TW200806690A - RAGE fusion proteins and methods of use - Google Patents

Description

200806690 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於高級糖化終末產物受體（Receptor for Advanced Glycated Endproducts (RAGE))之調控。更特定 言之，本發明述及包含RAGE多肽之融合蛋白、製備此等 融合蛋白之方法、以及使用此等蛋白以治療RAGE根據性 疾病之用途。 【先前技術】 蛋白或脂質與醛糖之恆溫共置可造成該等蛋白上胺基之 非酶性糖化及氧化而形成安瑪多立加成物（Amadori adducts)。之後，該等加成物會再進行其他之重排、脫 水、並與其他蛋白交聯而形成稱為高級糖化終末產物 (AGEs)之複合物。可促進AGEs形成之因子包括遲發性蛋 白質轉換（如，在澱粉樣變性中者）、具有高離胺酸含量之 巨分子之累積、以及高血糖含量（如，在糖尿病中者）(Hori et al·，J. Biol. Chem. 270:25752-761，（1995))。AGEs 已被 認為涉及各種不同之疾病，包括與糖尿病及正常之老化相 關之併發症。 AGEUf於單核細胞、巨噬細胞、微血管内皮細胞、平 滑肌細胞、腎膈細胞、及神經元上之細胞表面受體具有專 一性及可飽和之結合。高級糖化終末產物受體（RAGE)係 免疫球蛋白超基因分子家族之成員之一。RAGE之胞外（N-端）域包括三個免疫球蛋白類型區域··一個V(可變）型域， 接續兩個 C-型（恆定）域（Neeper et al·，J. Biol· Chem·， 118243.doc 200806690 267:14998-15004 (1992); Schmidt et al.? Circ. (Suppl.) 96# 194 (1997))。在該胞外域後接續有一單一穿膜跨越域 及一短型、高度帶電荷之胞質尾。該N-端胞外域可藉由 RAGE之蛋白酶解或是藉由分子生物學之方法分離，以產 生包含該等V及C域之可溶性RAGE (sRAGE)。 RAGE係在多種細胞類型上表現，包括白細胞、神經 元、小膠細胞、及血管内皮細胞（如，Hori et al·，J. Biol· Chem·， 270:26862-761 (1995))。亦在老化之組織 (Schleicher et al·，J. Clin· Invest·，99(3):457-468 (1997))以 及糖尿病性之視網膜、血管系統、及腎臟（Schmidt et al·， Nature Med·，1:1002-1004 (1995))中發現增高含量之 RAGE。 除AGEs外，其他化合物亦可結合並調控RAGE。RAGE 可結合多種功能及結構各異之配位體，包括β澱粉樣蛋白 (Αβ)、血清澱粉樣蛋白A (SAA)、高級糖化終末產物 (AGEs)、S 100 (—種鈣粒蛋白家族之促炎性成員）、羧甲基 離胺酸（CML)、兩性蛋白（amphoterin)、及 CDllb/CD18 (Bucciarelli et al., Cell Mol. Life Sci.5 58:1117-128 (2002); Chavakis et al·，Microbes Infect·，6:1219-1225 (2004);

Kokkola et al·，Scand. J. Immunol·，61:1-9 (2005); Schmidt et al·，J. Clin· Invest·，108:949-955 (2001); Rocken et al·， Am. J. Pathol·，162:1213-1220 (2003))。 諸如AGEs、S100/I弓粒蛋白、β澱粉樣蛋白、CML (Νε-羧甲基離胺酸、及兩性蛋白之配位體與RAGE之結合已經 118243.doc 200806690 顯示可修飾各種基因之表現。此等作用接著可起始信號傳 導機制，包括p38活化作用、p21ras、MAP激酶、Erkl-2磷 酸化作用、以及炎性信號傳導轉錄中介子NF-kB之活化 (Yeh et al·，Diabetes. 50:1459-1504 (2001))。舉例而言，在 諸多細胞類型中，RAGE及其配位體間之作用可產生氧化 壓力，其因而造成自由基敏感性轉錄因子NF-kB之活化， 以及NF-κΒ調控性基因之活化，諸如，細胞因子IL-Ιβ及 TNF-α。同時，RAGE之表現可經由NF-κΒ而正調節，並在 發炎或氧化壓力之位點顯示增高之表現（丁&1^1^61&1.，：[· Biol·，Chem·，275:24781-24790 (2000))。因此，其會因為 由配位體之結合所起始之正回饋循環而產生一種漸增且常 為有害之惡性循環。 在不同組織及器官中之RAGE活化可造成諸多之病生理 性後果。RAGE已被認為涉及各種不同之病況，包括：急 性及慢性發炎（Hoffmann et al·，Cell 97:889-901 (1999))、 糖尿病後期併發症之發展，諸如，增加之血管通透性 (Wautier et al·，J· Clin· Invest” 97:328-243 (1995))、腎病 (Teillet et al.，J· Am· Soc. Nephrol·，11:1488-1497 (2000))、動 脈硬化（Vlassara et al·，The Finnish Medical Society DUODECIM，Ann. Med·，28:419-426 (1996))、及視網膜病 (Hammes et al·，Diabetologia 42:603-607 (1999)) o RAGE亦 已被認為涉及阿兹海默症（Yan et al.，Nature，382:685-691 (1996))，以及腫瘤之侵染及轉移（Taguchi et al·，Nature， 405:354-357 (2000)) ° 118243.doc 200806690 儘管RAGE具有廣泛之表現，並在多種各異之疾病模型 中具有顯著之多向性角色，RAGE對於正常之發育而言似 乎並不具必要性。舉例而言，RAGE剔除小鼠並無任何明 顯之異常表型，此因而建議，儘管RAGE在經慢性激發時 可涉及疾病病理，RAGE之抑制卻並未顯示可造成任何非 所欲性之急性表型（Liliensiek et al.，J. Clin· Invest·， 113:1641-50 (2004))。 拮抗生理配位體與RAGE之結合可對諸等由過量濃度之 AGEs及其他RAGE配位體所造成之病生理性變化產生負調 節。藉由降低内源性配位體與RAGE之結合，諸等與RAGE 中介性疾病相關之症狀可獲得抑低。可溶性RAGE (sRAGE)可有效拮抗RAGE配位體與RAGE之結合。然而， sRAGE在體内投藥時所具有之半生期可能過短而無法對一 或多種疾病產生治療有效性。因此，需要發展出可拮抗 AGEs及其他生理性配位體與RAGE受體結合之化合物，其 中該化合物具有所欲之藥物動力學特性。 【發明内容】 本發明之具體實例包含RAGE融合蛋白及使用此等蛋白 之方法。本發明可以各種不同之方法具體實施。本發明之 具體實例可包含一種RAGE融合蛋白，其包含與一第二非 RAGE多肽連結之RAGE多肽。在一具體實例中，該RAGE 融合蛋白包含RAGE配位體結合位點。該RAGE融合蛋白尚 可包含直接連結包含免疫球蛋白CH2域或是該CH2域之部分 之多肽之RAGE多肽。 118243.doc 200806690 本發明亦涵括一種製備RAGE融合蛋白之方法。在一具 體實例中，該方法包含使一 RAGE多肽連結一第二非RAGE 多肽。在一具體實例中，該RAGE多肽包含RAGE配位體結 合位點。該方法可包含使一 RAGE多肽直接連結一包含免 疫球蛋白CH2域或是該CH2域之部分之多肽。 在其他具體實例中，本發明可包含用以治療一對象體内 之RAGE中介性疾病之方法及組合物。該方法可包含對該 對象投藥本發明之RAGE融合蛋白。該組合物可包含醫藥 可接受性載體中之本發明RAGE融合蛋白。 咸有各種可與本發明特定具體實例相關之優點。在一具 體實例中，本發明之RAGE融合蛋白在對一對象進行投藥 時可為代謝穩定性者。同時，本發明之RAGE融合蛋白可 具有對於RAGE配位體之高親和力結合。在部分具體實例 中，本發明之RAGE融合蛋白可以高納莫耳濃度至低微莫 耳濃度範圍之親和力結合RAGE配位體。藉著以高親和力 而結合生理性之RAGE配位體，本發明之RAGE融合蛋白可 用以抑制内源配位體對RAGE之結合，因而提供改善RAGE 中介性疾病之方法。 同時，本發明之RAGE融合蛋白可以蛋白或核酸形式提 供。在一例示具體實例中，該RAGE融合蛋白可經系統投 藥並維持在血管系統中，以潛在治療部分由RAGE 中介 之血管疾病。在另一例示具體實例中，該RAGE融合蛋白 可經局部投藥，以治療其中RAGE配位體可造成該疾病病 理之疾病。或者，可藉由使用適當之載體，諸如，病毒或 118243.doc -10- 200806690 裸DNA，將編碼^AGE融合蛋白之核酸建構物傳遞至一 位黑卜在料，瞬時性之局部表現可局部抑制rage配位 體與夂體間之作用。因&，投藥可為瞬時(如，如其中投 藥RAGE融合蛋白者）或更為永久性者（如，如其中編錄 合蛋白係以重組DNA之形式投藥者）。 咸具有其他之本發明特徵，其將於後文中敘述。咸可明 瞭，本發明並不限於其料錢巾請專㈣㈣求項、敛 述、及圖示.中所詳示之應用。本發明可具有其他具體實 例，且可以各種不同之方式實施或進行。 【實施方式】 就此說明書之目的而言’除非另外指明，所有在此說明 書中用以表示成分含量、反應條件等之數目皆應被理解為 在所有情形下皆由辭囊"約"所修飾。因此，除非指明為相 反情形’在下文之說明中所示之數字參數皆係近似值，其 可根據欲以本發明取得之所欲特性而各異。最少，且並非

用=限制中請專利範圍請求郷圍之#量原則應用，各個 數:參數應至少可參照其報告之有效數字並藉由應用慣常 之歸約技術而進行解釋。 儘管顯示本發明廣泛範圍之數字範圍及參數係近似值， 述於特^實例中之數字值則係經儘可能精確之報告。秋 :，任何之數值先天即含有部分必然會由其分別之試驗測 :中之標準差所產生之誤差。同時，所有本文中所揭示之 犯圍皆應被理解為涵括其中所包含之任何及所有次範圍。 舉例而言’範圍"⑴。"應可被視為包括介於(且涵括)該最 118243.doc 200806690 小值1及該最大值1〇之間之任何及所有Mm π 有以小值起始（如’ι61)並以ig或以下之最 大值終止:如，5.5至10)之次範圍。此外，任何被稱為"納 入本文中 <參考文獻皆應被理解為以其整體納入。 尚須註記，在此說明書中’單數形式"一"、"一"、及 ”該"皆包括複數之參照物，除非其明確且明白限制為一個 參照物。辭彙”或"係與辭彙’，及/或"以可互換之形式使用， 除非該内容清楚指出並非如此。 同時，辭彙"部分"及"片段"係以可互換之形式使用，以 指明多肽、核酸、或其他分子建構物之部分。 多肽及”蛋白”係在本文中以可互換之形式使用以敛述 蛋白分子，其可包括部分或全長蛋白。 如技藝中所知，"蛋白"、"肽"、"多肽，，、及，，寡肽，，係胺 基酸鏈卜般而言為L_胺基酸），其μ原子係經由肤鍵連 結，該等肽鍵係由-胺基酸α碳原子之竣基與另一胺基酸 CC碳原子之胺基間之縮合反應而形成。一般而言，構成蛋 白之胺基酸係經順序編號，由該胺端殘基起始，並以朝向 該蛋白羧端殘基之方向漸增。 在本文中，辭菜”上游”係指對一第二殘基而言-端之 殘基(當該分子係蛋白時)’或是對-第二殘基而言為5,之 誠（當該分子係核酸時）。亦在本文中，辭囊”下游"係指 f第=殘基而吕為c-端之殘基（當該分子係蛋白時），或 是對一第二殘基而言為3,之殘基(當該分子係核酸時)。 除非另外足義為不同，本文所用之所有技術及科學辭彙 118243.doc -12- 200806690 皆具有如熟習技藝者一般所明瞭者之相同意義。實施者特 別可參照 Current Protocols in Molecular Biology [分子生物 學之當今操作流程](參見，如，Ausubel，F.M. et al.，Short Protocols in Molecular Biology [分子生物學之短操作流 程]，4th Ed·，Chapter 2，John Wiley & Sons，Ν·Υ·)中之技藝 定義及辭彙。胺基酸殘基之縮寫係在技藝中用以指明2〇種 常見L-胺基酸之一之標準三字母及/或單字母密碼。 11核酸’’係聚核苷酸，諸如，去氧核糖核酸（DNA)或核糖 核酸（RNA)。該辭彙係用以包括單股核酸、雙股核酸、以 及由核苷酸或核甞類似物所構成之RNA及DNA。 辭彙”載體”係指一種核酸分子，其可用以將一第二核酸 分子運載至細胞中。在一具體實例中，載體可容許複製插 入該載體中之DNA序列。載體可包含啟動子，以增進該核 酸分子在至少部分宿主細胞中之表現。載體可自主複製 (在染色體外）或是可被納入宿主細胞之染色體中。在一具 體實例中，載體可包含表現載體，其可產生由至少部分之 插入該載體中之核酸序列所衍生之蛋白。 如技藝中所知，用以使核酸序列彼此雜交織條件可以自 低至高之嚴格性而進行敘述。一般而言，高嚴格性之雜交 條件係指在尚溫下於低鹽緩衝液中清洗雜交物。雜交可係 對連結於濾器上之DNA進行，在65°C下，使用技藝中之標 準雜交溶液，諸如，0.5 M NaHP〇4、7¼十二烷基硫酸鈉 (SDS)，並根據探針之長度，在自室溫至68^範圍之溫产 下，以〇·25 M NaHP04、3.5% SDS清洗，接著再以〇 i χ 118243.doc -13- 200806690 SSC/0.1% SDS清洗（Ausubel et al)。舉例而言，高嚴袼性 之清洗包含以6 χ SSC/0.05%焦磷酸鈉清洗，針對14鹼基之 寡核嘗酸探針在37°C下進行，或是針對17鹼基之寡核甞酸 探針在48°C下進行，或是針對2〇鹼基之寡核甞酸探針在 55°C下進行’或是針對25鹼基之寡核甞酸探針在⑽^下進 行’或是針對約250核：y：酸長度之核甞酸探針在65。(：下進 行。核酸探針可藉著以，例如，[γ_32Ρ]ΑΤΡ進行末端標 記’或是藉由隨機引子標記納入諸如[(x-^PWCTP之放射標 記性核甞酸而經放射性核甞酸標記。或者，探針可藉由納 入經生物素化或螢光標記之核：y：酸而經標記，並使用鏈黴 親和素或抗螢光抗體而偵測該等探針。 在本文中’ ”小有機分子”係分子量小於2,〇〇〇道耳呑之分 子’其含有至少一個碳原子。 辭彙π融合蛋白”係指蛋白或多肽，其具有衍生自二或多 種蛋白之胺基酸序列。融合蛋白亦可在衍生自不同蛋白之 胺基酸部分之間包括胺基酸之連結區域。 在本文中，”非RAGE多肽，，係任何並非衍生自RAGE或其 片段之多肽。此等非RAGE多肽包括免疫球蛋白肽、二聚 化多肽、安定性多肽、兩親性多肽、或是包含可提供，，標 記”以進行該蛋白之導向或純化之胺基酸序列之多肽。 在本文中，，，免疫球蛋白肽"可包含免疫球蛋白之重鏈或 其部分。在一具體實例中，該重鏈之部分可為Fc片段或其 部分。在本文中，Fc片段包含重鏈鉸鏈多肽、免疫球蛋白 重鏈之CH2及CH3域，以單體或雙體之形式存在。或者，可 118243.doc -14- 200806690 使用CH1及Fc片段作為免疫球蛋白多肽。該重鏈（或其部 分）可衍生自任何一種已知之重鏈同種型：IgG (γ)、IgM (μ)、IgD (δ)、IgE (ε)、或IgA (α)。此外，該重鏈（或其部 分）可衍生自任何一種已知之重鏈亞型·· IgGl (γΐ)、IgG2 (γ2)、IgG3 (γ3)、IgG4 (γ4)、IgAl (αΐ)、IgA2 (α2)、或是 此等同種型或亞型之改變其生物活性之突變體。可為改變 之生物活性實例之一包括降低一同種型結合部分Fc受體之 能力，例如，藉由修飾該鉸鏈區域。 辭彙’’相同性π或”相同性百分比’’係指兩胺基酸序列或兩 核酸序列間之序列相同性。相同性百分比可藉由排比兩序 列而判定，且其係指該等比較序列共有位置處之相同殘基 (亦即，胺基酸或核甞酸）數目。序列之排比以及比較可使 用技藝中之標準算法進行（如，Smith and Waterman，1981， Adv. Appl. Math. 2:482 ； Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443 ； Pearson and Lipman, 1988. Proc. Natl. Acad· Sci·，USA，85:2444)，或者可由此等算法之電腦化版 本進行（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive，Madison， WI)，其可以BLAST及FASTA公開取得。同時，亦可使用 ENTREZ (可經由 National Institutes of Health，Bethesda MD而取得）而進行序列比較。在一具體實例中，兩序列之 相同性百分比可使用GCG並以間隙權重1進行測定，因而 將各個胺基酸間隙視為其係兩序列間之單一胺基酸錯配而 加權計算。 118243.doc -15- 200806690 在本文中，辭彙”保守 或功能之蛋白之間比 * ’、曰夕種具有相同結構及’ 對於蛋白之結構之胺基酸。保守性殘基之區域 蛋白中所便％ 具有重要性者。因此，在三維 二=:生之眺連保守性殘基對於… τ係/、有重要性者。為 保守性區域，可對取白x ^ 殘基，或是結構之 不同生物種或是取自相同生物種之 不同個體之相同或類似蛋白進行序列比較。 :本文中’辭彙"同源物"意謂與野生型之胺基酸序列具 有某一程度同源性之多肽。同源性之比較可由目視進行， 或者：”見者’ #由可為輕易取得之序列比較程式之協 助而進仃此等市售可取得知電腦程式可計算二或多種序 列間之同源性百分比（如，Wilbur，WJ andLipman Dj， 1983, Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 80:726-730) 〇 ^ ^ s ’可將在其他具體實例中顯示彼此為至少.相同、 75%相同、80%㈣、85%相同、9〇%相同、95%相同、 97%相同、或98%相同、或99%相同之胺基酸序列包括於 同源序列之中。 在本文中，辭彙與其至少90%相同包括與所指序列具有 自90至99.99%相同性範圍之序列，且其包括其間所有之範 圍。因此’辭彙與其至少90。/〇相同包括與所指序列具有 91、91.5、92、92.5、93、93.5、94、94·5、95、95 5、 96、96,5、97、97·5、98、98·5、99、99.5相同性百分比之 序列。類似者，辭彙π至少70%相同，，包括具有自7〇至 99.99%相同性範圍之序列’包括其間所有之範圍。百分比 118243.doc -16· 200806690 相同性係使用本文所述之算法進行判定。 在本文中，多肽或蛋白之”域’’包含一多肽或蛋白上之區 域，其包含一獨立之單位。可由結構、序列、及/或生物 活性定義。在一具體實例中，一多肽域可包含一蛋白區 域，其係以實質上獨立於該蛋白其他部分之方式進行折 疊。域可使用域資料庫而辨識，諸如，但不限於， PFPAM、PRODOM、PROSITE、BLOCKS、PRINTS、 SBASE、ISREC PROFILES、SAMRT、及 PROCLASS。 在本文中，n免疫球蛋白域”係一胺基酸序列，其與一免 疫球蛋白之域具有結構同源性，或是相同性。免疫球蛋白 域之胺基酸序列長度可為任何長度。在一具體實例中，免 疫球蛋白域可為小於250個胺基酸。在一例示具體實例 中，免疫球蛋白域之長度可為約80-150個胺基酸。舉例而 言，IgG之可變區域、以及CH1、CH2、及CH3區域皆各為 免疫球蛋白域。在另一實例中，IgM之可變、CH1、CH2、 Ch3、及Ch4區域皆各為免疫球蛋白域。 在本文中，"RAGE免疫球蛋白域”係一取自RAGE蛋白之 胺基酸序列，其與一免疫球蛋白之域具有結構同源性，或 是相同性。舉例而言，RAGE免疫球蛋白域可包含RAGE V-域、RAGE 似-Ig C2-型 1 域（”C1 域”）、或是 RAGE 似-Ig C2-型 2域（nC2域”）。 在本文中，”域間連接子”包含連結兩域之多肽。Fc鉸鏈 區域係IgG中域間連接子之實例之一。 在本文中，’’直接連結”係辨識兩不同基團間（如，核酸序 118243.doc -17- 200806690 列、多肽、多肽域）之共價連結，其在所連結之該兩基團 間並無任何位於其中之原子。 在本文中，”配位體結合域”係指負責結合配位體之蛋白 域。辭彙配位體結合域包括一配位體結合域或其部分之同 源物。就此而言，可根據殘基之極性、電荷、溶解度、疏 水性、或是親水性相似性而在配位體結合位點處進行故意 之胺基酸取代，只要其可維持該配位體結合域之結合專一 性即可。 在本文中，”配位體結合位點”包含一蛋白中直接與一配 位體作用之殘基，或是涉及使該配位體定位於接近該等直 接與該配位體作用之殘基處之殘基。配位體結合位點中之 殘基作用可以該等殘基與一配位體在模型或結構中之空間 接近度而判定。辭彙配位體結合位點包括一配位體結合域 或其部分之同源物。就此而言，可根據殘基之極性、電 荷、溶解度、疏水性、或是親水性相似性而在配位體結合 位點處進行故意之胺基酸取代，只要其可維持該配位體結 合位點之結合專一性即可。配位體結合位點可存在於一蛋 白或夕肽之一或多個配位體結合域中。 在本文中，’’作用”係指一配位體或化合物，或是其部分 或片段’與一第二目標分子之部分間之接近情形。該作用 可為非共價性者，例如，由氫鍵、凡得瓦作用、或是靜電 或疏水作用造成，或者，其可為共價性者。 在本文中’ ”配位體”係指可與配位體結合位點作用之分 子或化合物或實體，包括受質或是其類似物或部分。如本 118243.doc -18· 200806690 文中所述，辭彙”配位體”可指稱可結合目標蛋白之化合 物。配位體可為拮抗劑、激動劑、或是調控劑。或者，配 位體可此不具有生物作用。或者，配位體可阻斷其他配位 體之結合，因而抑制一生物作用。配位體可包括，但不限 於，小分子抑制劑。此等小分子可包括肽、肽模擬物、有 機化合物、及其類似者。配位體亦包括多肽及/或蛋白。 在本文+ 周控劑化合物，，係指可改變或變更目標分子 生物活性之分子。調控劑化合物可增加或降低目標分子之 活性、或是改變其物理或化學特徵或是其功能性或免疫學 性特性。就RAGE而言，調控劑化合物可增加或降低rage (或其部分）之活性、或是改變其特徵或是其功能性或免疫 學性特性。調控劑化合物可包括天然及/或化學合成性或 人工之肽、經修飾之肽（如，磷酸肽）單醣、寡醣、多醣、 糖脂、雜環化合物、核甞或核甞酸或其部分、以及小有機 或無機分子。調控劑化合物可為内源性之生理化合物，或 者，其可為天然或合成性之化合物。或者，調控劑化合物 可為小有機分子。辭彙”調控劑化合物"亦包括經化學修飾 之配位體或化合物，且其包括異構物及外消旋形式。 ”激動劑”包含一化合物，其可結合受體以形成複合物， 該複合物可激發對於涉及其中之受體。 ’’拮抗劑”包含一化合物，其可結合激動劑或受體以形成 複合物，該複合物並不會產生實質上之藥學反應，且其可 抑制由該激動劑所誘發之生物反應。 RAGE激動劑因此可結合RAGE，並激發RAGE中介性細 118243.doc 19 200806690 胞反應，且RAGE拮抗劑可抑制RAGE中介性反應使其不為 RAGE激動劑誘發。舉例而言，在一具體實例中，該由 RAGE激動劑所誘發之細胞反應包含活化TNF-α基因轉 錄。 辭彙”肽模擬物”係指可在分子間之作用中作為肽替代物 之結構（Morgan et al·，1989，Ann· Reports Med. Chem·， 24:243-252)。肽模擬物可包括合成性之結構，其或可不含 有胺基酸及/或肽鍵，但其保有肽、或激動劑、或结抗劑 之結構及功能特徵。肽模擬物亦包括類肽（peptoid)、募類 肽（Simon et al·，1972，Proc. Natl· Acad. Sci·，USA，89:9367); 以及含有指定長度肽之肽庫，其表示對應於本發明之肽或 激動劑或拮抗劑之所有可能胺基酸序列。 辭彙’’治療”或”治療”係指改善一疾病或異常之症狀，且 其可包含治癒該疾病、實質性預防該疾病之起始、或使改 善該對象之病況。辭彙”治療’’在本文中係指針對一病患所 罹患之特定疾病之完整治療譜列，包括減輕由該疾病所產 生之一種症狀或是大部分之症狀，治癒該特定疾病、或是 預防該疾病之起始。 在本文中，辭彙"EC50”係定義為可造成50%之測量生物 作用之試劑濃度。舉例而言，具有可測量性生物作用之療 劑之EC50可包含該試劑展現50%該生物作用時之值。 在本文中，辭彙MIC50”係定義為可造成測量作用之50% 抑制之試劑濃度。舉例而言，RAGE結合之拮抗劑之IC50 可包含該拮抗劑可使該配位體與RAGE之配位體結合位點 118243.doc -20- 200806690 之結合降低5 〇%時之值。 在本文中有效里係意謂可在對象體内有效產生所欲 作用之式劑里。辭彙”治療有效量，，代表將可在動物或人類 =内激發所欲治療反應之藥物或醫藥試劑量。包含該有效 置之實際劑量可取決於投藥途徑、該對象之大小及健康、 欲治療之疾病、及其類似者。 辭彙醫藥可接文之載體”在本文中可係指諸等化合物及 組合物，其適用於人類或動物對象，例如，以用於經投藥 以治療RAGE中介性異常或疾病之治療性組合物。 辭彙’’醫藥組合物”在本文中係代表一組合物，其可以， 如’ 口服、腸外、4部、或藉由吸入喷霧、經鼻内、或經 直腸之方式，以含有習知之無毒性載體、稀釋劑、佐劑、 載劑、及其類似者之單元劑量調配物形式，而對哺乳動物 宿主進行投藥。 辭菜腸外在本文中包括皮下注射、靜脈内、肌内、腦 池内之注射或是灌流技術。 在本文中，”排斥"係指組織上之免疫或發炎反應，其可 造成細胞、組織、或器官之破壞，或者其可造成細胞、組 織、或器官之損傷。經排斥之細胞、組織、或器官可係衍 生自產生該排斥反應之相同對象，或者可係自一不同對象 移植至具有排斥反應之對象體内。 在本文中，辭彙”細胞"係指哺乳動物活系統之結構及功 能單元，其各包含一獨立之活系統。如技藝中所知，細胞 包括細胞核、細胞質、胞内之胞器、以及細胞壁，其包納 118243.doc -21 · 200806690 該細胞，並使該細胞可獨立於其他細胞。 在本文中，辭彙’’組織π係指細胞之凝聚物，其具有類似 之結構或功能，或是其共同作用以執行一特定之功能。組 織可包括類似之細胞以及該等細胞周圍之胞間物質之集 合。組織包括，但不限於，肌肉組織、神經組織、以及骨 絡。 在本文中，辭彙”器官”係指動物體内經完全分化之結構 及功能單位，其經特化以用於某些特定之功能。器官可包 含一群可執行特定之功能或功能群之組織。器官包括，但 不限於，心臟、肺、腦、目艮、胃、脾臟、胰臟、腎臟、肝 臟、腸、皮膚、子宮、膀胱、以及骨骼。 RAGE融合蛋白 本發明之具體實例包含RAGE融合蛋白、製備此等融合 蛋白之方法、以及使用此等融合蛋白之方法。本發明可以 各種不同之方式具體實施。 舉例而言，本發明之具體實例提供RAGE融合蛋白，其 包含與一第二非RAGE多肽連結之RAGE多肽。在一具體實 例中，該RAGE融合蛋白可包含RAGE配位體結合位點。在 一具體實例中，該配位體結合位點包含該RAGE融合蛋白 之最N-端域。該RAGE配位體結合位點可包含RAGE之V 域，或是其部分。在一具體實例中，該RAGE配位體結合 位點包含序列編號NO: 9或與其至少90%相同之序列，或是 序列編號NO: 10或與其至少90%相同之序列，或是序列編號 NO: 47或與其至少90%相同之序列。 118243.doc -22- 200806690 在其他具體實例中，該配位體結合位點可包含序列編號 NO: 1之胺基酸23-53。在另一具體實例中，該配位體結合 位點可包含序列編號NO: 1之胺基酸24-52。在另一具體實 例中，該配位體結合位點可包含序列編號NO: 1之胺基酸 3 1 -52。在另一具體實例中，該配位體結合位點可包含序 列編號NO: 1之胺基酸3 1 -116。在另一具體實例中，該配位 體結合位點可包含序列編號NO: 1之胺基酸19-52。 在一具體實例中，該RAGE多肽可連結包含一免疫球蛋 白域或是一免疫球蛋白域之部分（如，其片段）之多肽。在 一具體實例中，該多肽包含一免疫球蛋白域，該域包含人 類IgG之CH2或CH3域中至少一者之至少一部分。 RAGE蛋白或多肤可包含全長人類RAGE蛋白（如，序列 編號NO: 1)，或是人類RAGE之片段。在本文中，RAGE多 肽之片段係長度至少5個胺基酸者，或可為長度大於30個 胺基酸者，但其小於該全長胺基酸序列。在本發明之蛋 白、方法、及組合物之其他具體實例中，該RAGE多肽可 包含與人類RAGE或其片段至少70%、75%、80%、85%、 90%、95%、97%、98%、或99%相同之序列。舉例而言， 在一具體實例中，該RAGE多肽可包含人類RAGE，或其片 段，其中係以甘胺酸而非甲硫胺酸作為其第一殘基（參 見，如，Neeper et al·，（1992))。或者，該人類RAGE可包 含其中除去信號序列之全長RAGE (如，序列編號NO: 2或序 列編號NO: 3)(圖1A及1B)，或是該胺基酸序列之部分。 本發明之RAGE融合蛋白亦可包含SRAGE (如，序列編 118243.doc -23· 200806690 號NO: 4)、與sRAGE至少90%相同之多肽、或是sRAGE之片 段。在本文中，sRAGE係不包括穿膜區域或胞質尾之 RAGE蛋白（Park et al·，Nature Med·，4:1025-1031 (1998))。 舉例而言，RAGE多肽可包含人類sRAGE，或其片段，其 中係以甘胺酸而非甲硫胺酸作為其第一殘基（參見，如， Neeper et al·，（1992))。或者，RAGE多肽可包含其中除去 信號序列之人類sRAGE (參見，如，圖1C中之序列編號NO: 5或序列編號NO: 6，或是（圖16A中之序列編號NO: 45)，或是 該胺基酸序列之部分。 在其他具體實例中，該RAGE蛋白可包含RAGE V域（參 見，如，圖1D中之序列編號NO: 7或序列編號NO: 8 (Neeper et al·，（1992); Schmidt et al· (1997)，或是圖 16A中之序列 編號NO: 46)。或者，可使用與該RAGE V域至少90%相同之 序列或其片段。 或者，該RAGE蛋白可包含RAGE V域之片段（如，圖1D 中之序列編號NO: 9或序列編號NO: 10，或是圖16A中之序列 編號NO: 47)。在一具體實例中，該RAGE蛋白可包含配位 體結合位點。在一具體實例中，該配位體結合位點可包含 序列編號NO: 9或與其至少90%相同之序列，或是序列編號 NO: 10或與其至少90%相同之序列，或是序列編號NO: 47或 與其至少90%相同之序列。在又另一具體實例中，該 RAGE片段係一合成肽。 因此，用於本發明RAGE融合蛋白中之RAGE多肽可包含 全長RAGE之片段。如技藝中所知，RAGE包含三種似免疫 118243.doc -24- 200806690 球蛋白之域，V域、以及Cl及C2域，其各由域間連接子而 彼此連結。全長RAGE亦包括一穿膜多肽以及一胞質尾， 位於該C2域之下游（C-端），並連結該C2域。 在一具體實例中，該RAGE多肽並不包括任何信號序列 殘基。RAGE之信號序列可包含全長RAGE之殘基1-22或是 殘基1-23。同時，如技藝中所知，在其中該融合蛋白之N-端係麩醯胺之具體實例中（如，該信號序列包含殘基1-23)，該N-端麩醯胺（Q24)可經環化以形成焦麩胺酸（pE)。 此等分子之實例建構物係如序列編號NOS: 45、46、47、48、 49、50、及51所示，以及如56及57所示之RAGE融合蛋白。 如技藝中所知者，本發明RAGE融合蛋白之CH3域可具有 在部分重組系統中表現時經由轉譯後修飾作用而切除之C-端胺基酸（參見，如，Li，et al·，Bio Processing J·，2005，4, 23-3 0)。在一具體實例中，該經切除之C-端胺基酸係離胺 酸（K) 〇 因此，在各種具體實例中，該RAGE多肽可包含人類 RAGE之胺基酸23-116 (序列編號NO:7)或與其至少90%相同 之序列，或是人類RAGE之胺基酸24-116 (序列編號NO: 8) 或與其至少90%相同之序列，或是其中Q24環化以形成pE 之人類RAGE之胺基酸24-116 (序列編號NO: 46)或與其至少 90%相同之序列，對應於該RAGE V域。或者，該RAGE多 肽可包含人類RAGE之胺基酸124-221 (序列編號NO: 11)或 與其至少90%相同之序列，對應於該RAGE C1域。在另一 具體實例中，該RAGE多肽可包含人類RAGE之胺基酸227- 118243.doc -25- 200806690 3 17 (序列編號NO: 12)或與其至少90%相同之序列，對應於 該RAGE C2域。或者，該RAGE多肽可包含人類RAGE之胺 基酸23-123 (序列編號NO: 13)或與其至少90%相同之序列， 或是人類RAGE之胺基酸24-123 (序列編號NO: 14)或與其至 少90%相同之序列，對應於該RAGE V域以及一下游之域 間連接子。或者，該RAGE多肽可包含其中Q24環化以形 成pE之人類RAGE之胺基酸24-123 (序列編號NO: 48)或與其 至少90%相同之序列。或者，該RAGE多肽可包含人類 RAGE之胺基酸23-226 (序列編號NO: 17)或與其至少90%相 同之序列，或是人類RAGE之胺基酸24-226 (序列編號NO: 18)或與其至少90%相同之序列，對應於該V域、該Cl域、 以及連結此兩域之域間連接子。或者，該RAGE多肽可包 含其中Q24環化以形成pE之人類RAGE之胺基酸24-226 (序 列編號NO: 50)或與其至少90%相同之序列。或者，該RAGE 多肽可包含人類RAGE之胺基酸23-339 (序列編號NO·· 5)或 與其至少90%相同之序列，或是人類RAGE之胺基酸24-339 (序列編號NO: 6)或與其至少90%相同之序列，對應於 sRAGE (亦即，編碼該V、C1、及C2域以及域間連接子）。 或者，該RAGE多肽可包含其中Q24環化以形成pE之人類 RAGE之胺基酸24-339 (序列編號NO: 45)或與其至少90%相 同之序列。或者，可使用各個此等序列之片段。 該RAGE融合蛋白可包括並非衍生自RAGE或其片段之數 種類型之肽。該RAGE融合蛋白之第二多肽可包含衍生自 免疫球蛋白之多肽。在一具體實例中，該免疫球蛋白多肽 118243.doc -26- 200806690 可包含一免疫球蛋白重鏈或其部分（亦即，片段）。舉例而 言，該重鏈片段可包含衍生自免疫球蛋白Fc片段之多肽， 其中該Fc片段包含重鏈鉸鏈多肽，以及免疫球蛋白重鏈之 CH2及CH3域，以單體形式存在。該重鏈（或其部分）可衍生 自任何一種已知之重鏈同種型：IgG (γ)、IgM (μ)、igD (δ)、IgE (ε)、或IgA (α)。此外，該重鏈（或其部分）可衍生 自任何一種已知之重鏈亞型：IgGl (γΐ)、IgG2 (γ2)、IgG3 (γ3)、IgG4 (γ4)、IgAl (αΐ)、IgA2 (α2)、或是此等同種型 或亞型之改變其生物活性之突變體。該第二多肽可包含人 類IgG之CH2及CH3域或是此等域之一或二者之部分。.作為 一例示具體實例，該包含人類IgG之CH2及CH3域或是其部 分之多肽可包含序列編號NO: 38或序列編號NO: 40。該免疫 球蛋白肽可由序列編號NO: 39或序列編號NO: 41之核酸序列 編碼。序列編號NO: 38或序列編號NO: 40中之免疫球蛋白序 列亦可由序列編號NO: 52或序列編號NO: 53編碼，其中針對 編碼位於該序列C-端之脯胺酸（CCG至CCC)及甘胺酸（GGT 至GGG)之密碼子所進行之沈默鹼基變化可移除一個接近 該末端密碼子之隱蔽RNA剪接位點。 免疫球蛋白鏈之Fc部分可在體内具有促炎性。因此，在 一具體實例中，本發明之RAGE融合蛋白包含一衍生自 RAGE之域間連接子而非衍生自免疫球蛋白之域間较鏈多 肽。 因此，在一具體實例中，該RAGE融合蛋白可包含直接 連結包含免疫球蛋白CH2域或是該免疫球蛋白CH2域之片段 118243.doc -27- 200806690 或部分之多肽之RAGE多肽。在一具體實例中，該CH2域或 其片段包含序列編號NO: 42。在一具體實例中，該序列編 號NO: 42之片段包含其中除去前10個胺基酸之序列編號NO: 42。在一具體實例中，該RAGE融合蛋白可包含配位體結 合位點。該RAGE配位體結合位點可包含RAGE之V域或其 部分。在一具體實例中，該RAGE配位體結合位點包含序 列編號NO·· 9或與其至少90%相同之序列，或是序列編號NO·· 10或與其至少90%相同之序列，或是序列編號NO: 47或與其 至少90%相同之序列。 用於本發明RAGE融合蛋白中之RAGE多肽可包含一 RAGE免疫球蛋白域。此外或是或者，該RAGE片段可包含 一域間連接子。或者，該RAGE多肽可包含連結一上游（亦 即，較接近N-端）或下游（亦即，較接近C-端）域間連接子之 RAGE免疫球蛋白域。在又另一具體實例中，該RAGE多肽 可包含兩個（或以上）之RAGE免疫球蛋白域，其各由一域 間連接子而彼此連結。該RAGE多肽尚可包含多個RAGE免 疫球蛋白域，其由一或多個域間連接子而彼此連結，並具 有連附於該N-端RAGE免疫球蛋白域及/或C-端RAGE免疫 球蛋白域之末端域間連接子。RAGE免疫球蛋白域及域間 連接子之其他組合亦屬於本發明之範圍。 在一具體實例中，該RAGE多肽可包含連結一RAGE免疫 球蛋白域之一 RAGE域間連接子，其係使該RAGE免疫球蛋 白域之C-端胺基酸連結該域間連接子之N-端胺基酸，並使 該RAGE域間連接子之C-端胺基酸直接連結一包含免疫球 118243.doc -28- 200806690 蛋白CH2域或其片段之多肽之N-端胺基酸。該包含免疫球 蛋白CH2域之多肽可包含人類IgG之CH2及CH3域或是此等 域之一或二者之部分。作為一例示具體實例，該包含人類 IgG之CH2及CH3域或是其部分之多肽可包含序列編號NO: 38 或序列編號Να 40。 如上所述，本發明之RAGE融合蛋白可包含取自RAGE之 單一或多重域。同時，該包含連結一 RAGE多肽域之域間 連接子之RAGE多肽可包含全長RAGE蛋白之片段。舉例而 言，該RAGE多肽可包含人類RAGE之胺基酸23-136 (序列 編號NO: 15)或與其至少90%相同之序列，或是人類RAGE之 胺基酸24-136 (序列編號NO·· 16)或與其至少90%相同之序 列，或是其中Q24環化以形成pE之人類RAGE之胺基酸24· 136 (序列編號Να 49)或與其至少90%相同之序列，對應於 該RAGE V域以及一下游之域間連接子。或者，該RAGE多 肽可包含人類RAGE之胺基酸23-251 (序列編號NO: 19)或與 其至少90%相同之序列，或是人類RAGE之胺基酸24-251 (序列編號NO: 20)或與其至少90%相同之序列，或是其中 Q24環化以形成pE之人類RAGE之胺基酸24-25 1 (序列編號 NO: 51)或與其至少90%相同之序列，對應於該V域、該C1 域、連結此兩域之域間連接子、以及一位於C1下游之第二 域間連接子。 舉例而言，在一具體實例中，該RAGE融合蛋白可包含 兩個衍生自RAGE蛋白之免疫球蛋白域以及兩個衍生自人 類Fc多肽之免疫球蛋白域。該RAGE融合蛋白可包含連結 118243.doc -29- 200806690 第二RAGE免疫球蛋白域及第二RAGE域間連接子之第一 RAGE免疫球蛋白域及第一 RAGE域間連接子，其係使該第 一 RAGE域間連接子之N-端胺基酸連結該第一RAGE免疫球 蛋白域之C-端胺基酸、該第二RAGE免疫球蛋白域之N-端 胺基酸連結該第一 RAGE域間連接子之C-端胺基酸、該第 二RAGE域間連接子之N-端胺基酸連結該第二RAGE免疫球 蛋白域之C-端胺基酸、且該第二RAGE域間連接子之C-端 胺基酸直接連結該CH2免疫球蛋白域之N-端胺基酸。在一 具體實例中，四域之RAGE融合蛋白可包含序列編號NO: 32。在其他具體實例中，四域之RAGE融合蛋白可包含序 列編號NO: 33、序列編號NO: 34、或序列編號NO: 56。 或者，三域之RAGE融合蛋白可包含一個衍生自RAGE之 免疫球蛋白域以及兩個衍生自人類Fc多肽之免疫球蛋白 域。舉例而言，該RAGE融合蛋白可包含經由一 RAGE域間 連接子而連結一 Ch2免疫球蛋白域或是Ch2免疫球蛋白域之 部分之N-端胺基酸之單一 RAGE免疫球蛋白域。在一具體 實例中，三域之RAGE融合蛋白可包含序列編號NO: 35。在 其他具體實例中，三域之RAGE融合蛋白可包含序列編號 Να 36、序列編號NO: 37、或序列編號NO: 57。 RAGE域間連接子片段可包含一天然位於RAGE免疫球蛋 白域之下游，並因而與其連結之肽序列。舉例而言，就 RAGE V域而言，該域間連接子可包含天然位於該V域下游 之胺基酸序列。在一具體實例中，該連接子可包含序列編 號NO: 21，對應於全長RAGE之胺基酸117-123。或者，該 118243.doc -30· 200806690 連接子可包含具有天然rage序列其他部分之肽。舉例而 言，可使用包含位於序列編號NO: 21之上游及下游之數個 胺基酸（如，1-3個、1-5個、或1-10個、或丨·：^個胺基酸）之 域間連接子。因此，在一具體實例中，該連接子包含序列 編號NO: 23，其包含全長rage之胺基酸117-136。或者， 可使用自该連接子之任一端除去，例如，1、2、或3個胺 基酸之序列編號NO: 21之片段。在其他具體實例中，該連 接子可包含與序列編號NO: 21或序列編號NO: 23為至少70% 相同、75%相同、80%相同、85。/。相同、90。/。相同、95%相 同、97%相同、98%相同、或99%相同之肽。 就RAGE C1域而言，該連接子可包含天然位於該以域下 游之肽序列。在一具體實例中，該連接子可包含序列編號 NO: 22 ’對應於全長尺八〇£之胺基酸222_251。或者，該連 接子可包含具有天然RAGE序列其他部分之肽。舉例而 言’可使用包含位於序列編號NO: 22之上游及下游之數個 胺基酸（1-3個、1-5個、或1-10個、或1-15個胺基酸）之連接 子。或者，可使用自該連接子之任一端除去，例如，1_3 個、1-5個、或1-1〇個、或1-15個胺基酸之序列編號1<[〇: 22 之片段。舉例而言，在一具體實例中，RAGE域間連接子 可包含序列編號NO: 24，對應於胺基酸222-226。或者，域 間連接子可包含序列編號NO: 44，對應於RAGE胺基酸3 1 8-342 〇 同時，熟習技藝者將可辨知，在其編碼序列中變更、添 加、或除去單一胺基酸或是小百分比之胺基酸（一般而言 118243.doc 31- 200806690 係小於約5% ’更一般而言係小於約1❶/❶）之個別取代體、缺 失體、或添加體係經保守性修飾之版本，其中該等變更會 造成一胺基酸由一化學類似性之胺基酸取代。提供功能類 似性胺基酸之保守性取代表係技藝中所熟知者。下列之實 例組群各含有彼此為保守性取代之胺基酸： 1) 丙胺酸（A)、絲胺酸（S)、羥丁胺酸（T); 2) 天冬胺酸（D)、麩胺酸（e); 3) 天冬醯胺（N)、麩醯胺（Q); 4) 精胺酸（R)、離胺酸（κ); 5) 異白胺酸⑴、白胺酸（L)、甲硫胺酸（μ)、纈胺酸 (V);及 6) 苯丙胺酸（F)、酿胺酸（γ)、色胺酸（w)。 保守性之取代係一種取代，其中該取代之胺基酸（天然 存在性或經修飾性者）係與被取代之胺基酸具有結構相關 性者，亦即，其與被取代之胺基酸具有約為相同之大小及 電子特性。因此，該取代胺基酸可在其側鏈具有與該原始 胺基酸相同或類似之官能基。”保守性之取代"亦係指使用 一種取代胺基酸，其係與被取代之胺基酸相同，除外其側 鏈中之一官能基係經適當保護基保護。 如技藝中所知，胺基酸可藉由酶性或非酶性之反應機制 而自其天然之結構成為經化學修飾者舉例而言，在一具體 實例中，一N-端麩胺酸或麩醯胺可進行環化（並喪失水）以 形成焦麩胺酸（pyroE 或 pE)(Chelius et al·，Anal. Chem.， 78:2370-2376 (2006)及Burstein et al.，proc· National·，Acad· 118243.doc -32- 200806690

Sci·，73:2604-2608 (19776))。同時，序列編號NO: 56之 RAGE融合蛋白潛在可經由在殘基24處編碼麩胺酸而非在 殘基24處編碼麩醯胺（根據全長RAGE而編號）之核酸序列 產生。 製備RAGE融合蛋白之方法 本發明亦包含製備RAGE融合蛋白之方法。因此，在一 具體實例中，本發明包含一種製備RAGE融合蛋白之方 法，其包含使一 RAGE多肽共價連結一第二非RAGE多肽之 步驟，其中該RAGE多肽包含RAGE配位體結合位點。舉例 而言，該經連結之RAGE多肽以及該第二非RAGE多肽可由 一重組DNA建構物編碼。該方法尚可包含將該DNA建構物 納入一表現載體中之步驟。同時，該方法可包含將該表現 載體插入一宿主細胞中之步驟。 舉例而言，本發明之具體實例提供RAGE融合蛋白，其 包含與一第二非RAGE多肽連結之RAGE多肽。在一具體實 例中，該RAGE融合蛋白可包含RAGE配位體結合位點。在 一具體實例中，該配位體結合位點包含該RAGE融合蛋白 之最N-端域。該RAGE配位體結合位點可包含RAGE之V 域，或是其部分。在一具體實例中，該RAGE配位體結合 位點包含序列編號NO: 9或與其至少90%相同之序列，或是 序列編號NO: 10或與其至少90%相同之序列，或是序列編號 NO: 47或與其至少90%相同之序列。 在一具體實例中，該RAGE多肽可連結包含一免疫球蛋 白域或是一免疫球蛋白域之部分（如，其片段）之多肽。在 118243.doc -33 - 200806690 一具體實例中，該多肽包含一免疫球蛋白域，該域包含人 類IgG之CH2或CH3域中至少一者之至少一部分。 該RAGE融合蛋白可由重組DNA技術進行工程處理。舉 例而言，在一具體實例中，本發明可包含分離性之核酸序 列，該序列係包含編碼與一第二非RAGE多肽連結之RAGE 多肽之聚核苷酸序列，或是與其互補，或使與其具有顯著 之相同性。在一具體實例中，該RAGE多肽可包含RAGE配 位體結合位點。 該RAGE蛋白或多肽可包含全長人類RAGE蛋白（如，序 列編號NO: 1)，或是人類RAGE之片段。在一具體實例中， 該RAGE多肽並不包括任何信號序列殘基。RAGE之信號序 列可包含全長RAGE (序列編號NO: 1)之殘基1-22或是殘基 1-23。在其他具體實例中，該RAGE多肽可包含與人類 RAGE或其片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、 97%、98%、或99%相同之序列。舉例而言，在一具體實 例中，該RAGE多肽可包含人類RAGE，或其片段，其中係 以甘胺酸而非甲硫胺酸作為其第一殘基（參見，如， Neeper et al·，（1992))。或者，該人類RAGE可包含其中除 去信號序列之全長RAGE (如，序列編號NO: 2或序列編號 NO: 3)(圖1A及1B)，或是該胺基酸序列之部分。本發明之 RAGE融合蛋白亦可包含sRAGE (如，序列編號NO: 4)、與 sRAGE至少90%相同之多肽、或是sRAGE之片段。舉例而 言，該RAGE多肽可包含人類sRAGE，或其片段，其中係 以甘胺酸而非甲硫胺酸作為其第一殘基（參見，如， 118243.doc -34- 200806690

Neeper et al·，（1992))。或者，該人類RAGE多肽可包含其 中除去信號序列之sRAGE (參見，如，圖1C中之序列編號 NO·· 5或序列編號NO: 6，或是圖16A中之序列編號NO: 45)， 或是該胺基酸序列之部分。在其他具體實例中，該RAGE 蛋白可包含一 V域（參見，如，圖ID中之序列編號NO: 7或序 列編號Να 8，或是圖16A中之序列編號NO: 46)。或者，可 使用與該V域至少90%相同之序列或其片段。或者，該 RAGE蛋白可包含一 RAGE片段，其包含V域之部分（參見， 如，圖1D中之序列編號NO: 9或序列編號NO: 10，或是圖16A 中之序列編號NO: 47)。在一具體實例中，該配位體結合位 點可包含序列編號NO·· 9或與其至少90%相同之序列，或是 序列編號NO: 10或與其至少90%相同之序列，或是序列編號 NO: 47或與其至少90%相同之序列。在又另一具體實例中， 該RAGE片段係一合成肽。 在一具體實例中，該核酸序列包含序列編號NO: 25以編 碼人類RAGE之胺基酸1-118或其片段。舉例而言，可使用 包含序列編號NO: 25之核苷酸1-348之序列，以編碼人類 RAGE之胺基酸1-116。或者，該核酸可包含序列編號NO: 26以編碼人類RAGE之胺基酸1-123。或者，該核酸可包含 序列編號NO: 27以編碼人類RAGE之胺基酸1-136。或者， 該核酸可包含序列編號NO: 28以編碼人類RAGE之胺基酸1 -230。或者，該核酸可包含序列編號NO: 29以編碼人類 RAGE之胺基酸1-251。或者，可使用此等核酸序列之片段 以編碼RAGE多肽片段。 118243.doc -35· 200806690 該RAGE融合蛋白可包括並非衍生自RAGE或其片段之數 種類型之肽。該RAGE融合蛋白之第二多肽可包含衍生自 免疫球蛋白之多肽。該重鏈（或其部分）可衍生自任何一種 已知之重鏈同種型：IgG (γ)、IgM (μ)、IgD (δ)、IgE⑷、 或IgA (α)。此外，該重鏈（或其部分）可衍生自任何一種已 知之重鏈亞型：IgGl (γΐ)、IgG2 (γ2)、IgG3 (γ3)、igG4 (γ4)、IgAl (ctl)、IgA2 (α2)、或是此等同種型或亞型之改 變其生物活性之突變體。該第二多肽可包含人類IgG之Ch2 及Ch3域或是此等域之一或二者之部分。作為一例示具體 實例，該包含人類IgG之CH2及CH3域或是其部分之多肽可 包含序列編號NO: 38或序列編號NO: 40。該免疫球蛋白肽可 由序列編號NO: 39或序列編號NO: 41之核酸序列編碼。在其 他具體實例中，序列編號NO: 38或序列編號NO: 40中之免疫 球蛋白序列亦可分別由序列編號NO: 52或序列編號NO: 53編 碼。 免疫球蛋白鏈之Fc部分可在體内具有促炎性。因此，本 發明之RAGE融合蛋白可包含一衍生自raGE之域間連接子 而非衍生自免疫球蛋白之域間鉸鏈多肽。舉例而言，在一 具體實例中，該RAGE融合蛋白可由一重組DNA建構物編 碼。同時，該方法可包含將該DNA建構物納入一表現載體 中之步驟。同時，該方法可包含將該表現載體插入一宿主 細胞中之步驟。 因此，在一具體實例中，本發明包含一種製備RAGE融 合蛋白之方法，其包含使一 RAGE多肽共價連結一包含免 118243.doc -36- 200806690 疫球蛋白CH2域或是免疫球蛋白CH2域之部分之多肽之步 驟。在一具體實例中’該RAGE融合蛋白可包含RAGE配位 體結合位點。該RAGE配位體結合位點可包含RAGE之V 域，或是其部分。在一具體實例中，該RAGE配位體結合 位點包含序列編號NO: 9或與其至少90%相同之序列，或是 序列編號NO: 10或與其至少90%相同之序列，或是序列編號 NO: 47或與其至少90%相同之序列。 舉例而言，在一具體實例中，本發明包含一種核酸，其 編碼直接連結包含免疫球蛋白CH2域或其片段之多肽之 RAGE多肽。在一具體實例中，該cH2域或其片段包含序列 編號NO: 42。在一具體實例中，該序列編號NO: 42之片段包 含其中除去前1 〇個胺基酸之序列編號NO: 42。該第二多肽 可包含人類IgGl之CH2及CH3域。作為一例示具體實例，該 包含人類IgGl之CH2及CH3域之多肽可包含序列編號NO: 38 或序列編號NO: 40。該免疫球蛋白肽可由序列編號NO: 39或 序列編號NO: 41之核酸序列編碼。序列編號NO: 38或序列編 號NO: 40中之免疫球蛋白序列亦可由序列編號NO: 52或序列 編號NO: 53編碼，其中針對編碼位於該序列C-端之脯胺酸 (CCG至CCC)及甘胺酸（GGT至GGG)之密碼子所進行之沈 默鹼基變化可移除一個接近該末端密碼子之隱蔽RNA剪接 位點。 在一具體實例中，該RAGE多肽可包含連結一RAGE免疫 球蛋白域之一 RAGE域間連接子，其係使該RAGE免疫球蛋 白域之C-端胺基酸連結該域間連接子之N-端胺基酸，並使 118243.doc -37- 200806690 該RAGE域間連接子之C-端胺基酸直接連結一包含免疫球 蛋白CH2域或其片段之多肽之N-端胺基酸。該包含免疫球 蛋白CH2域或其部分之多肽可包含人類IgGl之CH2及CH3域 或是此等域之一或二者之部分。作為一例示具體實例，該 包含人類IgGl之CH2及CH3域或是其部分之多肽可包含序列 編號NO: 38或序列編號NO: 40。 本發明之RAGE融合蛋白可包含取自RAGE之單一或多重 域。同時，該包含連結一 RAGE多肽域之域間連接子之 RAGE多肽可包含全長RAGE蛋白之片段。舉例而言，在一 具體實例中，該RAGE融合蛋白可包含兩個衍生自RAGE蛋 白之免疫球蛋白域以及兩個衍生自人類Fc多肽之免疫球蛋 白域。該RAGE融合蛋白可包含連結第二RAGE免疫球蛋白 域及第二RAGE域間連接子之第一 RAGE免疫球蛋白域及第 一RAGE域間連接子，其係使該第一域間連接子之N-端胺 基酸連結該第一 RAGE免疫球蛋白域之C-端胺基酸、該第 二RAGE免疫球蛋白域之N-端胺基酸連結該第一域間連接 子之C-端胺基酸、該第二域間連接子之N-端胺基酸連結該 第二RAGE免疫球蛋白域之C-端胺基酸、且該第二RAGE域 間連接子之C-端胺基酸直接連結該包含CH2免疫球蛋白域 或其片段之多肽之N-端胺基酸。舉例而言，該RAGE多肽 可包含人類RAGE之胺基酸23-251 (序列編號NO: 19)或與其 至少90%相同之序列，或是人類RAGE之胺基酸24-251 (序 列編號NO:20)或與其至少90%相同之序列，或是其中Q24環 化以形成pE之人類RAGE之胺基酸24-25 1 (序列編號NO: 51) 118243.doc -38 - 200806690 或與其至少90%相同之序列，對應於該V域、該C1域、連 結此兩域之域間連接子、以及一位於C1下游之第二域間連 接子。在一具體實例中，包含序列編號NO· 30或其片段之 核酸建構物可編碼四域之rAGE融合蛋白。在另一具體實 例中，包含序列編號Να 54之核酸建構物可編碼四域之 RAGE融合蛋白，其中加入針對編碼位於該序列C-端之脯 胺酸（CCG至CCC)及甘胺酸（GGT至GGG)之密碼子所進行 之沈默鹼基變化以移除一個接近該末端密碼子之隱蔽RNA 剪接位點。 或者，三域之RAGE融合蛋白可包含一個衍生自RAGE之 免疫球蛋白域以及兩個衍生自人類Fc多肽之免疫球蛋白 域。舉例而言，該RAGE融合蛋白可包含經由一 RAGE域間 連接子而連結該包含CH2免疫球蛋白域或其片段之多肽之 N-端胺基酸之單一 rage免疫球蛋白域。舉例而言，該 RAGE多肽可包含人類rage之胺基酸23-136 (序列編號NO: 15)或與其至少9〇%相同之序列，或是人類RAGE之胺基酸 24_136 (序列編號NO: 16)或與其至少90%相同之序列，或是 其中Q24環化以形成pE之人類raGE之胺基酸24-136 (序列 編號NO: 49)或與其至少9〇%相同之序列，對應於該RAGE V 域以及一下游之域間連接子。在一具體實例中，包含序列 編號NO: 31或其片段之核酸建構物可編碼三域之raGE融合 蛋白。在另一具體實例中，包含序列編號N〇: 55之核酸建 構物可編碼三域之RAGE融合蛋白，其中針對編碼位於該 序列C-端之脯胺酸（Ccg至CCC)及甘胺酸（GGT至GGG)之 118243.doc -39- 200806690 密碼子所進行之沈默鹼基變化可移除一個接近該末端密碼 子之隱蔽RNA剪接位點。 RAGE域間連接子片段可包含一天然位於RAGE免疫球蛋 白域之下游，並因而與其連結之肽序列。舉例而言，就 RAGE V域而έ ’該域間連接子可包含天然位於該v域下游 之胺基酸序列。在一具體實例中，該連接子可包含序列編 號Να 21，對應於全長RAGE之胺基酸117-123。或者，該 連接子可包含具有天然RAGE序列其他部分之肽。舉例而 言，可使用包含位於序列編號NO: 21之上游及下游之數個 胺基酸（如，1-3個、1-5個、或1-10個、或1_15個胺基酸）之 域間連接子。因此，在一具體實例中，該連接子包含序列 編號NO: 23，其包含全長RAGE之胺基酸117-136。或者， 可使用自该連接子之任一端除去，例如，1、2、或3個胺 基酸之序列編號NO: 21之片段。在其他具體實例中，該連 接子可包含與序列編號NO: 21或序列編號NO: 23為至少70% 相同、或80%相同、或90%相同之序列。 就RAGE C1域而言，該連接子可包含天然位於該ci域下 游之肽序列。在一具體實例中，該連接子可包含序列編號 NO: 22 ’對應於全長RAGE之胺基酸222·25 1。或者，該連 接子可包含具有天然RAGE序列其他部分之肽。舉例而 言，可使用包含位於序列編號NO: 22之上游及下游之數個 胺基酸（1-3個、1-5個、或1-1〇個、或1-15個胺基酸）之連接 子。或者，可使用自該連接子之任一端除去，例如，1 _3 個、1 -5個、或1 -1 〇個、或1 _ 15個胺基酸之序列編號NO: 22 118243.doc -40 - 200806690 之片段。舉例而言，在一具體實例中，RAGE域間連接子 可包含序列編號NO: 24，對應於胺基酸222-226。或者，域 間連接子可包含序列編號NO: 44，對應於RAGE胺基酸3 18-342 〇 該方法尚可包含將該DNA建構物納入一表現載體中之步 驟。因此，在一具體實例中，本發明包含一種表現載體， 其編碼一 RAGE融合蛋白，其包含直接連結包含免疫球蛋 白CH2域或是免疫球蛋白CH2域之部分之多肽之RAGE多 肽。在一具體實例中，該RAGE多肽包含諸等建構物，諸 如本文所述者，其具有連結一 RAGE免疫球蛋白域之RAGE 域間連接子，其係使該RAGE免疫球蛋白域之C-端胺基酸 連結該域間連接子之N-端胺基酸，並使該RAGE域間連接 子之C-端胺基酸直接連結一包含免疫球蛋白CH2域或其部 分之多肽之N-端胺基酸。舉例而言，該用以轉染諸等細胞 之表現載體可包含核酸序列序列編號NO: 30或其片段、序 列編號NO: 54或其片段、序列編號NO: 31或其片段、或是序 列編號NO: 55或其片段。 該方法尚可包含以本發明之表現載體轉染一細胞之步 驟。因此，在一具體實例中，本發明包含一種細胞，其係 經該表現本發明RAGE融合蛋白之表現載體轉染，以使該 細胞表現一種RAGE融合蛋白，其包含直接連結包含免疫 球蛋白CH2域或是免疫球蛋白CH2域之部分之多肽之RAGE 多肽。在一具體實例中，該RAGE多肽包含諸等建構物， 諸如本文所述者，其具有連結一 RAGE免疫球蛋白域之 118243.doc -41 - 200806690 RAGE域間連接子，其係使該RAGE免疫球蛋白域之C-端胺 基酸連結該域間連接子之N-端胺基酸，並使該RAGE域間 連接子之C-端胺基酸直接連結一包含免疫球蛋白CH2域或 其部分之多肽之N-端胺基酸。舉例而言，該表現載體可包 含核酸序列序列編號NO: 30或其片段、序列編號NO: 54或其 片段、序列編號NO: 31或其片段、或是序列編號NO: 55或其 片段。 舉例而言，可藉由融合不同長度之人類RAGE 5’ cDNA 序列與人類IgGl (γΐ) 3’ cDNA序列而建構質體以表現 RAGE-IgG融合蛋白。可使用標準之重組技術，將該表現 盒序列插入一表現載體中，諸如，PCDNA3.1表現載體 (Invitrogen，CA) 〇 同時，該方法可包含使該表現載體轉染進入宿主細胞 中。RAGE融合蛋白可在哺乳動物表現系統中表現，包括 其中係使用病毒（諸如，逆轉錄病毒或腺病毒）而將該表現 建構物引入諸等哺乳動物細胞中之系統。可用以作為宿主 以進行表現之哺乳動物細胞系係技藝中所熟知者，且其包 括諸多可取自美國形態培養物保藏中心（American Type Culture Collection (ATCC))之無限增殖化細胞系。此等細 胞系包括，例如，中國倉氣印巢（CHO)細胞、NS0、SP2細 胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎臟（BHK)細胞、猴腎臟細胞 (COS)、人類肝細胞癌細胞（如，Hep G2)、A549細胞、以 及諸多其他細胞系。細胞系可經由判定何種細胞系具有高 RAGE融合蛋白表現量而進行選擇。其他可用之細胞系為 118243.doc -42- 200806690 昆蟲細胞系，諸如，Sf9細胞。植物宿主細胞包括，如， 煙草屬（Nicotiana)、擬南芥（Arabidopsis)、鴨草、玉米、 小麥、馬鈐薯等。細菌素主細胞包括大腸桿菌（E. c〇n)及 鏈黴菌屬種（Streptomyces)。酵母菌宿主細胞包括粟酒裂 殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)、釀酒酵母（Sacchar〇myces cerevisiae)、及畢赤酵母（pichia pastoris)。當將編碼raGE 融 合蛋白之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，可藉 著使該專宿主細胞進行足以在該宿主細胞中表現該rage 融合蛋白或是足以將該RAGE融合蛋白分泌至該等宿主細 胞所生長之培養基中之時間期之培養，因而製備該rage 融合蛋白。可使用標準之蛋白純化方法而自該培養基中回 收R A G E融合蛋白。 可使用編碼RAGE融合蛋白之核酸分子或是包含此等核 酸分子之表現載體以轉染適當之哺乳動物、植物、細菌、 或酵母菌宿主細胞。轉形可係藉由用於將聚核苷酸引入宿 主細胞中之任何已知方法而進行。可用於將異源聚核甞酸 引入哺乳動物宿主細胞中之方法係技藝中所熟知者，且其 包括葡聚糖中介性轉染、磷酸鈣沈澱、聚凝胺中介性轉 染、原生質體融合、電穿孔、將聚核苷酸包納於脂質體 中、以及直接將該DNA微注射至細胞核中。此外，核酸分 子可藉由病毒載體而引入哺乳動物細胞之中。用以轉形植 物細胞之方法係為技藝中所熟知，其包括，如，土壤桿菌 (Agr〇baCteriUm)中介性轉形、基因搶轉形、直接注射、電 穿孔、及病毒轉形。用以轉形細菌及酵母菌細胞之方法亦 118243.doc -43- 200806690 為技藝中所熟知。 表現載體亦可藉由使用DNA基因搶法而傳遞至表現系統 中，其中係使該質體沈澱於顯微顆粒上，較佳係金粒，再 將該等顆粒推進至目標細胞或表現系統中。DNA基因搶法 技術係為技藝中所熟知，且其裝置，如，"基因槍”，係可 由市售取得以用於將微顆粒傳遞至細胞中（如，Helios

Gene Gun，Bio-Rad Labs·，Hercules，CA)及皮膚中（PMED

Device，PowerMed Ltd·，Oxford，UK)。 自生產細胞系之RAGE融合蛋白表現可使用諸多已知之 技術而增強。舉例而言，麩醯胺合成酶基因表現系統（GS 糸統）及質體編碼性新黴素抗性系統係常用以在特定情形 下增進表現之方法。 由不同細胞糸所表現之RAGE融合蛋白可具有彼此不同 之糖基化模式。然而，由本文提供之核酸分子所編碼或是 包含本文所提供胺基酸序列之所有RAGE融合蛋白皆係本 發明之一部分，不論該RAGE融合蛋白之糖基化狀態為 何0 在一具體實例中，可使一重組表現載體轉染進入中國倉 鼠卵巢細胞（CHO)中，並對表現進行最適化。在其他具體 實例中，該等細胞可產生〇_1至20克/升，或是〇·5至1〇克/ 升，或是約1-2克/升。 如技藝中所知，此等核酸建構物可藉由突變而進行修 飾，例如，藉著以包含該目標突變之引子而進行核酸樣板 之PCR擴增。藉由此種方式，可設計包含各異RA(}E配位 118243.doc •44- 200806690 體親和力之多肽。在一具體實例中，該等經突變之序列可 與該起始DNA為90%或以上相同。因此，變體可包括可在 嚴格條件下（亦即，相當於在低於該DNA雙螺旋之解鏈溫 度（TM)約20-27°C而於1莫耳濃度之鹽中）進行雜交之核甞 酸序列。 該編碼序列可藉著使該表現載體轉染進入適當之宿主中 而進行表現。舉例而言，可使該重組載體穩定轉染進入中 國倉鼠卵巢（CHO)細胞中，再選擇表現該RAGE融合蛋白 之細胞並進行選殖。在一具體實例中，其係藉由使用抗生 素G418而選擇表現該重組建構物之細胞之質體編碼性新黴 素抗性。可選擇出個別之純系，並可對由西方點潰分析偵 測出表現高含量重組蛋白之純系進行擴增，再使用A蛋白 管柱進行親和層析而純化該基因產物。 編碼本發明RAGE融合蛋白之重組核酸例示實例示於圖 2-5及圖17-20。舉例而言，如上所述，由該重組DNA建構 物所生產之RAGE融合蛋白可包含連結一第二非raGE多肽 之RAGE多肽。該RAGE融合蛋白可包含兩個衍生自RAGE 蛋白之域以及兩個衍生自免疫球蛋白之域。其中一種具有 此種類型結構之編碼RAGE融合蛋白TTP-4000 (TT4)之實 例核酸建構物示於圖2 (序列編號NO: 30)及圖17 (序列編號 NO: 54)。如圖2及圖17所示，編碼序列1-753 (以粗體字強 調）係編碼該RAGE N·端蛋白序列，而自754-13 86之序列則 係編碼該I g G蛋白序列。 當衍生自序列編號NO: 30或序列編號NO: 54或與其至少 118243.doc -45- 200806690 90%相同之序列時，該rage融合蛋白可包含序列編號NO: 32之四域胺基酸序列，或是其中移除信號序列之該多肽（參 見’如圖4中之序列編號N0: 33或序列編號N〇: 34，或是圖 19中之序列編號術：56)。在圖4及圖19中，該rage胺基酸 序列係以粗體字強調。該免疫球蛋白序列係IgG2 Ch2及 Ch3免疫球蛋白域。如圖6B所示，該全長ττρ-4〇〇〇 rage 融合蛋白之前251個胺基酸含有包含胺基酸1—22/23之信號 序列、包含胺基酸23/24-116之V免疫球蛋白域（包括該配位 體結合位點）、包含胺基酸117至123之域間連接子、包含 胺基酸124-221之第二免疫球蛋白域（C1)、以及包含胺基酸 222-251之下游域間連接子作為該rage多肽序列。 在一具體實例中，該RAGE融合蛋白並不一定必須包含 該第二RAGE免疫球蛋白域。舉例而言，該RAGE融合蛋白 可包含一個衍生自RAGE之免疫球蛋白域以及兩個衍生自 人類Fc多肽之免疫球蛋白域。其中一種編碼此種類型 RAGE融合蛋白之實例核酸建構物示於圖3 (序列編$N〇: 31)及圖18 (序列編號NO: 55)。如圖3及圖18所示，自核甞酸 1至408之編碼序列（以粗體字強調）係編碼該rage N-端蛋 白序列，而自409-1041之序列則係編碼該IgG (γ1)蛋白序 列。 當衍生自序列編號NO: 31或序列編號Ν〇: 55或與其至少 90%相同之序列時，該RAGE融合蛋白可包含序列編號以〇: 35之二域胺基酸序列，或是其中移除信號序列之該多肽（參 見，如圖5中之序列編號斯：36或序列編號Ν〇: 37，或是圖 118243.doc -46- 200806690 20中之序列編號NO: 57)。在圖5及圖20中，該RAGE胺基酸 序列係以粗體字強調。如圖6B所示，該全長TTP-3000 RAGE融合蛋白之前130個胺基酸含有包含胺基酸1-22/23 之信號序列、包含胺基酸23/24-116之V免疫球蛋白域（包括 該配位體結合位點）、包含胺基酸117至136之域間連接子 作為該RAGE多肽。自137至346之序列包括該IgG之CH2及 CH3免疫球蛋白域。 本發明之RAGE融合蛋白可包含優於不含一第二多肽之 RAGE多肽之改良性體内安定性。該RAGE融合蛋白尚可進 一步經修飾以增加祈安定性、功效、強度、及生物可獲 性。因此，本發明之RAGE融合蛋白可經轉譯後之加工作 用或是化學修飾而修飾。舉例而言，該RAGE融合蛋白可 由合成製備以包括L-、D-、或非天然性胺基酸、α -雙取 代性胺基酸、或Ν-烷基胺基酸。此外，蛋白可由乙醯基 化、醯化、ADP-核糖基化、醯胺化、連附脂質（諸如，填 脂醯肌醇）、形成雙硫鍵、及其類似者而進行修飾。同 時，可加入聚乙二醇以增加該RAGE融合蛋白之生物安定 性。 RAGE拮抗劑與RAGE融合蛋白之結合 本發明之RAGE融合蛋白可包含諸多之應用。舉例而 言，本發明之RAGE融合蛋白可用於結合分析中以辨識 RAGE配位體，諸如，RAGE激動劑、拮抗劑、或調控劑。 舉例而言，在一具體實例中，本發明提供一種用以偵測 RAGE調控劑之方法，其包含：（a)提供一種包含連結一第 118243.doc -47- 200806690 二非RAGE多肽之RAGE多肽之RAGE融合蛋白，其中該 RAGE多肽包含配位體結合位點；（b)混合目標化合物及已 知具有RAGE結合親和力之配位體與該RAGE融合蛋白；及 (c)測量該已知RAGE配位體在該目標化合物存在下之與該 RAGE融合蛋白之結合。在一具體實例中，該配位體結合 位點包含該RAGE融合蛋白之最N-端域。 該RAGE融合蛋白亦可提供用以偵測RAGE調控劑之套 組。舉例而言，在一具體實例中，本發明之套組可包含（a) 作為陽性控制組之一種具有已知RAGE結合親和力之化合 物；（b) —種包含連結一第二非RAGE多肽之RAGE多肽之 RAGE融合蛋白，其中該RAGE多肽包含配位體結合位點； 及（c)使用指示。在一具體實例中，該配位體結合位點包含 該RAGE融合蛋白之最N-端域。 舉例而言，該RAGE融合蛋白可用於結合分析中以辨識 潛在性之RAGE配位體。在此種結合分析之一例示具體實 例中，其可以每孔約5微克之濃度，將一已知之RAGE配位 體塗覆於一固體受質上（如，Maxisorb盤），其中各孔各含 有約100微升（μΙ〇之總體積。可使該等試驗盤在4°C下隔夜 進行恆溫共置以容許該配位體進行吸收。或者，可使用較 高較短恆溫共置時間。在容許該配位體結合該受質之一段 時間後，可吸乾該等分析孔，並可加入阻斷缓衝液（如， 1% BSA於50 mM咪唑緩衝液中，pH 7.2)以阻斷非專一性 之結合。舉例而言，可在室溫下，將阻斷緩衝液加入該等 試驗盤中1小時。接著可吸乾該等試驗盤，及/或以清洗緩 118243.doc •48- 200806690 衝液對其進行清洗。在一具體實例中，可使用包含20 mM 咪唑、150 mM NaCn、0.05% Tween-20、5 mM CaCl2、及 5 mM MgCl2、pH 7.2之緩衝液作為清洗缓衝液。接著可將 漸增稀釋度之RAGE融合蛋白加入該等分析孔中。接著可 使該RAGE融合蛋白與該經固定之配位體在該分析孔中進 行恆溫共置，以使該結合達成平衡。在一具體實例中，其 係使該RAGE融合蛋白與該經固定之配位體在37°C下進行 約1小時之恆溫共置。在其他具體實例中，可使用較低溫 度下之較長恆温共置期。在對該RAGE融合蛋白與該經固 定之配位體進行恆溫共置後，可清洗該等試驗孔以除去任 何未連結之RAGE融合蛋白。可以各種不同之方式偵測連 結該經固定配位體之RAGE融合蛋白。在一具體實例中， 偵測係使用ELISA進行。因此，在一具體實例中，其可將 一含有單株小鼠抗人類IgGl、生物素化山羊抗小鼠IgG、 以及親和素連結性驗性填酸酶之免疫彳貞測複合物加入該固 定於分析孔中之RAGE融合蛋白中。使該免疫偵測複合物 結合該經固定之RAGE融合蛋白，以使經固定之RAGE融合 蛋白與該免疫偵測複合物間之結合達成平衡。舉例而言， 可使該複合物在室溫下結合該RAGE融合蛋白1小時。在此 時間點，可藉著以清洗緩衝液清洗該分析孔而除去任何未 連結之複合物。連結之複合物可藉著加入驗性填酸酶受質 對-硝基苯磷酸（PNPP)，並以405 nm吸收值之增加測量 PNPP至對-硝基酚（PNP)之轉化作用而偵測連結之複合物。 在一具體實例中，RAGE配位體係以納莫耳濃度（nM)至 118243.doc -49- 200806690 微莫耳濃度（μΜ)之親和力結合RAGE融合蛋白。其中一種 說明RAGE配位體與本發明RAGE融合蛋白之結合之實驗示 於圖7。製備分別具有1.082毫克/毫升及370微克/毫升起始 濃度之TTP-3000 (TT3)及 TTP-4000 (TT4)溶液。如圖 7所 示，在各種不同之稀釋度下，RAGE融合蛋白TTP-3 000及 TTP-4000可結合經固定之RAGE配位體β澱粉樣蛋白 (Abeta)(Amyloid Beta (1-40)取自 Biosouirce)、SlOOb (S100)、 及兩性蛋白（Ampho)，造成吸收值之增加。在無配位體存 在之情形下（亦即，僅以BSA進行塗覆），其中並無吸收值 之增加。 本發明之結合分析可用於定量與RAGE之配位體結合。 在其他具體實例中，RAGE配位體可以自0.1至1000納莫耳 濃度（nM)、或是自1至500 nM、或是自10至80 nM範圍之 親和力結合本發明之RAGE融合蛋白。 本發明之RAGE融合蛋白亦可用於辨識具有結合RAGE能 力之化合物。如圖8及9分別所示，可分析一 RAGE配位體 與經固定之β澱粉樣蛋白競爭結合TTP-4000 (TT4)或TTP-3000 (TT3) RAGE融合蛋白 之能力 。因此 ，可觀察到終分 析濃度（FAC)為10 μΜ之RAGE配位體可取代1:3、1:10、 1:30、及1:100濃度之起始TTP-4000溶液（圖8)或TTP-3000 (圖9)之RAGE融合蛋白與β澱粉樣蛋白之結合。 細胞效應劑之調節 本發明RAGE融合蛋白之具體實例可用於調節由RAGE中 介之生物反應。舉例而言，該等RAGE融合蛋白可經設計 118243.doc -50- 200806690 以調節RAGE誘發性之基因表現增加。因此，在一具體實 例中，本發明之RAGE融合蛋白可用於調節生物酶之功 能。舉例而言，RAGE及其配位體間之作用可產生氧化壓 力，並活化NF-κΒ以及NF-κΒ調控性基因，諸如，細胞因 子IL-Ιβ、TNF-α、及其類似者。此外，諸多其他調控途 徑，諸如涉及p21ras、MAP激酶、ERK1、及ERK2者，皆 已經顯示可由AGEs及其他配位體與RAGE之結合而活化。 使用本發明之RAGE融合蛋白以調節細胞效應劑TNF-a 表現之用途示於圖10。可在添加10% FBS之RPMI-1640培 養基中培養THP-1髓細胞，並經由以SlOOb激發RAGE而誘 發其分泌TNF-a。當此種激發作用係在RAGE融合蛋白之 存在下進行，由SlOOb與RAGE之結合所產生之TNF-a誘發 可獲得抑制。因此，如圖10所示，加入10微克之TTP-3000 (TT3)或 TTP-4000 (TT4) RAGE 融合蛋白可使 TNF-a 之 S 100b誘發作用降低約50%至75%。RAGE融合蛋白TTP-4000可至少如同sRAGE般而有效阻斷TNF-a之SlOOb誘發作 用（圖10)。TTP-4000及TTP-3 000之RAGE序列之抑制專一 性係由其中僅將IgG添加至經SlOOb激發之細胞中之實驗顯 示。在該分析中添加IgG及SlOOb可顯示與僅添加SlOOb者 相同之TNF-a含量。 RAGE融合蛋白之生理特徵 儘管sRAGE可具有調節RAGE中介性疾病之治療效益， 人類sRAGE作為獨立之療劑卻可根據SRAGE在血漿中之相 對較短半生期而具有限制。舉例而言，當鼠類sRAGE在正 118243.doc -51 - 200806690 常及糖尿病大鼠體内具有約20小時之半生期時，人類 sRAGE在以sRAGE之免疫反應性維持情形進行評估時卻僅 具有小於2小時之半生期（Ren ard et al.，K. Pharmacol. Εχρ. Ther·，290:1458-1466 (1999))。 為產生具有與sRAGE類似之結合特徵但卻具有更為穩定 之藥物動力學特性之RAGE療劑，可使用包含連結一或多 個人類免疫球蛋白域之RAGE配位體結合位點之rAGE融合 蛋白。如技藝中所知，該等免疫球蛋白域可包括免疫球蛋 白重鏈之Fc部分。 該免疫球蛋白之Fc部分可對一 RAGE融合蛋白產生數種 貝獻。舉例而言，該Fc融合蛋白可增加此等融合蛋白之血 清半生期，通常係自數個小時至數天。藥物動力學安定性 之增加則係由該Fc片段CH2及CH3區域間之連接子與FcRn 受體之作用造成（Wines et al” J· immun〇1，164:53 13 53 18 (2000)) 〇 儘管包含免疫球蛋白Fc多肽之融合蛋白可提供較高安定 性之優點’免疫球蛋白之融合蛋白可在引入宿主體内時激 發發炎反應。該發炎反應大部分可係由該融合蛋白之免疫 球蛋白Fc部分造成。如該目標係表現於必須予以排除之疾 病細胞類型上時(如，癌細胞、可造成自體免疫疾病之」 或—種群淋巴細胞），該促炎反應可為一欲取得之特徵。 如該目標係一可溶性之蛋白’該促炎反應可為一中性特 徵，因大部分之可溶性蛋白皆不會活化免疫球蛋白。然 而’如該目標係表現於其破壞將會導致負面副作用之細胞 118243.doc -52- 200806690 類型上時，該促炎反應即可為一負面特徵。同時，如一發 炎級聯會在融合蛋白結合組織目標之位點形成時，該促炎 反應可為一負面特徵，因諸多發炎反應之中介子皆係有害 於周圍組織及/或可造成系統性之效應者。 免疫球蛋白Fc片段之主要促炎位點係位於該Ch1及Ch2間 之鉸鏈區域。此一鉸鏈區域可與諸多白細胞上之FcRi-3作 用，並啟動此等細胞攻擊該目標（Wines et al，j immun〇1·， 164:53 13-53 18 (2000)) 〇 作為RAGE中介性疾病之療劑，RAGE融合蛋白可不須產 生發:k反應。因此，本發明RAGE融合蛋白之具體實例可 包含一種融合蛋白，其包含連結免疫球蛋白域2RAGE# 肽，其中已除去該取自免疫球蛋白之以鉸鏈區域並以一 RAGE多肽取代。藉由此種方式，可使該11八(}£融合蛋白與 炎性細胞上之Fc受體間之作用降至最低。然而，維持該 RAGE融合蛋白之諸等免疫球蛋白域間之適當堆積及其他 二維結構作用可係具有重要性者。因此，本發明rage融 合蛋白之具體實例可以分離RAGE之V及C1域之生物純性 但結構類似之RAGE域間連接子，或是分離rage之c 1及 C2域之連接子’取代該免疫球蛋白重鏈之正常鉸鏈區域。 因此’该RAGE融合蛋白之RAGE多肽可包含一天然可見於 RAGE免疫球蛋白域之下游之域間連接子序列，以形成一 RAGE免疫球蛋白域/連接子片段。藉由此種方式，其即可 維持由該RAGE或是該免疫球蛋白所提供之免疫球蛋白域 之間三維作用。 118243.doc -53 - 200806690 在一具體實例中，本發明之RAGE融合蛋白可包含相較 於sRAGE之藥物動力學安定性之顯著增加。舉例而言，圖 11顯示，一旦該RAGE融合蛋白TTP-4000已飽和其配位體 時，其可維持大於300小時之半生期。此種情形可顯著對 比sRAGE在人類血漿中僅為數小時之半生期。 因此，在一具體實例中，本發明之RAGE融合蛋白可用 於拮抗生理配位體與RAGE之結合以作為治療RAGE中介性 疾病之方法，同時並不會產生不可接受之發炎作用量。本 發明之RAGE融合蛋白可在產生促炎反應之方面具有相較 於IgG之顯著減少。舉例而言，如圖12所示，在其中可偵 測到人類IgG激發TNF-α釋出之條件下，該RAGE融合蛋白 TTP-4000並不會激發TNF-a自細胞釋出。 以RAGE融合蛋白之疾病治療 本發明亦可包含在人類對象體内治療RAGE中介性疾病 之方法。在一具體實例中，該方法可包含對一對象投藥一 RAGE融合蛋白，其包含連結一第二非RAGE多肽之包含 RAGE配位體結合位點之RAGE多肽。 在一具體實例中，本發明之RAGE融合蛋白可以各種不 同之途徑投藥。本發明RAGE融合蛋白之投藥可係使用腹 膜内（IP)之注射進行。或者，該RAGE融合蛋白可係以口 服、鼻内、或是以氣溶膠之形式進行投藥。在另一具體實 例中，投藥係經靜脈内（IV)進行。該RAGE融合蛋白亦可 由皮下注射。在另一具體實例中，該RAGE融合蛋白之投 藥係經動脈内進行。在另一具體實例中，投藥係經舌下進 118243.doc -54- 200806690 行。同時，投藥可使用長時釋放性膠囊進行。在又另一具 體實例中，投藥係經穿直腸之方式進行，諸如，以栓劑或 其類似者進行。舉例而言，皮下投藥可用於治療需要進行 自體投藥之慢性疾病。 諸多不同之動物模型已被用於驗證諸等可調控RAGE之 化合物作為療劑之用途。此等模型之實例如下： a) 在再狹窄之大鼠模型中，sRAGE可藉由抑制經由 RAGE之内皮、平滑肌、及巨噬細胞活化，在糖尿病 及正常大鼠體内，於動脈損傷之後，抑制新生血管内 皮之形成（Zhou et al·，Circulation 107:2238-2243 (2003))； b) 在系統性澱粉樣變性之小鼠模型中，使用sRAGE或抗 RAGE抗體之RAGE/配位體作用抑制可減少澱粉樣斑 之形成（Yan et al·，Nat. Med·，6:643_65 1 (2000))。伴 隨該澱粉樣斑之減少者係經治療動物體内之炎性細胞 因子間白素-6 (IL-6)及巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF)之減少，以及NF-κΒ之較低活化情形； c) 在AD之小鼠模型中，RAGE轉基因小鼠（RAGE過表現 者及RAGE顯性失活表現者）可抑制斑形成及認知缺陷 (Arancio et al.5 EMBO J.5 23:4096-4105 (2004))； d) 以sRAGE治療糖尿病大鼠可降低血管通透性 (Bonnardel-Phu et al.? Diabetes, 48:2052-2058 (1999))； e) 以sRAGE進行治療可在糖尿病性載脂蛋白E-裸鼠體内 減少動脈硬化病變，並預防db/db小鼠體内糖尿病性 118243.doc -55- 200806690 腎病之功能及形態指數（1111(18〇1161&1.，八]^11.3丨〇(：1^111· Biophys·，419:80-88 (2003));及 f) sRAGE可降低膠原誘發性關節炎之小鼠模型中 (Hofmann et al·，Genes Immunol·，3:123-135 (2002))、 實驗性過敏性腦脊髓炎之小鼠模型中（Yanetal·，Nat· Med.，9:28_293 (2003))、以及炎性腸疾之小鼠模型中 (Hofmann et al.，Cell，97:889-901 (1999))發炎情形之 嚴重性。 因此，在一具體實例中，本發明之RAGE融合蛋白可用 以治療糖尿病及/或衍生自糖尿病之併發症之由RAGE中介 之症狀。在其他具體實例中，該糖尿病或糖尿病後期併發 症之症狀可包含糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病、糖尿 病性腳潰瘍、糖尿病之心血管併發症、或是糖尿病性神經 疾病。 由於其最初係被辨識為一種其表現係與糖尿病之病理相 關之分子之受體，RAGE本身對於糖尿病併發症之病生理 學而言即具有重要性。在體内，RAGE與其配位體間作用 之抑制已在多種糖尿病併發症及發炎之模型中證實具有治 療性（Hudson et al·，Arch· Biochem. Biophys·，419:80-88 (2003))。舉例而言，以抗RAGE抗體進行兩個月之治療可 在糖尿病小鼠之體内使腎功能正常化，並降低異常之腎組 織病理（Flyvbjerg et al·，Diabetes，53:166-172 (2004))。同 時，可溶性形式RAGE (sRAGE)之治療（其可結合RAGE配 位體並抑制RAGE/配位體作用）可在糖尿病性載脂蛋白E-裸 118243.doc -56- 200806690 鼠體内減少動脈硬化病變，並降低db/db小鼠體内糖尿病 性腎病之功能及形態指數（Bucciarelli et al·，Circulation 106:2827-2835 (2002)) 〇 同時，咸已經證實，在腎衰竭中，於高血糖症以及其他 與系統或局部氧化壓力相關之病況存在下，最終可造成高 級糖化終末產物（AGEs)形成之巨分子非酶性糖化氧化作用 在發炎位點具有增強情形（Dyer etla·，J. Clin. Invest.， 91:2463-2469 (1993); Reddy et al.5 Biochem., 34:10872- 10878 (1995); Dyer et al.5 J· Biol·，Chem·，266:11654-11660 (1991); Degenhardt et al·，Cell Mol· Biol·，44:1139-1145 (1998))。血管系統中之AGEs累積可於局部產生，諸如可 見於罹患透析相關性澱粉樣變性之病患體内之由Α〇Ε-β2-微球蛋白構成之關節殿粉樣蛋白中（Miyata et al.，J. Clin.

Invest·，92:1243-1252 (1993); Miyata et al·，J. Clin· Invest·， 98:1088-1094 (1996))，或者，一般而言，如可由糖尿病患 之血管糸統及組織所例示者（S〇chmidt et al·，Nature Med.， 1:1002-1004 (1995))。糖尿病患體内隨時間而產生之ages 漸進性累積情形建議，内源性之清除機制並無法在age沈 積之位點有效作用。此等累積之AGEs具有可以諸多機制 改變細胞特性之能力。儘管rage在正常組織及血管系統 中係以低量表現，在其中該受體之配位體累積之環境中， 其已被證實RAGE會呈現正調節（Li et a丨，j Bi〇丨· chem·， 272:16498-16506 (1997); Li et al·，J· Biol. Chem.， 273:30870-30878 (1998); Tanaka et al·，j· Bi〇l· Chem·， 118243.doc -57- 200806690 275:25 781-25 790 (2000))。在糖尿病之血管系統中，RAGE 之表現會在内皮、平滑肌細胞、以及滲入性之單核呑嗤細胞 中增加。同時，細胞培養物之實驗已證實，AGE-RAGE作用 可造成對於血管體内穩態具有重要性之細胞特性變化。 在糖尿病相關性病理之治療中使用RAGE融合蛋白之用 途示於圖13。其在再狹窄之大鼠模型中評估RAGE融合蛋 白TTP-4000，其包括測量血管損傷後之平滑肌增殖及血管 内皮擴增。如圖13所示，TTP_4000之治療可在糖尿病相關 性之再狹窄中，以劑量反應性之方式，顯著降低血管内膜 /中膜（Ι/M)之比例（圖13Α ;表1)。同時，ΤΤΡ-4000之治療 可以劑量反應性之方式，顯著降低再狹窄相關性之血管平 滑肌細胞增殖。 表1 ΤΤΡ-4000於再狹窄之大鼠模型中之作用

IgG (n=9) TTP-4000 (n=9) 低劑量** (0.3 mg/動物qod x 4) TTP-4000 (n=9) 高劑量** (l.Omg/動物 qodx4) 管腔面積（mm2) 0.2 ± 0.03 0.18 士 0.04 0.16 ±0.02 中膜面積(mm2) 0.12 ±0.01 0.11 士 0.02 0.11 ±0.01 I/M比例 1.71 ±0.27 1.61 ±0.26 1.44* ±0.15 *?<0.05;**就高及低劑量兩者，使用311^/動物之初始劑量 在其他具體實例中，本發明之RAGE融合蛋白亦可用於 治療或逆轉澱粉樣變性及阿茲海默症。RAGE係β澱粉樣蛋 白（Αβ)以及其他澱粉樣蛋白生成性之蛋白包括saa及胰淀 素（amylin)之受體（Yan et al” Nature，382:685-691 (1996); Yan et al·，Proc· Natl. Acad· Sci·，USA，94:5296-5301 118243.doc -58- 200806690 (1997); Yan et al·，Nat· Med.，6:643-651 (2000); Sousa et al·，Lab Invest·，80:1101-1110 (2000))。同時，RAGE配位 體，包括AGEs、S 100b、及Αβ蛋白，可見於人類老化斑周 圍之組織中（Luth et al·，Cereb. Cortex 15:211-220 (2005); Petzold et al.5 Neurosci. Lett., 336:167-170 (2003); Sasaki et al.，Brain Res_，12:256_262 (2001); Yan et al.，Restor. Neurol· Neruosci·，12:167-173 (1998))。咸已經證實， RAGE可結合β-折疊纖維物質，不論其次單元之組成為何 (/5澱粉樣肽、胰淀素、血清澱粉樣蛋白A、朊病毒衍生 肽）（Yan et al·，Nature，382:685-691 (1996); Yan et al·，Nat. Med.，6:643-651 (2000))。此外，澱粉樣蛋白之沈積已經顯 示可造成增強之RAGE表現。舉例而言，在阿茲海默症 (AD)病患之腦中，於神經元及神經膠質有增加之RAGE表 現（Yan et al·，Nature，382:685-691 (1996))。在 RAGE配位 體表現之同時，RAGE在AD個體之海馬體中之星形細胞及 微膠質細胞中呈現正調節，但在不具有AD之個體體内則 無正調節之情形（Lou et al·，Exp· Neurol·，171:29-45 (2001))。此等發現建議，表現RAGE之細胞可在該老化斑 之附近經由RAGE/RAGE配位體之作用而活化。同時，在 體外，Αβ中介性之微膠質細胞活化可由導向對抗RAGE配 位體結合域之抗體阻斷（Yan et al·，Proc· Natl· Acad. Sci·， USA，94:5296-5301 (1997))。咸亦已經顯示，RAGE可作為 原纖維組合之灶點（Deane et al·，Nat. Med·，9:907-913 (2003)) 〇 118243.doc -59- 200806690 同時，使用sRAGE或抗RAGE抗體而對RAGE/配位體作 用所進行之體内抑制可在系統性殿粉樣變性之小鼠模型中 降低澱粉樣斑之形成（Yan et al.，Nat. Med.，6:643-651 (2000))。在神經元中過表現人類RAGE及具有瑞典及倫敦 突變之人類澱粉樣蛋白前體蛋白（APP)(突變體hAPP)之雙 重轉基因小鼠可較其經單一突變體hAPP轉機因之對手更 早發展出學習障礙及神經病理性之異常。相反的，因在相 同之突變體hAPP背景上表現一顯性失活形式之RAGE之神 經元而具有較低Αβ信號傳導能力之雙重轉基因小鼠則顯示 出相較於其經單一 ΑΡΡ轉機因之對手之延緩起始之神經病 理及學習異常（Arancio et al·，EMBO J·，23:4096-4105 (2004)) 〇 此外，RAGE-澱粉樣蛋白作用之抑制已經顯示可降低細 胞RAGE及細胞壓力標記物之表現（以及NF-κΒ之活化），並 可降低殿粉樣蛋白之沈積（Yan et al·，Nat· Med.，6:643-651 (2000))，因此建議RAGE-澱粉樣蛋白作用在富含澱粉樣蛋 白之環境中（甚至係在早期階段）擾動細胞特性以及在澱粉 樣蛋白之累積兩者中所扮演之角色。 因此，本發明之RAGE融合蛋白亦可用於治療降低澱粉 樣變性以及降低與阿茲海默症（AD)相關之澱粉樣斑及認知 失能。如上所數，sRAGE已經顯示可在AD之動物模型中 降低腦中之澱粉樣斑形成，並後續減少炎性標記物。圖 14A及14B顯示，具有AD並經TTP-4000或小鼠sRAGE治療3 個月之小鼠較接受載劑或人類IgG陰性控制組（IgGl)之動 118243.doc •60- 200806690 物具有較少之β澱粉樣蛋白（Αβ)斑以及較低之認知失能情 形。和sRAGE相似，ΤΤΡ-4000亦可減少與AD相關之炎性 細胞因子IL-1及TNF-α (數據未顯示）。 同時，本發明之RAGE融合蛋白亦可用於治療動脈硬化 及其他心血管疾病。因此，咸已經顯示，缺血性之心臟病 特別常見於糖尿病患體内（Robertson et al·，Lab. Invest.， 18:538-551 (1968); Kannel et al·，J. Am. Med. Assoc·， 241:2035-2038 (1979); Kannel et al·，Diab. Care” 2:120-126 (1979))。此外，研究已經顯示，糖尿病患體内之動脈 硬化係較並未罹患糠尿病之病患體内者更為迅速及大量發 生（參見，如，Waller et al·，Am. J· Med·，69:498-506 (1980); Crall et al.，Am. J. Med·，64:221-230 (1978); Hamby et al·，Chest， 2:251-257 (1976);及Pyorala et al·，Diab· Metab. Rev·，3:463-524 (1978))。儘管導致糖尿病環境中加速產生動脈硬化之原因 有許多，其已經顯示，AGEs之減少可減少斑形成。 舉例而言，本發明之RAGE融合蛋白亦可用於治療中 風。當在中風之疾病相關性動物模型中比較TTP-4000及 sRAGE時，發現TTP-4000可提供顯著較高之梗塞體積減少 情形。在此模型中，其對小鼠之中頸動脈進行接合接著進 行再灌流以形成梗塞。為評估RAGE融合蛋白治療或預防 中風之功效，其再即將進行再灌流前，以sRAGE或TTP-4000或控制組免疫球蛋白治療小鼠。如可見於表2中者， TTP-4000在限制此等動物體内之梗塞體積方面較sRAGE更 為有效，因而建議TTP-4000 (由於其較佳之血漿半生期）可 118243.doc -61 - 200806690 維持較sRAGE更大之保護作用。 表2 中風梗塞之降低情形 梗塞之減少％** sRAGE 15%* TTP-4000 (300 μ8) 38%* ΤΤΡ-4000 (300 μβ) 21%* TTP-4000 (300 μ8) 10%* IgG同種型控制組（300 μ§) 4% *顯著至Ρ<0.001;**相較於鹽水 在另一具體實例中，本發明之RAGE融合蛋白可用於治 療癌症。在一具體實例中’該可使用本發明RAGE融合蛋 白治療之癌症包含表現RAGE之癌細胞。舉例而言’可以 本發明之RAGE融合蛋白治療之癌症包括部分之肺癌、部 分之神經膠質瘤、部分之乳頭瘤、及其類似者。兩性蛋白 係一種高度流動第I類非組蛋白染色體DNA結合蛋白 (Rauvala et al·，J· Biol· Chem·，262:16625-16635 (1987);

Parkikinen et al., J. Bid. Chem.? 268:19726-19738 (1993)) ^ 其已經顯示可與RAGE作用。咸已經顯示’兩性蛋白可促 進軸突之向外生長’並可在溶纖系統（其已知亦可造成細 胞之流動性）中作為用於組合蛋白酶複合物之表面。此 外，已在一原發性腫瘤之模型（C6神經膠質瘤）路易斯 (Lewis)肺轉移模塑中（Taguchi et a1·，Nature 405:354_360 (2000))以及表現v-Ha-ras轉機因之小氣體内之自發性乳頭 瘤中（Lader et al·，P〇rc· Natl. Acad· Sci·，87:9178·9182 (1990))，觀察到由阻斷RAGE所造成之局部腫瘤生長抑制 118243.doc -62- 200806690 作用。 體實例中’本發明之ra_合蛋白可用於 二Γ他具體實例中，本發明之織歸合蛋白 關之發炎、與牛皮癖相：類風濕性關節炎相 Ρ 之發炎、與多重硬化相關之發 麵相關之發炎、與中風相關之發炎、與心臟病發 作^之發炎、與失錢休克相關之發炎、與敗金症相關 :火、與器官移植相關之發炎、與損傷性傷口復原相關 、或是與自體（如’自體免疫）或非自體（如，移植 性)細胞、組織、或器官之排斥相關之發炎。 舉例而言，在進行血栓溶解治療之後，諸如粒細胞之炎 性細胞會滲入該缺血組織中並產生氧自由基，其可摧毀較 該缺氧情形所殺傷者更多之細胞。以抗體或其他蛋白拮抗 y抑制4 f中性白細胞上負責使諸等嗜中性白細胞可侵入 該組織之受體已顯示可改善該反應。由於RAGE係此種嗜 中丨生白細胞叉體之一配位體，含有RAGE片段之RAGE融合 蛋白可作為一種誘餌，並預防該嗜中性白細胞輸運至該再 /瞿流位點’並因而預防進一步之組織破壞。rage在預防 發炎方面之角色可由顯示SRAGE可在糖尿病及正常大鼠體 内於動脈損傷之後抑制新生血管内皮擴增（推測係藉由抑 制經由RAGE之内皮、平滑肌細胞增殖、及巨噬細胞活化 而產生）之研究指明（Zhou et al·，Circulation 107:2238-2243 (2003))。此外，sRAGE可抑制諸等發炎模型，包括延遲型 之超敏性、實驗性之自體免疫腦炎、以及炎性腸疾 H8243.doc -63 - 200806690 (Hofman et al·，Cell，97:889-901 (1999))。 在一具體實例中，本發明之RAGE融合蛋白可用於治療 自體免疫基礎性疾病。舉例而言，在一具體實例中，本發 明之RAGE融合蛋白可用於治療腎衰竭。因此，本發明之 RAGE融合蛋白可用於治療系統性狼瘡腎炎或炎性狼瘡腎 炎。舉例而言，S 100/鈣粒蛋白已經顯示包含一家族之密 切相關性躬結合多肽，其特徵在於由一連結肽互相連結之 兩個 EF-手型區域（Schafer et al·，TIBS，21:134-140 (1996); Zimmer et al·，Brain Res. Bull” 37:417-429 (1995); Rammes et al.5 J. Biol., Chem., 272:9496-9502 (1997); Lugering et al.5 Eur. J. Clin. Invest·，25:659-664 (1995))。儘管其缺乏信號肽，咸早 已知道S 100/鈣粒蛋白可進入胞外間域，特別係在慢性免 疫/發炎反應之位點處，如在囊性纖維變性及類風濕性關 節炎之情形下。RAGE係S 100/鈣粒蛋白家族諸多成員之受 體，可中介其在諸如淋巴細胞及單核吞噬細胞之細胞上之 促炎作用。同時，在延遲型超敏反應、IL-10裸鼠體内之 結腸炎、膠原誘發性關節炎、以及實驗性之自體免疫腦炎 模型中所進行之研究建議，RAGE-配位體之作用（推測係 與S100/鈣粒蛋白之作用）在該炎性級聯中具有接近中心之 角色。 第I型糖尿病係一種自體免疫疾病，其可藉由本發明 RAGE融合蛋白之治療而預防或改善。舉例而言，咸已經 顯示，sRAGE可容許將脾細胞自非肥胖性糖尿病（NOD)小 鼠轉移至具有嚴重結合性免疫缺陷之NOD-小氣（NOD-scid 118243.doc •64- 200806690 小鼠）。NOD-scid小鼠並不會自動顯示糖尿病，其需要存 在可摧毀胰島細胞之免疫細胞始可誘發糖尿病。茲發現， 相較於並未經sR AGE治療之NOD-sc id受者，經sR AGE治療 之NOD-scid受者可展現較低之由轉移自糖尿病（N〇D)小鼠 之脾細胞所誘發之糖尿病起始情形（美國專利公開案 2002/0122799)。如此專利公開案之發明人所述，在此模型 中使用sR AGE之實驗結果係與諸如其中可產生未來之免疫 療法及胰島移植之臨床環境之人類疾病相關。 因此’在一具體實例中，本發明之rage融合蛋白可用 於治療與至少一種器官、組織、或多個細胞自第一位點至 第二位點之移植相關之發炎。該第一及第二位點可係在不 同之對象體内，或是在相同之對象體内。在其他具體實例 中，該等經移植之細胞、組織、或器官包含胰臟、皮膚、 肝臟、腎臟、心臟、肺、骨髓、血液、骨骼、肌肉、内皮 細胞、動脈、靜脈、軟骨、甲狀腺、神經系統、或幹細胞 之細胞。舉例而言，可使用本發明尺八(}]£融合蛋白之投藥 以協助將胰島細胞自第—非糖尿病對象移植至第二糖尿病 對象體内。 在另-具體實例中，本發明可提供—種治療骨f疏鬆症 之方法，其係藉著對一對象投藥治療有效量之本發明 田 a 蛋白而進行（Zh〇u et “，2〇3·1〇67_ 、〇80 (2006))。在一具體實例中，該治療骨質疏鬆症之方 法尚可包含增加該對象之骨密度或是減少該對象之骨密度 降低速率之步驟。 118243.doc •65- 200806690 因此，在各種選擇之具时射，本發明可提供一種抑 ^對象體内之遍糾細作用之方法，其係藉著對該 象技樂治療有效量之本發明RAG_合蛋白而進行。該 使用本發明之RAGE融合蛋白治療之對象可唯一動物。在 一具體實例中’該對象係人類。該對象可罹患細相關性 疾病，諸如，糖尿病、糖尿病併發症，諸如，腎病、神經 疾病、視網膜病、腳潰瘍、澱粉樣變性、《腎衰竭、以及 發炎。或者，該對象可為患有阿兹海默症之個體。在另一 具體實例中’該對象可為患有癌症之個體。在又另一具體 只例中，该對象可罹患系統性紅斑狼瘡或炎性狼瘡腎炎。 其他疾病亦可由rAGE中介，並因而可使用本發明之rage 融合蛋白治療。因此，在本發明其他之具體實例中，該 age融口蛋白可用於治療人類或動物對象體内之克隆氏 (Crohn)症、關節炎、血管炎、腎病、視網膜病、以及神經 疾病。在其他具體實例中，涉及自體免疫反應(如，自體 排斥)及非自體免疫反應(如，非自體排斥)兩者之發炎皆可 由RAGE中介’並因而可使用本發明之RAGE融合蛋白治 療0 ⑺療有效篁可包含能夠在一對象體内防止RAGE與AGE 或其他類型内源性RAGE配位體之作用之量。因此，該量 將S P通著欲冶療之對象而變化。該化合物之投藥可以每小 時一次、每天一次、每週一次、每月一次、每年一次、或 疋以單一事件之形式進行。在各種其他具體實例中，該 RAGE ^合蛋白之有效量可自約1納克/公斤體重至約100毫 118243.doc -66 - 200806690 克/公斤體重不等，或是自約10微克/公斤體重至約50毫克/ 公斤體重不等，或是自約100微克/公斤體重至約20毫克/公 斤體重。實際之有效量可使用技藝之標準方法而由劑量/ 反應刀析建立（Johnson et al·，Diabetes，42:1179, (1993)) 〇 因此’如技藝中所知，該有效量可取決於該化合物之生物 可獲性、生物活性、及生物可降解性。 組合物 本發明可包含一種組合物，其包含本發明之RAGE融合 蛋白混合醫藥可接受之載體。該RAGE融合蛋白可包含連 結一弟一非RAGE多肤之RAGE多肤。在一具體實例中，該 RAGE融合蛋白可包含RAge配位體結合位點。在一具體實 例中，該配位體結合位點包含該RAGE融合蛋白之最N-端 域。該RAGE配位體結合位點可包含RAGE之V域，或是其 部分。在一具體實例中，該RAGE配位體結合位點包含序 列編號NO: 9或與其至少90%相同之序列，或是序列編號NO: 10或與其至少90%相同之序列，或是序列編號NO: 47或與其 至少90%相同之序列。 在另一具體實例中，該配位體結合位點可包含序列編號 NO: 1之胺基酸22-51。在另一具體實例中，該RAGE配位體 結合位點可包含序列編號NO: 1之胺基酸23-5 1。在另一具 體實例中，該RAGE配位體結合位點可包含序列編號NO: 1 之胺基酸31-51。在另一具體實例中，該RAGE配位體結合 位點可包含序列編號N0: 1之胺基酸3 1 -116。 在一具體實例中，該RAGE多肽可連結包含一免疫球蛋 118243.doc •67- 200806690 白域或一免疫球蛋白域之部分（如，其片段）之多肽。在一 具體實例中，該包含一免疫球蛋白域之RAGE多肽包含人 類IgG之CH2或CH3域中至少一者之至少一部分。 該RAGE蛋白或多肽可包含全長人類RAGE (如，序列編 號NO: 1)，或是人類RAGE之片段。在一具體實例中，該 RAGE多肽並不包括任何信號序列殘基。RAGE之信號序列 可包含全長RAGE (序列編號NO: 1)之殘基1-22或是殘基1-23。在其他具體實例中，該RAGE多肽可包含與人類RAGE 或其片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、 97%、98%、或99%相同之序列。舉例而言，在一具體實 例中，該RAGE多肽可包含人類RAGE，或其片段，其中係 以甘胺酸而非甲硫胺酸作為其第一殘基（參見，如， Neeper et al·，（1992))。或者，該人類RAGE可包含其中除 去信號序列之全長RAGE (如，序列編號NO: 2或序列編號 ΝΟ:3)(圖1Α及1Β)，或是該胺基酸序列之部分。 本發明之RAGE融合蛋白亦可包含sRAGE (如，序列編 號NO: 4)、與sRAGE至少90%相同之多肽、或是sRAGE之片 段。舉例而言，該RAGE多肽可包含人類sRAGE，或其片 段，其中係以甘胺酸而非甲硫胺酸作為其第一殘基（參 見，如，Neeper et al·，（1992))。或者，該人類RAGE多肽 可包含其中除去信號序列之sRAGE (參見，如，圖1C中之 序列編號NO: 5或序列編號NO: 6，或是圖1 6A中之序列編號 NO: 45)，或是該胺基酸序列之部分。在其他具體實例中， 該RAGE蛋白可包含一 V域（參見，如，圖1D中之序列編號 118243.doc -68- 200806690 NO: 7或序列編號NO: 8，或是圖16A中之序列編號NO: 46)。 或者，可使用與該V域至少90%相同之序列或其片段。或 者，該RAGE蛋白可包含一 RAGE片段，其包含V域之部分 (參見，如，圖1D中之序列編號Να 9或序列編號NO: 10，或 是圖16 Α中之序列編號NO: 47)。在一具體實例中，該配位 體結合位點可包含序列編號NO: 9或與其至少90%相同之序 列，或是序列編號NO: 10或與其至少90%相同之序列，或是 序列編號NO: 47或與其至少90%相同之序列。在又另一具體 實例中，該RAGE片段係一合成肽。 舉例而言，該RAGE多肽可包含人類RAGE之胺基酸23-116 (序列編號NO: 7)或與其至少90%相同之序列，或是人類 RAGE之胺基酸24-116 (序列編號ΝΟ:8)或與其至少90%相同 之序列，或是其中Q24環化以形成ρΕ之人類RAGE之胺基 酸24-116 (序列編號NO: 46)或與其至少90%相同之序列，對 應於該RAGE V域。或者，該RAGE多肽可包含人類RAGE 之胺基酸124-22 1 (序列編號NO: 11)或與其至少90%相同之 序列，對應於該RAGE C1域。在另一具體實例中，該 RAGE多肽可包含人類RAGE之胺基酸227-3 17 (序列編號 NO: 12)或與其至少90%相同之序列，對應於該RAGE C2 域。或者，該RAGE多肽可包含人類RAGE之胺基酸23-123 (序列編號NO: 13)或與其至少90%相同之序列，或是人類 RAGE之胺基酸24-123 (序列編號NO: 14)或與其至少90%相 同之序列，對應於該RAGE V域以及一下游之域間連接 子。或者，該RAGE多肽可包含其中Q24環化以形成ρΕ之 118243.doc -69- 200806690 人類RAGE之胺基酸24-123 (序列編號NO: 48)或與其至少 90%相同之序列。或者，該RAGE多肽可包含人類RAGE之 胺基酸23-226 (序列編號NO: 17)或與其至少90%相同之序 列，或是人類RAGE之胺基酸24-226 (序列編號NO: 18)或與 其至少90%相同之序列，對應於該V域、該C1域、以及連 結此兩域之域間連接子。或者，該RAGE多肽可包含其中 Q24環化以形成pE之人類RAGE之胺基酸24-226 (序列編號 NO: 50)或與其至少90%相同之序列。或者，該RAGE多肽可 包含人類RAGE之胺基酸23-339 (序列編號NO: 5)或與其至 少90%相同之序列，或是人類RAGE之24-339 (序列編號 NO: 6)或與其至少90%相同之序列，對應於sRAGE (亦即， 編碼該V、C1、及C2域以及域間連接子）。或者，該RAGE 多肽可包含其中Q24環化以形成pE之人類RAGE之胺基酸 24-339 (序列編號NO: 45)或與其至少90%相同之序列。或 者，可使用各個此等序列之片段。 該RAGE融合蛋白可包括並非衍生自RAGE或其片段之數 種類型之肽。該RAGE融合蛋白之第二多肽可包含衍生自 免疫球蛋白之多肽。該重鏈（或其部分）可衍生自任何一種 已知之重鏈同種型：IgG (γ)、IgM (μ)、IgD (δ)、IgE (ε)、 或IgA (α)。此外，該重鏈（或其部分）可衍生自任何一種已 知之重鏈亞型：IgGl (γΐ)、IgG2 (γ2)、IgG3 (γ3)、IgG4 (γ4)、IgAl (αΐ)、IgA2 (α2)、或是此等同種型或亞型之改 變其生物活性之突變體。該第二多肽可包含人類IgG之Ch2 及Ch3域或是此等域之一或二者之部分。作為一例示具體 118243.doc -70- 200806690 實例，該包含人類IgG之CH2及CH3域或是其部分之多肽可 包含序列編號NO: 38或序列編號NO: 40。該免疫球蛋白肽 可由序列編號NO: 39或序列編號NO: 41之核酸序列編碼。 序列編號NO: 38或序列編號NO: 40中之免疫球蛋白序列亦 可由序列編號NO: 52或序列編號NO: 53編碼。 免疫球蛋白鏈之Fc部分可在體内具有促炎性。因此，在 一具體實例中，本發明之RAGE融合蛋白包含一衍生自 RAGE之域間連接子而非衍生自免疫球蛋白之域間鉸鏈多 肽。 因此，在一具體實例中，該RAGE融合蛋白可包含直接 連結包含免疫球蛋白CH2域或其片段之多肽之RAGE多肽。 在一具體實例中，該CH2域或其片段包含序列編號NO: 42。 在一具體實例中，該序列編號NO: 42之片段包含其中除去 前1 〇個胺基酸之序列編號NO: 42。 在一具體實例中，該RAGE多肽可包含連結一 RAGE免疫 球蛋白域之一 RAGE域間連接子，其係使該RAGE免疫球蛋 白域之C-端胺基酸連結該域間連接子之^端胺基酸，並使 該RAGE域間連接子之c_端胺基酸直接連結一包含免疫球 蛋白CH2域或其片段之多肽之^端胺基酸。該包含免疫球 蛋白Ch2域或其部分之多肽可包含人類IgG之CH2及CH3域 或是此等域之一或二者之部分。作為一例示具體實例，該 包含人類IgG之CH2及CH3域或是其部分之多肽可包含序列 編號NO: 38或序列編號no: 4〇。 本發明之RAGE融合蛋白可包含取自RAGE之單一或多重 118243.doc 200806690 域。同時，該包含連結一 RAGE多肽域之域間連接子之 RAGE多肽可包含全長RAGE蛋白之片段。舉例而言，在一 具體實例中，該RAGE融合蛋白可包含兩個衍生自RAGE蛋 白之免疫球蛋白域以及兩個衍生自人類Fc多肽之免疫球蛋 白域。該RAGE融合蛋白可包含連結第二RAGE免疫球蛋白 域及第二RAGE域間連接子之第一 RAGE免疫球蛋白域及第 一RAGE域間連接子，其係使該第一域間連接子之N-端胺 基酸連結該第一RAGE免疫球蛋白域之C-端胺基酸、該第 二RAGE免疫球蛋白域之N-端胺基酸連結該第一域間連接 子之C-端胺基酸、該第二域間連接子之N-端胺基酸連結該 第二RAGE免疫球蛋白域之C-端胺基酸、且該第二RAGE域 間連接子之C-端胺基酸直接連結該包含CH2免疫球蛋白域 或其片段之多肽之N-端胺基酸。舉例而言，該RAGE多肽 可包含人類RAGE之胺基酸23-25 1 (序列編號NO: 19)或與其 至少90%相同之序列，或是人類RAGE之胺基酸24-25 1 (序 列編號NO: 20)或與其至少90%相同之序列，或是其中Q24環 化以形成pE之人類RAGE之胺基酸24-251(序列編號NO: 51) 或與其至少90%相同之序列，對應於該V域、該Cl域、連 結此兩域之域間連接子、以及一位於C1下游之第二域間連 接子。在一具體實例中，包含序列編號NO: 30或其片段之 核酸建構物可編碼四域之RAGE融合蛋白。在另一具體實 例中，包含序列編號NO: 54之核酸建構物可編碼四域之 RAGE融合蛋白，其中加入針對編碼位於該序列C-端之脯 胺酸（CCG至CCC)及甘胺酸（GGT至GGG)之密碼子所進行 118243.doc -72- 200806690 之沈默鹼基變化以移除一個接近該末端密碼子之隱蔽RN A 剪接位點。 或者，三域之RAGE融合蛋白可包含一個衍生自RAGE之 免疫球蛋白域以及兩個衍生自人類Fc多肽之免疫球蛋白 域。舉例而言，該RAGE融合蛋白可包含經由一 RAGE域間 連接子而連結該包含CH2免疫球蛋白域或其片段之多肽之 N-端胺基酸之單一 RAGE免疫球蛋白域。舉例而言，該 RAGE多肽可包含人類RAGE之胺基酸23-136 (序列編號NO: 15)或與其至少90%相同之序列，或是人類RAGE之胺基酸 24-136 (序列編號NO: 16)或與其至少90%相同之序列，或是 其中Q24環化以形成pE之人類RAGE之胺基酸24-136 (序列 編號NO: 49)或與其至少90%相同之序列，對應於該RAGE V 域以及一下游之域間連接子。在一具體實例中，包含序列 編號NO: 31或其片段之核酸建構物可編碼三域之RAGE融合 蛋白。在另一具體實例中，包含序列編號NO: 55之核酸建 構物可編碼三域之RAGE融合蛋白，其中針對編碼位於該 序列C-端之脯胺酸（CCG至CCC)及甘胺酸（GGT至GGG)之 密碼子所進行之沈默鹼基變化可移除一個接近該末端密碼 子之隱蔽RNA剪接位點。 RAGE域間連接子片段可包含一天然位於RAGE免疫球蛋 白域之下游，並因而與其連結之肽序列。舉例而言，就 RAGE V域而言，該域間連接子可包含天然位於該V域下游 之胺基酸序列。在一具體實例中，該連接子可包含序列編 號NO: 21，對應於全長RAGE之胺基酸117-123。或者，該 118243.doc -73- 200806690 連接子可包含具有天然RAGE序列其他部分之肽。舉例而 言’可使用包含位於序列編號N〇: 21之上游及下游之數個 胺基酸（如，1·3個、丨^個、或^0個、或卜15個胺基酸）之 域間連接子。因此，在一具體實例中，該連接子包含序列 編號NO: 23，其包含全長raGE之胺基酸117-136。或者， 可使用自該連接子之任一端除去，例如，1、2、或3個胺 基酸之序列編號NO: 21之片段。在其他具體實例中，該連 接子可包含與序列編號NO: 21或序列編號NO: 23為至少 70%相同、或8〇〇/0相同、或9〇%相同之序列。 就RAGE C1域而言，該連接子可包含天然位於該c丨域下 游之肽序列。在一具體實例中，該連接子可包含序列編號 NO: 22，對應於全長rage之胺基酸222-251。或者，該連 接子可包含具有天然RAGE序列其他部分之肽。舉例而 言’可使用包含位於序列編號NO: 22之上游及下游之數個 胺基酸（1·3個、1-5個、或1-1〇個、或1-15個胺基酸）之連接 子。或者，可使用自該連接子之任一端除去，例如，1_3 個、1 -5個、或1 -1 〇個、或1 _ 1 5個胺基酸之序列編號Ν〇: 22 之片段。舉例而言，在一具體實例中，RAGE域間連接子 可包含序列編號NO: 24，對應於胺基酸222-226。或者，域 間連接子可包含序列編號NO: 44，對應於RAGE胺基酸 318-342 ° 醫藥可接受之載體可包含技藝中已知之任何標準醫藥可 接受性載體。在一具體實例中，該醫藥可接受之載體可為 一液體，且該RAGE融合蛋白或核酸建構物可以溶液之形 118243.doc -74- 200806690 式存在。在另一具體實例中 固體，以粉末、；東乾於太了接又之载體可為一 W Μ ^ , 叔末、或叙劑之形式存在。或者，兮 西樂可接受之載體可Α 及考，孩 體杏❹ 為一科、栓劑、或乳霜。在a他且 體“列中’該載體可包含脂質體、 二他具 但不限於::：。因此，辭囊醫藥可接受性載體涵括， 醢^/ 準之醫藥可接受性載體，諸如，水、 私、酸緩衝鹽溶液、糖類(如 乳_如，油/水乳液或甘油· 劑、錠劑、包衣鍵劑、及膠囊。 各種類型之渥潤 本：明RAGE融合蛋白之投藥可使用各種途 :進树❹細融合蛋白之投藥可係使用腹臈内（ιρ)之注 日‘仃或者，该RAGE融合蛋白可係以口服、鼻内、或 疋以氣溶膠之形式進行投藥。在另一具體實例中，投華係 ，靜脈内mo進行。該RAGE融合蛋白亦可由皮下注射; 具體實例中，該RAGE融合蛋白之投藥係經動脈内 仃。在另-具體實例中’投藥係經舌下進行。同時，投 *樂可使用長時釋放性膠囊進行。在又另一具體實例中，投 藥係經牙直腸之方式進行，諸如’以拴劑或其類似者進 行。舉例而言’皮下投藥可用於治療需要進行自體投藥之 慢性疾病。 該等醫藥組合物可係以無毒性腸外可接受性之溶劑或載 劑中之無菌可注射性溶液形式存在。可予使用之可接受性 載劑及溶劑係如水、林袼氏（Ringer)溶液、3_丁二醇、等 張性氯化鈉溶液、或是水性緩衝液，例如，生理可接受之 118243.doc •75· 200806690 柃棣酸、醋酸、甘胺酸、組胺酸、磷酸、tris、或琥珀酸 緩衝液。該可注射性溶液可含有安定劑，以保護其不會產 生化學性之降解或是凝聚物之形成。安定劑可包括抗氧化 劑，諸如，丁基化羥基茴香醚（BHA)、以及丁基化羥基甲 苯（BHT)、緩衝劑（檸檬酸、甘胺酸、組胺酸）、或界面活 (聚山離@予酯80、泊洛沙姆（p〇1〇xamers))。該溶液亦可 含有抗微生物性防腐劑，諸如，苯曱醇及對羥基苯甲酸。 该溶液亦可含有界面活性劑以減少凝聚，諸如，聚山離醇 酉180、泊洛沙姆、或其他技藝中已知之界面活性劑。該溶 液亦可含有其他添加劑，諸如糖類或鹽水，以將該組合物 之滲透壓調整為類似人類血液。 ^西藥組合物可係為無菌凍乾粉末之形式而在以稀釋 劑重構時用於注射。該稀釋劑可為注射用水、注射用之抑 水、或是無8鹽水。該;東乾粉末可係藉由冷純燥該 =蛋白之命液以產生乾燥形式之該蛋白而製備。如技藝 中所知，經凍乾之蛋白一山 ^ ^ , 叙而s較該蛋白之液體溶液具有 立曰加之安定性以及較長车 七r 之^木♦命。該凍乾粉末（餅）可含 有緩衝劑以調整其pH，例如， 酸、甘胺酸、組胺酸、抑.接R檸檬酸、醋 ♦ S夂、tnS、或琥珀酸緩衝劑。該 束乾粉末亦可含有凍齡枉％十丨 ^ 性mm , 維持其物理及化學安定 糖、甘露糖醇、或海萍糖糖類及二糖，諸如，蔬 保護其不會產生化學東乾粉末可含有安定劑，以 可包括，但不限於，卜是凝聚物之形成。安定劑 、乳化劑（bha、贿）、緩衝劑（檸檬 H8243.d( -76· 200806690 酸、甘胺酸、組胺酸）、痞只；、、去w w )次界面活性劑（聚山離醇酯80、泊 洛沙姆）。該束乾粉末亦可含有抗微生物性防腐劑， 如’苯甲醇及對經基苯甲酸，乾粉末亦可含有界面活 性劑以減少凝聚’諸如，聚山離醇醋8〇及泊洛沙姆。該康 乾粉末亦可含有添加劑（如，糖類或鹽水）以在重構該粉末 時將其渗透壓調整為類似人類▲液。該束乾粉末亦可含有 增量劑，諸如，糖類及二糖。 該等用於注射之醫藥組合物亦可以油性懸浮液之形式存 在。此種懸浮液可使用如上所述之適當分散或澄潤劑以及 懸浮劑，根據已知之方法而進行調配。此外，無菌之經固 化油類可便利作為溶劑或懸浮基質。就此目的而言，可利 用使用合成性之甘油單或二酯之任何固化油類混合物。同 時，油性懸浮液可藉著使該活性成分懸浮於蔬菜油（例 如，花生油、橄欖油、芝麻油、或椰子油）或礦物油（諸 士 液I、石蠛）中而進行調配。舉例而言，脂肪酸，諸 如，油酸，亦可用於製備可注射物。該等油性懸浮液可含 有增稠劑，例如，蜂蠟、硬石蠟、或鯨蠟醇。此等組合物 可藉由添加抗氧化劑（諸如，抗壞血酸）而進行防腐。 本發明之醫藥組合物亦可係以水溶油乳液或水性懸浮液 之形式存在。該油相可為蔬菜油（例如，撖欖油或花生 ’由）’或是礦物油（例如，液體石蠟），或是其混合物。適當 之礼化劑可為天然存在之膠體（例如，阿拉伯膠或黃蓍 膠）、天然存在之磷脂（例如，黃豆卵磷脂）、以及衍生自脂 肪酸及己醣醇酐之酯及部分酯（例如，山梨醇酐單油酸 118243.doc -77- 200806690 酯）、以及該等部分酯與環氧乙烷之縮合產物（例如，聚氧 乙烯山梨醇酐）。 水性懸浮液亦可含有混合賦形劑之活性化合物。此等賦 形劑可包括懸浮劑，例如，羧曱基纖維素鈉、黃蓍膠、及 阿拉伯膠；分散或溼潤劑，諸如，天然存在之磷脂，諸 如’印-脂’或是環氧院與脂肪酸之縮合產物，例如，聚 氧乙烯硬脂酸s旨’或是環氧乙焼與長鏈脂族醇之縮合產 物，例如’十七乙烯氧基鯨蠟醇，或是環氧乙烷與衍生自 脂肪酸及己畴醇之部分酉旨之縮合產物，諸如，聚氧乙稀山 梨醇單油酸醋，或是或是環氧乙院與衍生自脂肪酸及己畴 醇肝之部分醋之縮合產物，諸如，聚氧乙婦山梨醇酐單油 酸酉旨。 適用於藉由加人水而製備水性懸浮液之分散性粉末及顆 粒可提供混合分㈣、料劑、以及―或多種防腐劑之活 性化合物。適當之防腐劑、分散劑、及懸浮劑係如上所 述。 β等組合物亦可係為栓劑之形式以用於進行本發明化合 物之直腸投藥。此等組合物可藉由混合該藥物與適當之非 刺：性賦形劑而製備，該賦形劑在常溫下係固H，但在直 皿度下為液體’且其因此將會在直腸中融化而是出該藥 二適當之材料包括可可脂及聚乙二醇，舉例而言。 就局部# _ . 用而㊁，可使用含有本發明化合物之乳霜、油 用、疑膠、溶液、式縣、心 这人、、 次芯、，于液。局部之應用亦.可包括漱口液 及δ漱液。可择用说$

、®之防腐劑、抗氧化劑（諸如，BHA 118243.doc -78- 200806690 及BHT)、分散劑、界面活性劑、或緩衝劑。 本發明之化合物亦可以脂質體傳遞系統之形式進行ρ 藥，諸如，小單層載劑、大單層載劑、及多層載劑。脂= 體可自各種不同之磷脂形成’諸如’ _固醇、硬脂胺、或 磷脂醯膽鹼。 在部分具體實例中，本發明之化合物可經修飾以進一步 延遲其由代謝性之酶自循環系統中清除。在一具體實例 中，該等化合物可藉由水可溶性聚合物之共價連附而修 飾，諸如，聚乙二醇（PEG)、PEG及聚丙二醇之共聚物、 聚乙烯吡咯啶酮或聚脯胺酸、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚 乙烯醇、及其類似者。此等修飾亦可增加該化合物於水性 溶液中之溶解度。可將聚合物（諸如’ pEG)共價連附於一 或多個反應性胺基、録、錢基上。諸多活化形式之 PEG皆已獲得敘述，包括錢之活㈣旨或碳酸衍生物，特 別係其中該等離去基係N_羥基琥珀醯亞胺、對-硝基酚、 味唑、或1-羥基-2-硝基苯_3砜者（以進行與胺基之反應）， 多模式或齒乙醯基衍生物（以進行與巯基之反應），以及胺 基胼或醯肼衍生物（以進行與碳水化合物基團之反應）。 其他可用於本發明融合蛋白之蛋白調配物之製備方法述 於美國專利第6,267,958及5,567,677號。 在本發明之另一範疇中，本發明之rage融合蛋白可用 於佐劑治療或是與其他已知之療劑一同用於結合治療之 中。下列者係可結合本發明之raqe融合蛋白調控劑而使 用之佐劑及其他療劑之非盡列性表列·· 118243.doc -79- 200806690 抗癌劑之藥學分類： 1 ·烷化劑：環磷醯胺、硝脲、碳鉑、順鉑、丙卡巴胼 (procarbazine) 2 ·抗體：博來黴素（bleomycin)、柔紅黴素（daunorubicin)、 阿黴素（doxorubicin) 3. 抗代謝物：胺曱喋呤、阿糖胞苷（cytarabine)、氟尿 口密唆、硫。坐σ票呤（azathioprine)、6-魏基嗓呤、以及 胞毒性之癌症化療劑 4. 植物生物鹼：長春花鹼、長春新鹼、依托泊：y： (etoposide )、太平洋紫杉醇 5. 激素：他莫昔芬（tamoxifen)、酷酸奥曲肽（octreotide acetate)、非那雄胺（finasteride)、氟他胺（flutamide) 6. 生物反應修飾劑：干擾素、間白素 類風濕性關節炎治療之藥學分類 1. 止痛劑：阿斯匹靈 2. NSAIDs (非類固醇性抗炎藥物）：布洛芬（ibuprofen)、 莕普生（naproxen)、雙氣芬酸（diclofenac) 3. DMARDs (疾病修飾性抗風濕藥物）：胺甲嗓呤、金 製備物、經基氯奎寧（hydroxychloroquine)、柳氮磺 外匕口定（sulfasalazine) 4· 生物反應修飾劑，DMARDs :依那西普（etanercept)、 英利昔單抗（infliximab)、糖皮質激素，諸如，倍氣 米松（beclomethasone)、甲基強的松（methylprednisolone)、 倍他米松（betamethasone)、潑尼松（prednisone)、地 118243.doc -80- 200806690 塞米松（dexamethasone)、及氫化可的松（hydrocortisone) 糖尿病治療之藥學分類 1. 磺醯尿素：甲苯磺丁（tolbutamide)、妥拉磺脲 (tolazamide)、格列本脲(glyburide)、格列 p比嗪（glipizide) 2. 雙脈類：甲福明（metformin) 3. 各種口服劑·阿卡波糖(acarbose)、曲格列酮(troglitazone) 4. 胰島素 阿茲海默症治療之藥學分類 1·膽驗自旨酶抑制劑：塔克寧（tacrine)、多奈喊齊（donepezil) 2·抗精神病藥物：氟旅咬醇（haloperidol)、硫利達嗪 (thioridazine) 3·抗憂鬱劑：去曱丙味嗪（desipramine)、氟西汀 (fluoxetine)、曲唾酮（traz〇d〇ne)、帕羅西、;丁（paroxetine) 4.抗癲癇劑：卡馬西平（carbamazepine)、丙戊酸（valproic acid) 在一具體實例中，本發明之組合物可包含治療有效量之 RAGE融合蛋白結合單一或多種其他療劑。除前文所述之 試劑外，下列之療劑亦可結合本發明之RAGE融合蛋白使 用：免疫抑制劑，諸如，環胞黴素、他克莫司 (tacrolimus)、雷帕黴素（rapamyCin)、以及其他FK_5〇6 類型 之免疫抑制劑。 在一具體實例中，本發明因此提供一種治療RAGE中介 性疾病之方法，該方法包含對需要治療之病患投藥治療有 效量之RAGE融合蛋白結合諸等療劑，該等療劑係選自烷 118243.doc -81 - 200806690 化劑、抗代謝物、植物生物鹼、抗生素、激素、生物反應 修飾劑、止痛劑、NSAIDs、NMARDs、生物反應修飾劑 (如’糖皮質激素）、磺醯尿素、雙胍類、胰島素、膽鹼酯 酶抑制劑、抗精神病藥物、抗憂鬱劑、抗癲癇劑、及免疫 抑制劑（諸如，環胞黴素、他克莫司（tacr〇lirnus)、雷帕黴 素（rapamycin)、以及其他FK_5〇6類型之免疫抑制劑）。在 另一具體實例中’本發明提供如上所述之本發明醫藥組合 物’其尚包含一或多種療劑，選自烷化劑、抗代謝物、植 物生物鹼、抗生素、激素、生物反應修飾劑、止痛劑、 NSAIDs、NMARDs、生物反應修飾劑（如，糖皮質激素）、 石頁醯尿素、雙胍類、胰島素、膽鹼酯酶抑制劑、抗精神病 藥物、抗憂鬱劑、抗癲癇劑、及免疫抑制劑（諸如，環胞 黴素、他克莫司（taCr〇limus)、雷帕黴素（rapamycin)、以及 其他FK-506類型之免疫抑制劑）。 實例 在下列之實例中進一步說明由本發明所涵蓋之發明概念 之特徵及優點。 實例1A : RAGE融合蛋白之製備 建構兩種質體以表現RAGE-IgG融合蛋白。該兩質體皆 係藉由接合不同長度之取自人類RAGE之5, cDNA序列與取 自人類IgGl (γΐ)之相同3’ cDNA序列而建構。接著將此等 表現序列（亦即’接合產物）插入pcDNA31表現載體 (InWtrogen，CA)中。編碼該尺^^^融合蛋白編碼區域之核 酸序列示於圖2及3。就TTP-4〇〇〇 RAGE融合蛋白而言，自 118243.doc -82- 200806690 1至753之核酸序列（以粗體字強調）係編碼該rage n_端蛋 白序列，而自754至1386之核酸序列則係編碼該IgG蛋白序 列（圖2)。就TTP-3000而言，自1至4〇8之核酸序列（以粗體 字強調）係編碼該RAGE N-端蛋白序列，而自4〇9至1〇41之 核酸序列則係編碼該IgG蛋白序列（圖3)。 為產生該等RAGE融合蛋白，將該等包含序列編號^^以3〇 或序列編號NO·· 31核酸序列之表現載體穩定轉染至ch〇細 胞中。以由該質體所產生之新黴素抗性選擇陽性轉形株並 進行選殖。對由上清液之西方點潰分析偵測出之高生產性 純系進行擴增，再使用A蛋白管柱進行親和層析而純化該 基因產物。對表現進行最適化，以使該等細胞可以約每升 13克之含量生產重組TTP-4000。 實例IB : RAGE融合蛋白之製備 建構一種質體以表現RAGE-IgG融合蛋白。該質體係藉 由接合取自人類RAGE之5’ cDNA序列與取自人類IgG (γΐ) 之3’ cDNA序列而建構。使用PCR以擴增該cDNA。同時， 在該5’端，該PCR引子加入了 一個選殖用之Eco RI限制酶 位點以及一段Kozak共有轉譯起始序列。在該3,端，該PCR 引子於該末端密碼子之後加入了一個Xho I限制位點。在 該3’端，該PCR引子亦納入了兩個沈默鹼基變化以在該免 疫球蛋白部分中移除一個接近該末端密碼子之隱蔽RNA剪 接位點。編碼脯胺酸之密碼子（殘基409，根據序列編號NO: 32中蛋白序列之編號）自CCG變為CCC，而編碼甘胺酸之密 碼子（殘基410，根據序列編號NO: 32中蛋白序列之編號）則 118243.doc • 83 - 200806690 自GGT變為GGG。以Eco RI及Xho I對該PCR片段進行酶切 消化，接著將其插入一個已經Mfe I酶切消化（以形成可與 Eco RI相容之末端）並經Xho I酶切消化之逆轉錄載體質體 (pCNS-newMCS-WPRE (new ori)，可自 Gala，Inc·取得）。 對該經選殖質體之插入部分以及選殖接界進行定序，以確 保選殖過程中並未產生任何突變。 為產生該RAGE融合蛋白，將該包含序列編號NO: 54核酸 序列之表現載體穩定轉染至CHO細胞中。 以各種定性實驗，確認由該等經轉染細胞所表現之分離 性RAGE融合蛋白TTP-4000之序列係序列編號NO: 34或序列 編號NO: 56，或是序列編號NO: 34及序列編號NO: 56兩者。因 此，由序列編號NO: 32之前23個胺基酸所編碼之信號序列 已經切除，而該N-端殘基則係麵醯胺（Q)或是焦麩胺酸 (pE)或是其混合物。定性實驗亦顯示N2&N288 (根據序列 編號NO: 34或序列編號NO: 56之編號）處之糠基化位點，並顯 示該RAGE融合蛋白CH3區域之C-端殘基可能經由其在此種 重組系統中表現時所受到之轉譯後修飾作用而受到切除。 實例2:用以試驗RAGE-IgGl融合蛋白活性之方法 A.體外配位體結合： 以每孔5微克之濃度，將已知之RAGE配位體塗覆於 Maxisorb盤之表面。使該等試驗盤在4°c下隔夜進行恒溫 共置。在進行配位體恆溫共置後，吸乾該等試驗盤’並在 室溫下，於該等試驗盤中加入阻斷緩衝液（1% BS A於50 mM咪唑緩衝液中，pH 7·2) 1小時。接著吸乾該等試驗 118243.doc -84· 200806690 盤，及/或以清洗緩衝液對其進行清洗（20 mM咪唑、150 mM NaCl、0.05% Tween-20、5 mM CaCl2、及 5 mM MC12，pH 7.2)。製備起始濃度1·〇82毫克/毫升之TTP-3000 (TT3)溶液及起始濃度370微克/毫升之TTP-4000 (TT4)溶 液。在該初始樣本中加入漸增稀釋度之RAGE融合蛋白。 使該RAGE融合蛋白與該經固定之配位體在37°C下進行1小 時之恒溫共置，接著清洗該試驗盤，並分析該RAGE融合 蛋白之結合。結合係藉由加入含有單株小鼠抗人類IgG 1 (1··1 1，000稀釋至21納克/毫升之終分析濃度（FAC))、生物 素化山羊抗小鼠IgG (1:500稀釋至500納克/毫升之FAC)、 以及親和素連結性鹼性磷酸酶之免疫偵測複合物而進行偵 測。使該免疫"ί貞測複合物結合該經固定之RAGE融合蛋白 在室溫下進行恆溫共置1小時，接著清洗該試驗盤，並加 入鹼性磷酸酶受質對-硝基苯磷酸（PNPP)。該複合物與該 經固定RAGE融合蛋白之結合係藉由測量PNPP至對-硝基 酚（PNP)之轉化作用（其係在405 nm以分光光度計測量）而進 行定量。 如圖7所示，在各種不同之稀釋度下，RAGE融合蛋白 TTP-4000 (TT4)及 TTP-3000 (TT3)可與已知之RAGE 配位體 β殿粉樣蛋白（Abeta)、SlOOb (S100)、及兩性蛋白（Ampho) 進行專一性之作用。在無配位體存在之情形下（亦即，僅 以BSA進行塗覆）(BSA或BAS +清洗），其中並無高於由該免 疫偵測複合物之非專一性結合所造成含量之吸收值增加情 形。在使用β澱粉樣蛋白作為經標記配位體時，其可能必 118243.doc -85- 200806690 須在該分析之前對該β澱粉樣蛋白進行預共置。預共置可 使該β澱粉樣蛋白自體凝聚成為折疊片之形式，因β澱粉樣 蛋白較佳係以折疊片之形式結合RAGE。 有關RAGE融合蛋白TT-4000及TTP-3 000與RAGE配位體 間之專一性作用之其他證據可在顯示RAGE配位體可與已 知之RAGE配位體有效競爭結合該等RAGE融合蛋白之研究 中例示。在此等研究中，其係將β澱粉樣蛋白（Α-β)固定於 Maxisorb盤上，並如上所述加入RAGE融合蛋白。此外， 亦再加入該RAGE融合蛋白之同時，在部分之孔中加入 RAGE配位體。 茲發現，當TTP-4000係以123微克/毫升存在時（1:3稀 釋，圖8)，該RAGE配位體可阻斷約25%至30%之TTP-4000 (TT4)結合。當TTP-4000之起始溶液係以10或30之係數稀 釋時（1:10或1:30)，該RAGE融合蛋白與該經固定配位體之 結合可由該RAGE配位體競爭抑制。類似的，當TTP-3000 係以360微克/毫升存在時（1:3稀釋，圖9)，該RAGE配位體 可阻斷約50%之TTP-3000 (TT3)結合。當TTP-3000之起始 溶液係以10之係數稀釋時（1:10)，該RAGE融合蛋白與該經 固定配位體之結合可由該RAGE配位體競爭抑制。因此， RAGE融合蛋白與RAGE配位體間之結合專一性係劑量相關 性者。同時，如圖8及9所示，在無RAGE融合蛋白存在之 情形下，亦即，僅使用該免疫偵測複合物（”僅含複合物”）， 其基本上並未偵測到結合。 B· RAGE融合蛋白於細胞基礎性分析中之作用 118243.doc -86- 200806690 先前之研究已顯示，骨髓ΤΗΡ-1細胞可反應RAGE配位 體而分泌TNF-α。在此分析中，其使用由ATCC所提供之流 程，於添加10% FBS之RPMI-1640培養基中，培養THP-1細 胞。在無及有RAGE融合蛋白TTP-3000 (TT3)或TTP-4000 (TT4)(10微克）、sRAGE (10微克）、及人類IgG (10微克）（亦 即，作為陰性控制組）存在之情形下，以〇 · 1毫克/毫升之 SlOOb刺激RAGE，以誘發細胞分泌TNF-α。在將該等蛋白 添加至細胞培養物中24小時後，使用市售可取得之TNF-a ELISA套組（R&D Systems，Minneapolis，MN)，測量由該等 THP-1細胞所分泌之TNF-α量。圖10所示之結果說明，該 等RAGE融合蛋白可抑制此等細胞中之S100b/RAGE-誘發 性TNF-a生成。如圖10所示，在加入10微克之TTP-3000或 TTP-4000 RAGE融合蛋白時，S100B (0.1毫克/毫升FAC)之 TNF-a誘發可分別減少約45°/。至70%。RAGE融合蛋白TTP-4000可至少如同sRAGE般而有效阻斷TNF-a之SlOOb誘發作 用（圖10)。TTP-4000及TTP-3 000之RAGE序列之抑制專一 性係由其中僅將IgG添加至經SlOOb激發之細胞中之實驗顯 示。在該分析中添加IgG及SlOOb可顯示與僅添加SlOOb者 相同之TNF-a含量。TTP-4000及TTP-3000之RAGE融合蛋 白之RAGE序列對於TNF-a誘發之抑制專一性係由其中僅 將IgG添加至經SlOOb激發之細胞中之實驗顯示。茲發現， 在該分析中添加IgG (亦即，無RAGE序列之人類IgG (Sigma人類IgG，10微克/毫升添加）以及SlOOb可顯示與僅 添加SlOOb者相同之TNF-α含量。 118243.doc -87- 200806690 實例3 ·· ΤΤΡ-4〇00之藥物動力學特性 為測疋ΤΤΡ-4000是否具有優於人類sRAGE之較佳藥物動 力车特性，對大鼠及非人類之靈長類給予之靜脈 内（IV) ’主射（5宅克/宅升），接著評估灰漿中之ττρ_4⑽〇存 在。在此等實驗中，使兩隻天然公猴於外周靜脈中接受 ΤΤΡ-4000之單一IV劑團（5毫克/毫升/公斤），接著接受約 1.0¾升（mL)之鹽水沖洗。在投劑前（亦即，注射ττρ_4〇〇〇 之前）或是在投劑後之0.083、0.25、0.5、2、4、8、12、 24 、 48 、 72 、 96 、 120 、 168 、 240 、 288 、及336小時，將 血液樣本（約1·〇毫升）收集至含有（肝素鋰）之管中。在進行 收集後，將該等管置於溼冰上（最長3〇分鐘），直到在冰櫃 中（於2至8°C下）以1500 X g進行離心15分鐘。接著冷凍貯 存（_70°C±10°C)各個取得之血漿樣本，直到於不同之注射 後時間點，如實例6所述，使用ELISA進行RAGE多肽之分 析。 圖11所述之動力學特性顯示，一旦TTP-4000已飽和其配 位體時（如由該兩動物體内相當陡峭之α相所證明），其可 維持大於300小時之終末半生期。此一半生期顯著大於人 類sRAGE在血漿中之半生期（一般而言係約2小時），並可提 供一種以其作為急性及半慢性病徵之單一注射物之機會。 在圖11中’各個曲線係代表在相同實驗條件下之不同動 物。 實例4 : TTP_4〇〇〇之Fe活化作用 進行實驗以測量由RAGE融合蛋白TTP-4000相較於人類 118243.doc -88 - 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IgG所產生之Fc受體活化作用。Fc受體活化作用係藉由測 Ϊ表現Fc受體之THP-1細胞之TNF - α分泌而測量。在此等 實驗中，以10微克/孔之TTP-4000或人類IgG塗覆一 96孔試 驗盤。Fc之激發可造成TNF-α之分泌。TNF-α之量係以酶 連免疫吸附分析（ELISA)測量。 因此，以此方式，根據ATCC之指示，使該髓細胞系 THP-1 (ATCC # TIB-202)維持在添加1〇%胎牛血清之RPMI-1640培養基中。一般而言，其係藉著以1〇微克/孔之經熱 凝聚（63°C，30分鐘）之TTP-4000或人類IgG預塗覆該試驗 孔而經由Fc受體之激發以誘發每孔40,000-80,000個細胞分 泌TNF-a。由該等THP-1細胞所分泌之TNF-a量係使用市售 可取得之TNF ELISA套組（R&D Systems，Minneapolis，MN # DTA00C)，根據其指示，在取自經處理試驗孔中之24小 時細胞培養物之上清液中測量。 諸等結果示於圖12中，其中可見，TTP-4000可產生小於 2納克/孔之TNF，而IgG則可產生大於40納克/孔。 實例5 : TTP-4000之體内活性 在數種人類疾病之體内模型中，比較丁丁？-4000與设八(^ 之活性。 A·血管再狹窄模型中之TTP-4000 在血管再狹窄之糖尿病大鼠模型中評估rage融合蛋白 TTP-4000，其係在血管損傷21天後測量平滑肌之增殖以及 血管内膜之擴增。在此等實驗中，使用標準之流程，在 Zucker糖尿病及非糖尿病小鼠之左側頸總動脈中進行氣球 118243.doc -89 - 200806690 扣傷。在進行損傷前i天，由腹膜内（ιρ)投藥起始劑量（3毫 克Μ鼠）之IgG、TTP-4000、或鱗酸緩衝鹽水（pBS)。在進 行損傷後’每隔-天給予—次維持劑量直天為止（亦 :，損傷後之第卜3、5、及7天）。該維持劑量係高劑 直-1¾克/小鼠（第一組）或低劑量=〇 3毫克/小鼠（第二組卜 為測量血管平滑肌細胞（VSMC)之增殖，在損傷後之第4及 2 1天犧牲動物。 為測里、、、田胞増殖’使第4天之動物在進行安樂死前以、 12、及2小時，接受50毫克/公斤溴脫氧尿苷（BrdU)之腹膜 内注射。在進行犧牲之後，收集完整之左及右頸動脈。在 進行匕埋釗，將樣本貯存於Hist〇ch〇ice中至少24小時。 VSMC增殖之評估係使用小鼠抗Brdu單株抗體進行。加入 一螢光標記性山羊抗小鼠次級抗體。由兩位不知該治療療 程之觀察員，對各個切片中之份仍陽性細胞核進行計數。 在第21天犧牲剩餘之大鼠以進行形態分析。形態分析係 由位不知δ亥研究組之觀察員，使用電腦化之數位顯微側 面軟體Image-Pro Plus於系列切片上進行（5瓜瓜間隔），頸 動脈係由Van Giescm染色。所有之數據皆係以平均值±sd 之形式表示。使用SPSS軟體進行統計分析。使用非配對t 試驗比較連續性之變數。將p值別·〇5視為具有統計顯著 性。 如圖13A及13B所示，TTp_4〇〇〇i治療可以劑量反應性 之方式，顯著降低血管内膜/中膜之比例以及血管平滑肌 、、、田胞之增殖。在圖13B中，該y軸代表Brdu增殖細胞之數 118243.doc -90- 200806690 目。 Β· AD動物模型中之TTP4000 在AD之小鼠模型中進行實驗以評估ττρ_4〇〇〇是否可影 響澱粉樣蛋白之形成以及認知失能。該等實驗係使用在 PDGF-B鏈啟動子之控制下表現人類瑞典突變體澱粉樣蛋 白前體蛋白（ΑΡΡ)之轉基因小鼠而進行。在一段時間之 後，此等小鼠可產生高含量之RAGE配位體^澱粉樣蛋白 (Αβ)。先前，3個月之sRAGE治療已顯示可在此模型中減 少腦中之澱粉樣斑形成及相關之炎性標記物增加情形。 藉著將人類APP基因（具有瑞典及倫敦突變）微注射至受 到血小板衍生性生長因子B (PDGF_B)鏈基因啟動子控制之 小鼠卵中，設計用於此一實驗中之App小鼠（雄性）。該等 小鼠係在C57BL/6背景下產生，並由編咖血几⑽㈣如， Inc·研發。該等動物係經隨意餵食，並以兄妹近親交配維 持。自此建構物所產生之小鼠自6個月齡起發展出殿粉樣 蛋白沈積。至該等動物6個月齡後，繼續維持9〇天再犧牲 進行澱粉樣蛋白定量。 在自6個月齡起始，每隔一天對該App轉基因小鼠進行 一次載劑或TTP4000之投藥[qod (Lp )]共持續卯天。在該 實驗之終，犧牲該等動物，並檢驗腦中之八0負擔（亦即， 斑之數目）。使用一6個月齡之控制組App組以測定澱粉樣 蛋白沈積之基線。此外，在該實驗之終，對該等動物進行 行為（Morris水迷宮）分析。研究員係不知該等試驗化合Z 者。對該等小鼠給予〇·25毫升/小鼠/每隔一天之樣本。此 118243.doc -91 - 200806690 外，對一組小鼠給予200微克/天之sRAGE。 1. β澱粉樣蛋白沈積 為進行組織學之檢驗，以戊巴比妥鈉（5 0毫克/公斤）之腹 膜内注射（IP)痲痒動物。以4°C之磷酸緩衝鹽水（PBS)對該 等動物進行穿心灌流，接著以4%三聚甲醛進行。切除 腦，並將其隔夜置於4%三聚甲醛中。對該等腦進行石蠟 處理，並進行包埋。取得10片通過該腦之30微米厚度系列 切片。在4°C下，對該等切片進行初級抗體處理（Αβ肽抗 體），以偵測該等轉基因動物腦中之澱粉樣蛋白沈積（Guo et al·，J. Neurosci·，22:5 900-5909 (2002))。以 Tris緩衝鹽水 (TBS)清洗該等切片，再加入次級抗體並在室溫下進行1小 時之怪溫共置。在清洗後，如Vector ABC Elite套組（Vector Laboratories)中之指示對該等切片進行共置，並以二胺基 苯甲酸（DAB)進行染色。在水中中止反應，並在以二甲苯 處理之後蓋上蓋玻片。使用由裝備Quick Capture影像擷取 卡之Power Macintosh電腦、裝在Olympus顯微鏡及相機架 上之Hitachi CCD相機構成之電腦輔助性影像分析系統， 判定各切片中之澱粉樣蛋白區域。使用NIH影像分析軟體 V. 155。捕捉該等影像，並計算該10片切片中之總澱粉樣 蛋白區域。以一位不明該處理狀態之操作員進行所有測 量。總計該等切片之澱粉樣蛋白體積，並除以總切片數 目’以計鼻該殿粉樣蛋白體積。 就定量分析而言，其係使用酶連免疫吸附分析 (ELISA)，測量 APP 轉基因小鼠（Biosource International， 118243.doc •92- 200806690

Camadllo，CA)腦中 曰、 < 人類總體Αβ (Apt()tal)及Apb42之含 里以鹽酸脈自小鼠® $ — 卒取 APt〇tal 及Αβ 1-42 J 並如該製造 商所述進行定量。此 禮分析可自腦中萃取總體Αβ肽（可溶 性及凝聚性兩者）。 2.認知功食色 進行Morns水迷宮試驗：在該實驗之終，在Mwris 水迷宮試驗中試驗所有小鼠一次。在12米之㈣水迷宮 中训、束小氣。在該水池中注入3〇公分深知水，並維持在U ^將°亥逃脫平台00平方公分）置於水面下1公分處。在該 等式驗之過私巾，將該平台自該池中移出。在周圍以白色 幕簾圍繞以隱藏任何迷宮外線索之池中進行該線索試驗。 對二斤有之動物進行連續三天之非空間性預訓練（猜）。此 等4驗係肖以預傷該等動物而進行終行為試驗，以判定其 發現該平台之記憶存留情形。此等試驗並未予以記錄，其 僅係因為訓練之目#而進行。在該等訓練及學習實驗時， 除去忒等幕簾以提供迷宮外線索（如此可辨識具有游泳障 礙之動物）。在第！天，將該等小鼠置於該隱藏之平台上2〇 秒（試驗1)，而在試驗2_3時，將該等動物於距離該線索平 台或隱藏平台（試驗4) 1〇公分處釋放至水中，並允許其游 至該平台上。在試驗之第二天，在該池之中心及各四分圓 之中心之間隨機移動該隱藏平台。將該等動物釋放至池 中，隨機面向池壁，並給予其6〇秒以到達該平台（3次試 驗）。在第二試驗中，對該等動物給予三次試驗，兩次係 以隱藏平台進行，一次係以線索平台進行。在進行Nsp後 Π 8243.doc -93- 200806690 兩天，對該等動物進行終行為試驗（Morris水迷宮試驗）。 就此等試驗（每隻動物各3次），將該平台置於該池之一個四 刀圓之中心，再以隨機方式將該等動物面向池壁而釋放。 讓該動物發現該平台或游泳60秒（潛伏期，其用以發現該 平口所消耗之時間）。所有動物皆係在投劑4_6小時内進行 4驗，並係由一位不知該試驗組之操作員隨機選擇進行試 驗。 該等結果係以平均值±標準差（SD)之形式表示。使用^式 驗分析該澱粉樣蛋白及行為試驗中之差異顯著性。比較該 6個月齡之APP控制組與該等經TTP_4〇〇〇處理之動物，亦 比車父该9個月齡之ΑΡΡ載劑處理組與該等經ττρ-4000處理 之動物。將低於0 _ 〇 5之差異視為具有顯著性。藉由取用各 組中數據之總和，並除以該比較組者，以判定澱粉樣蛋白 及行為之變化百分比（亦即，1，i.p./6個月齡之控制組=0/〇 變化）。 圖14A及14B顯示’以TTP-4000或小鼠sraGE治療3個月 之小鼠較經載劑以及經陰性控制組人類IgGl (igGl)處理之 動物具有較少之Αβ斑及較低之認知失能情形此種數據指 出，ΤΡΡ-4000可在轉基因小鼠之模型中有效降低ad之病 理。茲亦發現，和sRAGE相似，TTP-4000亦可降低炎性細 胞因子IL-1及TNF-ct (數據未顯示）。 C· TTP-4000在中風動物模型中之功效 亦在中風之疾病相關性動物模型中比較TTP-4000及 sRAGE。在此模型中，其對小鼠之中頸動脈進行接合1小 118243.doc -94- 200806690 時，接著進行23小時之再灌流，再在該時間點犧牲小鼠， 亚評估其腦中之梗塞情形。再即將進行再灌流前，以 sRAGE或丁TP-4000或控制組免疫球蛋白治療小鼠。 在此等實驗中，以250微升/小鼠之載劑或是ττρ試驗物 (250微升 /小鼠之 ΤΤΡ-3000、τΤΡ-4000)注射雄性 C57bl/6 小鼠。小鼠係在缺血起始1小時後由腹膜内接受注射。對 小鼠進行1小時之腦缺血，再進行24小時之再灌流。為誘 發缺血，麻醉各小氣，並以外部之加溫而使其體溫維持在 36-37 °C。經由頸部之中線切開而暴露左側頸總動脈 (CCA)。在該頸内動脈（iCA)之起點周圍放置一微手術夾。 以絲線接合該ECA之遠端，並進行橫切。在該eca之斷處 周圍鬆散綁上6-0號絲線。將經火焰磨光之尼龍縫線尖端 溫和置入該ECA斷處。在該斷處周圍綁緊該6_〇號絲線之 % ’再使β尼遽縫線進一步深入並通過該頸内動脈 (ICA) ’直到其停滞在前大腦動脈，因而封閉前大腦交通 動脈及中大腦動脈。在置入該尼龍縫線1小時後，再次麻 醉該動物，記錄直腸溫度，再除去該縫線，並閉合該切 ν 〇 以戊巴比妥鈉（50毫克/公斤）之腹膜内注射痲痺動物，接 著切除腦’以測定梗塞體積。接著將該等腦通過該梗塞區 域切片成為4片2-mm之切片，再將其置於2%之氣化三苯四 氮唑（TTC)中30分鐘。之後，將該等切片隔夜置於4〇/0之三 聚甲醛中。使用由裝備Quick Capture影像擷取卡之Power Macintosh電腦、裝在〇iympUS顯微鏡及相機架上之Hitachi 118243.doc -95- 200806690 判定各切片中 155。捕捉該等影 以一位不明該處理 CCD相機構成之電腦輔助性影像分析系統 之梗塞區域。使用NIH影像分析軟體v. i 像’並計异該等切片中之總梗塞區域。 狀態之操作員進行所有測量、總計該等切片之梗塞體積， 以計算該總梗塞體積。該等結果係以平均值±標準差（sd) 之形式表示。使用t試驗分析該梗塞體積數據中之差異顯 著性。 如表2之數據所示，TTP_4000在限制此等動物體内之梗 塞體積方面較sRAGE更為有效，因而建議ττρ_4〇〇〇 (由於 其較佳之血漿半生期）可在此等小鼠體内維持更大之保護 作用。 實例6:以ELISA偵測RAGE融合蛋白 一開始，經由隔夜之恆溫共置，使50微升濃度為1〇微克/毫 升於IX PBS pH 7.3中之RAGE專一性單株抗體1；[^1〇11塗 覆於試驗盤上。在可予使用時，以3 〇〇微升之1X咪嗤_ Tween清洗緩衝液清洗試驗盤3次，並以1% bSA進行阻 斷。加入該等樣本（經稀釋）以及已知TTP-4000稀釋液之標 準稀釋液置100微升之終體積。使該等樣本在室溫下進行 恆溫共置1小時。在進行共置後，清洗該等試驗盤三次。 加入含1% BSA之1XPBS中之山羊抗人類IgGl 1 (Sigma A3312) AP綴合物，並使其在室溫下進行恆溫共置1小時。 清洗該等試驗盤三次。以對硝基苯磷酸進行顯色。 實例7 : RAGE配位體與RAGE融合蛋白之結合之定量 圖15顯示TTP-4000與各種不同之經固定已知RAGE配位 118243.doc -96- 200806690 體之飽和結合曲線。將該等配位體固定於為滴定盤上，並 在自0至360 nM漸增濃度之RAGE融合蛋白存在下進行恆溫 共置。使用對於該融合嵌合物之IgG部分具有專一性之鹼 性磷酸酶綴合性多株抗體，偵測該RAGE融合蛋白-配位體 作用。使用Graphpad Prizm軟體計算相對Kd值，並與 RAGE-RAGE配位體既經建立之文獻值進行比對。HMG1B =兩性蛋白，CML=魏甲基離胺酸，A beta=0澱粉樣蛋白1-40 ° 實例8 :使用RAGE融合蛋白以預防過敏性移植排斥 RAGE之阻斷預期可阻斷過敏性移植排斥。此等實驗係 探究使用本發明之RAGE融合蛋白而對配位體-RAGE作用 進行阻斷是否可降低已自健康供者移植至糖尿病動物體内 之胰島細胞之排斥反應，由經移植動物維持低於目標濃度 之血糖含量之時間長度測量。如本文所論，茲發現，在移 植之兩種（同種異基因性及同基因性）動物模型中，在已接 受胰島細胞移植之糖尿病動物體内投藥RAGE融合蛋白 (如，TTP-4000)可顯著延緩高血糖症之復發，並因而延緩 經移植胰島細胞之排斥作用。 A.小鼠體内之異基因性胰島移植 第一組之實驗係試驗RAGE融合蛋白（TTP-4000)之投藥 是否可在糖尿病之C57BL/6J (B6)小鼠模型中，調控經移植 胰島細胞之異基因性排斥以及糖尿病之復發。 糖尿病動物模型 以200毫克/公斤鏈脲佐菌素（STZ)(Sigma Chemical Co·， 118243.doc -97- 200806690

St· Louis，MO)之單一靜脈内注射，使C57BL/6J (6-8週齡） (B6)小鼠成為糖尿病性者。以BALB/cJ (6-8週齡）（BALB) 小鼠作為供者以進行胰島移植，因而提供胰島移植之異體 錯配。 胰島分離 以氯胺酮HC1/二曱苯胺p塞嗪HC1溶液（Sigma，St. Louis， MO)麻醉小鼠（BALB/c)。在經胰腺導管内注射含有1.5毫克/ 毫升膠原酶P (Roche Diagnostics，Branchburg，NJ)之 3毫升 冰漢克氏（Hank)平衡鹽溶液（HBSS，Gibco，Grand Island NY)後，以手術取得胰腺，並在37°C下進行消化20分鐘。 以HBSS清洗胰島，再使用具有四種不同密度（26%、 23%、20%、及 11%)之 Polysucrose 400 (Cellgro，Herndon VA)進行非連續性梯度離心而進行純化。收集位於20%及 23%層界面之組織片段，清洗，再使其再懸浮於HBSS中。 在倒立式光學顯微鏡下，以人工摘取部含連附之腺泡、血 管、及導管組織之個別胰島，因而產生經高度純化之胰島 以進行移植。 胰島移植 在診斷出具有糖尿病之2天内，使鏈脲佐菌素誘發性糖 尿病C57BL/6 (B6)小鼠接受胰島移植物。以BALB/cJ (6-8 週齡）（BALB)小鼠作為供者以進行異基因性胰島移植。為 進行移植，以一輸注組撿取由供者小鼠取得之500-600個 新鮮分離之胰島（亦即，約550胰島當量），並將其移植至受 者右腎之囊下空間。 118243.doc 98 - 200806690 以試驗化合物進行治療 一旦移植胰島後立即投藥試驗化合物；投藥持續約60 天，根據控制組動物之進食情形而定。根據下列之療程， 對小鼠注射0.25毫升之磷酸緩衝鹽水（PBS)、PBS中之TTP-4000、或是PBS中之IgG (表3)。 表3 試驗化合物及/或載劑之投藥

試驗組 小鼠數目 初始劑量 維持劑量 療程 未經處理 控制組 8 控制組 載劑(PBS) 8 0.25 ml/劑/小鼠 於第1天 0.25 ml/劑/小鼠 自第2天起始 每隔1天1次 (QOD) X 60 天；IP IgG 8 (300 0.25 ml/劑/小鼠 於第1天 (100 0.25 ml/劑/小鼠 自第2天起始 (1〇〇 μΒ) 每隔1天1次 (QOD) X 60 天；IP TTP-4000 8 (3〇〇 μ§) 0.25 ml/劑/小鼠 於第1天 (100 μΕ) 0.25 ml/劑/小鼠 自第2天起始 (1〇〇 μΒ) 每隔1天1次 (QOD)x60 天；1Ρ TTP-4000 8 (3〇〇 μ%) 0.25 ml/劑/小鼠 於第1天 (3〇 0.25 ml/劑/小鼠 自第2天起始 (3〇 Kg) 每隔1天1次 (QOD) X 60 天；IP 胰島移植物功能之監測 以胰島移植後最初2週之每日系列血糖測量值以及其後 每隔一天之測量值而監測胰島移植物之功能。糖尿病之逆 轉係以血糖含量低於200 mg/dl之兩連續測量值而定義。當 兩連續測量值之血糖含量超過250 mg/dl時即判定為移植物 喪失。該等結果不於表4。 118243.doc -99- 200806690 表4 TTP-4000對於同種異體移植胰島移植之作用* ΤΤΡ-4000 300 pg LD + 100 pg qod ip (、组 1) PBS (組2) ΤΤΡ-4000 300 pg+ 30 pg qod ip (組3) IgG 300 pg LD + 100 pg qod ip (組4) 未經處理 控制組 14 9 13 8 9 16 8 14 9 8 13 10 12 10 9 13 8 12 8 10 12 11 11 8 9 16 8 11 8 8 15 8 8 9 11 14 8 8 11 9 7 9 8 9 平均 值 14.125 8.75 11.125 8.875 8.833333 SD 1.457738 1.164965 2.167124 1.125992 1.029857 η 8 8 8 8 12 數值反應各動物移植物喪失之天數，如由增高血糖含量之復發而定義 針對BALB/c胰島於Β6小鼠體内之同種異體移植排斥投 藥ΤΤΡ-4000之作用係在圖21中以卡普蘭梅爾（Kaplan-Meier)累積存活圖顯示。其中可見，相對於完全未經治療 之動物（控制組）或是以載劑（PBS)或（人類IgGl)治療之動 物，以TTP-4000治療之動物（組1及3)在偵測到移植物衰竭 前之時間方面有增加之情形。使用各種統計分析（“&1^61-Cox Logrank, Breslow-Gehan-Wilcoxon; Tarone-Ware5 Peto-Peto-Wilcoxin;及Harring-Fleming)，該控制組與TTP-4000 (組1及3)間之差異具有顯著性（表5)。 118243.doc -100 - 200806690 表5 統計方法 控制組vs組1(TTP4000) 控制組vs組3 (TTP4000) Chi-平方 DF* P-值 Chi-平方 DF P-值 Logrank (Mantel-Cox) 18.777 1 <0.0001 7.662 1 0.0056 Breslow-Gehan-Wilcoxon 15.092 1 0.0001 4.904 1 0.0268 Tarone-Ware 16.830 1 <0.0001 6.212 1 0.0127 Peto-Peto-Wilcoxon 14.359 1 0.0002 4.315 1 0.0378 Harrington-Fleming (rho = 0.5) 16.830 1 <0.0001 6.212 1 0.0127 自由度 Β·作為自體免疫疾病模型之NOD-小鼠醴内之胰島移植 第二組之實驗係試驗RAGE融合蛋白（亦即，TTP-4000或 TTP-3000)之投藥是否可調控NOD小鼠體内復發糖尿病之 進程（使用同基因性NOD移植模型）。 糖尿病動物模型 以自動性自體免疫非肥胖性糖尿病小鼠（NOD/LtJ) (12-25週齡）作為胰島細胞之受者，同時以幼前糖尿病性 NOD/LtJ小鼠（6-7週齡）小鼠作為同源性胰島移植之供者。 用以進行移植之胰島係如上文章節A (異基因性胰島移植） 所述而分離。 胰島移植 在診斷出具有糖尿病之2天内，使糖尿病NOD/LtJ小鼠接 受胰島移植物。以一輸注組撿取由供者小鼠取得之500-600個新鮮分離之胰島（亦即，約550胰島當量），並將其移 植至右腎之囊下空間。 以試驗化合物進行治療 一旦移植胰島後立即投藥試驗化合物，並持續約8週。 根據下列之療程，對小鼠注射0.25毫升之PBS、PBS中之 118243.doc -101 - 200806690 TTP-4000、或是 PBS 中之 TTP-3000(表 6)。 表6

組 小鼠 數目 初始劑量體積 維持劑量體積 療程 TTP- 4000 8 (3〇〇 μ§) 0.25 ml/劑/小鼠 於第1天 (100 pg) 〇·25 ml/劑/小鼠 自第2天起始 (100 每隔1天1次(QOD) X 8 週；IP TTP- 3000 8 (3〇〇 μθ 0.25 ml/劑/小鼠 於第1天 (100 gg) 〇·25 ml/劑/小鼠 自第2天起始 (100 pg) 每隔1天1次 (QOD) X 8週；IP PBS 8 0.25 ml/劑/小鼠 於第1天 〇·25 ml/劑/小鼠 自第2天起始 每隔1天1次 (QOD) X 8週；IP 胰島移植物功能之監測 以胰島移植後最初2週之每日系列血糖測量值以及其後 每隔一天之測量值而監測胰島移植物之功能。糖尿病之逆 轉係以血糖含量低於200 mg/dl之兩連續測量值而定義。當 兩連續測量值之血糖含量超過250 mg/dl時判定移植物喪失 百分比。該等結果示於表7。 表7 ΤΊΊΜ000及ΤΤΡ·0在NOD+ ^體内之同基因性月夷島移植中 對於復發糖尿病之作用* TTP-4000 300 pg LD + 100 pg qod ip (、组 l) n c Hu ιλλλ 11 r-3U00 300 100 pg q〇d ip (組2) 控制組 35 〇 〇 44 23 ~ 3δ Λ Λ 46 4U Λ η 42 26 '~~ 43 ο ΖΓ 41 22 ' ~ 3ο Λ C 34 22 45 Λ Λ 32 24 ~ 44 Ο Ο 30 21 ' 3ο __ 20 ' 22 _~^ 118243.doc -102· 200806690 21 24 平均值 39.875 38.42857 22.727273 SD 3.758324 6.32079 1.8488326 η 8 7 11 *數值反應各動物移植物喪失之天數，如由增高血糖含量之復發而定義 針對糖尿病NOD小鼠體内之同基因性移植胰島排斥投藥 TTP-4000之作用係在圖22中以卡普蘭·梅爾（Kaplan_Meier) 累積存活圖顯示。如表7之數據所示，相對於完全未經治 療之動物（控制組），以TTP-4000 (組1)及TTP-3000 (組2)治 療之動物在偵測到移植物衰竭前之時間方面有增加之情 形。圖22顯示以TTP-4000 (組1)治療之動物及完全未經治 療之動物在偵測到移植物衰竭前之時間方面之增加情形。 使用各種統計分析（MantelCoxLogrank，Breslow·Gehan-Wilcoxon; Tarone-Ware5 Peto-Peto-Wilcoxin; Harring-Fleming) » 該控制組與TTP-4000 (組1)以及該控制組與TTP-3 000 (組2) 間之差異具有顯著性（表8)。 表8 統計方法 控制組 vs 組 1 (TTP-4000) 控制組vs組2 0TP-3000) Chi-平方 DF* P-值 Chi·平方 DF P-值 Logrank (Mantel-Cox) 18.410 1 <0.0001 16.480 1 <0.0001 Breslow-Gehan-Wilcoxon 14.690 1 0.0001 12.927 1 0.0001 Tarone-Ware 16.529 1 <0.0001 14.686 1 0.0001 Peto-Peto-Wilcoxon 14.812 1 0.0001 13.027 1 0.0003 Harrington-Fleming (rho = 0.5) 16.529 1 <0.0001 14.686 1 0.0001 *自由度 前述者僅可被視為係本發明原則之說明。由於熟習技藝 者將可輕易進行諸多修飾及變化，咸並不欲將本發明限制 為所示及所述之精確具體實例，且所有屬於附呈申請專利 118243.doc -103 - 200806690 範圍請求向範圍中之適當修飾及當I物皆被視為係屬於本 發明之發明概念。 【圖式簡單說明】 本發明之各種特徵、範缚、及優點將可參照下列之圖示 而更為顯見。 圖1顯示根據本發明各種具體實例之各種11入(3]5序列及免 疫球蛋白序列·· A部分’序列編號NO: 1 ’人類RAGEfe：基 酸序列；以及序列編號NO: 2，不含胺基酸1_22之信號序 列之人類RAGE胺基酸序列；B部分，序列編號1^0: 3 ’不 含胺基酸1-23之信號序列之人類RAGE胺基酸序列；€部 分，序列編號NO: 4，人類sRAGE胺基酸序列；序列編號 NO: 5，不含胺基酸1-22之信號序列之人類sRAGE胺基酸 序列；以及序列編號NO: 6，不含胺基酸1-23之信號序列 之人類sRAGE胺基酸序列；D部分，序列編號NO: 7，包含 人類RAGE V域之胺基酸序列；序列編號NO: 8，包含人類 RAGE V域之另一胺基酸序列；序列編號N0: 9，人類 RAGE V域之N-端片段；序列編號NO: 10，人類RAGE V域 之另一 N-端片段；序列編號NO: 11，人類RAGE胺基酸 124-221之胺基酸序列；序列編號NO: 12，人類RAGE胺基 酸227-317之胺基酸序列；序列編號NO: 13，人類RAGE胺 基酸23-123之胺基酸序列；E部分，序列編號NO: 14 ’人 類RAGE胺基酸24· 123之胺基酸序列；序列編號\〇: 15， 人類RAGE胺基酸23-136之胺基酸序列；序列編號1^0: 16，人類RAGE胺基酸24-136之胺基酸序列；序列編號1^0: -104- 118243.doc 200806690 17，人類RAGE胺基酸23-226之胺基酸序列；序列編號NO: 18，人類RAGE胺基酸24-226之胺基酸序列；F部分，序列 編號NO: 19，人類RAGE胺基酸23-251之胺基酸序列；序 列編號NO: 20，人類RAGE胺基酸24-251之胺基酸序列； 序列編號NO·· 21，一 RAGE域間連接子；序列編號NO: 22，一第二RAGE域間連接子；序列編號NO: 23，一第三 RAGE域間連接子；序列編號NO: 24，一第四RAGE域間連 接子；G部分，序列編號NO: 25，編碼人類RAGE胺基酸1-118之DNA ;序列編號NO: 26，編碼人類RAGE胺基酸1-123之DNA ;及序列編號NO: 27，編碼人類RAGE胺基酸1-136之DNA ; Η部分，序列編號NO: 28，編碼人類RAGE胺 基酸1-23 0之DNA ;及序列編號NO: 29，編碼人類RAGE胺 基酸1-251之DNA ; I部分，序列編號NO: 38，人類IgG Ch2 及Ch3域之部分胺基酸序列；序列編號NO: 39，編碼人類 IgG人類CH2及CH3域之部分之DNA ;序列編號NO: 40，人 類IgG CH2及CH3域之胺基酸序列；J部分，序列編號NO: 41，編碼人類IgG人類CH2及CH3域之DNA ;序列編號NO: 42，人類IgG CH2域之胺基酸序列；序列編號NO: 43，人 類IgG CH3域之胺基酸序列；及序列編號NO: 44，一第五 RAGE域間連接子。 圖2顯示根據本發明一具體實例之第一 RAGE融合蛋白 (TTP-4000)編碼區域之DNA序列（序列編號NO: 30)。以粗 體字強調之編碼序列1-753係編碼RAGE N-端蛋白序列， 而序列754-1386則係編碼人類IgG (γΐ)蛋白序列。 118243.doc -105 - 200806690 圖3顯示根據本發明一具體實例之第二RAGE融合蛋白 (TTP-3000)編碼區域之DNA序列（序列編號NO: 31)。以粗 體字強調之編碼序列1-408係編碼RAGE N-端蛋白序列， 而序列409-1041則係編碼人類IgG (γΐ)蛋白序列。 圖4顯示胺基酸序列序列編號NO: 32、序列編號NO: 33、及序列編號NO: 34，其各編碼一根據本發明諸等具體 實例之四域RAGE融合蛋白。RAGE序列係以粗體字強調。 圖5顯示胺基酸序列序列編號NO: 35、序列編號NO: 36、及序列編號NO·· 37，其各編碼一根據本發明諸等具體 實例之三域RAGE融合蛋白。RAGE序列係以粗體字強調。 圖6，A部分，顯示人類RAGE與人類Ig γ-l Fc部分中諸 等蛋白域之比較，以及根據本發明諸等具體實例之用以製 備TTP-3000 (於位置136)及TTP-4000 (於位置251)之切割 點；而B部分顯示根據本發明諸等具體實例之TTP-3000及 TTP-4000之域結構。 圖7顯示根據本發明一具體實例之sRAGE、第一RAGE融 合蛋白TTP-4000 (TT4)、及第二RAGE融合蛋白TTP-3000 (TT3)與RAGE配位體0澱粉樣蛋白（A-beta)、S100b (SI 00)、及兩性蛋白（Ampho)之體外結合分析結果。 圖8顯示根據本發明一具體實例之第一 RAGE融合蛋白 TTP-4000 (TT4)(”蛋白”）相較於僅包括該免疫偵測試劑（"僅 含複合物’’）之陰性控制組之與/3澱粉樣蛋白之體外結合分 析結果，以及此等結合作用由RAGE拮抗劑（nRAGE配位體π) 所產生之括抗作用。 118243.doc -106- 200806690 圖9顯示根據本發明一具體實例之第二raGE融合蛋白 ΤΤΡ-3000 (TT3)(”蛋白”）相較於僅包括該免疫偵測試劑（”僅 含複合物π)之陰性控制組之與/3澱粉樣蛋白之體外結合分 析結果，以及此等結合作用由RAGE拮抗劑（"RAGE配位體，，） 所產生之拮抗作用。 圖10顯示根據本發明一具體實例之測量由RAGE融合蛋 白 TTP-3000 (TT3)及 TTP-4000 (TT4)以及 sRAGE 對 S100b/RAGE誘發性TNF-α生成所產生之抑制作用之細胞基 礎性分析結果。 圖11顯示根據本發明一具體實例之RAGE融合蛋白TTP-4000之藥物動力學特性，其中各個曲線係代表在相同實驗 條件下之不同動物。 圖12顯示根據本發明一具體實例之由RAGE融合蛋白 TTP-4000及人類IgG之激發而造成自THP-1細胞釋出之 TNF-a相對含量，其可作為一炎性反應之測量值。 圖13顯示根據本發明諸等具體實例而使用RAGE融合蛋白 TTP-4000以減少糠尿病動物體内之再狹窄，其中A部分顯 示，相較於陰性控制組（IgG)，TTP-4000 RAGE融合蛋白可 降低血管内膜/中膜之比例，而B部分顯示，TTP-4000 RAGE 融合蛋白可以劑量反應性之方式降低平滑肌細胞之增殖。 圖14顯示根據本發明諸等具體實例之而使用RAGE融合 蛋白TTP-4000以減少罹患阿茲海默症（AD)之動物體内之澱 粉樣蛋白形成及認知失能，其中A部分顯示，ττρ-4000 RAGE融合蛋白可減少腦中之澱粉樣蛋白負載量，而Β部分 118243.doc -107- 200806690 顯示，TTP-4000 RAGE融合蛋白可改善認知失能。 圖15顯示根據本發明一具體實例之TTP-4000與各種不同 之經固定已知RAGE配位體之飽和結合曲線。 圖16顯示根據本發明諸等具體實例之各種RAGE序列及 免疫球蛋白序列：A部分，序列編號NO: 45，其中該N-端 麩醯胺殘基環化以形成焦麩胺酸之不含胺基酸1 -23之信號 序列之人類sRAGE胺基酸序列；序列編號NO: 46，其中該 N-端麩醯胺殘基環化以形成焦麵胺酸之包含人類sRAGE V 域之另一胺基酸序列；序列編號NO: 47，其中該N-端麩醯 胺殘基環化以形成焦麩胺酸之人類RAGE V域之另一 N-端 片段；序列編號NO: 48，其中該N-端麩醯胺殘基環化以形 成焦麩胺酸之人類RAGE胺基酸24-123之胺基酸序列；B部 分，序列編號NO: 49，其中該N-端麩醯胺殘基環化以形成 焦麩胺酸之人類RAGE胺基酸24-136之胺基酸序列；序列 編號NO: 50，其中該N-端麩醯胺殘基環化以形成焦麩胺酸 之人類RAGE胺基酸24-226之胺基酸序列；序列編號NO: 5 1，其中該N-端麩醯胺殘基環化以形成焦麩胺酸之人類 RAGE胺基酸24-251之胺基酸序列；C部分，序列編號NO: 52，編碼序列編號NO: 38中人類IgG人類CH2及CH3域之部 分之另一DNA序列；序列編號NO: 53，編碼序列編號NO: 40中人類IgG人類CH2及CH3域之另一 DNA序列。 圖17顯示根據本發明一具體實例之第一 RAGE融合蛋白 (TTP-4000)編碼區域之另一 DNA序列（序列編號NO: 54)。 以粗體字強調之編碼序列1-753係編碼RAGE N-端蛋白序 118243.doc -108- 200806690 列，而序列754-1386則係編碼人類IgG(yl)蛋白序列。 圖18顯示根據本發明一具體實例之第二rage融合蛋白 (TTP-3000)編碼區域之另一 DNA序列（序列編號1^〇: 。 以粗體字強調之編碼序列^408係編碼RAGE N-端蛋白序 列，而序列409-1041則係編碼人類IgG(Yl)蛋白序列。 圖19顯示胺基酸序列序列編號no : 5 6，其編碼根據本發 明一具體實例之四域RAGE融合蛋白。RAGE序列係以粗體 字強調。 圖20顯示胺基酸序列序列編號no: 57,其編碼根據本發 明一具體實例之三域RAGE融合蛋白。RAGE序列係以粗體 字強調。 圖21顯示根據本發明諸等具體實例而使用rage融合蛋 白TTP-4000以減少異基因性胰島細胞移植之排斥作用，其 中空圈（未填滿）係指明未經治療之控制組動物；具有斜線 花紋之圈係指明在第一次之投劑時以TTP-4000治療之動 物；具有波浪花紋之圈係指明在第二次之投劑時以TTP-4000治療之動物；其中繪有菱形之圈係指明經控制組PBS 治療之動物；而實圈係指明經控制組IgG治療之動物。 圖22顯示根據本發明諸等具體實例而使用RAGE融合蛋 白TTP-4000以減少同基因性胰島細胞移植之排斥作用，其 中空圈（未填滿）係指明未經治療之控制組動物；而實圈係 指明經TTP-4000治療之動物。 118243.doc -109- 200806690 序列表 <11〇> 美商創世泰克藥業股份有限公司 <120> RAGE融合蛋白及其使用方法 <130〉 57739-339019 <140〉 096104916 <141> 2007-02-09 <150> US 60/771,619 <151> 2006-02-09 <160> 57 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 、<211> 404

<212> PRT <213>人類 <400> 1

Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu 1 5 10 15

Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu 2〇 25 30

Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg 35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu 50 55 60

Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro 65 70 75 80

Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie 85 90 95

Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn 100 105 110

Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp 115 120 125

Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys 130 135 140 118243-序列表.doc 200806690

Val Ser 145 Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp 150 155 160 Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin 165 170 175 Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu 180 185 190 Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys 195 200 205 Ser Phe 210 Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro 215 220 工le Gin 225 Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu 230 235 240 Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr 245 250 255 Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gin Pro Ser Pro Gin lie His Trp Met 260 265 270 Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu lie Leu 275 280 285 Pro Glu 290 工le Gly Pro Gin Asp Gin Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr 295 300 His Ser 305 Ser His Gly Pro Gin Glu Ser Arg Ala Val Ser lie Ser lie 310 315 320 He Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser 325 330 335 Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly lie Leu Gly Gly Leu Gly 340 345 350 Thr Ala Ala Leu Leu lie Gly Val lie Leu Trp Gin Arg Arg Gin Arg 355 360 365

Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Asn Gin Glu Glu Glu Glu Glu 370 375 380 118243-序列表.doc ·2- 200806690

Arg Ala Glu Leu Asn Gin Ser Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser 385 390 395 400

Thr Gly Gly Pro <210> 2 <211> 382 <212> PRT <213> 人類 <400> 2 Ala Gin Asn lie 1

Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 5 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60

Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95

Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110

Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr 115 120 125

Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro 130 135 140

Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu 145 150 155 160

Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg 165 170 175

Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu 180 185 190 118243-序列表.doc 200806690

Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin Pro Arg Val Trp 195 200 205

Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly 210 215 220

Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro 225 230 235 240

Ala Gin Pro Ser Pro Gin lie His Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu 245 250 255

Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu lie Leu Pro Glu lie Gly Pro Gin 260 265 270

Asp Gin Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro 275 280 285

Gin Glu Ser Arg Ala Val Ser 工le Ser lie lie Glu Pro Gly Glu Glu 290 295 300

Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly Leu Gly Thr Leu Ala 305 310 315 320

Leu Ala Leu Gly lie Leu Gly Gly Leu Gly Thr Ala Ala Leu Leu lie 325 330 335

Gly Val 工le Leu Trp Gin Arg Arg Gin Arg Arg Gly Glu Glu Arg Lys 340 345 350

Ala Pro Glu Asn Gin Glu Glu Glu Glu Glu Arg Ala Glu Leu Asn Gin 355 360' 365

Ser Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser Thr Gly Gly Pro 370 375 380 <210> 3 <211> 381 <212> PRT <213>人類 <400> 3

Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 15 10 15 4- 118243·序列表.doc 200806690

Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30

Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro 35 40 45

Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60

Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn 65 70 75 80

Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin 85 90 95 lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala 100 105 110

Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro 115 120 125

Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn 130 135 140

Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu Thr 145 150 155 160

Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly 165 170 175

Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro 180 185 190

Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin Pro Arg Val Trp Glu 195 200 205

Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly 210 215 220

Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala 225 230 235 240

Gin Pro Ser Pro Gin lie His Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro 245 250 255 118243-序列表.doc 200806690

Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu lie Leu Pro Glu lie Gly Pro Gin Asp 260 265 270

Gin Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro Gin 275 280 285

Glu Ser Arg Ala Val Ser lie Ser lie 工le Glu Pro Gly Glu Glu Gly 290 295 300

Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu 305 310 315 320

Ala Leu Gly lie Leu Gly Gly Leu Gly Thr Ala Ala Leu Leu lie Gly 325 330 335

Val 工le Leu Trp Gin Arg Arg Gin Arg Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala 340 345 350

Pro Glu Asn Gin Glu Glu Glu Glu Glu Arg Ala Glu Leu Asn Gin Ser 355 360 365

Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser Thr Gly Gly Pro 370 375 380 <210> 4 <211> 339 <212> PRT <213> 人類 <400> 4

Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu 15 10 15

Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu 20 25 30

Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg 35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu 50 55 60

Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro 65 70 75 80

Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie 85 90 95 -6- 118243-序列表.doc 200806690

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Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp 115 120 125

Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys 130 135 140

Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp 145 150 155 160

Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin 165 170 175

Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu 180 185 190

Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys 195 200 205

Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro 210 215 220 工le Gin Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu 225 230 235 240

Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr 245 250 255

Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gin Pro Ser Pro Gin lie His Trp Met 260 265 270

Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu lie Leu 275 280 285

Pro Glu lie Gly Pro Gin Asp Gin Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr 290 295 300

His Ser Ser His Gly Pro Gin Glu Ser Arg Ala Val Ser lie Ser lie 305 310 315 320 lie Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser 325 330 335 118243-序列表.doc 200806690

Gly Leu Gly <210> 5 <211> 317 <212> PRT <213>人類 <400> 5

Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15

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Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60

Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95

Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110

Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr 115 120 125

Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro 130 135 140

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Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu 180 185 190 -8 118243·序列表.doc 200806690

Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin Pro Arg Val Trp 195 200 205

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Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro 225 230 235 240

Ala Gin Pro Ser Pro Gin lie His Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu 245 250 255

Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu lie Leu Pro Glu lie Gly Pro Gin 260 265 270 / ''

Asp Gin Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro 275 280 285

Gin Glu Ser Arg Ala Val Ser lie Ser lie lie Glu Pro Gly Glu Glu 290 295 300

Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly Leu Gly 305 310 315 <210> 6 <211> 316

<212> PRT <213>人類 <400> 6

Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 15 10 15

Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30

Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro 35 40 45

Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60

Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn 65 70 75 80

Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin 85 90 95 9- 118243·序列表.doc 200806690 lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala 100 105 110

Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro 115 120 125

Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn 130 135 140

Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu Thr 145 150 155 160

Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly 165 170 175

Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro 180 185 190

Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin Pro Arg Val Trp Glu 195 200 205

Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly 210 215 220

Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala 225 230 235 240

Gin Pro Ser Pro Gin lie His Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro 245 250 255

Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu lie Leu Pro Glu lie Gly Pro Gin Asp 260 265 270

Gin Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro Gin 275 280 285

Glu Ser Arg Ala Val Ser lie Ser lie 工le Glu Pro Gly Glu Glu Gly 290 295 300

Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly Leu Gly

305 310 315 <210> 7 <211> 94 <212> PRT 10- 118243-序列表.doc 200806690 <213> 人類 <400> 7

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Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60 、Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg 85 90 <210> 8 <211> 93 <212> PRT <213> 人類 <400> 8

Gin Asn 工le Thr Ala Arg 工le Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 1 5 10 15

Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30 \ /

Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro 35 40 45

Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60

Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn 65 70 75 80

Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg 85 90 <210> 9 <211> 30 -11 - 118243-序列表.doc 200806690 <212> PRT <213>人類 <400> 9

Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys 20 25 30 <210> 10 <211> 29 <212> PRT <213> 人類 <400> 10 、Gin Asn lie Thr Ala Arg 工le Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 1 5 10 15

Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys 20 25 <210> 11 <211> 98 <212> PRT <213>人類 <400> 11

Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn 15 10 15

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Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr 50 55 60

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Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala 85 90 95

Leu Arg -12- 118243-序列表.doc 200806690 <210> 12 <211> 91 <212> PRT <213>人類 <400> 12

Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val 15 10 15

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Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu lie Leu Pro Glu 50 55 60 工le Gly Pro Gin Asp Gin Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser 65 70 75 80

Ser His Gly Pro Gin Glu Ser Arg Ala Val Ser 85 90 <210> 13

<211> 101 <212> PRT <213>人類 <400> 13

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Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80 13 118243·序列表.doc 200806690

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95

Gin lie Pro Gly Lys 100 <210> 14 <211> 100 <212> PRT <213>人類 <400> 14

Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 15 10 15

Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30

Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro 35 40 45

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Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn 65 70 75 80

Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin 85 90 95 lie Pro Gly Lys 100 <210> 15 <211> 114 <212> PRT <213>人類 <400> 15 Ala Gin Asn 1 工le Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 5 10 15

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Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45 •14- 118243-序列表.doc 200806690

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Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95

Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110

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Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 15 10 15

Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30

Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro 35 40 45

Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60

Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn 65 70 75 80

Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin 85 90 95 lie Pro Gly Lys Pro Glu 工le Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala 100 105 110

Gly <210> 17 -15- 118243-序列表.doc 200806690 <211> 204

<212> PRT <213>人類 <400> 17

Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60

Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95

Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110

Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr 115 120 125

Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro 130 135 140

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Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro 工le Gin 195 200

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Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 15 10 15

Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30

Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro 35 40 45

Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60

Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn 65 70 75 80

Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin 85 90 95 lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala 100 105 110

Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro 115 120 125

Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn 130 135 140

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Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly 165 170 175

Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro 180 185 190

Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin 195 200 <210> 19 <211> 229

<212> PRT <213>人類 •17· 118243-序列表.doc 200806690 <400> 19

Ala Gin Asn 1 lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 5 10 15 Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30 Thr Gly Arg 35 Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 40 45 Pro Trp Asp 50 Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 55 60 Pro Ala Val ,65 Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95 Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110 Ala Gly Val 115 Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr 120 125

Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro 130 135 140 Asn Glu Lys 145 Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu 150 155 160 ^ J Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg 165 170 175 Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu 180 185 190 Pro Arg His 195 Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin Pro Arg Val Trp 200 205 Glu Pro Val 210 Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly 215 220 Gly Ala Val 225 Ala Pro 18- 118243-序列表.doc 200806690

<210> 20 <211> 228 <212> PRT <213>人類 <400> 20

Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 15 10 15

Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30

Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro 35 40 45

Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60

Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn 65 70 75 80

Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin 85 90 95 lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala 100 105 110

Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro 115 120 125

Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn 130 135 140

Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu Thr 145 150 155 160

Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly 165 170 175

Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro 180 185 190

Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin Pro Arg Val Trp Glu 195 200 205 -19- 118243-序列表.doc 200806690

Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly 210 215 220

Ala Val Ala Pro 225 <210> 21 <211> 7

<212> PRT <213>人類 <400> 21

Val Tyr Gin lie Pro Gly Lys 1 <210> 22 <211> 30 <212> PRT <213> 人類 <400> 22

Thr Ala Pro 工le Gin Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu 15 10 15

Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro 20 25 30 <210> 23

<211> 20 <212> PRT <213>人類 <400> 23

Val Tyr Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu 15 10 15

Leu Thr Ala Gly 20 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> 人類 <400> 24 Thr Ala Pro lie Gin 1 5 <210> 25 -20- 118243·序列表.doc 200806690 <211> 354 <212> DNA <213>人類 <400> 25 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120 gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240 aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300 gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctac 354 <210> 26 <211> 369

<212> DNA <213>人類 <400> 26 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120 gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240 aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300 gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360 cctgggaag 369 <210> 27 <211> 408

,<212> DNA <213>人類 <400> 27 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120 gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240 aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300 gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360 cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggt 408 <210> 28 -21 - 118243·序列表.doc 200806690 <211> 690 <212> DNA <213>人類 <400> 28 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120 gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240 aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300 gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360 cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtgt tcccaataag 420 gtggggacat gtgtgtcaga ggggagctac cctgcaggga ctcttagctg gcacttggat 480 gggaagcccc tggtgcctaa tgagaaggga gtatctgtga aggaacagac caggagacac 540 cctgagacag ggctcttcac actgcagtcg gagctaatgg tgaccccagc ccggggagga 600 gatccccgtc ccaccttctc ctgtagcttc agcccaggcc ttccccgaca ccgggccttg 660 cgcacagccc ccatccagcc ccgtgtctgg 690 <210> 29 <211> 753

<212> DNA <213>人類 <400> 29 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120 gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240 aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300 gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360 cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtgt tcccaataag 420 gtggggacat gtgtgtcaga ggggagctac cctgcaggga ctcttagctg gcacttggat 480 gggaagcccc tggtgcctaa tgagaaggga gtatctgtga aggaacagac caggagacac 540 cctgagacag ggctcttcac actgcagtcg gagctaatgg tgaccccagc ccggggagga 600 gatccccgtc ccaccttctc ctgtagcttc agcccaggcc ttccccgaca ccgggccttg 660 cgcacagccc ccatccagcc ccgtgtctgg gagcctgtgc ctctggagga ggtccaattg 720 gtggtggagc cagaaggtgg agcagtagct cct 753 -22- 118243-序列表.doc 200806690 <210> 30 <211> 1386 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人類 <400> 30 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120 gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240 aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300 gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360 cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtgt tcccaataag 420 gtggggacat gtgtgtcaga ggggagctac cctgcaggga ctcttagctg gcacttggat 480 gggaagcccc tggtgcctaa tgagaaggga gtatctgtga aggaacagac caggagacac 540 cctgagacag ggctcttcac actgcagtcg gagctaatgg tgaccccagc ccggggagga 600 gatccccgtc ccaccttctc ctgtagcttc agcccaggcc ttccccgaca ccgggccttg 660 cgcacagccc ccatccagcc ccgtgtctgg gagcctgtgc ctctggagga ggtccaattg 720 gtggtggagc cagaaggtgg agcagtagct cctccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 780 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 840 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 900 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 960 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1020 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1080 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 1140 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1200 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1260 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1320 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1380 aaatga 1386 <210> 31 -23- 118243-序列表.doc 200806690 <211> 1041 <212> DNA <213 >人工序列 <220> <223>人類 <400> 31 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120 gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240 aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300 gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360 cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtcc gtcagtcttc 420 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 480 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 540 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 600 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 660 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 720 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 780 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 840 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 900 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 960 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1020 tccctgtctc cgggtaaatg a 1041 <210> 32 <211> 461 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 人類 <4〇0> 32

Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu 1 5 10 15 Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu 20 25 30 -24- 118243-序列表.doc 200806690

Pro Leu Val Leu 35

Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg 40 45

Leu Glu Trp Lys 50

Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu 55 60

Ser Pro Gin Gly 65

Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro 70 75 80

Asn Gly Ser Leu

Phe Leu Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie 85 90 95

Phe Arg Cys Gin 100

Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn 105 110

Tyr Arg Val Arg 115

Val Tyr Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu 工le Val Asp 120 125

Ser Ala Ser Glu 130

Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys 135 140

Val Ser Glu Gly 145

Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp 150 155 160

Gly Lys Pro Leu

Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin 165 170 175

Thr Arg Arg His 180

Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu 185 190

Met Val Thr Pro 195

Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys 200 205

Ser Phe Ser Pro 210

Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro 215 220 lie Gin Pro Arg 225

Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu 230 235 240

Val Val Glu Pro

Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Pro Ser Val Phe Leu 245 250 255

Phe Pro Pro Lys 260

Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu 265 270 118243-序列表.doc -25· 200806690

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 275 280 285

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 290 295 300

Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 305 310 315 320

Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 325 330 335

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys 340 345 350

Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 355 360 365

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 370 375 380

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 385 390 395 400

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 405 410 415

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 420 425 430

Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 435 440 445

His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 33 <211> 439 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類 <400> 33

Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg 工le Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15 26- 118243-序列表.doc 200806690

Lys Gly Ala Pro 20

Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 25 30

Thr Gly Arg Thr 35

Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 40 45

Pro Trp Asp Ser 50

Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 55 60

Pro Ala Val Gly 65 lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 70 75 80

Asn Arg Asn Gly

Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95

Gin lie Pro Gly 100

Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 105 110

Ala Gly Val Pro 115

Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr 120 125

Pro Ala Gly Thr 130

Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro 135 140

Asn Glu Lys Gly 145

Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu 150 155 160

Thr Gly Leu Phe

Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg 165 170 175

Gly Gly Asp Pro 180

Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu 185 190

Pro Arg His Arg 195

Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin Pro Arg Val Trp 200 205

Glu Pro Val Pro 210

Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly 215 220

Gly Ala Val Ala 225

Pro Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 230 235 240

Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 245 250 255 118243-序列表.doc -27- 200806690

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 260 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 275 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 305 310 315 320

Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 325 330 335

Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 340 345 350

Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 355 360 365 工le Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 370 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 385 390 395 400

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 405 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 420 425 430

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 <210> 34 <211> 438 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類 <400> 34

Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 1 5 10 15 28- 118243-序列表.doc 200806690

Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30

Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro 35 40 45

Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60

Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn 65 70 75 80

Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin 85 90 95 lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala 100 105 110

Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro 115 120 125

Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn 130 135 140

Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu Thr 145 150 155 160

Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly 165 170 175

Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro 180 185 190

Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin Pro Arg Val Trp Glu 195 200 205

Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly 210 215 220

Ala Val Ala Pro Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 225 230 235 240

Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 245 250 255 29- 118243-序列表.doc 200806690

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 260 265 270

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 275 280 285

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 290 295 300

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 305 310 315 320

Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 325 330 335

Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 340 345 350

Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 355 360 365

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 370 375 380

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 385 390 395 400

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 405 410 415

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 420 425 430

Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 <210> 35 <211> 346 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人類 <400> 35

Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu 15 10 15 30- 118243-序列表.doc 200806690

Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu 20 25 30

Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg 35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu 50 55 60

Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro 65 70 75 80

Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie 85 90 95

Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn 100 105 110

Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu 工le Val Asp 115 120 125

Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 130 135 140

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 工le Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 145 150 155 160

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 165 170 175

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 180 185 190

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 195 200 205

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 210 215 220

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 225 230 235 240

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 245 250 255 -31 - 118243-序列表.doc 200806690

Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 260 265 270

Pro Ser Asp 工le Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 275 280 285

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 290 295 300

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 305 310 315 320

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 325 330 335

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340 345 <210> 36 <211> 324 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類 <400> 36

Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30 /

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60

Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95

Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu 工le Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110 -32- 118243-序列表.doc 200806690

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 115 120 125

Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 130 135 140

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 145 150 155 160

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 165 170 175

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 180 185 190

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 195 200 205 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 210 215 220

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val 225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val 245 250 255

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 260 265 270

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 275 280 285

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 290 295 300

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 305 310 315 320

Ser Pro Gly Lys

<210> 37 <211> 323 <212> PRT 33- 118243-序列表.doc 200806690 <213 > 人工序列 <220> <223>人類 <400> 37

Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 5 10 15

Gin Asn lie Thr 1

Gly Ala Pro Lys 20

Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 25 30

Gly Arg Thr Glu 35

Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro 40 45

Trp Asp Ser Val 50

Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 55 60

Ala Val Gly lie 65

Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn 70 75 80

Arg Asn Gly Lys

Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin 85 90 95 lie Pro Gly Lys 100

Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala 105 110

Gly Pro Ser Val 115

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 120 125 lie Ser Arg Thr 130 \ / Glu Asp Pro Glu 145

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 135 140

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 150 155 160

His Asn Ala Lys

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 165 170 175

Arg Val Val Ser 180

Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 185 190

Lys Glu Tyr Lys 195

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie 200 205

Glu Lys Thr lie 210

Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val 215 220 118243-序列表.doc -34- 200806690

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser 225 230 235 240

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu 245 250 255

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 260 265 270

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 275 280 285

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 290 295 300

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 305 310 315 320

Pro Gly Lys <210> 38 <211> 210 <212> PRT <213>人類 <400> 38

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 15 10 15

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 20 25 30

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 35 40 45

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 50 55 60

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 65 70 75 80

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu 85 90 95 35- 118243-序列表.doc 200806690

Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 100 105 110

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 115 120 125

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp 130 135 140

Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 145 150 155 160

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 165 170 175

Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 180 185 190

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 195 200 205

Gly Lys 210 <210> 39 <211> 633 <212> DNA <213>人類 <4〇0> 39 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 60 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 120 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 180 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 240 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 300 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 360 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 420 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 480 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 540 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 600 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 633 * -36- 118243·序列表.doc 200806690 <210> 40 <211> 220 <212> PRT <213>人類 <400> 40

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 15 10 15

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60

Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80

Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala 100 105 110

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 115 120 125

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 130 135 140

Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 145 150 155 160

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 165 170 175

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 180 185 190

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 -37- 118243·序列表.doc 200806690 <210> 41 <211> 663 <212> DNA <213>人類 <400> 41 ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 60 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 120 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 180 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 240 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 300 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 360 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 420 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 480 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 540 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 600 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 660 tga 663 <210> 42 <211> 113 <212> PRT <213>人類 <400> 42

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 5 10 15

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60

Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 --38- 118243-序列表.doc 200806690

Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala 100 105 110

Lys <210> 43 <211> 107

<212> PRT <213>人類 <400> 43

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 、1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30

Tyr Pro Ser Asp 工le Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95

Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 44 <211> 25 <212> PRT <213> 人類 <400> 44 lie Ser lie He Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Leu Gly Thr Leu Ala 20 25 -39- 118243-序列表.doc 200806690 <210> 45 <211> 317 <212> PRT <213>人類 <220> < 2 21> MISC—FEATURE <222> (1).7(1) <223> Xaa=焦麩胺酸 <400> 45

Xaa Glu Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60

Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95

Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110

Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr 115 120 125

Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro 130 135 140

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Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg 165 170 175

Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu 180 185 190 -40 118243·序列表.doc 200806690

Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro 工le Gin Pro Arg Val Trp 195 200 205

Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly 210 215 220

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Asp Gin Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro 275 280 285

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Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly Leu Gly 305 310 315 <210> 46 <211> 94

<212> PRT <213>人類 <22 0> <221> MISC一FEATURE <222> (1) .7(1) <223> Xaa=焦麩胺酸 <400> 46

Xaa Glu Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60 -41 - 118243·序列表.doc 200806690

Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg 85 90 <210> 47 <211> 30 <212> PRT <213>人類 <220> <221> MI SC—FEATURE <222> (1).7(1) <223> Xaa=焦麩胺酸 <400> 47

Xaa Glu Asn lie Thr Ala Arg 工le Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys 20 25 30 <210> 48 <211> 101 <212> PRT <213>人類 <220> <221> MIS C—FEATURE <222> (1).7(1) <223> Xaa=焦麩胺酸 ，<400> 48

Xaa Glu Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60

Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80 -42 118243-序列表.doc 200806690

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95

Gin lie Pro Gly Lys 100 <210> 49 <211> 114 <212> PRT <213>人類 <220> <221> MIS C—FE ATURE <222> (1) .7(1) <223> Xaa=焦麩胺酸 <400> 49

Xaa Glu Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60

Pro Ala Val Gly 工le Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95

Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110

Ala Gly <210> 50 <211> 204 <212> PRT <213>人類 -43 - 118243·序列表.doc 200806690 <220> <221> MISC FEATURE <222> (1) .7(1) <223> 焦麩胺酸 <400> 50

Xaa Glu Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60

Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95

Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu 工le Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110

Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr 115 120 125

Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro 130 135 140

Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu 145 150 155 160

Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg 165 170 175

Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu 180 185 190

Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin 195 200 <210> 51 <211> 229 -44- 118243-序列表.doc 200806690 <212> PRT <213>人類 <220> <221> MIS C一 FEATURE <222> (1).7(1) <223> 焦麩胺酸 <400> 51

Xaa Glu Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60

Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95

Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110

Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr 115 120 125

Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro 130 135 140

Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu 145 150 155 160

Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg 165 170 175

Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu 180 185 190

Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin Pro Arg Val Trp 195 200 205 -45- 118243-序列表.doc 200806690

Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly 210 215 220

Gly Ala Val Ala Pro 225 <210> 52 <211> 633 <212> DNA <213 >人工序列 <220> <223> 人類 <400> 52 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa ctggactccg acggctcctt cagcagggga acgtcttctc cagaagagcc tctccctgtc <210> 53 <211> 663 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 人類 <400> 53 ccgtgcccag cacctgaact aaggacaccc tcatgatctc cacgaagacc ctgaggtcaa aagacaaagc cgcgggagga gtcctgcacc aggactggct tgggcagccg gagaacaact cttcctctac agcaagctca atgctccgtg atgcatgagg tcccgggaaa tga acaagaccac gcctcccgtg ccgtggacaa gagcaggtgg ctctgcacaa ccactacacg 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 633 cctgggggga ccgtcagtct ccggacccct gaggtcacat gttcaactgg tacgtggacg gcagtacaac agcacgtacc gaatggcaag gagtacaagt tcctcttccc cccaaaaccc gcgtggtggt ggacgtgagc gcgtggaggt gcataatgcc gtgtggtcag cgtcctcacc gcaaggtctc caacaaagcc 60 120 180 240 118243-序列表.doc -46- 300 200806690 ctcccagccc gtgtacaccc ctggtcaaag gagaacaact agcaagctca atgcatgagg tga ccatcgagaa tgcccccatc gcttctatcc acaagaccac ccgtggacaa ctctgcacaa aaccatctcc ccgggatgag cagcgacatc gcctcccgtg gagcaggtgg ccactacacg aaagccaaag ctgaccaaga gccgtggagt ctggactccg cagcagggga cagaagagcc ggcagccccg accaggtcag gggagagcaa acggctcctt acgtcttctc tctccctgtc agaaccacag cctgacctgc tgggcagccg cttcctctac atgctccgtg tcccgggaaa 360 420 480 540 600 660 663 <210> 54 <211> 1386 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人類 <400> 54 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc gtggggacat gtgtgtcaga ggggagctac gggaagcccc tggtgcctaa tgagaaggga cctgagacag ggctcttcac actgcagtcg gatccccgtc ccaccttctc ctgtagcttc cgcacagccc ccatccagcc ccgtgtctgg gtggtggagc cagaaggtgg agcagtagct cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc agccacgaag accctgaggt caagttcaac gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac accgtcctgc accaggactg gctgaatggc gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg tggaaactga acacaggccg gacagaagct ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc atccaggatg aggggatttt ccggtgccag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt tctgaactca cggctggtgt tcccaataag cctgcaggga ctcttagctg gcacttggat gtatctgtga aggaacagac caggagacac gagctaatgg tgaccccagc ccggggagga agcccaggcc ttccccgaca ccgggccttg gagcctgtgc ctctggagga ggtccaattg cctccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 -47- 118243-序列表.doc 1140 200806690 tgcctggtca ccggagaaca tacagcaagc gtgatgcatg aaatga aaggcttcta actacaagac tcaccgtgga aggctctgca tcccagcgac cacgcctccc caagagcagg caaccactac atcgccgtgg gtgctggact tggcagcagg acgcagaaga agtgggagag ccgacggctc ggaacgtctt gcctctccct caatgggcag cttcttcctc ctcatgctcc gtctcccggg 1200 1260 1320 1380 1386 <210> 55 <211> 1041 <212> DNA <213 >人工序列 <220> <223>人類 <400> 55 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtcc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc ccgggaaatg a <210> 56 <211> 439

<212> PRT 118243-序列表.doc -48- 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1041 200806690 <213>人工序列 <220> <223> 人類 <220> <221> MIS C一 FEATURE <222> (1).7(1) <223> Xaa=焦麵胺酸 <400> 56

Xaa Glu Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60

Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95

Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110

Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr 115 120 125

Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro 130 135 140

Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu 145 150 155 160

Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg 165 170 175

Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu 180 185 190 •49 118243-序列表.doc 200806690

Pro Arg His 195

Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin Pro Arg Val Trp 200 205

Glu Pro Val 210

Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly 215 220

Gly Ala Val 225

Ala Pro Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 230 235 240

Asp Thr Leu

Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 245 250 255

Asp Val Ser

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 260 265 270

Gly Val Glu 275

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 280 285

Asn Ser Thr 290

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 295 300

Trp Leu Asn 305

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 310 315 320

Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 325 330 335

Glu Pro Gin

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 340 345 350

Asn Gin Val 355

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 360 365 lie Ala Val 370

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 375 380

Thr Thr Pro 385

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 390 395 400

Lys Leu Thr

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 405 410 415

Cys Ser Val

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 420 425 430 118243·序列表.doc -50 200806690

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 <210> 57 <211> 324 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人類 <220> <221> MISC FEATURE <222> ⑴·了 (1) <223> Xaa=焦麩胺酸 <400> 57

Xaa Glu Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60

Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95

Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 115 120 125

Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 130 135 140

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 145 150 155 160 -51 - 118243-序列表.doc 200806690

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser 165 170 175

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu 180 185 190

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 195 200 205 工le Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 210 215 220

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin 225 230 235

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala 245 250 255

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 260 265 270

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 275 280 285

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 290 295 300

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 305 310 315

Thr Asn Pro Gin Val 240 Val Pro Thr Val Leu 320

Ser Pro Gly Lys 118243-序列表.doc 52-

Claims (1)

1. 200806690 十、申請專利範圍： 1. 一種RAGE融合蛋白，其包含直接連結包含免疫球蛋白 CH2域或是免疫球蛋白CH2域之部分之多肽之RAGE多 肽。 2. 根據請求項1之RAGE融合蛋白，其中該RAGE多肽包含 連結RAGE免疫球蛋白域之RAGE域間連接子，其使該 RAGE免疫球蛋白域之C-端胺基酸連結該域間連接子之 N-端胺基酸，並使該RAGE域間連接子之C-端胺基酸直 接連結包含免疫球蛋白CH2域或其部分之多肽之N-端胺 基酸。 3. 根據請求項1之RAGE融合蛋白，其中該RAGE多肽包含 配位體結合位點。 4. 根據請求項3之RAGE融合蛋白，其中該RAGE配位體結 合位點包含序列編號NO: 9或與其至少90%相同之序列， 或是序列編號NO: 10或與其至少90%相同之序列。 5. 根據請求項2之RAGE融合蛋白，其中該包含連結RAGE 免疫球蛋白域之RAGE域間連接子之RAGE多肽包含全長 RAGE蛋白之片段。 6. 根據請求項5之RAGE融合蛋白，其尚包含連結第二 RAGE免疫球蛋白域及第二RAGE域間連接子之第一 RAGE免疫球蛋白域及第一 RAGE域間連接子，其使該第 一域間連接子之N-端胺基酸連結該第一 RAGE免疫球蛋 白域之C-端胺基酸、該第二RAGE免疫球蛋白域之N-端 胺基酸連結該第一域間連接子之C-端胺基酸、該第二域 118243.doc 200806690 間連接子之N-端胺基酸連結該第二RAGE免疫球蛋白域 之C-端胺基酸、且該第二RAGE域間連接子之C-端胺基 酸直接連結該CH2免疫球蛋白域或CH2免疫球蛋白域之部 分之N-端胺基酸。 7. 根據請求項6之RAGE融合蛋白，其包含序列編號NO: 32、 序列編號NO: 33、序列編號NO: 34、或序列編號NO: 56之胺 基酸序列。 8. 根據請求項6之RAGE融合蛋白，其包含無C-端離胺酸胺 基酸殘基之序列編號NO: 33、無C-端離胺酸胺基酸殘基之 序列編號NO: 34或無C-端離胺酸胺基酸殘基之序列編號 NO: 56之胺基酸序列。 9. 根據請求項6之RAGE融合蛋白，其中該直接連結免疫球 蛋白CH2域或其部分之RAGE域間連接子包含序列編號 Να 22或與其至少90%相同之序列，或是序列編號NO·· 24 或與其至少90%相同之序列。 10·根據請求項5之RAGE融合蛋白，其包含經由RAGE域間 連接子而連結包含Ch2免疫球蛋白域或是免疫球蛋白Ch2 域之部分之多肽之N-端胺基酸之單一 RAGE免疫球蛋白 域。 11. 根據請求項10之RAGE融合蛋白，其包含序列編號NO: 35、序列編號NO: 36、序列編號NO: 37、或序列編號NO: 57 之胺基酸序列。 12. 根據請求項10之RAGE融合蛋白，其包含無C_端離胺酸胺 基酸殘基之序列編號NO: 36、無C-端離胺酸胺基酸殘基之 118243.doc 200806690 序列編號NO·· 37、或無C-端離胺酸胺基酸殘基之序列編號 NO: 57之胺基酸序列。 13. 根據請求項10之RAGE融合蛋白，其中該直接連結免疫球 蛋白CH2或其部分之RAGE連接子包含序列編號NO: 21或 與其至少90%相同之序列，或是序列編號NO: 23或與其至 少90%相同之序列。 14. 一種分離性核酸序列，其編碼根據請求項1之RAGE融合 蛋白。 15. 根據請求項14之分離性核酸序列，其中該RAGE多肽包含 連結RAGE免疫球蛋白域之RAGE域間連接子，其使該 RAGE免疫球蛋白域之C-端胺基酸連結該域間連接子之 N-端胺基酸，並使該RAGE域間連接子之C-端胺基酸直 接連結包含免疫球蛋白CH2域或其部分之多肽之N-端胺 基酸。 16. 根據請求項15之核酸，其包含序列編號NO: 30或其片段、 或是序列編號NO: 31或其片段、序列編號NO: 54或其片 段、或是序列編號NO: 55或其片段之序列。 17. —種表現載體，其編碼根據請求項1之RAGE融合蛋白。 18. 根據請求項17之表現載體，其中該RAGE多肽包含連結 RAGE免疫球蛋白域之RAGE域間連接子，其使該RAGE 免疫球蛋白域之C-端胺基酸連結該域間連接子之N-端胺 基酸，並使該RAGE域間連接子之C-端胺基酸直接連結 包含免疫球蛋白CH2域或其部分之多肽之N-端胺基酸。 19. 根據請求項17之表現載體，其包含序列編號NO·. 30或其片 118243.doc 200806690 段、或是序列編號NO: 31或其片段、序列編號Να 54或其 片段、或是序列編號NO: 55或其片段之序列。 20. —種經根據請求項17之表現載體轉染之細胞，其使該細 胞表現RAGE融合蛋白，該RAGE融合蛋白包含直接連結 包含免疫球蛋白CH2域或是免疫球蛋白CH2域之部分之多 肽之RAGE多肽。 21. —種經根據請求項17之表現載體轉染之細胞，其使該細 胞表現RAGE融合蛋白，該RAGE融合蛋白包含序列編號 NO: 32、序列編號NO: 33、序列編號NO: 34、序列編號NO: 35、序列編號NO: 36、序列編號NO: 37、序列編號NO: 56、 或序列編號NO: 57之胺基酸序列。 22. —種經根據請求項17之表現載體轉染之細胞，其使該細 胞表現RAGE融合蛋白，該RAGE融合蛋白包含無C-端離 胺酸胺基酸殘基之序列編號NO: 33、無C-端離胺酸胺基酸 殘基之序列編號NO: 34、無C-端離胺酸胺基酸殘基之序列 編號NO: 36、無C-端離胺酸胺基酸殘基之序列編號NO: 37、無C-端離胺酸胺基酸殘基之序列編號NO: 56、或無C-端離胺酸胺基酸殘基之序列編號NO: 57之胺基酸序列。 23_ —種組合物，其包含治療有效量之根據請求項1之RAGE 融合蛋白。 24.根據請求項23之組合物，其中該RAGE多肽包含連結 RAGE免疫球蛋白域之RAGE域間連接子，其使該RAGE 免疫球蛋白域之C-端胺基酸連結該域間連接子之N-端胺 基酸，並使該RAGE域間連接子之C-端胺基酸直接連結 118243.doc 200806690 包含免疫球蛋白CH2域或其部分之多肽之N-端胺基酸。 25. 根據請求項23之組合物，其中該RAGE多肽包含配位體結 合位點。 26. 根據請求項25之組合物，其中該RAGE配位體結合位點包 含序列編號NO: 9或與其至少90%相同之序列，或是序列 編號NO: 10或與其至少90%相同之序列。 27. 根據請求項24之組合物，其中該包含連結RAGE免疫球蛋 白域之RAGE域間連接子之RAGE多肽包含全長RAGE蛋 白之片段。 28·根據請求項23之組合物，其尚包含連結第二RAGE免疫球 蛋白域及第二RAGE域間連接子之第一 RAGE免疫球蛋白 域及第一 RAGE域間連接子，其使該第一域間連接子之 N_端胺基酸連結該第一RAGE免疫球蛋白域之C-端胺基 酸、該第二RAGE免疫球蛋白域之N-端胺基酸連結該第 一域間連接子之C·端胺基酸、該第二域間連接子之N-端 胺基酸連結該第二RAGE免疫球蛋白域之C_端胺基酸、 且該第二RAGE域間連接子之C-端胺基酸直接連結該Ch2 免疫球蛋白域或Ch2免疫球蛋白域之部分之N-端胺基 酸。 29. 根據請求項28之組合物，其中該RAGE融合蛋白包含序列 編號Να 32、序列編號NO: 33、序列編號NO: 34、或序列編 號NO: 56之胺基酸序列。 30. 根據請求項28之組合物，其中該RAGE融合蛋包含無C-端 離胺酸胺基酸殘基之序列編號NO: 33、無C-端離胺酸胺基 118243.doc 200806690 酸殘基之序列編號NO: 34、或無C-端離胺酸胺基酸殘基之 序列編號NO: 56之胺基酸序列。 31·根據請求項27之組合物，其中該RAGE融合蛋白包含經由 RAGE域間連接子而連結包含CH2免疫球蛋白域或是免疫 球蛋白CH2域之部分之多肽之N-端胺基酸之單一 RAGE免 疫球蛋白域。 32·根據請求項31之組合物，其中該RAGE融合蛋白包含序列 編號NO: 35、序列編號NO: 36、序列編號NO: 37、或序列編 號NO: 57之胺基酸序列。 33·根據請求項31之組合物，其中該RAGE融合蛋白包含無C-端離胺酸胺基酸殘基之序列編號NO: 36、無C-端離胺酸胺 基酸殘基之序列編號NO: 37、或無C-端離胺酸胺基酸殘基 之序列編號NO: 57之胺基酸序列。 34. 根據請求項23之組合物，其中該RAGE融合蛋白係調配為 可注射性溶液。 35. 根據請求項23之組合物，其中該該RAGE融合蛋白係調配 為無菌凍乾粉末。 36. —種製備根據請求項1之RAGE融合蛋白之方法，其包含 使RAGE多肽共價連結包含免疫球蛋白CH2域或是免疫球 蛋白CH2域之部分之多肽之步驟。 37. 根據請求項36之方法，其中該RAGE多肽包含連結RAGE 免疫球蛋白域之RAGE域間連接子，其使該RAGE免疫球 蛋白域之C-端胺基酸連結該域間連接子之N-端胺基酸， 並使該RAGE域間連接子之C-端胺基酸直接連結包含免 118243.doc 200806690 疫球蛋白CH2域或其部分之多肽之N-端胺基酸。 38. 根據請求項36之方法，其中該RAGE多肽包含配位體結合 位點。 39. 根據請求項38之方法，其中該RAGE配位體結合位點包含 序列編號NO: 9或與其至少90%相同之序列，或是序列編 號NO: 10或與其至少90%相同之序列。 40. 根據請求項37之方法，其中該包含連結一 RAGE免疫球蛋 白域之一 RAGE域間連接子之RAGE多肽包含一全長 RAGE蛋白之片段。 41. 根據請求項40之方法，其中該尚包含連結第二RAGE免疫 球蛋白域及第二RAGE域間連接子之第一 RAGE免疫球蛋 白域及第一 RAGE域間連接子，其使該第一域間連接子 之N-端胺基酸連結該第一RAGE免疫球蛋白域之C-端胺 基酸、該第二RAGE免疫球蛋白域之N-端胺基酸連結該 第一域間連接子之C-端胺基酸、該第二域間連接子之N-端胺基酸連結該第二RAGE免疫球蛋白域之C_端胺基 酸、且該第二RAGE域間連接子之C-端胺基酸直接連結 該CH2免疫球蛋白域或CH2免疫球蛋白域之部分之N-端胺 基酸。 42. 根據請求項40之之方法，其中該RAGE融合蛋白包含經由 RAGE域間連接子而連結包含CH2免疫球蛋白域或是免疫 球蛋白CH2域之部分之多肽之N-端胺基酸之單一 RAGE免 疫球蛋白域。 43. 根據請求項36之方法，其中該RAGE融合蛋白係由重組 118243.doc 200806690 DNA建構物編碼。 44. 根據請求項43之方法，其尚包含將該DNA建構物納入表 現載體中之步驟。 45. 根據請求項44之方法，其尚包含使該表現載體轉染進入 宿主細胞中之步驟。 46. —種製備根據請求項1之RAGE融合蛋白之方法，其包含 在細胞中表現該RAGE融合蛋白，其中該細胞包含編碼 該RAGE融合蛋白之核酸序列。 47. 根據請求項46之方法，其中該所表現之RAGE融合蛋白包 含序列編號NO: 32、序列編號NO: 33、序列編號NO: 34、序 列編號Να 35、序列編號NO: 36、序列編號NO: 37、序列編 號NO: 56、或序列編號NO: 57之胺基酸序列。 48. 根據請求項46之方法，其中該所表現之RAGE融合蛋白包 含無C-端離胺酸胺基酸殘基之序列編號NO: 33、無C-端離 胺酸胺基酸殘基之序列編號NO: 34、無C-端離胺酸胺基酸 殘基之序列編號NO: 36、無C-端離胺酸胺基酸殘基之序列 編號NO: 37、無C-端離胺酸胺基酸殘基之序列編號NO: 56、或無C-端離胺酸胺基酸殘基之序列編號NO: 57之胺基 酸序列。 49· 一種製備RAGE融合蛋白之方法，該RAGE融合蛋白包含 直接連結包含免疫球蛋白CH2域或是免疫球蛋白CH2域之 部分之多肽之RAGE多肽，該方法包含在細胞中表現由 請求項16之核酸編碼之該RAGE融合蛋白。 50.根據請求項49之方法，其中該細胞係哺乳動物細胞。 118243.doc 200806690 51. 根據請求項49之方法，其中該細胞係選自CHO細胞、 NS0細胞、HeLa細胞、COS細胞、及SP2細胞所組成之 群〇 52. 根據請求項51之方法，該方法尚包含培養該細胞，並自 其中回收該蛋白。 53. —種如請求項1所定義之RAGE融合蛋白之用途，其係用 以製造用於治療RAGE中介性疾病之藥物。 54·根據請求項53之用途，其中該RAGE多肽包含連結RAGE 免疫球蛋白域之RAGE域間連接子，其使該RAGE免疫球 蛋白域之C-端胺基酸連結該域間連接子之N-端胺基酸， 並使該RAGE域間連接子之C-端胺基酸直接連結包含免 疫球蛋白CH2域或其部分之多肽之N-端胺基酸。 55. 根據請求項53之用途，其中該RAGE配位體結合位點包含 序列編號NO: 9或與其至少90%相同之序列，或是序列編 號NO: 10或與其至少90%相同之序列。 56. 根據請求項54之用途，其中該包含連結RAGE免疫球蛋白 域之RAGE域間連接子之RAGE多肽包含全長RAGE蛋白 之片段。 57. 根據請求項56之用途，其尚包含連結第二RAGE免疫球蛋 白域及第二RAGE域間連接子之第一 RAGE免疫球蛋白域 及第一RAGE域間連接子，其使該第一域間連接子之N-端胺基酸連結該第一 RAGE免疫球蛋白域之C_端胺基 酸、該第二RAGE免疫球蛋白域之N-端胺基酸連結該第 一域間連接子之C-端胺基酸、該第二域間連接子之N-端 118243.doc 200806690 胺基酸連結該第二RAGE免疫球蛋白域之C-端胺基酸、 且該第二RAGE域間連接子之C-端胺基酸直接連結該Ch2 免疫球蛋白域或Ch2免疫球蛋白域之部分之N-端胺基 酸。 58·根據請求項57之用途，其中該RAGE融合蛋白包含序列編 號NO: 33、序列編號NO·· 34、或序列編號NO·· 56之胺基酸序 列。 59. 根據請求項57之用途，其中該RAGE融合蛋白包含無C-端 離胺酸胺基酸殘基之序列編號NO·. 33、無C-端離胺酸胺基 酸殘基之序列編號NO: 34、或無C-端離胺酸胺基酸殘基之 序列編號NO: 56之胺基酸序列。 60. 根據請求項57之用途，其中該直接連結免疫球蛋白CH2域 或其部分之RAGE域間連接子包含序列編號NO: 22或與其 至少90°/。相同之序列，或是序列編號NO: 24或與其至少 90%相同之序列。 61. 根據請求項56之用途，其中包含經由RAGE域間連接子而 連結包含CH2免疫球蛋白域或是免疫球蛋白CH2域之部分 之多肽之N-端胺基酸之單一 RAGE免疫球蛋白域。 62. 根據請求項61之用途，其中該RAGE融合蛋白包含序列編 號NO: 36、序列編號NO: 37、或序列編號NO: 57之胺基酸序 列。 63. 根據請求項61之用途，其中該RAGE融合蛋白包含無C-端 離胺酸胺基酸殘基之序列編號NO: 36、無C_端離胺酸胺基 酸殘基之序列編號NO: 37、或無C-端離胺酸胺基酸殘基之 118243.doc -10- 200806690 序列編號NO: 57之胺基酸序列。 64·根據請求項61之用途，其中該直接連結免疫球蛋白ce或 其部分之RAGE域間連接子包含序列編號N0·· 21或與其至 少9〇%相同之序列，或是序列編號NO: 23或與其至少9〇% 相同之序列。 65·根據印求項53之用途，其中該藥物係用於選自靜脈内投 藥、腹膜内投藥、或皮下投藥中之至少一者之投藥。 66·根據請求項53之用途，其中該藥物係用於治療糖尿病之 症狀或是糖尿病後期併發症之症狀。 67·根據請求項66之用途，其中該糖尿病或糖尿病後期併發 症之症狀包含糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病、糖尿 病杜腳潰瘍、心血管併發症、或是糖尿病性神經疾 之至少一者。 、 根據π求項53之用途，其中該藥物係用於治療殿粉樣變 性或阿茲海默症中之至少一者。 根據印求項53之用途，其中該藥物係用於治療癌症。 70·根據請求項53之用途，其中該藥物係用於治療發炎。 根據凊求項53之用途，其中該藥物係用於治療與 ^ Μ -Μ ι» 、Θ 厢光 又吐、二性腸疾、類風濕性關節炎、牛皮癖、多重硬 :匕、缺氧、中風、心臟病發作、失血性休克、敗血症、 或是損傷性傷口復原中之至少一者相關之發炎。 72·ΓΓ項71之用途，其中該自體免疫性包含皮膚細 广、神經細胞、肌細胞、内皮細胞、心臟細 、肝細胞、腎細胞、心臟、骨髓細胞、骨骼、血液細 118243.doc 200806690 胞動脈細胞、靜脈細胞、軟骨細胞、甲狀腺細胞、或 幹細胞中至少一者之排斥。 73·根據睛求項53之用途，其中該藥物係用於治療腎衰竭。 74·根據請求項53之用途，其中該藥物係用於治療與至少〆 器g '且織、或多個細胞自第一位點至第二位點之移 植相關之發炎及/或排斥。 75·根據請求項74之用途，其中該第一及第二位點係在不同 之對象體内。 76.根據請求項74之用途，其中該第一及第二位點係在相同 之對象體内。 77·根據請求項74之用途，其中該等經移植之細胞、組織、 或器官包含胰臟、皮膚、肝臟、腎臟、心臟、骨髓、血 液、骨骼、肌肉、動脈、靜脈、軟骨、甲狀腺、神經系 統、或幹細胞之細胞、組織、或器官。 78· —種如請求項【所定義之RAGE融合蛋白之用途，其係用 以製造用於預防細胞、組織、或器官之移植排斥之藥 物0 118243.doc