之抗原決定部位競爭檢定分析中，顯示與 iL· 17 a結合之部分抑制（亦即低於丨〇〇%抑制）。例如， 可抑制結合至IL-17A不超過50%，例如不超過約2〇〇/q。 Π-17Β、C、D、E或F中並無任一者可完全抑制結合成 15員之結合至人Π-17Α。於抗原決定部位競爭檢定分析中， 本發明之結合成員結合至人IL-17A無法完全由1 μΜ IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E或 IL-17F 中之任—者（個 別）完全抑制。如此，於抗原決定部位競爭檢定分析中，鈐 合成員結合至IL-17A無法由大於50%，例如不大於2〇%之
制0 於抗原決定部位競爭檢定分析中之資料實例顯示於巧 例2.7 (參考表7)。IC5〇值無法於使用IL-17B、C、d、 之抗原決定部位競爭檢定分析中測定，指示1C%值過高而 27 200815469 法於此種檢定分析中測定。 本發明之結合成員所具有之與IL-17同系物之有限交 叉反應提供其^療帛途及/或診_途之優點，特別於活 體應用中之治療及/或診斷用途，此處特別期望抑制 5 IL-17A。由非期望之交叉反應性所引發之副作用減少。此 外’可使用較低濃度結合成員，原因在於有限交叉反應性 表不較南投予之結合成員劑量可用於結合標靶IL-17A。如 此表示給藥用於活體内治療用途之特殊優點。 本發明之結合成員包含抗體分子，例如人抗體分子。 10結合成員通常包含抗體VH功能部位及/或VL功能部位。結 合成員之VH功能部位也提供作為本發明之一部分。於vh 及VL功能部位各自内部為互補決定區（rCDR」）及框構區 (「FR」）。VH功能部位包含一組HCDR，VL功能部位包含 一組LCDR。抗體分子包含抗體Vh功能部位包含VH 15 CDR1、CDR2及CDR3及框構。另外，也包含抗體VL功能 部位包含VL CDIU、CDR2及CDR3及框構。VH或VL功能部 位框構包含四個框構區FR1、FR2、FR3及FR4分散有呈如 下結構式之CDR : FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。 20 根據本發明之抗體VH及VL功能部位、FR及CDR之實 例列舉於隨附之序列表，構成本揭示之一部分。額外CDR 實例討論如下及表21。此處揭示之全部VH及VL序列、CDR 序列、CDR集合及HCDR集合及LCDR集合構成本發明之多 個態樣及實施例。如此處所述，「CDR集合」包含CDR1、 28 200815469 CDR2及CDR3。如此，HCDR集合係指HCDRl、HCDR2及 HCDR3 ; LCDR集合係指LCDR1、LCDR2及LCDR3。除非 另行陳述，否則「CDR集合」包括HCDR及LCDR。典型地， 本發明之結合成員為單株抗體。 5 本發明之又一態樣為抗體分子包含具有與隨附之序列 表所述抗體1至抗體16中任一者之VH功能部位有至少80、 85、90、95、98或99%胺基酸序列相同性之一 VH功能部位， 及/或包含具有與隨附之序列表所述抗體1至抗體16中任一 者之VL功能部位有至少80、85、90、95、98或99%胺基酸 10序列相同性之一VL功能部位。可用於計算兩種胺基酸序列 之相同度百分比之演繹法則包括例如BLAST (Altschul等人 1990)、FASTA (Pearson & Lipman 1988)、或史密斯·瓦特曼 (Smith_Waterman)演繹法則（Smith與Waterman 1981)，例如 採用内設麥數來計算。 15 本發明之結合成員包含抗原結合部位於非抗體分子， 通常係由一個或多個CDR例如HCDR3及/或LCDR3，或一 CDR集合於非抗體蛋白質鷹架上(容後詳述)所提供。 如實驗部分之細節討論，發明人分離有CDR序列集合 之一親代抗體分子(抗體1號），如表21所示。最佳化處理程 2〇 序，產生抗體純株2號至16號之一集合，CDR3序列係衍生 自親代CDR3序列，具有於表21指示之各個位置的取代。如 此例如由表21可知，抗體2有親代HCDRl、HCDR2、 HCDR3、LCDR1及LCDR2序歹，有親代LCDR3序列，其中 卡貝特(Kabat)殘基93及94分別係以P及Η置換。如此處所述 29 200815469 之親代抗體分子及抗體分子2至16分別係指有親代抗體分 子之CDR之抗體分子及有抗體分子2至16之CDR之抗體分 子0 此處所述為一種結合成員包含如表21所示之親代CDR 5 集合，其中HCDR1為SEQ ID NO : 3 (卡貝特殘基31-35)、 HCDR2為 SEQ ID NO : 4 (卡貝特殘基50-65)、HCDR3 為 SEQ IDNO: 5 (卡貝特殘基95-102)、LCDRl為SEQ IDNO: 8 (卡 貝特殘基24-34)、LCDR2為SEQ ID NO: 9 (卡貝特殘基50_56) 及LCDR3為SEQIDNO: 10(卡貝特殘基89-97)。 〇 本發明之結合成員包含一個或多個如此處所述之 CDR，例如CDR3及視需要也包含CDR1及CDR2來形成一 CDR集合。該CDR或CDR集合可為親代CDR或親代CDR集 合，或可為抗體2至抗體6中任一者之CDR或CDR集合，或 可為如此處所述之變異株。 5 例如根據本發明之VL功能部位之結合成員包含親代 LCDR3，卡貝特殘基93及94分別由P及Η所置換。 結合成員或VH功能部位包含親代HCDR3，有下列取代 中之一者或多者： 卡貝特殘基98由F或Η所置換； 0 卡貝特殘基100Α由G或Τ所置換； 卡貝特殘基101由R所置換； 卡貝特殘基102由G或Ν所置換。 於LCDR3之卡貝特位置93之D以Ρ取代係與結合成員 對人IL-17A及/或馬來·κ^·17α有較大結合強度。 30 200815469 本發明之結合成員包含抗體1至抗體16中任一者之 HCDR1、HCDR2及/或HCDR3及/或抗體i至抗體16中任一者 之LCDR1、LCDR2及/或LCDR3，例如表21所示抗體1至抗 體16中任一者之CDR集合。結合成員包含此等抗體中之一 5者之VH CDR集合。任選地，也包含此等抗體中之一者之 VL CDR集合，VL CDR可得自VH CDR之相同抗體或不同 抗體。包含抗體1至抗體16中任一者之HCDR集合之VH功能 部位，及/或包含抗體1至抗體16中任一者之LCDR集合之VL 功能部位也屬於本發明之個別實施例。 10 典型地，VH功能部位係與VL功能部位成對，來提供抗 體抗原結合部位，但容後詳述，單獨VH功能部位或VL功能 部位可用於結合抗原。於一個實施例中，抗體1 VH功能部 位係與抗體1 VL功能部位配對，故形成包含抗體1 VH及VL 功能部位之抗體抗原結合部位。對此處討論之其它VH及VL 15 功能部位提供類似之實施例。於其它實施例中，抗體1 VH 係與抗體1 VL以外之VL功能部位配對。輕鏈雜交於業界已 經明確建立。再度由本發明對此處揭示之其它VH及VL功能 部位提供類似之實施例。如此，親代VH或抗體2至16中任 一者之VH可與親代VL或抗體2至16中任一者之VL配對。 20 本發明之一個態樣為離體抗體分子包含VH功能部 位，具有SEQ ID NO ·· 62所示之VH功能部位胺基酸序列及 一個VL功能部位，有SEQIDNO : 67或SEQIDNO : 176所 示之VL功能部位胺基酸序列。 結合成員可包含親代抗體或抗體2至16中任一者之Η 31 200815469 CDR及/或LCDR之集合，於所揭示之及或[⑶找 合中有10個或9個或更少個例如i、2、3、4、或5個取代。 例如，本發明之結合成員包含抗體7iH cdr及/或L cdr 木口’有1G個或更少個取代例如Q、個取代。取代可能 5於CDR集合内部的任何殘基達成，可能於。〇1^、⑶&2及, 或CDR3内部。 取代可能於CDR3内部，如表21所示，例如於抗體2至 16中任者取代的位置。如此，一個或多個取代可包含於 下列殘基之一個或多個取代： 10 卡貝特殘基98、100A、1〇1或102於HCDR3 ;或 卡貝特殘基90、92、93、94、95或96於LCDR3。 如此，CDR3可為例如具有取代於卡貝特殘基93及/或 94之親代(抗體1) LCDR3。 於親代CDR之取代實例說明於文中它處。如本文說 15明，取代可包含如表所示之一個或多個取代。 結合成員可包含於抗體框構中有一個或多個CDR例如 CDR集合之抗體分子。例如抗體之_個或多個(：1^或(：^ 集合可接枝入框構(例如人框構)來提供抗體分子。框構區包 含人生殖系列基因節段序列。如此框構可經過生殖系列 20化，藉此於框構内部的一個或多個殘基可改變來匹配於最 熟知的人生殖細胞框構中位在相當位置的殘基。熟諳技藝 人士可於生殖系列化之前，選擇序列最接近於抗體之框構 序列之生殖系列節段，·測試抗體之親和力或反應性來驗證 於本文所述檢定分析中，生殖系列化並未顯著降低抗原結 32 200815469 合能力或強度。人生殖系列基因節段序列為熟諳技藝人士 所已知，例如可由VBase彙編中存取。 於一個實施例中，本發明之結合成員為具有一VH功能 部位包含於人生殖系列框構中之HCDR集合例如VH3-23之 5離體人抗體基因。如此，VH功能部位框構區FR1、FR2及/ - 4FR3包含人生殖系列基因節段VH3-23之框構區。FR4包含 人生殖系列j節段JH1、JH4或JH5 (此等j節段具有相同之胺 基酸序列）之框構區，或包含人生殖系列j節段jH3之框構 Φ 區。VH FR1之胺基酸序列可為SEQ ID NO : 189。VH FR2 10 之胺基酸序列可為SEQ ID NO : 190。VH FR3之胺基酸序列 可為SEQ ID NO : 191。VH FR4之胺基酸序列可為SEQ ID NO : 192。結合成員也有一個VL功能部位包含一LCDR集 合例如於人生殖系列框構例如VX6a。如此，VL功能部位框 構區FR1、FR2及/或FR3可包含人生殖系列基因節段VX6a 15 之框構區。FR4包含人生殖系列j節段JL2或JL3之框構區（此 等j節段有相同之胺基酸序列）。VL FR1之胺基酸序列可為 # SEQIDNO : 193。VLFR2之胺基酸序列可為SEQIDNO : 194。VLFR3之胺基酸序列可為SEQIDNO : 195。VLFR4 之胺基酸序列可為SEQ ID NO : 196。生殖系列化VH或VL 20 功能部位可能於一個或多個沃尼亞(Vernier)殘基生殖系列 化，但通常為否。 本發明之抗體分子或VH功能部位包含下列重鏈框構 區集合： FR1 SEQIDNO ： 189 ； 33 200815469 FR2 SEQ ID NO : 190 ; FR3 SEQ ID NO ： 191 ； FR4 SEQ ID NO ： 192 ； 或包含該重鏈框構區集合有1、2、3、4或5個胺基酸變 5 化例如取代。 本發明之抗體分子或VL功能部位包含下列輕鏈框構 區集合· FR1 SEQ ID NO ： 193 ； FR2 SEQ ID NO ： 194 ； 10 FR3 SEQ ID NO ： 195 ； FR4 SEQ ID NO ： 196 ； 或包含該輕鏈框構區集合有1、2、3、4或5個胺基酸變 化例如取代。 胺基酸變化可為取代、插入或刪除。 15 舉例言之，本發明之抗體分子可包含重鏈框構區及輕 鏈框構區集合，其中 重鏈FR1 為SEQ ID NO : 189 ; 重鏈 FR2 為 SEQ ID NO: 190; 重鏈FR3為SEQroNO : 191 ; 20 重鏈FR4為SEQ ID NO : 192 ; 輕鏈FR1 為 SEQ ID NO : 193 ; 輕鏈FR2為 SEQ ID NO : 194 ; 輕鏈FR3為 SEQ ID NO : 195 ; 輕鏈FR4為 SEQ ID NO : 196 ; 34 200815469 或可包含有10個或更少個例如5個或更少個胺基酸變 化例如取代之該重鏈框構區與輕鏈框構區之集合。例如於 该重鏈及輕鏈框構區集合中有一個或兩個胺基酸取代。 非生殖系列化抗體比較生殖系列或抗體，有相同 5 CDR，但有不同框構。 此處所示抗體序列中，抗體2、3、4、5、6、7、13、 14及15之VH功能部位經過生殖系列化，抗體1、8、9、10、 η、12及16之VH功能部位未經生殖系列化，抗體2及7之VL 功能部位經生殖系列化，和抗體1、3、4、5、6、8、9、10、 10 Η、12、13、14、15及16之VL功能部位未經生殖系列化。 本發明之結合成員可為與結且包含結合成 員、VH功能部位及/或VL功能部位、CDR如HCDR3及/或此 處揭示之CDR集合之任何結合成員競爭結合至IL17。結合 成員間之競爭可容易於試管試驗檢定分析，例如使用 15 ELISA檢定分析及/或將特定通報子分子貼標籤至一個結合 成員（可於一個或多個其它未貼標籤的結合成員存在下被 檢測）來於试管内變成容易檢定分析，來允許識別結合相同 抗原決定部位或重疊抗原決定部位之結合成員。競爭例如 可使用ELISA測定，其中IL-i7制動至板，第一加標籤的結 2〇合成員連同一個或多個其它未加標籤的結合成員添加至該 板。經由加標籤之結合成員發出之信號減低，觀察到與加 標籤之結合成員競爭之未加標籤之結合成員。此種方法方 便為熟諳技藝人士所已知，容後詳述。於一個實施例中， 如此處所述，競爭結合係使用抗原決定部位競爭檢定分析 35 200815469 來檢定分析。本發明之結合成員包含抗體抗原結合部位， 其係與抗體分子例如特別為包含VH功能部位及/或VL功能 部位、CDR例如HCDR3或親代抗體或抗體1至16中之任一者 用來結合IL-17之CDR集合之抗體分子。本發明之態樣提供 5結合成員，其可與此處定義之任何結合成員競爭結合之 IL-17,例如於scFv格式或IgGl格式競爭與親代抗體或抗體2 至16中任一者之結合。競爭IL_17與此處定義之任何結合成 員結合之結合成員，可具有此處對本發明之結合成員揭示 之結構性質及/或功能性質中之任一者或多者。 10 於又一態樣中，本發明提供一種離體核酸，其包含編
碼根據本發明之結合成員、VH功能部位及/或VL功能部位 之一序列；本發明之結合成員、VH功能部位及/或VL功能 部位之製備方法，包含於可獲得該結合成員、VH功能部位 及VL功能部位之製造之條件下表現該核酸，及回收核酸。 15 本發明之另一態樣提供編碼此處揭示之VH CDR或VL CDR序列之核酸，通常為離體核酸。 又一態樣提供一種含有本發明之核酸且以該核酸轉形 之宿主細胞。 本發明之額外態樣提供含有本發明之結合成員之組成 20物及其用於抑制及/或中和IL-17之方法，包括藉治療處理人 體或動物體之方法。 根據本發明之結合成員可用於人體或動物體之處理或 診斷方法，諸如於人類病人處理（包括預防性處理）疾病或病 症之方法，包含對該病人投予治療有效量之本發明之結合 36 200815469 成員。根據本發明可處理之病症包括其中IL-17扮演某種角 色之病症，如文中它處之討論。 此等及其它本發明之態樣進一步說明其細節如下。 術語 5 方便於此處指出，此處使用之「及/或」係作為兩種特 定特徵或元件有或無另一特徵或元件之特定揭示。舉例言 之，「A及/或B」須視為（i)A、（ii)B及(iii)A及B各自之特定 揭示，彷彿其個別陳述於本文般。 IL-17 10 IL-17、或IL-17A為介白素17。除非另行指示，否則述 及IL-17通常係指人IL-17A。 IL-17A於活體内表現有23胺基酸N端信號胜肽，經裂解 來製造成熟IL-17A。野生型成熟人IL-17A之序列為SEQ ID NO : 198。 15 習知述及1之胺基酸殘基係根據成熟序列不含信 號胜肽之殘基號碼。除非另行指示，否則此處人IL_17之殘 基編號係指成熟序列SEQ ID NO : 198之編號。成熟IL-17 之殘基1為Gly，Gly為全長多胜肽之位置24。 人1L_17序列係寄存於存取號碼Q16552 (Swiss-Prot)， 2〇顯示包括信號胜肽之全長前驅物IL-17A。 馬來猴IL_17之序列顯示為SEQIDNO: 162,由SEQID NO : 161所編碼。 如文中它處所述，IL-ΠΑ可為重組，及/或可為糖化或 未經糖化。IL-17A自然界於活體内係以N鍵聯糖化形式表 37 200815469 不。糖化IL-17A也於重組系統例如於HEK EBNA細胞表 現。亿-以可呈非糖化形式於大腸桿菌細胞表現。 結合成員 說明-對分子彼此結合中的一個成員。一個結合對之 5成員係天然射或全部或部分合成製造。成對分子中之一 個成員於表面上有一區或一個空腔，其係結合至成對分子 之另個成員之一特定空間與極性組織，因此與該空間及 極性組織互補。結合對類型之實例為抗原_抗體、生物素_ 抗生物素、激素-激素受體、受體_配體、酶-酶基質。本發 10明係有關抗原·抗體型反應。 結合成員通常包含具有抗原結合部位之分子。例如結 合成員可為抗體分子或包含抗原結合部位之非抗體蛋白 質。 抗原結合部位可利用CDR排列於非抗體蛋白質鷹架上 15提供，鷹架例如纖維膠或細胞色素B等(Haan & Magg〇s， 2004 ; Koide 1998 ; Nygren 1997)，或經由將_迴路之胺基 酸殘基隨機排列或於蛋白質鷹架内突變來提供對期望之標 把之結合特異性。於蛋白質中工程加工新穎結合位置之鷹 架已經有Nygren等人⑽7)詳細檢討。抗體模擬物之蛋白質 20鷹架係揭示於WO/0034784,全文以引用方式併入此處，其 中發明人說明蛋白質（抗體模擬物）包括纖維蛋白膠^領 域有至少-個隨機分配回路。移植_個或多個咖例如 HCDR集合或HCDR及/或LCDR3之適當鷹架可由免疫球蛋 白基因超群中的任何功能部位成員來提供。鷹架可為人或 38 200815469 1貝非k體蛋白質鷹架之優點為可於比較至少若 ^子更]、及/或更容易製造的鷹架分子中提供抗原 結合部位。小尺寸姓 、、’° a成貝可提供有用的生理性質例如可 進入細胞，穿透潘 入、、且織’或到達其它結合内部的標靶， 或結合於標靶抗原 所 ，、之蛋白貝空腔内部。使用於非抗體蛋白 10 15 20 抗原結合部位係綜述於Wess 2G04。典型為有適 田主鏈及個或多個可變迴路之蛋白質，其中迴路之胺基 -夂序列、工過彳寸別或隨機突變來形成與標妹原結合之抗原 、、” °M:。此種蛋白質包括得自金黃葡萄球菌(S. aureus) 、鐵轉和蛋白、四膠素(tetranectin)、纖維蛋白膠 (例如第戰維蛋自膠細功能部⑻及賴素咖㈣㈣ 之IgG、、、口口口|5位。其它辦法包括合成「微體」（希洛可公司 (Selecore Gmbh))，其係基於環肽類(cyd〇tides)，亦即有分 子内雙硫鍵的小型蛋白。 除了抗體序列及/或抗原結合部位之外，根據本發明之 結合成員包含其它胺基酸，例如形成胜肽或多胜肽，諸如 摺疊功能部位，或除了結合抗原之能力之外，對分子提供 另一項功能特性。本發明之結合成員可攜帶可檢測標籤， 或可軛合至毒素或標靶部分或酶(例如透過胜肽鍵或鍵聯 基胺合）。舉例言之’結合成員可包含催化位置(例如於崎功 能部位）及抗原結合部位，其中該抗原結合部位結人至^ 原，如此將催化部位的目標靶定於抗原。催化部位例如可 藉裂解而抑制抗原之生物功能。 雖然如前文說明，CDR可由非抗體鷹架所承载， 39 200815469 載CDR例如CDR3或本發明之CDR集合之結構通常為抗體 重鏈序列或輕鏈序列或其實質部分，其中CDR或CDR集合 係位在與由重排後之免疫球蛋白基因所編碼的天然VH抗 體可變功能部位及VL抗體可變.功能部位之CDR或CDR集 5合相對應。免疫球蛋白可變功能部位之結構及位置可參照 卡貝特1987及其更新決定，今日可於網際網路上取得（於 immuno.bme.nwu.edu或使用任何搜尋引擎來搜尋「Kabat」)。 CDR區或CDR—詞意圖指示如Rabat等人(卡貝特1991a 及其後的版本）所定義之免疫球蛋白重鏈和輕鏈之高度可 10變區。抗體典型含有3重鏈CDR及3輕鏈CDR。CDR或多個 CDR等詞用於此處來視情況而定指示此等區中之一者或數 者或甚至含有負責藉抗體對抗原或其辨識的抗原決定部位 的親和力結合之大部分胺基酸殘基。 6個短CDR序列中，重鏈之第三CDR (HCDR3)有較大尺 15寸可變性(較大多樣化，主要係由於產生該HCDR3之基因排 列機轉之故）。可短至2胺基酸，但最長已知尺寸為26。功 能上，HCDR3於部分決定抗體特異性扮演某種角色（Segal 1974 , Amit 1986 ； Chothia 1987 ； Chothia 1989 ； Caton 1990 ；
Sharon 1990a ; Sharon 1990b ; Kabat等人 199lb) o 20 抗體分子 此處說明免疫球蛋白，無論為天然或部分或全部合成 製造之免疫球蛋白。該術語也涵蓋包含抗體抗原結合部位 的任何多胜肽或蛋白質。此處須了解本發明並非與天然形 式的抗體有關，換言之，並非於自然環境中，反而可由天 40 200815469 然來源藉純化單離或獲得，否則藉基因重組或藉化學合成 而獲得，則其含有非天然胺基酸，容後詳述。包含抗體抗 原結合部位之抗體片段包括但非限於諸如Fab、Fab，、 秘’41|、8〇?¥^、(1八1),等分子;及二元抗體((1油0(^)。 5 本發明之抗體分子可為IgG，例如IgGl。 可利用單株抗體及其它抗體，使用重組DNA技術來製 造與標乾抗原結合的其它抗體或嵌合體分子。此等技術涉 及將一抗體之編碼免疫球蛋白可變區之DNA或CDR導入不 同免疫球蛋白之恆定區或恆定區加框構區。例如參考 10 EP_A]84187、GB 2188638A或EP-A-239400及大量隨後的 參考文獻。融合瘤或可製造抗體的其它細胞可接受基因突 變或其它改變，該等改變可能變更或可能未變更所製造之 抗體之結合特異性。 由於抗體可以多種方式修改，故「抗體分子」一詞須 15解譯為涵蓋任何結合成員或物質具有抗體抗原結合部位具 有所需對抗原之特異性及/或對抗原之特異性結合。如此， 本術語涵蓋抗體片段及抗體衍生物，包括包含抗體抗原結 合部位之任何多胜肽，包括天然或全部合成或部分合成之 多胜肽。因此也包括包含抗體抗原結合部位或相當基團稠 20 合至另一個多胜肽（例如衍生自另一種屬或屬於另一類抗 體類別或抗體亞類之多胜肽)之嵌合體分子。嵌合體抗體之 轉殖與表現係說明於ΕΡ-Α-0120694及ΕΡ-Α-0125023及大量 隨後之參考文獻。 抗體工程技藝界可用之其它技術可分離人抗體及人化 41 200815469 抗體。例如人融合瘤可如Kontermann & Dubel (2001)所述 製造。噬菌體顯示系統為另一種已知可產生結合成員之已 經確立的技術，細節說明於多個公開文獻，諸如 W092/01047 (容後詳述）及美國專利案US5969108、 5 US5565332 、 US5733743 、 US5858657 、 US5871907 、 US5872215 、 US5885793 、 US5962255 、 US6140471 、 US6172197 、 US6225447 、 US6291650 、 US6492160 、 US6521404及Kontermann & Dubel (2001)。小鼠抗體基因 已經被鈍化，功能上以人抗體基因置換，同時留下小鼠免 10 疫系統的其它成分完好的轉移基因小鼠，可用於單離人抗 體(Mendez 1997)。 合成抗體分子可由利用於適當表現載體内部所合成且 所組裝之募核苷酸產生的基因表現而形成，例如述於 Knappik等人(2000)或Krebs 等人(2001)。 15 業已顯示完整抗體之片段可從事結合抗原之功能。結 合片段之實例為⑴由VL、VH、CL及CH1功能部位所組成 之Fab片段；（ii)由VH及CH1功能部位所組成之Fd片段；（iii) 由單一抗體之VL及VH功能部位所組成之Fv片段；（iv)由VH 或VL功能部位所組成之dAb片段(Ward 1989 ; McCafferty 20 1990 ; Holt 2003) ; (v)離體CDR區；（vi) F (ab，)2片段，此乃 包含二鏈結Fab片段之二價片段；（vii)單鏈FV分子(scfv)， 其中VH功能部位及VL功能部位係藉胜肽鍵聯基鍵聯，胜肽 鍵聯基允許兩個功能部位結合來形成一個抗原結合部位 (Bird 1988 ; Huston 1988) ; (viii)二特異性單鏈卜二元抗體 42 200815469 (PCT/US92/09965)及(ix)「二元抗體」，由基因融合所組成 之多價片段或多特異性片段（WO94/13804 ; Holliger 1993a)。Fv、scFv或二元抗體分子可經由結合雙硫橋鍵聯 VH功能部位及VL功能部位來穩定化(Reiter 1996)。也可製 5作包含SCFV接合至CH3功能部位之迷你本體(jju 1996)。其 它結合片段之實例為Fab，，Fab，與Fab片段的差異係經由添 加數個殘基於重鏈CH1功能部位之羧端包括得自抗體鉸鏈 區之一個或多個半胱胺酸及Fab^SH,其為恆定功能部位之 半胱胺酸殘基帶有一個自由態巯基之Fab，片段。 10 本發明之抗體片段可始於此處所述之任一種抗體分子 獲得，例如包含VH功能部位及/或VL功能部位或抗體丨至抗 體16中任一者之CDR之抗體分子，藉諸如酵素如胃蛋白酶 及木瓜蛋白酶消化，及/或藉化學還原裂解雙硫橋等方法獲 得。以另一種方式，包含於本發明之抗體片段可藉基因重 15組技術獲得，同樣為熟諳技藝人士眾所周知，否則例如利 用自動胜肽合成儀諸如應用生物系統公司 (AppliedBiosystems)等供給的胜肽合成儀進行胜肽合成獲 得；或藉核酸合成及表現獲得。 根據本發明之功能抗體片段包括任何功能片段，其半 20生期可藉化學修改特別係藉PEG化或結合於微脂粒修改來 延長。 dAb(功能部位抗體）為一抗體之小型單元體抗原決定 片^又’換言之’抗體重鏈或輕鏈之可變區（H〇it 2003)。VH dAb天然出現於駱駝類（駱駝、駱馬），dAb之製法係使用目 43 200815469 標抗原免疫接種駱駝，單離抗原特異性B細胞，由個别0細 胞直接轉殖dAb基因製造。dAb也可於細胞培養製造。其尺 寸小、溶解度良好、溫度安定性良好，因此特別為生该上 有用，適合供選擇及親和力成熟。本發明之結合成員 5實質上如此處所述包含VH或VL功能部位之dAb，或實質上 如此處所述包含CDR集合之VH或VL功能部位。 如此處討論，「實質上如所述」一詞係指此處所述结I 成員之VH或VL功能部位之相關CDR的特性將相同戒高度 類似如此處所述序列之特化區。如此處所述，就一個或多 10 個可變功能部位之特化區而言，「高度類似」一詞表米於 CDR及/或VH或VL功能部位可做出1至約5，例如1至4，包 括1至3、或1或2、或3或4個胺基酸取代。 雙特異性抗體或雙官能抗體形成第二代單株抗體’其 中兩個不同可變區組合於同一個分子(Holliger 1999)。其用 15 途驗證可用於診斷領域及治療領域，此種抗體可召募新的 效應物功能，或鎖定目標於腫瘤細胞表面上的若干分子。 若欲使用雙特異性抗體，可為習知雙特異性抗體，可以多 種不同方式製造(Holliger 1993b)，例如以化學方式製備， 或由雜交融合瘤製備，或可為前文說明之任一種雙特異性 20 抗體片段。此等抗體可藉化學方法獲得(Glennie 1987;Repp 1995)或本體方法獲得(Staerz 1986 ; Suresh 1986)，但同樣 係藉基因工程技術獲得，基因工程技術允許執行非同質二 聚合，如此輔助抗體純化程序(Merchand 1998)。雙特異性 抗體實例包括BiTE技術，其中有不同特異性之兩種抗體之 44 200815469 結合功能部位可使用，透過短的可撓性胜肽直接鍵聯。如 此將兩個抗體組合於一個短的單一多胜肽鏈上。二元抗體 及scFv可只使用可變功能部位未含Fc區組成，可能可降低 抗特異基因型反應的影響。 5 雙特異性抗體可組成為整個IgG、組成為雙特異性
Fab’2、組成為Fab’PEG、組成為二元抗體或雙特異性scFv。 此外，兩個雙特異性抗體可使用技藝界已知之例行方法鍵 聯來形成四價抗體。 與雙特異性整個抗體相反，雙特異性二元抗體特別有 10用，原因在於容易組成且可於大腸桿菌表現。具有適當結 合特異性之二元抗體（及多種其它多胜肽，諸如抗體片段) 方便使用嗟菌體顯示系統(WO94/13804)而由存庫中選出。 若二元抗體的一臂維持恆定，例如具有針對1£^17的特異 性，則可製作出一個存庫，其中另一個臂為可變，選出有 15適當特異性之抗體。如Ridgeway 1996所述，雙特異性完整 抗體可藉其它基因工程技術製造。 技藝界已知多種方法可獲得抗比―；^之抗體。抗體可為 單株抗體，特別為人、鼠、嵌合體或人化來源，抗體可根 據熟諸技藝人士眾所周知之標準方法獲得。 20 大致上，為了製備單株抗體或其功能部位，特別為鼠 來源之抗體或其功能片段參考特別說明於「抗體」手冊 (Harlow及Lane 1988)之技術，或參考如Kohlei^Milstein， 1975所述由融合瘤製備之技術。單株抗體例如可由對乩_17 免疫接種之動物細胞獲得，或其片段之一含有藉該單株抗 45 200815469 體可辨識之抗原決定部位。IL_17或其片段之一特別可根據 尋常工作方法製造，始於含於虬_17或其片段之編碼cDna 中之核酸序列，藉基因重組製造；始於包含於il_17之胜肽 序列及/或其片段中之胺基酸序列，藉胜肽合成製造。例如 5單株抗體可於親核管柱上純化，於該親核管柱上事先已經 制動IL_17或含有可藉該單株抗體所辨識的抗原決定部位 之其片段之一。特別，單株抗體可於蛋白質八及/或蛋白質^ 上層析純化，接著或未接著離子交換層析術，離子交換層 析術係針對去除殘餘蛋自質污染物；DNA及m本身接著 1〇或未接著於希法羅斯(Sephar〇se)凝膠上的排除層析術，來 去除由於存在有_聚物或其它多聚物所可能造成的聚集 體。於一個實施例中，全部此等技術可同時使用或循序使 用。 抗原結合部位 15 20 此處說明結合至目標抗原之全部或部分且與其互補之 一個分子之-部分。於㈣分子中，稱作為抗體抗原結合 部位’包含可結合至目標抗原的全部或部分且與其互補之 抗體部分。當抗原尺寸大時，抗體只結合至抗原的特定部 分，该部分定名為抗原決定部位。抗體抗原結合部位可由 2或多個抗體可變功能部位所提供。抗體抗原結合部位 ^抗體輕鍵可變區(VL)及抗體重鏈可變區_。 46 200815469
10 15
VH及/或VL功能部位、及編媽核酸分子及載體可以者 純質形式或同質形式單離提供及/或例如由天然環=以 實質純質形式或同質形式純化；或於核酸之情況下，不含 或實質上不含除了編碼具有所需功能之多胜肽序列以 狀核酸或基因。單離的結合成員及單離的_將不含或 實質上不含其天然結合的材料，諸如於天然環境中或㈣ 備係藉試管㈣活體内實作的重組DNA技術進行時，^ 狀環境巾⑽如細胞騎)所見之其它多職或核酸。結合 成貝及核酸可以稀釋劑或輔劑調配，為了實用目的須經單 離，例如成員係與明膠或其它_混合用來塗覆微力:孔 板來用於免錢定分析，或成M將與藥學上可接受之載劑 或稀釋劑混合驗診斷或治療。結合成員可自然或藉非同 質真核細胞系（例如CHO細胞或NSO細胞（ECACC 8511〇5〇3))糖化，或結合成員可未經糖化(例如於原核細胞 中表現）。
包含抗IL-17抗體分子之非同質製劑也構成本發明之 一部分。例如此等製劑可為抗體混合物，有全長重鏈及缺c 端離胺酸之重鏈，有不等程度之糖化，及/或有衍生之胺基 酸，諸如N端麩胺酸環化來形成焦麩胺酸殘基。 2〇 圖式簡單說明 第1圖為N端加標籤之人il-ΠΑ胺基酸序列（SEQ ID NO: 197>N端標籤殘基1至21之下方畫線。與成熟人IL-17A 之殘基71-87相對應之殘基92-108被框出（SEQ ID NO: 199)。 第2圖為有C端His5標籤之全長前驅物人IL-17A胺基酸 47 200815469 序列（SEQ ID NO : 200)。23胺基酸殘基之N端信號胜肽顯示 為下方畫線。由野生型人IL-17突變之殘基(SEQIDNO: 198) 以粗體字及下方晝線表示，框出與成熟人IL-17A之殘基 71-87相對應之序列SEQ ID NO : 199。不含N端胜肽及His 5 標籤之成熟突變株人IL-17A為SEQIDNO:201。 【實施方式】 較佳實施例之詳細說明 如前文說明，根據本發明之結合成員調變與中和IL-17 之生物功能。如本文說明，本發明之IL-17結合成員可經過 10最佳化獲得中和強度。大致上，強度的最佳化係涉及突變 所選疋結合成員之序列（通常為抗體之可變功能部位序列） 來產生結合成員存庫，隨後檢定分析其強度，選出較為強 而有力的結合成員。如此選出的r強度最佳化」結合成員 傾向於具有比存庫由其中所產生之結合成員更高的強度。 15雖言如此，高強度結合成員也可未經最佳化來獲得，例如 可直接由初步筛檢，例如生化中和檢定分析獲得高強度結 合成員。「強度最佳化」結合成員係指有特定活性之中和最 佳強度或IL-17下游功能之最佳強度之結合成員。檢定分析 及強度之細節說明如後。本發明提供強度最佳化之結合成 員及強度未經最佳化之結合成員，以及由選出之結合成員 將強度最佳化之方法。如此對本發明引起熟諸技藝人士產 生有局強度之結合成員。 雖然強度最佳化可用來由給定之結合成員產生較高強 度結合成員，也須注意即使未經強度最佳化仍可獲得高強 48 200815469 度結合成員。 於又-態樣中，本發明提供一種獲得可與抗原結合之 -種或多種結合成員之方法’該方法包括將根據本發明之 結合成員之存庫與該抗原接觸，以及選出可與該抗原結合 5之存庫中的一個或多個結合成員。 存庫可顯不於粒子上或分子複體上，例如可複製之義 因封裝體，諸如酵母粒子、細菌粒子或噬菌體粒子（例如 T7)、病毒、細胞、或二價表現系統、核糖體表現系統或其 它活體内表現系統，各個粒子或各個分子複體含有編碼抗 10體VH可變功能部位之核酸顯示於其上，若存在時視需要也 可顯示VL功能部位。噬菌體顯示系統說明於W092/01047 及例如美國專利案US5969108、US5565332、US5733743、 US5858657 、 US5871907 、 US5872215 、 US5885793 、 US5962255 、 US6140471 、 US6172197 、 US6225447 、 15 US6291650、US6492160、及US6521404，各案全文以引用 方式併入此處。 於選出可與抗原結合且於噬菌體或其它存庫粒子或分 子複體上顯示之後，由顯示此種選出的結合成員之噬菌體 或或其它存庫粒子或分子複體取出核酸。此種核酸可用於 20 經由使用取自顯示此種選出的結合成員之噬菌體或或其它 存庫粒子或分子複體之核酸序列由核酸表現，製造結合成 員或抗體VH或VL可變功能部位。 有該選定之結合成員之抗體VH可變功能部位之胺基 酸序列之抗體VH可變功能部位可以離體形式提供，如同包 49 200815469 含此種VH功能部位之結合成員可以離體形式提供般。 可進一步測試結合IL-17的能力，也可測試與親代抗體 分子或抗體分子1至16 (例如呈scFv格式及/或IgG格式例如 IgG 1)競爭結合至IL-17之能力。也可測試中和IL-17之能 5 力，容後詳述。 根據本發明之結合成員可以抗體1至抗體16中之一者 之親和力例如呈scFv格式或IgGl格式結合IL_17，或以更佳 之親和力結合IL-17。 根據本發明之結合成員可以抗體1至抗體16中之一者 10 之強度例如呈scFv格式或IgGl格式，或以更佳之強度中和 IL-17之生物活性。 不同結合成員之結合親和力及中和強度可於適當條件 下比較。 此處揭示之抗體分子之變異株可經製造且用於本發 15明。遵照電腦化學應用多變量資料分析技術於結構/性質_ 活性關係(Wold 1984)的指示，抗體之量化活性_性質關係可 使用眾所周知的數學技術導出，諸如統計迴歸、圖案辨識 及分類（Norman 1998 ; Kandel & Backer 1995 ; Krzanowski 2000 ； Witten & Frank 1999 ； Denison (Ed) 2002 ； Ghose & 20 Viswanadhan)。抗體之性質可由抗體序列、功能結構及三度 空間結構之實驗模型和理論模型（例如分析可能的接觸殘 基、或計算所得之物理化學性質）導出，此等性質可單獨考 慮和組合考慮。 VH功能部位和VL功能部位所組成之抗體抗原結合部 50 200815469
位典塑係由6多胜肽迴圈所組成：3個係得自輕鏈可變功能 部位(VL)及3個係得自重鏈可變功能部位(VH)。分析抗體之 已知原子結構，說明抗體結合部位之序列與三度空間結構 間之關係(Chothia 1992 ; Al-Lazikani 1997)。此等關係暗示 5 除了 VH功能部位的第三區（迴圈）外，結合部位迴圈有小量 主鏈構型：正準結構(canonical structures)。形成於特定迴 圈之正準結構顯示可由其大小決定，以及於迴圈區及框構 區二者中之關鍵位置存在有某些殘基來決定（Chothia 1992 ; Al_Lazikani 1997) 〇 10 此項序列-結構關係的研究可用來預測於具有已知序 列但具有未知三度空間結構之抗體中之該等殘基，該等殘 基對於維持其CDR迴圈之三度空間結構相當重要，因而對 於維持結合特異性相當重要。此等預測可經由比較該等預 測與得自領先最佳化實驗之輸出獲得證實。於結構辦法 15中’使用自由可得或市售套裝軟體如WAM (Whitelegg & Rees 2000)，可形成抗體分子（chothia 1986)。蛋白質視覺化 及分析套裝軟體，諸如1118丨§]^11(亞塞理司公司（八(^^1678, Inc·)或Deep View (葛氏沛奇公司（Guex & Peitsch) 1997)用 來評估於CDR之各位置可能的取代。此項資訊可用來讓取 20代可能對活性極少造成影響或具有有利的功效。 於CDR、抗體VH或VL功能部位及結合成員之胺基酸序 列内部作取代所要求之技術通常於技藝界可得。使用可預 測或可能並未預測對活性有極小影響或有利功效之取代， 可做出變異株序列，並測試其結合及/或中和IL_17i能力， 51 200815469 及/或測試任何其它期望的性質。 VH和VL功能部位中之任一者之可變功能部位胺基酸 序列變異株(其序列特別揭示於此處)可根據本發明使用，討 _如文。特殊變異株包括一個或多個胺基酸序列變更(胺基 5酸殘基之加成、刪失、取代及/或插入)可少於約20變更，少 於約15變更，少於約10變更或少於約5變更，可為5、4、3、 2或1個變更。可於一個或多個框構區及/或一個或多個cdr 作k更。變更通常不會導致功能的喪失，故包含如此變更 後之胺基酸序列之結合成員可保有結合及/或中和IL-17的 10月b力。舉例言之，可保有與其中未做出變更之結合成員相 同的量化結合能力及/或中和能力，該等能力例如藉本文所 述檢定分析測定。包含如此變更之胺基酸序列之結合成員 具有結合及/或中和IL-17之改良能力。 欠更包含以非天然胺基酸或非標準胺基酸置換一個或 15多個胺基酸殘基；將一個或多個胺基酸殘基修改成為非天 然形式或非標準形式；或將一個或多個非天然胺基酸或非 ‘準胺基酸插入序列内部。於本發明之序列中之變更數目 和變更所在位置之實例說明於文中它處。天然胺基酸包括 20個「標準」L胺基酸，以其標準單字母碼識別為g、a、v、 20 l、i、m、p、f、w、s、t、n、q、y、c、Kr、h、d、 E°非標準胺基酸包括可結合人多胜肽主鏈或由現有胺基酸 殘基修改所得的任何其它殘基。非標準胺基酸可為天然胺 基酸或非天然胺基酸。若干天然非標準胺基酸為技藝界所 已知，諸如4-羥基脯胺酸、5_羥基離胺酸、3_甲基組胺酸' 52 200815469 N-乙醯基絲胺酸等(Voet & Voet 1995)。於其Ν-α位置衍生之 該等胺基酸殘基只能位在胺基酸殘基的]^端。通常於本發明 中，胺基酸為L胺基酸，但於若干實施例中可為D胺基酸。 因此變更包含將L胺基酸改質成為d胺基酸，或以d胺基酸 5置換L胺基酸。胺基酸之甲基化形式、乙醯化形式及/或磷 酸化形式亦為已知，本發明之胺基酸可為該等改質的主題。 於本發明之抗體功能部位和本發明之結合成員中之胺 基酸序列可包含前述非天然胺基酸或非標準胺基酸。於若 馨干實施例中，非標準胺基酸(例如D胺基酸)可於合成期間摻 10 混入胺基酸序列，而其它實施例中，非標準胺基酸可於合 成胺基酸序列後藉改質或藉置換「原先的」標準胺基酸而 導入其中。
使用非標準胺基酸及/或非天然胺基酸，增加結構多樣 化及功能多樣化，如此增加於本發明之結合成員中達成期 - 15望的IL-Π結合性質及中和性質的潛力。此外，業已顯示D ~ 胺基酸及類似物於投予動物體例如人體後，由於有L胺基酸 ® 之多胜肽的活體内分解，故比標準L胺基酸有較佳藥力學輪 廓資料。
攜帶本發明之CDR衍生序列之新穎VH區或VL區可使 2〇 用一個或多個選定之VH基因及/或VL基因之隨機突變來產 生，俾於整個可變功能部位内部產生突變。此種技術由Gram 等人（1992)說明，Gmm等人係使用易生誤差的PCR。於若 干實施例中，於整個可變功能部位或CDR集合中做出一項 或二項胺基酸取代。另一種可使用之方法係於VH基因或VL 53 200815469 基因之CDR區直接突變發生。此種技術係由如作⑽等人 (1994)及 Schier 等人（1996)所揭示。 全部前述技術皆為技藝界所已知，熟諳技藝人士可使 用此種技術來使用技藝界之例行方法而提供本發明之結合 5 成員。 本發明之又一態樣提供一種獲得IL_17之抗體抗原結 合部位之方法，該方法包含藉由提供於此處陳述之¥11功能 部位之胺基酸序列中的一個或多個胺基酸的加成、刪失、 取代或插入，來提供VH功能部位之胺基酸序列變異株之一 10種VH功能部位，視需要可組合如此所提供的¥11功能部位 於一個或多個VL功能部位，測試該¥11功能部位或VH/VL 組合，來識別IL-17之結合成員或抗體抗原結合部位，任選 地有一項或多項功能性質，例如中和IL_17活性之性質。該 VL功能部位具有實質上如本文說明之胺基酸序列。可採用 15類似方法，其中此處揭示之VL功能部位之一個或多個序列 變異株係與一個或多個VH功能部位組合。 如前文說明，實質上如此處陳述之CDR胺基酸序列可 呈CDR攜帶於人抗體可變功能部位或其實質部分。實質上 如此處陳述之HCDR3序列表示本發明之實施例，其各自可 2〇呈HCDR3攜帶於人重鏈可變功能部位或其實質部分。 本發明使用之可變功能部位可由任何生殖系列或重排 後的人可變功能部位獲得或衍生，或各個功能部位可為基 於已知人可變功能部位之同位序列或實際序列之合成可變 功能部位。可變功能部位可由非人抗體所導出。本發明之 54 200815469 CDR序列（例如CDR3)可使用重組圓八技術而導入缺乏 CDR之各種功能部位(例如CDR3)之全部庫存。例如施咖 等人（1992)敘述製造抗體可變功能部位之全部庫存之方 法，其中針對可變功能部位區之5,端或相鄰於該5,端之同位 5引子係、、° a ▽1^基因之第三框構區的同位引子，來提供缺 CDR3之VH可變功能部位之全部庫存。偷加等人進一步說 明此項庫存如何於特定抗體之CDR3組合。使用類似技術， 本發明之CDR3衍生之序列可與缺CDR3之VH功能部位或 VL功旎部位的全部庫存洗牌，洗牌後的完整乂1^或乂1功能 10部位與同源VL或VH功能部位組合，來提供本發明之結合成 員。然後全部庫存顯示於適當宿主系統諸如WO92/01047之 噬菌體顯示系統中，該案全文以引用方式併入此處，或顯 示於任何隨後大量的參考文獻中，包括Kay，winter & McCafferty (1996)，因此可選擇適當結合成員。全部庫存可 15由1〇4個別成員至例如至少105、至少1〇6、至少1〇7、至少1〇8、 至少10、或至少1〇1()成員所組成。其它適當宿主系統包括 但非限於酵母顯示系統、細菌顯示系統、T7顯示系統、病 毒顯示系統、細胞顯示系統、核糖體顯示系統及共價顯示 系統。 20 類似之洗牌技術或綜合技術也由Stemmer (1994)所揭 示，Stemmer說明有關β-内醯胺酶基因之技術，觀察該辦法 可用於產生抗體。 提供一種製備IL-17抗原之結合成員之方法，該方法包 55 200815469 (a) 提供編碼VH功能部位之起始核酸全部庫存，該VH 功能部位包括欲置換的CDR3，或缺CDRm碼區； (b) 將該全部庫存與本文對VH⑶们實質上陳述之編 碼胺基酸序列之給予者核酸組合，讓該給予者核酸係插入 5全部庫存的CDR3區内部，因而提供編碼VH功能部位之核 酸之產物全部庫存； (C)表現該產物全部庫存之核酸； (d) 選擇IL-17之結合成員；以及 (e) 回收该結合成員或編碼該結合成員之核酸。 1〇 再度，可使用類似方法，其中本發明之VL CDR3係與 編碼VL功能部位之核酸之全部庫存組合，該等核酸包括欲 置換之CDR3或缺CDR3編碼區。
同理，一種或多種CDR或全部三個CDR皆可接枝至VH 或VL功能部位的全部庫存上，然後篩選IL_n用之結合成 15員。 於一個實施例中，可採用親代抗體或抗體2至16、 HCDIU、HCDR2及HCDR3中之一者或多者或親代抗體或抗 體2至16之HCDR集合；及/或可採用親代抗體或抗體2至16
LCDR1、LCDR2及LCDR3或親代抗體或抗體2至16之LCDR 20 集合中之一者或多者。 同理，可採用此處所述之其它VH和VL功能部位、CDR 集合及HCDR集合及/或LCDR集合。 於若干實施例中，實質部分之免疫球蛋白可變功能部 位包含至少三個CDR區’連同其介入之框構區。該部分也 56 200815469 包括第—和第四框構區之任一者或二者之至少約5〇%，該 观為第-框構區之〇端50%及第四框構區之屬娜。於該 I變功能部位之實質部分之N端或c端之額外殘基可為通 常並未與天然可變功能部位區結合的殘基。例如，藉重組 A技術所製作之本發明之結合成員之組成將導致由所導 入之鍵聯基編碼對N端或c端殘基之導入其中，來輔助轉殖 步驟或其它操縱步驟。其它操縱步驟包括導入鍵聯基來接 t本發明之可變魏雜至其它蛋”序列，包括抗體恆 疋區其匕可變功能部位(例如於二元抗體的製造）或可檢測 10標記/功能標記，容後詳述。 雖然於本發明之若干態樣中，結合成員包含一對VH# 能部位*VL功能部位，但基於VH或VL功能部位序列之單 一結合功能部位構成本發明之又一態樣。已知單一免疫球 蛋白功能部位，特別為VH功能部位可以特定方式結合目標 15抗原。例如參考前文有關dAb的討論。 於單一結合功能部位之情況下，此等功能部位可用來 篩檢可形成二功能部位結合成員之互補功能部位來與 IL-17結合。可使用如w〇92/〇! 〇47揭示之所謂的階層式雙重 、、示a辦法’猎嗟痛體顯示糸統師檢方法來達成，該案全文 20以引用方式併入此處，其中含有H鏈純株或L鏈純株之個別 群落用來感染編碼另一鏈(L鏈或Η鏈)之純株的完整存庫， 結果所得二鏈結合成員係根據噬菌體顯示系統技術選出， 諸如於該參考文獻中所述。此項技術也揭示於Marks 1992。 本發明之結合成員進一步包含抗體恆定區或其部分， 57 200815469 例如人抗體恆定區或其部分。例如VL功能部位可於其c端 附接至包括人Ck或CX鍵例如(ϋλ鍵之抗體輕鍵怔定功能部 位。同理，基於VH功能部位之結合成員可於C端附接至由 任何抗體同功型例如IgG、IgA、IgE及IgM及任何同功型亞 5類’特別為IgGl及IgG4所衍生之免疫球蛋白重鏈之全部或 #为（例如(3111功能部位）。坨01由於其效應物功能及容易製 造故為較佳。任何具有此等性質且可穩定可變區之合成變 異株或其它恆定區變異株皆可用於本發明之實施例。 本發明之結合成員可以可檢測標記或功能標記標示。 10 標記可為可產生信號或經過誘導來產生信號之任何分子， 包括但非限於螢光劑、放射性標記、酶、化學冷光劑或光 敏化劑。如此，經由檢測螢光或冷光、放射性、酶活性或 吸光比可檢測及/或測量結合。 適當標記舉例言之但非限制性，包括酶諸如鹼性磷酸 15酶、葡萄糖-6-磷酸去氫酶（「G6PDH」）及辣根過氧化酶； 染料；螢光劑例如螢光素、若丹明化合物、藻紅素、藻青 素、別藻青素、鄰苯二甲醛、螢光胺、螢光基團諸如鑭系 元素穴合物及螯合物（伯金踅瑪公司（Perkin Elmer)及CIS生 物國際公司（Cis Biointernational));化學冷光劑諸如等冷光 20 醇(isohiminol);敏化劑；輔酶類；酶基質類；放射性標記 包括但非限於 125I、131I、35S、32P、14c、3II、57Co、99Tc及 7 5 S e及此處所述其它放射性標記；粒子諸如乳膠粒子或碳粒 子；金屬溶膠；結晶體，微脂粒；細胞等，進一步可以染 料、催化劑或其它可檢測基團標記。適當酶及輔酶係揭示 58 200815469 於Litmari等人U.S· Pat· No· 4,275，149，及B0gUSlaski等人u.S·
Pat. No· 4,318,98〇，各案全文以引用方式併入此處。適當瑩 光劑及化學冷光劑係揭示於Litman等人U.S. Pat. No. 4,275，149，該案全文以引用方式併入此處。標記進一步包 5括化學部分諸如生物素，其可透過結合至特定同源可檢測 部分例如加標記的抗生物素或鏈絲菌抗生物素來檢測。可 檢測標§己可使用技藝界已知之習知化學而附接至本發明之 抗體。 有多種方法，標記可藉該方法產生可由外部手段例如 10由視覺檢查、電磁輻射、熱、及化學劑而可檢測之信號。 標記也結合至另一個與本發明之抗體結合的結合成員，或 結合至撐體。 標記可直接產生信號，因此無需額外成分來產生信 號。多種有機分子例如螢光增白劑可吸收紫外光及可見 15光，光吸收可將能量傳遞於此等分子，將分子升高至激發 的能態。然後此種被吸收的能量藉第二波長光的發光來耗 政此種弟一波長杳光也傳遞能量予經標記的接受者分 子所產生的此畺係藉發光例如螢光共振能量傳遞(FRET) 而從接受者分子耗散。其它可直接產生信號的標記包括放 20 射性同位素及染料。 另外，標記可能需要其它成分來產生信號，信號產生 系統包括農生可量測的信號所需的全部成分，該等成分包 括基質、辅酶、促進劑、額外酶、與酶催化產物反應之物 貝、催化劑、活化劑、輔因子、抑制劑、清除劑、金屬離 59 200815469
獲得可檢測及/或可量化的信號。 合物可與下列_合，該等酶諸如過氧化酶、驗性鱗酸酶、 。免疫輛 半乳糖答酶、 水酶、乙醯膽鹼酿 葡萄糖氧合酶、葡萄糖澱粉酶、碳酸脫
根據本毛明之其功能片段，螢光標記特別包括榮光素及其 行生物帛光發色團、若丹明及其衍生物、GFP (GFp表示 綠螢光蛋白」）、丹黃、繳形酮、鑭系元素螯合物、或穴 合物例如鋪等。 15 免疫軛合物或其功能片段可藉熟諳技藝人士已知之方 法製備。可直接或藉間隔基或鍵聯基諸如三聚曱盤，例如 戊二醛、伸乙基二胺四乙酸(EDTA)、二伸乙基-三胺戊乙酸 (PTA)的中71，或於偶合劑諸如前述用於治療性扼合物的 偶合劑存在下，而偶合至酶或偶合至螢光標記。含有螢光 20素型標記之軛合物可經由與異硫氰酸酯反應而製備。其它 免疫軛合物也同樣包括化學冷光標記，諸如冷光醇及二_ σ旦’生物冷光標記諸如蟲螢光素酶及蟲螢光素，或放射性 標記諸如碘123、碘125 '碘126、碘131、碘133、漠77、鉻 99m、銦 in、銦 U3m、鎵67、鎵68、硫35、磷32、碳14、 200815469 氣（氫3)、鉛57、砸75、#了95、釕97、釕 i〇3、釕 105、汞 107、 汞203、錬99m、銶 101、銖 1〇5、銃47、碲121111、碲122111、 碲125m、鉈165、鉈167、鉈168、氟8、釔199。熟諳技藝人 士已知直接或透過螯合劑諸如前述EDTA、DTPA而將治療 5作用之放射性同位素偶合至抗體之方法可用於診斷用之放 射兀素。同樣值得一提藉氯胺T方法以Na [I 125]標記 (Hunter 及 Greenwood 1962)或藉 Crockford 等人使用鉻 99m 標記（美國專利案4,424,20〇，該案全文以引用方式併入此 處），或如Hnatowich所述透過dtpa附接（美國專利案 10 4,479,93〇 ’全文以引用方式併入此處）。額外免疫軛合物包 括毋素刀’例如送自於假單胞桿菌（pseud〇inonas)外毒素 (PE或胞毒性片段或其突變株）、白喉毒素或其胞毒性片段 或突變株、肉毒桿菌毒素八至毒素F、蓖麻毒蛋白或其胞毒 性片段、雞母珠毒蛋白或其胞毒性片段、皂素或其胞毒性 15片段、商陸抗病毒毒素或其胞毒性片段及布里歐素(bryodin) 1或其胞毒性片段。 本發明提供一種方法包含造成或允許如此處提供之結 合成貝結合至IL-17。如前文說明，此種結合可於活體内進 行例如於投予結合成員或編碼結合成員之核酸後進行； 2〇 ^可於試管内進行例如於皿认、西方墨點、免疫細胞化 子、免疫沈澱、親和層析術及基於生物化學或基於細胞的 檢定分㈣如此處所錢行。本發明也提供_採用根據 本發明之結合成員例如用於生物感測器系統來直接測量抗 原含量。 61 200815469 舉例言之’本發明包含一種檢測及/或測量與IL-17結合 之方法’該方法包含⑴暴露該結合成員至IL-17 ;以及(i〇 檢測該結合成員與IL_17之結合，其中該結合係使用此處所 述之任一種方法或可檢測標記檢測。此種及其它此處所述 5之結合檢測方法可藉進行該方法之人員直接解譯，例如經 由目測觀察可檢測標記來解譯。另外，此種方法或此處所 述的任何其它結合檢測方法可以自動放射性照片、照片、 電腦列印、流動細胞計量學報告、線圖、圖表、盛裝結果 的忒官或谷态或孔或任何其它該方法結果之視覺表示或物 10理表示來產生報告。 可測定結合成員與IL-Π之結合量。定量係與試樣中之 抗原數量有關，於診斷上令人感興趣。IL-17結合之篩檢及 /或其定量例如可用於篩檢與IL-17相關聯之疾病或病症的 15 20 ； 諸如於文中它處所述。於一個實施例中，本發明之 ^斷方法包含⑴由個體取得組織或體液樣本；（ii)將該組織 =體液樣本暴露於本發明之一種或多種結合成員；以及⑴i) =成I〜合的IL-17且與對照樣本比較，其中IL_17結合量以對 曰加彳曰不乩-17表現或活性之異常程度。欲試驗之組織 ，本或體液樣本包括血液、血清、尿液、生檢材料、腫瘤 =何其它懷疑含有異常m濃度之組織。經過試驗為異 书_17濃度或活性呈陽性之個體也可由後文揭示之治療 方法獲益。 =者技藝人讀擇舰此處揭示之方法根據其偏好及 曼常識來測定結合成員與抗原結合之適當模型。 62 200815469 樣本中之結合成員之反應性可藉任一種適當手段測 定。放射性免疫檢定分析(RIA)為一種可能辦法。放射性標 記抗原與未經標記的抗原（試驗樣本)混合，讓其與結合成員 結合。結合的抗原與未結合的抗原實體分開，測定結合至 5 結合抗原之放射性抗原量。試驗樣本中之抗原含量愈高， 則放射性抗原結合至結合成貝之量愈少。競爭結合檢定分 析也可用於非放射性抗原，使用鍵聯至通報子分子的抗原 或類似物。通報子分子可為螢光基團、填或雷射染料具有 光譜上分開的吸光特性或發光特性。適當螢光基團包括螢 10光素、若丹名、藻紅素、德州紅、鑭系元素、螯合物或穴 合物。適當產色染料包括二胺基聯苯胺。 其它通報子包括巨分子膠體粒子或微粒狀物質，諸如 有色、磁性或順磁性的乳膠珠粒，以及可直接或間接造成 可檢測信號為可目測觀察、以電子檢測或以其它方式紀錄 15之生物活性劑或化學活性劑。此等分子可為酶，其催化反 應’該反應可顯色或變色，或造成例如電氣性質的改變。 可為为子上可激發，讓能態間的電子變遷，導致特徵性的 光譜吸光或發光。可包括用於結合生物感測器之化學實 體也可使用生物素/抗生物素或生物素/鍵絲菌抗生物素及 20驗性磷酸誨檢測系統。 個別結合成通報子輛合物所產生的信號可用來導 旦4本(正书樣本及試驗樣本)中相關結合成員結合的可 置化絕對資料或可量化相對資料。 匕3根據本發明之任何態樣或實施例之結合成員之一 63 200815469 種套件組也提供作為本發明之一個態樣。於該套件組中 結合成員可加標記來允許其於欲測定之古’ 10 15 20 L今後料。此外，結合成員可附接或可未附接至 >體套件組成分通常為無菌且係置於密封小瓶嘎其a二 器内。套件組可用於診斷分析或結合成員有用之其^各 法。套件組可含錢核分驗—種枝例如根據 之方法之指示。輔助或允許執行此種方法之輔助材料可含 括於本發明之套件組。輔助材料包括第二種不同的結人3 員，該結合成員係結合至第-結合成員，且係輛合至= 測標記(例如螢光標劑、放射性同位素或酶）。基於抗體兔 件組也包含進行免疫沈社珠粒。套件組的各個成分= 係置於其本身的容㈣。如此’料套件組通常包含適I 用於各個結合成員之分開的容器。此外，套件組包含 檢定分析之指減_與分析由蚊料之錢所得二 之方法之指示。 、 本發明也提更使用如前述結合成員用來於競爭檢定分 析中敎抗原含量，換言之’經由採用本發明所提供之二 合成員於競爭檢定分析，用來測定樣本中之抗原人旦之方 法。可能為無需實體分離結合的抗原與未結合的抗原之: 通報子分子鍵聯至結合成員，而於結合出現物理變化或光 學變化屬於其中-項可腿。魏子分子可直接或間接產 生可檢測的信號，可檢測的信號可經量化。通報子分子 例如透過胜肽鍵結直接或間接共價鍵結，或非共價鍵,。 透過胜肽腦讀聯可能為㈣_及她付子融切 64 200815469 行重、组表現所得結果。 舉例言之，本發明包括一種識別„^17結合化合物之方 匕含⑴將IL-17制動於撐體；（ϋ)讓該經過制動之江_17 Z時或以逐步方式而與根據本制之至少—賴標鐵或經 5 =的結合成員及—種或多種未經標籤或未經標記之試驗 結合化合物接觸；以及(iii)經由觀察來自於加標簸之結合成 員之結合標籤量減少，而識別新穎IL_17結合化合物。 。另一種識別1 L-17結合化合物之方法包含⑴將結合成 員制動於一撐體；（ii)讓該經過制動的結合成員同時或以逐 V方式而與加標籤之IL_17& _種或多種未加標籤或未經 軚不之試驗結合成員或結合化合物接觸；（iii)經由觀察來自 於加標籤IL_17之結合標籤量的減少，來識賴穎IL_n結合 化合物。 此種方法可使用多孔格式或陣列格式以高通量方式執 仃。此等檢定分析也可如實例2所述。於溶液中例如呈htrf 檢定分析執行。例如參考U.S· 5,814,468，該案全文以引用 方式併入此處。如前述，結合之檢測可由執行該方法之人 員直接進行，例如經由視覺觀察可檢測標記或觀察其存在 2〇的減少來進行。另外，本發明之結合方法可產生呈自動放 20射性攝影、照片、·電腦列印、流體細胞計數報告、線圖、 圖表含有結果之試管或容器或孔或任何其它該方法結果 之視覺呈現或實體呈現之形式之報告。 只兄爭檢疋分析也可用於同位素映射。於一個例中，同 位素映射可用來識別由IL-Π結合成員所結合之同位素，該 65 200815469 IL-17結合成員視需要可有最佳化中和特徵及/或調節特 性。此種同位素可為線性或可為隨形。隨形同位素包含至 少兩個不同的IL-17片段，其中當iL_17摺疊成其三級結構或 四級結構來形成可由IL-17抑制劑諸如IL_17結合成員所辨 5識之隨形同位素時，該等片段之位置彼此鄰近。於試驗競 爭性時’可使用抗原之胜肽片段，特別為包括感興趣之同 位素或主要係由感興趣之同位素所組成之胜肽片段。有同 位素序列加上一個或多個胺基酸於任一端之胜肽也可使 用。根據本發明之結合成員為其對抗原之結合係受到帶有 10 或包括所給定之序列之胜肽所抑制。 本發明進一步提供編碼本發明之結合成員之離體核 酸。核酸包括DNA及/或RNA。於一個態樣中，本發明提供 編碼CDR或CDR集合或VH功能部位或VL功能部位或抗體 抗原結合部位或抗體分子例如如前文定義本發明之s c F v或 15 IgG如IgGl之核酸。 本發明也提供包含至少一種如前述之多核苔酸之呈植 體、載體、轉錄卡匣或表現卡匣形式之構築體。 本發明也提供包含一種或多種如前述構築體之重組宿 主細胞。編碼任何CDR或CDR集合或VH功能部位或VL功能 20部位或抗體抗原結合部位或抗體分子例如前文提供之scFv 或IgGl之核酸構成本發明之一個態樣，如同編碼產物之製 造方法構成本發明之一個態樣，該方法包含由編螞核酸表 現。方便地經由於適當條件下培養含有核酸之重組宿主細 胞來達成表現。藉表現VH功能部位或V或結合成員製造 66 200815469 或純化，然 後，結合㈣可仙任何適當技術_單離及/ 後視需要而使用。 根據本發明之__職RNA，可為 ㈣合成。述及前述之核⑽序列，涵蓋有指定相之〇= 文 刀子’涵盍有規定序列之歷分子其㈣取代(除非 有其它要求）。 '
又另一態樣提供—種製造抗體VH可變功能部位 法，該方法包含由編碼核酸表現。此種方法包含於該抗體 VH可變功能部位之製造條件下培養宿主細胞。 10 VH可變功能部值之類似製法其包含VH及/或凡功能 部位之結合成員之類似製法提供作為本發明之又一態樣。 一種製法包含產物之單離及/或純化。_種製法包含將 產物調配入包括至少一種額外成分諸如藥學上可接受之賦 形劑之組成物。 15 於多種不同宿主細胞轉殖及表現多胜肽之系統為眾所 周知。適當宿主細胞包括細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、 有纖毛真菌、酵母菌及棒狀病毒系統及轉移基因植物及轉 移基因動物。抗體及抗體片段於原核細胞中之表現為技藝 界所明確確立。有關其綜論例如可參考pmckthmi 1991。常 2〇用細菌宿主為大腸桿菌。 於培養中之真核細胞中之表現也可由熟諳技藝人士用 作為製造結合成員之選項，例如Chadd & Chamow (2001)、 Andersen & Krummen (2002)、Larrick & Thomas (2001)。技 藝界可用來表現非同質多胜肽之哺乳動物細胞系包括中國 67 200815469 倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、嬰倉鼠腎細胞、NS0小鼠 黑素瘤細胞、YB2/0大鼠黑素瘤細胞、人胎腎細胞、人胎視 網膜細胞及多種其它細胞。 適當載體可經選擇或構築，含有適當調節序列，包括 5 啟動基因序列、終結基因序列、多腺苷化序列、促進基因 序列、標記基因及其它視需要而使用之序列。若屬適當， 載體可為植體例如嗟菌體、或病毒例如病毒嗟菌體。進一 步細節可參考Sambrook & Russell (2001)。已知操作核酸之 技術及方案例如用於核酸構築體之製備、突變、定序、將 10 DNA導入基因及基因表現及蛋白質之分析細節係說明於 Ausubel 1999。 本發明之又一態樣提供一種如此處揭示之含核酸之宿 主細胞。此種宿主細胞可於試管或可於培養。此種宿主細 胞也可於活體。活體内存在有各宿主細胞允許本發明之結 15合成員之胞外表現為「胞内體」或「胞内抗體」。胞内抗體 可用於基因治療。 又另一態樣提供一種包含將本發明之核酸導入宿主細 胞之方法。導入可採用任一種技術。用於真核細胞的導入 技術包括磷酸鈣轉移感染、DEAE-葡萄聚糖、電穿孔、微 20脂粒媒介之轉移感染及使用反錄病毒或其它病毒例如牛痘 病毒之轉導；或用於感染細胞使用棒狀病毒。將核酸導入 宿主細胞特別為真核細胞可使用基於病毒之系統或基於植 體之系統。植體系統可以附加體方式維持，或植體系統可 結合入宿主細胞或結合入人造染色體。結合可經由一個或 68 200815469 多個複本隨機整合或靶定整合於一個或多個位置來達成。 對細囷細胞而言，適當技術包括氯化鈣轉形、電穿孔及使 用噬菌體轉移感染。 導入可接著為造成核酸的表現或允許核酸的表現，例 5如經由於基因表現條件下培養宿主細胞來讓基因表現。表 現產物之純化可藉熟諳技藝人士眾所周知之技術而達成。 於一個實施例中’本發明之核酸係整合入宿主細胞的 基因體(例如染色體）。可經由根據標準技術，含括可促進於 0 基因體重組的序列來促進整合。 10 本發明也提供一種包含使用如前述之構成體於一表現 系統來表現如前述之結合成員或多胜肽之方法。 本發明之結合成員係設計來用於人體或動物體例如人 體之診斷或治療方法。舉例言之，結合成員可用於診斷或 治療IL-17相關疾病或病症，其實例述於文中它處。 _ 15 本發明之結合成員可用於治療或診斷之疾病之其它實 例包括： • h呼吸道：呼吸道阻塞疾病包括：氣喘，包括支氣管氣 喘、過敏性氣喘、内因性氣喘、外因性氣喘、運動誘發氣 喘、藥物誘發（包括阿斯匹靈誘發及奶細誘發)氣喘及灰塵 2〇誘舍氣％，包括間歇氣喘及持續性氣喘以及全部嚴重度之 氣喘，及其它呼吸道高度反應性的起因；慢性阻塞性肺疾 (COPD) ’支氣g炎’包括傳染性支氣管炎及嗜伊紅血球性 ，氣管炎;肺氣腫;支氣管擴張;囊性纖維化；肉狀瘤病; 農夫肺及相關疾病；過敏性肺炎；肺纖維化，包括原因不 69 200815469 明的纖維化肺泡炎、特發性間質性肺炎、抗腫瘤治療及慢 性感染併發纖維化，包括結核病及黑麴菌病及其它真菌感 染併發纖維化；肺臟移植併發症；肺血管床之血管病症及 血栓病症，及肺性高血壓；止咳作用活性，包括治療與呼 5 吸道的發炎病症及分泌病症所引起的慢性咳漱，及幻咳； 急性鼻炎及慢性鼻炎，包括藥物性鼻炎及血管運動型鼻 炎；常年性過敏性鼻炎及季節性過敏性鼻炎，包括神經性 鼻炎(枯草熱）；鼻息肉；急性病毒感染，包括感冒，以及因 呼吸道融合病毒、流感病毒、冠狀病毒（包括SARS)及腺病 10 毒所引發的感染； 2.骨骼及關節：與骨關節炎/骨關節病相關聯或包括骨 關節炎/骨關節病之關節炎療，包括原發性及繼發於例如先 天性臀部發育不良之關節病；頸椎炎及腰椎炎，及下背痛 及頸痛，類風濕性關郎炎及史提爾氏病（Still’s disease);血 15 清反應陰性脊椎關節病變包括僵直性脊椎炎、乾癖性關節 炎、反應性關節炎、及未分化之脊椎關節病變；壞死性關 節炎及其它感染相關之關節病變及骨病症，諸如結核包括 波特氏病（Potts’ disease)及旁賽特氏症候群（poncet，s syndrome);急性及慢性晶體誘發滑液炎包括尿酸炎性痛 20 風、焦填酸約沈積病及填灰石約引起的肌腱、滑囊及滑液 發炎；貝歇特氏病（Behcet’s disease);原發性及繼發性修格 連氏症候群(Sjogren’s syndrome);系統性硬化及限制性硬 皮病；系統性紅斑性狼瘡、混合型結締組織病及未分化之 結締組織病；發炎型肌病變，包括皮肌炎及多發性肌炎； 70 200815469 風濕性多發性肌痛；幼年型關節炎，包括任一種分布於關 節且與關節相關之症候群之特發性發炎性關節病、及風濕 熱及其系統性併發症；血管炎疹包括巨細胞動脈炎、高安 氏動脈炎（Takayasu’s arteritis)、恰吉_史特斯症候群
5 (Churs-strauss syndrome)、結節性多發性動脈炎、以及病毒 感染、過敏反應、冷凝球蛋白、及副蛋白所引起的血管炎 疹；下背痛；家族性地中海型熱、馬可_威爾斯症候群 (Muckle-Wells syndrome)及家族性愛爾蘭熱、菊池病 (Kikuchi disease);藥物誘發之關節痛、腱炎療、及肌病變； 10 3·由於受傷例如運動傷害或疾病造成的肌肉骨骼病變 之疼痛及結締組織重建·關節炎療(例如類風濕性關節炎、 骨關節炎、痛風性或晶體性關節病變）、其它關節疾病（諸如 椎間盤退化或顳顎關節退化）、骨骼重建病（諸如鬆骨病、班 吉特氏病(Paget’s disease)或骨壞死）、多發性軟骨炎、硬皮 15病、混合型結締組織病、脊椎關節病變、或牙周病（諸如牙 周炎）； 4·皮膚：乾癬、異位性皮炎、接觸性皮炎或其它濕疹 性皮炎、及延遲型過敏反應；植物性皮炎及光皮炎；脂漏 性皮炎、瘤療樣皮炎、扁平苔癣、硬化與萎縮性苔蘚、壞 20疽性膿皮病、皮膚肉狀瘤病、圓盤型紅斑性狼瘡、天皰疫、 類天皰瘡、大泡性表皮鬆解症、蓴麻療、血管水腫、血管 炎疹、毒性紅斑、表皮嗜伊紅血球增多、矢狀禿、雄性禿、 史威特氏症候群(Sweet’s syndrome)、偉伯克利斯、、 (Weber-Christian syndrome)、多形性紅斑；蜂惫 ；傧释 萬級織炎，包 71 200815469 括感染性及非感染性蜂窩組織炎；脂肪層炎；表皮淋巴瘤、 非黑素瘤皮膚癌及其它發育不良病灶；藥物誘發之病病’ 包括固定型藥物疹； 5·眼部：瞼緣炎；結膜炎包括長年型及春天型過敏性 5結膜炎；虹膜炎；前葡萄膜炎及後葡萄膜炎；鞏膜炎；影 響視網膜的自體免疫病、退化病或發炎病症；眼炎包括交 感神經性眼炎；肉狀瘤病；感染包括病毒性、真菌性、及 細菌性感染； 6·胃腸道：舌炎、齒齦炎、牙周病；食道炎包括回流 1〇 性食道炎；嗜伊紅血球增多性腸胃炎、肥大細胞病、克隆 氏病（Crohn’s disease)、結腸炎例如潰瘍性結腸炎、直腸炎、 肛門搔癢；腹腔病、激躁性腸症候群、及具有腸遠端效應 的食物引發的過敏(例如偏頭痛、鼻炎、或濕疹）； 7.腹部：肝炎’包括自體免疫性肝炎、酒精性肝炎及 15 病毒性肝炎；肝纖維化及肝硬化；膽囊炎；胰炎，包括急 性及慢性； 8·生殖泌尿道：腎炎，包括間質性腎炎及腎小球腎炎； 腎病症後群；膀胱炎，包括急性膀胱炎及慢性（間質性)膀耽 炎及亨能氏潰瘍(Hunner’s ulcer);急性尿道炎及慢性尿道 2〇炎、攝護腺炎、副睪炎、卵巢炎及輸卵管炎；外陰陰道炎； 裴洛尼氏病（Peyronie’s disease);勃起功能障礙（包括男性及 女性）； 9.同種異體移植片排斥：諸如於腎、心、肝、肺、骨 髓、皮膚或眼角膜移植後之急性排斥和慢性排斥，或輪血 72 200815469 後的急性排斥或慢性排斥；或慢性移植片對宿主病；
10·中枢神經系統(CNS):阿兹海默氏病（Alzheimer，s disease)及其它癡呆病症包括庫賈氏病（狂牛病、cjd)及 nvCJD;類澱粉蛋白病；多發性硬化及其它脫趙鞠症候群； 腦動脈粥狀硬化及血管炎；顳動脈炎；重症肌無力；急性 疼痛和慢性疼痛（急性、間歇性、或持續性，包括中樞來源 或周邊來源的疼痛），包括内臟痛、頭痛、偏頭痛、三叉神 經痛、非典型顏面疼痛、關節及骨痛、因癌症及腫瘤侵襲 所導致的疼痛、神經病變疼痛症候群包括糖尿病性神經病 變、疱疹後神經病變、及HIV引發之神經病變；神經肉狀瘤 病；惡性病、傳染病、或自體免疫病之中樞神經系統及周 邊神經系統併發症； 11·其它自體免疫病症及過敏病症包括橋本氏甲狀腺 炎、葛雷夫氏病（Graves，disease)、愛迪森氏病（Addis〇n，s 15 disease)、糖尿病、特發性血小板缺乏性紫瘢、嗜伊紅血球 性肌膜炎、IgE過高症候群、抗磷脂質症候群； 12.其它帶有發炎成分或免疫成分之病症；包括後天免 疫缺乏症候群（AIDS)、麻風、希哲瑞症候群（Sezary syndrome)、及腫瘤相關症候群； 20 心血管方面：動脈粥狀硬化，影響冠狀循環及周邊 循環；心包炎；心肌炎，發炎性心肌病變、及自體免疫性 心肌病變，包括心肌肉狀瘤；缺血後再灌流傷害；心内膜 炎、心臟瓣膜炎、及主動膜炎包括傳染性(例如梅毒性）；血 管炎疹；近端靜脈及周邊靜脈病症，包括靜脈炎及血栓， 73 200815469 包括深部靜脈血检、及靜脈曲張併發症，以及 14.腫瘤：治療常見癌症，包括攝護腺癌、乳癌、肺癌、 卵巢癌、胰癌、大腸及結腸癌、胃癌、皮膚癌及腦癌以及 影響骨髓（包括白血病）及淋巴增殖系統的惡性病，諸如何杰 5 金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤；包括轉移癌及腫瘤復 發、以及腫瘤相關症候群的預防及治療。 如此，本發明之結合成員可用作為治療劑用於治療涉 及畸變IL-17表現及/或活性之疾病。其中一個實施例為一種 治療方法，包含將有效量之本發明之結合成員投予有需要 10 之病人，其中降低IL-17之畸變表現及/或活性。其中另一個 實施例為一種治療方法，包含⑴例如使用前述診斷方法， 識別驗證畸變IL-17程度或活性之病人；以及(ϋ)將有效量之 本發明之結合成員投予該病人，其中IL-17之畸變表現及/ 或活性降低。根據本發明之有效量為可降低IL-17之畸變表 15現及/或活性，因而減少或減輕接受治療之特定疾病或病症 之至少一種症狀的嚴重程度，但非必然治癒該疾病或病 症。如此，本發明之一個實施例為一種治療或減輕此處所 述任一種疾病之至少一種症狀之嚴重程度之方法，包含對 有需要之病人單獨投予有效量之一種或多種本發明之結合 20成員，或與技藝界已知之或此處所述之另一種適當藥物呈 組合治療計畫投予，讓任一種病症之至少一種症狀的嚴重 程度減輕。其中本發明之另一個實施例為一種拮抗IL-17之 至少一種效應之方法，包含接觸或投予有效量之一種或多 種本發明之結合成員，因而拮抗几_17之至少一種效應，例 74 200815469 如IL-17結合至IL-17RA之效應 之釋放。 或下游效應諸如細胞激肽 如此，本發明之其它方面提供治療方法，包含投予如 本發明所提供之結合成員，包含此種結合成員之藥學组成 5物，以及使用此種結合成員製造投予藥物之用途，例如用 於製造藥物或藥學組成物之方法，包含將該結合劑鱼藥學 上可接受之賦形劑調配。藥學上可接受之賦形劑可為化人 物或化合物之組合形成為藥學组成物，不會激發繼發反 應，例如允許辅助活性化合物的投予、延長其使用壽命及/ !〇或提高於體内之功效、增加於溶液之溶解度或改良直保留 性。此等藥學上可接受之载媒劑為眾所周知，且由熟諸技 藝人士依據所選用之活性成分之本質及好模式調整。 本發明之結合成員通常係呈藥學組成物形式投予，組 成物除了結合成員之外可包含至少一種成分。如此，根據 15本發明之藥學組成物及根據本發明之用途，除了活性成分 外，包含热諳技藝人士眾所周知之藥學上可接受之賦形 劑、載劑、缓衝劑、安定劑或其它材料。此等材料須為無 毒且不會干擾活性成分之功效。載劑或其它材料之精確性 質將依據投藥途徑決定，投藥可經由口服、吸入、或注射 2〇 例如靜脈注射投予。 口服投藥用之藥學組成物例如奈米級本體等也涵蓋於 本發明之範圍。此等口服調配物可呈鉸劑、膠囊劑、散劑、 液劑或半固體形式。錠劑包含固體載劑諸如明膠或輔劑。 液體藥學組成物通常包含液體載劑，諸如水、石蠟、動物 75 200815469 油或植物油石廣油或合成油。生理食鹽水溶液、葡萄糖溶 液或其它醣類溶液或甘醇類諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二 醇也可含括於藥學組成物中。 供靜脈注射或患病部位注射之用，活性成分將呈腸道 5外可接受之水溶液形<，其為不含熱原、，有適當pH、等張 性及安定性。熟諳技藝人士可準備例如使用等張載媒劑諸 如氯化鈉注射液、林格氏注射液、乳酸化林格氏注射液來 製備適當溶液。視需要可使用保藏劑、安定劑、緩衝劑、 抗氧化劑及/或其它添加劑，包括緩衝劑諸如磷酸鹽、檸檬 1〇酸鹽、組織胺及其它有機酸類；抗氧化劑諸如抗壞血酸及 蛋胺酸，保藏劑(諸如十八烧基二甲基罕基氯化銨；氯化六 甲錄i ’氣化卞烧錄I、氯化午乙鐵；紛、丁醇或午醇；對經基 苯甲酸烷酯類諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；兒茶酚；對 苯二酚；環己醇；3，-戊醇；及間甲酚）；低分子量多胜肽類； 15蛋白質諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白類；親水聚合 物諸如聚乙烯基咄咯啶酮；胺基酸類諸如甘胺酸、麵胺、 天冬醯胺類、組織胺、精胺酸或離胺酸，·單餹類、雙醣類 及其它碳水化合物類包括葡萄糖、甘露糖或糊精類；螯合 劑諸如EDTA;糖類諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖 20醇；形成鹽之抗衡離子諸如鈉；金屬錯合物(例如鋅_蛋白質 錯合物）；及/或非離子界面活性劑諸如呑恩(TWEEN)、普隆 尼克(PLURONICS)或聚乙二醇(PEG)。 依據分子的物化性質及輸送途徑，本發明之結合成員 可調配成液體、半固體或固體形式。調配物包括賦形劑或 76 200815469 賦形劑之組合例如：糖類、胺基酸類及界面活性劑類。液 體調配物包括寬廣之抗體濃度之pH。固體調配物可藉;東 乾、噴乾、或超臨界流體技術乾燥而製造。anti-U7調配 物將依據期望之輸送途徑決定：例如經肺輸送之調配物可 m 5 包含粒子，粒子具有物理性質可確保於吸入時可穿透入肺 * 臟深部；局部調配物包括黏度改性劑，黏度改性劑可延長 藥物駐留於作用部位的時間。於若干實施例中，結合成員 可使用將保護結合成員不會快速釋放之載劑製備，諸如控 _ 制釋放調配物，包括植體、經皮貼片、及微包囊輸送系統。 10 可使用可生物分解之生物相容性聚合物，諸如乙稀乙酸乙 稀酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸g旨類及聚乳 酸。多種此等調配物之製備方法為熟諳技藝人士眾所周 知。例如參考Robinson，1978。 使用本發明之結合成員進行Anti-IL-17處理可經口投 - 15予(例如奈米級本體)藉注射投予（例如皮下、關節内、靜脈、 - 腹内、動脈内或肌肉注射投予）、藉吸入投予、藉膀胱内途 ® 徑投予（滴注入膀胱）、或局部投予（例如眼内、鼻内、直腸、 傷口内、皮膚上）。處理可藉脈衝式輸注投予，例如使用遞 減劑量之結合成員投予。投藥途徑可由處理之物理化學特 20性、疾病之特殊考量、或最佳化功效或減少副作用等要求 來決疋。一種特殊投藥途徑為靜脈投藥。另一種投予本發 明之藥學組成物之途徑為皮下投藥。預期anti_IL_17處理並 非限於於診所内使用。因此以使用無針注射裝置之皮下注 射為佳。 77 200815469 組成物可單獨投予或於另一 另—種治療劑呈組合製劑投 依據欲治療之病情而定，組成 種治療同時或循序投予，或與另_ 〇
根據本發明之結合成M可與下列_中之_者或多者 細胞激素功能拮抗劑（例如作用於細胞激素發訊路徑 之作用齊！，諸如S0CS系統調控劑干擾素、卜干擾 素、及γ_干擾素，·仿胰島素生長因子地即叫、其受體及 相關聯之結合蛋白質；介白素(il)例如m33中之一者 !5或多者，及/或介白素拮抗劑和介白素抑制劑諸如阿納金拉 (anakinra);介白素家族成員受體抑制劑、或此等受體之特 異性亞單位抑制劑；腫瘤壞死因子a(TNF-a)抑制劑，諸如 抗NF單株抗體（諸如音菲喜麥扣打;阿達里牧麥 (adalimUmab)、及CDP_870)，及/或TNF受體拮抗劑，例如 免疫球蛋白刀子（諸如伊塔那賽(etanercept))，及/或低分子 畺作用背彳，諸如戊氧菲林(pentoxyfylline); B細胞調控劑：例如單株抗體靶定B—淋巴細胞（諸如 CD2〇 (里土希麥）或MRA-aIL16R)或T-淋巴細胞例如 CTLA4-Ig、HuMax Il_i5、或阿巴賽特(Abatacept)); 78 200815469 -抑制破骨細胞活性之調控劑：例如RANKL抗體； 一化學激素或化學激素受體功能調控劑：諸如CCR1、 CCR2、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR5、CCR6、CCR7、 CCR8、CCR9、CCR10及CCR11 拮抗劑（用於C-C家族）； ,5 CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4及 CXCR5 及 CXCR6 拮 抗劑（用於C-X-C家族）；及CX3CR1之拮抗劑用於ox3-c家 族； —基質金屬蛋白酶(MMP)抑制劑，亦即基質溶解素類 肇 （stromelysins)、膠原酶類、及明膠酶類以及凝集 10 酶(aggrecanase);特別為膠原酶-1 (MMP1)、膠原酶-2 (MMP8)、膠原酶-3 (MMP13)、基質溶解素-1 (MMP3)、基 質溶解素-2 (MMP10)、及/或基質溶解素3 (MMP11)及/或 MMP9及/或MMP12，包括諸如去氧環素(doxycycline)等藥 劑； . 15 —白三烯生物合成抑制劑、5-脂氧合酶(5-LO)抑制劑或 5-脂氧合酶活化蛋白質（FLAP)拮抗劑：諸如吉留騰 _ (zileuton) ; ABT-761 ;芬留騰（fenleuton);特波薩林 (tepoxalin);亞伯特（Abbott)-79175 ;亞伯特-85761 ; N-(5-經取代之)-噻吩-2-烷基磺醯胺；2,6-二-第三-丁基酚腙；曱 2〇 氧基四氫哌喃類諸如吉納卡（Zeneca) ZD-2138 ;化合物 SB-210661 ;經吡啶基取代之2-氰基萘化合物諸如 L-739,010 ; 2-氰基喳啉化合物諸如l_746,530 ;或吲哚化合 物及/或喹啉化合物諸如MK-59卜MK-886、及ΒΑΥχ 1005 ; -白三烯類（LT) B4、LTC4、LTD4、及LTE4之受體拮 79 200815469 抗劑：選自於由啡噻畊-3-1諸如L-651，392所組成之組群； 脒基化合物諸如CGS-25019c ;苯并乙二胺類諸如昂塔佐雷 (ontazolast);苯羧醯胺醯亞胺類諸如BIIL 284/260 ;及諸如 雜佛盧卡（zafirlukast)、阿布盧卡（ablukast)、蒙特盧卡 5 (montelukast)、盤盧卡（pranlukast)、沃盧卡（veriukast) (MK-679)、RG_ 12525、Ro-245913、伊拉盧卡(iraiukast) (CGp 45715A)、及ΒΑΥχ 7195等化合物； -磷酸二酯酶(PDE)抑制劑：諸如甲基黃嘌呤包括茶驗 及胺基菲林(aminophylline);及/或選擇性PDE同功酶抑制劑 10 例如PDE4抑制劑、及/或同質異形體PDE4D抑制劑、及/或 PDE5抑制劑； --組織胺I型受體抬抗劑：諸如希提里金(cetirizine)、洛 拉塔丁（loratadine)、德洛拉塔丁（desloratadine)、菲索菲納 丁（fexafenadine)、阿里法斯汀（acrivastine)、妥菲納丁 15 (terfenadine)、阿特米佐（astemizole)、阿茲雷汀（azelastine)、 雷佛卡巴、;丁（levocabastine)、 克弗尼拉明 (chlorpheniramine)、波美薩金（promethazine)、赛克里金 (cyclizine)、及/或米佐雷、;丁(mizolastine)(通常係經口、經局 部或經腸道外投藥施用）； 2〇 —質子幫浦抑制劑（諸如歐美帕佐（omeprazole))或胃保 護性組織胺2型受體拮抗劑； 一組織胺4型受體拮抗劑； --α-1/α-2腎上腺素受體激動劑、血管縮窄劑、擬交感 神經作用劑：諸如波皮海塞真(propylhexedrine)、菲尼雷芙 80 200815469 林(phenylephrine)、苯丙醇胺、麻黃素、假麻黃素、納法佐 林（naphazoline)鹽酸鹽、歐喜塔佐林（oxymetazoline)鹽酸 鹽、特徹贺佐林（tetrahydrozoline)鹽酸鹽、希洛塔佐林 (xylometazoline)鹽酸鹽、徹瑪佐林(tramazoline)鹽酸鹽及乙 、 5 基正腎上腺素鹽酸鹽； a —抗膽鹼激性劑，例如蕈毒鹼受體(Ml、M2、和M3) 拮抗劑：諸如阿托平（atrOpine)、莨菪驗、葛來可洛雷 (glycopyrrrolate)、伊珀徹平（ipratropium)溴化物、提歐徹平 φ (ti0tr0Pium)溴化物、歐喜徹平(oxitropium)溴化物、匹蘭哲 10 平(pirenzepine)及特蓮哲平(telenzepine); --β腎上腺素受體激動劑（包括β受體亞型1_4):諸如伊 索沛納林(isoprenaline)、沙布塔摩(salbutamol)、佛摩特洛 (formotero1)、沙美特洛（salmeterol)、特布塔林(terbutaline)、 偶希沛納林(orciprenaline)、比托特洛(bit〇lter〇1)曱績酸鹽、 . 15 及/或拍布特洛(pirbuterol)例如其對掌對映異構物。 —口兑酮：諸如克摩乙醇酸(cromoglycate)鈉及/或尼多克 馨 迷(nedocromil)鈉； —糖皮質激素：諸如芙尼索賴（flunisoiide)、翠安喜諾 隆（triamcinolone)丙酮化物、貝克美沙松(bed〇methas〇ne) 20二丙酸鹽、布迪索奈（budesonide)、芙提卡松(fluticasone) 丙酸鹽、希克索奈(ciclesonide)及/或摩美特松(m()metasone) 糠酸鹽； -細胞核激素受體調控劑：諸如PPAR ; -免疫球蛋白（Ig)或Ig製劑或調控Ig功能之拮抗劑或抗 81 200815469 體·諸如抗IgE (例如歐瑪里足瑪（〇maiizumab)); ―其它系統施用的或局部施用的抗炎劑：諸如沙利竇邁 (thalidomide)或其衍生物、維生素a酸、迪司拉諾(dithranol) 及/或卡希波翠歐(calcipotriol); 5 —胺基水揚酸鹽及績基吼σ定之組合··諸如沙法塞拉金 (sulfasalazine)、美塞拉金（mesaiazine)、巴塞拉載 (balsalazide)、及歐塞拉金(〇isaiazjne);以及免疫調控劑諸 如硫嘌呤類及皮質類固醇諸如布迪索奈之組合； ―抗菌劑諸如青黴素衍生物、四環素、巨環抗生素、β 10内醯胺抗生素、氟喳喏酮、美車尼達佐(metronidazole)、及 /或吸入型胺基糖苷；及/或抗病毒劑例如阿賽克佛 (acyclovir)、芳希克佛（fanicid〇vir)、法拉希克佛 (valaciclovir)、甘希克佛（ganciclovir)、希多芙佛 (cidofovir)、阿滿塔定（amantadine)、里滿塔定 15 (rimantadine)、里巴維潤（ribavirin)、紮納瑪佛（zanamavir)及 /或歐綏塔瑪佛（oseltamavir);蛋白酶抑制劑諸如印迪納佛 (indinavir)、拿菲納佛(neifinavir)、里托納佛(rit〇navir)、及 /或沙葵納佛(saquinavir);核苷反錄酶抑制劑諸如迪達諾辛 (didanosine)、拉米弗定（lamivudine)、史塔弗定（stavudine)、 2〇紮希塔賓(zalcitabine)或吉多弗定(zidovudine);非核苔反錄 酶抑制劑諸如尼維拉平(nevirapine)、伊法維蘭（efavirenz); —心血管治療劑諸如約通道阻斷劑、β-腎上腺素受體阻 斷劑、升壓素轉換酶(ACE)抑制劑、升壓素-2受體拮抗劑； 脂質下降劑諸如史塔汀(statin)或費布雷特(fibrate);血球型 82 200815469 態調控劑諸如戊氧菲林；錄溶_歧/或抗凝血劑諸如 血小板凝集抑制劑； --CNS作用劑：諸如抗#劑(諸如舍查林㈣加㈣）、 抗帕金森樂物(諸如帝培尼(deprenyl)、左多巴(L_d^a)、羅 5 皮尼柔（r〇pinirole)、琶米沛梭(PTamipex〇le)、MA0B抑制劑 諸如塞雷金(selegine)、及拉沙吉林(rasagiline)、c〇mp抑制 劑諸如塔斯麻(tasmar)、A-2抑制劑、多巴胺再吸收抑制劑、 NMDA拮抗劑、菸鹼激動劑、多巴胺激動劑及/或神經元氧 化亞氮合成酶抑制劑），以及抗阿茲海默氏藥物諸如多尼培 10 吉（donepezil)、里法提明（rivastigmine)、塔克潤（tacrine)、 COX-2抑制劑、波番托菲林(pr〇pent〇fyliine)、或美崔弗奈 (metrifonate)； —急性或慢性疼痛治療劑：諸如中樞作用止痛劑或周邊 作用止痛劑（例如鴉片類或其衍生物）、卡巴瑪茲平 15 (carbamazepine)、菲尼托音（phenytoin)、法波酸(valpr〇ate) 鈉、阿米翠提林(amitryptiline)或其它抗鬱劑、帕拉希塔摩 (pamcetamol)或非類固醇抗炎劑； -腸道外施用或局部施用（包括吸入型）局部麻醉劑：諸 如利諾卡因（lignocaine)或其類似物； 20 —抗骨質疏鬆劑：例如荷爾蒙製劑諸如拉洛希芬 (raloxifene)、或雙膦酸鹽諸如阿連卓奈(alendr〇nate); —(Ο類胰蛋白酶抑制劑；（ii)血小板活化因子(pAF)拮抗 劑，（ill)介白素轉化酶(ICE)抑制劑；（iv) IMPDH抑制劑；（v) 黏著分子抑制劑包括VLA_4拮抗劑；（vi)組織蛋白酶；（vii) 83 200815469 激酶抑制劑諸如酪胺酸激酶(諸如Btk、Itk、Jak3MAp抑制 诏灵例包括吉菲提尼(Gefitinib)、伊瑪提尼(Imatinib)甲石黃酸 鹽）、絲胺酸/蘇胺酸激酶(諸如MAp激酶抑制劑，諸如p38、 JNK、蛋白質激酶a、b*c或IKK)、或涉及細胞週期調節 5之激酶(諸如週期素(cylin)依賴型激酶）；（viii)葡萄糖-6磷酸 去氫嗨抑制劑；（ix)激肽-B1·或激肽B2·-受體拮抗劑；（”抗 痛風劑例如秋水仙素；（xi)黃嘌呤氧化酶抑制劑例如別嘌呤 醇(allopurinol) ; (xii)利尿劑例如波貝尼希(pr〇benedd)、沙 芬皮拉宗（sulfinpyrazone)或班茲玻瑪隆(benzbr〇mar〇ne); 10 (xm)生長激素分泌類似物；（xiv)轉形生長因子(TGFp); (χν) 血小板衍生生長因子(PDGF) ; (xvi)纖維母細胞生長因子， 諸如鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF) ; (xvii)粒狀細胞巨噬 細胞群落刺激因子(GM-CSF); (xviii)辣椒辣素乳膏劑；（xix) 速激肽(tachykinin) ΝΚ·sub 1 ·及/或NK.sub3 ·受體拮抗劑諸 15 如 NKP-608C、SB-233412 (塔尼坦特（talnetant))、及 / 或 D-4418 ; (XX)彈力蛋白酶抑制劑諸如UT-77及/或ZD-0892 ; (xxi) TNF-α轉化酶抑制劑(TACE); (xxii)誘導氧化亞氮合成 酶(iNOS)抑制劑；或(xxiii)於TH2細胞上表現的化學誘引劑 受體同系分子(諸如CRTH2拮抗劑）；（xxiv) P38抑制劑；（χχν) 20 Toll狀受體(TLR)之功能調控劑，及(xxvi)嗓呤激性受體活性 調控劑諸如P2X7 ;或（xxvii)轉錄因子活化抑制劑，諸如 NFkB、API、及/或 STATS。 抑制劑可為特異性抑制劑，或可為混合型抑制劑，例 如乾定於前述分子（例如受體）或分子類別中之多於一者之 84 200815469 抑制劑。 結合成員也可組合化學治療劑或其它酪胺酸激梅抑制 劑共同投予、或呈免疫軛合物形式使用。抗體片段也可用 於經由重組機轉或生化偶合作用所得之雙重特異性抗體， 5然後將前述抗體之特異性與可辨識涉及IL-17相關聯之活 動中的其它分子之其它抗體特異性相結合。 供治療發炎病之用，本發明之結合成員可與一種或多 種藥劑組合，該等藥劑諸如： 非類固醇抗炎劑(後文稱作為NSAID)，包括非選擇性考 10氧合酶concoxJ抑制劑，包括局部施用或系統性投= (諸如裴洛希康(piroxicam)、待克菲納⑷咖如狀卜丙酸類 诸如納波森(naproxen)、芙比波芬(f]ur|3iprofen)、菲諾波穴 (fenoprofen)、凯托波芬（ketoprofen)及伊布波夂 (ibuprofen)、芬南酸類（fenamates)諸如美菲納米酸 15 (mefenamic acid)、引朵美沙辛（indomethacin)、蘇林達克 (sulindac)、阿哲波帕宗（azapropazone)、0比ϋ坐酮類諸如笨丁 酮、水揚酸類諸如阿斯匹靈(aspirin));選擇性c〇x_2抑制劑 (諸如美洛希康（meloxicam)、希雷可喜(ceiecoxib)、羅菲可 喜（rofecoxib)、法德可喜（valdecoxib)、盧瑪洛可喜 20 (lumar〇coxib)、培瑞可喜（parecoxib)及伊托里可喜 (etoricoxib));環氧合酶抑制性氧化亞氮給予者(cin〇d); 糖皮質激素類（無論藉局部、口服、肌肉、靜脈、或動脈内 途徑投藥），美索崔賽；雷芙諾麥(lefhmomide);經基氯楓； d-青黴胺；歐拉諾芬(auranofin)或其它腸道外金製劑或口服 85 200815469 金製劑，止痛劑；待塞靈(diacerein);關節内治療諸如玻尿 酸衍生物；及營養補充品諸如葡萄糖胺。 本發明結合成員也可組合既有癌症治療劑使用。適宜 之組合使用之治療劑包括： 5 ⑴抗增殖/抗腫瘤藥物或其組合如同用於腫瘤之方式 使用’諸如燒化劑（例如希司_翻、;丁（cis-platin)、卡玻鈾、;丁 (carboplatin)、環磷醯胺、氮芥子氣、梅法連(melphalan)、 克洛蘭布席（chlorambucil)、布沙芳(busulphan)或亞硝基尿 素類）；抗代謝劑(例如抗葉酸鹽諸如含氟嘧啶諸如5_氟尿嘧 10 唆或特佳佛（tegafur)、拉提翠細（ralitrexed)、美索翠賽 (methotrexate)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、羥基尿蚤、真希塔賓 (gemcitabine)或太平洋紫杉醇(paclitaxel);抗腫瘤抗生素(例 如蔥環素(anthracycline)諸如亞里亞黴素(adriamycin)、布里 歐黴素(bleomycin)、多索盧比辛（doxorubicin)、島諾黴素 15 (daunomycin)、艾皮盧比辛（epirubicin)、伊達盧比辛 (idarubicin)、米托黴素（mitomycin)-C、達提諾黴素 (dactinomycin)或米司拉黴素(mithramycin);抗有絲分裂劑 (例如長春花生物驗諸如文克里汀(vincristine)、文布里、汀 (vinblastine)、文德信(vindesine)或維諾瑞賓（vinorelbine)、 20 或類紫杉（taxoid)諸如紫杉醇(taxol)或紫杉礙taxotere));或 拓樸異構酶抑制劑（例如鬼臼毒，諸如伊托波賽 (etoposide)、特尼波賽(teniposide)、安薩克潤(amsacrine)、 托波特肯(topotecan)或喜樹驗）； (ii)細胞抑制劑諸如抗雌激素（例如塔莫希芬 200815469 (tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、拉洛希芬、卓洛希芬 (droloxifene)或伊歐朵希芬(iodoxyfene))、雌激素受體向下 調控劑（例如芙維斯重（fiilvestrant))、抗雄激素(例如比卡盧 塔麥(bicalutamide)、弗塔麥(flutamide)、尼盧塔麥(nilutamide) 5 或賽波特隆(cyproterone)乙酸鹽）、LHRH拮抗劑或LHRH激 動劑（例如句基瑞林(goserelin)、留波瑞林(leuprorelin)或布 塞瑞林(buserelin))、黃體内泌素（例如美結斯綽(111%以打〇1) 乙酸鹽）、芳香化酶抑制劑（例如阿納史绰佐(anastr〇z〇le)、 _ 雷绰佐（letrozole)、佛拉佐（vorazole)或艾克美斯坦 10 (exemestane))或5α-還原酶抑制劑諸如菲納史提賴 (finasteride)； (ni)抑制癌細胞入侵劑（例如金屬蛋白酶抑制劑例如馬 里馬史特(marimastat)或尿激酶胞質素原受體功能抑制劑)； (IV)生長因子功能抑制劑例如：生長因子抗體(例如抗 15 erbb2抗體徹斯土足麥(trastuzumab)、或抗erbb 1抗體賽土希 麥(cetuximab) [C225])、法尼基轉移酶抑制劑、酪胺酸激酶 • 抑制劑、及絲胺酸/蘇胺酸激酶抑制劑、例如表皮生長因子 抑制劑家族[例如E GF R家族酪胺酸激酶抑制劑諸如N _ (3 _氯 -4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-咮琳基丙氧基)喳唑琳冬胺（吉菲 20 尼提(gefitinib)，AZD1839)、N_(3_乙炔基苯基)_6,7_貳(2_甲 氧基乙氧基)σ奎唑琳-4·胺(俄洛提尼(eri〇tinib)，〇SI_774)、 或6-丙烯醯胺基-N-(3 -氣-4-氟苯基)-7-(3-咮啉基丙氧基)喹 唑啉-4-胺(CI 1033)]、例如血小板衍生之生長因子抑制劑家 族、以及例如肝細胞生長因子抑制劑家族； 87 200815469 (V)抗血管生成劑，諸如可抑制血管内皮生長因子之功 效之治療劑（例如抗血管内皮生長因子抗體，貝法希足麥 (bevacizumab)、揭示於WO 97/22596、WO 97/30035、w〇 97/32856及WO 98/13354之化合物，各案全文揭示係以引用 5方式併入此處），以及藉另一種機轉發揮功效之化合物(例如 里諾麥(liiiomide)、接合素ανβ3功能抑制劑、或血管抑制 素）； (vi)血管破壞劑’諸如康柏抑制素(co—retastatin) Α4 及 WO 99/02166、WO 00/40529、w〇 〇〇/41669、w〇 10 01/92224、W〇 02/04434及WO 02/08213揭示之化合物，各 案全文揭示係以引用方式併入此處； (VII)反訊息治療，諸如針對前文列舉之標的之治療劑 諸如 ISIS 2503、anti-ras反訊息； (viii)基因治療辦法，例如置換畸變基因，諸如畸變p53 或畸變BRCA1或BRCA2、GDEPT (基因導向之酶前藥治療) 辦法，諸如使用胞倾去胺酶、胸腺苔激酶或細菌硝基還 原酶之辦法，以及增加病人對化學治療或放射線治療諸如 多重藥物抗性基因治療的耐性之辦法；以及 ⑻免疫治療辦法，諸如活料辦法及活_辦法來提 2〇高病人腫瘤細胞之免疫原性，諸如使用細胞激素諸如介白 素2、介白素4或粒狀細胞·巨嗔細胞群落刺激因子轉移感染 之辦法；減少T細胞無活力之辦法；使用轉移感染免疫細胞 諸如細胞激素轉移感染樹狀細胞之辦法；使用轉移感染免 疫細胞諸如細胞激素轉移感染腫瘤細胞系之辦法；及使用 200815469 抗特應性抗體之辦法。 本發明之結合成員及一種或多種前述額外藥物成分可 用於製造藥劑。藥劑可供分開投予或組合投予個體，如此 藥劑包含結合成員及額外成分呈組合製劑或呈分開製劑。 5分開製劑可用於辅助分開和循序投藥或同時投藥，且允許 藉不同途徑例如經口途徑及經腸道外途徑來投予各種成 分。 根據本發明，所提供之組成物可投予哺乳動物。投藥 係採用「治療上有效量」，此種治療上有效量足夠對病人顯 10示效果。此等效果至少可改善至少一種症狀。實際投藥量 及投藥速率及時程將依據接受治療的疾病本質及疾病嚴重 私度、接叉治療的特定哺乳動物、個別病人的臨床狀況、 病症的起因、組成物之輸送位置、結合成員類型、投藥方 法、投藥計晝、及其它醫事從業人員已知之因素決定。治 15療的處方例如劑量的判定等係屬於一般執業醫師及其它醫 師的責任範圍，治療的處方可依據所治療之症狀嚴重程度 及/或所治療之疾病之進展來決定。適當抗體劑量為技藝界 眾所周知(Ledermann 199^Bagshawe 1991)。可使用此處 指示之特定劑量或對該投予藥劑的類型適當之於「醫師桌 2〇面參考手冊」（2003年)所指*之劑量。本發明之結合成·員之 治療有效量或適當劑量可經由於動物研究模型中比較其試 官内活性及活體内活性來判定。用於小鼠及其它試驗動物 之有效劑量外推至用於人類之方法為已知。射劑量將依 據多項因素決定，該等因素包括抗體係用於診斷、預防、 200815469 或用於治療、欲治療區域的面積或所在位置、抗體的精確 性質（例如全抗體、片段或二元抗體），以及任何附接至抗體 的可檢測標記或其它分子之本質。典型抗體劑量供系統性 投藥係於100微克至丨克之範圍，供局部投藥係於i微克至i 5毫克之範圍。可投予最初較高的載荷劑量，接著為一劑或 多劑較低劑量。典型地，抗體為全抗體，例如IgG1同型基 因。此乃單次用於成年病人治療用量，對兒童及嬰兒可呈 比例調整劑量，也可依據分子量對其它抗體配方呈比例調 整劑Ϊ。依據醫師的裁量，處理可每日、每週兩次、每週 -次或每個月次投予。處理t係藉皮下投藥時可為 每兩週至每四週投予，而靜脈注射時可為每四週至八週投 予。於本發明之若干實施例中，處理可為週期性，投藥間 的週期約為兩週或以上，例如約三週或以上、約四週或以 上、或每個月一次。於本發明之其它實施例中，處理可於 15術4給予及/或於術後給予，也可直接於手術治療的解剖位 置投藥或施用。 實例 實例1 :抗艚朱導單雙_ 1.1選擇 20 轉殖入基於絲狀噬菌體M13之噬菌植體載體中之大型 單鏈Fv (scFv)人抗體存庫用於選擇（Vaughan等人1996，
Hutchings等人2001)。Anti_IL_ 17A特異性scFv抗體係使用大 致上如前文說明之對重組人IL_17A之一連串選擇循環，而 由噬菌體選擇存庫單離(Vaughan等人1996)。簡言之，人 200815469 IL_17A於PBS (杜別可(Duibecco’s) PBS，pH 7.4)於4°C被吸 附於微力價孔板的孔上隔夜。孔以PBS洗滌，然後以PBS-大理石（3% w/v)封阻1小時。經純化之噬菌體於pbs_大理石 (3%w/v)添加至各孔，讓其結合所塗覆的抗原經歷1小時時 5間。未結合之噬菌體使用PBS呑恩(0.1% v/v)及PBS藉一連 串洗滌週期去除。結合的噬菌體粒子經洗提，感染細菌， 準備用於下一回合的選擇(Vaughan等人1996)。 代表性數目之得自第二回合選擇之個別純株生長於96 孔孔板。scFv於細菌周質内表現，於人IL-17受體a檢定分 10析中篩檢其抑制活性。對IL-17A : IL-17RA交互作用呈粗產 物周質萃取物顯示顯著抑制功效之scFv接受DNA定序 (Vaughan 1996’Osbourn 1996)。獨特scFv 再度於細菌表現， 藉親和層析術純化(Bannister等人2006)，於町1^受體-配體 結合檢定分析中，以及於抗人IL_17及抗馬來猴IL_17之 I5 ΗΤ1〇8〇Ι6釋放檢定分析中，經由試驗一系列稀釋的純化 後之scFv來測定IC5G值。 1.2於德菲亞(DELFIA)抗原決定部位競爭檢定分析中 抗體之選擇性及種屬交叉反應性
抗體對IL-17家族成員之種屬交叉反應性及選擇性係 20使用德菲亞抗原決定部位競爭檢定分析來確定，該檢定分 析係經由測量對HIS FLAG IL-17A (於實驗室内由HEK EBNA衍生）結合各個經過制動之anti·；^丨7抗體之抑制作 用。 未加標籤經純化的人IL_17A (於實驗室内由大腸桿菌 91 200815469
(Ε· coli)衍生）、皮波泰克公司（Peprotech))、IL-17C
(R & D系統公司）、IL-17D (皮波泰克公司）、IL-17E (R & D 系統公司）及IL-17F (皮波泰克公司）之滴定係於各次檢定分 析中測試，藉檢定分析之IC5G值來確定IL-17家族成員個別 5 的強度。 IL-17A種屬包括人IL_17A、馬來猴IL-17A (於實驗室中 由大腸桿菌衍生）及鼠IL-17A (R & D系統公司）之滴定係於 各次檢定分析中測定來確立抗體之種屬交叉反應性。 純化後之IgG吸附於96孔美希索（Maxisorp)微力價孔板 10 (囊克(Nunc))上，於磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)，濃度為當生 物素化人IL-17A係於對該特定IgG之約略Kd估值添加時，可 獲得顯著信號。使用PBS-呑恩(0.1% v/v)洗掉過量IgG，各 孔以PBS-大理石（3% w/v)封阻1小時。於pbs準備競爭者（鼠 IL-17A或馬來猴IL-17A或IL-17家族成員）之一連串稀釋 15液，始於生物素化人IL-17A與個別lgG間之交互作用Kd值之 約200倍濃度。未經生物素化之人IL_17A用作為陽性對照。 於此一系列稀釋液中，添加等量濃度約為兩倍d之生物素化 重組人IL-17A (獲得一系列稀釋，始於競爭者抗原：生物素 化人IL-17A之比約等於1〇〇 : 1。然後混合物轉移至經過封 20阻之1§〇上，讓其平衡1小時。未結合的抗原以PBS-呑恩 (0·1%ν/ν)洗掉，剩餘生物素化人IL_17A係藉鏈絲菌抗生物 素-銪3+軛合物(德菲亞檢測，伯金愛瑪公司）檢測。於恩維 森(EnVision)孔板讀取器（伯金愛瑪公司）上測定於62〇奈米 之時間解析螢光。螢光資料被轉成特異性結合百分比（由含 92 200815469 生物化人IL-17A但不含競爭者之對照孔測得loo%，由含生 物化人IL-17A及100倍過量未經生物素化人il_17A之孔測 得0%)。所得資料係使用Prism曲線匹配軟體（葛拉派公司） 分析來測定IC5〇值。由於各種IgG對IL-17A之親和力不同， 5 故使用不同的檢定分析條件，結果係以人IL-17A與競爭抗 原間之IQo值間之倍數差異表示。如此允許比較不同的igG。
表1 : IL-17家族成員及不同IL-17種屬於人IL-17A結合IgG 檢定分析(德菲亞）之強度
IC5〇(nM) 純株名稱 人 IL-17A 鼠 IL-17A 與人IL_17A 之差異倍數 馬來猴 IL-17A 與人IL-17A 之差異倍數 人 IL-17B 至F TINA1 12 98 12 NI NI TINA7 28 NI - 4 0.14 ND TINA10 7 50% - 21 3 NI TINA11 4 NI - 28 7 NI 抗體1 6 NI - 69 11.5 NI TINA21 1 6 NI - 20 3.1 1 NI TINA22 7 NI - 7 1 ND TINA48 9 NI • 7 0.8 NI TINA51 25 35 0.7 NI - NI ND指示未測定、NI指示未抑制。對各個試驗純株，使 10用IL-17B至IL-17F觀察得人IL-17A之結合未受到抑制。 1.3 IL-17A與IL-17受體結合之抑制 選擇輸出係於受體-配體結合HTRF (均質時間解析螢^ 光’ CIS生物國際公司）檢定分析格式中篩檢生物素化人
IL_17A (皮波泰克公司，200-17)或HIS FLAG標籤人IL_i7A 15 (於實驗室中由HEK EBNA所衍生）結合IL_17RA Fc融合蛋 白質(R&D系統公司177-IR)之抑制。全部強度檢定分析中皆 93 200815469 含括參考品anti-IL-17 mAb (生物來源公司）作為陽性對 照。檢定分析方法之細節係提供於檢定分析材料與方法章 即。 由HIS FLAG標籤人IL-17A結合IL-17RA融合蛋白質檢 5 定分析所得之領先scFv強度實例顯示於表2。 表2 :於HIS FLAG IL-17A結合IL-17RAFC檢定分析中之領 先scFv強度之實例 純株名稱 IC50 (nM)於HTRF 檢定分析 純株名稱 IC50(nM)於 HTRF 各定分析 TINA1 213 TINA22 53 TINA7 118 TINA48 57 TINA 10 59 TINA51 80 TINA11 156 TINA55 79 抗體1 12 TINA62 4 TINA21 36 TINA107 25 1.4抗原決定部位結合 領先scFv係於抗原決定部位競爭檢定分析中測試HIS 10 FLAG人IL-17A (於實驗室中由HEK EBNA所衍生）結合抗 人IL-17抗體包括親代抗體1 mAb317 (R&D系統公司）或生 物來源公司mAb之抑制作用。 使用mAb317或生物來源公司mAb之抗原決定部位競 爭檢定分析係涉及3 nM或6 nM anti-IL-17抗體與以XL665 15 標記之20 nM或10 nM抗鼠FC (CIS生物國際公司 61PAMXLB)分別於含有0·4 Μ氟化鉀及0.1% BSA (檢定分 析緩衝液)之50mMHEPES缓衝液中前培養。抗體及XL665 之檢測係於室溫於暗處前培養1小時。用於使用抗體1之檢 定分析，抗體1係直接以六合物（CIS生物國際公司 94 200815469 62EUSPEA)標記，於使用前於檢定分析緩衝液中稀釋500 倍。 並行地，用於使用mAb317或生物來源mAb之檢定分 析，10nM生物素化IL-17A(20nM單體)係與3·2ηΜ鏈絲菌 5 抗生物素穴合物於檢定分析緩衝液中，於室溫於暗處前培 • 養1小時。用於抗體1檢定分析，2 nMHIS FLAG ΙΙ^17Α(4 η Μ單體）係與2 nM以X L6 6 5標記之抗旗標抗體（CIS生物國 際公司61FG2XLB)於檢定分析緩衝液中，於室溫於暗處前 • 培養1小時。 10 反應劑前培養後，10微升經過純化之scFv樣本添加至 384孔低量檢定分析孔板(柯斯塔公司）。接著添加5微升經過 前培養之IL-17抗體及其XL665用於使用mAb317或生物來 源mAb之檢定分析進行XL665的檢測，然後添加5微升人生 物素化IL-17A及穴合物檢測混合物。 — 15 用於抗體1檢定分析，10微升經過純化之SCFv樣本添加 至384孔低量檢定分析孔板，接著添加5微升經過穴合物標 _ 記之抗體卜然後添加5微升HISFLAGIL_17A及XL665檢測 混合物。 檢定分析孔板於室溫於1000 rpm離心1分鐘，然後於室 20溫培養長達4小時，隨後使用恩維森孔板讀取器（伯金愛瑪 公司）讀取於620奈米及665奈米發光波長的時間解析螢光。 計算各樣本之％AF值(CIS生物國際公司），分析資料， 然後用來測定特異性結合百分比。 結果摘述於表3。 95 200815469 表3 :於IL-17A抗原決定部位競爭檢定分析中領先scFv特徵 化之結果之實例 純株名稱 於抗原戎定部位競爭 對下列之抑1 檢疋分 ϊ'ί : 抗體1 mAb 生物 mAb ΤΙΝΑ1 +++ + ΤΙΝΑ7 + + + TINA 10 +++ + TINA11 +++ + +++ TINA12 +++ + ++ΐ " TINA21 +++ ++ 4-++ TINA22 +++ +++ ++ TINA48 +++ + ++4- TINA51 ++ + ++ TINA55 +/- + +++ TINA62 +/- + ++ TINA107 +++ + +++ 抗體 1 (TINA12 IgGl) +++ - +++ mAb 317 (R&D系統公司） +/- +++ +/- 生物來源mAb +++ +/- +++ +++觀察得良好抑制。 + 觀察得不良‘帝j。 5 - 觀察得未抑制。 3次抗原決定部位競爭檢定分析中，觀察到scFv領先群 間有不同抑制程度，指示於該群中部分純株可辨識與其它 scFv略微不同的或重疊的抗原決定部位，或與該檢定分析 10 所使用之mAb略微不同或重疊的抗原決定部位。 1.5 scFv重新格式化成為igGl 經由將VH功能部位及vL功能部位次轉殖入可表現全體 抗體重鏈和輕鏈之載體内，而純株由SCFV轉換成為igGcVH 功能部位係轉殖入載體(PEU15.1)，載體t含有人重鏈恆定功 15能部位及調節元體來於哺乳動物細胞表現全lgG重鏈。同 理，VL功能部位係轉殖入載體(ρΕυ4·4)，載體中含有人輕鏈 96 200815469 (λ)恒定功能部位及調節元體來於哺乳動物細胞表現全IgG輕 鏈。表現重鏈和輕鏈之載體原先係說明於persic等人，1997。 康橋抗體技術公司（Cambridge Antibody Technology)載體係 單純經由導入歐理普元體經過基因工程處理。為了獲得 5 kG，重鏈和輕鏈1gG表現載體轉移感染入EBNA-HEK293哺 乳動物細胞。IgG經過表現且分泌入培養基内。收穫物經過 匯集及過濾，然後純化。IgG係使用蛋白質A層析術純化。培 養上>月液載何於適當尺寸之陶变蛋白質（Ceramic Protein) A (百歐希帕公司（BioSepra))之管柱上，以50 mM Tris-HCl (pH 10 9.0)洗滌。結合的IgG係使用〇·1 Μ檸檬酸鈉(pH 3.0)而由管柱 洗提，藉加入Tris-HCl (pH 9.0)中和。洗提後之材料使用 NaplO管柱（阿莫杉公司（Amersham)，#17-0854-02)經緩衝液 交換入PBS，基於IgG胺基酸序列，使用消光係數以分光光譜 術測定IgG濃度(Mach等人，1992)。使用SEC-HPLC及藉 15 SDS_pAGE，分析純化後IgG之凝集或分解。 1.6 IL-17誘生由HT1080細胞釋放IL-6 為了測定IL-17抑制劑之生物活性，於HT1080人纖維肉 瘤細胞檢定分析中評估scFv及IgG活性。此等細胞係以劑量 相依性方式釋放IL-6來回應於人IL-17。有關檢定分析方法 20 之細節’參考「檢定分析材料及方法」章節。 於本檢定分析中，藉IC5G值測得，一群anti_IL-l7 scFv/IgG之抑制活性係回應於1 nM人IL-17A或1 nM馬來狼 (cyno)非人靈長類IL-17A測定。所得scFv強度及IgG強度顯 示於表4。 97 200815469 表4 :於HT1080檢定分析中之scFv及IgG強度之實例
人 IL-17 Cyno IL-17 純株名稱 scFv抑制 IgG 1C,n rnM) IgG — IC5〇 rnM) TINA1 IA 50%抑制 IA " TINA7 抑制 54±26 (n=3) 155 ±26 (n=3) TINA10 抑制 92±16 (n=2) 216土 188 (n=2) TINA 11 抑制 22±10 (n=6) 172±32 (n=5) 抗體1 抑制 29±11 (n=6) 28±15 (n-5) TINA21 抑制 69±15 (n=3) 33±4 (n=3) TINA22 抑制 17 (n=l) 1 IA NT未測試 IA 無活性 由領先單離所得scFv通常於HT1080檢定分析中產生微 5 弱抑制，故無法測定強度。因此，於HT1080檢定分析中具 有抑制作用之任何scFv被重新格式化成為IgGl，且於檢定 分析再度測試來更準確判定強度，讓純株可被分級。 實_例2 :抗體之最祛仆 2.1親和力熟成 10 領先抗體係使用靶定之突變發生辦法及基於親和力之 噬菌體表現選擇來最佳化。使用如所述(Clacks(m 2004)之標 準分子生物學技術，經由可變重鏈(Vh)及輕鏈(Vl)互補決定 區3 (CDR3)之募核苷酸指導突變發生，形成由領先純株所 衍生而得之大型scFv-噬菌體存庫。存庫接受基於親和力之 15噬菌體表現選擇，來以對IL-ΠΑ之高度親和力選出變異 株。結果，顯不IL-17A與其受體結合之改良抑制活性。選 擇大致上係如前文說明進行（Th〇mps〇n 19%)。簡言之， scFv-嗟g體粒子係肖重組生物素化人IL_ i 7a於溶液培養 (bio-huIL-17A，於實驗室内由HEK EBNA所衍生及於實驗 98 200815469 室内經過修改）。然後遵照製造商的推薦，將與抗原結合之 s c F v嗟菌體捕捉於經過鏈絲菌抗生物素塗覆之順磁性珠粒 上(待納比德(；Dynabeads) M-280)。所選出之scpv嗟菌體粒子 如前文說明獲得（Osbourn 1996)，於遞減濃度之 5 bio-huIL-17A (100 nM至10pM經5回合)存在下重複選擇程 ^ 序。粗產物含scF>之周質萃取物係由得自選擇輸出之代表 性數目之個別純株而製備，大致上如實例丨所示，篩檢其抑 制人bio-huIL-17A與人IL-17受體A結合之能力。與其個別之 • 親代抗體比較時，篩檢命中換言之篩檢顯示顯著改良抑制 10功效之scFv變異株，接受DNA定序，製造獨特變異株成為 經純化之scFv來接受進一步特徵化(參考實例u。 然後選出若干scFv，且如實例1所述轉換成IgG1再度測 試。試圖獲得額外強度，於轉移感染步驟將改良之Vh及改 良之VL重組，評估所得igGl。於轉移感染層面之vh與VL - 15重組可識別為略微無法預測之技術，於產生改良強度之抗 體具有混合型成功。但幸運地，於此種情況下，該技術可 _ 成功地製造多種高強度IgG，包括抗體3、4、5、7、9、10 及12，容後詳述。 2.2生殖系列 20 經過最佳化之anti-IL-17 A抗體之VH功能部位和vL功能 部位之胺基酸序列經與VBASE資料庫（Tomlinson 1997)已 知之人生殖系列序列校準，藉序列類似性來識別出最接近 的生殖系列。用於Tina 12抗體替代培養之VH功能部位為 VH3-23。而對VL功能部位則為VX6a。 99 200815469 未考慮沃尼亞殘基(F〇〇te & Winter 1992)，維持不變， vH功能部位的架構有一項變化，Vl功能部位有兩項變化， 全部皆逆轉成最接近的生殖系列序列，來使用標準位置指 導突變發生技術以適當的致突變發生引子來以相同方式匹 5配人抗體。於VH功能部位之沃尼亞殘基為於VHFR3之C端 Arg (VH功能部位序列之殘基號碼98)，並未改變成生殖系 列Lys。於VL功能部位之沃尼亞殘基於VL FR2為Ile (Vl功 能部位序列之殘基號碼47)，其未被逆轉成生殖系列Thr ; 而於VL FR2之Phe (VL功能部位序列之殘基號碼50)，其未 10 被逆轉成生殖系列Tyr。 2.3最佳化純株之HTRF受體·配體檢定分析 如檢定分析材料及方法章節所述，最佳化選擇輸出係 於HTRF受體配體結合檢定分析中篩檢有關HIS FLAG標籤 人IL-17A (於實驗室經過HEK EBNA衍生）結合IL-17RA融 15 合蛋白質之抑制作用。 然後於HTRF受體配體結合檢定分析中，測定由篩檢命 中所識別的純化後之scFv之強度。所得領先scFv強度實例 顯示於表5。此處所述資料為非生殖系列化抗體序列之資 料。 20 表5 ··於HTRF受體配體檢定分析中最佳化領先scFv強度之實例 純株名稱 IC5〇 (nM)於 HTRF檢定分析 純株名稱 IC50 (nM)於 HTRF檢定分析 抗體1 12.0 抗體13 1.6 抗體2 0.7 抗體14 2.5 抗體3 ND 抗體15 1.6 抗體4 ND 抗體16 1.6 抗體5 ND FORD022E03 8 100 200815469 抗體6 1.7 FORD023A05 6 抗體7 ND FORD025D03 7 抗體8 0.7 FORD022B08 6 抗體9 ND FORD023B10 4 抗體10 ND FORD146B02 13 抗體11 0.6 FORD016D04 0.6 抗體12 ND 生物來源mAb 1.5 *ND=f測定’由於無法取得此等純株之scFv。此等純株係於IgG階段藉重組而產 2.4最佳化純株之HT1080 IL-6釋放檢定分析 5 於得自領先單離之抗體最佳化後，生物活性之改良係
於如「檢定分析材料及方法」章節中所述之HT1080人纖維 肉瘤細胞評估。全部檢定分析皆係使用衍生自HEK-EBNA 表現系統之人IL-17A及衍生自大腸桿菌表現系統或HEK EBNA表現糸統之馬來猴IL-17A進行。 10 —群最佳化anti-IL-17 scFv/IgG係於HT1080檢定分析 中，以濃度相依性方式回應於InM人IL-17A或InM馬來猴 (cyno) IL-17A進行評估。所得scFv強度及IgG強度實例顯示 於表6A。 表6A :於HT1080檢定分析中scFv改良強度及IgG改良強度之實例 人 IL-17 Cyno IL-17 交叉反應^ 之差異倍數 (IgG 广 純株 名稱 scFv IC50 (ΏΜ) IgG IC50 ί-ηΜ) scFv ICso^nM) IgG ICsornM) 抗體1 70%抑制 23.0 IA 144.0 抗體2 16.2 1.5 99.0 18.3 12^^ 抗體3 - 0.8 - 13.0 抗體4 - 0.9 - 7.3 抗體5 - 1.4 • 39.7 28^^ 抗體6 31.2 1.5 135.8 39.6 26^^ 抗體7 - 0.7* - 5.〇t r— 抗體8 34.3 2.9 96.4 53.0 ιΓ- 101 200815469 抗體9 - 2.3 - 9.2 4 抗體10 - 2.2 - 4.9 2 抗體11 8.2 2.2 20%抑制 25.0 4 抗體12 - 2.1 墨 4.2 2 抗體13 35.9 2.0 147.0 28.8 14 抗體14 36.7 L8 99.5 29.0 16 抗體15 21.7 1.7 158.8 30.9 19 抗體16 13.0 1.6 249.0 29.5 19 FORD023B10 24.7 3.4 14.1 1.5 2 FORD023A05 30.6 3.3 17.0 8.7 3 FORD025D03 34.1 2.5 26.3 6.6 3 FORD022B08 39.6 4.5 22.1 4.6 1 FORD022E03 47.7 14.6 31.2 17.0 1 FORD146B02 52,1 9.3 30.7 17.5 2 mAb317 (R&D系統公司） - 3.2 - 14.1 4 生物來源mAb - 6.2 - 6.8 1 *額外實驗(資料集合n=15)指示幾何平均IC5G值為0.8，95%信度間隔〇·6至1.0 卞額外實驗(資料集合η=12)指示幾何平均iC5〇值為4.8，95%信度間隔3.2至6.4。 2.5測量協同增效IL-6釋放之HT1080細胞檢定分析 5 HT1080細胞可以濃度相依性方式，經由協同增效釋放 IL-6來回應於人IL-17A及人TNFa。最佳化抗體2及7對協同增 效IL-6反應之生物活性係使用如前述對HT1080細胞檢定分析 方法之修改來評估，其中IL-6之釋放係回應於125 pM人IL-17 及25ρΜ人TNFa測定(參考「檢定分析材料及方法」章節）。 0 抗體2及抗體7皆可中和協同增效性IL_6反應。IC5〇值實 例顯示於表6b。 H於IL-17/TNFa中之IgG 1強度之實例 純株名稱 IgG ICUrwnM) 抗體7 0.24 (95% Cl 0.19-0.28) 抗體2 0.41 102 200815469 2·6於HTl080細胞中天然IL-l7A誘生反應之抑制 抗體抑制IL-17A天然來源之能力係使用衍生自一次人 類T細胞之IL-17A進行評估。由大腸桿菌所衍生之重組 IL-17A為未經糖化，不似天然來源有^^鍵聯之糖化位置。使 5用T細胞衍生之IL-17A評估抗體，可確保對天然來源蛋白質 維持活性。
得自健康人類捐贈者之τ細胞使用提升IL_17A製造的 條件刺激。此等上清液含有其它細胞激肽諸如TNFa，其可 與任何存在的IL-17A協同增效。得自τ細胞之經調理的培養 10基於有或無抗體存在下添加至HT1080細胞，評估基準線上 方之IL-6的誘生。由此算出ICs()值。本檢定分析之方法細節 k供於檢定分析材料及方法章節。 表6c:抗體對im〇80細胞中τ細胞上清液誘導IL-6製造之影
15 ICs〇 (nM) 抗體(IgGl) 平均(95% Cl) η X·*- J8A Ο 0.25 (0.09-0.74) 3 抗體7 0.13 (0.04-0.46) 3 擇性及種屬交叉反應性 使用HTRF抗原決定部位競爭檢定分析，經由測量HIS FLAG IL-17A (於實驗室中由HEK EBNA所衍生）結合各個 最佳化anti-IL-17抗體之抑制作用，來確立領先抗體對il_17 20豕族成員之選擇性及種屬交又反應性。 各次檢定分析中刪試未加標籤經純化後之人IL_17A (於實驗室以大腸桿菌衍生）、IL_17B〈皮波泰克公司）、 103 200815469 IL-17C (R & D系統公司）、IL-17D (皮波泰克公司）、IL-17E (R&D系統公司）及IL-17F (皮波泰克公司）之滴定，來藉檢定 分析中之IC5Q值之測量值確定各個IL-17家族成員之強度。 於各次檢定分析中測試IL-17種屬包括人IL-17A、馬來 5 猴IL-17A、犬IL-17A (全部皆於實驗室内由大腸桿菌衍生） 及鼠IL-17A (R&D系統公司）之滴定，來確定最佳化抗體之 種屬交叉反應性。 結果摘述於表7。初步資料指出領先最佳化試驗抗體對人 IL-17A具有選擇性，但未能辨識家族成員IL-17B、C、D、E及F。 10 於進一步實驗中，以1 μΜ或以上之濃度使用，使用人 IL-17F觀察得與抗體7之部分抑制。 此外，全部接受試驗之最佳化抗體可辨識人IL-17A、 馬來猴IL-17A及犬IL-ΠΑ，有不等強度。藉任一種最佳化 抗體皆未能辨識鼠IL-17A。 15 表7 :於人IL-17A結合最佳化IgG檢定分析(HTRF)中，IL-17 家族成員及不同IL-17種屬之強度 最佳化抗體 檢定分析 IL-17種屬/家族成員之IC50 nM 人 IL-17A 馬來猴 IL-17A 鼠 IL-17A 犬 IL-17A B C D E F FORD023A05 1.5 ND ND ND NI NI NI NI NI 抗體2 2.9 (1.6*) 4.5 ΝΙ 34 NI NI NI NI NI 抗體7 1.4 (0.9*) 2.0 (1.7*) ΝΙ 1.4 (11.9*) NI NI NI NI 觀察到部分抑制 (於約1 μΜ或以 上20%抑制） 生物來源 mAb 3.7 4.0 ΝΙ 50 nM NI NI NI NI ΝΙ
B=人 IL-17B C=人 IL-17C D=人 IL-17D 20 E=人 IL-17E F=人 IL-17F NI=無抑制 ND =未測定 *數值表示由兩次或多次分開實驗隨後求出ICso平均值。 104 25 200815469 豈金對人IL-17A之和々 3」PA2分析 為了進一步特徵化，於抗體進行anti-IL_17A抗體pA2 分析，使用檢定分析材料及方法章節所述之方法。用來評 5估1gG對人1L_17A之平衡解離常數(Kd)。使用ΗΤι〇8〇人纖維 • 肉瘤細胞及ίίΕΚΕΒΝΑ表現人IL-17A進行分析。 分析估計anti-IL-17對人IL-17A之親和力為65 ρΜ至 550 ρΜ，實例資料顯示於表8。分析係使用生物來源瓜八七 ^ 及陰性對知mAb進行。單離抗體之親和力顯示比生物來源 10 mAb之親和力高2倍至5倍。 表8a : IgG對人IL-17A之親和力實例 PA2值 Kd(pM) 抗體2 9.73 188 抗體7 9.23 553 生物來源mAb 8.96 1100 3.2使用生物感測器分析結合親和力資料 百歐可（BIAcore) 2000 (GE健康照護公司（GE Healthcare))用來評估抗體7與不同種屬il_i7a間之交互作 15用之動力學參數。 生物感測器係使用表面電漿子共振(SPR)光學效應來 研究由流動於配體分子上方之被分析物分子共價附接至生 物感測器晶片之葡萄聚糖層之交互作用所得表面濃度變 化。典型地，特定濃度之被分析物種屬流動於偶合配體上， 20任何結合係以局部SPR信號(結合期）之增高來檢測。接著為 緩衝液流動期，於該緩衝液流動期間，隨著信號的降低觀 105 200815469 察到被分析物物種的解離(解離期）。由與晶片結合之配體去 除’於若干不同被分析物濃度重複進行該程序。實驗期間 通常採用一串對照來確保於整個實驗期間絕對結合能力以 及偶合配體之動力學輪廓資料皆無顯著改變。專屬 5缓衝食鹽水(HBS_EP)典型用作為被分析物樣本的主要稀釋 緩衝液，及用作為解離期期間的流動緩衝液。實驗資料係 以任意共振單位(RU,為與SPR信號直接相對應之任意單位) 相對於時間（秒）紀錄。RU係於晶片表面上之折射率變化成 正比，該折射率變化又是被分析物結合量的近似值測量 10值。BIAevaluation套裝軟體用來處理資料，將結合模型帶 入該資料集合。逆轉結合速率常數(M“ s-i)及解離速率常數 (S )，允§午异出結合親和力常數(Μ·1)及解離親和力常數 (Μ)。 抗體7之親和力係使用單一檢定分析估計，其中IgGi 15係共價（胺鍵聯）偶合至專屬CM3晶片表面至3〇〇 ru表面密 度終值。然後一連串重組人IL-17A或馬來猴IL_17A之稀釋 液(0.78-50 nM)循序通過抗體7。配體之莫耳濃度係使用已 經公開之方法基於所算出之2 8 〇奈米吸光係數及消光係數 來測疋。空白流動細胞資料由1§〇1中扣除，朋§_£緩衝液空 20白組係由主資料集合中扣除（「雙重空白扣除」）。然後使用 BIAevaluation 3.2軟體’將1 : 1蘭米爾（Langmuir)模型及二價 被分析物模型同時帶入得自各個被分析物濃度集合之資料。 貢料之有效性係藉計算得之Chi2值及T值評估/約束（參 數值/補償值），分別為小於2及大於1〇〇。 106 200815469 抗體7制動於CM3晶片表面，一系列重組IL_n變異株 稀釋液(0·78-50 ηΜ)循序通過IgGi。資料同時帶入丨·· i蘭米 爾模型（同時ka kd)及同時帶入二價被分析物模型(同時 kd)。由肉眼及優異Chi2值判定，二價被分析物模型可獲得 5 較佳匹配。然後由速率常數值比kdl/kal求出親和常數 (Kd)。 表8b :抗體7之動力學分析 抗原 1 : 1蘭米爾~ KD fnM) 一價被分析物 (r»]Vn 人IL-17A (大腸桿菌） 0.195 ------------ /__ 2.098 馬來猴IL-17A (大腸桿菌） 0.512 1.340 人IL-17A-Flag-HislO (ΗΕΚ) 0.171 0.4M.88 豈例4 ··於人一汝軟骨細胞中IL-17A諉導活枓夕 多種發炎疾病包括類風濕性關節炎及骨關節炎的一項 10主要特徵係關節軟骨的破壞。關節軟骨内部的主要細胞類 型為軟骨細胞。一次人軟骨細胞可由膝關節置換手術所取 出的組織中單離。藉膠原蛋白酶消化，由軟骨中萃取出細 胞’及於無菌條件下培養供用於試管内檢定分析。軟骨細 胞菖使用重組IL-17或天然IL-17刺激時，可產生一定範圍之 15發炎媒介物質及破壞媒介物質，包括細胞激肽(諸如IL-6、 IL-8)、PGE2及分解酶諸wMMP13。檢定分析細節說明於檢 定分析材料及方法章節。 表9a及表10a顯示本檢定分析所使用之igGl抗體之初 步資料。表9b及表10b顯示對較大資料集合(較多n數目）求出 20 之更新的資料。 107 200815469 表9a :藉anti-IL-17A抗體抑制由人一次軟骨細胞釋放 IL-17A誘導之IL-6之初步資料
IgGl 0.2nMIL-17A η 2nMIL-17A η FORD023A05 2.77(1.05-7.31) 4 5.75 (2.69-12.30) 4 抗體2 (non-GL*) 0.85 (0.44-1.65) 4 5.76 (3.39-9.90) 4 生物來源mAb 1.02 (0.78-1.32) 9 5.18 (4.02-6.67) 12 TINA10 27.23 (10.02-74.00) 5 87.97 (52.92-146.24) 7 抗體1 29.85 (11.23-79.29) 4 75.67 (27.55-207.82) 4 幾何平均IC5〇係以nM(95%信度極限）表示。 *抗體2係以非生殖系列化形式用於本檢定分析。 表9b :藉anti-IL-17A抗體抑制由人一次軟骨細胞釋放 IL-17 A誘導之IL-6之更新資料
IgGl 0.2nMIL-17A η 2 nM IL-17A η 抗體2 1.52 (0.61-3.78) 5 5.51 (3.54-8.57) 5 生物來源mAb 1.03 (0.80-1.33) 12 5.70 (4.64-7.01) 12 抗體7 0.51 (0.18-1.43) 6 1.44 (0.79-2.64) 6 幾何平均IC5Q係以nM(95%信度極限）表示。 表10a :藉anti-IL-17A抗體抑制由人一次軟骨細胞釋放 10 11^17人誘導之11^8之初步資料
IgGl 0.2nMIL-17A η 2nMIL-17A η FORD023A05 2.77(1.86-4.11) 7 7.84 (4.12-14.90) 7 抗體2 (non-GL*) 0.74 (0.46-1.18) 7 3.81 (2.24-6.45) 7 抗體2 2.30 3 7.91 3 抗體7 0.17 3 1.60 3 生物來源mAb 0.78 (0.52-1.17) 10 3.98 (3.09-5.12) 14 TINA10 21.42(12.85-35.69) 7 61.96 (45.76-83.90) 9 抗體1 18.12(10.7-30.67) 4 44.47 (39.93-49.53) 4 幾何平均IC5Q係以nM(95%信度極限）表示。 *抗體2係以生殖系列化形式及非生殖系列化形式用於本檢定分析測試。 表10b :藉anti-IL-17A抗體抑制由人一次軟骨細胞釋放 15 IL-17 A誘導之IL-8之更新資料
IgGl 0.2nMIL-17A η 2nMIL-17A η 抗體2 1.49 (0.80-2.78) 8 7.18 (4.38-11.75) 8 抗體7 0.30 (0.14-0.63) 8 1.30 (1.10-1.54) 9 生物來源mAb 0.85 (0.58-1.24) 14 5.09 (4.06-6.37) 15 幾何平均IC5〇係以nM(95%信度極限）表示。 108 200815469 表11 :藉anti-IL-17A抗體抑制由人一次軟骨細胞釋放 11^17八誘導之]^]\«)13
IgGl 0.2nMIL-17A η 2nMIL-17A η FORD023A05 4.79 2 6·84，>50 2 抗體2 (non-GL*) 1.55 2 11.53 2 生物來源mAb 1.69 (1.01-2.82) 7 11.56 (8.05-16.60) 7 TINA10 59.06 (22.49-155.07) 6 範圍：63.4->400 7 抗體1 110.04 (35.29-343.16) 4 範圍·· 147->400 5 幾何平均IC5G係以nM (95%信度極限）表示。 *抗體2係以非生殖系列化形式而用於本檢定分析。
表12 :藉anti-IL-17A抗體抑制由人一次軟骨細胞釋放 IL-17A誘導之PGE2
IgGl 0.2 nM IL-17A n FORD023A05 4.75 3 抗體2 (non-GL*) 1.94 3 生物來源mAb 2.83 3 TINA10 NT 抗體1 NT 幾何平均IC5G係以nM(95%信度極限)表示。 NT :未測試 *抗體2係以非生殖系列化形式而用於本檢定分析。 复例5 :龙Balb C小氪之氣袋电炎j舌體内il_17a誘導生物法 性之抑制 5.1氣袋之形成 15 Balb c小鼠使用異氟烧(isoflurane)麻醉，背面剃毛。為 了形成氣袋，2.5毫升經過濾之無菌空氣係使用25g針頭皮 下注射之背侧中線。手術後小鼠移至其各自之籠内，第3曰 將小鼠溫和固定，使用2·5毫升無菌空氣再度充氣氣袋。 抗體(IgGl)係像用兩種方法評估：預先混合法，抗體 20與1L_17係於注射前預先混合；系統性方法，抗體係與 IL-17A注射前投予。於系統性給藥之情況下，抗體係於無 109 200815469 菌PBS稀釋，於第5曰w I十，θ 乐〕《 Μ大劑量腹内注射。 於第6日’小鼠溫和固定，各小鼠再度接收氣袋内注射 1么升s大腸才干菌*生人mAuw甲基纖維素(於實驗 S之反應劑）可單彳H射（於對照組動物或系統性給藥動物 5之f月況下）’或與_卜IL]7抗體組合注射（預先混合抗體及 IL-17A)。於此等實驗中，抗體與配體共同混合，於37。〇前 „ 支口養30刀鐘’ 後注射入氣袋内。小鼠送回其籠内，直到 最〜取& ’此日$係使用遞增濃度之二氧化破來挑選。為了 辅助由氣袋中回收灌洗的流體，將2毫升含4 mM EDTA之 肇 10 入氣袋内’氣袋溫和按壓約⑽、。由氣袋中溫和 取出灌洗流體’傾析人有刻度的聚丙烯管。紀錄回收量。 樣本維持於冰上直到加工供儲存。 5.2灌洗流體分析 總白血球(TWBC)計數 15 於含有10毫升艾索通（Isoton)之各個庫特（Coulter)瓶 ， 内’加入20微升灌洗流體。樣本於庫特Z1計數器上重複進 行項取’對各樣本獲得重複計數值，背景讀數維持小於 鲁 2000。然後調整細胞數目來考慮由氣袋所取得之灌洗量。 IL-6量化 20 樣本於1500 rPm離心5分鐘，300微升上清液置於96孔 孔板’重複三次，儲存於-2(TC至準備分析。遵照套件組方 案’藉R&D系統公司廣提津（Quantikine)鼠IL_6細胞激肽 ELISA套件組(型錄號碼M6000B)分析50微升標準品、對照 品及灌洗流體樣本。 110 200815469 使用SoftMax Pro ELISA孔板讀取器於450奈米及校正波長 540奈米，由小鼠IL-6標準曲線測定灌洗流體中之IL-6濃度。 5.3於氣袋中IL-17A誘導IL-6之釋放之抑制
表13a:於小鼠氣袋中IL-17A誘導IL-6釋放之抑制：預先混 5 合抗體及IL-17A IL-6 抗體(IgGl) 最大抑制％ 瓜5〇微克 抗體2 (non-GL*) 46±9 4±3 FORD023A05 51±15 10±11 生物來源mAb 96±8 6±2 抗體7 115.9 0.5 *抗體2以非生殖系列化形式用於本檢定分析。 表13b :於小鼠氣袋中IL-17A誘導IL-6釋放之抑制：系統性 投予抗體抗原結合部位 IL-6 抗體(IgGl) 最大抑制％ ID50微克(95% CI) 抗體7 85.2 0.056 (-0.071 - 0.184) 5.4於氣袋中IL-17A誘導白血球流入之抑制 10表14a:於小鼠氣袋中il-ΠΑ誘導白血球流入之抑制：預先 混合抗體及IL-17A ' TWBC計數 抗體(IgGl) 最大抑制％ id5〇微克 抗體 2(non-GL*) 110±23 1±0.4 FORD023A05 91±5 17±12 生物來源mAb 71±7 3±1.4 抗體7 111 0.3 *抗體2以非生殖系列化形式用於本檢定分析。 表14b:於小鼠氣袋中IL]7A誘導白血球流入之抑制：系統 _性投予抗體抗原結合部位 TWBC計數 抗體(IgGl) 最大抑制％ 山5〇微克(95% CI) 抗體7 100.9 0.617(-0.518 ^ 1.752) 111 200815469 f例6 : IL-17A/TNFOC協同增#烚宗分析 6 · 1於死後軟骨外植體中之IL-17 A/TNFa協同增n生 多種發炎疾病包括類風濕性關節炎及骨關節> I尺的一►項 主要特徵係關節軟骨的破壞。關節軟骨内部的主要細於/ 型為軟骨細胞。人軟骨可單離自膝關節置換手術時所取出 的組織或單離自大體捐贈者。由軟骨切下外植體圓般 、 無囷條件下培養用於試管試驗檢定分析，將軟骨、細^、維_ 於其細胞基質内。以IL-17A或TNFa刺激外植體時，外植體 產生一定範圍之發炎及破壞媒介物質，包括細胞激肤， 如IL_6。本檢定分析之細節方法提供於檢定分析材料及方 法章節。 10 於初步實驗評估於軟骨外植體中，抗體對於 IL-nA/TNFa協同增效檢定分析之功效，由於組織供給量 有限，故未產生1C%資料。對給定濃度之結合成員，算出相 15 對於於無結合成員存在下之反應（％抑制）之抑制百分比。資 料顯示於表15a。於進一步實驗中’算出IC50資料，如表15b 所示。 IL-17A及TNFa組合誘導協同增效之IL-6反應，該反應 受到IL-17A中和抗體之抑制。同基因型對照抗體不影響協 20 同增效反應。 表15a :於人死後軟骨外植體中抗體對1L-WA及TNFa之協同增效 性IL-6反應之影響(誤差<12次重複之標準差，n=l捐贈者) ---— IL_6(皮克/亳升） 抗體(IgGl) __ 平均 標準差(±) %抑制 IL-17A10奈克/毫升 0.38 0.16 - TNF 1奈克/毫升 6.19 3.32 - 112 200815469
IL-17A+TNF 55.00 4.62 0 IL-17A+TNF+生物來源mAb 4.91 1.08 91.1 IL-17A+TNF+mIgGl同基因型對照 47.41 5.77 13.8 IL-17A+TNF+抗體2 (non-GL*) 4.63 2.30 91.6 IL-17A+TNF+hIgGl同基因型對照 53.17 8.59 3.3 表i5b:於人死後軟骨外植體中抗體aIL_17A&TNFa協同 增效性IL-6反應之ICso (平均資料，95%信度間隔） 抗體(IgGl) 平均 IC5〇 (95% CI) η 抗體2 3.39 2 抗體7 0.61 (0.26-1.42) 5 6.2於骨關節炎（0A)滑液纖維母細胞中之il_丨7A/TNFa協 5 同增效性
、諸如類風濕性關節炎等疾病的關節損傷特徵包括於發 乂的’月液中存在有免疫系統細胞，包括例如巨噬細胞、T 細胞B細胞及增生中的纖維母細胞。關節置換手術期間取 出之，節組織可單離發炎的滑液。滑液經過膠原蛋白酶消 單、之、、、田胞係於無菌條件下培養供試管内檢定分析使 用/月液主要為纖維母細胞組成。纖維母細胞當以IL-17A 或二Fa勺刺激時，纽某個範圍之發炎媒介物質及破壞媒介 物質，包括細胞激肽諸如18。本檢定分析之細節方法提 供於檢定分析材料及方法章節。 15 使用不同兩組細胞激肽濃度，IL-17A及TNFa共同誘導 協同增效之δ c @ 反應。本反應可使用IL_17A中和抗體降 一 5 土口沒對照抗體對協同增效反應無影響。 113 200815469 表16a :於人〇A滑液纖維母細胞中抗體對IL-17A (10奈克/ 毫升)及TNFa (1奈克/毫升)協同增效1L-8反應之功 效(細胞激肽濃度以皮克/毫升為單位，誤差=重複 三次資料點之標準差，n=1捐贈者） IL-8 (皮克/毫升） 抗體(IgGl) 平均 %抑制 IL-17A 10奈克/亳升+TNF 1奈克/毫升 62519.10 - IL-17A+TNF+ hlgG 1同基因型對照 64967.81 -3.9 IL-17 A+TNF+FORD23 A05 32117.64 48.6 IL-17A+TNF+抗體 2 23340.13 62.7 IL-17A+TNF+抗體 7 20829.47 66.7 5 表16b :於人OA滑液纖維母細胞中抗體對IL_17A(1奈克/毫 升)及TNFa (0.01奈克/毫升)協同增效IL-8反應之功 效(細胞激肽濃度以皮克/毫升為單位，誤差=重複 三次資料點之標準差，n=1捐贈者）。 IL-8 (皮克/毫升） 抗體(IgGl) 平均 %抑制 IL-17A 10奈克/毫升+TNF 1奈克/毫升 3255.86 0 IL· 17A+TNF+ hlgG 1同基因型對照 3298.59 -1.3 IL-17A+TNF+FORD23 A05 1731.59 46.8 IL-17A+TNF+抗體 2 1506.59 53.7 IL-17A+TNF+抗體 7 1107.75 66.0 6.3於類風濕性關節炎（RA)滑液纖維母細胞中IL-17A及 10 IL-17A/TNFa 誘導 IL-8 之抑制 如6.2節之摘要說明，發炎的滑液為RA的關鍵特徵。 R A滑液也可使用所述相同方法單離自R A關節置換術中所 取出的關節組織。此等細胞為疾病相關細胞，對IL-17A及 TNFa之反應係產生包括IL-8之細胞激肽。當同時添加細胞 15 激肽時，產生協同增效反應。本檢定分析之細節方法提供 於檢定分析材料及方法章節。 114 200815469 表17 :於人RA滑液纖維母細胞中抗體對IL-17A及 IL-17A/TNFa誘導IL-8反應之功效(IC5G)(平均資 料，95%信度範圍） ' 抗體(IgGl)及刺激 平均 IC50 nM，95% CI η 抗體7相對於IL-17A (2 nM) 2.85 (1.96-4.15) 抗體7相對於IL-17A(1 nM)及TNFa ί〇·1奈克/毫升） 4.97 (1.48-16.73) 3 實例7 :抗體7結合至人IL-17A之抗原決定部位之映Μ 5 7·1 IL-17A之Η/D交換速率受抗體7擾動 於第一實驗中，IL-17A交換溶液中之D2〇,結合至制動 _ 於管柱上之抗體7 (IgGl)，然後回交換入HW，同時仍然結 合於抗體管柱，導致於回交換反應期間抗原決定部位受保 護，隨後以氘標記。於第二實驗中，IL-17A首先結合至管 10 柱上的抗體7 (IgGl)，然後以D20標記，最後交換回h2〇 , 同時仍然結合於管柱，故無任何IL-17A部分係以氣標記。 然後測定兩項實驗間之胜肽質量差異。兩項實驗間之氣含 量差異為結合至抗體時的交換延遲的測量值。本方案之方 法細節提供於材料及方法章節。 φ 15 以N為端基加標籤之IL-17A用於本研究，其序列顯示於 第1圖（SEQIDNO : 197)。殘基1_21表示添加供檢測目的之 用之胜肽標籤’標籤包含允許特別於標籤之離胺酸殘基進 行酶催化生物素化之「亞維泰格(Avitag)」。Gly22為成熟 IL-17A之第一殘基。 20 於Η/D父換速率顯示顯著擾動之唯--區係介於第1圖 所示SEQ ID NO : 197之胺基酸92-108間，涵蓋序列 CRHLGCINADGNVDYHM (SEQ ID NO : 199)。本系列係 與成熟人IL-17A之殘基71-87相對應（SEQIDNO ·· 198)。 115 200815469 5 表18 :比較氘化而當結合多拆體7時換回質子與於溶液中氘 化而當與抗體結合日矛換回質子之氘化程度之差異百 分比。差異大於10% ’ σ特別於早期時間點差異大於 10%被視為顯著。殘基號媽為第1圖所示的序列號碼 (SEQ IPjsjQ ： 197)^^ 殘基號碼 __時間點（秒） 起點 終點 150 / 500 1500 5000 3 8 ____^ 5 0 -4 1 11 17 -3 -1 -1 20 44 — -3 -1 -3 47 63 -1 -2 -2 -2 66 74 -13 -12 -13 77 89 -1 -1 1 -2 92 108 -23 ^ -21 -15 -13 111 118 _ ____^ 3 -2 -2 -2 121 131 5 ^ -3 -1 -2 134 137 _ —^^ -3 ^^ -2 0 0 140 153 •5」 -9 -8 -3 7·2突變株IL_17A與抗體7厶結合之分析 舉第二辦法來證實實例7· 1中識別的抗原決定部位為 正確。如此係利用觀察到抗體7不會與鼠IL-17A結合，但鼠 IL-17A將透過人IL-17A受體發訊來誘導IL-6之合成。實例 10 7·1 所識別之胜肽序列（CRHLGCINADGNVDYHM，SEQID NO: 199)於人序列與鼠序列間有7個變化。若此區確實含有 由抗體7所結合之抗原決定部位，則當全部7個殘基皆由人 殘基改成鼠相當殘基時，則預期所得突變株IL-17A仍然可 15 於人受體發揮作用，但不再可由抗體7所結合或所抑制。 突變株IL-17A有下列變化(L74Q、G75R、I77V、D80E、 N82K、V83L、Y85H)且係顯示於第2圖（SEQ ID NO : 200)。 116 200815469 於去除信號序列後’第一殘基為Gly24。5個組胺酸殘基添 加於C端來輔助純化。成熟形式之突變株人IL-17A為SEQ ID NO : 201。 如此突變株IL-17A係於哺乳動物HEK/EBNA細胞系中 5 轉殖與表現。培養基經收集，蛋白質係使用Ni層析術純化。 本處理程序之洋細祝明參考材料及方法章節。野生型 IL-17A經過轉殖，然後藉相同方案表現及純化。 野生型IL-17A分子與突變株IL-17A分子結合係根據製 造傷的指示，使用百歐可(BIAcore)含有抗體7 (IgGl)制動於 10 CM5晶片來分析。獲得5275反應單位(RU)之制動。 表19 : IL-17A野生型及突變株結合至CM5感測器晶片表面 上經過制動之抗體7 配體 平均反應單位(+標準差） 突變株IL-17A 8.0 (5.4) 野生型IL-17A 539.1 (0.2) 未結合至對照IgG (劍橋抗體技術公司（Cambridge Antibody Technology))。野生型IL-17A強力結合至制動的抗 15體7。相反地，突變株IL-17A並未結合至抗體7。觀察得低 反應單位信號只能歸因於背景「雜訊」。抗體7並無可檢測 的結合至突變株IL-17A，進一步證實實例7.1所示序列（SEQ ID NO : 199)確實含有至少部分由抗體7所辨識的抗原決定 部位，換言之，抗體結合至SEQ ID NO : 199内部之一個或 20 多個殘基。 7.3抗體對突變形式IL-17A所誘導由HT1080細胞釋放虬_6 之效應 117 200815469 為了測定突變株IL-17A (如實例7.2所述之突變株)之生 物活性，於HT1080人纖維肉瘤細胞檢定分析中評估反應。 至於檢定分析方法之細節，參考章節「檢定分析材料及方 法」。 5 於本檢定分析中，評估〗Ι-17Α (大腸桿菌、皮波泰克公 司或HEK ΕΒΝΑ於實驗室内衍生）或突變株IL_i7A (於實驗 室中由HEK EBNA衍生）對IL-6釋放之EC50 (獲得半最大反 應之濃度）（表20a)。其次，藉IQq值，測定響應於IL-17A或 突變株IL-17A (使用次於最高濃度），anti-iL-l7 IgG之抑制 10 活性。抗體7 (呈IgGl)之強度抗各種形式il_17A之強度之實 例顯示於表20b。對照IgG於本檢定分析中並未驗證il-6反 應之抑制。 表20a :於HT1080檢定分析中IL_17A或突變株IL-17A誘導 IL-6釋放之EC5G之實例 配體 來源 EC5〇 (nM) IL-17A 皮波泰克公司（大腸桿菌） 0.40 IL-17A 實驗室内（HEKEBNA) 0.52 突變株IL-17A 實驗室内（HEKEBNA) 2.36 15 表20b :於HT1080檢定分析中抗體7對IL-17A或突變株 配體 來源 [配體](nM) 抗體7 IC50 rnM) IL-17A 皮波泰克公司 (大腸桿菌） 1 0.35 IL-17A 實驗室内 (HEK EBNA) 2 0.43 突變株IL-17A 實驗室内 (HEK EBNA) 1 無抑制 118 200815469
- 3 LCDR3 a > 96 > —- a 96 t/i D a > ，6 m ffi H > 3： s >- i—* H >- C6 Q Of a： SU a {X & Οι CL· cu： Oh a* Z6 Q C« (/3 2 OQ C/5 00 V5 16 > 06 OQ： .H w E-. 68 a LCDR2 扣 GO Ρζ £9 σ zs 15 OS <ί LCDR1 n u u \i oe 6Z %z BiZ VLZ LI n 9t PZ a > > < </3 o on m P< HCOR3 ZOl 101 V001 001 66 86 £6 96 56 CO z 2： d ό ο O Pei； ;«S < H f- O Ο ο > o ffi H ffi K U- tin Q HCDR2 S9 P9 i9 Z9 19 09 65 8S L9 95 ξξ n ίξ vzs Ιζ IS os o > m O < > H OO o a v o </ϊ < HCDR1 n a Z£ n </3 ：< ;^ CO 卡貝特 編碼 抗體01 抗體02 抗體03 抗雖04 抗體05 抗體06 抗艚07 抗體08 抗體09 抗艘K) 抗體11 抗體12 抗體U 抗難14 抗Hi 5 抗體16: 119 200815469 檢定分析材料及方法 IL-17澧唐 於全部後文及其它所述檢定分析中，IL-17A濃度或 IL-17同系物濃度係指雙硫鍵IL-17同質二元體之濃度。 5 受體-配體結合HTRF檢宗分析 選擇輸出係於受體-配體結合HTRF (均質時間解析榮 光）檢定分析格式中篩檢生物素化人IL-17A (皮波泰克
200-17)或HIS FLAG加標籤人IL-ΠΑ (於實驗室中由HEK EBNA所衍生）與IL-17RA Fc融合蛋白（R&D系統公司177-IR) 10 結合之抑制作用。 HTRF (均質時間解析螢光)檢定分析為利用彼此鄰近 的施體螢光基團與受體螢光基團間的螢光共振能傳輸之均 質檢定分析技術。此種檢定分析可用來經由直接或間接偶 合感興趣之分子之一偶合至施體螢光基團、隱色銪（Eu3+) 15 及偶合其它感興趣的分子至受體螢光基團XL665 (穩定交 聯別藻青素）而用來測量聚分子交互作用。隱色分子的激發 (於337奈米）導致於620奈米發螢光。來自此發光之能量可傳 遞至隱色基團鄰近的XL665，導致由XL665發出特定長壽螢 光(於665奈米）。測量施體的特異性信號(於620奈米）及受體 20 的特異性信號(於665奈米），讓665/620奈米比之計算可補償 檢定分析中有色化合物的存在。 輸出係以未經稀釋(領先單離）或稀釋(領先最佳化）來 師檢含粗產物scFv之周質萃取物’係於％ MOPS緩衝液 pH 7.4、0.5 mM EDTA及0.5 Μ山梨糠醇製備。3 nM生物素 120 200815469 化人IL-17A (6 nM單體）或3 nM HIS FLAG加標籤之人 IL-17A (6 nM單體)係於室溫於暗處分別與3·2 nM鏈絲菌抗 生物素隱色基團（CIS生物國際公司，610SAKLB)，或與1.6 nM以隱色基團加標籤之抗旗標IgG(CIS生物國際公司 • 5 610?210^)前培養1小時。全部稀釋皆係於含有〇4]^氟化鉀
• 及0·1% BSA (檢定分析緩衝液)之50 mM HEPES緩衝液中 進行。並行地，12 nM IL-17RA Fc融合蛋白質於暗處與4〇 nM抗人Fc抗體，係以使用XL665加標籤之抗原Fc抗體(CIS Φ 生物國際公司61HFCXLA)於檢定分析緩衝液中於室溫前培 10 養1小時。 反應劑前培養後，10微升粗產物scFv樣本添加至384孔 低量檢定分析孔板(柯斯塔公司3676)。接著添加5微升經過 月培養之受體及anit-Fc XL665混合物，然後添加5微升人 IL-17A及隱色基團檢測混合物。 • 15 檢定分析中所使用之IL-17A終濃度為〇.75 nM。 然後檢定分析孔板於室溫於1000 rpm離心1分鐘，於室 _ 溫培養5小時，隨後使用EnVision孔板讀取器（伯金愛瑪公司） 進行於620奈米及665奈米發光波長的讀取時間解析螢光。 各樣本之資料係經由計算％AF值來分析。aF係根據方 2〇 程式1計算。 方程式1 : %AF= Μ本665奈米/620奈米比值）-(非特異性對照665奈来太乎比值） (非特異性對照665奈米/620奈米—- xl0° 隨後％AF值用來如方程式2所述計算％特異性結合。 121 200815469 方程式2 :
xlOO
%特異性結合= 樣本之％AF
口口 系悤結合對照之％AF 由篩檢所識別之得自陽性純株經純化之scFv係於 HTRF檢定分析中測試IL_丨7a與IL- i 7受體結合之抑制作 5用。scFv.度之滴定用來建立如檢定分析中由IC50值所測量 之純株強度。IC%值係使用Graphpad Prism軟體使用四參數 邏輯方程式（方程式3)藉曲線匹配測定。
方程式3 : Y=底+(頂-底)/(l + l〇A((L〇gEC50-X)* 斜率)） 10 為濃度之對數值。Y為比結合 □Y始於底，走向頂而有S字形。 全部檢定分析中皆含括參考品anti-IL-17 mAb(生物來 源公司）作為陽性對照。 HIS FLAG人IL-17A輿抗人IL-17A抗體結合之抑制拾宗公 15 析用之抗原決定部位競拳HTRF檢定分折
本抗原決定部位競爭檢定分析可用來測定IL-17A結合 成貝間之競爭。本檢定分析也可用來測定結合成員結合來 自不同種屬之IL-17A例如人及馬來猴IL-17A之交叉反應 性，及/或測量結合成員與其它IL-17家族成員例如IL-17同 20 系物A至F之交叉反應性。本檢定分析所測試之結合成員通 常係呈scFv格式，但熟諳技藝人士也可調整該檢定分析來 用於IgG或其它結合成員格式。大致上，反應劑濃度將隨 IL-ΠΑ抗體之親和力而改變。 122 200815469 2 nM人HIS FLAG IL-17A (4 nM單體)於室溫於暗處與 使用隱色基團標記之1.6 ηΜ抗旗標IgG前培養1小時。全部 稀釋皆係於檢定分析緩衝液進行。平行地，0.6 nM anti-IL-17 IgGl (欲測試試驗結合成員之競爭）係於室溫於 ’ 5 暗處與經以XL665標記之20 nM抗人Fc抗體於檢定分析緩 ’ 衝液中前培養1小時。
反應劑前培養後，10微升樣本添加至384孔低容量檢定 分析孔板，重複進行。接著為添加5微升經過前培養之HIS # FLAG人IL-17A與抗旗標隱色基團混合物，然後添加5微升 10 抗人IL-17抗體與XL665檢測混合物。 然後檢定分析孔板於1000 rpm於室溫離心1分鐘，於室 溫培養2小時，隨後使用EnVision孔板讀取器（伯金愛瑪公司） 讀取於620奈米及665奈米發光波長的時間解析螢光。 對各樣本計算％AF值來分析資料，隨後用來測定％特 - 15 異性結合。IC5〇值係使用GraphPad Prism軟體測定。 有關HTRF檢定分析之討論可參考受體-配體結合 • HTRF檢$分析方法。 HT1080 IL-17誘導IL-6釋放檢定分析 HT1080細胞（歐洲細胞培養收集會此八^：，以ECACC 20 N〇. 85111505獲得）以5 X 1〇4細胞/孔播種於96孔平底組織培 養檢疋分析孔板(柯斯塔公司）。然後細胞於200微升檢定分 析培養基[最低必須培養基(MEM)含有俄爾斯(Earl es)鹽及L 麩胺（英維仇貞公司（Invitrogen))、10%(v/v)熱鈍化胎牛血清 (FB S)(英維仇貞公司）、1 %(v/v) MEM•非必須胺基酸不含乙 123 200815469 麩胺（英維仇貞公司）]於潮濕氣氛中於37°C及5%二氧化碳 中隔夜培養。 純化後scFv/IgG之滴定係於磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)中 準備，於37t於檢定分析缓衝液中於IL-17A (1 nM終濃度) 5 共同前培養30-60分鐘。並行地，培養基由細胞中吸取，添 加100微升/孔檢定分析培養基。於其中加入100微升/孔樣 本，培養隔夜（18小時±4小時）。收穫上清液，即刻檢定分析 或儲存於-20°C。 上清液中之IL-6濃度係使用人IL-6杜爾赛（Duoset) 10 ELISA套件組(R&D系統公司）測定。ELISA係於以2微克/毫 克IL-6捕捉抗體(Ab)(於PBS稀釋，1〇〇微升/孔）塗覆隔夜之 芙洛囊克(FhloroNunc)美希索孔板上進行。ELISA孔板以 PBS_呑恩洗三次，添加300微升反應劑稀釋劑（1%胎牛血清 (BSA)於PBS)。於室溫(RT)培養1小時後，ELISA孔板係如 15 前文說明經洗滌。於1小時培養時間，經過調理之培養基係 於1200 rpm離心5分鐘來去除細胞殘骸。於孔板洗滌及經過 調理之培養基製備後，IL-6標準品（濃度範圍1〇〇〇皮克/毫升 -1皮克/毫克）及170微升經過調理之培養基添加至ELISA孔 板，於室溫培養90分鐘。 2〇 培養後，取出樣本，如前洗滌孔板。然後於反應劑稀 釋劑之200奈克/毫升IL-6檢測抗體（1〇〇微升/孔）添加至孔 板，於室溫培養60分鐘。然後孔板如前述洗滌，1〇〇微升鏈 絲菌抗生物素銪於德菲亞檢定分析缓衝液(伯金愛瑪公司） 稀釋1 : 1000，於室溫培養60分鐘。ELISA孔板以德菲亞洗 124 200815469 滌緩衝液洗七次，添加100微升德菲亞加強液(伯金愛瑪公 司）。遵照製造商指示，使用維特(victor)孔板讀取器（伯金 愛瑪公司）於615奈米定量螢光。 資料於Excel (微軟公司（Microsoft))分析，經由對各個 5孔板之IL_6標準品產生標準曲線，使用本曲線來計算各個 孔板中的IL-6存在量。抑制劑資料也使用於無抑制劑對照 存在下得自IL-6之數值與無il_6對照之規度化至最大il_6 釋放百分比。進一步分析係於Prism(葛拉派公司）進行，資 料係以對照反應相對於scFv/IgG濃度對數值之百分比作 10圖。使用Prism曲線匹配軟體（葛拉派公司）計算IC5〇值。 g[_T1080細胞檢定分折測量協同增效之il—6之釋放 本檢定分析為前述HT1080 IL-17誘導IL-6釋放檢定分 析之修改，其中IL-6係回應於人IL-17A及人TNFa(R&D系統 公司）之添加而協同增效性製造。 15 純化後之scF v/IgG之滴定係於磷酸鹽緩衝食鹽水(pb S) 中準備’於37°C於檢定分析培養基中以IL-17A (125 pM IL-17 終濃度)前培養30-60分鐘。並行地，由細胞中吸取培養基， 添加100微升/孔含人TNFa之檢定分析培養基(TNFa終濃度 25 pM)。於其中加入100微升/孔樣本，培養隔夜(18小時土4小 2° 時）。收穫上清液，即刻檢定分析IL-6，或儲存於-20°C。 IL-6濃度係藉ELISA測定，資料係如前文對HT1080 IL-17誘導IL-6釋放檢定分析所述進行分析。 Λ然IL-17A之產生及抗體對T細胞調理培養某誘導由 ΗΤ1080細胞製造IL-6之效應 125 200815469 於含肝素的血袋中採集得自3位捐贈者的人血200毫 升。血液層疊於淋巴製品(lymphoprep) (30毫升血液於15毫 升淋巴製品置於葛來納（Greiner)留可賽(Leucosep)管中）及 離心（2000 rpm，20分鐘，室溫，無煞車）。血漿移入新鮮管 5 内，離心，用來於無菌0.9%食鹽水製造5%自體血漿於無菌 0.9%食鹽水。於介面的單核細胞(PBMC)層移入50毫升離心 管内，各試管内的容量以培養基[RPMI補充10%hiFCS、翅 胺（2 mM)、青黴素（penicillin) (100單位/毫升）及鏈黴素 (streptomycin) (0.1毫克/毫升）及1%非必須胺基酸]加倍。 10 PBMC經過離心（1800 rpm，10分鐘室溫），細胞丸粒各 自懸浮於約15毫升5%血漿，匯集來自於各個捐贈者的血 漿。PBMC於5%血漿洗三次（1000 rpm，10分鐘），來減少血 小板數目，然後再度懸浮於2毫升培養基。 PBMC添加至尼龍綿管柱（波利賽恩斯公司 15 (Polysciences) #425A，使用前，浸泡於培養基且溫熱至37°C) 及培養（1小時，37°C)。然後20毫升培養基逐滴添加至管柱， 收集含有純化後T細胞之流出流。 T細胞於5x 106細胞/毫升終濃度於anti-CD3/anti-CD28 (希格瑪公司（Sigma)皆為1微克/毫升終濃度）、TNFP (R&D 20 系統公司，5奈克/毫升）、IL-23 (R&D系統公司，50奈克/ 毫升）、anti-IFNY(R&D系統公司，1〇微克/毫升)及山羊抗小 鼠IgG交聯劑（希格瑪公司，4微克/毫升)存在下刺激。添加 anti-CD3/anti-CD28後至添加交聯劑之前有5分鐘時間。T細 胞於37°C刺激48小時。細胞經離心（1〇〇〇 rpm，5分鐘)及去 126 200815469 除上清液。 HT1080細胞係以1·5χ104細胞/孔於96孔孔板(柯斯塔公 司）於培養基[DMEM補充10%hiFCS、麩胺(2 1^)、青黴素 (penicillin) (100單位/毫升）及鏈黴素（strept〇mycin) (〇1毫 5克/毫升)及1%非必須胺基酸]於潮濕氣氛下於37。(：及％二氧 化碳播種隔夜。 抗體之滴定係於前述培養基中準備。等量抗體溶液混合 經過調理之T細胞培養基及培養(37°C，1小時）。由細胞取出 培養基，以抗體溶液置換，細胞培養隔夜。收穫上清液，儲 10存於-2(TC，直到使用IL-6如所述進行ELISA (喜托賽 (Cytoset)，生物來源公司)進行分析。il-6值係使用Origin ν7·5 (歐瑞貞實驗室公司（OriginLab Corporation))作圖，來計算 IL-6釋放之抑制之圯別值，且與於無抗體存在下之反應比較。 I骨細胞IL-6/TTJ/MMP13/PGE”釋放檢定分妍 15 於當地醫學倫理委員會核准下，於骨關節炎病人的膝 關節置換手術後取得軟骨。樣本於37°C於2毫克/毫升膠原蛋 白酶中消化隔夜。消化後，軟骨細胞於培養瓶中擴增，培 養瓶含有杜別可改性鷹式培養基，補充10%胎牛血清、青 黴素（100單位)、鏈黴素(〇·1毫克/毫升）、L_麩胺(2 、兩 20 性素（amPh〇teracin) B (2.5微克/毫升）及非必須胺基酸 (IX)。四個分開鈿胞系經培養且用於繼代培養1。軟骨細胞 經收穫’以1.5xl〇4細胞/孔之密度接種於96孔孔板之培養基 中，讓其於30°C、5%二氧化碳黏著隔夜。 anti-IL-17A抗體係於檢定分析培養基[杜別可改性鷹 127 200815469 式培養基，補充2%胎牛血清、青黴素（100單位）、鏈黴素(〇·1 毫克/毫升）、L-麩胺(2 mM)及非必須胺基酸(IX)]以一定濃 度範圍（由〇·〇8 nM至400 nM)稀釋。重組人IL-17A (實驗室 中製備或皮波泰克公司由大腸桿菌衍生）稀釋於檢定分析 5 培養基，以0.2 nM及2 nM終濃度試驗。重組IL_17A添加至 anti-IL-17抗體溶液，前培養1小時。由軟骨細胞移出培養 基，加入100微升重組之IL-17/anti-IL-17A抗體混合物。培 養24小時後收集培養上清液。藉ELISA測量人IL-6、IL-8、 MMP13 及PGE2。 10 ELISA供檢測人IL-6之製造： 遵照製造商的指示，藉ELISA、喜托賽（生物來源公司， CHC1264)測定IL-6。簡言之，ELISA孔板以單株IL-6抗體（1 微克/毫升)於4°C塗覆隔夜，以1% BSA/碳酸氫鹽緩衝液封 阻。孔板係以0.05%呑恩20/PBS洗務，與得自人軟骨細胞及 15 生物素軛合鼠anti-huIL-6抗體(0.4微克/毫升）之培養上清液 於室溫培養2小時。洗滌後，使用辣根過氧化酶軛合鏈絲菌 抗生物素（1:2500)檢測IL-6。使用3,3’，5,5’-四甲基聯苯胺將 孔顯影。以2 Μ硫酸中止反應，使用菲樂史達(PHERAstar) 孔板讀取器測定於450奈米之光密度。 20 ELISA供檢測人IL-8之製造： 遵照製造商的指示，藉ELISA、喜托賽（生物來源公司， CHC1304)測定IL-8。簡言之，ELISA孔板以單株IL-6抗體（1 微克/毫升)於4。(3塗覆隔夜，以1% BSA/碳酸氫鹽緩衝液封 阻。孔板係以0.05%呑恩20/PBS洗滌，與得自人軟骨細胞及 200815469 生物素軛合鼠anti-huIL-8抗體(0.4微克/毫升）之培養上清液 於室溫培養2小時。洗滌後，使用辣根過氧化酶轆合鏈絲菌 抗生物素（1:5000)檢測IL-8。使用3,3’，5,5’-四甲基聯苯胺將 孔顯影。以2 Μ硫酸中止反應，使用菲樂史達孔板讀取器測 5 定於450奈米之光密度。 - ELISA用於檢測人ΜΜΡ13之製造： ELISA孔板以小鼠anti-huMMP13單株抗體（r&d系統 公司，MAB511 : 1微克/毫升)於磷酸鹽緩衝液於4。(3塗覆。 _ 孔板以2% BSA/磷酸鹽緩衝液封阻，接著以〇·〇5%吞恩 10 20/PBS洗滌，與得自人軟骨細胞之上清液加兔 anti_huMMP13 多株抗體（Abeam 9128: 1:2500稀釋液）於 37°C培養2小時。洗滌後，MMP13以辣根過氧化酶軛合抗兔 IgG (阿莫杉生物科學公司（Amersham Biosciences) NA934: 1:2500)檢測。 - 15 使用3,3’，5,5’-四甲基聯苯胺將孔顯影。以2 Μ硫酸中止 - 反應，使用菲樂史達孔板讀取器測定於450奈米之光密度。 _ ELISA用於檢測人PGE2之製造： ELISA孔板以鼠抗兔IgG(希格瑪公司，R2004 : 10微克 /毫升)於4°C塗覆隔夜。孔板以0.05%吞恩20/PBS洗滌，與得 20 自人軟骨細胞、前列腺素AChE追蹤劑（凱曼化學公司 (Cayman Chemicals)，414010)及PGE2抗血清（於實驗室製 備，1:50,000)之上清液於室溫共同培養隔夜。洗滌後，孔 板使用愛爾曼(Ellman’s)試劑（凱曼化學公司，400050)顯 影，使用菲樂史達孔板讀取器測定於405奈米之光密度。 129 200815469 死後軟骨外植艚中之IL-17協同增效檢宗公析 死後膝樣本係以醫事委員會同意得自勤彌爾醫院 (Kings Mill Hospital)，諾丁罕，置於杜別可改性鷹式培養 基(DMEM)中，各個膝關節於無菌條件下使用22號解剖刀解 5剖。可能使一全深度塊單離軟骨。外植體圓盤係使用軟木 塞鑽（5毫米）切下，以96孔孔板每孔1個外植體而接種於220 微升培養基[DMEM(不含酚紅）補充青黴素（1〇〇單位/毫 升）、鏈黴素(0.1毫克/毫升）、麩胺(2 mM)、1%非必須胺基 酸及建它黴素(gentamycin) (1微克/毫升)]。於刺激前外植體 10 休息3日。各條件皆使用12個重複試驗之外植體。 所使用的刺激為單獨培養基、IL-17A (皮波泰克公司） 於10奈克/毫升、TNFa(皮波泰克公司）單獨於1奈克/毫升或 組合全部稀釋於含多黏桿菌素(polymyxin) B硫酸鹽(2微克/ 毫升)之培養基。抗IL-17A中和抗體及其同基因型對照[小鼠 15 （R&D系統公司）人IgG〗 CAT002 (劍橋抗體技術有限公 司）]係於含2微克/毫升多黏桿菌素B之培養基中稀釋成50 nM用於初步實驗，稀釋成〇·5 nM至50 nM用於IC5〇實驗。於 適當時’抗體與細胞激肽混合，全部溶液皆經過培養隨後 才添加至外植體(37°C，30分鐘）。 20 由外植體移出培養基，以220微升刺激培養基置換。孔 板培養72小時(37°C，潮濕氣氛），隨後移出上清液供於_2〇°C 儲存。根據製造商的指示且如實例3之說明（抗體對人IL-17A 之親和力），藉ELISA(喜托賽，生物來源公司）分析IL_6含量。 數值係使用Origin ν7·5 (歐瑞貞實驗室公司）計算。 130 200815469 胞之IL· i7 a協同增效檢定合析 付自全關節置換手術之骨關節炎膝樣本係經過醫事委 員會核准得自勤彌爾醫院，諾丁罕，置於DMEM。各個膝 關即於無菌條件下使用22號解剖刀解剖。由關節切除發炎 5的/月膜’置於無gT75cm2燒瓶内。滑膜塊於dmem[補充青黴 素(100單位/毫升）、鏈黴素(0.1毫克/毫升）、麵胺(2 mM)、1% 非必須胺基酸及兩性素Β (2·5微克/毫升)]，於膠原蛋白酶溶液 (2毫克/毫升)於維持於37°C之潮濕培育 器内培養24小時。 、、二過消化後之滑膜細胞懸浮液經細胞染色、洗條及於 Μ[補充月挺素（1〇〇單位/毫升）、鏈黴素（〇1毫克/毫 升）、麩胺(2 mM)、1%非必須胺基酸及兩性素Β (2.5微克/ *升)]，於維持於3 7。〇之潮濕培育器内進行細胞培養 。每 1-2 週細胞繫f培養，用於繫帶培養2。使用胰蛋白酶_edta由 k瓶内卸下細胞，以每孔15 χ 1〇4細胞接種於％孔孔板，接 15 種後1日使用。 使用之刺激為單獨培養基、單獨IL_17A(皮波泰克公司）、 TNFa(皮波泰克公司）可單獨使用或組合使用 。Anti-IL-17A 中 和抗體及其同基因型對照組[小鼠IgGi (R&D系統公司）人坨仏 CAT002 (劍橋抗體技術有限公司)]於含丨微克/毫升多黏桿菌素 2〇 B之培養基中稀釋至％ nM。於適當時抗體與細胞；敫肽混合， 全部溶液皆係於添加外植體前培養(3Tt，3〇分鐘）。 由細胞移出培養基，以1〇〇微升刺激培養基置換 。孔板
培養24小時(37°c，潮濕氣氛），隨後移出上清液供於_2〇〇c 儲存。根據製造商的指示且如實例3之說明（抗體對人il—17A 131 200815469 之親和力），藉ELISA (喜托賽，生物來源公司）分析IL_8含量。 數值係使用Origin ν7·5 (歐瑞貞貫驗室公司）計算。 於類風濕性關節炎滑液纖中il_17a^ IL-17A/TNFa讀導IL-8之抑盤 5 經過醫事委員會核准’於阿徹金卡R&D公司 (AstraZeneca R&D)崇沃德由全關節置換手術病人取得類風 濕性關節炎的膝關節樣本。RA滑液纖維母細胞於繫帶痒養 2提供予阿徹金卡R&D公司，阿德利公園市。細胞於T225 cm2燒瓶中於DMEM[補充 10% FCS (Hyclone)、青黴素（1〇〇 10單位/毫升）、鏈黴素(〇·1毫克/毫升）、麩胺(2 mM)、1%非必 須胺基酸及兩性素B (2.5微克/毫升)]，於維持於37°C之潮濕 培育器内進行細胞培養。 每1-2週細胞繫帶培養1次，於繫帶培養5使用。使用胰 蛋白酶-EDTA由燒瓶中卸下細胞，以每孔5χ1〇3細胞接種於 15 卯孔孔板，於接種後的3日使用。 使用之刺激為單獨培養基、單獨IL-17A (皮波泰克公司） 單獨使用或組合TNFa(R&D系統公司）使用。Anti-IL-17A中 和抗體及其同基因型對照組[小鼠IgGl (R&D系統公司）人IgGi CAT002 (劍橋抗體技術有限公司）]於含丨微克/毫升多黏桿菌 20素B之培養基中稀釋至50 nM。於適當時抗體與細胞激肽混 合，全部溶液皆係於添加外植體前培養(37°C，30分鐘）。 由細胞移出培養基，以100微升刺激培養基置換。孔板 培養24小時(37°C，潮濕氣氛），隨後移出上清液供於-20°C 儲存。根據製造商的指示且如實例3之說明（抗體對人 132 200815469 IL-17A之親和力），藉ELISA (喜托賽，生物來源公司）分析 IL-8含量。IL-8值經繪圖來產生IC5〇值，IC5〇值係使用〇rigin ν7·5 (歐瑞貞實驗室公司）計算。 ΒΑι分析 5 1化競爭拮抗劑之親和力之主要藥理工具為希爾德 (Schild)分析。使用此種辦法，可測定於功能檢定分析中估 计拮抗劑親和力的與系統無關之手段。該方法係基於拮抗 劑濃度及其親和力可決定激動劑反應之拮抗作用之構想。 由於結構可經過量化，拮抗劑濃度為已知，可判定拮抗劑 10親和力。此種拮抗係經由測量激動劑之等活性濃度比，於 有及無拮抗劑存在下測定稱作為劑量比(DR)來加以量化。 劑量比係經由於無結合成員存在下激動劑（典型為 IL-17A)之EC%相對於於有單一濃度結合成員存在下之激 動劑之ECso之比求出。然後以1〇g(DR_1}表示之劑量比可於 15 1〇g[結合成員]進行線性迴歸用來產生希爾德迴歸。如此， 對每種結合成員濃度，將有一個相對應2DR值；係以 log(DR-l)對log[結合成員]之迴歸作圖。若拮抗作用為競爭 性，則根據希爾德方程式，l〇g(DR-l)與i〇g[結合成員]間有 線姓關姓，其中該方程式如下 20 Log(DR-l) = log[B]-l〇g κΒ [Β]為結合成員之莫耳濃度。 於此等情況下，縱座標之零數值獲得&軸的節點，此處 l〇g[B]=l〇g ΚΒ。因此可產生Log(DR_1) = 〇之結合成員濃度 將等於log KB，結合成員-受體複體之平衡解離常數。用於 133 200815469 結合成員親和力之估計，給系_立之量化。 辦法仙來測定受體拮抗劑之親和力，但基於配體中和之 類似假設’㈣比的計算也允許估躲合成員親和力中和 IL-n對細胞之活性。因Kb值係得自對數作圖，為常能 的對數值。特定濃度之負對數於實驗上稱作為PW2為 可產生激動_量反應曲狀兩倍位移的拮抗劑濃度。括 抗劑強度可經由從方程式計算由可產生劑量比單之拮 抗劑單一濃度，計算PA2來量化，其中 pA2 = log(DR-1 )-l〇g[B] 10 [B]=加倍激動劑濃度來提引出原先低於最大反應所需 之拮抗劑之莫耳濃度。 DR=經由測量於有及無拮抗劑存在下，激動劑之等活 性?辰度比’可定量劑量比。 PA?係由劑量-反應檢定分析資料求出。 用於pA2分析來計算抗體對人IL-17A之親和力之用於 pA2分析之檢定分析方法 HT1080細胞（歐洲細胞培養收集會，ECACC)以5xl〇4 細胞/孔播種於96孔平底組織培養檢定分析孔板(柯斯塔公 司）。然後細胞於200微升檢定分析培養基[MEM含有俄爾斯 2〇 鹽及L_麩胺，10%(v/v)熱鈍化澳洲FBS，1%(ν/ν) MEM-非必 須胺基酸（不含L-麩胺），英維仇貞公司]/孔於潮濕氣氛於 37X：及5%二氧化碳培養隔夜。 IL-17A之滴定（終濃度範圍1 μΜ至7 pM)係於磷酸鹽緩 衝食鹽水(PBS)中置換，以經過純化之IgG(使用之抗體終濃 134 200815469 度範圍為270 nM至270 pM)於檢定分析培養基中於37。〇前 培養30-60分鐘。並行地，由細胞抽取培養基，加入1〇〇微 升/孔檢定分析培養基。於其中添加1〇〇微升/孔樣本，培養 隔夜（18小時±4小時）。上清液經收穫，即刻檢定分析或儲存 5 於-20〇C。 上清液中之IL-6濃度係使用人IL-6杜爾賽ELISA套件組 (R&D系統公司）測定。ELISA係於以2微克/毫克IL-6捕捉抗體 (Ab)(於PBS稀釋，100微升/孔)塗覆隔夜之芙洛囊克美希索孔 _ 板上進行。ELISA孔板以PBS-呑恩洗三次，添加300微升反應 10劑稀釋劑（1%胎牛血清(BSA)於PBS)。於室溫(RT)培養1小時 後，ELISA孔板係如前文說明經洗滌。於1小時培養時間，經 過調理之培養基係於1200 rpm離心5分鐘來去除細胞殘骸。於 孔板洗滌及經過調理之培養基製備後，IL_6標準品（濃度範圍 1000皮克/毫升-1皮克/毫克)及170微升經過調理之培養基添 ， 15加至ELISA孔板，於室溫培養90分鐘。培養後，取出樣本， 一 如前洗滌孔板。然後於反應劑稀釋劑之200奈克/毫升IL_6檢 _ 測抗體（100微升/孔)添加至孔板，於室溫培養60分鐘。然後 孔板如前述洗滌，1〇〇微升鏈絲菌抗生物素銪於德菲亞檢定 分析緩衝液(伯金愛瑪公司）稀釋1 ·· 1000，於室溫培養6〇分 20鐘。ELISA孔板以德菲亞洗滌緩衝液洗七次，添加100微升德 非亞加強液(伯金踅瑪公司）。遵照製造商指示，使用維特孔 板讀取器(伯金愛瑪公司)於615奈米定量螢光。 資料於Excel (微軟公司）分析，經由對各個孔板之比_6 標準品產生標準曲線，使用本曲線來計算各個孔板中的 135 200815469 IL-6存在量。濃度相依性曲線係使用得自IL-6之數值，於無 抑制劑對照存在下，規度化至最大IL-6釋放。於prism(葛拉 派軟體公司）進行分析，此處資料係以對照反應百分比相對 於IgG濃度對數值作圖，使用Prism曲線匹配軟體（葛拉派公 5 司）產生IC5〇值。求取濃度相依性曲線之斜率之平均，固定 來計算劑量比。用來產生希爾德作圖（也以Prism表示），由 pA2值估算Kd值。 由結合成員擾動IL-17A之Η/D交換速率 加標籤之IL-17A係以0.5毫克/毫升於50 mM Tris.HCl 10 pH 7·4，150 mMNaCl使用。 抗體係以10.6毫克/毫升於PBS (1.54 mM KH2P04，2.71 mMNa2HP04，155mMNaClpH7.2)使用。根據製造商指 示，抗體偶合至POROS AL樹脂（應用生物系統公司（Applied Biosystems))來製備100微升管柱，維持於1°C。 15 管柱係於50 mM Tris.HCl pH 7.5，150 mM NaCl製備於 75%D20洗滌。IL-17A係於以75%D20製備成0.125毫克/毫 升之緩衝液稀釋，培養150、500、1500及5000秒，隨後注 射至抗體管柱上。管柱快速以0.2毫升緩衝液於水洗滌，然 後培養相等時間，亦即交換入D20中150秒的樣本交換回水 20 中經歷150秒，也同樣對500秒、1500秒及5000秒之樣本進 行交換。不同的時間點藉首先注入初次80微升甲酸，然後 注入40微升0.8%甲酸洗提。後者40微升經收集，加入20微 升於1°C pH3之2 Μ尿素，1 MTCEP。整體混合物注射至1〇〇 微升含有胃蛋白酶之管柱上來將蛋白酶消化成為胜肽，藉 136 200815469 rpHPLC使用12%-28·5%乙腈梯度分離，質量係於熱費尼根 (Thermo Finnigan) LCQ電喷灑質譜儀及麥可邁斯 (Micromass) Q-TOF質譜儀測定。使用SEQUEST軟體程式 (熱費尼根公司，加州聖荷西市）來識別親代胜肽離子序列。 5 抗體對IL-6不同部分交換速率的影響大致上係如前述 測定，但有下列例外：IL-17首先於含緩衝液之水中稀釋成 0.125毫克/毫升，然後注射至預先以50 mM Tris.HCl ρΗ7·5，150 mM NaCl (於水中準備）洗滌。結合後，管柱以 50 mM Tris HCl ρΗ7·5，150 mM NaCl (於水中準備）洗滌， 10 然後與於75% D20準備之50 mM Tris.HCl pH7.5，150 mM NaCl共同培養150、500、1500及5000秒，隨後交換回H20， 且如前述處理。 突蠻株IL-17A構成體之韓殖、表現及純化 突變株IL-17A係使用Gateway技術（英維仇貞公司）及 15 習知突變發生方法（使用史翠特基因（Stratagene)多位置突 變發生套件組）或聚合酶連鎖反應以C端組胺酸標籤轉殖。 轉殖後之基因使用LR轉殖酶反應插入表現載體pCEP4。 帶有C端His標籤之野生型IL-17A及突變株IL-17A係於 HEK293/EBNA細胞中表現。當細胞為60-70%融合時細胞轉 2〇 移感染30微克DNA/T162燒瓶。使用PEI轉移感染劑(得自希 格瑪公司），細胞培養隔夜，隨後移出培養基，以不含血清 的新鮮培養基置換，又培養72小時。收集得自此等細胞之 上清液，用於純化各重組蛋白質。 得自經過轉移感染之HEK293/EBNA細胞之上清液經 137 200815469 收集，pH調整至7.4,然後於鎳-希法羅斯(Sepharose)快速流 動(GE健康照護公司）上藉親和層析術純化。純化後之蛋白 質透析入PBS緩衝液内，藉SDS-PAGE、愛德曼(Edman) N 端排序及西方墨點，使用抗組織胺抗體作為檢測工具分 5 析。證實蛋白質的身份，隨後開始結合研究及功能研究。 經由組合於280奈米之吸光比係藉庫馬希蘭（Coomassie blue)於SDS-PAGE測定染色濃度的組合來判定濃度。 野生型IL-17A及穿轡姝IL-17A之BIAcore結会f驗 根據製造商指示，使用BIAcore 3000及胺偶合套件組 10 (BIAcore型錄號碼BR-1000-50)將100微克/毫升抗體制動於 CM5感測器晶片（BIAcore型錄號碼BR-1033-99)表面。使用 10 mM甘胺酸pH 1.5，藉酸再生來再生基準線。各次實驗 前，建立基準線，以10微升/分鐘速率將配體(25 nM)注射於 晶片表面上7分鐘時間。經由測量注射前30秒和注射後60秒 15 之信號(RU)，由後者扣除前者，測定結合之IL-17A數量。 HT1080 IL-17讀導IL-6釋放檢定分析(抗原決定部位映射研努λ ΗΤ1080細胞((歐洲細胞培養收集會ECACC，以ECACC No· 85111505獲得）以5 X 104細胞/孔播種於96孔平底組織培 養檢定分析孔板(村斯塔公司）。然後細胞於200微升檢定分 20 析培養基[最低必須培養基(MEM)含有俄爾斯鹽及l麩胺 (英維仇貞公司）、1%青黴素及鏈黴素、1〇%(ν/ν)熱鈍化胎 牛血清(FBS) (Hyclone)(英維仇貞公司）、1%(ν/ν) MEM-非 必須胺基酸不含L麩胺（英維仇貞公司）]於潮濕氣氛中於 37°C及5%二氧化碳中隔夜培養。 138 200815469 感興趣之抗體或對照IgG之滴定係於檢定分析培養基 中準備，以IL-17A或IL-17A突變株形式（終濃度如表2〇b之 摘述，範圍1-2 nM)於37°C前培養30-60分鐘。此外，準備單 獨IL-17A或突變之滴定曲線來評估細胞對配體反 5應。由細胞抽取培養基，加入100微升/孔培養的抗體及 IL-17A (或突變株IL_17A)或單獨IL_17A及培養隔夜（^小 犄土4小時）。收穫上清液，即刻檢定分析且儲存於_20°C。實 驗中各個資料點係重複試驗三次。
上清液中的IL-6濃度係如「軟骨細胞 10 ΙΙ^6/Ιί·8/ΜΜΡ13/ΡΟΕ2釋放檢定分析」材料及方法章節之 摘述測定。 使用「標準校準及未知數之計算」，由標準曲線外推未 知數值；使用Origin ν7·5 (歐瑞貞實驗室公司）之r劑量反應 -1-15集合」計算IC5〇。 15 序列 結合成員之VH功能部位、VL功能部位、及CDR序列顯 不於隨附之序列表，其中SEQIDNOS對應如下：
PTN = 胺基酸序列 1 抗體 01 VH DNA 2 抗體 01 VH PTN 3 抗體 01 VH CDR1 PTN 4 抗體 01 VH CDR2 PTN 5 抗體 01 VH CDR3 PTN 6 抗體 01 VLDNA 7 抗體 01 VLPTN 8 抗體 01 VLCDR1 PTN 9 抗體 01 VLCDR2 PTN 10 抗體01 VLCDR3 PTN 11 抗體 02 VH DNA 12 抗體 02 VH PTN 13 抗體02 VH CDR1 PTN 14 抗體 02 VH CDR2 PTN 15 抗體 02 VH CDR3 PTN 16 抗體 02 VLDNA 17 抗體 02 VLPTN 18 抗體02 VLCDR1 PTN 19 抗體 02 VLCDR2PTN 20 抗體 02 VL CDR3 PTN 21 抗體 02 VH DNA 22 抗體 03VHPTN · 139 200815469
23 抗體03 VH CDRl PTN 24 抗體 03 VH CDR2 PTN 25 抗體 03 VH CDR3 PTN 26 抗體03 VLDNA 27 抗體 03 VL PTN 28 抗體03 VL CDRl PTN 29 抗體 03 VL CDR2 PTN 30 抗體 03 VL CDR3 PTN 31 抗體 04 VH DNA 32 抗體 04 VH PTN 33 抗體04 VH CDRl PTN 34 抗體 04 VH CDR2 PTN 35 抗體 04 VH CDR3 PTN 36 抗體04 VLDNA 37 抗體 04 VL PTN 38 抗體04 VL CDRl PTN 39 抗體 04 VLCDR2 PTN 40 抗體 04 VLCDR3 PTN 41 抗體 05 VH DNA 42 抗體05 VH PTN 43 抗體05 VH CDRl PTN 44 抗體 05 VH CDR2 PTN 45 抗體 05 VH CDR3 PTN 46 抗體05 VLDNA 47 抗體 05 VL PTN 48 抗體05 VL CDRl PTN 49 抗體 05 VL CDR2 PTN 50 抗體05 VLCDR3 PTN 51 抗體 06 VH DNA 52 抗體 06 VH PTN 53 抗體06 VH CDRl PTN 54 抗體06 VH CDR2 PTN 55 抗體 06 VH CDR3 PTN 56 抗體06 VLDNA 57 抗體 06 VL PTN 58 抗體06 VL CDRl PTN 59 抗體 06 VLCDR2 PTN 60 抗體06 VLCDR3 PTN 61 抗體 07 VH DNA 62 抗體 07 VH PTN
抗體07 VH CDRl ΡΤΝ 抗體07 VH CDR2 PTN 抗體07 VH CDR3 ΡΤΝ 抗體 07 VLDNA 抗體 07 VL ΡΤΝ 抗體07 VL CDRl ΡΤΝ 抗體 07 VLCDR2 ΡΤΝ 抗體07 VLCDR3 ΡΤΝ 抗體 08 VH DNA 抗體08 VH PTN 抗體08 VH CDRl PTN 抗體 08 VH CDR2 PTN 抗體 08 VH CDR3 PTN 抗體08 VLDNA 抗體 08 VL PTN 抗體08 VL CDRl PTN 抗體 08 VLCDR2 PTN 抗體08 VLCDR3 PTN 抗體 09 VH DNA 抗體09 VH PTN 抗體09 VH CDRl PTN 抗體 09 VH CDR2 PTN 抗體 09 VH CDR3 PTN 抗體09 VLDNA 抗體09 VL PTN 抗體09 VL CDRl PTN 抗體 09 VL CDR2 PTN 抗體 09 VLCDR3 PTN 抗體 10 VH DNA 抗體 10 VH PTN 抗體 10 VH CDRl PTN 抗體 10 VH CDR2 PTN 抗體 10 VH CDR3 PTN 抗體 10 VLDNA 抗體 10 VL PTN 抗體 10 VL CDRl PTN 抗體 10 VLCDR2 PTN 抗體 10 VL CDR3 PTN 抗體 11 VH DNA 抗體 11 VH PTN 140 200815469
103 抗體 11 VH CDR1 PTN 143 抗體 15 VH CDR1 PTN 104 抗體 11 VH CDR2 PTN 144 抗體 15 VH CDR2 PTN 105 抗體 11 VH CDR3 PTN 145 抗體 15 VH CDR3 PTN 106 抗體 11 VLDNA 146 抗體 15 VLDNA 107 抗體 11 VL PTN 147 抗體 15 VL PTN 108 抗體 11 VLCDR1 PTN 148 抗體 15 VL CDR1 PTN 109 抗體 11 VL CDR2 PTN 149 抗體 15 VLCDR2 PTN 110 抗體 11 VLCDR3 PTN 150 抗體 15 VLCDR3 PTN 111 抗體 12 VH DNA 151 抗體 16 VH DNA 112 抗體 12 VH PTN 152 抗體 16 VH PTN 113 抗體 12 VH CDR1 PTN 153 抗體 16 VH CDR1 PTN 114 抗體 12 VH CDR2 PTN 154 抗體 16 VH CDR2 PTN 115 抗體 12 VH CDR3 PTN 155 抗體 16 VH CDR3 PTN 116 抗體 12 VLDNA 156 抗體 16 VLDNA 117 抗體 12 VL PTN 157 抗體 16 VL PTN 1Ϊ8 抗體 12 VL CDR1 PTN 158 抗體 16 VL CDR1 PTN 119 抗體 12 VLCDR2 PTN 159 抗體 16 VL CDR2 PTN 120 抗體 12 VLCDR3 PTN 160 抗體 16 VLCDR3 PTN 121 抗體 13 VH DNA 161 馬來猴IL-17 DNA 122 抗體 13 VH PTN 162 馬來猴IL-17 PTN 123 抗體 13 VH CDR1 PTN 163 抗體1 VL DNA 124 抗體 13 VH CDR2 PTN 164 抗體1 VLPTN 125 抗體 13 VH CDR3 PTN 165 抗體2 VLDNA 126 抗體 13 VLDNA 166 抗體2 VLPTN 127 抗體 13 VL PTN 167 抗體3及9 VLDNA 128 抗體 13 VL CDR1 PTN 168 抗體3及9 VLPTN 129 抗體 13 VLCDR2 PTN 169 抗體4 VLDNA 130 抗體 13 VLCDR3 PTN 170 抗體4 VLPTN 131 抗體 14 VH DNA 171 抗體5及8 VLDNA 132 抗體 14 VH PTN 172 抗體5及8 VLPTN 133 抗體 14 VH CDR1 PTN 173 抗體6 VLDNA 134 抗體 14 VH CDR2 PTN 174 抗體6 VLPTN 135 抗體 14 VH CDR3 PTN 175 抗體7 VLDNA 136 抗體 14 VLDNA 176 抗體7 VLPTN 137 抗體 14 VL PTN 177 抗體 10 VLDNA 138 抗體 14 VLCDR1 PTN 178 抗體 10 VLPTN 139 抗體 14 VLCDR2PTN 179 抗體 11 VLDNA 140 抗體 14 VLCDR3 PTN 180 抗體 11 VLPTN 141 抗體 15 VH DNA 181 抗體12及16 VLDNA 142 抗體 15 VH PTN 182 抗體12及16 VLPTN 141 200815469
197 加標籤之成熟hIL-17A
183 抗體 13 VLDNA
184 抗體 13 VLPTN
185 抗體 14 VLDNA
186 抗體 14 VLPTN
187 抗體 15 VLDNA
188 抗體 15 VLPTN
189 VHFR1PTN
193 VLFR1PTN
194 VLFR2PTN
195 VLFR3PTN
196 VLFR4PTN
198 成熟人IL-17A 199 人IL-17A胜肽
190 VHFR2PTN 191 VHFR3PTN 192 VHFR4PTN 200 加標籤之突變株前驅物
hIL-17A
2〇1 突變株成熟人IL-17A 抗體3、4及5有相同VH功能部位。 抗體9、10及12有相同VH功能部位。 抗體2及10有相同VL CDR。對抗體2所顯示之VL功能 部位序列經過生殖系列化，而對抗體10所顯示之VL功能部 5 位序列未經生殖系列化。 抗體3、9及11有相同VL功能部位。 抗體4及15有相同VL功能部位。 抗體5及8有相同VL功能部位。 抗體12及16有相同VL功能部位。
10 抗體1至16之VL功能部位核苷酸序列不包括於SEQ ID NO : 6, 16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146及156之3’端所示gag密碼子。相對應地，VL功能部位胺 基酸序列不包括分別於SEQ ID NO: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147及 157之C端Glu殘基（殘 15 基112)。Glul 12殘基及相對應之gag密碼子並未於抗體1至16 表現。比較所書寫的與生殖系列基因片段，指示Glu殘基及 相對應之gag密碼子不構成VL功能部位之一部分。 於位置111之Gly殘基(卡貝特殘基1〇8)係存在於所表現 142 200815469 之scFv及IgG序列。但此殘基不存在於構成VL功能部位之框 架4區的人生殖系列j節段序列。Gly殘基未被視為Vl功能部 位之一部分。 欲表現IgG之輕鏈，提供編碼抗體輕鏈之核苔酸序列， 5包含編碼VL功能部位之第一表現序列、編碼cl功能部位之 第二表現序列、及隔開第一表現序列與第二表現序列之插 入序列。於正常情況下，插入序列係藉細胞mRNA處理機 構勇接’將第一表現序列之3’端接合至第二表現序列之5， ® 端。如此，當有核苷酸序列之DNA表現為RNA時，第一表 10現序列與第二表現序列共同剪接。剪接後的RNA轉譯，製 造包含VL功能部位及CL功能部位之多胜肽。剪接後，於位 置111之Gly由VL功能部位框架4序列之最末一個鹼基(g)編 碼及CL功能部位之頭兩個鹼基(gt)編碼。 抗體1至16之VL功能部位序列為如前文指示之SEq id ' I5 N0 : 163至188。VL功能部位核苷酸序列係以eta結束作為 最末字碼子，L⑶為相對應之VL功能部位胺基酸序列中之 ® 最末絲酸殘基。 L圖式簡單說明;j 第1圖為N端加標籤之人il-ΠΑ胺基酸序列（SEQ ID 20 NO: 197hN端標籤殘基1至21之下方畫線。與成熟人IL_i7A 之殘基71-87相對應之殘基92-108被框出（SEQ ID NO: 199)。 第2圖為有C端His5標籤之全長前驅物人IL_17A胺基酸 序列（SEQ ID NO : 200)。23胺基酸殘基之N端信號胜肽顯示 為下方晝線。由野生型人IL-17突變之殘基(SEQ ID NO: 198) 143 200815469 以粗體字及下方畫線表示，框出與成熟人IL-17A之殘基 71-87相對應之序列SEQ ID NO : 199。不含N端胜肽及His 標籤之成熟突變株人II-17A為SEQIDNO : 201。 【主要元件符號說明】 (無）
144 200815469 參考文獻 本說明書它處引用之全部參考文獻，包括前文任一處 所引用之參考文獻全文以引用方式併入此處。
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<150〉 US 60/815,828 <151〉 2006-06-23 〈150〉 US 60/913,566 <151〉 2007-04-24 <160> 201 <170> Patentln version 3. 3 <210> 1 <211〉 354 <212〉 DNA <213〉人類 <220> 〈223> 抗體 01 <400> 1
60 120 180 240 300 354 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagatcta atttggggag tggctgggag ctggggccag gggacaatgg tcaccgtctc ctca <210〉 2 <211> 118 〈212〉 PRT <213> 人類 <220〉 <223> 抗體01 〈400〉 2 153 200815469
Glu Val Gin Leu
Ser Leu Arg Leu 20 Ala Met Ser Trp 35 Ser Ala lie Ser 50 Lys Gly Arg Phe 65 Leu Gin Met Asn
Ala Arg Asp Leu 100 Met Val Thr Val 115
Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30 Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45 Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 55 60 Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 70 75 80 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 lie Trp Gly Val Ala Gly Ser Trp Gly Gin Gly Thr 105 110 Ser Ser <210〉 3 <211〉 5 <212> PRT <213〉人類<220〉 <223〉抗體 01 <400〉 3 Ser Tyr Ala Met
Ser 5 0 12 3 1± IX IX 2 2 2 2 < < < <
T <220〉 〈223> 抗體 01 <400> 4 Ala lie Ser Gly
Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15
Gly <210〉 5 〈211〉 9 <212> PRT <213〉人類 154 200815469 <220〉 <223〉抗體 01 〈400> 5
Asp Leu lie Trp Gly Val Ala Gly Ser 5 〈210〉 6 〈211〉 336 <212> DNA 〈213> 人類 <220> <223〉抗體 01 <400〉 6
60 120 180 240 300 336 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagtctt atgatgacag cagcgtggtg ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtgag <210> 7 〈211〉 112 〈212〉 PRT <213〉人類 <220> 〈223> 抗體 01 〈400〉 7
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 5 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 35 40 45
He Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Asp 85 90 95 155 200815469
Ser Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu 100 105 110 <210〉 8 <211〉 13 <212> PRT <213〉人類 〈220〉 〈223> 抗體 01 <400> 8
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr Tyr Val Gin 5 10 <210〉 9 〈211〉 7 <212> PRT 〈213〉人類 <220〉 〈223> 抗體 01 <400〉 9
Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser <210〉 10 <211〉 9 <212> PRT <213〉人類 <220> <223〉抗體 01 <400〉 l〇
Gin Ser Tyr Asp Asp Ser Ser Val Val 5 > > > > 0 12 3 IX 1x 1x IX 2 2 2 2 〈220> <223〉抗體 〇2 <400〉 11 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 156 200815469 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagatcta 300 atttggggag tggctgggag ctggggccag gggacactgg tcaccgtctc ctca 354 0 12 3 1X iix 1x 1x 2 2 2 2 < < < < 00 T類 2 1 R V 1 1 p Ay 〈220> 〈223〉抗體 02 <400> 12
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Leu lie Trp Gly Val Ala Gly Ser Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 0 12 3 1X 1A lx 1± 2 2 2 2 < < < <
T類 〈220〉 <223〉抗體 02 <400> 13
Ser Tyr Ala Met Ser 5 <210〉 14 〈211〉 17
<212> PRT 157 200815469 〈213> 人類 <220〉 <223〉抗體 02 <400> 14
Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15
Gly 〈210〉 15 〈211〉 9 〈212〉 PRT 〈213> 人類 <220> 〈223> 抗體 02 〈400〉 15
Asp Leu lie Trp Gly Val Ala Gly Ser 5 <210> 16 <211〉 336
<212〉 DNA <213〉人類 ， 〈220〉 60 120 180 240 300 336 〈223> 抗體 02 <400> 16 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc ccgggcagtt cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagtcgt acgaccccca cagcgtggtg ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtgag 〈210〉 17 〈211〉 112 <212> PRT 〈213> 人類 <220> 〈223> 抗體 02 〈400〉 17
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 158 200815469 5 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr lie Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Gly 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Pro 85 90 95
His Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu 100 105 110 T類 8 3 R V 1 1 p Ay > > > > 0 12 3 1i ία 1i 11 2 2 2 2 < < \/ < <220> 〈223> 抗體 02 <400〉18 ’ :
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr Tyr Val Gin 5 10 〈210〉 19 〈211〉 7 <212> PRT 〈213> 人類 <220> 〈223> 抗體 02 <400〉 19
Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser 5 0 12 3 2 2 2 2 < < < <
<220〉 〈223> 抗體 02 <400> 20
Gin Ser Tyr Asp Pro His Ser Val Val 159 5 200815469 <210〉 21 <211> 354 <212> DNA 〈213> 人類 <220〉 <223〉抗體 03 <400〉 21 60 120 180 240 300 354 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagatcta attcacgggg tgacgcggaa ctggggccag gggacactgg tcaccgtctc ctca 〈210〉 22 <211〉 118 <212〉 PRT 〈213>人類 <220> 〈223> 抗體 03 <400〉 22
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Leu lie His Gly Val Thr Arg Asn Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 160 200815469 > > > > 0 12 3 IX 1x IX 1x 2 2 2 2 T類 3 R、 2 5 p Ax <220> <223〉抗體 03 <400> 23
Ser Tyr Ala Met Ser 5 > > > > 0 12 3 11 11 1± 1 2 2 2 2 T類 4 7 R 2 1 p A/ <220〉 <223〉抗體 03 <400〉 24
Ala He Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15
Gly > > > > 0 12 3 1M 1x ix 2 2 2 2 T類 5 R 2 9 p // <220> <223〉抗體 03 <400> 25
Asp Leu lie His Gly Val Thr Arg Asn 5 <210〉 26 <211> 336 <212> DNA 〈213〉人類 <220〉 〈223> 抗體 03 〈400〉 26 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 I6l 200815469 ctgaagactg aggacgag ttcggcggag ggaccaag <210> 27 <211> 112 <212> PRT 〈213> 人類 <220〉 <223〉抗體 03 <400> 27 Asn Phe Met Leu Thr 5 Thr Val Thr lie Ser ' 20 Tyr Val Gin Trp Tyr 35 lie Phe Ala Asn Asn 50 Gly Ser lie Asp Ser 65 Leu Lys Thr Glu Asp 85 His Ser Val Val Phe 100 gc tgactactac tgccagtcct actcccccca cagcgtggtg 300 ct gaccgtccta ggtgag 336
Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 10 15
Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 25 30
Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 40 45
Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 55 60
Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 70 75 80
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Ser Pro 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu 105 110 <210〉 <211><212> <213> T類 8 3 R IV 2 1 p <220〉 〈223> 抗體 03 <400> 28 Thr Arg Ser Ser Gly 5
Ser Leu Ala Asn Tyr Tyr Val Gin 10 〈210〉 29 〈211〉 7 <212〉 PRT <213〉人類 〈220〉 〈223> 抗體 03 162 200815469 <400〉 29
Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser 5 T類 OR、 3 9 p Ax > > > > 0 12 3 i—* lx 1x 2 2 2 2 <220〉 <223〉抗體 03 <400> 30
Gin Ser Tyr Ser Pro His Ser Val Val
A類 DN人 > > > > 0 12 3 IX IX 1x 2 2 2 2 15 3 3 〈220〉 <223〉抗體 04 <400〉 31 gaggtgcagc tgttggagtc tcctgtgcag cctctggatt ccagggaagg ggctggagtg gcagactccg tgaagggccg ctgcaaatga acagcctgag attcacgggg tgacgcggaa tgggggaggc ttggtacagc cacctttagc agctatgcca ggtctcagct attagtggta gttcaccatc tccagagaca agccgaggac acggccgtgt ctggggccag gggacactgg ctggggggtc cctgagactc tgagctgggt ccgccaggct gtggtggtag cacatactac attccaagaa cacgctgtat attactgtgc aagagatcta tcaccgtctc ctca 60 120 180 240 300 354 > > > > 0 12 3 1M 1± 2 2 2 2 8 T類 2 1 R 3 1 p // <220> <223〉抗體 04 <400〉 32
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Yal 35 40 45 163 200815469
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly 50 55 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser 65 70 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg 85 Ala Arg Asp Leu lie His Gly 100 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 ly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 60 rg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 75 80 la Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95 al Thr Arg Asn Trp Gly Gin Gly Thr 105 110 > > > > 0 12 3 1i 1± 11 11 2 2 2 2 <220〉 〈223> 抗體 04 <400〉 33
Ser Tyr Ala Met Ser 5 <210〉 〈211> <212〉 <213〉 <220〉 <223〉抗體 04 <400> 34 er Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 10 15
Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly
Gly <210〉 35 <211〉 9 <212> PRT <213〉人類 <220> <223〉抗體 04 <400> 35 rg Asn
Asp Leu lie His Gly Val Thr 5 164 200815469 <210> 36 <211> 336 <212〉 DNA <213〉人類 <220> <223〉抗體 04
2 T類 7 τ—- R oo 1 p Ay > > > > 0 12 3 1X i—< t—A lx 2 2 2 2 <400> 36 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagtcct actccccgac gagcgtggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtgag 336 〈220> 〈223> 抗體 04 <400> 37
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 5 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Ser Pro 85 90 95
Thr Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu 100 105 110 > > > > 0 12 3 t—Η τ—X 1x 1x 2 2 2 2 T類 8 3 R 3 1 p 165 200815469 <220〉 〈223> 抗體 04 <400> 38
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr Tyr Val Gin 5 10 <210> 39 <211> 7 <212〉 PRT 〈213> 人類 <220〉 <223〉抗體 04 <400〉 39
Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser 5 T類 o R IV 4 9 p "S > > > > 0 12 3 IX ix IX 2 2 2 2 <220〉 〈223> 抗體 04 <400〉 40
Gin Ser Tyr Ser Pro Thr Ser Val Val 5 <210> 41 〈211〉 354 〈212〉 DNA <213> 人類 <220〉 <223〉抗體 05 <400> 41 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attcacgggg tgacgcggaa ctggggccag gggacactgg <210> 42 ctggggggtc cctgagactc 60 tgagctgggt ccgccaggct 120 gtggtggtag cacatactac 180 attccaagaa cacgctgtat 240 attactgtgc aagagatcta 300 tcaccgtctc ctca 354 166 200815469 〈211〉 118 <212> PRT <213〉人類 〈220〉 <223〉抗體 05 <400> 42
Glu Val Gin Leu Leu Giu Ser Giy Gly Giy Leu Vai Gin Pro Gly Gly 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Leu lie His Gly Val Thr Arg Asn Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 〈210〉 43 <211> 5 〈212〉 PRT 〈213> 人類 <220〉 <223〉抗體 05 <400> 43
Ser Tyr Ala Met Ser 5 > > > > 0 12 3 1X 11 1i IX 2 2 2 2 〈220> <223〉抗體 05 <400> 44
Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15 167 200815469
Gly <210> 45 <211〉 9 <212> PRT 〈213〉人類 <220> <223〉抗體 05 <400> 45
Asp Leu lie His Gly Val Thr Arg Asn 5 〈210〉 6DA1 <211> <212> <213> <220> <223〉抗體 05 <400〉 46 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagtctt ataaccacaa ggacatcgtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtgag 336 > > > > 0 12 3 IX 1x IX 1X 2 2 2 2 2 T類 7 1 R (V 4 1 p <220> 〈223> 抗體 05 <400> 47
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 5 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 168 200815469 50 55 Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser 65 70 Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala 85 Lys Asp lie Val Phe Gly Gly 100 60
Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 75 80
Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asn His 90 95
Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu 105 110
<210><211><212><213〉
T類 8 3 R tv 4 1 p "S <220>〈223> 抗體 05 <400〉 48 Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu5
Ala Asn Tyr Tyr Val Gin10 0 12 3 IT—It—I i—_ 2 2 2 2 < < < <
<220〉<223〉抗體 05 <400> 49 Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser5 > > > > 0 12 3 i—Η τ—A 1± 2 2 2 2 50 9 PRT人類
<220〉 <223> <400> Gin S 抗體05 50
Tyr Asn His Lys Asp 5
He Val <210><211> 〈212〉<213> 169 <220> 200815469 <223〉抗體 06 <400> 51 gaggtgcagc tgt^tggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagatcta 300 atttggggag tggctgggag ctggggccag gggacactgg tcaccgtctc ctca 354 > > > > 0 12 3 IX IX IX 2 2 2 2 2 5
8 T 1 R 類 人 <220〉 <223〉抗體 06 <400> 52 ,
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Leu lie Trp Gly Val Ala Gly Ser Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 > > > > 0 12 3 IX 1x 1i 2 2 2 2 T類 3 R IV 5 5 p 〈220> <223〉抗體 06 <400〉 53 170 200815469
Ser Tyr Ala Met Ser T類 4 7 R IV 5 1 p > > > > 0 12 3 1X 1x 1x 1x 2 2 2 2 <220〉 <223〉抗體 06 <400> 54 Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15
Gly T類 5 R 5 9 p "S > > > > 0 12 3 1X 1x 1x 1X 2 2 2 2 〈220〉 <223〉抗體 06 <400> 55 Asp Leu lie Trp Gly Val Ala Gly Ser 5 > > > > 0 12 3 IX 11 1± IX 2 2 2 2 <220> 〈223> 抗體 06 <400> 56 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagtcgt acagcccgag cagcgtggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtgag 336
<210> 57<211〉 112 〈212〉 PRT I7l 200815469 〈213〉人類 <220> 〈223> 抗體 06 〈400〉 57 Asn Phe Met Leu
Thr Val Thr lie 20 Tyr Val Gin Trp 35 lie Phe Ala Asn 50 Gly Ser lie Asp 65 Leu Lys Thr Glu
Ser Ser Val Val 100 0 12 3 IX ix 1x 2 2 2 2 < < <
Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 5 10 15
Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 25 30
Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 40 45
Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 55 60
Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Ser Pro 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu 105 110 <220〉 <223〉抗體 06 <400> 58 Thr Arg Ser Ser
Gly Ser Leu Ala Asn Tyr Tyr Val Gin 5 10 <210〉 59 <211〉 7 〈212〉 PRT <213〉人類 <220> <223〉抗體 06 〈400〉 59
Arg Pro Ser 5
Ala Asn Asn Gin
<210〉 60 <211> 9 <212> PRT 172 200815469 <213〉人類 <220> 〈223> 抗體 06 <400> 60
Gin Ser Tyr Ser Pro Ser Ser Val Val 5 > > > > 0 12 3 τ—^ lx 1x 1M 2 2 2 2
4 A類 1 5 N IV 6 3 D "S 〈220〉 <223〉抗體 07 <400〉 61 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagatcta 300 attcacgggg tgacgcggaa ctggggccag gggacactgg tcaccgtctc ctca 354 0 12 3 1111 2 2 2 2 < < < <
<220〉 〈223> 抗體 07
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 173 200815469
Ala Arg Asp Leu lie His Gly Val Thr Arg Asn Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 63 <211> 5 <212> PRT <213〉人類 〈220〉 〈223> 抗體 07 <400〉 63 0 12 3 ΙΑ li 1X lx 2 2 2 2 < < < < T類 4 7 R |\ 6 1—IP Ay <220> 〈223〉抗體 07 〈400〉 64
Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15 > > > > 0 12 3 1X IX IX 2 2 2 2
T 〈220> 〈223> 抗體 07 <400> 65
Asp Leu lie His Gly Val Thr Arg Asn 5 > > > > 0 12 3 IX 1—* T-* 2 2 2 2 <220〉 <223〉抗體 07 174 200815469 <400> 66 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtt cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240 " ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagacgt acgaccccta cagcgtggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtgag 336 0 12 3 IX IX 11 2 2 2 2 < < < < <220〉 <223〉抗體 07 <400〉 67
Ser Pro Gly Lys 15
Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu 5 10
Asn Phe Met Leu
Thr Val Thr lie 20
Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser 25
Leu Ala Asn Tyr 30
Tyr Val Gin Trp 35
Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ser 40
Pro Thr lie Val 45 lie Phe Ala Asn 50
Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 55 60
Gly Ser lie Asp 65
Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu 70 75
Thr lie Ser Gly 80
Thr Tyr Asp Pro 95
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin 85 90
Tyr Ser Val Val 100
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 105
Val Leu Gly Glu 110 > > > > 0 12 3 1—-111 2 2 2 2 T類 8 3 R IV 6 1 p 〈220> <223〉抗體 07 <400> 68
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr Tyr Yal Gin 5 10 175 200815469 T類 9 R 6 7 p 1/ > > > > 0 12 3 1—I 1—111 2 2 2 2 <220> 〈223> 抗體 07 <400> 69
Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser <210> 70 〈211〉 9 〈212〉 PRT <213〉人類 <220〉 〈223> 抗體 07 <400> 70
Gin Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Val Val 5 > > > > 0 12 3 ΙΑ 1x t—-- ix 2 2 2 2 8 T類 2 1 R tv 7 1 p 〈210〉 71 <211〉 354 <212> DNA 〈213〉 人類 <220〉 <223> 抗體08 <400> 71 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagatcta 300 atttggggag tggctgggag ctggggccag gggacaatgg tcaccgtctc ctca 354 <220> <223〉抗體 08 <400> 72 176 200815469
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser 5 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 20 Ala Met Ser Trp Val Arg Gin 35 Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly 50 55 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser 65 70 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg 85 Ala Arg Asp Leu lie Trp Gly
Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 10 15
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 60
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 75 80
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95
Val Ala Gly Ser Trp Gly Gin Gly Thr 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser 115 T類 3 K L 7 5 p > > > > 0 12 3 1X 1x * —I* 1X 2 2 2 2 <220> <223〉抗體 08 <400> 73
Ser Tyr Ala Met Ser 0 12 3 11—111 2 2 2 2 < < < < 4 7 R 7 1 p Ay
T R 類 <220> <223〉抗體 08 <400> 74
Ala lie Ser Gly Ser Gly Giy Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15
Gly > > > > 0 12 3 IX τ―I i―H 2 2 2 2 177 200815469 <220〉 〈223> 抗體 08 <400> 75
Asp Leu lie Trp Gly Val Ala Gly Ser 5 > > > > 0 12 3 IX 1x IX 11 2 2 2 2 <220> <223〉抗體 08 <400> 76 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagtctt ataaccacaa ggacatcgtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtgag 336 <210> 77 <211〉 112 〈212〉 PRT 〈213〉人類 <220〉 <223〉抗體 08 <400> 77
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 5 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asn His 85 90 95
Lys Asp lie Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu 178 200815469 > > > > 0 12 3 1± τ—^ τ—X 1Λ 2 2 2 2 T類 8 3 R 7- 1x or <220> <223〉抗體 08 <400〉 78
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr Tyr Val Gin 5 10 T類 9 R 7 7 p /y > > > > 0 12 3 1X τ—1x 1S 2 2 2 2 〈220〉 〈223〉抗體 08 <400> 79
Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser 5 T類 o R IV s 9 p /y > > > > 0 12 3 1X 1x 1x 1x 2 2 2 2 < < < < <220> 〈223> 抗體 08 <400〉 80
Gin Ser Tyr Asn His Lys Asp lie Val 5 > > > > 0 12 3 1x 1x 1x 2 2 2 2
4 A類 1 5 N 8 3 D /X <220〉 <223〉抗體 09 <400> 81 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 179 200815469 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagatcta 300 attttcgggg tggggggggg gtggggccag gggacaatgg tcaccgtctc ctca 354 8 T類 2 1 R IV 8 1 p // <210> 〈211> 〈212〉 <213〉 <220〉 <223〉抗體 09 <400> 82
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Leu lie Phe Gly Val Gly Gly Gly Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser 115 T類 3 R、 8 5 p > > > > 0 12 3 IX IX IX IX 2 2 2 2 <220〉 〈223> 抗體 09 <400> 83
Ser Tyr Ala Met Ser 5 0 12 3 1± IX IX IX 2 2 2 2 < < < < 180 200815469<220> <223〉抗體 09 <400> 84 Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys T類 5 R L 8 9 p 乂 > > > > 0 12 3 IX 1x IX 1± 2 2 2 2 〈220〉 <223〉抗體 09 <400〉 85
Asp Leu lie Phe Gly Val Gly Gly Gly 5 > > > > 0 12 3 IX 1x IX 11 2 2 2 2 〈220〉 〈223> 抗體 09 <400> 86 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagtcct actcccccca cagcgtggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtgag 336 > > > > 0 12 3 1X 1± IX 2 2 2 2 〈220〉 <223〉抗體 09 <400〉 87 Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 5 10 15 I8l 200815469
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30 Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80 Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Ser Pro 85 90 95 His Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu 100 105 110 <210> 〈211> 〈212>〈213> 〈220〉〈223> 抗體 09 〈400〉 88 Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr Tyr Val Gin 5 10 > > > > 0 12 3 11 1± IX 2 2 2 2 〈220〉<223> 抗體 09 <400〉 89 Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser 5 T類 o R IV 9 9 p > > > > 0 12 3 1± IX 1± 1x 2 2 2 2 〈220>〈223> 抗體 09 <400〉 90 Gin Ser Tyr Ser Pro His Ser Val Val 5 182 200815469 <210〉 91 <211> 354 <212> DNA <213〉人類 <220> <223〉抗體 10 <400〉 91 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagatcta
60 120 180 240 300 354 attttcgggg tggggggggg gtggggccag gggacaatgg tcaccgtctc ctca <210> 92 〈211〉 118 〈212〉 PRT 〈213> 人類 <220> <223〉抗體 10 <400> 92
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leo Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Ser Giy Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Yal 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Leu lie Phe Gly Val Gly Gly Gly Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 93 183 200815469 <211〉 5 <212> PRT <213〉人類 <220> 〈223> 抗體 10 <400> 93
Ser Tyr Ala Met Ser 5 T類 4 7 R、 11 p 〈210> <211〉 〈212> <213> <220〉 <223〉抗體 10 <400> 94
Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15
Gly > > > > 0 12 3 1S 1± IX IX 2 2 2 2 〈220〉 <223〉抗體 10 〈400〉 95
Asp Leu lie Phe Gly Val Gly Gly Gly 5
6 3 N IV 9 3 D
〈210> <211> <212〉 <213> 〈220> <223〉抗體 10 <400> 96 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 184 200815469 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagtcgt acgaccccca cagcgtggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtgag 336 <210> 97 <211> 112 <212> PRT 〈213〉人類 〈220〉
〈223〉抗體 10 <400> 97
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 5 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Pro 85 90 95
His Ser Val Val Phe.Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu 100 105 110 > > > > 0 12 3 1X 11 11 11 2 2 2 2 T類 8 3 R IV 9 1 p Ay <220> 〈223> 抗體 10 <400〉 98
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr Tyr Val Gin 5 10 T類 9 R IV 9 7 p Ax > > > > 0 12 3 11* 1X i—I i—H 2 2 2 2 〈220〉 <223〉抗體 10 <400> 99 185 200815469
Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser 5 0 12 3 τ—A 1x IX IX 2 2 2 2 < < < <
o T類 OR、 i—- 9 p /X <220〉 <223〉抗體 10 〈400〉 100
Gin Ser Tyr Asp Pro His Ser Val Val 5 > > > > 0 12 3 lx IX lx IX 2 2 2 2 1 4 A類 0 5 N 1 3 D 乂 〈220〉 <223〉抗體 11 <400> 101 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagatcta ctggggccag gggacaatgg tcaccgtctc ctca 60 120 180 240 300 354 > > > > 0 12 3 ix IX IX 2 2 2 2
2 8 T o 1 R 類 人 <220〉 〈223> 抗體 11 〈400> 102 Glu Val Gin Leu Leu 5 Ser Leu Arg Leu Ser 20 Ala Met Ser Trp Val 35
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30
Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45 186 200 815469
Ser Ala lie Ser 50 Lys Gly Arg Phe 65 Leu Gin Met Asn
Ala Arg Asp Leu 100
Met Yal Thr Val 115
Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 55 60 Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 70 75 80 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 lie Trp Gly Val Ala Gly Ser Trp Gly Gin Gly Thr 105 110 Ser Ser
<210> 〈211〉<212> 〈213〉<220> <223> <400> Ser T 103 5 PRT人類抗體11 103 _ Ala Met
Ser
<210> <211〉<212> <2i3><220> <223〉 <400> Ala I o 7 R K lip
T R 類
Gly
〈210〉<211><212> <213><220> <223〉 <400〉 Asp L 抗體11 104 Ser Gly 105 9 PRT人類抗體11 105 l lie Trp
Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15
Gly Val Ala Gly Ser 5 187 200815469 > > > > 0 12 3 1i 1x 1x 2 2 2 2 〈220> <223〉抗體 11 <400〉 106 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagtcct actcccccca cagcgtggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtgag 336 〈210〉 107 〈211〉 112 <212〉 PRT 〈213〉人類 <220> <223〉抗體 11 <400> 107
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 5 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Ser Pro 85 90 95
His Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu 100 105 110 > > > > 0 12 3 1i IX 1± lx 2 2 2 2
8 T類 o 3 R、 ΊΧ 1x PI 188 〈220> 200815469 <223〉抗體 11 <400> 108
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr Tyr Val Gin 5 10 > > > > 0 12 3 IX 1x 1x 1x 2 2 2 2
〈220> <223〉抗體 11 <400> 109
Pro Ser
Ala Asn Asn Gin Arg 5 0 T類 1 R IV 1 9 PAy > > > > 0 12 3 τ—* 1x 1x 2 2 2 2
His Ser Val Val <220> <223〉抗體 11 <400> 110
Gin Ser Tyr Ser Pro 5 〈210〉 111 <211> 354 <212〉 DNA 〈213>人類 <220〉 〈223> 抗體 12 <400> 111 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac attttcgggg tggggggggg gtggggccag 〈210〉 112 <211〉 118 ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 acggccgtgt attactgtgc aagagatcta 300 gggacaatgg tcaccgtctc ctca 354 189 200815469 <212> PRT 〈213> 人類 <220> 〈223> 抗體 12 <400〉 112
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Leu lie Phe Gly Val Gly Gly Gly Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 113 <211> 5 <212> PRT 〈213〉人類 <220〉 <223〉抗體 12 <400〉 113
Ser Tyr Ala Met Ser 5 > > > > 0 12 3 IX IX IX 2 2 2 2 1 7 R lip
T R 類 <220> 〈223> 抗體 12 <400〉 114
Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15 190 200815469 5 T類 1 R IV 1 9 p夕 > > > > 0 12 3 1111 2 2 2 2 〈220〉 <223〉抗體 12 〈400〉 115
Asp Leu He Phe Gly Val Gly Gly Gly 5 0 12 3 IX 1x 1x IX 2 2 2 2 < < /X < <220> <223〉抗體 12 <400> 116 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagacgt acgaccccta cagcgtggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtgag 336 > > > > 0 12 3 τ—Λ 1x 1Λ 一—Η 2 2 2 2
7 2 T 1 1 R 類人 <220〉 〈223> 抗體 12 <400> 117
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 5 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 2〇 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr He Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 I9l 200815469
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Thr Tyr Asp Pro 85 90 95
Tyr Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu 100 105 110 > > > > 0 12 3 T-* 2 2 2 2 <220> <223〉抗體 12 <400> 118
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr Tyr Val Gin 5 10 <210〉 119 〈211〉 7 <212> PRT 〈213> 人類 <220> <223〉抗體 12 <400> 119
Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser 5 <210> 120 <211〉 9 <212> PRT 〈213〉人類 <220〉 〈223> 抗體 12 〈400> 120
Gin Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Val Val 5 <210> 121 <211> 354 <212> DNA <213〉 人類 〈220〉 <223〉抗體 13 192 200815469 <400〉 121 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 " ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagatcta 300 atttggggag tggctgggag ctggggccag gggacactgg tcaccgtctc ctca 354 2 8 T類 2 i R IV 1 i p A/ <210〉 <211〉 <212〉 <213> <220〉 <223〉抗體 13 <400> 122
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Yal 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Leu lie Trp Gly Val Ala Gly Ser Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Vai Ser Ser 115 3 T類 2 R Rv 1 5 p > > > > 0 12 3 1M 1± 1x 2 2 2 2 〈220〉 〈223> 抗體 13 <400〉 123 193 200815469
Ser Tyr Ala Met Ser 0 12 3 IX IX IX IX 2 2 2 2 < < < < 4 T類 2 7 R IV 1 1 PAy <220〉 <223〉抗體 13 <400〉 124
Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15
Gly 5 T類 2 R、 1 9 p /X > > > > 0 12 3 IX 1x II lx 2 2 2 2 < < \/ < 〈220〉 <223〉抗體 13 <400〉 125
Asp Leu lie Trp Gly Val Ala Gly Ser 5 0 12 3 1± 1x lx 1X 2 2 2 2 < < < < 6 6 Aii 2 3 N、 1 3 D A/ 〈220〉 <223〉抗體 13 <400〉 126 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagtctt atgacccgcg ggtggtcgtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtgag 336 <210〉 127 <211〉 112 <212〉 PRT 〈213> 人類 194 200815469 <220> <223〉抗體 13 <400> 127
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Vai Ser Glu Ser Pro Gly Lys 5 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Pro 85 90 95
Arg Val Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu 100 105 110 > > > > 0 12 3 1X ix IX 1x 2 2 2 2 8 了類 2 3 R V 1x 01 〈220〉 〈223> 抗體 13 〈400〉 128
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr Tyr Val Gin 5 10
0 12 3 1—-111 2 2 2 2 < < < <
<220> 〈223〉抗體 13 <400〉 129
Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser 5 > > > > 0 12 3 1—-111 2 2 2 2 195 200815469 〈220〉 〈223> 抗體 13 〈400〉 130
Pro Arg Val Val Val 5
Gin Ser Tyr Asp > > > > 0 12 3 IX 1± lx 1x 2 2 2 2 1 3 :類 〈220> <223〉抗體 14 <400> 131 gaggtgcagc tgtt tcctgtgcag cctc ccagggaagg ggct gcagactccg tgaa ctgcaaatga acag atttggggag tggc 〈210〉 132 <211〉 118 <212> PRT 〈213> 人類 〈220〉 〈223> 抗體 14 〈400> 132 Glu Val Gin Leu
Ser Leu Arg Leu 20 Ala Met Ser Trp 35 Ser Ala lie Ser 50 Lys Gly Arg Phe 65 Leu Gin Met Asn ggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 cctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagatcta 300 tgggag ctggggccag gggacactgg tcaccgtctc ctca 354
Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 5 10 15
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30
Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 55 60
Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 70 75 80
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 196 200815469
Ala Arg Asp Leu lie Trp Gly Val Ala Gly Ser Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 133 〈211〉 5 <212> PRT <213〉人類 <220> 〈223> 抗體 14 〈400〉 133 3 7 R 1 1 p Ay > > > 0 12 3 ΊΧ 11 lx IX 2 2 2 2
T R 類 <220> 〈223> 抗體 14 <400> 134
Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15 > > > > 0 12 3 t—^ 1x 2 2 2 2 3 11 〈220> <223〉抗體 14 <400〉 135
Asp Leu lie Trp Gly Val Ala Gly Ser 5 0 12 3 11 1x 11 1x 2 2 2 2 < < < <
6 6 A類 3 3 N (V 1 3 D <220> 〈223> 抗體 14 <400> 136 197 200815469 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagtctt atgacccgac gaaccaggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtgag 336 〈210〉 137 <211> 112 〈212〉 PRT 〈213> 人類 <220〉 <223〉抗體 14 <400〉 137
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 5 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Pro 85 90 95
Thr Asn Gin Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu 100 105 110 > > > > 0 12 3 1—-111 2 2 2 2
T R 類 <220〉 <223〉抗體 14 <400〉 138
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr Tyr Val Gin 5 10 〈210〉 139 198 200815469 〈211〉 7 〈212〉 PRT 〈213〉人類<220> <223〉抗體 14 <400> 139 Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser 5 > > > > 0 12 3 11 1x IX 1x 2 2 2 2 <220〉 〈223> 抗體 14 <400> 140 Gin Ser Tyr Asp Pro Thr Asn Gin Val > > > > 0 12 3 ΤΑ 1x 11 11 2 2 2 2 <220> <223〉抗體 15 <400> 141 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagatcta 300 atttggggag tggctgggag ctggggccag gggacactgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 142 〈211〉 118 <212> PRT <213〉人類 <220〉 <223〉抗體 15 <400〉 142 Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 199 200815469
Ser Leu Arg Leu 20 Ala Met Ser Trp 35 Ser Ala lie Ser 50 Lys Gly Arg Phe 65 Leu Gin Met Asn
Ala Arg Asp Leu 100 Leu Val Thr Val 115 5 10 15
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30
Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 55 60
Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 70 75 80
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 lie Trp Gly Val Ala Gly Ser Trp Gly Gin Gly Thr 105 110
Ser Ser
Ser 5 <210> 143 <211> 5 〈212〉 PRT <213〉人類 <220〉 <223〉抗體 15 <400〉 143 Ser Tyr Ala Met > > > > 0 12 3 IX IX IX IX 2 2 2 2 4 T類 4 7 R、 -—-1 p A/ 〈220〉 <223〉抗體 15 <400> 144 Ala lie Ser Gly
Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15 > > > > 0 12 3 1X ix IX 1x 2 2 2 2
RT 200 <220〉 2008 15469 〈223> 抗體 15 <400> 145 Asp Leu lie Trp
Gly Val Ala Giy Ser 5 > > > > 0 12 3 1X IX 1x 2 2 2 2 6 6 A類 4 3 N 1 3 D Ax <220> <223〉抗體 15 <400> 146 aattttatgc tgact tcctgcaccc gcagc ccgggcagtg ccccc gatcgattct ctggc ctgaagactg aggac 7 2 T類 4 1 R »Λ^ν 1 11 p A/ > > > > 0 12 3 IX i—A 2 2 2 2 cagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 agtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 accat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 tccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 gaggc tgactactac tgccagtcct actccccgac gagcgtggtg 300 aagct gaccgtccta ggtgag 336 <220〉 <223〉抗體 15 〈400> 147 Asn Phe Met Leu
Thr Val Thr lie 20 Tyr Val Gin Trp 35 lie Phe Ala Asn 50 Gly Ser lie Asp 65 Leu Lys Thr Glu
Thr Ser Val Val 100
Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 5 10 15
Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 25 30
Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 40 45
Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 55 60
Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Ser Pro 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu 105 110 201 200815469
8 T類 4 3 R、 1X IX PS <210〉 <211〉 〈212〉 <213〉 〈220〉 <223〉抗體 15 <400> 148
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr Tyr Val Gin 5 10 > > > > 0 12 3 IX IX 1x 1x 2 2 2 2 9 Tp 4 R IV 1 7 p A/ <220> 〈223> 抗體 15 〈400〉 149
Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser 0 12 3 IX IX li 1x 2 2 2 2 < < < < pARi <220> <223〉抗體 15 <400〉 150
Gin Ser Tyr Ser Pro Thr Ser Val Val 5 <210> 4DNAA* <211〉 <212> 〈213〉 <220> <223〉抗體 16 <400> 151 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 202 200815469 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagatcta 300 atttggggag tggctgggag ctggggccag gggacaatgg tcaccgtctc ctca 354 0 12 3 111!—_ 2 2 2 2 < < < < 2 8 5 1 <220> <223〉抗體 16 <400> 152
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Leu lie Trp Gly Val Ala Gly Ser Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 r 5 h 1 T 1 0 12 3 1X 1x 1± 1x 2 2 2 2 < < < < <220> <223〉抗體 16 <400> 153
Ser Tyr Ala Met Ser 0 12 3 1X ix 1x 2 2 2 2 < < < < 4 T類 5 7 R \v IX 1i px Ay 203 200815469 〈220〉 〈223> 抗體 16 <400〉 154
Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys > > > > 0 12 3 1x ii 1x 2 2 2 2 <220> <223〉抗體 16 <400〉 155
Asp Leu lie Trp Gly Val Ala Gly Ser 5 〈210〉 156 <211> 336 <212〉 DNA <213〉人類 <220> <223〉抗體 16 <400> 156 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagacgt acgaccccta cagcgtggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtgag 336 > > > > 0 12 3 1± 1x 1x 2 2 2 2
7 2 no IX <220> <223〉抗體 16 <400> 157
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 5 10 15 204 200815469
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Thr Tyr Asp Pro 85 90 95
Tyr Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu 100 105 HO 8 T類 5 3 R 1 1i PA Ay 〈210> <211〉 〈212> <213〉 〈220〉 <223〉抗體 16 <400> 158
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr Tyr Val Gin 5 10 〈210〉 159 <211> 7 <212〉 PRT <213〉人類 <220> 〈223> 抗體 16 <400> 159
Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser 5 0 12 3 11 lx IX II-2 2 2 2 < \/ < <
T類 <220〉 〈223> 抗體 16 <400> 160
Gin Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Val Val 205 200815469 <210> 161 <211> 466 <212〉 DNA 〈213〉長尾彌猴 <400> 161 atgactcctg ggaagacctc attggtgcta ctgctgctgc tgctgagcct ggaggccata 60 gtgaaggcag gaatagcaat cccacgaaat tcaggatgcc caaattccga ggacaagaac 120 ttcccccgga ctgtgatggt caacctgaac atccataacc ggaataccag taccaatccc 180 aaaaggtcct cagattacta caaccgatcc acctcacctt ggaatctcca ccgcaatgag 240 gaccctgaga gatatccctc tgtgatctgg gaggcaaaat gccgccactt aggctgcgtc 300 aaggctgatg ggaacgtaga ctaccacatg aactctgtcc ccatccagca agagatcctg 360
gtcctgcgca gggagcctcg gcactgcccc aactccttcc ggctggagaa gatactggtg 420 tccgtgggct gcacctgtgt cacccccatt gtccaccatg tagcct 466 〈210〉 162 <211〉 155 <212〉 PRT 〈213> 長尾獼猴 <400〉 162
Met Thr Pro Gly Lys Thr Ser Leu Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser 15 10 15
Leu Glu Ala lie Val Lys Ala Gly lie Ala lie Pro Arg Asn Ser Gly 20 25 30
Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn 35 40 45
Leu Asn lie His Asn Arg Asn Thr Ser Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser 50 55 60
Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu 65 70 75 80
Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val lie Trp Glu Ala Lys Cys Arg His 85 90 95
Leu Gly Cys Val Lys Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser 100 105 110
Val Pro lie Gin Gin Glu lie Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Arg His 115 120 125
Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys lie Leu Val Ser Val Gly Cys 130 135 140 206 200815469
Thr Cys Val Thr Pro lie Val His His Val Ala 145 150 155 > > > > 0 12 3 1X 1x 1x 2 2 2 2 3 o A類 6 3 N、 13 d/- <220〉 <223〉抗體 01 <400> 163 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagtctt atgatgacag cagcgtggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 0 12 3 1x 1x 2 2 2 2 < < < <
4 ο T 6 1 R 類 人 <220〉 <223〉抗體 01 <400〉 164
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 15 10 15
Thr Val Thr He Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Asp 85 90 95 207 200815469
Ser Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 0 12 3 1x 1x II 2 2 2 2 < < < <
5 o Ap 6 3 N «V 1 3 D <220> 〈223〉抗體 02 〈400〉 165 aattttatgc tgactcagcc tcctgcaccc gcagcagtgg ccgggcagtt cccccaccat gategattct ctggctccat ctgaagactg aggaegagge tteggeggag ggaccaagct ccactctgtg tcggagtctc cagccttgcc aactactatg tgtgatcttt gcgaataacc cgacagctcc tccaactctg tgactactac tgccagtcgt gaccgtccta cggggaagac ggtaaccatc tgcagtggta ccaacagcgc aaagaccctc tggggtccct cctccctcac catctctgga acgaccccca cagcgtggtg 120 180
300 330 > > > > 0 12 3 ΙΑ 1x IX 1x 2 2 2 2
6 ο T 6 1 R 類 人 <220〉 <223〉抗體 02 <400> 166
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 15 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr lie Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Gly 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Pro 85 90 95 208 200815469
His Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 > > > > 0 12 3 1x 11 11 2 2 2 2 7 o A類 6 3 N 1 3 D Ay <220> <223〉抗體 03 <400〉 167 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagtcct actcccccca cagcgtggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210〉 168 <211> 110 <212〉 PRT <213〉人類 <220〉 <223〉抗體 03 <400> 168
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Ly^ 1 5 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr He Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Ser Pro 85 90 95 209 200815469
His Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 0 12 3 IX IX 1x 1± 2 2 2 2 < < < \/ <220> 〈223> 抗體 04 <400> 169 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagtcct actccccgac gagcgtggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 > > > > 0 12 3 τ—* 1x τ—- 1M 2 2 2 2 < < < <
o o T 7 1 R 類 人 <220〉 〈223> 抗體 04 <400> 170
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 15 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Ser Pro 85 90 95 210 200815469
Thr Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 1 o A類 7 3 N 1 3 D > > > > 0 12 3 1 1 1M 11 2 2 2 2 <220> <223〉抗體 05 <400> 171 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagtctt ataaccacaa ggacatcgtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 0 12 3 i—- 1X 1x 2 2 2 2 < < < < 2 ο Tp 7 i R tv 1 1 p A/ <220> <223〉抗體 05 <400〉 172 /
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asn His 85 90 95 211 200815469
Lys Asp lie Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 > > > > 0 12 3 IX 1x 1x 1x 2 2 2 2 3 o A類 7 3 N IV 1 oo D Ay <220〉 〈223> 抗體 06 <400> 173 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagtcgt acagcccgag cagcgtggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 > > > > 0 12 3 1x 1A 1x 2 2 2 2
4 ο T 7 1 R 類 人 <220> <223〉抗體 06 <400> 174
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Ser Pro 85 90 95 212 200815469
Ser Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 > > > > 0 12 3 1X 1x 1± 2 2 2 2
5 o A類 7 3 N IV 1 3 D <220> <223〉抗體 07 <400> 175 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtt cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagacgt acgaccccta cagcgtggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 X > > > > 0 12 3 IX IX 1± lx 2 2 2 2 < < < <
6 ο T 7 -—- R 類 <220> 〈223> 抗體 07 <400> 176
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 15 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr He Val 35 ' 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Gly 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Thr Tyr Asp Pro 85 90 95 213 200815469
Tyr Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 > > > > 0 12 3 1111 2 2 2 2 <220〉 <223〉抗體 10 <400〉 177 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagtcgt acgaccccca cagcgtggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 > > > > 0 12 3 11 1± IX 11 2 2 2 2
8 ο T 7 t—* R 類 人 〈220〉 〈223> 抗體 10 <400> 178
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Pro 85 90 95 214 200815469
His Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 0 12 3 1111 2 2 2 2 < < < <
9 o A類 7 3 N 1 3 D <220> <223〉抗體 11 <400〉 179 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagtcct actcccccca cagcgtggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 > > > > 0 12 3 1X 1x 11 1± 2 2 2 2
o o T 8 1 R 類 人 <220〉 〈223> 抗體 11 <400> 180
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 15 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Ser Pro 85 90 95 215 200815469
His Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 > > > > 0 12 3 IX 1M ΙΑ 1x 2 2 2 2 <220〉 <223〉抗體 12 〈400> 181 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagacgt acgaccccta cagcgtggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 182 <211〉 110 〈212〉 PRT <213〉 人類 〈220〉 〈223> 抗體 12 <400> 182
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Thr Tyr Asp Pro 85 90 95 216 200815469
Tyr Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 8 3 1 3 A類 DN人 > > 0 12 3 ΙΑ 1A 11 IX 2 2 2 2 < < < < <220> 〈223> 抗體 13 <400> 183 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagtctt atgacccgcg ggtggtcgtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 > > > > 0 12 3 1S 1M 1x 2 2 2 2
4 ο T 8 1 R 類 人 <220> <223〉抗體 13 <400> 184
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 15 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Pro 85 90 95 217 200815469
Arg Val Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 > > > > 0 12 3 1X 1x 1x 1x 2 2 2 2
5 o A類 8 3 N、 1i oo D /X <220> 〈223> 抗體 14 〈400> 185 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtg cccccaccat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcgattct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgccagtctt atgacccgac gaaccaggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 〈220> <223〉抗體 14 <400> 186
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 15 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 2〇 25 30
Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val 35 40 45 lie Phe Ala Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Pro 85 90 95
0 12 3 1X 1X 1x 1x 2 2 2 2 < < < <
6 ο T類 218 200815469
Thr Asn Gin Val 100
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu105 110 7 o A類 8 3 N、 1 3 D ^ > > > > 0 12 3 lx 1x ix lx 2 2 2 2
<220><223〉抗體 15<400> 187 aattttatgc tgact tcctgcaccc gcagc ccgggcagtg ccccc gatcgattct ctggc ctg aggac gag ggacc cagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc agtgg cagccttgcc aactactatg tgcagtggta ccaacagcgc accat tgtgatcttt gcgaataacc aaagaccctc tggggtccct tccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga gaggc tgactactac tgccagtcct actccccgac gagcgtggtg aagct gaccgtccta > > > > 0 12 3 11 1x 11 11 2 2 2 2 188 110 PRT人類 <220><223〉<400> Asn Phe 1 Thr Val 抗體15 188 Met Leu
Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys5 10 15
Thr lie 20
Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr25 30
Tyr Val Gin Trp35
Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr lie Val40 45 lie Phe Ala Asn50
Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser55 60
Gly Ser lie Asp65
Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Arg70 75 80
Leu Lys Thr Glu
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Ser Pro85 90 95 219 200815469
Thr Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 9 T類 8 o R IV 1 3 p <210> <211> 〈212〉 <213> 〈220〉 <223〉VH框架區1 <400> 189
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 > > > > 0 12 3 IX IX IX 2 2 2 2
o T類 9 4 R、 IX IX <220> <223〉VH框架區2 <400〉 190
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 > > > > 0 12 3 lx ix IX IX 2 2 2 2 1 T類 9 2 R IV 1 oo p <220> <223〉VH框架區3 <400> 191
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 15 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 〈210〉 192 <211> 11 220 200815469 〈212〉 PRT 〈213> 人類 <220> <223〉VH框架區4 <400> 192
Θ o SI 9 2 R Λν 1 2 p Ay > > > > 0 12 3 1i 11 11- 1x 2 2 2 2
T R <220> 〈223〉VL框架區1 〈400〉 193
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 15 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys 20 <210> 194 〈211〉 15 <212> PRT <213〉人類 <220〉 〈223〉VL框架區 <400〉 194
Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr lie Val lie Phe 1 5 10 15 0 12 3 11 11 1x 1± 2 2 2 2 < < < < 5 T類 9 4 R 1 CO p Ay <220> <223〉VL框架區3 <400> 195
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser 1 5 10 15
Ala Ser Leu Thr lie Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 20 25 30 221 200815469
Tyr Cys <210> <211〉<212> <213〉
9 o R、 IX PA
T R 類 <220〉 <223> VL框架區4 〈400〉 196
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210〉 197 〈211〉 153 <212> PRT 〈213> 人造序列 <220> <223〉合成序列：N端加標籤人IL-17A <400> 197
Met Gly Gly Leu Asn Asp lie Phe Glu Ala Gin Lys lie Glu Trp His 15 10 15
Glu lie Val Lys Ala Gly lie Thr lie Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro 20 25 30
Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn 35 40 45 lie His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr 50 55 60
Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro 65 70 75 80
Glu Arg Tyr Pro Ser Val lie Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly 85 90 95
Cys lie Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro 100 105 110 lie Gin Gin Glu lie Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro 222 200815469 115 120 125
Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys lie Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys 130 135 140
Th r-H L〇 a 4 VI so .1
IX 0 12 3 1X IX 1x 1x 2 2 2 2 \/ < < <
8 2 T 9 3 R 類 人 <220> <223〉成熟人 IL-17A <400> 198
Gly lie Thr lie Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys 15 10 15
Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn lie His Asn Arg Asn 20 25 30
Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr 35 40 45
Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser 50 55 60
Val lie Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys lie Asn Ala Asp 65 70 75 80
Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro lie Gin Gin Glu lie 85 90 95
Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 100 105 110
Glu Lys lie Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro lie Val 115 120 125
His His Val Ala 130 > > > > 0 12 3 1 1 11 11 2 2 2 2 9 T類 9 7 R 1 1 p 223 200815469 <220> <223〉 人IL-17A胜呔 <400> 199 Cys Arg His Leu Gly Cys lie Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His 1 5 10 15 Met <210> 200 <211> 160 <212> PRT 〈213> 人造序列 <220> 〈223>合成序列：帶有His標籤之突變株IL-17A <400> 200
Met Thr Pro Gly Lys Thr Ser Leu Val Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ser 15 10 15
Leu Glu Ala lie Val Lys Ala Gly lie Thr lie Pro Arg Asn Pro Gly 20 25 30
Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn 35 40 45
Leu Asn lie His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser 50 55 60
Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu 65 70 75 80
Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val lie Trp Glu Ala Lys Cys Arg His 85 90 95
Gin Arg Cys Val Asn Ala Glu Gly Lys Leu Asp His His Met Asn Ser 100 105 110
Val Pro lie Gin Gin Glu lie Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His 115 120 125
Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys lie Leu Val Ser Val Gly Cys 130 135 140
Thr Cys Val Thr Pro lie Val His His Val Ala His His His His His 224 200815469 > > > > 0 12 3 IX 1x 1x τ—< 2 2 2 2 列序 1 2 T造 ο 3 R 2 ^—- p <220> ' <223〉合成序列：突變株成熟IL-17A <400> 201
Gly lie Thr lie Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys 1 5 10 15
Asn Phe Pro Arg Thr Yal Met Val Asn Leu Asn lie His Asn Arg Asn 20 25 30
Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr 35 40 45
Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser 50 55 60
Val lie Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Gin Arg Cys Val Asn Ala Glu 65 70 75 80
Gly Lys Leu Asp His His Met Asn Ser Val Pro lie Gin Gin Gin lie 85 90 95
Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 100 105 110
Glu Lys lie Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Yal Thr Pro lie Yal 115 120 125
His His Val Ala 130 225

Claims (1)

  1. 200815469 十、申請專利範圍： 1· 一種人IL-17A之經單離之結合成員，其中該結合成員係 結合於成熟人IL-17A之位置71-87之 Cys-Arg-His-Leu-Gly-Cys-Ile-Asn-Ala-Asp-Gly-Asn-Val Asp-Tyr-His-Met (SEQ ID NO: 199)中之至少一個殘基。 2·如申請專利範圍第1項之結合成員，其中該結合成員係 結合成熟人IL-17A於殘基Leu74、Tyr85及/或His86。 3·如申請專利範圍第1或2項之結合成員，其具有對結合有 胺基酸序列SEQ ID NO: 198之成熟人IL-17A之親和力 比結合具有胺基酸序列SEQ ID NO : 201之突變株人 IL-17A之結合親和力高10倍以上，其中該親和力為使用 二價被分析物資料模型，藉表面電漿子共振測定之速率 常數kdl/kal之比求出之Kd。 4·如申請專利範圍第3項之結合成員，其中該結合成員確 實不會結合有胺基酸序列SEQ ID NO : 201之突變株人 IL-17A 〇 5·如前述申請專利範圍各項中任一項之結合成員，其中： ⑴經由與IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E或IL-17F 競爭所得之IC5G ;對 (ii)經由與未加標記之IL_丨7A競爭所得之IC5〇 之比值比較於抗原決定部位競爭檢定分析中與經 標記之IL-17A競爭與結合成員結合之比值大2〇〇倍以 上。 6·如前述申請專利範圍各項中任一項之結合成員，其中該 226 200815469 結合成員具有對馬來猴IL-17A之結合親和力係小於對 人IL-17A之親和力之5倍，其中該親和力為使用二價被 分析物資料模型，藉表面電漿子共振測定之速率常數 kdl/kal之比求出之Kd。 7·如前述申請專利範圍各項中任一項之結合成員，其中於 回應於1 nM人IL-17A IL-6釋放之HT1080細胞檢定分析 中，結合成員之IC%與回應於inM馬來猴IL-17AIL_6釋 放之HT1080細胞檢定分析中，結合成員之κ：5()之差異係 不大於10倍。 8· —種人IL-17A之經單離之結合成員，包含CDR之一集 合：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2 及 LCDR3，其中該CDR集合有來自於CDR集合之10個或更 少個胺基酸取代，其中： HCDR1為胺基酸序列SEQ ID NO : 63 ; HCDR2為胺基酸序列SEQIDNO : 64 ; HCDR3為胺基酸序列SEQIDNO : 65 ; LCDR1為胺基酸序列SEQIDNO ·· 68 ; LCDR2為胺基酸序列SEQ IDNO : 69 ;及 LCDR3為胺基酸序列SEQIDNO : 70。 9·如申請專利範圍第1至7項中任一項之結合成員，包含 CDR之一集合：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、 LCDR2及LCDR3，其中該CDR集合有來自於CDR集合之 10個或更少個胺基酸取代，其中： HCDR1為胺基酸序列SEQIDNO : 63 ; 227 200815469 HCDR2為胺基酸序列SEQIDNO : 64 ; HCDR3為胺基酸序列SEQIDNO : 65 ; LCDR1為胺基酸序列SEQIDNO : 68 ; LCDR2為胺基酸序列SEQIDNO : 69 ;及 LCDR3為胺基酸序列SEQIDNO : 70。 10. 如申請專利範圍第8或9項之結合成員，於該CDR集合中 包含0、1或2個取代。 11. 如前述申請專利範圍各項中任一項之結合成員，包含 HCDR3序列，其中HCDR3為SEQIDNO: 15。 12. 如前述申請專利範圍各項中任一項之結合成員，包含 HCDR3序列，其中HCDR3為SEQIDNO : 65。 13. 如申請專利範圍第8至12項中任一項之結合成員，其中 於LCDR3之卡貝特(Kabat)殘基93為Pro。 14. 如前述申請專利範圍各項中任一項之結合成員，包含 LCDR3 序歹》J，其 LCDR3 為 SEQ ID NO : 20。 15. 如申請專利範圍第1至13項中任一項之結合成員，包含 LCDR3序列，其LCDR3 為 SEQ ID NO : 70。 16. 如申請專利範圍第8至15項中任一項之結合成員，其中 HCDR1 為 SEQ ID NO : 63 ; HCDR2為 SEQ ID NO : 64 ; LCDR1 為 SEQ ID NO : 68 ;及 LCDR2為 SEQ ID NO : 69。 17. 如申請專利範圍第10項之結合成員，其中 HCDR1 為SEQIDNO : 63 ; 228 200815469 HCDR2 為 SEQ ID NO : 64 ; HCDR3 為 SEQ ID NO : 65 ; LCDR1 為 SEQ ID NO : 68 ; LCDR2為 SEQ ID NO : 69 ;及 LCDR3 為 SEQ ID NO : 70 o 18·如申請專利範圍第8或9項之結合成員，包含 合·表21所述抗體1至抗體16中任一者之HCDR1、 HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及 LCDR3。 19·如申請專利範圍第1至16項中任一項之結合成員，其中 該結合成員具有回應於1 nM人IL-17A於IL-6釋放之 HT1080細胞檢定分析中測得IC50不大於1 nM。 20·如申請專利範圍第1至16項中任一項或如申請專利範圍 第19項之結合成員，其中該結合成員於回應於125 pM人 IL-17A及25 pM TNFa之IL-6之協同增效釋放之HT1080 細胞檢定分析中，測得IC50不大於0.5nM〇 21· —種用於人IL-17A之單離的結合成員，其中使用二價被 分析物資料模型，藉表面電漿子共振測定，由速率常數 kdl/kal之比計算，該結合成員具有對AIL-17A之以係 小於2.5 nM。 22. —種用於人IL-17A之單離的結合成員，其中該結合成員 如於測量回應於1 nM人IL-17A之IL-6釋放之HT1080細 胞檢定分析中測定，具有IC50值不大於1 nM ;以及其中 該IC%值與於測量回應於1 nM馬來猴IL-17A之IL-6釋放 之HT1080細胞檢定分析中測得結合成員之ic5G差異不 229 200815469 超過ίο倍。 23·如前述申請專利範圍各項中任一項之結合成員，其中該 結合成員包含一抗體分子其包含抗體VIi功能部位及抗 體VL功能部位，其中該抗體分子包含一 cdr集合： HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDIU、LCDR2 及 LCDR3， 其中 VH功能部位包含HCDR1、HCDR2、及HCDR3及重 鏈框架區FIU、FR2、FR3及FR4， 及VL功能部位包含LCDR1、LCDR2及LCDR3及輕 鏈框架區FR1、FR2、FR3及FR4。 24.如申請專利範圍第23項之結合成員，包含一抗體恆定 區〇 25·如申請專利範圍第24項之結合成員，其中該抗體分子為 IgGl。 26·如申請專利範圍第23項之結合成員，其中該抗體分子為 scFv 〇 27·如申請專利範圍第23至26項中任一項之結合成員，其中 該重鏈框架區及/或輕鏈框架區包含人生殖系列基因節 段序列。 28·如申請專利範圍第27項之結合成員，其中重量FR1為 SEQ ID NO : 189，FR2為 SEQ ID NO : 190，FR3為 SEQ IDNO: 191 及 FR4 為 SEQIDNO: 192。 29.如申請專利範圍第28項之結合成員，其中該抗體VH功 能部位具有SEQ ID NO: 62所示之VH功能部位胺基酸序 230 200815469 列。 3〇.如申請專利範圍第27至29項中任一項之結合成員，其中 該輕鏈 FR1 為 SEQIDNO: 193，FR2 為 SEQIDNO: 194, FR3 為 SEQ ID NO : 195及FR4為 SEQ ID NO : 196。 31.如申請專利範圍第30項之結合成員，其中該抗體VL功 能部位具有SEQ ID NO : 176所示之VL功能部位胺基酸 序列。 32· —種經單離之抗體分子，包含有SEQ ID NO : 62所示之 VH功能部位胺基酸序列之一 Vh功能部位及有SEQ ID NO : 176所示之VL功能部'位胺基酸序列之一 VL功能部 位。 33·如申請專利範圍第32項之抗體分子，其為IgG1。 34·如申請專利範圍第32項之抗體分子，其為scFv。 35·如申請專利範圍第23至32項中任一項之抗體分子之一 經單離之VH功能部位。 36.如申請專利範圍第23至32項中任一項之抗體分子之一 經單離之VL功能部位。 37· —種組成物，包含如申請專利範圍第丨至^項中任一項 之結合成員或如申請專利範圍第32至34項中任-項之 抗體分子及藥學上可接受之賦形劑。 38· -種組成物，包含如申請專利範圍第^項中任一項 ，結合成員或如巾請專利範圍第32至34項中任一項之 抗體刀子’供用於藉手術或治療處理人體或動物體之方 法。 231 200815469 39·如申請專利範圍第38項之組成物，用於治療與il-ΠΑ相 關聯之病症。 4〇·〆種如申請專利範圍第1至31項中任一項之結合成員或 如申請專利範圍第32至34項中任一項之抗體分子，用於 製造與IL-17A相關聯之病症之治療用藥之用途。 41•/種治療個體之與IL-17A相關聯之病症之方法，包含對 該個體投予如申請專利範圍第丨至31項中任一項之尹入 成員或如申請專利範圍第32至34項中任一項之抗 子。 刀 42.如申請專利範圍第39項之組成物、如申請專利範圍第4〇 項之用途或如中料利制第41項之方法， 為發炎病症。 …病症 43·如申請專利範圍第39項之組成物、如申請專利範圍第40 項之用途或如”專利制糾項之枝 為類風濕性關節炎、骨關節炎、 ^症 脫髓勒病症、乾痗、㈠失、呼吸道過敏、 _ 乾癬皮膚過敏、紐移_斥、同種異 體移植片排斥、移植片 ^ 對 病、糸統性硬化、系統性 蠱、自體免疫發炎性勝病、尿路發炎病症、心 J病、血管炎、週期性發燒、葡萄糖代謝障礙、肺疾、 •^ /4周病肝基質角化症、過敏、反應性關節炎、 ^ ^疼痛、脊椎關節病變、敗血病、敗血性休克、或 阿二休克、腦膜炎、手術創傷、自體免疫性血液病、 炎# ⑽瘤病、肝硬化、肝炎、腎絲球體腎 人或月曰貝代謝異常。 232 200815469 44·如申請專利範圍第43 禾W項之組成物、用途或方法，其中該 病症為類風濕性關節炎。 ’ 45· —種包含一核苷酴皮 一 1之經單離之核酸分子，該核苷酸 序列編碼： 如申請專利範圍第1迎項中任-項之結合成員； 如申請專鄕32至34項巾任1之抗體分子； 申月專利&圍第35項之抗體分子之-VH功能部 位；或
    如申請專利範圍第36項之抗體分子之-VL功能部 位。 46· 一種宿主細胞’於試管内使用如中請專鄉圍第45項之 核酸轉形。 47· -種製造-結合成員、抗體分子或一抗體分子之經單離 之VH功能部位或VL功能部位之方法，包含於可製造該 結合成員、抗體分子或抗體VH或VL功能部位之條件 下’培養如申請專利範圍第46項之宿主細胞。 48.如申請專利範圍第47項之方法，進一步包含單離及/或 純化該結合成員、抗體分子、VH功能部位或VH功能部 位。 49· 一種製造包含一結合成員、抗體分子或vh功能部位或 VL功能部位之組成物之方法，包含： 經由如申請專利範圍第4 7或4 8項之方法製造一結 合成員、抗體分子或VH功能部位或VL功能部位；以及 將該結合成員、抗體分子或VH功能部位或VL功能 233 200815469 部位調配成包含至少一種額外成分之組成物。 5〇· —種製造人IL-17A用之抗體抗原結合功能部位之方 法，該方法包含： 經由加成、刪失、取代或插入而於包含HCDR1、 HCDR2及HCDR3之一親代VH功能部位之胺基酸序歹丨J 中提供一個或多個胺基酸，其中該親代VH功能部位 HCDR1、HCDR2及HCDR3為如表21所示之一HCDR集 合，如此提供一VH功能部位其為親代VH功能部位之胺 基酸序列之變異株，及視需要將如此所提供之VH功能 部位於一個或多個VL功能部位組合來提供一種或多種 VH/VL組合；以及 測試該VH功能部位，其為親代VH功能部位或 VH/VL組合之胺基酸序列變異株，來識別供人IL-17A用 之一抗體抗原結合功能部位。 51·如申請專利範圍第50項之方法，其中該親代VH功能部 位為於SEQ ID NO: 62所示之VH功能部位胺基酸序列。 52.如申請專利範圍第50或51項之方法，其中該一個或多個 VL功能部位係經由加成、刪失、取代或插入一個或多 個胺基酸序列於包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之一親 代VL功能部位之胺基酸序列來提供，其中該親代VL功 能部位LCDR1、LCDR2及LCDR3為如表21所示之CDR VL集合，產生一個或多個VL功能部位，其各自為該親 代VL功能部位之胺基酸序列變異株。 53·如申請專利範圍52項之方法，其中該親代VL功能部位 234 200815469 具有SEQ ID NO : 176所示之VL功能部位胺基酸序列。 54·如申請專利範圍第50至53項中任一項之方法，其中該 VH功能部位為由CDR突變發生所提供之親代VH功能 部位之一胺基酸序列變異株。 r ^ 55·如申請專利範圍第50至54項中任一項之方法，進一步包 t 含製造抗體抗原結合功能部位作為IgG、scFv或Fab抗體 分子之一個成分。 56· —種製造可結合人IL-17A之一結合成員之方法，該方法 • 包含: 提供編碼一 V Η功能部位之起始胺基酸或起始胺基 酸序列貯倉其各自係編碼一VH功能部位，其中該VH功 能部位或該等VH功能部位係包含預備置換之一 HCDR1、HCDR2及/或HCDR3編碼區，或缺一 JJCDR1、 HCDR2及/或HCDR3編碼區； 、 將該起始核酸或起始貯倉與由表21所示之 ， HCDIU、HCDR2及/或HCDR3之胺基酸序列突變所編碼 或突變所製造之施體核酸或該等施體核酸組合，讓該施 體核酸或該等施體核酸插入起始核酸或起始貯倉中之 CDia、CDR2及/或CDR3區，因而提供編碼¥11功能部位 之核酸之產物貯倉； 表現該產物貯倉之核酸來製造產物VH功能部位； 視需要將該產物VH功能部位與一個或多個vl功能 ^ 部位組合； • 選擇人IL-17A之一結合成員，該結合成員包含一產 235 200815469 物VH功能部位及任選地一VL功能部位；以及 回收该結合成員或編碼該結合成員之核酸。 57·如申㈣利範圍第55項之方法，其巾該等施體核酸係經 由该HCDR1及/或HCDR2之突變所製造。 58·如申料利範圍第％奴方法，其巾料施體核酸係經 由該HCDR3之突變所製造。 59·如申請專利範圍第56項之方法，包含經由核酸之隨機突 變來提供該施體核酸。 60. 如申請專利範圍第56至59項中任一項之方法進一步附 接包含於所回收之結合成員内部之一產物VH#能部位 置疑抗體恆定區。 61. 如申請專利範圍第56至59項中任—項之方法包含提供 包含該VH功能部位及一VL功能部位之一收、士或 Fab抗體分子。 62. 如申請專利範圍㈣至61項中任―項之方法，進一步包 含測試抗體抗原結合功能部位或與結合人IL_17A之結 合成員其中和人IL-17A之能力。 63. 如申請專利範圍第62項之方法，其中獲得一結合成員， 其包含可結合且中和IL_17A之—抗體分子。 64. 如申請專利範圍第63項之方法，其中該抗體分子為scFv。 65. 如申請專利範圍第63項之方法，其中該抗體分子為吵。 66· 一種製造-抗體分子組成物之方法，包含使用如申請專 利範圍第5〇至65項中任-項之方法獲得一抗體分子，將該 抗體分子調配人包含至少-種額外成分之—組成物内。 236
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