NL2000476C2

NL2000476C2 - Rage-fusie-eiwitten en werkwijzen voor het gebruik ervan.

Info

Publication number: NL2000476C2
Application number: NL2000476A
Authority: NL
Inventors: Adnan M M Mjalli; Robert Rothlein; Jeffrey C Webster; Ye E Tian
Original assignee: Transtech Pharma
Priority date: 2006-02-09
Filing date: 2007-02-07
Publication date: 2008-04-08
Also published as: JP2007215543A; BRPI0707640A2; AU2007215503A8; EP1989227A2; WO2007094926A3; CN101410411A; ZA200806288B; AU2007215503A1; IL192581A0; KR20080105066A; NZ569545A; WO2007094926A2; EA200870244A1; AR059377A1; EA015657B1; CA2638907A1; TW200806690A; NL2000476A1; US20090004190A1

Description

RAGE-FUSIE-EIWITTEN EN WERKWIJZEN VOOR HET GEBRUIK ERVAN KRUISVERWIJZING NAAR VERWANTE AANVRAGEN

5 De onderhavige aanvraag maakt aanspraak op prioriteit onder 35 U.S.C. § 119(e) van Amerikaanse voorlopige octrooi-aanvraag serienummer 60/771.619, ingediend op 9 februari 2006. De beschrijving van Amerikaanse voorlopige octrooi-aanvraag 60/771.619 is hierin in het geheel door verwijzing opgenomen.

10 GEBIED VAN DE UITVINDING

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op regulering van de Receptor voor Advanced Glycated Endproducts (RAGE). De onderhavige uitvinding beschrijft meer in het bijzonder fusie-eiwitten die een RAGE-polypeptide omvatten, werkwijzen voor 15 het maken van dergelijke fusie-eiwitten en het gebruik van dergelijke eiwitten voor behandeling van RAGE-gebaseerde stoornissen.

ACHTERGROND

20 Incubatie van eiwitten of lipiden met aldose-suikers resulteert in niet-enzyma- tische glycering en oxidatie van aminogroepen op eiwitten voor het vormen van Ama-dori adducten. Gedurende de tijd ondergaan de adducten aanvullende herrangschikkin-gen, dehydrataties en verknoping met andere eiwitten voor het vormen van complexen die bekend zijn als Advanced Glycation End Products (AGE’s). Factoren die de vor-25 ming van AGE’s bevorderen omvatten vertraagde omzetting van eiwit (bijvoorbeeld als bij amyloidosis), accumulatie van macromoleculen die een hoog lysine-gehalte hebben en hoge glucose-niveaus van het bloed (zoals bijvoorbeeld bij diabetes) (Hori et al, J. Biol. Chem. 270: 25752-761, (1995)). AGE’s zijn betrokken bij een verscheidenheid van stoornissen waaronder complicaties die met diabetes zijn geassocieerd en normale 30 veroudering.

AGE’s vertonen specifieke en verzadigbare binding aan receptoren van het cel-oppervlak op monocyten, macrofagen, endotheelcellen van de microvasculatuur, gladde spiercellen, mesengiale cellen en neuronen. De Receptor voor Advanced Glycated 2000476 2

Endproducts (RAGE) is een lid van de immunoglobuline-supergen familie van moleculen. Het extracellulaire (N-eindstandige) domein van RAGE omvat drie immunoglobu-line-type gebieden: één V (variabel) type domein gevolgd door twee C-type (constante) domeinen (Neeper et al., J. Biol. Chem., 267:14998-15004 (1992); Schmidt et al, Circ.

5 (Suppl.) 96#194 (1997)). Een enkel transmembraan omspannend domein en een korte sterk geladen cytosolische staart volgen het extracellulaire domein. Het N-eindstandige extracellulaire domein kan worden geïsoleerd door proteolyse van RAGE of door moleculaire biologische benaderingswijzen voor het genereren van oplosbaar RAGE (sRAGE) dat is samengesteld uit de V- en C-domeinen.

10 RAGE wordt op meerdere celsoorten tot expressie gebracht waaronder leukocy- ten, neuronen, microgliale cellen en vasculair endotheel (bijvoorbeeld Hori et al, J Biol. Chem., 270:25752-761 (1995)). Verhoogde niveaus van RAGE worden ook in weefsels gevonden die een verouderingsproces ondergaan (Schleicher et al, J Clin. Invest., 99 (3): 457-468 (1997)), en de diabetische retina, vasculatuur en nier (Schmidt 15 et al, Nature Med, 1:1002-1004 (1995)).

In aanvulling op AGE’s kunnen andere verbindingen aan RAGE binden en deze moduleren. RAGE bindt aan meerdere functioneel en structureel diverse liganden, waaronder amyloïde-bèta (Ap), serum amyloïde A (SAA), Advanced Glycation End products (AGE’s), SI00 (een ontstekingsbevorderend lid van de Calgranuline familie), 20 carboxymethyllysine (CML), amfoterine en CDllb/CD18 (Bucciarelli et al, Cell Mol Life Sci., 59:1117-128 (2002); Chavakis et al, Microbes Infect., 6:1219-1225 (2004); Kokkola et al, Scand. J. Immunol., 61:1-9 (2005); Schmidt et al, J. Clin. Invest., 108:949-955 (2001); Rocken et al, Am. J. Pathol, 162:1213-1220 (2003)).

Het is getoond dat binding van liganden zoals AGE’s, S100/calgranuline, β-25 amyloïde, CML (N£-Carboxymethyllysine) en amfoterine aan RAGE expressie van een verscheidenheid van genen modificeert. Deze interacties kunnen vervolgens mechanismen van signaaltransductie initiëren waaronder p38 activering, p21ras, MAP-kinasen, Erkl-2 fosforylatie en de activering van de transcriptionele bemiddelaar van signalering van ontsteking, NF-κΒ (Yeh et al, Diabetes, 50:1495-1504 (2001)). Bij vele 30 celsoorten kan interactie tussen RAGE en de liganden ervan bijvoorbeeld oxidatieve stress genereren dat resulteert in activering van de voor vrije radicalen gevoelige trans-criptiefactor NF-κΒ en de activering van NF-KB-gereguleerde genen, zoals de cytoki-nen IL-Ιβ en TNF-α. Expressie van RAGE wordt bovendien opwaarts gereguleerd door 3 middel van NF-κΒ en toont verhoogde expressie op plaatsen van ontsteking of oxida-tieve stress (Tanaka et al, J. Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000)). Een neerwaartse en vaak schadelijke spiraal kan aldus worden gevoed door een positieve feedback lus die wordt geïnitieerd door binding van ligand.

5 Activering van RAGE in verschillende weefsels en organen kan tot een aantal pa- thofysiologische gevolgen leiden. RAGE is betrokken bij een verscheidenheid van aandoeningen waaronder: acute en chronische ontsteking (Hofmann et al, Cell 97:889-901 (1999)), de ontwikkeling van late complicaties bij diabetes zoals verhoogde vasculaire permeabiliteit (Wautier et al., J. Clin. Invest., 97:238-243 (1995)), nefropathie (Teillet 10 et al., J. Am. Soc. Nephrol, 11:1488-1497 (2000)), arteriosclerose (Vlassara et al., The Finnish Medical Society DUODECIM, Ann. Med, 28:419-426 (1996)) en retinopathie (Hammes et al, Diabetologia, 42:603-607 (1999)). RAGE is ook betrokken bij de ziekte van Alzheimer (Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996)), en bij tumor invasie en metastase (Taguchi et al., Nature, 405:354-357 (2000)).

15 Ondanks de wijd verbreidde expressie van RAGE en de ogenschijnlijke pleiotro- pe rol ervan bij meerdere modellen van diverse ziekten lijkt RAGE niet essentieel te zijn voor normale ontwikkeling. Knock-out muizen voor RAGE hebben bijvoorbeeld geen duidelijk abnormaal fenotype dat suggereert dat terwijl RAGE een rol kan spelen bij pathologie van ziekte wanneer het chronisch wordt gestimuleerd, de remming van 20 RAGE niet lijkt bij te dragen aan elk ongewenst acuut fenotype (Liliensiek et al, J. Clin. Invest., 113:1641-50 (2004)).

Het tegenwerken van de binding van fysiologische liganden aan RAGE kan de pathofysiologische veranderingen die teweeg worden gebracht door overmatige concentraties van AGE’s en andere liganden van RAGE neerwaarts reguleren. Door het 25 verlagen van de binding van endogene liganden aan RAGE kunnen symptomen die zijn geassocieerd met RAGE-bemiddelde stoornissen worden verlaagd. Oplosbaar RAGE (sRAGE) is in staat op effectieve wijze de binding van liganden van RAGE aan RAGE tegen te werken. sRAGE kan echter, wanneer het in vivo wordt toegediend, een half-waardetijd hebben die te kort kan zijn om op therapeutische wijze bruikbaar te zijn 30 voor één of meer stoornissen. Er is aldus een noodzaak verbindingen te ontwikkelen die de binding van AGE’s en andere fysiologische liganden aan de RAGE-receptor tegen werken waarbij de verbinding een gewenst farmacokinetisch profiel heeft.

4

SAMENVATTING

Uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding omvatten fusie-eiwitten van RAGE en werkwijzen voor het gebruik van dergelijke eiwitten. De onderhavige uitvin-5 ding kan op een verscheidenheid van wijzen worden uitgevoerd. Uitvoerings-vormen van de onderhavige uitvinding kunnen een RAGE-fusie-eiwit omvatten dat een RAGE-polypeptide gekoppeld aan een tweede niet-RAGE polypeptide omvat. In één uitvoeringsvorm omvat het RAGE-fusie-eiwit een bindingsplaats voor een ligand van RAGE. Het RAGE-fusie-eiwit kan verder een RA GE-polypeptide omvatten dat op directe wij-10 ze is gekoppeld aan een polypeptide dat het C^-domein van een immunoglobuline of een deel van het CH2-domein omvat.

De onderhavige uitvinding omvat ook een werkwijze voor het maken van een RAGE-fusie-eiwit. In één uitvoeringsvorm omvat de werkwijze het koppelen van een RAGE-polypeptide aan een tweede niet-RAGE-polypeptide. In één uitvoeringsvorm 15 omvat het RAGE-polypeptide een bindingsplaats voor een ligand van RAGE. De werkwijze kan omvatten het koppelen van een RAGE-polypeptide op directe wijze aan een polypeptide dat het Cn2-domein van een immunoglobuline of een deel van het Cn2-domein omvat.

In andere uitvoeringsvormen kan de onderhavige uitvinding werkwijzen en pre-20 paraten voor het behandelen van een RAGE-bemiddelde stoornis bij een patiënt omvatten. De werkwijze kan het toedienen van een RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding aan de patiënt omvatten. Het preparaat kan een RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding in een farmaceutisch aanvaardbare drager omvatten.

Er zijn verscheidene voordelen die met specifieke uitvoeringsvormen van de on-25 derhavige uitvinding kunnen zijn geassocieerd. In één uitvoeringsvorm kunnen de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding metabool stabiel zijn wanneer ze aan een patiënt worden toegediend. De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen ook binding aan liganden van RAGE met hoge affiniteit vertonen. Bij bepaalde uitvoeringsvormen binden de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uit-30 vinding aan liganden van RAGE met affiniteiten in het traject van hoog nanomolair tot laag micromolair. Door binding met hoge affiniteit aan fysiologische liganden van RAGE, kunnen de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding worden ge- 5 bruikt voor het remmen van binding van endogene liganden aan RAGE, waardoor middelen worden verschaft voor het verzwakken van RAGE-bemiddelde ziekten.

De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen ook in de vorm van eiwit of nucleïnezuur worden verschaft. In één voorbeeld van een uitvoeringsvorm 5 kan het RAGE-fusie-eiwit systemisch worden toegediend en in het vaatstelsel blijven om mogelijk vasculaire ziekten die gedeeltelijk worden bemiddeld door RAGE te behandelen. In een ander voorbeeld van een uitvoeringsvorm kan het RAGE-fusie-eiwit lokaal worden toegediend voor het behandelen van ziekten waarbij liganden van RAGE bijdragen aan de pathologie van de ziekte. Als alternatief kan een nucleïnezuur-10 construct dat voor het RAGE-fusie-eiwit codeert op een plaats worden afgeleverd door het gebruik van een geschikte drager zoals een virus of kaal DNA waarbij transiënte lokale expressie lokaal de interactie tussen liganden van RAGE en receptoren kan remmen. Toediening kan aldus transiënt (bijvoorbeeld zoals wanneer het RAGE-fusie-eiwit wordt toegediend) of meer permanent van aard (bijvoorbeeld zoals wanneer het 15 RAGE-fusie-eiwit als een recombinant DNA wordt toegediend) zijn.

Er zijn aanvullende kenmerken van de uitvinding die hierna zullen worden beschreven. Het moet duidelijk zijn dat de uitvinding wat betreft de toepassing ervan niet is beperkt tot de details die in de volgende conclusies, beschrijving en figuren zijn uiteengezet. De uitvinding kan in andere uitvoeringsvormen worden gebruikt en kan op 20 verscheidene wijzen worden gebruikt en worden uitgevoerd.

KORTE BESCHRIJVING VAN DE FIGUREN

Verscheidene kenmerken, aspecten en voordelen van de onderhavige uitvinding 25 zullen duidelijker worden met verwijzing naar de volgende figuren.

Figuur 1 toont verscheidene sequenties van RAGE en immunoglobuline-sequenties die in overeenstemming met andere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding zijn: Paneel A, SEQ ID NO: 1, de aminozuursequentie voor humaan RAGE; en SEQ ID NO: 2 de aminozuursequentie voor humaan RAGE zonder de signaalse-30 quentie van aminozuren 1-22; Paneel B, SEQ ID NO: 3, de aminozuur-sequentie voor humaan RAGE zonder de signaalsequentie van aminozuren 1-23; Paneel C, SEQ ID NO: 4, de aminozuursequentie van humaan sRAGE; SEQ ID NO: 5, de aminozuursequentie van humaan sRAGE zonder de signaalsequentie van aminozuren 1-22, en SEQ

6 ID NO: 6, de aminozuursequentie van humaan sRAGE zonder de signaalsequentie van aminozuren 1-23; Paneel D, SEQ ID NO: 7, een aminozuursequentie die het V-domein omvat van humaan RAGE omvat; SEQ ID NO: 8, een andere aminozuursequentie die het V-domein van humaan RAGE omvat; SEQ ID NO: 9, een N-eindstandig fragment 5 van het V-domein van humaan RAGE; SEQ ID NO: 10, een ander N-eindstandig fragment van het V-domein van humaan RAGE; SEQ ID NO: 11, de aminozuursequentie voor aminozuren 124-221 van humaan RAGE; SEQ ID NO: 12, de aminozuursequentie voor aminozuren 227-317 van humaan RAGE; SEQ ID NO: 13, de aminozuursequentie voor aminozuren 23-123 van humaan RAGE; Paneel E, SEQ ID NO: 14, de amino-10 zuursequentie voor aminozuren 24-123 van humaan RAGE; SEQ ID NO: 15, de aminozuursequentie voor aminozuren 23-136 van humaan RAGE; SEQ ID NO: 16, de aminozuursequentie voor aminozuren 24-136 van humaan RAGE; SEQ ID NO: 17, de aminozuursequentie voor aminozuren 23-226 van humaan RAGE; SEQ ID NO: 18, de aminozuursequentie voor aminozuren 24-226 van humaan RAGE; Paneel F, SEQ ID 15 NO: 19, de aminozuursequentie voor aminozuren 23-251 van humaan RAGE; SEQ ID NO: 20, de aminozuursequentie voor aminozuren 24-251 van humaan RAGE; SEQ ID NO: 21, een interdomein linker van RAGE; SEQ ID NO: 22, een tweede interdomein linker van RAGE; SEQ ID NO: 23, een derde interdomein linker van RAGE; SEQ ID NO: 24, een vierde interdomein linker van RAGE; Paneel G, SEQ ID NO: 25, DNA 20 dat codeert voor aminozuren 1-118 van humaan RAGE; SEQ ID NO: 26, DNA dat codeert voor aminozuren 1-123 van humaan RAGE; en SEQ ID NO: 27, DNA dat codeert voor aminozuren 1-136 van humaan RAGE; Paneel H, SEQ ID NO: 28, DNA dat codeert voor aminozuren 1-230 van humaan RAGE; SEQ ID NO: 29, DNA dat codeert voor aminozuren 1-251 van humaan RAGE; Paneel I, SEQ ID NO: 38, een gedeeltelij-25 ke aminozuursequentie voor de Ch2- en C^-domeinen van humaan IgG; SEQ ID NO:39, DNA dat codeert voor een deel van de humane Ch2- en C^-domeinen van humaan IgG; SEQ ID NO: 40, een aminozuursequentie voor de Ch2- en CH3-domeinen van humaan IgG; Paneel J, SEQ ID NO: 41, een DNA dat codeert voor de humane Ch2- en Cn3-domeinen van humaan IgG; SEQ ID NO: 42, een aminozuursequentie 30 voor het CH2-domain van humaan IgG; SEQ ID NO: 43, een aminozuursequentie voor het Cn3-domein van humaan IgG; en SEQ ID NO: 44, een vijfde interdomein linker van RAGE.

7

Figuur 2 toont de DNA-sequentie (SEQ ID NO: 30) van een eerste coderend gebied voor RAGE-fusie-eiwit (TTP-4000) dat in overeenstemming is met een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding. Coderende sequentie 1-753 dat in vetgedrukte letters is gemarkeerd codeert voor de N-eindstandige eiwitsequentie van RAGE ter-5 wijl sequentie 754-1386 voor de eiwitsequentie van humaan IgG (γΐ) codeert.

Figuur 3 toont de DNA-sequentie (SEQ ID NO: 31) van het coderende gebied van een tweede RAGE-fusie-eiwit (TTP-3000) dat in overeenstemming is met een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding. Coderende sequentie 1-408 dat in vetgedrukte letters is gemarkeerd codeert voor N-eindstandige eiwitsequentie van RAGE 10 terwijl sequentie 409-1041 voor eiwitsequentie van humaan IgG (γ 1) codeert.

Figuur 4 toont de aminozuursequenties, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 en SEQ ID NO: 34, die elk coderen voor een RAGE-fusie-eiwit met vier domeinen dat in overeenstemming is met andere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding. RAGE-sequentie is in vetgedrukte letters gemarkeerd.

15 Figuur 5 toont de aminozuursequenties, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 en SEQ ID NO: 37, die elk coderen voor een RAGE-fusie-eiwit met drie domeinen dat in overeenstemming is met andere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding. RAGE-sequentie is in vetgedrukte letters gemarkeerd.

Figuur 6, Paneel A, toont een vergelijking van de eiwitdomeinen van humaan 20 RAGE en humaan Ig gamma-1 Fc-eiwit en splitsingspunten die worden gebruikt voor het maken van TTP-3000 (op positie 136) en TTP-4000 (op positie 251) in overeenstemming met andere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding; en Paneel B toont de domeinstructuur voor TTP-3000 en TTP-4000 die in overeenstemming is met andere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding.

25 Figuur 7 toont resultaten van een in vitro bindingstest voor sRAGE en een eerste RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 (TT4) en een tweede RAGE-fusie-eiwit TTP-3000 (TT3), aan de RAGE-liganden amyloïde-bèta (A-bèta), SI00b (SI00) en amfoterine (Ampho), die in overeenstemming is met een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding.

Figuur 8 toont resultaten van een in vitro bindingstest voor een eerste RAGE-30 fusie-eiwit TTP-4000 (TT4) (“Proteïne”) aan amyloïde-bèta in vergelijking met een negatieve controle die alleen het reagens voor immuundetectie omvat (“alleen complex”) en antagonisme van een dergelijke binding door een antagonist van RAGE

8 (“RAGE-ligand”) in overeenstemming met een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding.

Figuur 9 toont resultaten van een in vitro bindingstest voor een tweede RAGE-fusie-eiwit TTP-3000 (TT3) (“Proteïne”) aan amyloïde-bèta in vergelijking met een 5 negatieve controle die alleen het reagens voor immuundetectie omvat (“alleen complex”) en antagonisme van een dergelijke binding door een antagonist van RAGE (“RAGE-ligand”) in overeenstemming met een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding.

Figuur 10 toont de resultaten van een cel-gebaseerde test die de remming meet 10 van S100b-RAGE-geïnduceerde productie van TNF-α door RAGE-fusie-eiwitten TTP- 3000 (TT3) en TTP-4000 (TT4) en sRAGE in overeenstemming met een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding.

Figuur 11 toont een farmacokinetisch profiel voor RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 in overeenstemming met een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding waarbij 15 elke kromme een ander dier onder dezelfde experimentele omstandigheden vertegenwoordigt.

Figuur 12 toont relatieve niveaus van afgifte van TNF-α van THP-1-cellen door stimulatie door RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 en humane IgG stimulatie als een maat van een ontstekingsreactie in overeenstemming met een uitvoeringsvorm van de onder-20 havige uitvinding.

Figuur 13 toont het gebruik van RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 voor het verlagen van restenose bij diabetische dieren in overeenstemming met andere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding, waarbij Paneel A toont dat RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 de intima/media verhouding verlaagde in vergelijking met een negatieve controle 25 (IgG) en Paneel B toont dat RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 proliferatie van vasculaire gladde spiercellen op een dosis-reagerende wijze verlaagde.

Figuur 14 toont het gebruikt van RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 voor het verlagen van amyloïde vorming en cognitieve dysfunctie bij dieren met de ziekte van Alzheimer (AD) in overeenstemming met andere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvin-30 ding, waarbij Paneel A toont dat RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 de hoeveelheid amyloïde in de hersenen verlaagde en Paneel B toont dat RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 cognitieve functie verbeterde.

9

Figuur 15 toont de krommes van verzadiging van binding met TTP-4000 aan verscheidene geïmmobiliseerde bekende RAGE-liganden in overeenstemming met een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding.

Figuur 16 toont verscheidene RAGE-sequenties en immunoglobulinesequenties 5 in overeenstemming met andere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding: Paneel A, SEQ ID NO: 45, de aminozuursequentie van humaan sRAGE zonder de sig-naalsequentie van aminozuren 1-23, waarbij het glutamine-residu aan het N-uiteinde gecycliseerd is voor het vormen van pyroglutaminezuur, SEQ ID NO: 46, een andere aminozuursequentie die het V-domein van humaan sRAGE omvat, waarbij het gluta-10 mine-residu aan het N-uiteinde is gecycliseerd voor het vormen van pyroglutaminezuur, SEQ ID NO: 47, een ander N-eindstandig fragment van het V-domein van humaan RAGE waarbij het glutamine-residu aan het N-uiteinde is gecycliseerd voor het vormen van pyroglutaminezuur, SEQ ID NO: 48, de aminozuursequentie voor aminozuren 24-123 van humaan RAGE, waarbij het glutamine-residu aan het N-uiteinde is 15 gecycliseerd voor het vormen van pyroglutaminezuur; Paneel B, SEQ ID NO: 49, de aminozuursequentie voor aminozuren 24-136 van humaan RAGE waarbij het glutamine-residu aan het N-uiteinde is gecycliseerd voor het vormen van pyroglutaminezuur, SEQ ID NO: 50, de aminozuursequentie voor aminozuren 24-226 van humaan RAGE waarbij het glutamine-residu aan het N-uiteinde is gecycliseerd voor het vormen van 20 pyroglutaminezuur, SEQ ID NO: 51, de aminozuursequentie voor aminozuren 24-251 van humaan RAGE waarbij het glutamine-residu aan het N-uiteinde is gecycliseerd voor het vormen van pyroglutaminezuur; Paneel C, SEQ ID NO: 52, een andere DNA-sequentie die codeert voor een deel van de humane Ch2- en CH3-domeinen van humaan IgG in SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 53, een andere DNA-sequentie die codeert voor 25 de humane Ch2- en CH3-domeinen van humaan IgG in SEQ ID NO: 40.

Figuur 17 toont een andere DNA-sequentie (SEQ ID NO: 54) van een coderend gebied van een eerste RAGE-fusie-eiwit (TTP-4000) in overeenstemming met een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding. Coderende sequentie 1-753 die in vetgedrukte letters is gemarkeerd codeert voor de N-eindstandige eiwitsequentie van RAGE 30 en sequentie 754-1386 codeert voor de eiwitsequentie voor humaan IgG (γΐ).

Figuur 18 toont een andere DNA-sequentie (SEQ ID NO: 55) van een coderend gebied van een tweede RAGE-fusie-eiwit (TTP-3000) die in overeenstemming is met een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding. Coderende sequentie 1-408 die in 10 vetgedrukte letters is gemarkeerd codeert voor de N-eindstandige eiwitsequentie van RAGE en sequentie 409-1041 codeert voor de eiwitsequentie voor humaan IgG (γΐ).

Figuur 19 toont de aminozuursequentie SEQ ID NO: 56 die codeert voor een RAGE-fusie-eiwit van vier domeinen die in overeenstemming is met een andere uitvoe-5 ringsvorm van de onderhavige uitvinding. De RAGE-sequentie is in vetgedrukte letters gemarkeerd.

Figuur 20 toont de aminozuursequentie SEQ ID NO: 57 die codeert voor een RAGE-fusie-eiwit van drie domeinen die in overeenstemming is met een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding. De RAGE-sequentie is in vetgedrukte letters 10 gemarkeerd.

Figuur 21 toont het gebruik van RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 voor het verlagen van de afstoting van allogene transplantaten van cellen van de eilandjes van de alvleesklier die in overeenstemming is met andere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding, waarbij open (niet-gevulde) cirkels niet-behandelde controle dieren aangeven; 15 cirkels met diagonale arcering dieren aangeven die zijn behandeld met TTP-4000 bij een eerste dosering; cirkels met golvende arcering dieren aangeven die zijn behandeld met TTP-4000 bij een tweede dosering; Met ruiten gevulde cirkels dieren aangeven die zijn behandeld met controle PBS; en dichte cirkels dieren aangeven die met controle IgG zijn behandeld.

20 Figuur 22 toont het gebruik van RAGE-fusie-eiwitten TTP-4000 voor het verla gen van de afstoting van syngene transplantaten van cellen van eilandjes van de alvleesklier die in overeenstemming is met andere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding, waarbij open (niet-gevulde) cirkels niet-behandelde controle dieren aangeven; en dichte cirkels dieren aangeven die zijn behandeld met TTP-4000.

25

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING

Voor de doelen van deze specificatie worden, tenzij anders wordt aangegeven, alle getallen die hoeveelheden van bestanddelen, reactie-omstandigheden, enzovoort 30 aangeven die in de specificatie worden gebruikt, bedoeld in alle gevallen te worden gemodificeerd door de term “ongeveer”. Dienovereenkomstig zijn tenzij het tegengestelde wordt aangegeven de numerieke parameters die in de volgende specificatie uiteengezet zijn benaderingen die kunnen variëren afhankelijk van de gewenste eigen- 11 schappen die worden gezocht om te worden verkregen door de onderhavige uitvinding. Op het minst en niet als een poging om de toepassingen van de doctrine van equivalenten van de beschermingsomvang van de conclusies te beperken zou elke numerieke parameter tenminste moeten worden beschouwd met het oog op het aantal vermelde 5 significante getallen en door het toepassen van de gewoonlijke technieken van afronding.

Ondanks dat de numerieke trajecten en parameters die de brede beschermingsomvang van de uitvinding uiteenzetten benaderingen zijn, zijn de numerieke waarden die uiteengezet zijn in de specifieke voorbeelden zo precies als mogelijk vermeld. Elke 10 numerieke waarde bevat echter inherent bepaalde fouten die noodzakelijkerwijs resulteren van de standaardafwijking die in de onderscheidenlijke metingen van testen worden gevonden. Het moet bovendien duidelijk zijn dat alle trajecten die hierin zijn beschreven elke en alle subtrajecten die daarin zijn opgenomen omvatten. Een gesteld traject van “1 tot 10” zou bijvoorbeeld moeten worden beschouwd elke en alle subtrajecten 15 tussen (en waaronder) de minimale waarde van 1 en de maximale waarde van 10 te omvatten; dat wil zeggen, alle subtrajecten die met een minimale waarde van 1 of meer beginnen, bijvoorbeeld 1 tot 6,1 en eindigen met een maximale waarde van 10 of lager, bijvoorbeeld 5,5 tot 10. In aanvulling moet elke verwijzing waarnaar hierin wordt verwezen als “hierin opgenomen” worden begrepen als in het geheel opgenomen.

20 Het moet verder worden opgemerkt dat, zoals in deze specificatie wordt gebruikt, de enkelvoudige vormen “een”, “de” en “het” verwijzingen in het meervoud omvatten tenzij uitdrukkelijk en ondubbelzinnig tot één verwijzing wordt beperkt. De term “of’ wordt onderling uitwisselbaar gebruikt met de term “en/of ’ tenzij de samenhang duidelijk anders aangeeft.

25 De termen “deel” en “fragment” worden ook onderling uitwisselbaar gebruikt om te verwijzen naar delen van een polypeptide, nucleïnezuur of ander moleculair construct.

“Polypeptide” en “eiwit” worden hierin onderling uitwisselbaar gebruikt voor het beschrijven van eiwitmoleculen die ofwel gedeeltelijke eiwitten of eiwitten met de vol-30 ledige lengte kunnen omvatten.

Zoals in het vakgebied bekend is zijn “eiwitten”, “peptiden”, “polypeptiden” en “oligopeptiden” ketens van aminozuren (kenmerkend L-aminozuren) waarvan de alfa-koolstoffen zijn gekoppeld door middel van peptidebindingen die worden gevormd 12 door een condensatiereactie tussen de carboxylgroep van de alfa-koolstof van één aminozuur en de aminogroep van de alfa-koolstof van een ander aminozuur. De aminozuren die een eiwit vormen zijn kenmerkend in volgorde genummerd, beginnend bij het amino-eindstandige residu en toenemend in de richting van het carboxy-eindstandige 5 residu van het eiwit.

Zoals hierin wordt gebruikt verwijst de term “stroomopwaarts” naar een residu dat N-eindstandig is aan een tweede residu wanneer het molecuul een eiwit is of 5’ aan een tweede residu wanneer het molecuul een nucleïnezuur is. Zoals hierin ook wordt gebruikt verwijst de term “stroomafwaarts” naar een residu dat C-eindstandig is aan 10 een tweede residu wanneer het molecuul een eiwit is, of 3’ aan een tweede residu wanneer het molecuul een nucleïnezuur is.

Tenzij anders wordt gedefinieerd hebben alle technische en wetenschappelijke termen die hierin worden gebruikt dezelfde betekenis zoals die algemeen duidelijk is bij de deskundigen in het vakgebied. Deskundigen worden in het bijzonder verwezen 15 naar Current Protocols in Molecular Biology (zie bijvoorbeeld Ausubel, F.M. et al, Short Protocols in Molecular Biology, 4de editie, Hoofdstuk 2, John Wiley & Sons, N.Y.) voor definities en termen van het vakgebied. Afkortingen voor aminozuur-residuen zijn de standaard 3-letter en/of 1 -letter codes die in het vakgebied worden gebruikt om te verwijzen naar één van de 20 algemene L-aminozuren.

20 Een “nucleïnezuur” is een polynucleotide zoals deoxyribonucleïnezuur (DNA) of ribonucleïnezuur (RNA). De term wordt gebruikt om enkelstrengs nucleïnezuren, dub-belstrengs nucleïnezuren en RNA en DNA dat van nucleotide of nucleoside-analoga is gemaakt te omvatten.

De term “vector” verwijst naar een nucleïnezuurmolecuul dat kan worden ge-25 bruikt voor het transporteren van een tweede nucleïnezuurmolecuul in een cel. In één uitvoeringsvorm maakt de vector replicatie van DNA-sequenties die in de vector zijn geïnsereerd mogelijk. De vector kan een promoter omvatten voor het verhogen van de expressie van het nucleïnezuurmolecuul in tenminste sommige gastheercellen. Vectoren kunnen op autonome wijze (extrachromosomaal) repliceren of kunnen in een chro-30 mosoom van de gastheercel zijn geïntegreerd. In één uitvoeringsvorm kan de vector een expressievector omvatten die in staat is een eiwit te produceren dat afkomstig is van tenminste een deel van een nucleïnezuursequentie die in de vector is geïnsereerd.

13

Zoals in het vakgebied bekend is kunnen omstandigheden voor het aan elkaar hy-bridiseren van nucleïnezuursequenties worden beschreven als variërend van lage naar hoge stringentie. Hoge stringente hybridisatie-omstandigheden verwijzen in het algemeen naar het wassen van hybriden in buffer met laag zoutgehalte bij hoge temperatu-5 ren. Hybridisatie kan aan filter gebonden DNA zijn door het gebruik van hybridisatie-oplossingen die in het vakgebied standaard zijn, zoals 0,5 M NaHPC>4, 7% natriumdo-decylsulfaat (SDS), bij 65°C en wassen in 0,25 M NaHPOi, 3,5% SDS gevolgd door wassen in 0,1 x SSC/0,1% SDS bij een temperatuur die varieert van kamertemperatuur tot 68°C afhankelijk van de lengte van de probe (Ausubel et al.). Een was bij hoge 10 stringentie omvat bijvoorbeeld wassen in 6x SSC/0,05% natriumpyrofosfaat bij 37°C voor een oligonucleotide-probe van 14 basen of bij 48°C voor een oligonucleotide-probe van 17 basen of bij 55°C voor een oligonucleotideprobe van 20 basen, of bij 60°C voor een oligonucleotide-probe van 25 basen, of bij 65 °C voor een nucleotide-probe met een lengte van ongeveer 250 nucleotiden. Nucleïnezuurprobes kunnen met 15 radionucleotiden worden gemerkt door eindstandig merken met bijvoorbeeld [γ-32P]ATP of incorporatie van radioactief gemerkte nucleotiden zoals [a-32P]dCTP door willekeurige labelling met primers. Als alternatief kunnen probes worden gemerkt door incorporatie van gebiotinyleerde of fluoresceïne-gemerkte nucleotiden en de probe wordt gedetecteerd door het gebruik van Streptavidine of anti-fluoresceïne antilicha-20 men.

Zoals hierin wordt gebruikt zijn “kleine organische moleculen” moleculen met een molecuulgewicht van lager dan 2.000 Dalton die tenminste één koolstofatoom bevatten.

De term “fusie-eiwit” verwijst naar een eiwit of polypeptide dat een aminozuur-25 sequentie heeft die afkomstig is van twee of meer eiwitten. Het fusie-eiwit kan ook het koppelen van gebieden van aminozuren tussen delen van aminozuren die van afzonderlijke eiwitten zijn verkregen omvatten.

Zoals hierin wordt gebruikt is een “niet-RAGE-polypeptide” elk polypeptide dat niet afkomstig is van RAGE of een fragment daarvan. Dergelijke niet-RAGE-30 polypeptiden omvatten immunoglobuline-peptiden, dimeriserende polypeptiden, stabiliserende polypeptiden, amfifiele peptiden of polypeptiden die aminozuur-sequenties omvatten die “merkers” voor het doelgericht sturen of zuiveren van het eiwit verschaffen.

14

Zoals hierin wordt gebruikt kunnen “immunoglobuline-peptiden” een zware keten van een immunoglobuline of een deel daarvan omvatten. In één uitvoeringsvorm kan het deel van de zware keten het Fc-fragment of een deel daarvan zijn. Zoals hierin wordt gebruikt omvat het Fc-fragment het schamierpolypeptide van de zware keten en 5 de Ch2- en Ch3-domeinen van de zware keten van een immunoglobuline in ofwel mo-nomere of dimere vorm. Het ChI- en Fc-fragment kunnen ook als het immunoglobuli-ne-polypeptide worden gebruikt. De zware keten (of deel daarvan) kan afkomstig zijn van elk van de bekende isotypen van zware ketens: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε) of IgA (a). In aanvulling kan de zware keten (of deel daarvan) afkomstig zijn van elk van 10 de bekende subtypen van zware ketens: IgGl (γΐ), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgAl (al), IgA2 (a2), of mutaties van deze isotypen of subtypen die de biologische activiteit veranderen. Een voorbeeld van biologische activiteit die kan worden veranderd omvat verlaging van het vermogen van een isotype om te binden aan sommige Fc-receptoren zoals bijvoorbeeld door modificatie van het schamiergebied.

15 De termen “overeenkomst” of “percentage overeenkomst” verwijst naar sequen- tie-overeenkomst tussen twee aminozuursequenties of tussen twee nucleïnezuur-sequenties. Percentage overeenkomst kan worden bepaald door het positioneren van twee sequenties en verwijst naar het aantal identieke residuen (d.w.z. aminozuur of nucleotiden) op posities die worden gedeeld door de sequenties de worden vergeleken. 20 Sequentie-positionering en vergelijking kan worden uitgevoerd door het gebruik van de algoritmen die in het vakgebied standaard zijn (bijvoorbeeld Smith en Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman en Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443; Pearson en Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 85:2444) of door gecomputeriseerde versies van deze algoritmen (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics 25 Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI) die publiekelijk verkrijgbaar zijn als BLAST en FASTA. Ook, ENTREZ, verkrijgbaar door middel van de National Institutes of Health, Bethesda MD, kan voor de sequentievergelijking worden gebruikt. In één uitvoeringsvorm kan het percentage overeenkomst van twee sequenties worden bepaald door het gebruik van GCG met een gap weight van 1, zodanig dat elk tussen-30 ruimte van een aminozuur wordt gewogen alsof het een enkele verkeerde paring van aminozuren tussen de twee sequenties is.

Zoals hierin wordt gebruikt verwijst de term “geconserveerde residuen” naar aminozuren die hetzelfde zijn onder een verscheidenheid van eiwitten die dezelfde 15 structuur en/of functie hebben. Een gebied van geconserveerde residuen kan belangrijk zijn voor eiwitstructuur en functie. Opeenvolgende geconserveerde residuen zoals ze in een driedimensionaal eiwit worden geïdentificeerd kunnen aldus belangrijk zijn voor de structuur en functie van een eiwit. Voor het vinden van geconserveerde residuen of 5 geconserveerde gebieden van een 3-D-structuur kan een vergelijking van sequenties voor dezelfde of overeenkomstige eiwitten van verschillende soorten of van individuen van dezelfde soort worden uitgevoerd.

Zoals hierin wordt gebruikt betekent de term “homoloog” een polypeptide dat een mate van homologie heeft met de wildtype aminozuursequentie. Vergelijkingen op ho-10 mologie kan door middel van het oog worden uitgevoerd of meer gebruikelijk met behulp van eenvoudig verkrijgbare programma’s voor sequentievergelijking. Deze in de handel verkrijgbare computerprogramma’s kunnen het percentage homologie tussen twee of meer sequenties berekenen (bijvoorbeeld Wilbur, W. J. en Lipman, D. J., 1983, Proc. Nail. Acad Sci. USA, 80:726-730). Homologe sequenties kunnen bijvoorbeeld 15 worden beschouwd aminozuursequenties te omvatten die in andere uitvoeringsvormen tenminste 70% identiek, 75% identiek, 80% identiek, 85% identiek, 90% identiek, 95% identiek, 97% identiek, of 98% identiek, of 99% identiek aan elkaar zijn.

Zoals hierin wordt gebruikt omvat de term tenminste 90% identiek daarmee sequenties die variëren van 90 tot 99,99% overeenkomst met de aangegeven sequenties 20 en omvat alle trajecten daartussen. De term tenminste 90% identiek daarmee omvat aldus sequenties die 91, 91,5, 92, 92,5, 93, 93,5, 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5 procent identiek zijn aan de aangegeven sequentie. Op overeenkomstige wijze omvat de term “tenminste 70% identiek” sequenties die variëren van 70 tot 99,99% identiek, met alle trajecten daartussen. De bepaling van percentage overeen-25 komst wordt bepaald door het gebruik van algoritmen die hier zijn beschreven.

Zoals hierin wordt gebruikt omvat een polypeptide of eiwit “domein” een gebied bij een polypeptide of eiwit dat een onafhankelijke eenheid omvat. Domeinen kunnen worden gedefinieerd in termen van structuur, sequentie en/of biologische activiteit. In één uitvoeringsvorm kan een polypeptidedomein een gebied van een eiwit omvatten dat 30 op een wijze vouwt die nagenoeg onafhankelijk is van de rest van het eiwit. Domeinen kunnen worden geïdentificeerd door het gebruik van gegevensbanken van domeinen zoals maar niet beperkt tot PFAM, PRODOM, PROSITE, BLOCKS, PRINTS, SBASE, ISREC PROFILES, SAMRT en PROCLASS.

16

Zoals hierin wordt gebruikt is een “immunoglobuline-domein” een sequentie van aminozuren die structureel homoloog is of identiek is aan een domein van een immunoglobuline. De lengte van de sequentie van aminozuren van een immunoglobuline-domein kan van elke lengte zijn. ïn één uitvoeringsvorm kan een immunoglobuline-5 domein kleiner zijn dan 250 aminozuren. In een voorbeeld van een uitvoeringsvorm kan een immunoglobuline-domein ongeveer 80-150 aminozuren in lengte zijn. Het variabele gebied en de ChK Ch2- en Cn3-gebieden van een IgG zijn elk bijvoorbeeld immunoglobuline-domeinen. In een ander voorbeeld zij de variabele, de ChI-, Ch2-, Ch3- en CH4-gebieden van een IgM elk immunoglobuline-domeinen.

10 Zoals hierin wordt gebruikt is een “RAGE-immunoglobuline-domein” een se quentie van aminozuren van RAGE-eiwit die structureel homoloog is of identiek is aan een domein van een immunoglobuline. Een RAGE-immunoglobuline-domein kan bijvoorbeeld het V-domein van RAGE, het Ig-achtige C2-type 1 domein van RAGE (“Cl-domein) of het Ig-achtige C2-type 2-domein (“C2-domein”) van RAGE omvatten.

15 Zoals hierin wordt gebruikt omvat een “interdomein linker” een polypeptide dat twee domeinen tezamen verbindt. Een Fc-schamiergebied is een voorbeeld van een interdomein linker in een IgG.

Zoals hierin wordt gebruikt identificeert “direct gekoppeld” een covalente koppeling tussen twee verschillende groepen (bijvoorbeeld nucleïnezuursequenties, polypep-20 tiden, polypeptide-domeinen) die geen tussenliggende atoom tussen de twee groepen die worden gekoppeld heeft.

Zoals hierin wordt gebruikt verwijst “ligand-bindend domein” naar een domein van een eiwit dat verantwoordelijk is voor het binden van een ligand. De term ligand-bindend domein omvat homologen van een ligand-bindend domein of delen daarvan. In 25 dit opzicht kunnen opzettelijke aminozuursubstituties in de ligand-bindende plaats worden gemaakt op basis van overeenkomst in polariteit, lading, oplosbaarheid, hydro-fobiciteit of hydrofiliteit van de residuen zolang de bindingsspecificiteit van het ligand-bindende domein wordt behouden.

Zoals hierin wordt gebruikt omvat een “ligand bindingsplaats” residuen in een 30 eiwit die op directe wijze in interactie vertonen met een ligand of residuen die zijn betrokken bij het positioneren van het ligand in dichte nabijheid aan die residuen die op directe wijze met het ligand interactie vertonen. De interactie van residuen in de ligand-bindende plaats kan worden bepaald door de ruimtelijke nabijheid van de residuen met 17 een ligand in het model of de structuur. De term ligand-bindende plaats omvat homologen van een ligand-bindende plaats of delen daarvan. In dit opzicht kunnen opzettelijke aminozuursubstituties in de ligand-bindende plaats worden gemaakt op basis van overeenkomst in polariteit, lading, oplosbaarheid, hydrofobiciteit of hydrofiliteit van de 5 residuen zolang de bindingsspecificiteit van de ligand-bindende plaats wordt behouden. Een ligand-bindende plaats kan in één of meer ligand-bindende domeinen van een eiwit of polypeptide voorkomen.

Zoals hierin wordt gebruikt verwijst de term ’’interactie” naar een omstandigheid van nabijheid tussen een ligand of verbinding of delen of fragmenten daarvan en een 10 deel van een tweede molecuul van belang. De interactie kan niet-covalent zijn, bijvoorbeeld als een resultaat van waterstofbinding, van der Waals interacties of elektrostatische of hydrofobe interacties of het kan covalent zijn.

Zoals hierin wordt gebruik verwijst “ligand” naar een molecuul of verbinding of eenheid die interactie vertoont met een ligand bindingsplaats, waaronder substraten of 15 analoga of delen daarvan. Zoals hierin is beschreven kan de term “ligand” verwijzen naar verbindingen die aan het eiwit van belang binden. Een ligand kan een agonist, een antagonist of een modulator zijn. Of een ligand kan geen biologisch effect hebben. Of een ligand kan de binding van andere liganden blokkeren waardoor een biologisch effect wordt geremd. Liganden kunnen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, remmers in 20 de vorm van kleine moleculen. Deze kleine moleculen kunnen peptiden, peptidomime-tica, organische verbindingen en dergelijke omvatten. Liganden kunnen ook polypepti-den en/of eiwitten omvatten.

Zoals hierin wordt gebruikt verwijst een “modulerende verbinding” naar een molecuul dat de biologische activiteit van een molecuul van belang verandert of verwis-25 selt. Een modulerende verbinding kan activiteit verhogen of verlagen of de fysische of chemische kenmerken of functionele of immunologische eigenschappen van het molecuul van belang veranderen. Voor RAGE kan een modulerende verbinding activiteit verhogen of verlagen of de kenmerken of functionele of immunologische eigenschappen van het RAGE of een deel daarvan veranderen. Een modulerende verbinding kan 30 natuurlijke en/of chemisch gesynthetiseerde of kunstmatige peptiden, gemodificeerde peptiden (bijvoorbeeld fosfopeptiden), antilichamen, koolhydraten, monosacchariden, oligosacchariden, polysacchariden, glycolipiden, heterocyclische verbindingen, nucleo-siden of nucleosiden of delen daarvan en kleine organische of anorganische moleculen 18 omvatten. Een modulerende verbinding kan een endogene fysiologische verbinding zijn of het kan een natuurlijke of synthetische verbinding zijn. Of de modulerende verbinding kan een klein organisch molecuul zijn. De term “modulerende verbinding” omvat ook een chemisch gemodificeerde ligand of verbinding en omvat isomeren en racemi-5 sche vormen.

Een “agonist” omvat een verbinding die aan een receptor bindt voor het vormen van een complex dat een farmacologische respons opwekt die specifiek is voor de betrokken receptor.

Een “antagonist” omvat een verbinding die aan een agonist of aan een receptor 10 bindt voor het vormen van een complex dat niet resulteert in een aanzienlijke farmacologische respons en de biologische respons die door een agonist wordt geïnduceerd kan remmen.

RAGE-agonisten kunnen daardoor aan RAGE binden en RAGE-bemiddelde cellulaire processen stimuleren en RAGE-antagonisten kunnen RAGE-bemiddelde proces-15 sen remmen om te worden gestimuleerd door een RAGE-agonist. In één uitvoeringsvorm omvat het cellulaire proces dat door RAGE-agonisten wordt gestimuleerd bijvoorbeeld activering van transcriptie van het TNF-a-gen.

De term “peptidomimetica” verwijst naar structuren die dienen als substituenten voor peptiden bij interacties tussen moleculen (Morgan et al., 1989, Ann. Reports Med. 20 Chem., 24:243-252). Peptidomimetica kunnen synthetische structuren omvatten die wel of niet aminozuren en/of peptidebindingen kunnen bevatten maar die de structurele en functionele kenmerken van een peptide of agonist of antagonist behouden. Peptidomimetica omvatten ook peptoïden, oligopeptoïden (Simon et al, 1972, Proc. Natl. Acad, Sci., USA, 89:9367); en peptide-bibliotheken die peptiden van een ontworpen lengte 25 bevatten die alle mogelijke sequenties van aminozuren die met een peptide of agonist of antagonist van de uitvinding overeenkomen vertegenwoordigen.

De term “behandeling” of “behandelt” verwijst naar het verbeteren van een symptoom van een ziekte of stoornis en kan het genezen van de stoornis omvatten, waarbij het begin van de stoornis nagenoeg wordt voorkomen of de conditie van de 30 patiënt wordt verbeterd. De term “behandeling” zoals hierin wordt gebruikt verwijst naar het volledige spectrum van behandelingen voor een bepaalde stoornis waaraan de patiënt lijdt, waaronder het verlichten van één symptoom of de meeste symptomen die 19 resulteren van die stoornis, een genezing voor de specifieke stoornis of het voorkomen van het begin van de stoornis.

Zoals hierin wordt gebruikt wordt de term “EC50” gedefinieerd als de concentratie van een middel die in 50% van een gemeten biologisch effect resulteert. De EC50 5 van een therapeutisch middel dat een meetbaar biologisch effect heeft kan bijvoorbeeld de waarde waarbij het middel 50% van het biologische effect vertoond omvatten.

Zoals hierin wordt gebruikt wordt de term “IC50” gedefinieerd als de concentratie van een middel die resulteert in 50% remming van een gemeten effect. De IC50 van een antagonist van binding van RAGE kan bijvoorbeeld de waarde omvatten waarbij de 10 antagonist binding van het ligand aan de ligand-bindende plaats van RAGE met 50% verlaagt.

Zoals hierin wordt gebruikt betekent een “effectieve hoeveelheid” de hoeveelheid van een middel die effectief is voor het produceren van een gewenst effect bij een patient. De term “therapeutisch effectieve hoeveelheid” geeft die hoeveelheid van een ge-15 neesmiddel of farmaceutisch middel aan die een therapeutische respons van een dier of mens die men zoekt zal opwekken. De werkelijke dosis die de effectieve hoeveelheid omvat kan afhangen van de route van toediening, de grootte en gezondheid van de patient, de stoornis die wordt behandeld en dergelijke.

De term “farmaceutisch aanvaardbare drager” zoals hierin wordt gebruikt kan 20 verwijzen naar verbindingen en preparaten die geschikt zijn voor gebruik bij patiënten dat mensen of dieren zijn, zoals bijvoorbeeld voor therapeutische preparaten die worden toegediend voor de behandeling van een RAGE-bemiddelde stoornis of ziekte.

De term “farmaceutisch preparaat” wordt hierin gebruikt om een preparaat aan te geven dat aan een zoogdierlijke gastheer kan worden toegediend op bijvoorbeeld orale, 25 parenterale, topicale wijze, door inhalatie spray, intranasale wijze of rectale wijze, in preparaten voor eenheidsdosering die gebruikelijke niet-toxische dragers, verdun-ningsmiddelen, adjuvans, hulpstoffen en dergelijke bevatten.

De term “parenteraal” zoals hierin wordt gebruikt omvat subcutane injecties, intraveneuze, intramusculaire, intracistemale injectie of technieken van infusie.

30 Zoals hierin wordt gebruikt verwijst “afstoting” naar de immuun- of ontsteking- reactie op weefsel die leidt tot vernietiging van cellen, weefsels of organen of die leidt tot schade aan cellen, weefsels of organen. De afgestoten cellen, weefsel of orgaan kan 20 afkomstig zijn van dezelfde patiënt die de afweerreactie opwekt of kan van een andere patiënt in de patiënt die afstoting vertoont zijn getransplanteerd.

Zoals hierin wordt gebruikt verwijst de term “cel” naar de structurele en functionele eenheden van een zoogdierlijk levend systeem die elk een onafhankelijk levend 5 systeem omvatten. Zoals in het vakgebied bekend is omvatten cellen een kern, cyto-plasma, intracellulaire organellen en een celwand die de cel omgeeft en het mogelijk maakt dat de cel onafhankelijk is van andere cellen.

Zoals hierin wordt gebruikt verwijst de term “weefsel” naar een aggregaat van cellen die een overeenkomstige structuur of functie hebben of die tezamen werken voor 10 het uitvoeren van een specifieke functie. Een weefsel kan een verzameling van overeenkomstige cellen en de intercellulaire bestanddelen die de cellen omgeven omvatten. Weefsels omvatten, maar zijn niet beperkt tot, spierweefsel, zenuwweefsel en bot.

Zoals hierin wordt gebruikt verwijst een “orgaan” naar een volledig gedifferentieerde structurele of functionele eenheid in een dier dat voor een bepaalde specifieke 15 functie is gespecialiseerd. Een orgaan kan een groep van weefsel omvatten die een specifieke functie of groep van functies uitoefenen. Organen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, het hart, longen, hersenen, oog, maag, milt, alvleesklier, nieren, lever, dunne darmen, huid, baarmoeder, blaas en bot.

20 RAGE-fusie-eiwitten

Uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding omvatten RAGE-fusie-eiwitten, werkwijzen voor het maken van dergelijke fusie-eiwitten en werkwijzen voor het gebruik van dergelijke fusie-eiwitten. De onderhavige uitvinding kan op een ver-25 scheidenheid van wijzen worden uitgevoerd.

Uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding verschaffen bijvoorbeeld RAGE-fusie-eiwitten die een RAGE-polypeptide gekoppeld aan een tweede niet-RAGE-polypeptide omvatten. In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-fusie-eiwit een bindingsplaats voor een ligand van RAGE omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat de 30 ligand-bindingsplaats het meest N-eindstandige domein van het RAGE-fusie-eiwit. De bindingsplaats voor het ligand van RAGE kan het V-domein van RAGE of een deel daarvan omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat de bindingsplaats voor een ligand van RAGE SEQ ID NO: 9 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ

21 ID NO: 10 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 47 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is.

In een andere uitvoeringsvorm kan de ligand-bindingsplaats aminozuren 23-53 van SEQ ID NO:l omvatten. In een andere uitvoeringsvorm kan de ligand-bindings-5 plaats aminozuren 24-52 van SEQ ID NO: 1 omvatten. In een andere uitvoeringsvorm kan de ligand-bindingsplaats aminozuren 31-52 van SEQ ID NO: 1 omvatten. In een andere uitvoeringsvorm kan de ligand-bindingsplaats aminozuren 31-116 van SEQ ID NO: 1 omvatten. In een andere uitvoeringsvorm kan de ligand- bindingsplaats aminozuren 19-52 van SEQ ID NO: 1 omvatten.

10 In een uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide zijn gekoppeld aan een poly peptide dat een immunoglobuline-domein of een deel daarvan (bijvoorbeeld fragment daarvan) van een immunoglobuline domein omvat. In één uitvoeringsvorm omvat het polypeptide dat een immunoglobuline-domein omvat tenminste een deel van tenminste één van de Ch2- of de CH3-domeinen van een humaan IgG.

15 Een RA GE-eiwit of polypeptide kan een humaan RAGE-eiwit met volledige lengte (bijvoorbeeld SEQ ID NO: 1) of een fragment van humaan RAGE omvatten. Zoals hierin wordt gebruikt heeft een fragment van een RAGE-polypeptide een lengte van tenminste 5 aminozuren en kan in lengte langer dan 30 aminozuren zijn, maar is kleiner dan de volledige aminozuursequentie. In andere uitvoeringsvormen van de ei-20 witten, werkwijzen en preparaten van de onderhavige uitvinding kan het RAGE-polypeptide een sequentie omvatten die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, of 99% identiek is aan humaan RAGE, of een fragment daarvan. In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide bijvoorbeeld humaan RAGE of een fragment daarvan met Glycine als het eerste residu in plaats van een Methionine omvatten 25 (zie bijvoorbeeld Neeper et al, (1992)). Of het humane RAGE kan RAGE met de volledige lengte omvatten waarbij de signaalsequentie is verwijderd (bijvoorbeeld SEQ ID NO: 2 of SEQ ID NO: 3) (Figuren IA en 1B) of een deel van die aminozuursequentie.

De RA GE-fusie-ei witten van de onderhavige uitvinding kunnen ook sRAGE 30 (bijvoorbeeld SEQ ID NO: 4), een polypeptide dat tenminste 90% identiek is aan sRAGE, of een fragment van sRAGE omvatten. Zoals hierin wordt gebruikt is sRAGE het RAGE-eiwit dat niet het transmembraangebied of de cytoplasmatische staart omvat (Park et al, Nature Med., 4:1025-1031 (1998)). Het RAGE-polypeptide kan bijvoor- 22 beeld humaan sRAGE of een fragment daarvan, met Glycine als het eerste residu in plaats van een Methionine omvatten (zie bijvoorbeeld Neeper et al., (1992)). Of een RAGE-polypeptide kan humaan sRAGE waarbij de signaalsequentie is verwijderd omvatten (zie bijvoorbeeld SEQ ID NO: 5 of SEQ ID NO: 6 in Figuur 1C of SEQ ID NO: 5 45 in Figuur 16A) of een deel van die aminozuursequentie.

In andere uitvoeringsvormen kan het RAGE-eiwit een V-domein van RAGE omvatten (zie bijvoorbeeld SEQ ID NO: 7 of SEQ ID NO: 8 in Figuur 1D (Neeper et al, (1992); Schmidt et al. (1997) of SEQ ID NO: 46 in Figuur 16A). Of een sequentie die tenminste 90% identiek is aan het V-domein van RAGE of een fragment daarvan kan 10 worden gebruikt.

Of het RAGE-eiwit kan een fragment van het V-domein van RAGE omvatten (bijvoorbeeld SEQ ID NO: 9 of SEQ ID NO: 10 in Figuur ID of SEQ ID NO: 47 in Figuur 16A). In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-eiwit een ligand-bindingsplaats omvatten. In een uitvoeringsvorm kan de ligand-bindingsplaats SEQ ID NO: 9, of een 15 sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 10, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 47, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, omvatten. In nog een andere uitvoeringsvorm, is het RAGE-fragment een synthetisch peptide.

Het RAGE-polypeptide dat aldus in de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige 20 uitvinding wordt gebruikt kan een fragment van RAGE met de volledige lengte omvatten. Zoals in het vakgebied bekend is omvat RAGE drie immunoglobuline-achtige po-lypeptide-domeinen, het V-domein en de Cl- en C2-domeinen die elk aan elkaar zijn gekoppeld door een interdomein linker. RAGE met de volledige lengte omvat ook een transmembraan polypeptide en een cytoplasmatische staart stroomafwaarts (C-25 eindstandig) van het C2-domein en gekoppeld aan het C2-domein.

In een uitvoeringsvorm, omvat het RAGE-polypeptide geen residuen van een signaalsequentie. De signaalsequentie van RAGE kan ofwel residuen 1 -22 of residuen 1-23 van RAGE met de volledige lengte omvatten. Zoals in het vakgebied bekend is kunnen wanneer het N-uiteinde van het fiisie-eiwit glutamine is (bijvoorbeeld de sig-30 naalsequentie omvat residuen 1-23) het N-eindstandige glutamine (Q24) cycliseren voor het vormen van pyroglutaminezuur (pE). Voorbeeld constructen van dergelijke moleculen zijn getoond als SEQ ID NO’s: 45, 46, 47, 48, 49, 50 en 51, alsook RAGE-fusie-eiwitten die zijn getoond als 56 en 57.

23

Zoals in het vakgebied bekend is kan aan het Cn3-gebied van het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding het C-eindstandige aminozuur zijn afgesplitst door een post-translationele modificatie wanneer het in bepaalde recombinante systemen tot expressie wordt gebracht (zie bijvoorbeeld Li, et al., BioProcessing J., 2005;4, 23-30).

5 In een uitvoeringsvorm, is het C-eindstandige aminozuur dat wordt afgesplitst lysine (K).

In verscheidene uitvoeringsvormen kan het RAGE-polypeptide aminozuren 23-116 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 7) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-116 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 8) of een sequen-10 tie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-116 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 46) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, overeenkomend met het V-domein van RAGE omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 124-221 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 11) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt 15 met het Cl-domein van RAGE, omvatten. In een andere uitvoeringsvorm, kan het RAGE-polypeptide aminozuren 227-317 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 12) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het C2-domein van RAGE omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 23-123 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 13) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of 20 aminozuren 24-123 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 14) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het V-domein van RAGE en een stroomafwaartse interdomein linker, omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 24-123 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 48) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is omvatten. Of het 25 RAGE-polypeptide kan aminozuren 23-226 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 17) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-226 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 18) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het V-domein, het Cl-domein en de interdomein linker die deze twee domeinen koppelt, omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 24-226 30 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 50), of een sequentie die 90% identiek daar aan is, omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 23-339 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 5) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-339 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 6) 24 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met sRAGE (d.w.z. codeert voor de V-, Cl- en C2-domeinen en interdomein linkers) omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 24-339 van humaan RAGE waarbij Q24 cycli-seert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 45) of een sequentie die tenminste 90% 5 identiek daar aan is, omvatten. Of fragmenten van elk van deze sequenties kunnen worden gebruikt.

Het RAGE-fusie-eiwit kan verscheidene soorten van peptiden omvatten die niet afkomstig zijn van RAGE of een fragment daarvan. Het tweede polypeptide van het RAGE-fusie-eiwit kan een polypeptide omvatten dat afkomstig is van een immunoglo-10 buline. In één uitvoeringsvorm kan het immunoglobuline-polypeptide een zware keten van een immunoglobuline of een deel (d.w.z. een fragment) daarvan omvatten. Het fragment van de zware keten kan bijvoorbeeld een polypeptide omvatten dat afkomstig is van een Fc-fragment van een immunoglobuline, waarbij het Fc-fragment het schar-nierpolypeptide van de zware keten en de Ch2- en CH3-domeinen van de zware keten 15 van het immunoglobuline als een monomeer omvat. De zware keten (of deel daarvan) kan afkomstig zijn van één van de bekende isotopen van de zware keten: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε), of IgA (a). In aanvulling kan de zware keten (of deel daarvan) worden verkregen van één van de bekende subtypen van de zware keten: IgGl (yl), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgAl (al), IgA2 (a2), of mutaties van deze isotypen 20 of subtypen die de biologische activiteit veranderen. Het tweede polypeptide kan de Ch2- en Cn3-domeinen van een humaan IgGl of delen van elk of beide van deze domeinen omvatten. Als een voorbeeld van uitvoeringsvormen kan het polypeptide dat de Ch2- en Ch3-domeinen van een humane IgGl of een deel daarvan omvat SEQ ID NO: 38 of SEQ ID NO: 40 omvatten. Het immunoglobuline-peptide kan worden geco-25 deerd door de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO: 39 of SEQ ID NO: 41. De im-munoglobulinesequentie in SEQ ID NO: 38 of SEQ ID NO: 40 kan ook worden gecodeerd door SEQ ID NO: 52 of SEQ ID NO: 53, waarbij stille basenveranderingen voor de codons die coderen voor proline (CCG naar CCC) en glycine (GGT naar GGG) aan het C-uiteinde van de sequentie een cryptische RNA-splitsingsplaats vlakbij het eind-30 standige codon verwijderen.

Het Fc-deel van de immunoglobulineketen kan in vivo ontstekingsbevorderend zijn. In één uitvoeringsvorm omvat het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvin- 25 ding aldus een interdomein linker die afkomstig is van RAGE in plaats van een inter-domein schamierpolypeptide dat van een immunoglobuline afkomstig is.

In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-fiisie-eiwit aldus een RAGE-polypeptide omvatten dat op directe wijze is gekoppeld aan een polypeptide dat een Cn2-domein 5 van een immunoglobuline of een fragment of een deel van het Cn2-domein van een immunoglobuline omvat. In één uitvoeringsvorm omvat het Ch2-domein of een fragment daarvan SEQ ID NO: 42. In een uitvoeringsvorm omvat het fragment van SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 42 waarbij de eerste tien aminozuren zijn verwijderd. In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide een Iigand-bindingsplaats omvatten. De bin-10 dingsplaats voor het ligand van RAGE kan het V-domein van RAGE of een deel daarvan omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat de bindingsplaats voor een ligand van RAGE SEQ ID NO: 9 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 10 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 47, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is.

15 Het RAGE-polypeptide dat in de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uit vinding wordt gebruikt kan een immunoglobuline-domein van RAGE omvatten. In aanvulling of als alternatief kan het fragment van RAGE een interdomein linker omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan een immunoglobuline-domein van RAGE omvatten die is gekoppeld aan een stroomopwaartse (d.w.z. dichter bij het N-uiteinde) of stroom-20 afwaartse (d.w.z. dichter bij het C-uiteinde) interdomein linker. In nog een andere uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide twee (of meer) immunoglobuline-domeinen van RAGE omvatten die elk aan elkaar zijn gekoppeld door een interdomein linker. Het RAGE-polypeptide kan verder meerdere immunoglobuline-domeinen van RAGE omvatten die aan elkaar zijn gekoppeld door één of met interdomein linkers en die een 25 eindstandige interdomein linker verbonden aan het N-eindstandige immunoglobuline-domein van RAGE en/of het C-eindstandige immunoglobuline-domein van RAGE hebben. Aanvullende combinaties van immunoglobuline-domeinen en interdomein linkers van RAGE vallen binnen de beschermingsomvang van de onderhavige uitvinding.

30 In één uitvoeringsvorm omvat het RAGE-polypeptide een interdomein linker van RAGE die zodanig aan het immunoglobuline-domein van RAGE is gekoppeld dat het C-eindstandige aminozuur van het immunoglobuline-domein van RAGE aan het N-eindstandige aminozuur van de interdomein linker is gekoppeld en het C-eindstandige 26 aminozuur van de interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een CH2-domein van een immu-noglobuline of een fragment daarvan omvat. Het polypeptide dat een Cn2-domein van een immunoglobuline omvat, kan de Ch2- en Cn3-domeinen van een humaan IgGl of 5 een deel van elk, of beide van deze domeinen omvatten. Als een voorbeeld van een uitvoeringsvorm kan het polypeptide dat de Ch2- en CH3-domeinen of een deel daarvan van een humaan IgGl omvat, SEQ ID NO: 38 of SEQ ID NO: 40 omvatten.

Zoals hierboven is beschreven kan het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding een enkele of meerdere domeinen van RAGE omvatten. Het RAGE-10 polypeptide dat een interdomein linker omvat die is gekoppeld aan een domein van een RAGE-polypeptide kan ook een fragment van het RAGE-eiwit met volledige lengte omvatten. Het RAGE-polypeptide kan bijvoorbeeld aminozuren 23-136 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 15) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is of aminozuren 24-136 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 16) of een sequentie die tenmin-15 ste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-136 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 49), of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het V-domein van RAGE en een strooomafwaartse interdomein-linker omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 23-251 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 19) of een sequentie die tenminste 90% 20 identiek daar aan is, of aminozuren 24-251 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 20) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-251 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 51), of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is die overeenkomt met het V-domein, het Cl-domein, de interdomein linker die deze twee domeinen koppelt en een tweede 25 interdomein linker stroomafwaarts van C1, omvatten.

In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-fusie-eiwit bijvoorbeeld twee immu-noglobuline-domeinen omvatten die afkomstig zijn van RAGE-eiwit en twee immu-noglobuline-domeinen die afkomstig zijn van een humaan Fc-polypeptide. Het RAGE-fusie-eiwit kan een eerste immunoglobuline-domein van RAGE en een eerste interdo-30 mein linker van RAGE gekoppeld aan een tweede immunoglobuline-domein van RAGE en een tweede interdomein linker van RAGE omvatten, zodanig dat het N-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het eerste immunoglobuline domein van RAGE, het N- 27 eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobuline-domein van RAGE is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker, het N-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobuline-domein van RAGE en het 5 C-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van het CH2-immunoglobuline domein. In één uitvoeringsvorm kan een RAGE-fusie-eiwit met vier domeinen SEQ ID NO: 32 omvatten. In andere uitvoeringsvormen omvat een RAGE-fusie-eiwit met vier domeinen SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, of SEQ ID NO: 56.

10 Als alternatief kan een RAGE-fusie-eiwit met drie domeinen één immunoglobu line-domein omvatten dat afkomstig is van RAGE en twee immunoglobuline-domeinen die afkomstig zijn van een humaan Fc-polypeptide. Het RAGE-fusie-eiwit kan bijvoorbeeld een enkel immunoglobuline-domein van RAGE gekoppeld door middel van een interdomein linker van RAGE aan het N-eindstandige aminozuur van een Ch2-15 immunoglobuline domein of een deel van een CH2-immunoglobuline-domein omvatten. In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-fusie-eiwit met drie domeinen SEQ ID NO: 35 omvatten. In andere uitvoeringsvormen kan een RAGE-fusie-eiwit met drie domeinen SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, of SEQ ID NO: 57 omvatten.

Een fragment van een interdomein linker van RAGE kan een peptidesequentie 20 omvatten die van nature stroomafwaarts is van, en aldus gekoppeld is aan, een immunoglobuline-domein van RAGE. Voor het V-domein van RAGE kan de interdomein linker bijvoorbeeld aminozuursequenties omvatten die van nature stroomafwaarts zijn van het V-domein. In een uitvoeringsvorm kan de linker SEQ ID NO: 21 omvatten, die overeenkomt met aminozuren 117-123 van RAGE met de volledige lengte. Of de linker 25 kan een peptide omvatten dat aanvullende delen van de natuurlijke sequentie van RAGE heeft. Een interdomein linker die verscheidene aminozuren (bijvoorbeeld 1-3, 1-5, of 1-10, of 1-15 aminozuren) stroomopwaarts of stroomafwaarts van SEQ ID NO: 21 omvat, kan bijvoorbeeld worden gebruikt. In één uitvoeringsvorm omvat de interdomein linker aldus SEQ ID NO: 23 die aminozuren 117-136 van RAGE met de volledi-30 ge lengte omvat. Of fragmenten van SEQ ID NO: 21 waarbij bijvoorbeeld 1, 2 of 3 aminozuren van elk uiteinde van de linker zijn verwijderd kunnen worden gebruikt. In andere uitvoeringsvormen kan de linker een peptide omvatten dat tenminste 70% iden- 28 tiek, 75% identiek, 80% identiek, 85% identiek, 90% identiek, 95% identiek, 97% identiek, 98% identiek of 99% identiek is aan SEQ ID NO: 21 of SEQ ID NO: 23.

Voor het Cl-domein van RAGE kan de linker een peptidesequentie omvatten die van nature stroomafwaarts van het Cl-domein is. In een uitvoeringsvorm kan de linker 5 SEQ ID NO: 22 omvatten die overeenkomt met aminozuren 222-251 van RAGE met de volledige lengte. Of de linker kan een peptide omvatten dat aanvullende delen van de natuurlijke sequentie van RAGE heeft. Een linker die verscheidene (1-3, 1-5, of 1-10, of 1-15 aminozuren) aminozuren stroomopwaarts en stroomafwaarts van SEQ ID NO: 22 heeft kan bijvoorbeeld worden gebruikt. Of fragmenten van SEQ ID NO: 22 10 kunnen worden gebruikt, waarbij bijvoorbeeld 1-3, 1-5, of 1-10, of 1-15 aminozuren van elk uiteinde van de linker zijn gedeleteerd. In één uitvoeringsvorm kan een inter-domein linker van RAGE SEQ ID NO: 24 omvatten die overeenkomt met aminozuren 222-226. Of een interdomein linker kan SEQ ID NO: 44 omvatten die overeenkomt met aminozuren 318-342 van RAGE.

15 Het zal voor een deskundige in het vakgebied bovendien duidelijk zijn dat afzon derlijke substituties, deleties of addities die een enkel aminozuur of een klein percentage van aminozuren (kenmerkend minder dan ongeveer 5%, meer kenmerkend minder dan ongeveer 1%) in een gecodeerde sequentie veranderen, toevoegen of verwijderen op conservatieve gemodificeerde variaties zijn waarbij de veranderingen resulteren in 20 de substitutie van een aminozuur met een chemisch gelijkwaardig aminozuur. Tabellen van conservatieve substituties die functionele overeenkomstige aminozuren verschaffen zijn in het vakgebied goed bekend. De volgende voorbeelden van groepen bevatten elk aminozuren die conservatieve substituties voor elkaar zijn: 25 1) Alanine (A), Serine (S), Threonine (T); 2) Asparaginezuur (D), Glutaminezuur (E); 3) Asparagine (N), Glutamine (Q); 4) Arginine (R), Lysine (K); 5) Isoleucine (I), Leucine (L), Methionine (M), Valine (V); en 30 6) Fenylalanine (F), Tyrosine (Y), Tryptofaan (W).

Een conservatieve substitutie is een substitutie waarbij het gesubstitueerde aminozuur (natuurlijk voorkomend of gemodificeerd) structureel verwant is aan het amino- 29 zuur dat wordt gesubstitueerd, d.w.z. heeft ongeveer dezelfde grootte en elektronische eigenschappen als het aminozuur dat wordt gesubstitueerd. Het vervangende aminozuur zou aldus dezelfde of een overeenkomstige functionele groep in de zijketen hebben als het oorspronkelijke aminozuur. Een “conservatieve substitutie” verwijst ook naar het 5 gebruik van een vervangend aminozuur dat identiek is aan het aminozuur dat wordt vervangen behalve dat een functionele groep in de zijketen wordt beschermd met een geschikte beschermende groep.

Zoals in het vakgebied bekend is kunnen aminozuren van de natuurlijke structuur ervan chemisch worden gemodificeerd door ofwel enzymatische of niet-enzymatische 10 reactiemechanismen. In één uitvoeringsvorm kan een N-eindstandige glutaminezuur of glutamine cycliseren onder verlies van water, voor het vormen van pyroglutaminezuur (pyroE of pE) (Chelius et al, Anal.Chem, 78: 2370-2376 (2006) en Burstein et al., Proc. National Acad. Sci., 73:2604-2608 (1976)). Een RAGE-fusie-eiwit met SEQ ID NO: 56 zou verder mogelijk kunnen worden verkregen door middel van een nucleïne-15 zuursequentie die codeert voor glutaminezuur op residu 24 in plaats van een glutamine op residu 24. (op basis van de nummering van RAGE met de volledige lengte).

Werkwijzen voor het produceren van RAGE-fusie-eiwitten 20 De onderhavige uitvinding omvat ook een werkwijze voor het maken van een RAGE-fusie-eiwit. In één uitvoeringsvorm omvat de onderhavige uitvinding aldus een werkwijze voor het maken van een RAGE-fusie-eiwit die de stappen omvat van het op covalente wijze koppelen van een RAGE-polypeptide dat is gekoppeld aan een tweede niet-RAGE-polypeptide waarbij het RAGE-polypeptide een bindingsplaats voor een 25 ligand van RAGE omvat. Het gekoppelde RAGE-polypeptide en het tweede niet-RAGE-polypeptide kunnen bijvoorbeeld worden gecodeerd door een recombinant DNA-construct. De werkwijze kan verder de stap van het incorporeren van het DNA-construct in een expressievector omvatten. De werkwijze kan ook de stap van het inse-reren van de expressievector in een gastheercel omvatten.

30 Uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding verschaffen bijvoorbeeld RAGE-fusie-eiwitten die een RAGE-polypeptide gekoppeld aan een tweede niet-RAGE polypeptide omvatten. In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-fusie-eiwit een bindingsplaats voor een ligand van RAGE omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat de 30 bindingsplaats voor het ligand het meest N-eindstandige domein van het RAGE-fiisie-eiwit. De bindingsplaats voor het ligand van RAGE kan het V-domein van RAGE of een deel daarvan omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat de bindingsplaats voor het ligand van RAGE SEQ ID NO: 9 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan 5 is, of SEQ ID NO: 10 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 47, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is.

In een uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide zijn gekoppeld aan een polypeptide dat een immunoglobuline-domein of een deel (bijvoorbeeld een fragment daarvan) van een immunoglobuline-domein omvat. In één uitvoeringsvorm omvat het poly-10 peptide dat een immunoglobuline-domein omvat tenminste een deel van tenminste één van de Ch2- of de Cn3-domeinen van een humaan IgG.

Het RAGE-fusie-eiwit kan door recombinante DNA-technieken worden gemanipuleerd. In één uitvoeringsvorm kan de onderhavige uitvinding bijvoorbeeld een geïsoleerd nucleïnezuursequentie omvatten die, complementariteit met of aanzienlijke over-15 eenkomst met een polynucleotidesequentie die codeert voor een RAGE-polypeptide dat is gekoppeld aan een tweede niet-RAGE-polypeptide omvat. In een uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide een bindingsplaats voor een ligand van RAGE omvatten.

Het RAGE-eiwit of polypeptide kan humaan RAGE met de volledige lengte (bijvoorbeeld SEQ ID NO: 1) of een fragment van humaan RAGE omvatten. In een uitvoe-20 ringsvorm omvat het RAGE-polypeptide geen residuen van een signaalsequentie. De signaalsequentie van RAGE kan ofwel residuen 1-22 of residuen 1-23 van RAGE met de volledige lengte (SEQ ID NO: 1) omvatten. In andere uitvoeringsvormen kan het RAGE-polypeptide een sequentie omvatten die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% of 99% identiek is aan humaan RAGE, of een fragment daarvan. In 25 één uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide bijvoorbeeld humaan RAGE of een fragment daarvan, met Glycine als het eerste residu in plaats van een Methionine (zie bijvoorbeeld Neeper et al, (1992)) omvatten. Of het humane RAGE kan RAGE met de volledige lengte waarbij de signaalsequentie is verwijderd (bijvoorbeeld SEQ ID NO: 2 of SEQ ID NO: 3) (Figuren IA en 1B) of een deel van die aminozuursequentie omvat-30 ten. De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen ook sRAGE (bijvoorbeeld SEQ ID NO: 4), een polypeptide die tenminste 90% identiek is aan sRAGE, of een fragment van sRAGE omvatten. Het RAGE-polypeptide kan bijvoorbeeld humaan sRAGE of een fragment daarvan, met Glycine als het eerste residu in plaats van 31 een Methionine (zie bijvoorbeeld Neeper et al., (1992)) omvatten. Of het humane RAGE kan sRAGE waarbij de signaalsequentie is verwijderd (Zie bijvoorbeeld SEQ ID NO: 5 of SEQ ID NO: 6 in Figuur 1C of SEQ ID NO: 45 in Figuur 16 A) of een deel van die aminozuursequentie omvatten. In andere uitvoeringsvormen kan het 5 RAGE-eiwit een V-domein omvatten (zie bijvoorbeeld SEQ ID NO: 7 of SEQ ID NO: 8 in Figuur ID of SEQ ID NO: 46 in Figuur 16A). Of een sequentie die tenminste 90% identiek is aan het V-domein of een fragment daarvan kan worden gebruikt. Of het RAGE-eiwit kan een fragment van RAGE omvatten dat een deel van het V-domein omvat (zie bijvoorbeeld SEQ ID NO: 9 of SEQ ID NO: 10 in Figuur ID of SEQ ID 10 NO: 47 in Figuur 16A). In een uitvoeringsvorm kan de bindingsplaats voor het ligand SEQ ID NO: 9 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 10, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 47, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is omvatten. In nog een andere uitvoeringsvorm is het RAGE-fragment een synthetisch peptide.

15 In een uitvoeringsvorm omvat de nucleïnezuursequentie SEQ ID NO: 25 om te coderen voor aminozuren 1-118 van humaan RAGE of een fragment daarvan. Een sequentie die nucleotiden 1- 348 van SEQ ID NO: 25 omvat kan bijvoorbeeld worden gebruikt om te coderen voor aminozuren 1-116 van humaan RAGE. Of het nucleïne-zuur kan SEQ ID NO: 26 omvatten om te coderen voor aminozuren 1-123 van humaan 20 RAGE. Of het nucleïnezuur kan SEQ ID NO: 27 omvatten om te coderen voor aminozuren 1-136 van humaan RAGE. Of het nucleïnezuur kan SEQ ID NO: 28 omvatten om te coderen voor aminozuren 1-230 van humaan RAGE. Of het nucleïnezuur kan SEQ ID NO: 29 omvatten om te coderen voor aminozuren 1-251 van humaan RAGE. Of fragmenten van deze nucleïnezuursequenties kunnen worden gebruikt om te coderen 25 voor fragmenten van het RAGE-polypeptide.

Het RAGE-fusie-eiwit kan verscheidene soorten van peptiden omvatten die niet afkomstig zijn van RAGE of een fragment daarvan. Het tweede polypeptide van het RAGE-fusie-eiwit kan een polypeptide omvatten dat van een immunoglobuline afkomstig is. De zware keten (of deel daarvan) kan afkomstig zijn van één van de bekende 30 isotypen van de zware keten: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε) of IgA (a). In aanvulling kan de zware keten (of deel daarvan) afkomstig zijn van één van de bekende subtypen van de zware keten: IgGl (γΐ), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgAl (al), IgA2 (a2), of mutaties van deze isotypen of subtypen die de biologische activiteit verande- 32 ren. Het tweede polypeptide kan de Ch2- en CH3-domeinen van een humaan IgGl of een deel van elk of beide van deze domeinen omvatten. Als een voorbeeld van uitvoeringsvormen kan het polypeptide dat de Ch2- en Ch3-domeinen van een humaan IgGl of een deel daarvan omvat SEQ ID NO: 38 of SEQ ID NO: 40 omvatten. Het immu-5 noglobuline-peptide kan worden gecodeerd door de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO: 39 of SEQ ID NO: 41. In andere uitvoeringsvormen kan de immunoglobulinese-quentie in SEQ ID NO: 38 of SEQ ID NO: 40 ook worden gecodeerd door respectievelijk SEQ ID NO: 52 of SEQ ID NO: 53.

Het Fc-deel van de immunoglobulineketen kan in vivo ontstekingsbevorderend 10 zijn. Het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding kan aldus een interdomein linker omvatten die afkomstig is van RAGE in plaats van een interdomein schamierpo-lypeptide dat van een immunoglobuline afkomstig is. In één uitvoerings-vorm kan het RAGE-fusie-eiwit bijvoorbeeld worden gecodeerd door een recombinant DNA-construct. De werkwijze kan ook de stap omvatten van het incorporeren van het DNA-15 construct in een expressievector. De werkwijze kan ook het transfecteren van de ex-pressievector in een gastheercel omvatten.

In één uitvoeringsvorm omvat de onderhavige uitvinding aldus een werkwijze voor het maken van een RAGE-fusie-eiwit die de stap omvat van het op covalente wijze koppelen van een RAGE-polypeptide aan een polypeptide dat een Ch2-domein van 20 een immunoglobuline of een deel van een CH2-domein van een immunoglobuline omvat. In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-fusie-eiwit een bindingsplaats voor een ligand van RAGE omvatten. De bindingsplaats voor het ligand van RAGE kan het V-domein van RAGE of een deel daarvan omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat de bindingsplaats voor een ligand van RAGE SEQ ID NO: 9 of een sequentie die tenmin-25 ste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 10 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 47, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is.

In één uitvoeringsvorm omvat de onderhavige uitvinding bijvoorbeeld een nucle-inezuur dat codeert voor een RAGE-polypeptide dat op directe wijze is gekoppeld aan 30 een polypeptide dat een Cn2-domein van een immunoglobuline of een fragment daarvan omvat. In één uitvoeringsvorm omvat het Cn2-domein of een fragment daarvan SEQ ID NO: 42. In een uitvoeringsvorm omvat het fragment van SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 42 waarvan de eerste 10 aminozuren zijn verwijderd. Het tweede polypeptide 33 kan de Ch2- en CH3-domeinen van een humaan IgGl omvatten. Als een voorbeeld van een uitvoeringsvorm kan het polypeptide dat de Ch2- en Cn3-domeinen van een humaan IgGl omvat SEQ ID NO: 38 of SEQ ID NO: 40 omvatten. Het immunoglobuli-ne-peptide kan worden gecodeerd door de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO: 39 5 of SEQ ID NO: 41. De immunoglobulinesequentie in SEQ ID NO: 38 of SEQ ID NO: 40 kan ook worden gecodeerd door SEQ ID NO: 52 of SEQ ID NO: 53, waarbij stille basenveranderingen voor de codons die coderen voor proline (CCG naar CCC) en glycine (GGT naar GGG) aan het C-uiteinde van de sequentie een cryptische RNA-splitsingsplaats vlakbij het eindstandige codon verwijderen.

10 In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide een interdomein linker van RAGE gekoppeld aan het immunoglobuline-domein van RAGE omvatten zodanig dat het C-eindstandige aminozuur van het immunoglobuline-domein van RAGE aan het N-eindstandige aminozuur van de interdomein linker is gekoppeld en het C-eindstandige aminozuur van de interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het 15 N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een CH2-domein van een immunoglobuline-domein, of een fragment daarvan omvat. Het polypeptide dat een Ch2-domein van een immunoglobuline of een deel daarvan omvat kan een polypeptide omvatten dat de Ch2- en Cn3-domeinen van een humaan IgGl of een deel van beide of van elk van deze domeinen omvat. Als en voorbeeld van een uitvoeringsvorm kan het 20 polypeptide dat de Ch2- en CH3-domeinen van een humaan IgGl of een deel daarvan omvat SEQ ID NO: 38 of SEQ ID NO: 40 omvatten.

Het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding kan een enkele of meerdere domeinen van RAGE omvatten. Het RAGE-polypeptide dat een interdomein linker gekoppeld aan een immunoglobuline-domein van RAGE omvat kan ook een fragment 25 van een RAGE-eiwit met een volledige lengte omvatten. In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-fusie-eiwit bijvoorbeeld twee immunoglobuline domeinen omvatten die afkomstig zijn van een RAGE-eiwit en twee immunoglobuline-domeinen die afkomstig zijn van een humaan Fc-polypeptide. Het RAGE-fusie-eiwit kan een eerste immunoglobuline-domein van RAGE en een eerste interdomein linker gekoppeld aan een 30 tweede immunoglobuline-domein van RAGE en een tweede interdomein linker van RAGE omvatten, zodanig dat het N-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het eerste immunoglobuline-domein van RAGE, het N-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobuline- 34 domein van RAGE is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van de eerste inter-domein linker, het N-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobuline-domein van RAGE en het C-eindstandige aminozuur van het tweede interdomein linker van 5 RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van het polypeptide dat een C^-immunoglobuline domein of fragment daarvan omvat. Het RAGE-polypeptide kan bijvoorbeeld aminozuren 23-251 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 19) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-251 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 20) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan 10 is, of aminozuren 24-251 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 51) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het V-domein, het Cl-domein, de interdomein linker die deze twee domeinen koppelt en een tweede interdomein linker stroomafwaarts van Cl omvat. In één uitvoeringsvorm kan een nucleïnezuurconstruct dat SEQ ID NO: 30 of een frag-15 ment daarvan omvat coderen voor een RAGE-fusie-eiwit met vier domeinen. In een andere uitvoeringsvorm kan een nucleïnezuurconstruct dat SEQ ID NO: 54 omvat coderen voor een RAGE-fusie-eiwit met vier domeinen, waarbij stille basenveranderingen voor de codons die coderen voor een proline (CCG naar CCC) en glycine (GGT naar GGG) aan het C-uiteinde van de sequentie worden gemaakt voor het verwijderen 20 van een cryptische RNA-splitsingsplaats vlakbij het eindstandige codon.

Als alternatief kan een RAGE-fusie-eiwit met drie domeinen één immunoglobuline-domein die afkomstig is van RAGE en twee immunoglobuline-domeinen die afkomstig zijn van een humaan Fc-polypeptide omvatten. Het RAGE-fusie-eiwit kan bijvoorbeeld een enkel immunoglobuline-domein van RAGE omvatten dat is gekop-25 peld door middel van een interdomein linker van RAGE aan het N-eindstandige aminozuur van het polypeptide dat het CH2-immunoglobuline-domein of een fragment daarvan omvat. Het RAGE-polypeptide kan bijvoorbeeld aminozuren 23-136 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 15) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is of aminozuren 24-136 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 16) of een sequentie die tenmin-30 ste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-136 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 49) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het V-domein van RAGE en een stroomafwaartse interdomein linker omvatten. In één uitvoerings-vorm kan een nuclei- 35 nezuurconstruct dat SEQ ID NO: 31 of een fragment daarvan omvat coderen voor een RAGE-fusie-eiwit met drie domeinen. In een andere uitvoeringsvorm kan het nucleïne-zuurconstruct dat SEQ ID NO: 55 omvat coderen voor een RAGE-fusie-eiwit met drie domeinen, waarbij stille basen-veranderingen voor de codons die coderen voor proline 5 (CCG naar CCC) en glycine (GGT naar GGG) aan het C-uiteinde van de sequentie een cryptische RNA-splitsingsplaats vlakbij het eindstandige codon verwijderen.

Een fragment van de interdomein linker van RAGE kan een peptidesequentie omvatten die van nature stroomafwaarts is van en aldus gekoppeld is aan een immu-noglobuline-domein van RAGE. Voor het V-domein van RAGE kan de interdomein 10 linker bijvoorbeeld aminozuursequenties omvatten die van nature stroomafwaarts van het V-domein zijn. In een uitvoeringsvorm kan de linker SEQ ID NO: 21 omvatten die overeenkomt met aminozuren 117-123 van RAGE met de volledige lengte. Of de linker kan een peptide omvatten dat aanvullende delen van de natuurlijke sequentie van RAGE heeft. Een interdomein linker die verscheidene aminozuren (bijvoorbeeld 1-3, 1-15 5, of 1-10, of 1-15 aminozuren) stroomopwaarts en stroomafwaarts van SEQ ID NO: 21 omvat kan bijvoorbeeld worden gebruikt. In één uitvoeringsvorm omvat de interdomein linker aldus SEQ ID NO: 23 die aminozuren 117-136 van RAGE met de volledige lengte omvat. Of fragmenten van SEQ ID NO: 21 waarbij bijvoorbeeld 1, 2, of 3 aminozuren van elk uiteinde van de linker zijn verwijderd kunnen worden gebruikt. In 20 andere uitvoeringsvormen kan de linker een sequentie omvatten die tenminste 70% identiek, of 80% identiek, of 90% identiek is aan SEQ ID NO: 21 of SEQ ID NO: 23.

Voor het Cl-domein van RAGE kan de linker een peptidesequentie omvatten die van nature stroomafwaarts van het C1 -domein is. In een uitvoeringsvorm kan de linker SEQ ID NO: 22 omvatten die overeenkomt met aminozuren 222-251 van RAGE met 25 de volledige lengte. Of de linker kan een peptide omvatten dat aanvullende delen van de natuurlijke sequentie van RAGE heeft. Een linker die verscheidene (1-3, 1-5, of Ι-ΙΟ, of 1-15 aminozuren) aminozuren stroomopwaarts en stroomafwaarts van SEQ ID NO: 22 heeft kan bijvoorbeeld worden gebruikt. Of fragmenten van SEQ ID NO: 22 kunnen worden gebruikt waarbij bijvoorbeeld 1-3, 1-5, of 1-10, of 1-15 aminozuren 30 van één van de uiteinden van de linker zijn verwijderd. In één uitvoeringsvorm kan een interdomein linker van RAGE bijvoorbeeld SEQ ID NO: 24 omvatten die overeenkomt met aminozuren 222-226. Of een interdomein linker kan SEQ ID NO: 44 omvatten die overeenkomt met aminozuren 318-342 van RAGE.

36

De werkwijze kan verder de stap van het incorporeren van het DNA-construct in een expressievector omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat de onderhavige uitvinding aldus een expressievector die codeert voor een RAGE-fusie-eiwit dat een RAGE-polypeptide omvat dat direct gekoppeld is aan een polypeptide dat een C^-domein van 5 een immunoglobuline of een deel van een CH2-domein van een immunoglobuline omvat. In een uitvoeringsvorm omvat het RAGE-polypeptide constructen zoals die welke hierin zijn beschreven, die een interdomein linker van RAGE gekoppeld hebben aan een immunoglobuline-domein van RAGE zodanig dat de C-eindstandige aminozuur van het immunoglobuline-domein van RAGE aan het N-eindstandige aminozuur van de 10 interdomein linker is gekoppeld en het C-eindstandige aminozuur van de interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een C^-domein van een immunoglobuline of een deel daarvan omvat. De expressievector die wordt gebruikt voor het transfecteren van de cellen kan bijvoorbeeld de nucleïnezuursequentie SEQ ID NO: 30 of een fragment daarvan, SEQ 15 ID NO: 54, of een fragment daarvan, SEQ ID NO: 31, of een fragment daarvan, of SEQ ID NO: 55, of een fragment daarvan omvatten.

De werkwijze kan verder de stap omvatten van het transfecteren van een cel met de expressievector van de onderhavige uitvinding. In een uitvoeringsvorm omvat de onderhavige uitvinding aldus een cel die is getransfecteerd met de expressievector die 20 het RAGE-fusie-eiwit van de uitvinding tot expressie brengt, zodanig dat de cel een RAGE-fusie-eiwit tot expressie brengt dat een RAGE-polypeptide omvat dat op directe wijze is gekoppeld aan een polypeptide dat een C^-domein van een immunoglobuline of een deel van een C^-domein van een immunoglobuline omvat. In een uitvoeringsvorm omvat het RAGE-polypeptide constructen, zoals die welke hierin zijn beschre-25 ven, die een interdomein linker van RAGE gekoppeld hebben aan een immunoglobuline-domein van RAGE, zodanig dat het C-eindstandige aminozuur van het immunoglobuline-domein van RAGE is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van de interdomein linker en het C-eindstandige aminozuur van de interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van een poly-30 peptide dat een Cn2-domein van een immunoglobuline of een deel daarvan omvat. De expressievector kan bijvoorbeeld de nucleïnezuursequentie SEQ ID NO: 30 of een fragment daarvan, SEQ ID NO: 54, of een fragment daarvan, SEQ ID NO: 31, of een fragment daarvan, of SEQ ID NO: 55, of een fragment daarvan omvatten.

37

Plasmiden die kunnen bijvoorbeeld worden geconstrueerd voor het tot expressie brengen van RAGE-IgG fusie-eiwitten door het fuseren van verschillende lengten van een 5’-cDNA-sequentie van humaan RAGE met een 3’ cDNA-sequentie van humaan IgGl (γΐ). De sequenties van de expressiecassette kunnen in een expressievector zoals 5 expressievector pcDNA3.1 (Invitrogen, CA) worden geïnsereerd door het gebruik van standaard recombinante technieken.

De werkwijze kan ook het transfecteren van de expressievector in een gastheercel omvatten. RAGE-fusie-eiwitten kunnen tot expressie worden gebracht in zoogdierlijke expressiesystemen waaronder systemen waarbij de expressieconstructen in de zoog-10 dierlijke cellen worden geïntroduceerd door het gebruik van een virus zoals retrovirus of adenovirus. Zoogdierlijke cellijnen die beschikbaar zijn als gastheren voor expressie zijn in het vakgebied goed bekend en omvatten vele onsterfelijk gemaakte cellijnen die verkrijgbaar zijn van de American Type Culture Collection (ATCC). Deze omvatten onder andere eierstokcellen van de Chinese hamster (CHO), NSO, SP2-cellen, Hela-15 cellen, niercellen van baby hamster (BHK), apenniercellen (COS), humane hepatocel-lulaire carcinoomcellen (bijvoorbeeld Hep G2), A549-cellen en een aantal andere cellijnen. Cellijnen kunnen worden geselecteerd door het bepalen welke cellijnen hoge expressieniveaus van een RAGE-fusie-eiwit hebben. Andere cellijnen die kunnen worden gebruikt zijn insectencellijnen zoals Sf9-cellen. Gastheercellen van planten omvat-20 ten bijvoorbeeld Nicotiana, Arabidopsis, kroos, maïs, tarwe, aardappel, enzovoort. Bac-teriële gastheercellen omvatten soorten van E. coli en Streptomyces. Gastheercellen van gist omvatten Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae en Pichia pastoris. Wanneer recombinante expressievectoren die voor genen voor RAGE-fusie-eiwitten coderen in zoogdierlijke gastheercellen worden geïntroduceerd, worden de 25 RAGE-fusie-eiwitten geproduceerd door het kweken van de gastheercellen gedurende een tijdsperiode die voldoende is om expressie van het RAGE-fusie-eiwit in de gastheercellen of uitscheiding van het RAGE-fusie-eiwit in het kweekmedium waarin de gastheercellen worden gekweekt mogelijk te maken. RAGE-fusie-eiwitten kunnen van het kweekmedium worden teruggewonnen door het gebruik van standaard werkwijzen 30 van eiwitzuivering.

Nucleïnezuurmoleculen die voor RAGE-fusie-eiwitten coderen en expressievectoren die deze nucleïnezuurmoleculen omvatten kunnen worden gebruikt voor trans-fectie van een geschikte zoogdierlijke, planten-, bacteriële- of gist-gastheercel. Trans- 38 formatie kan door elke bekende werkwijze voor het introduceren van polynucleotiden in een gastheercel zijn. Werkwijzen voor introductie van heterologe polynucleotiden in zoogdierlijke cellen zijn in het vakgebied goed bekend en omvatten dextran-bemiddelde transfectie, calciumfosfaat-precipitatie, polybreen-bemiddelde transfectie, 5 protoplastfusie, elektroporatie, inkapseling van het/de polynucleotide(n) in liposomen en directe micro-injectie van het DNA in kernen. In aanvulling kunnen nucleïnezuur-moleculen in zoogdierlijke cellen worden geïntroduceerd door virale vectoren. Werkwijzen voor het transformeren van plantencellen zijn in het vakgebied goed bekend waaronder bijvoorbeeld Agrobacterium-bemiddelde transformatie, biolistische trans- 10 formatie, directe injectie, elektroporatie en virale transformatie. Werkwijzen voor het transformeren van bacteriële cellen en gistcellen zijn in het vakgebied goed bekend.

Een expressievector kan ook aan een expressiesysteem worden afgeleverd door het gebruik van biolostische technieken met DNA, waarbij het plasmide op microscopische deeltjes, bij voorkeur van goud, wordt geprecipiteerd en de deeltjes in een doel- 15 witcel of expressiesysteem worden geschoten. Biolistische technieken met DNA zijn in het vakgebied goed bekend en inrichtingen, bijvoorbeeld een “gengeweer” zijn in de handel verkrijgbaar voor het afleveren van de microdeeltjes in een cel (bijvoorbeeld Helios Gene Gun, Bio-Rad Labs., Hercules, CA) en in de huid (PMED Device, Pow-derMed Ltd., Oxford, UK).

20 Expressie van RAGE-fusie-eiwitten van productie cellijnen kan worden verhoogd door het gebruik van een aantal bekende technieken. Het expressiesysteem met het glu-taminesynthetasegen (het GS-systeem) en het plasma-gecodeerde neomycine-resistentie systeem zijn bijvoorbeeld algemene benaderingswijzen voor het verhogen van expressie onder bepaalde omstandigheden.

25 RAGE-fusie-eiwitten die door verschillende cellijnen tot expressie zijn gebracht kunnen verschillende glycosylatiepatronen van elkaar hebben. Alle RAGE-fusie-eiwitten die worden gecodeerd door de nucleïnezuurmoleculen die hierin worden verschaft of die de aminozuursequenties omvatten die hierin worden verschaft, zijn deel van de onderhavige uitvinding, ongeacht de glycosylatie van het RAGE-fusie-eiwit.

30 In één uitvoeringsvorm kan een recombinante expressievector in eierstokcellen van de Chinese hamster (CHO) worden getransfecteerd en expressie kan worden geoptimaliseerd. In andere uitvoeringsvormen kunnen de cellen 0,1 tot 20 gram/liter of 0,5 tot 10 gram/liter of ongeveer 1-2 gram/liter produceren.

39

Zoals in het vakgebied bekend is kunnen dergelijke nucleïnezuurconstructen worden gemodificeerd door mutatie, zoals bijvoorbeeld door PCR-amplificatie van een nucleïnezuurmatrijs met primers die de mutatie van belang omvatten. Op deze wijze kunnen polypeptiden die variërende affiniteit voor liganden van RAGE omvatten wor-5 den ontworpen. In één uitvoeringsvorm kunnen de gemuteerde sequenties 90% of meer identiek zijn aan het DNA waarvan wordt uitgegaan. Als zodanig kunnen varianten nucleotidesequenties omvatten die onder stringente omstandigheden (d.w.z. gelijkwaardig aan ongeveer 20-27°C onder de smelttemperatuur (TM) van de DNA-duplex in 1 molair zout) hybridiseren.

10 De coderende sequentie kan tot expressie worden gebracht door het transfecteren van de expressievector in een geschikte gastheer. De recombinante vectoren kunnen bijvoorbeeld op stabiele wijze in eierstokcellen van de Chinese hamster (CHO) worden getransfecteerd en cellen die het RAGE-fusie-eiwit tot expressie brengen worden geselecteerd en gekloneerd. In een uitvoeringsvorm worden de cellen die het recombinante 15 construct tot expressie brengen geselecteerd op plasmide-gecodeerde neomycine-resistentie door het toedienen van het antibioticum G418. Afzonderlijke klonen kunnen worden geselecteerd en klonen die hoge niveaus van recombinant eiwit tot expressie brengen, zoals wordt gedetecteerd door Westem-blot-analyse van het supernatant van de cellen, kunnen worden uitgebreid en het genproduct kan worden gezuiverd door 20 affiniteitschromatografie door het gebruik van Proteïne A kolommen.

Voorbeelden van uitvoeringsvormen van recombinante nucleïnezuren die coderen voor de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding zijn getoond in Figuren 2-5 en Figuren 17-20. Zoals bijvoorbeeld hierboven is beschreven kan het RAGE-fusie-eiwit dat wordt geproduceerd door het recombinante DNA-construct een RAGE-25 polypeptide gekoppeld aan een tweede niet-RAGE-polypeptide omvatten. Het RAGE-fusie-eiwit kan twee domeinen omvatten die afkomstig zijn van RAGE-eiwit en twee domeinen die afkomstig zijn van een immunoglobuline. Een voorbeeld van een nucleï-nezuurconstruct dat codeert voor een RAGE-fusie-eiwit, TTP-4000 (TT4) dat dit soort van structuur heeft is in Figuur 2 (SEQ ID NO: 30) en Figuur 17 (SEQ ID NO: 54) ge-30 toond. Zoals in Figuur 2 en Figuur 17 is getoond codeert de coderende sequentie 1-753 (in vetgedrukte letters gemarkeerd) voor de N-eindstandige eiwitsequentie van RAGE terwijl de sequentie van 754-1386 voor de IgG-eiwitsequentie codeert.

40

Wanneer het wordt verkregen van SEQ ID NO: 30 of SEQ ID NO: 54 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, kan het RAGE-fusie-eiwit de amino-zuursequentie volgens SEQ ID NO: 32 met vier domeinen omvatten of het polypeptide waarbij de signaalsequentie is verwijderd (zie bijvoorbeeld SEQ ID NO: 33 of SEQ ID 5 NO: 34 in Figuur 4 of SEQ ID NO: 56 in Figuur 19). In Figuur 4 en Figuur 19, is de aminozuursequentie voor RAGE in vetgedrukte letter gemarkeerd. De immunoglobuli-nesequentie zijn de Ch2- en CH3-immunoglobulinedomeinen van IgG. Zoals in Figuur 6B is getoond bevatten de eerste 251 aminozuren van het RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 met de volledige lengte als de RAGE-polypeptidesequentie een signaalsequentie die 10 aminozuren 1-22/23, het V-immunoglobuline-domein (waaronder de bindingsplaats voor het ligand) die aminozuren 23/24-116 omvat, een interdomein linker die aminozuren 117 tot 123 omvat, een tweede immunoglobuline-domein (Cl), die aminozuren 124-221 omvat en een stroomafwaartse interdomein linker die aminozuren 222-251 omvat.

15 In een uitvoeringsvorm hoeft het RAGE-fusie-eiwit niet noodzakelijkerwijs het tweede RAGE-immunoglobuline-domein te omvatten. Het RAGE-fusie-eiwit kan bijvoorbeeld één immunoglobuline-domein die afkomstig is van RAGE en twee immu-noglobuline-domeinen die afkomstig zijn van een humaan Fc-polypeptide omvatten. Een voorbeeld van een nucleïnezuurconstruct dat voor dit soort van RAGE-fusie-eiwit 20 codeert is getoond in Figuur 3 (SEQ ID NO: 31) en in Figuur 18 (SEQ ID NO: 55). Zoals in Figuur 3 en Figuur 18 is getoond codeert de coderende sequentie van nucleoti-den 1 tot 408 (in vetgedrukte letters gemarkeerd) voor de N-eindstandige eiwitsequen-tie van RAGE, terwijl de sequentie van 409-1041 voor de eiwitsequentie van IgGl (γΐ) codeert.

25 Wanneer het wordt verkregen van SEQ ID NO: 31 of SEQ ID NO: 55, of een se quentie die tenminste 90% identiek daar aan is, kan het RAGE-fusie-eiwit de aminozuursequentie van SEQ ID NO: 35 met drie domeinen of het polypeptide waarvan de signaalsequentie is verwijderd omvatten (zie bijvoorbeeld SEQ ID NO: 36 of SEQ ID NO: 37 in Figuur 5 of SEQ ID NO: 57 in Figuur 20). In Figuur 5 en Figuur 20 is de 30 aminozuursequentie van RAGE met een vetgedrukt lettertype gemarkeerd. Zoals in Figuur 6B is getoond bevatten de eerste 136 aminozuren van het RAGE-fusie-eiwit TTP-3000 met de volledige lengte als het RAGE-polypeptide een signaalsequentie die aminozuren 1-22/23 omvat, het V-immunoglobuline-domein (waaronder de ligand- 41 bindingsplaats) die aminozuren 23/24-116 omvat en een interdomein linker die aminozuren 117 tot 136 omvat. De sequentie van 137-346 omvat de Cy\2- en Ch3-immunoglobuline-domeinen van IgG.

De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen verbeterde in vi-5 vo stabiliteit omvatten ten opzichte van RAGE-polypeptiden die niet een tweede polypeptide omvatten. Het RAGE-fusie-eiwit kan verder worden gemodificeerd voor het verhogen van de stabiliteit, de werkzaamheid, kracht en de biologische beschikbaarheid. De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen aldus door post-translationele bewerking of door chemische modificatie worden gemodificeerd. Het 10 RAGE-fusie-eiwit kan bijvoorbeeld synthetisch worden bereid om L-, D- of nietnatuurlijke aminozuren, alfa-digesubstitueerde aminozuren of N-alkyl-aminozuren te omvatten. In aanvulling kunnen eiwitten worden gemodificeerd door acetylatie, acyla-tie, ADP-ribosylatie, amidatie, verbinding van lipiden zoals fosfatidyl-inositol, vorming van disulfide-bindingen en dergelijke. Polyethyleenglycol kan bovendien worden toe-15 gevoegd voor het verhogen van de biologische stabiliteit van het RAGE-fusie-eiwit.

Binding van antagonisten van RAGE aan RAGE-fusie-eiwitten

De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen een aantal toe-20 passingen omvatten. Het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding kan bijvoorbeeld worden gebruikt in een bindingstest voor het identificeren van liganden voor RAGE, zoals agonisten, antagonisten of modulators van RAGE.

In één uitvoeringsvorm verschaft de onderhavige uitvinding bijvoorbeeld een werkwijze voor detectie van modulators van RAGE, die omvat (a) het verschaffen van 25 een RAGE-fusie-eiwit die een RAGE-polypeptide gekoppeld aan een tweede niet-RAGE polypeptide omvat, waarbij het RAGE-polypeptide een ligand-bindingsplaats omvat; (b) het mengen van een verbinding van belang en een ligand dat een bekende bindingsaffiniteit voor RAGE heeft met het RAGE-fusie-eiwit; en (c) het meten van binding van het bekende RAGE-ligand aan het RAGE-fusie-eiwit in de aanwezigheid 30 van de verbinding van belang. In een uitvoeringsvorm omvat de ligand-bindingsplaats het meest N-eindstandig domein van het RAGE-fusie-eiwit.

De RAGE-fusie-eiwitten kunnen ook kits verschaffen voor de detectie van modulators van RAGE. In één uitvoeringsvorm kan een kit van de onderhavige uitvinding 42 bijvoorbeeld omvatten (a) een verbinding die en bekende bindingsaffiniteit voor RAGE heeft als een positieve controle; (b) een RAGE-fusie-eiwit dat een RAGE-polypeptide gekoppeld aan een tweede, niet-RAGE-polypeptide omvat, waarbij het RAGE-polypeptide een bindingsplaats voor een ligand van RAGE omvat; en (c) instructies 5 voor gebruik. In een uitvoeringsvorm omvat de ligand-bindingsplaats het meest N-eindstandige domein van het RAGE-fusie-eiwit.

Het RAGE-fusie-eiwit kan bijvoorbeeld in een bindinigstest worden gebruikt voor het identificeren van mogelijke liganden van RAGE. In één voorbeeld van een uitvoeringsvorm van een dergelijke bindingstest kan een bekende ligand van RAGE op een 10 vast substraat (bijvoorbeeld Maxisorb platen) worden bekleed bij een concentratie van ongeveer 5 microgram per putje, waarbij elk putje een totaal volume van ongeveer 100 microliter (μΐ) bevat. De platen kunnen gedurende de nacht bij 4°C worden geïncubeerd om het mogelijk te maken dat het ligand op de plaat absorbeert. Als alternatief kunnen kortere incubatieperioden bij hogere temperaturen (bijvoorbeeld kamertemperatuur) 15 worden gebruikt. Na een tijdsperiode om het mogelijk te maken dat het ligand aan het substraat bindt, kunnen de testputjes worden afgezogen en een blokking buffer (bijvoorbeeld, 1% BS A in 50 mM imidizoolbuffer, pH 7,2) kan worden toegevoegd om niet-specifieke binding te blokkeren. De blokking buffer kan bijvoorbeeld gedurende 1 uur bij kamertemperatuur aan de platen worden toegevoegd. De platen kunnen vervol-20 gens worden afgezogen en/of worden gewassen met een wasbuffer. In één uitvoeringsvorm kan een buffer die 20 mM Imidizool, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20, 5 mM CaCh en 5 mM MgCh, pH 7,2 bevat als een wasbuffer worden gebruikt. Het RAGE-fusie-eiwit kan vervolgens bij toenemende verdunningen aan de testputjes worden toegevoegd. Het RAGE-fusie-eiwit kan vervolgens worden toegestaan met het geïmmobi-25 liseerde ligand in het testputje te incuberen, zodanig dat binding een evenwicht kan bereiken. In één uitvoeringsvorm wordt het RAGE-fusie-eiwit toegestaan gedurende ongeveer één uur bij 37°C met het geïmmobiliseerde ligand te incuberen. In andere uitvoeringsvormen kunnen langere incubatieperioden bij lagere temperaturen worden gebruikt. Nadat het RAGE-fusie-eiwit en het geïmmobiliseerde ligand zijn geïncubeerd 30 kan de plaat worden gewassen voor het verwijderen van elk niet-gebonden RAGE-fusie-eiwit. Het RAGE-fusie-eiwit dat is gebonden aan het geïmmobiliseerde ligand kan op een verscheidenheid van wijzen worden gedetecteerd. In één uitvoeringsvorm maakt de detectie gebruik van ELISA. In één uitvoeringsvorm kan een immuundetec- 43 tiecomplex dat een monoklonaal anti-humaan IgGl van muis, gebiotinyleerd anti-muis IgG van geit en een met avidine gekoppelde alkalische fosfatase bevat, worden toegevoegd aan het RAGE-fusie-eiwit dat in het testputje is geïmmobiliseerd. Het immuun-detectiecomplex kan worden toegestaan te binden aan het geïmmobiliseerde RAGE-5 fusie-eiwit, zodanig dat de binding tussen het RAGE-fusie-eiwit en het immuundetec-tiecomplex een evenwicht bereikt. Het complex kan bijvoorbeeld worden toegestaan gedurende één uur bij kamertemperatuur aan het RAGE-fusie-eiwit te binden. Op dat punt kan elk niet-gebonden complex worden verwijderd door het wassen van het testputje met wasbuffer. Het gebonden complex kan worden gedetecteerd door het toe νοεί 0 gen van het substraat voor alkalische fosfatase, /rarn-nitrofenylfosfaat (PNPP) en het meten van de omzetting van PNPP naar para-nitrofenol (PNP) als een toename van absorptie bij 405 nm.

In een uitvoeringsvorm bindt het RAGE-ligand aan het RAGE-fusie-eiwit met een affiniteit in het nanomolaire (nM) of micromolaire (μΜ) traject. Een experiment 15 dat binding van RAGE-liganden aan RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding illustreert is in Figuur 7 getoond. Oplossingen van TTP-3000 (TT3) en TTP-4000 (TT4) die initiële concentraties hebben van respectievelijk 1,082 mg/ml en 370 pg/ml, werden bereid. Zoals in Figuur 7 wordt getoond zijn de RAGE-fusie-eiwitten TTP-3000 en TTP-4000 bij verscheidene verdunningen in staat aan geïmmobiliseerde 20 RAGE-liganden Amyloïde-bèta (Abèta) (Amyloid Bèta (1-40) van Biosource), SI00b (SI00) en amfoterine (Ampho) te binden, dat in een toename van absorptie resulteert. In de afwezigheid van ligand (d.w.z. het bekleden met alleen BSA) was er geen toename in absorptie.

De bindingstest van de onderhavige uitvinding kan worden gebruikt voor het 25 kwantificeren van binding van ligand aan RAGE. In andere uitvoeringsvormen kunnen RAGE-liganden aan het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding binden met bindingsaffiniteiten die variëren van 0,1 tot 1000 nanomolair (nM) of van 1 tot 500 nM of van 10 tot 80 nM.

Het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding kan ook worden gebruikt 30 voor het identificeren van verbindingen die het vermogen hebben om aan RAGE te binden. Zoals in respectievelijk Figuren 8 en 9 is getoond kan een RAGE-ligand worden getest op het vermogen ervan om te concurreren met geïmmobiliseerd amyloïde bèta om te binden aan RAGE-fusie-eiwitten TTP-4000 (TT4) of TTP-3000 (TT3). Het 44 kan aldus worden gezien dat een RAGE-ligand bij een uiteindelijke testconcentratie (FAC) van 10 μΜ binding van RAGE-fusie-eiwit aan amyloïde-bèta bij concentraties van 1:3, 1:10, 1:30 en 1:100 van de initiële TTP-4000 oplossing (Figuur 8) of TTP-3000 (Figuur 9) kan verdringen.

5

Modulatie van cellulaire effectoren

Uitvoeringsvormen van de RAGE-fiisie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen worden gebruikt voor het moduleren van een biologische respons die wordt 10 bemiddeld door RAGE. De RAGE-fusie-eiwitten kunnen bijvoorbeeld worden ontworpen voor het moduleren van RAGE-geïnduceerde toename van genexpressie. In een uitvoeringsvorm kunnen RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding aldus worden gebruikt voor het moduleren van de functie van biologische enzymen. De interactie tussen RAGE en de liganden ervan kan bijvoorbeeld oxidatieve stress en active-15 ring van NF-κΒ en NF-tcB-gereguleerde genen, zoals de cytokinen IL-Ιβ, TNF-α en dergelijke. In aanvulling is het getoond dat verscheidene andere regulerende routes, zoals die welke p21ras, MAP-kinasen, ERK1 en ERK2 behelzen, worden geactiveerd door binding van AGE’s en andere liganden aan RAGE.

Het gebruik van de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding voor het 20 moduleren van de expressie van de cellulaire effector TNF-α is in Figuur 10 getoond. THP-1 myeloïde cellen kunnen worden gekweekt in RPM1-1640 media dat is aangevuld met 10% FBS en worden geïnduceerd om TNF-α uit te scheiden door middel van stimulatie van RAGE met SI00b. Wanneer een dergelijke stimulatie plaatsvindt in de aanwezigheid van een RAGE-fusie-eiwit kan inductie van TNF-α door binding van 25 SI00b aan RAGE worden geremd. Zoals aldus in Figuur 10 is getoond verlaagt de toe voeging van 10 gg RAGE-fusie-eiwit TTP-3000 (TT3) of TTP-4000 (TT4) inductie van TNF-α door SlOOb met ongeveer 50% tot 75%. RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 kan tenminste net zo effectief zijn in het blokkeren van inductie van TNF-α door SlOOb als sRAGE (Figuur 10). Specificiteit van de remming voor de RAGE-sequenties van TTP-30 4000 en TTP-3000 is getoond door het experiment waarbij alleen IgG werd toegevoegd aan met SlOOb-gestimuleerde cellen. Toevoeging van IgG en SlOOb aan de test toont dezelfde niveaus van TNF-α als SlOOb alleen.

45

Fysiologische kenmerken van RAGE-fusie-eiwitten

Terwijl sRAGE een therapeutisch voordeel kan hebben bij de modulatie van RAGE-bemiddelde ziekten kan humaan sRAGE beperkingen hebben als een zelfstan-5 dig therapeutisch middel op basis van de relatieve korte halfwaardetijd van sRAGE in plasma. Terwijl bijvoorbeeld sRAGE van knaagdieren een halfwaardetijd in normale en diabetische ratten heeft van bij benadering 20 uur, heeft humaan sRAGE een halfwaardetijd van minder dan 2 uur wanneer het wordt bepaald door retentie van de immunore-activiteit van sRAGE (Renard et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 290:1458-1466 (1999)). 10 Voor het genereren van een therapeutisch middel van RAGE dat overeenkomsti ge kenmerken van binding heeft als sRAGE maar een meer stabiel farmacokinetisch profiel heeft, kan een RAGE-fusie-eiwit dat een bindingsplaats voor een ligand van RAGE gekoppeld aan één of meer humane immunoglobuline-domeinen omvat, worden gebruikt. Zoals in het vakgebied bekend is, kunnen de immunoglobuline-domeinen het 15 Fc-deel van de zware keten van het immunoglobuline omvatten.

Het Fc-deel van het immunoglobuline kan verscheidene eigenschappen aan een RAGE-fusie-eiwit verlenen. Het Fc-fusie-eiwit kan bijvoorbeeld de halfwaardetijd in serum van dergelijke fusie-eiwitten verlengen, vaak van uren tot verscheidene dagen. De toename in farmacokinetische stabiliteit is in het algemeen een resultaat van de in-20 teractie van de linker tussen de Ch2- en CH3-gebieden van het Fc-fragment met de FcRn-receptor (Wines et al., J. Immunol., 164:5313-5318 (2000)).

Alhoewel fusie-eiwitten die een Fc-polypeptide van een immunoglobuline omvatten het voordeel van verhoogde stabiliteit kunnen verschaffen, kunnen fusie-eiwitten met immunoglobuline een ontstekingsreactie opwekken wanneer ze in een gastheer 25 worden geïntroduceerd. De ontstekingsreactie kan voor een groot deel te wijten zijn aan het Fc-deel van het immunoglobuline van het fusie-eiwit. De ontstekingsbevorderende respons kan een gewenst kenmerk zijn indien het doelwit tot expressie wordt gebracht op een celsoort die ziek is die vernietigd dient te worden (bijvoorbeeld een kankercel of een populatie van lymfocyten die een auto-immuun-ziekte veroorzaken). De ontste-30 kingsbevorderende reactie kan een neutraal kenmerk zijn indien het doelwit een oplosbaar eiwit is, omdat de meeste oplosbare eiwitten niet immunoglobulinen activeren. De ontstekingsbevorderende reactie kan echter een negatief kenmerk zijn indien het doelwit tot expressie wordt gebracht op celsoorten waarvan de vernietiging tot ongewenste 46 bijwerkingen zou leiden. De ontstekings-bevorderende reactie kan ook een negatief kenmerk zijn indien een ontstekingscascade ontstaat op de plaats van een binding van een fusie-eiwit aan een doelwitweefsel omdat vele bemiddelaars van een ontsteking schadelijk voor het omringende weefsel zouden kunnen zijn en/of systemische effecten 5 kunnen veroorzaken.

De primaire ontstekings-bevorderende plaats op Fc-fragmenten van immuno-globuline is aanwezig in het schamiergebied tussen de ChI en Ch2. Dit schamiergebied vertoont interactie met het FcRl-3 op verscheidene leukocyten en veroorzaken dat deze cellen het doelwit aanvallen. (Wines et al, J. Immunol, 164:5313-5318 (2000)).

10 Als therapeutische middelen voor RAGE-bemiddelde ziekten kunnen RAGE- fusie-eiwitten niet de generering van een ontstekingsreactie vereisen. Uitvoeringsvormen van RAGE-fiisie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen aldus een RAGE-fusie-eiwit omvatten dat een RAGE-polypeptide omvat dat is gekoppeld aan een immunoglobuline domein(en), waarbij het Fc-schamiergebied van het immuno-15 globuline is verwijderd en is vervangen door een RAGE-polypeptide. Op deze wijze kan de interactie tussen het RAGE-fusie-eiwit en Fc-receptoren op ontstekingscellen worden geminimaliseerd. Het kan echter belangrijk zijn om de juiste stapeling en andere driedimensionale structurele interacties tussen de verscheidene immuno-globuline-domeinen van het RAGE-fusie-eiwit aan te houden. Uitvoeringsvormen van de RAGE-20 fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen aldus de biologisch inerte, maar structureel overeenkomstige interdomein linker van RAGE die de V- en Cl-domeinen van RAGE scheidt of de linker die de Cl- en C2-domeinen van RAGE scheidt substitueren ter vervanging van het normale schamiergebied van de zware keten van het immunoglobuline. Het RAGE-polypeptide van het RAGE-fusie-eiwit kan aldus een se-25 quentie van een interdomein linker omvatten die van nature stroomafwaarts van een immunoglobuline-domein van RAGE wordt gevonden voor het vormen van een immu-noglobuline-domein/linker fragment van RAGE. Op deze wijze kunnen de driedimensionale interacties tussen de immunoglobuline-domeinen die worden bijgedragen door ofwel RAGE of het immunoglobuline worden aangehouden.

30 In een uitvoeringsvorm kan een RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding een aanzienlijke toename van farmacokinetische stabiliteit in vergelijking met sRAGE omvatten. Figuur 11 toont bijvoorbeeld dat indien het RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 met liganden ervan verzadigd is, het een halfwaardetijd kan bereiken van meer dan 300 uur.

47

Dit kan worden vergeleken met de halfwaardetijd van sRAGE van maar een paar uur in humaan plasma.

In een uitvoeringsvorm kunnen aldus de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding worden gebruikt voor het tegenwerken van de binding van fysiologische 5 liganden aan RAGE als een wijze voor het behandelen van RAGE-bemiddelde ziekten zonder het genereren van een onaanvaardbare omvang van ontsteking. De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen een aanzienlijke afname van het genereren van een ontstekings-bevorderende reactie vertonen in vergelijking met IgG. Zoals bijvoorbeeld in Figuur 12 is getoond stimuleert het RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 niet 10 afgifte van TNF-α van cellen onder omstandigheden waarbij stimulatie van afgifte van TNF-α door humaan IgG wordt gedetecteerd.

Behandeling van ziekte met RAGE-fusie-eiwitten 15 De onderhavige uitvinding kan ook werkwijzen voor de behandeling van RAGE- bemiddelde stoornis bij een humane patiënt omvatten. In een uitvoeringsvorm kan de werkwijze omvatten het aan een patiënt toedienen van een RAGE-fusie-eiwit dat een RAGE-polypeptide omvat dat een bindingsplaats voor een ligand van RAGE gekoppeld aan een tweede niet-RAGE-polypeptide omvat.

20 In een uitvoeringsvorm kan een RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding door verscheidene routes worden toegediend. Toediening van het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding kan gebruik maken van intraperitoneale (IP) injectie. Als alternatief kan het RAGE-fusie-eiwit op orale wijze, intranasale wijze of als een aërosol worden toegediend. In een andere uitvoeringsvorm is toediening intraveneus 25 (IV). Het RAGE-fusie-eiwit kan ook op subcutane wijze worden geïnjecteerd. In een andere uitvoeringsvorm is toediening van het RAGE-fusie-eiwit intra-arterieel. In een andere uitvoeringsvorm is toediening sublinguaal. Toediening kan ook gebruik maken van een capsule met afgifte gedurende de tijd. In nog een andere uitvoeringsvorm kan toediening transrectaal zijn zoals door een zetpil of dergelijke. Subcutane toediening 30 kan bijvoorbeeld bruikbaar zijn voor het behandelen van chronische stoornissen wanneer het zelfstandig toedienen gewenst is.

48

Een verscheidenheid van dierlijke modellen zijn gebruikt voor het valideren van het gebruik van de verbindingen die RAGE moduleren als therapeutische middelen. Voorbeelden van deze modellen zijn als volgt: a) sRAGE remde neointima vorming bij een model van rat van restenose volgend op 5 arteriële schade bij zowel diabetische en normale ratten door het remmen van endothe- liale, gladde spieren en macrofaag-activering door middel van RAGE (Zhou et al, Circulation 107:2238-2243 (2003)); b) Remming van interacties van RAGE/ligand door het gebruik van ofwel sRAGE of een anti-RAGE antilichaam, verlaagde de vorming van amyloïde-plaques bij een model 10 van muis van systemische amyloidosis (Yan et al, Nat. Med., 6:643-651 (2000)). Samengaand met de vermindering van amyloïde plaques was er een verlaging van de in-flammatoire cytokinen, interleukine-6 (IL-6) en macrofaag-kolonie-stimulerende factor (M-CSF) alsook verlaagde activering van NF-κΒ bij de behandelde dieren; c) RAGE transgene muizen (muizen die RAGE tot overexpressie brengen en muizen 15 die RAGE dominant negatief tot expressie brengen) vertonen plaque-vorming en cognitieve gebreken bij een model van muis van AD (Arancio et al, EMBOJ., 23:4096-4105 (2004)); d) Behandeling van diabetische ratten met sRAGE verlaagde de vasculaire permeabiliteit (Bonnardel-Phu et al, Diabetes, 48:2052-2058 (1999)); 20 e) Behandeling met sRAGE verlaagde atherosclerotische beschadigingen bij diabetische apolipoproteïne E-null muizen en voorkwam de functionele en morfologische indices van diabetische nefropathie bij db/db muizen (Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003)); en f) sRAGE verzwakte de ernst van ontsteking in een model van muis van collageen-25 geïnduceerde artritis (Hofmann et al, Genes Immunol, 3:123-135 (2002)), een model van muis van experimentele allergische encefalomyelitis (Yan et al, Nat. Med. 9:28-293 (2003)) en een model van muis van inflammatoire darmziekte (Hofmann et al, Cell, 97:889-901 (1999)).

In een uitvoeringsvorm kunnen de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uit-30 vinding aldus worden gebruikt voor het behandelen van een symptoom van diabetes en/of complicaties resulterend van diabetes die door RAGE worden bemiddeld. In andere uitvoeringsvormen kan het symptoom van diabetes of late complicaties van diabe- 49 tes diabetische nefropathie, diabetische retinopathie, een diabetische voetzweer, een cardiovasculaire complicatie van diabetes of diabetische neuropathie omvatten.

Oorspronkelijk geïdentificeerd als een receptor voor moleculen waarvan de expressie ervan is geassocieerd met de pathologie van diabetes, is RAGE zelf essentieel 5 voor de pathofysiologie van diabetische complicaties. In vivo is het getoond dat remming van interactie van RAGE met de liganden ervan therapeutisch is in meerdere modellen van diabetische complicaties en ontsteking (Hudson et al., Arch. Biochem. Biop-hys., 419:80-88 (2003)). Een behandeling van twee maanden met anti-RAGE antili-chamen normaliseerde bijvoorbeeld de nierfunctie en verlaagde abnormale histopatho-10 logie van nieren bij diabetische muizen (Flyvbjerg et al, Diabetes 53:166-172 (2004)). Behandeling met een oplosbare vorm van RAGE (sRAGE) dat aan liganden van RAGE bindt en interacties van RAGE/ligand remt, verlaagde bovendien atherosclerotische beschadigingen bij diabetische apolipoproteïne E-null muizen en verzwakte de functionele en morfologische pathologie van diabetische nefropathie bij db/db muizen (Bucci-15 arelli et al, Circulation 106:2827-2835 (2002)).

Het is ook getoond dat niet-enzymatische glycoxidatie van macromoleculen, die uiteindelijk resulteert in de vorming van advanced glycatie endproducts (AGE’s) is verhoogd op plaatsen van ontsteking, bij renaal falen, in de aanwezigheid van hyper-glycemie en andere aandoeningen die zijn geassocieerd met systemische of lokale oxi-20 dant stress (Dyer et al, J. Clin. Invest., 91:2463-2469 (1993); Reddy et al, Biochem., 34:10872-10878 (1995); Dyer et al, J. Biol. Chem., 266:11654-11660 (1991); Degen-hardt et al, Cell Mol Biol, 44:1139-1145(1998)). Accumulatie van AGE’s in de vascu-latuur kan focaal voorkomen, zoals in het amyloïde van gewrichten dat is samengesteld uit AGE-p2-microglobuline dat wordt gevonden bij patiënten met dialyse-verwante 25 amyloidosis (Miyata et al, J. Clin. Invest., 92:1243-1252 (1993); Miyata et al., J Clin. Invest, 98:1088-1094 (1996)), of algemeen zoals wordt geïllustreerd door de vascula-tuur en weefsels van patiënten met diabetes (Schmidt et al, Nature Med., 1:1002-1004 (1995)). De progressieve accumulatie van AGE’s gedurende de tijd bij patiënten met diabetes suggereert dat endogene mechanismen van klaring niet in staat zijn om op ef-30 fectieve wijze te functioneren op plaatsen van afzetting van AGE. Dergelijke geaccumuleerde AGE’s hebben het vermogen om cellulaire eigenschappen te veranderen door een aantal mechanismen. Alhoewel RAGE bij lage niveaus tot expressie wordt gebracht in normale weefsels en vasculatuur is het getoond dat het in een omgeving 50 waarbij de liganden van de receptor accumuleren dat RAGE opwaarts wordt gereguleerd (Li et al, J. Biol. Chem., 272:16498-16506 (1997); Li et al, J. Biol. Chem., 273:30870-30878 (1998); Tanaka et al., J Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000)). Expressie van RAGE is verhoogd in endotheel, gladde spiercellen en infiltrerende mo-5 nonucleaire fagocyten in diabetische vasculatuur. Studies in celkweek hebben ook getoond dat interactie van AGE-RAGE veranderingen van cellulaire eigenschappen veroorzaakt die belangrijk zijn bij vasculaire homeostase.

Het gebruik van de RAGE-fusie-eiwitten bij de behandeling van diabetes verwante pathologie is in Figuur 13 geïllustreerd. Het RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 werd be-10 oordeeld in een model van een diabetische rat van restenose die het meten van proliferatie van gladde spiercellen en intima uitbreiding volgend op vasculaire schade behelsde. Zoals in Figuur 13 is geïllustreerd kan behandeling met TTP-4000 de verhouding van intima/media (I/M) aanzienlijk verlagen (Figuur 13A; Tabel 1) bij diabetes-geassocieerde restenose op een dosis-reagerende wijze. Behandeling met TTP-4000 15 kan ook restenose-geassocieerde proliferatie van vasculaire gladde spiercellen aanzienlijk verlagen op een dosis-afhankelijke wijze.

Tabel 1

Effect van TTP-4000 op restenose in een model van rat

IgG (n=9) TTP-4000 (n=9) TTP-4000 (n=9)

Lage dosis** Hoge dosis** (0,3 mg/dier qod x 4) (1,0 mg/dier qod x 4)

Luminaal gebied (mm2) 0,2 ±0,03 0,18 ±0,04 0,16 ±0,02

Mediaal gebied(mmJ) 0,12 ±0,01 0,11 ±0,02 0,11 ±0,01 I/M verhouding 1,71 ±0,27 1,61 ±0,26 1,44* ±0,15 20 *P<0,05; ** Voor zowel hoge en lage dosis werd een loading-dosis van 3 mg/dier gebruikt.

In andere uitvoeringsvormen kunnen de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding ook worden gebruikt voor het behandelen of omkeren van amyloidosis en de ziekte van Alzheimer. RAGE is een receptor voor amyloïde-bèta (Αβ) alsook andere 25 amyloïdogene eiwitten waaronder SAA en amyline (Yan et al, Nature, 382:685-691 (1996); Yan et al, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 94:5296-5301 (1997); Yan et al, Nat. Med., 6:643-651 (2000); Sousa et al, Lab Invest., 80:1101-1110 (2000)). De RAGE-liganden, waaronder AGE’s, SI00b en Αβ-eiwitten, worden ook gevonden in weefsel 51 dat de seniele plaque bij mensen omgeeft (Luth et al, Cereb. Cortex 15:211-220 (2005); Petzold et al, Neurosci. Lett., 336:167-170 (2003); Sasaki et al, Brain Res., 12:256-262 (2001); Yan et al, Restor. Neurol Neruosci., 12:167-173 (1998)). Het is getoond dat RAGE β-sheet fibrillair materiaal bindt ongeacht de samenstelling van de subeenheden 5 (amyloïde-β peptide, amyline, serum amyloïde A, prion-afkomstig peptide) (Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996); Yan et al, Nat. Med, 6:643-651 (2000)). In aanvulling is het getoond dat afzetting van amyloïde in verhoogde expressie van RAGE resulteert. In de hersenen van patiënten met de ziekte van Alzheimer (AD) neemt expressie van RAGE bijvoorbeeld toe in neuronen en glia (Yan, et al, Nature 382:685-691 (1996)). 10 Gelijktijdig met expressie van liganden van RAGE wordt RAGE opwaarts gereguleerd in astrocyten en microgliale cellen in de hippocampus van individuen met AD maar is niet opwaarts gereguleerd bij individuen die niet AD hebben (Lue et al, Exp. Neurol, 171:29-45 (2001)). Deze vindingen suggereren dat cellen die RAGE tot expressie brengen worden geactiveerd door middel van interacties van RAGE/RAGE-ligand in de 15 nabijheid van de seniele plaques. Αβ-bemiddelde activering van microgliale cellen kan in vitro ook worden geblokkeerd met antilichamen die zijn gericht tegen het ligand-bindende domein van RAGE (Yan et al., Proc. Natl Acad. Sci., USA, 94:5296-5301 (1997)). Het is ook getoond dat RAGE als een focaal punt kan dienen voor verzameling van fibrillen (Deane et al, Nat. Med. 9:907-913 (2003)).

20 Remming van interacties van RAGE/Jigand door het gebruik van ofwel sRAGE

of een anti-RAGE-antilichaam kan in vivo ook vorming van amyloïde plaques verlagen in een model van muis van systemische amyloïdose (Yan et al, Nat. Med., 6:643-651 (2000)). Dubbele transgene muizen die humaan RAGE en humaan amyloïde voorloper-eiwit (APP) met de Swedish en London mutaties (mutant hAPP) tot overexpressie 25 brengen in neuronen ontwikkelen eerder leerstoornissen en neuropathologische abnormaliteiten dan de transgene tegenhangers ervan met een enkele mutante hAPP. In tegenstelling tonen dubbele transgene muizen met afgenomen capaciteit van Αβ-signalering doordat de neuronen een dominante negatieve vorm van RAGE tot expressie brengen in dezelfde mutante hAPP achtergrond, een vertraagd begin van neuropa-30 thologische abnormaliteiten en abnormaliteit van leren in vergelijking met de transgene tegenhangers ervan van een enkele APP (Arancio et al., EMBO J., 23:4096-4105 (2004)).

52

In aanvulling is het getoond dat remming van interactie van RAGE-amyloïde expressie van cellulair RAGE en merkers van stress van cellen (alsook activering van NF-κΒ) verlaagd en afzetting van amyloïde te niet doet (Yan et al, Nat. Med., 6:643-651 (2000)) dat een rol suggereert voor interactie van RAGE-amyloïde bij zowel per-5 turbatie van cellulaire eigenschappen in een omgeving die is verrijkt met amyloïde (zelfs in vroege fasen) alsook bij accumulatie van amyloïde.

De RAGE-fiisie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen aldus ook worden gebruikt voor het verlagen van amyloïdose en voor het verlagen van amyloïde plaques en cognitieve dysfunctie die met de ziekte van Alzheimer (AD) zijn geassocieerd. 10 Zoals hierboven is beschreven is getoond dat sRAGE zowel de vorming van amyloïde plaques in de hersenen verlaagt en daaropvolgend de merkers voor ontsteking doet toenemen bij een dierlijk model van AD. Figuren 14A en 14B tonen dat muizen die AD hebben en gedurende 3 maanden worden behandeld met ofwel TTP-4000- of sRAGE van muis minder amyloïde bèta (Αβ) plaques en minder cognitieve dysfunctie hadden 15 dan dieren die een hulpstof of een humane IgG als negatieve controle (IgGl) kregen. Zoals sRAGE kan TTP-4000 ook de inflammatoire cytokinen IL-1 en TNF-α die met AD zijn geassocieerd verlagen (gegevens niet getoond).

RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen ook worden gebruikt voor het behandelen van arteriosclerose en andere cardiovasculaire stoornissen. Het is 20 aldus getoond dat ischemische hartziekte in het bijzonder veel voorkomt bij patiënten met diabetes (Robertson, et al, Lab Invest., 18:538-551 (1968); Kannel et al, J. Am. Med. Assoc, 241:2035-2038 (1979); Kannel et al, Diab. Care, 2:120-126 (1979)). In aanvulling hebben studies getoond dat arteriosclerose bij patiënten met diabetes meer wordt versneld en uitgebreid is dan bij patiënten die niet aan diabetes lijden (zie bij-25 voorbeeld Waller et al, Am. J. Med., 69:498-506 (1980); Crall et al, Am. J. Med. 64:221-230 (1978); Hamby et al, Chest, 2:251-257 (1976); en Pyorala et al, Diab. Me-tab. Rev., 3:463-524 (1978)). Alhoewel er veel redenen zijn voor het versnellen van arteriosclerose in het verband met diabetes, is het getoond dat verlaging van AGE’s de vorming van plaques kan verminderen.

30 De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen bijvoorbeeld ook worden gebruikt voor het behandelen van een beroerte. Wanneer TTP-4000 werd vergeleken met sRAGE bij een dierlijk model van beroerte dat relevant is voor de ziekte werd gevonden dat TTP-4000 aanzienlijk sterkere verlaging van het volume van het 53 infarct verschaft. Bij dit model is de middelste halsslagader van een muis geligeerd en vervolgens door reperfusie behandeld voor het vormen van een infarct. Voor het bepalen van de werkzaamheid van RAGE-ftxsie-eiwitten voor het behandelen of voorkomen van beroerte werden muizen met sRAGE of TTP-4000 of controle immunoglobuline 5 behandeld vlak voorafgaand aan reperfusie. Zoals in Tabel 2 kan worden gezien was TTP-4000 meer werkzaam dan sRAGE bij het beperken van het gebied van een infarct bij deze dieren dat suggereert dat TTP-4000, door de betere halfwaardetijd in plasma, in staat was een betere bescherming te onderhouden dan sRAGE.

10 Tabel 2

Verlaging van infarct bij beroerte % verlaging van infarct** sRAGE 15%* TËÏMÖMÖÖÖjliö 38%* TTP-4000 (300 Mg) 21%* TTP-4000 (300 Mg) 10%*

IgG Isotype controle (300 μg) 4%* * Significant aan p<0,001; ** In vergelijking met zoutoplossing

In een andere uitvoeringsvorm kunnen de RAGE-fusie-eiwitten van de onderha-15 vige uitvinding worden gebruikt voor het behandelen van kanker. In één uitvoeringsvorm omvat de kanker die wordt behandeld door het gebruik van de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kankercellen die RAGE tot expressie brengen. Soorten kanker die bijvoorbeeld met het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding kunnen worden behandeld omvatten sommige soorten longkanker, sommige glio-20 men, sommige papillomen en dergelijke. Amfotherine is een groep I niet-histon chromosomaal DNA-bindend eiwit met hoge mobiliteit (Rauvala et al, J. Biol. Chem., 262:16625-16635 (1987); Parkikinen et al, J. Biol. Chem. 268:19726-19738 (1993)) waarvan is getoond dat het met RAGE interactie vertoont. Het is getoond dat amfotherine uitgroei van neurieten bevordert alsook als een oppervlak dient voor het verzame-25 len van protease-complexen in het fibrinolytische systeem (waarvan ook bekend is dat het bijdraagt aan mobiliteit van cellen). In aanvulling is een lokaal remmend effect van de groei van tumoren van het blokkeren van RAGE waargenomen in een model van een primaire tumor (C6-glioom) het model van Lewis longmetastase (Taguchi et al, 54

Nature 405:354-360 (2000)) en op spontane wijze opkomende papillomen bij muizen die het v-Ha-rav transgen tot expressie brengen (Leder et al, Proc. Natl. Acad. Sci, 87:9178-9182(1990)).

In nog een andere uitvoeringsvorm kunnen de RAGE-fiisie-eiwitten van de on-5 derhavige uitvinding worden gebruikt voor het behandelen van ontsteking. In andere uitvoeringsvormen kunnen de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding worden gebruikt voor het behandelen van ontsteking die is geassocieerd met inflamma-toire darmziekte, ontsteking die is geassocieerd met reumatoïde artritis, ontsteking die is geassocieerd met psoriasis, ontsteking die is geassocieerd met multipele sclerose, 10 ontsteking die is geassocieerd met hypoxie, ontsteking die is geassocieerd met beroerte, ontsteking die is geassocieerd met hartaanval, ontsteking die is geassocieerd met he-morrhagische shock, ontsteking die is geassocieerd met sepsis, ontsteking die is geassocieerd met orgaantransplantatie, ontsteking die is geassocieerd met verzwakte genezing van wonden of ontsteking die is geassocieerd met afstoting van eigen (bijvoor-15 beeld auto-immuun) of niet-eigen (bijvoorbeeld getransplanteerde) cellen, weefsel of organen.

Volgend op trombolytische behandeling infiltreren ontstekingscellen zoals gra-nulocyten het ischemische weefsel en produceren zuurstofradicalen die meer cellen kunnen vernietigen dan door de hypoxie werden gedood. Het is getoond dat remming 20 van de receptor op de neutrofiel, die er verantwoordelijk voor is dat de neutrofielen in staat zijn de weefsels binnen te dringen, met antilichamen of andere eiwit-antagonisten deze reactie verzwakt. Omdat RAGE een ligand is voor deze neutrofïel-receptor kan een RAGE-fusie-eiwit dat een fragment van RAGE bevat werken als een lokmiddel en kan voorkomen dat de neutrofiel naar de plaats van reperfusie beweegt en aldus verdere 25 vernietiging van weefsel voorkomt. De rol van RAGE bij het voorkomen van ontsteking kan worden aangegeven door studies die tonen dat sRAGE neointimale uitbreiding in een model van rat van restenose volgend op arteriële beschadiging bij zowel diabeti-sche en normale ratten remt, vermoedelijk door het remmen van proliferatie van endot-heliale gladde spiercellen en activering van macrofagen door middel van RAGE (Zhou 30 et al, Circulation, 107:2238-2243 (2003)). In aanvulling remde sRAGE modellen van ontsteking waaronder vertraagd type van hypergevoeligheid, experimentele auto-immuun encefalitis en inflammatoire darmziekte (Hofman et al, Cell, 97:889-901 (1999)).

55

In een uitvoeringsvorm kunnen de RAGE-fiisie-eiwitten van de onderhavige uitvinding worden gebruikt voor het behandelen van auto-immuun-gebaseerde stoornissen. In een uitvoeringsvorm kunnen de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding bijvoorbeeld worden gebruikt voor het behandelen van nierfalen. De RAGE-5 fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen aldus worden gebruikt voor het behandelen van systemische lupus nefritis of inflammatoire lupus nefritis. Het is bijvoorbeeld getoond dat de SlOO/calgranulinen een familie van nauw verwante calcium-bindende polypeptiden omvatten die wordt gekenmerkt door twee EF-hand gebieden die door een verbindend peptide worden verbonden (Schafer et al, TIBS, 21:134-140 10 (1996); Zimmer et al, Brain Res. Bull, 37:417-429 (1995); Rammes et al, J. Biol.

Chem., 272:9496-9502 (1997); Lugering et al, Eur. J Clin. Invest, 25:659-664 (1995)). Alhoewel ze signaalpeptiden missen is het al lang bekend dat SlOO/calgranulinen toegang tot de extracellulaire ruimte krijgen, in het bijzonder op plaatsen van chronische immuun/ontstekingsreacties, zoals bij cystische fibrose en reumatoïde artritis. RAGE is 15 een receptor voor vele leden van de familie van S100/calgranuline, die de ontstekings-bevorderende effecten ervan op cellen zoals lymfocyten en mononucleaire fagocyten bemiddelt. Ook suggereren studies op modellen van vertraagd soort van hypergevoe-ligheidsreactie, colitis bij IL-10 null muizen, collageengeïnduceerde artritis en experimentele auto-immuun encefalitis dat interactie van RAGE-ligand (vermoedelijk met 20 SlOO/calgranulinen) een voorname rol heeft bij de ontstekingscascade.

Type I diabetes is een auto-immuunstoomis die kan worden voorkomen of kan worden afgezwakt door behandeling met de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding. Het is bijvoorbeeld getoond dat sRAGE de overdracht van splenocyten van niet-zwaarlijvige diabetische (NOD) muizen naar NOD-muizen met ernstige gecombi-25 neerde immunodeficiëntie (NOD-scid muizen) mogelijk kan maken. NOD-scid muizen vertonen niet op spontane wijze diabetes maar vereisen de aanwezigheid van immuno-cyten die in staat zijn de cellen van de eilandjes te vernietigen, zodanig dat diabetes vervolgens wordt geïnduceerd. Het werd gevonden dat ontvangende NOD-scid muizen die met sRAGE zijn behandeld een verlaagd begin van diabetes dat werd geïnduceerd 30 door splenocyten die zijn overgebracht van een diabetische (NOD) muis vertoonden in vergelijking met ontvangende NOD-scid muizen die niet met sRAGE zijn behandeld (Amerikaanse octrooi-publicatie 2002/0122799). Zoals door de uitvinders in deze oc-trooi-publicatie wordt gesteld zijn de experimentele resultaten met het gebruik van 56 sRAGE in dit model relevant voor humane ziekte zoals klinische achtergronden waarin toekomstige immuuntherapieën en transplantatie van eilandjes kunnen voorkomen.

In een uitvoeringsvorm kan een RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding aldus worden gebruikt voor het behandelen van ontsteking die is geassocieerd met 5 transplantatie van tenminste één van een orgaan, een weefsel of een verscheidenheid van cellen van een eerste plaats naar een tweede plaats. De eerste en tweede plaatsen kunnen in verschillende personen of in dezelfde persoon zijn. In andere uitvoeringsvormen omvatten de getransplanteerde cellen, weefsel of orgaan cellen van een alvleesklier, huid, lever, nier, hart, long, beenmerg, bloed, bot, spier, endotheelcellen, 10 slagader, ader, kraakbeen, schildklier, zenuwstelsel of stamcellen. Toediening van de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kan bijvoorbeeld worden gebruikt voor het bewerkstelligen van transplantatie van cellen van de eilandjes van een eerste niet-diabetische persoon naar een tweede diabetische persoon.

In een andere uitvoeringsvorm kan de onderhavige uitvinding een werkwijze ver-15 schaffen voor het behandelen van osteoporose door het toedienen van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding aan een persoon (Zhou et al, J. Exp. Med, 203:1067 -1080 (2006)). In een uitvoeringsvorm, kan de werkwijze voor het behandelen van osteoporose verder de stap van het verhogen van de botdichtheid van de persoon of het verlagen van de snelheid van af-20 name van botdichtheid van een persoon omvatten.

In verscheidene geselecteerde uitvoeringsvormen kan de onderhavige uitvinding aldus een werkwijze verschaffen voor het remmen van de interactie van een AGE met RAGE bij een persoon door het toedienen aan de persoon van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding. De per-25 soon die is behandeld door het gebruik van de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kan een dier zijn. In een uitvoeringsvorm is de persoon een mens. De persoon kan lijden aan een AGE-verwante ziekte zoals diabetes, diabetische complicaties zoals nefropathie, neuropathie, retinopathie, voetzweren, amyloïdoses, of renaal falen en ontsteking. Of de persoon kan een individu met de ziekte van Alzheimer zijn. 30 In een alternatieve uitvoeringsvorm kan de persoon een individu met kanker zijn. In nog andere uitvoeringsvormen kan de persoon lijden aan systemische lupus erythema-tose of inflammatoire lupus nefritis. Andere ziekten kunnen worden bemiddeld door RAGE en kunnen aldus worden behandeld door het gebruik van de RAGE-füsie- 57 eiwitten van de onderhavige uitvinding. In aanvullende alternatieve uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding kunnen de RAGE-fusie-eiwitten worden behandeld voor de behandeling van de ziekte van Crohn, artritis, vasculitis, nefropathieën, retinopathie-en en neuropathieën bij humane of dierlijke patiënten. In andere uitvoeringsvormen kan 5 ontsteking die zowel auto-immuunresponsen (bijvoorbeeld afstoting van eigen) en niet-auto-immuunresponsen (bijvoorbeeld afstoting of niet-eigen) behelsen worden bemiddeld door RAGE en kan aldus worden behandeld door het gebruik van RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding.

Een therapeutisch effectieve hoeveelheid kan een hoeveelheid omvatten die in 10 staat is de interactie van RAGE met een AGE of andere soorten van endogene liganden van RAGE bij een persoon te voorkomen. Dienovereenkomstig zal de hoeveelheid variëren met de persoon die wordt behandeld. Toediening van de verbinding kan elk uur, dagelijks, wekelijks, maandelijks, jaarlijks of als een enkele gebeurtenis zijn. Bij verscheidene alternatieve uitvoeringsvormen kan de effectieve hoeveelheid van het 15 RAGE-fusie-eiwit variëren van ongeveer 1 ng/kg lichaamsgewicht tot ongeveer 100 mg/kg lichaamsgewicht of van ongeveer 10 pg/kg lichaamsgewicht tot ongeveer 50 mg/kg lichaamsgewicht of van ongeveer 100 pg/kg lichaamsgewicht tot ongeveer 20 mg/kg lichaamsgewicht. De werkelijke effectieve hoeveelheid kan worden vastgesteld door dosis/respons testen door het gebruik van werkwijzen die in het vakgebied stan-20 daard zijn (Johnson et al, Diabetes. 42: 1179, (1993)). Zoals bij de deskundigen in het vakgebied bekend is kan de effectieve hoeveelheid aldus afhangen van de biologische beschikbaarheid, biologische activiteit en biologische afbreekbaarheid van de verbinding.

25 Preparaten

De onderhavige uitvinding kan een preparaat omvatten dat een RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding gemengd met een farmaceutisch aanvaardbare drager omvat. Het RAGE-fusie-eiwit kan een RAGE-polypeptide gekoppeld aan een tweede 30 niet-RAGE-polypeptide omvatten. In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-fusie-eiwit een bindingsplaats voor een ligand van RAGE omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat de ligand-bindingsplaats het meest N-eindstandige domein van het RAGE-fusie-eiwit. De bindingsplaats voor een ligand van RAGE kan het V-domein van RAGE of een deel 58 daarvan omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat de bindingsplaats voor het ligand van RAGE SEQ ID NO: 9 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 10 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 47 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is.

5 In een andere uitvoeringsvorm kan de ligand-bindingsplaats aminozuren 22-51 van SEQ ID NO: 1 omvatten. In een andere uitvoeringsvorm kan de ligand-bindingsplaats aminozuren 23-51 van SEQ ID NO: 1 omvatten. In een andere uitvoeringsvorm kan de ligand-bindingsplaats aminozuren 31-51 van SEQ ID NO: 1 omvatten. In een andere uitvoeringsvorm kan de ligand-bindingsplaats aminozuren 31-116 10 van SEQ ID NO: 1 omvatten.

In een uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide zijn gekoppeld aan een polypeptide dat een immunoglobuline-domein of een deel (bijvoorbeeld een fragment daarvan) van een immunoglobuline-domein omvat. In één uitvoeringsvorm omvat het polypeptide dat een immunoglobuline-domein omvat tenminste een deel van tenminste één 15 van de C\\2- of de CH3-domeinen van een humaan IgG.

Het RAGE-eiwit of polypeptide kan humaan RAGE met de volledige lengte (bijvoorbeeld SEQ ID NO: 1) of een fragment van humaan RAGE omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat het RAGE-polypeptide geen residuen van een signaalsequentie. De signaalsequentie van RAGE kan ofwel residuen 1 -22 of residuen 1 -23 van RAGE met 20 de volledige lengte (SEQ ID NO: 1) omvatten. In andere uitvoeringsvormen kan het RAGE-polypeptide een sequentie omvatten die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% of 99% identiek is aan humaan RAGE, of een fragment daarvan.

In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide bijvoorbeeld humaan RAGE, of een fragment daarvan, met Glycine als het eerste residu in plaats van een Methionine om-25 vatten (zie bijvoorbeeld Neeper et al., (1992)). Of het humane RAGE kan RAGE met de volledige lengte waarbij de signaalsequentie is verwijderd (bijvoorbeeld SEQ ID NO: 2 of SEQ ID NO: 3) (Figuren IA en IB) of een deel van die aminozuur-sequentie omvatten.

De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen ook sRAGE 30 (bijvoorbeeld SEQ ID NO: 4), een polypeptide dat tenminste 90% identiek is aan sRAGE, of een fragment van sRAGE omvatten. Het RAGE-polypeptide kan bijvoorbeeld humaan sRAGE, of een fragment daarvan, waarbij Glycine als het eerste residu is in plaats van een Methionine omvatten (zie bijvoorbeeld Neeper et al., (1992)). Of het 59 humane RAGE kan sRAGE omvatten waarbij de signaalsequentie is verwijderd (zie bijvoorbeeld SEQ ID NO: 5 of SEQ ID NO: 6 in Figuur 1C of SEQ ID NO: 45 in Figuur 16A) of een deel van die aminozuursequentie. In andere uitvoeringsvormen kan het RAGE-eiwit een V-domein omvatten (zie bijvoorbeeld SEQ ID NO: 7 of SEQ ID 5 NO: 8 in Figuur ID of SEQ ID NO: 46 in Figuur 16A). Of, een sequentie die tenminste 90% identiek is aan het V-domein of een fragment daarvan kan worden gebruikt. Of het RAGE-eiwit kan een fragment van RAGE omvatten dat een deel van het V-domein omvat (zie bijvoorbeeld SEQ ID NO: 9 of SEQ ID NO: 10 in Figuur ID of SEQ ID NO: 47 in Figuur 16A). In een uitvoeringsvorm kan de ligand-bindingsplaats SEQ ID 10 NO: 9, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 10, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 47, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is omvatten. In nog een andere uitvoeringsvorm is het RAGE-fragment een synthetisch peptide.

Het RAGE-polypeptide kan bijvoorbeeld aminozuren 23-116 van humaan RAGE 15 (SEQ ID NO: 7) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-116 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 8) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-116 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 46), of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het V-domein van RAGE omvatten. Of het RAGE-20 polypeptide kan aminozuren 124-221 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 11) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het Cl-domein van RAGE omvatten. In een andere uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide aminozuren 227-317 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 12) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het C2-domein van RAGE omvatten. Of 25 het RAGE-polypeptide kan aminozuren 23-123 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 13) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-123 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 14) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het V-domein van RAGE en een stroomafwaartse interdomein linker omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 24-123 van humaan RAGE 30 omvatten, waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 48), of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 23-226 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 17) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-226 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 18) 60 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het V-domein, het Cl-domein en de interdomein linker die deze twee domeinen koppelt omvat. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 24-226 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliceert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 50), of een sequentie die 90% 5 identiek daar aan is, omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 23-339 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 5) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-339 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 6) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met sRAGE (d.w.z. coderend voor de V-, Cl- en C2-domeinen en interdomein linkers) omvatten. Of het RAGE-10 polypeptide kan aminozuren 24-339 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 45), of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is omvatten, Of fragmenten van elk van deze sequenties kunnen worden gebruikt.

Het RAGE-fusie-eiwit kan verscheidene soorten van peptiden die niet afkomstig zijn van RAGE of en fragment daarvan omvatten. Het tweede polypeptide van het 15 RAGE-fusie-eiwit kan een polypeptide omvatten dat afkomstig is van een immunoglo-buline. De zware keten (of deel daarvan) kan afkomstig zijn van één van de bekende isotypen van de zware keten: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε), of IgA (a). In aanvulling kan de zware keten (of deel daarvan) afkomstig zijn van één van de bekende subtypen van de zware keten: IgGl (γΐ), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgAl (al), IgA2 20 (a2), of mutaties van deze isotypen of subtypen die de biologische activiteit verande ren. Het tweede polypeptide kan de Ch2- en CH3-domeinen van een humane IgGl of een deel van één ervan of beide van deze domeinen omvatten. Als een voorbeeld van uitvoeringsvormen kan het polypeptide dat de Ch2- en CH3-domeinen van een humaan IgGl of een deel daarvan omvat, SEQ ID NO: 38 of SEQ ID NO: 40 omvatten. Het 25 immunoglobulinepeptide kan worden gecodeerd door de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO: 39 of SEQ ID NO: 41. De immunoglobuline sequentie in SEQ ID NO: 38 of SEQ ID NO: 40 kan ook worden gecodeerd door SEQ ID NO: 52 of SEQ ID NO: 53.

Het Fc-deel van de immunoglobulineketen kan in vivo ontstekingsbevorderend 30 zijn. In één uitvoeringsvorm omvat het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding aldus een interdomein linker die afkomstig is van RAGE in plaats van een interdomein schamierpolypeptide dat van een immunoglobuline afkomstig is.

61

In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-fusie-eiwit aldus verder een RAGE-polypeptide omvatten dat direct gekoppeld is aan een polypeptide dat een CH2-domein van een immunolgobuline of een fragment daarvan omvat. In één uitvoeringsvorm omvat het Cn2-domein of een fragment daarvan SEQ ID NO: 42. In een uitvoeringsvorm 5 omvat het fragment van SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 42 waarvan de eerste tien aminozuren zijn verwijderd.

In één uitvoeringsvorm omvat het RAGE-polypeptide een interdomein linker van RAGE die aan een immunoglobuline-domein van RAGE is gekoppeld zodanig dat het C-eindstandige aminozuur van het immunoglobuline-domein van RAGE is gekoppeld 10 aan het N-eindstandige aminozuur van de interdomein linker en het C-eindstandige aminozuur van de interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een CH2-domein van een immu-noglobuline of een fragment daarvan omvat. Het polypeptide dat een C^-domein van een immunoglobuline of een deel daarvan omvat kan de Ch2- en Cn3-domeinen van 15 een humane IgGl of een deel van beide of één van deze domeinen omvatten. Als een voorbeeld van een uitvoeringsvorm kan het polypeptide dat de Ch2- en CH3-domeinen van een humaan IgGl of een deel daarvan omvat, SEQ ID NO: 38 of SEQ ID NO: 40 omvatten.

Het RAGE-iusie-eiwit van de onderhavige uitvinding kan een enkele of meerdere 20 domeinen van RAGE omvatten. Het RAGE-polypeptide dat een interdomein linker gekoppeld aan een immunoglobuline-domein van RAGE omvat kan een fragment van een RAGE-eiwit met volledige lengte omvatten. In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-fusie-eiwit bijvoorbeeld twee immunoglobuline-domeinen die afkomstig zijn van RAGE-eiwit en twee immunolgobuline-domeinen die afkomstig zijn van een hu-25 maan Fc-polypeptide omvatten. Het RAGE-fusie-eiwit kan een eerste immunoglobuline-domein van RAGE en een eerste interdomein linker gekoppeld aan een tweede immunoglobuline-domein van RAGE en een tweede interdomein linker van RAGE omvatten, zodanig dat het N-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het eerste immunoglobuline-domein 30 van RAGE, het N-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobuline-domein van RAGE is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker, het N-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobuline-domein van 62 RAGE en het C-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van het polypeptide dat een CH2-immunoglobuline-domein of een fragment daarvan omvat. Het RAGE-polypeptide kan bijvoorbeeld aminozuren 23-251 van humaan (SEQ ID NO: 19) of een 5 sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-251 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 20) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-251 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliceert voor het vormen van pE, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is (SEQ ID NO: 51), die overeenkomt met het V-domein, het Cl-domein, de interdomein linker die deze twee 10 domeinen koppelt en een tweede interdomein linker stroomafwaarts van C1 omvatten. In één uitvoeringsvorm kan een nucleïnezuurconstruct dat SEQ ID NO: 30 of een fragment daarvan omvat coderen voor een RAGE-fusie-eiwit met vier domeinen. In een andere uitvoeringsvorm kan een nucleïnezuurconstruct dat SEQ ID NO: 54 omvat coderen voor een RAGE-fusie-eiwit met vier domeinen, waarbij stille basenverande-15 ringen voor de codons die coderen voor proline (CCG naar CCC) en glycine (GGT naar GGG) aan het C-uiteinde van de sequentie worden gemaakt voor het verwijderen van een cryptische RNA-splitsingsplaats vlakbij het eindstandige codon.

Als alternatief kan een RAGE-fusie-eiwit met drie domeinen één immunoglobu-line-domein die afkomstig is van RAGE en twee immunoglobuline-domeinen die af-20 komstig zijn van een humaan Fc-polypeptide, omvatten. Het RAGE-fusie-eiwit kan bijvoorbeeld een enkel immunoglobuline-domein van RAGE omvatten dat is gekoppeld door middel van een interdomein linker van RAGE aan het N-eindstandige aminozuur van het polypeptide dat het CH2-immunoglobuline-domein of een fragment daarvan omvat. Het RAGE-polypeptide kan bijvoorbeeld aminozuren 23-136 van humaan 25 RAGE (SEQ ID NO: 15) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is of aminozuren 24-136 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 16) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-136 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliceert voor het vormen van pE, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is (SEQ ID NO: 49), die overeenkomt met het V-domein van RAGE en een 30 stroomafwaartse interdomein linker omvatten. In één uitvoeringsvorm kan een nucleïnezuurconstruct dat SEQ ID NO: 31 of een fragment daarvan omvat, coderen voor een RAGE-fusie-eiwit met drie domeinen. In een andere uitvoeringsvorm kan een nucleïnezuurconstruct dat SEQ ID NO: 55 omvat, coderen voor een RAGE-fusie-eiwit met 63 drie domeinen, waarbij stille basenveranderingen voor de codons die coderen voor proline (CCG naar CCC) en glycine (GGT naar GGG) aan het C-uiteinde van de sequentie zijn gemaakt voor het verwijderen van een cryptische RNA-splitsingsplaats vlakbij het eindstandige codon.

5 Een fragment van de interdomein linker van RAGE kan een peptidesequentie omvatten die van nature stroomafwaarts is van, en aldus gekoppeld is aan, een immu-noglobuline-domein van RAGE. Voor het V-domein van RAGE kan de interdomein linker bijvoorbeeld aminozuursequenties omvatten die van nature stroomafwaarts zijn van het V-domein. In een uitvoeringsvorm kan de linker SEQ ID NO: 21 omvatten, die 10 overeenkomt met aminozuren 117-123 van RAGE met de volledige lengte. Of de linker kan een peptide omvatten dat aanvullende delen van de natuurlijke sequentie van RAGE heeft. Een interdomein linker die verscheidene aminozuren (bijvoorbeeld 1-3, 1-5, of 1-10, of 1-15 aminozuren) stroomopwaarts en stroomafwaarts van SEQ ID NO: 21 omvat, kan bijvoorbeeld worden gebruikt. In één uitvoeringsvorm omvat de inter-15 domein linker aldus SEQ ID NO: 23 die aminozuren 117-136 van RAGE met de volledige lengte omvat. Of fragmenten van SEQ ID NO: 21 waarbij bijvoorbeeld 1, 2, of 3 aminozuren van één van de uiteinden van de linker zijn verwijderd kunnen worden gebruikt. In andere uitvoeringsvormen kan de linker een sequentie omvatten die tenminste 70% identiek, of 80% identiek, of 90% identiek is aan SEQ ID NO: 21 of SEQ ID NO: 20 23.

Voor het Cl-domein van RAGE kan de linker een peptidesequentie omvatten die van nature stroomafwaarts van het Cl-domein is. In een uitvoeringsvorm kan de linker SEQ ID NO: 22 omvatten die overeenkomt met aminozuren 222-251 van RAGE met de volledige lengte. Of de linker kan een peptide omvatten dat aanvullende delen van 25 de natuurlijke sequentie van RAGE heeft. Een linker die verscheidene (1-3, 1-5, of Ι-ΙΟ, of 1-15 aminozuren) aminozuren stroomopwaarts en stroomafwaarts van SEQ ID NO: 22 omvat kan bijvoorbeeld worden gebruikt. Of fragmenten van SEQ ID NO: 22 kunnen worden gebruikt, waarbij bijvoorbeeld 1-3, 1-5, of 1-10, of 1-15 aminozuren van één van de uiteinden van de linker zijn verwijderd. In één uitvoeringsvorm kan de 30 interdomein linker van RAGE bijvoorbeeld SEQ ID NO: 24 omvatten die overeenkomt met aminozuren 222-226. Of een interdomein linker kan SEQ ID NO: 44 omvatten die overeenkomt met aminozuren 318-342 van RAGE.

64

Farmaceutisch aanvaardbare dragers kunnen elk van de standaard farmaceutisch geaccepteerde dragers die in het vakgebied bekend zijn omvatten. In één uitvoeringsvorm kan de farmaceutische drager een vloeistof zijn en het RAGE-fusie-eiwit of nu-cleïnezuurconstruct kan in de vorm van een oplossing zijn. In een andere uitvoerings-5 vorm kan de farmaceutisch aanvaardbare drager een vaste stof zijn in de vorm van een poeder, een gevriesdroogd poeder of een tablet. Of de farmaceutische drager kan een gel, zetpil of crème zijn. In andere uitvoeringsvormen kan de drager een liposoom, mi-crocapsule, een in polymeer ingekapselde cel of een virus zijn. De term farmaceutisch aanvaardbare drager omvat aldus, maar is niet beperkt tot, elk van de standaard farma-10 ceutisch geaccepteerde dragers, zoals water, alcoholen, fosfaat-gebufferde zoutoplossingen, suikers (bijvoorbeeld sucrose of mannitol), oliën of emulsies zoals olie/water emulsies of een triglyceride emulsie, verscheidene soorten van bevochtigende middelen, tabletten, beklede tabletten en capsules.

Toediening van RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kan van ver-15 scheidene routes gebruik maken. Toediening van het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding kan aldus gebruik maken van intraperitoneale (IP) injectie. Als alternatief kan het RAGE-fusie-eiwit op orale wijze, intranasale wijze of als een aërosol worden toegediend. In een andere uitvoeringsvorm is toediening intraveneus (IV). Het RAGE-fusie-eiwit kan ook subcutaan worden toegediend. In een andere uitvoerings-20 vorm is toediening van RAGE-fusie-eiwit intra-arterieel. In een andere uitvoeringsvorm is toediening sublinguaal. Toediening kan ook gebruik maken van een capsule met afgifte gedurende de tijd. Subcutane toediening kan bijvoorbeeld bruikbaar zijn voor het behandelen van chronische stoornissen wanneer het gewenst is dat iemand zelf de toediening uitvoert.

25 De farmaceutische preparaten kunnen in de vorm van een steriele injecteerbare oplossing zijn in een niet-toxische parenteraal aanvaardbaar oplosmiddel of hulpstof. Onder de aanvaardbare hulpstoffen en oplosmiddelen die kunnen worden gebruikt zijn water, Ringer’s oplossing, 3-butaandiol, isotonische natriumchloride-oplossing of waterige buffers zoals bijvoorbeeld fysiologisch aanvaardbaar citraat-, acetaat-, glycine-, 30 histidine-, fosfaat-, tris- of succinaatbuffers. De injecteerbare oplossing kan stabiliserende middelen bevatten om te beschermen tegen chemische afbraak en vorming van aggregaten. Stabiliserende middelen kunnen anti-oxidanten omvatten zoals gebutyleer-de hydroxy-anisool (BHA) en gebutyleerde hydroxytolueen (BHT), buffers (citraten, 65 glycine, histidine) of oppervlakte-actieve stoffen (polysorbaat 80, poloxameren). De oplossing kan ook antimicrobiële conserveringsmiddelen bevatten, zoals benzylalcohol en parabenen. De oplossing kan ook oppervlakte-actieve stoffen bevatten voor het verlagen van aggregatie, zoals Polysorbaat 80, poloxameer of andere oppervlakte-actieve 5 stoffen die in het vakgebied bekend zijn. De oplossing kan ook andere additieven bevatten, zoals een suiker(s) of zoutoplossing voor het aanpassen van de osmotische waarde van het preparaat om gelijk te zijn aan humaan bloed.

De farmaceutische preparaten kunnen in de vorm zijn van een steriel gevriesdroogd poeder voor injectie na reconstitutie met een verdunningsmiddel. Het verdun-10 ningsmiddel kan water voor injectie, bacteriostatisch water voor injectie of steriele zoutoplossing zijn. Het gevriesdroogde poeder kan worden geproduceerd door het vriesdrogen van een oplossing van het fusie-eiwit voor het produceren van een eiwit in droge vorm. Zoals in het vakgebied bekend is, heeft het gevriesdroogde eiwit in het algemeen een verhoogde stabiliteit en een langere houdbaarheid dan een vloeibare op-15 lossing van het eiwit. Het gevriesdroogde poeder (koek) kan een buffer bevatten om de pH aan te passen, zoals bijvoorbeeld fysiologisch aanvaardbare citraat-, acetaat-, glycine-, histidine-, fosfaat-, tris- of succinaatbuffer. Het gevriesdroogde poeder kan ook een middel voor bescherming bij vriesdrogen bevatten om de fysische en chemische stabiliteit ervan te behouden. De algemeen gebruikte middelen voor bescherming bij vries-20 drogen zijn niet-reducerende suikers en disacchariden zoals sucrose, mannitol of trehalose. Het gevriesdroogde poeder kan stabiliserende middelen bevatten om te beschermen tegen chemische afbraak en vorming van aggregaten. Stabiliserende middelen kunnen omvatten, maar zijn niet beperkt tot anti-oxidanten (BHA, BHT), buffers (citra-ten, glycine, histidine) of oppervlakte-actieve stoffen (polysorbaat 80, poloxameren). 25 Het gevriesdroogde poeder kan ook antimicrobiële conserveringsmiddelen bevatten, zoals benzylalcohol en parabenen. Het gevries-droogde poeder kan ook oppervlakte-actieve stoffen bevatten voor het verlagen van aggregatie, zoals maar niet beperkt tot, Polysorbaat 80 en poloxomeer. Het gevriesdroogde poeder kan ook additieven bevatten (bijvoorbeeld suikers of zoutoplossing) voor het aanpassen van de osmotische waarde 30 om gelijk te zijn aan humaan bloed na reconstitutie van het poeder. Het gevriesdroogde poeder kan ook massa-vormende middelen bevatten, zoals suikers en disacchariden.

De farmaceutische preparaten voor injectie kunnen ook in de vorm zijn van een olieachtige suspensie. Deze suspensie kan worden bereid volgens de bekende werkwij- 66 zen door het gebruik van geschikte dispergerende of bevochtigende middelen en suspenderende middelen die hierboven zijn beschreven. In aanvulling worden steriele, gefixeerde oliën op geschikte wijze gebruikt als oplosmiddel of suspenderend medium. Voor dit doel kan elke neutrale gefixeerde olie worden gebruikt door het gebruik van 5 synthetische mono- of disacchariden. Olie-achtige suspensies kunnen ook worden bereid door het suspenderen van het actieve bestanddeel in een plantaardige olie, bijvoorbeeld arachis-olie, olijfolie, sesamolie of kokosnootolie of in een minerale olie zoals een vloeibare paraffine. Vetzuren zoals oleïnezuur vinden bijvoorbeeld toepassing bij de bereiding van injecteerbare middelen. De olie-achtige suspensies kunnen een ver-10 dikkingsmiddel bevatten, bijvoorbeeld bijenwas, harde paraffine of cetylalcohol. Deze preparaten kunnen worden geconserveerd door de toevoeging van een anti-oxidant zoals ascorbinezuur.

De farmaceutische preparaten van de onderhavige uitvinding kunnen ook in de vorm zijn van olie-in-water emulsies of waterige suspensies. De olie-achtige fase kan 15 een plantaardige olie zijn, bijvoorbeeld olijfolie of arachis-olie of een minerale olie bijvoorbeeld een vloeibare paraffine of een mengsel daarvan. Geschikte emulgerende middelen kunnen van nature voorkomende soorten gom zijn, bijvoorbeeld acacia-gom of tragacanthgom, natuurlijk-voorkomende fosfatiden, bijvoorbeeld soja, lecithine en esters of gedeeltelijke esters die afkomstig zijn van vetzuren en hexitolanhydriden, bij-20 voorbeeld sorbitanmono-oleaat en condensatieproducten van de gedeeltelijke esters met ethyleenoxide, bijvoorbeeld polyoxyethyleensorbitan.

Waterige suspensies kunnen ook de actieve verbindingen tezamen gemengd met excipiënten bevatten. Dergelijke excipiënten kunnen suspenderende middelen omvatten, bijvoorbeeld natriumcarboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxy-propyl-25 methylcellulose, natriumalginaat, polyvinylpyrrolidon, tragacanth-gom en acacia-gom; dispergerende of bevochtigende middelen, zoals een natuurlijk-voorkomende fosfatide zoals lecithine, of condensatieproducten van een alkyleenoxide met vetzuren, bijvoorbeeld polyoxyethyleenstearaat, of condensatieproducten van ethyleenoxide met alifati-sche alcoholen met lange ketens, bijvoorbeeld heptadeca-ethyl-eenoxycetanol, of con-30 densatieproducten van ethyleenoxide met gedeeltelijke esters die afkomstig zijn van vetzuren en een hexitol zoals polyoxyethyleensorbitol-mono-oleaat, of condensatieproducten van ethyleenoxide met gedeeltelijke esters die afkomstig zijn van vetzuren en hexitolanhydriden, bijvoorbeeld polyethyleensorbitan-mono-oleaat.

67

Dispergeerbare poeders en granules die geschikt zijn voor de bereiding van een waterige suspensie door de toevoeging van water kan de actieve verbinding tezamen gemengd met een dispergerend middel, suspenderend middel en één of meer conserverende middelen verschaffen. Geschikte conserveringsmiddelen, dispergerende midde-5 len en suspenderende middelen zijn hierboven beschreven.

De preparaten kunnen ook in de vorm van zetpillen zijn voor rectale toediening van de verbindingen van de uitvinding. Deze preparaten kunnen worden bereid door het mengen van het geneesmiddel met een geschikte niet-irriterende excipiënt die bij gewone temperaturen vast is maar vloeibaar is bij de rectale temperatuur en zal aldus in 10 het rectum smelten om het geneesmiddel af te geven. Dergelijke materialen omvatten bijvoorbeeld cacaoboter en polyethyleenglycolen.

Voor topicaal gebruik kunnen crèmes, zalven, gelei, oplossingen of suspensies die de verbindingen van de uitvinding bevatten worden gebruikt. Topicale toepassingen kunnen ook mondspoelingen en gorgeldranken omvatten. Geschikte conserverings-15 middelen, anti-oxidanten zoals BHA en BHT, dispergerende middelen, oppervlakte-actieve stoffen of buffers kunnen worden gebruikt.

De verbindingen van de onderhavige uitvinding kunnen ook worden toegediend in de vorm van liposoom-afleverende systemen, zoals kleine unilamellaire vesicles, grote unilamellaire vesicles en multilamellaire vesicles. Liposomen kunnen van een 20 verscheidenheid van fosfolipiden worden gevormd zoals cholesterol, stearylamine of fosfatidylcholinen.

In bepaalde uitvoeringsvormen kunnen de verbindingen van de onderhavige uitvinding worden gemodificeerd om verdere klaring van de circulatie door metabolische enzymen te vertragen. In één uitvoeringsvorm kunnen verbindingen worden gemodifi-25 ceerd door de covalente verbinding van water-oplosbare polymeren zoals polyethy-leenglycol (PEG) copolymeren van PEG en polypropyleenglycol, polyvinylpyrrolidon of polyproline, carboxymethylcellulose, dextran, polyvinylalcohol en dergelijke. Dergelijke modificaties kunnen ook de oplosbaarheid van de verbinding in waterige oplossing verhogen. Polymeren zoals PEG kunnen op covalente wijze worden verbonden 30 aan één of meer reactieve aminozuurresiduen, sulydryl-residuen of carboxylresiduen. Talrijke geactiveerde vormen van PEG zijn beschreven, waaronder actieve esters van carbonzuur- of carbonaat-derivaten, in het bijzonder die waarbij de vertrekkende groepen N-hydroxsuccinimide, p-nitrofenol, imdazool of l-hydroxy-2-nitrobenzeen-3- 68 sulfon zijn voor reactie met aminogroepen, multimode of halogeenacetyl derivaten voor reactie met sulfhydrylgroupen en aminohydrazine of hydrazide-derivaten voor reactie met koolhydraatgroepen.

Aanvullende werkwijzen voor bereiding van eiwitpreparaten die met de füsie-5 eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen worden gebruikt zijn beschreven in Amerikaanse octrooischriftnummers 6.267.958 en 5.567.677.

In een ander aspect van de onderhavige uitvinding kunnen de RAGE-fusie-eiwitten van de uitvinding worden gebruikt in adjuvans in therapeutische of combinatie therapeutische behandelingen met andere bekende therapeutische middelen. Het vol-10 gende is een niet-uitputtende opsomming van adjuvans en aanvullende therapeutische middelen die in combinatie met de modulators van het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding kunnen worden gebruikt:

Farmacologische classificatie van antikanker middelen: 15 1. Alkylerende middelen: Cyclofosfamide, nitroso-ureum, carboplatine, cisplati- ne, procarbazine 2. Antibiotica: Bleomycine, Daunorubicine, Doxorubicine 3. Antimetabolieten: Methotrexaat, Cytarabine, Fluoruracil, Azathioprine, 6- 20 Mercaptopurine en cytotoxische chemotherapeutische middelen tegen kanker 4. Alkaloïden van planten: Vinblastine, Vincristine, Etoposide, Paclitaxel, 5. Hormonen: Tamoxifen, Octreotide-acetaat, Finasteride, Flutamide 6. Modificeerders van de biologische respons: Interferons, Interleukinen 25 Farmacologische classificaties van behandeling van reumatoïde artritis 1. Analgesica: Aspirine 2. NSAIDs (niet-steroïdale ontstekingsremmende geneesmiddelen): Ibuprofen,

Naproxen, Diclofenac 30 3. DMARDs (ziekte-modificerende antireumatische geneesmiddelen): Methotr exaat, goudpreparaten, hydroxychloroquine, sulfasalazine 69 4. Modificeerders van de biologische respons, DMARDs: Etanercept, Infliximab

Glucocorticoïden, zoals beclomethason, methylprednisolon, bètamethason, pred- nison, dexamethason en hydrocortison 5 Farmacologische classificaties van behandeling van diabetes mellitus 1. Sulfonylureums: Tolbutamide, Tolazamide, Glyburide, Glipizide 2. Biguaniden: Metformin 3. Veelzijdige orale middelen: Acarbose, Troglitazon 10 4. Insuline

Farmacologische classificaties van behandeling van ziekte van Alzheimer 1. Cholinesterase remmer: Tacrine, Donepezil 15 2. Antipsychotica: Haloperidol, Thioridazine 3. Antidepressiva: Desipramine, Fluoxetine, Trazodon, Paroxetine 4. Anticonvulsants: Carbamazepine, Valproïnezuur

In een uitvoeringsvorm kunnen de preparaten van de onderhavige uitvinding een 20 therapeutisch effectieve hoeveelheid van een RAGE-fusie-eiwit in combinatie met een enkele of meerdere aanvullende therapeutische middelen omvatten. In aanvulling op de middelen die hiervoor zijn beschreven kunnen de volgende therapeutische middelen in combinatie met de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding worden gebruikt: immuunonderdrukkende middelen zoals cyclosporine, tacrolimus, rapamycine 25 en andere FK-506 type immuunonderdrukkende middelen.

In één uitvoeringsvorm kan de onderhavige uitvinding daarom een werkwijze van het behandelen van RAGE-bemiddelde ziekten verschaffen, waarbij de werkwijze omvat het aan een patiënt die daar behoefte aan heeft toedienen van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een RAGE-fusie-eiwit in combinatie met therapeutische mid-30 delen die zijn gekozen uit de groep die bestaat uit alkylerende middelen, antimetabolie-ten, alkaloïden van planten, antibiotica, hormonen, modificeerders van de biologische respons, analgesica, NS AID’s, DMARD’s, modificeerders van de biologische reactie (bijvoorbeeld glucocorticoïden), sulfonylureums, biguaniden, insuline, cholinesterase- 70 remmers, antipsychotica, antidepressiva, anticonvulsants en immuun-onderdrukkende middelen zoals cyclosporine, tacrolimus, rapamycine en andere FK-506 type immuun-onderdrukkende middelen. In een andere uitvoeringsvorm verschaft de onderhavige uitvinding het farmaceutische preparaat van de uitvinding zoals hierboven is beschre-5 ven, die verder één of meer therapeutische middelen omvat die zijn gekozen uit de groep die bestaat uit alkylerende middelen, antimetabolieten, alkaloïden van planten, antibiotica, hormonen, modificeerders van de biologische respons, analgesica, NSAID’s, DMARD’s, modificeerders van de biologische reactie (bijvoorbeeld gluco-corticoïden), sulfonylureums, biguaniden, insuline, cholinesterase-remmers, antipsy-10 chotica, antidepressiva, anticonvulsants en immuunonderdrukkende middelen zoals cyclosporine, tacrolimus, rapamycine en andere FK-506 type immuunonderdrukkende middelen.

Specifieke uitvoeringsvormen 15 53. Een werkwijze voor het behandelen van een RAGE-bemiddelde stoornis bij een patiënt die het aan een patiënt toedienen van het RAGE-fusie-eiwit zoals hierin is gedefinieerd omvat.

54. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 53, waarbij het RA GE-polypeptide 20 een interdomein linker van RAGE gekoppeld aan een immunoglobuline-domein van RAGE omvat zodanig dat het C-eindstandige aminozuur van het immunoglobuline-domein van RAGE aan het N-eindstandige aminozuur van de interdomein linker is gekoppeld en het C-eindstandige aminozuur van de interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige amino-25 zuur van een polypeptide dat een C^-domein van een immunoglobuline, of een deel daarvan omvat.

55. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 53, waarbij de bindingsplaats voor het ligand van RAGE SEQ ID NO: 9 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 10 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar 30 aan is omvat.

56. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 54, waarbij het RAGE-polypeptide dat een interdomein linker gekoppeld aan een immunoglobuline-domein van RAGE omvat een fragment van een RAGE-eiwit met volledige lengte omvat.

71 57. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 56, die verder een eerste immunoglo-buline-domein van RAGE en een interdomein linker van RAGE gekoppeld aan een tweede immunoglobuline domein van RAGE en een tweede interdomein linker van RAGE omvat, zodanig dat het N-eindstandige aminozuur van de eerste 5 interdomein linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het eerste immunoglobuline-domein van RAGE, het N-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobuline-domein van RAGE is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker, het N-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker is gekoppeld aan het C-eindstandige 10 aminozuur van het tweede immunoglobuline-domein van RAGE en het C- eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van het Ch2 immunoglobuline-domein of een deel van een CH2-domein van een immunoglobuline.

58. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 57, waarbij het RAGE-fusie-eiwit de 15 aminozuursequentie SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, of SEQ ID NO: 56 omvat.

59. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 57, waarbij het RAGE-fusie-eiwit de aminozuursequentie SEQ ID NO: 33 zonder het C-eindstandige aminozuurre-sidu lysine, SEQ ID NO: 34 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine of SEQ ID NO: 56 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine omvat.

20 60. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 57, waarbij de interdomein linker van RAGE die op directe wijze is gekoppeld aan het immunoglobuline CH2-domein of een deel daarvan SEQ ID NO: 22 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 24 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is omvat.

25 61. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 56, die een enkel immunoglobuline- domein van RAGE gekoppeld door middel van een interdomein linker van RAGE aan het N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een Ch2-immunoglobuline-domein of een deel van een CH2-domein van een immunoglobuline omvat.

30 62. De werkwijze volgens uitvoeringvorm 61, waarbij het RAGE-fusie-eiwit de aminozuursequentie SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, of SEQ ID NO: 57 omvat. 63. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 61, waarbij het RAGE-fusie-eiwit de aminozuursequentie SEQ ID NO: 36 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu 72 lysine, SEQ ID NO: 37 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine, of SEQ ID NO: 57 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine omvat.

64. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 61, waarbij de interdomein linker van RAGE die op directe wijze is gekoppeld aan het immunoglobuline Ch2 of een 5 deel daarvan SEQ ID NO: 21 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 23 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is omvat.

65. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 53, waarbij de werkwijze van toediening tenminste één intraveneuze toediening, intraperitoneale toediening of subcu- 10 tane toediening van het RAGE-fusie-eiwit aan de patiënt omvat.

66. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 53, waarbij het fusie-eiwit wordt gebruikt voor het behandelen van een symptoom van diabetes of een symptoom van late complicaties van diabetes.

67. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 66, waarbij het symptoom van diabe- 15 tes of late complicaties van diabetes tenminste één van diabetische neifopathie, diabetische retinopathie, een diabetische voetzweer, een cardiovasculaire complicatie of diabetische neuropathie omvat.

68. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 53, waarbij het fusie-eiwit wordt gebruikt voor het behandelen van tenminste één van amyloïdoses of de ziekte van 20 Alzheimer.

69. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 53, waarbij het fusie-eiwit wordt gebruikt voor het behandelen van kanker.

70. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 53, waarbij het fusie-eiwit wordt gebruikt voor het behandelen van ontsteking.

25 71. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 53, waarbij het fusie-eiwit wordt ge bruikt voor het behandelen van ontsteking die is geassocieerd met tenminste één van auto-immuniteit, inflammatoire darmziekte, reumatoïde artritis, psoriasis, multipele sclerosis, hypoxie, beroerte, hartaanval, hemorrhagische shock, sepsis, of verzwakte genezing van wonden.

30 72. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 71, waarbij de auto-immuniteit afsto ting van tenminste één van huidcellen, alvleeskliercellen, zenuwcellen, spiercellen, endotheelcellen, hartcellen, levercellen, niercellen, hart, beenmergcellen, bot, 73 bloedcellen, slagaderlijke cellen, aderlijke cellen, kraakbeencellen, schildkliercel-len of stamcellen omvat.

73. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 53, waarbij het fusie-eiwit wordt gebruikt voor het behandelen van nierfalen.

5 74. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 53, waarbij het fusie-eiwit wordt ge bruikt voor het behandelen van ontsteking en/of afstoting die is geassocieerd met transplantatie van tenminste één van een orgaan, een weefsel of een verscheidenheid van cellen van een eerste plaats naar een tweede plaats.

75. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 74, waarbij de eerste en tweede plaat- 10 sen in verschillende patiënten zijn.

76. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 74, waarbij de eerste en tweede plaatsen in dezelfde persoon zijn.

77. De werkwijze volgens uitvoeringsvorm 74, waarbij de getransplanteerde cellen, weefsel of orgaan een cel, weefsel of orgaan van alvleesklier, huid, lever, 15 nier, hart, beenmerg, bloed, bot, spier, slagader, ader, kraakbeen, schildklier, ze nuwstelsel of stamcellen omvat.

78. Een werkwijze voor het voorkomen van transplantaatafstoting van een cel, weefsel of orgaan, waarbij de werkwijze het toedienen van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van het RAGE-fusie-eiwit zoals hierin is gedefinieerd om- 20 vat.

VOORBEELDEN

Kenmerken en voordelen van het inventieve concept die in de onderhavige uitvinding zijn opgenomen zijn verder in de voorbeelden die volgen geïllustreerd.

25

Voorbeeld IA: Productie van RAGE-fusie-eiwitten

Twee plasmiden werden geconstrueerd voor het tot expressie brengen van RAGE-IgG fusie-eiwitten. Beide plasmiden werden geconstrueerd door het ligeren van 30 verschillende lengten van een 5’ cDNA-sequentie van humaan RAGE met dezelfde 3’ cDNA-sequentie van humaan IgG (γΐ). Deze expressiesequenties (d.w.z. ligatie-producten) werden vervolgens geïnsereerd in expressievector pcDNA3.1 (Invitrogen, CA). De nucleïnezuursequenties die coderen voor het coderende gebied van het RAGE- 74 fusie-eiwit zijn in Figuren 2 en 3 getoond. Voor het RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 codeert de nucleïnezuursequentie van 1 tot 753 (gemarkeerd in vetgedrukte letters) voor de N-eindstandige eiwitsequentie van RAGE, terwijl de nucleïnezuursequentie van 754 tot 1386 voor de IgG-eiwitsequentie codeert (Figuur 2). Voor TTP-3000, codeert de 5 nucleïnezuursequentie van 1 tot 408 (gemarkeerd in vetgedrukte letters) voor de N-eindstandige eiwitsequentie van RAGE, terwijl de nucleïnezuursequentie van 409 tot 1041 voor de eiwitsequentie van IgG codeert (Figuur 3).

Voor het produceren van de RAGE-fusie-ei witten werden de expressievectoren die de nucleïnezuursequenties van ofwel SEQ ID NO: 30 of SEQ ID NO: 31 omvatten 10 op stabiele wijze in CHO-cellen getransfecteerd. Positieve transformanten werden geselecteerd op neomycine-resistentie die door het plasmide werd verleend en gekloneerd. Klonen met een hoge productie, zoals werd gedetecteerd door Westem-blot analyse van supernatant, werden uitgebreid en het genproduct werd gezuiverd door afïïni-teitschromatografie door het gebruik van Proteïne A-kolommen. Expressie werd zoda-15 nig geoptimaliseerd dat cellen recombinant TTP-4000 produceerden bij niveaus van ongeveer 1,3 gram per liter.

Voorbeeld 1B: Productie van RAGE-fusie-eiwitten

20 Een plasmide werd geconstrueerd voor het tot expressie brengen van RAGE-IgG

fusie-ei witten. Het plasmide werd geconstrueerd door het ligeren van een 5’ cDNA-sequentie van humaan RAGE met een 3’ cDNA-sequentie van humaan IgG (γΐ). PCR werd gebruikt voor het amplificeren van het cDNA. Aan het 5’-uiteinde voegde de PCR-primer verder een plaats voor het Eco RI-restrictie-enzym toe voor klonering en 25 een Kozak-consensus translatie-initiatiesequentie. Aan het 3’-uiteinde voegde de PCR-primer een Xho I-restrictieplaats toe vlak na het terminatiecodon. Aan het 3’-uiteinde omvatte de PCR-primer ook twee stille basenveranderingen die een cryptische RNA-splitsingsplaats in het immunoglobulinedeel vlakbij het eindstandige codon verwijderen. Het codon dat codeert voor proline (residu 409 op basis van de nummering van de 30 eiwitsequentie van SEQ ID NO: 32) werd veranderd van CCG naar CCC en het codon dat codeert voor glycine (residu 410 op basis van de nummering van de eiwitsequentie van SEQ ID NO: 32) werd van GGT naar GGG veranderd. Het PCR-fragment werd gedigereerd met Eco RI en Xho I en vervolgens geïnsereerd in een retrovector plasmide 75 (pCNS-newMCS-WPRE (new ori), verkrijgbaar van Gala, Inc.) die was gedigereerd met Mfe I (voor het vormen van een verenigbaar uiteinde met Eco RI) en gedigereerd met Xho I. Van het geïnsereerde deel van het gekloneerde plasmide en de overgangen van klonering werd de sequentie geanalyseerd om zeker te zijn dat geen mutaties gedu-5 rende de klonering zijn opgetreden.

Voor het produceren van het RAGE-IgG-fusie-eiwit werd de expressievector die de nucleïnezuursequentie SEQ ID NO: 54 omvat op stabiele wijze in CHO-cellen getransfereerd.

De sequentie van het geïsoleerde RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 dat door de ge-10 transfecteerde cellen tot expressie werd gebracht werd bevestigd door verscheidene studies voor karakterisering als ofwel SEQ ID NO: 34 of SEQ ID NO: 56, of zowel SEQ ID NO: 34 en SEQ ID NO: 56. De signaalsequentie die werd gecodeerd door de eerste 23 aminozuren van SEQ ID NO: 32 werd aldus gesplitst en het N-eindstandige residu was glutamine (Q) of pyroglutaminezuur (pE) of een mengsel daarvan. Karakte-15 riserende studies toonden ook glycosylatieplaatsen op N2 en N288 (op basis van de nummering van SEQ ID NO: 34 of SEQ ID NO: 56) en toonden dat het CH3-gebied van het RAGE-fusie-eiwit het C-eindstandige residu verwijderd kan hebben door een posttranslationele modificatie wanneer het in dit recombinante systeem tot expressie werd gebracht.

20

Voorbeeld 2: Werkwijze voor het testen van activiteit van een RAGE-IgGl fusie-eiwit A. Binding van ligand in vitro 25 Bekende RAGE-liganden werden bekleed op het oppervlak van Maxisorb-platen bij een concentratie van 5 microgram per putje. Platen werden gedurende de nacht bij 4°C geïncubeerd. Volgend op de incubatie met het ligand werden de platen afgezogen en een blokking buffer van 1% BSA in 50 mM imidizoolbuffer (pH 7,2) werd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur aan de platen toegevoegd. De platen werden vervolgens 30 afgezogen en/of gewassen met wasbuffer (20 mM Imidizool, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20, 5 mM CaCh en 5 mM MgCh, pH 7,2). Een oplossing van TTP-3000 (TT3) bij een initiële concentratie van 1,082 mg/ml en een oplossing van TTP-4000 (TT4) bij een initiële concentratie van 370 pg/ml werden bereid. Het RAGE-fusie-eiwit werd bij 76 toenemende verdunningen van het initiële monster toegevoegd. Het RAGE-fusie-eiwit werd toegestaan gedurende één uur bij 37°C met het geïmmobiliseerde ligand te incu-beren waarna de plaat werd gewassen en werd getest op binding van het RAGE-fusie-eiwit. Binding werd gedetecteerd door de toevoeging van een immunodetectiecomplex 5 dat een monoklonaal anti-humaan IgGl van muis, dat 1:11.000 is verdund tot een uiteindelijke testconcentratie (FAC) van 21 ng/100 μΐ, een gebiotinyleerd anti-muis IgG van geit dat 1:500 is verdund naar een FAC van 500 ng/μΐ en een avidine-gekoppelde alkalische fosfatase bevat. Het complex werd gedurende één uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met het geïmmobiliseerde RAGE-fusie-eiwit waarna de plaat werd gewas-10 sen en het substraat voor alkalische fosfatase, para-nitrofenylfosfaat (PNPP), werd toegevoegd. Binding van het complex aan het geïmmobiliseerde RAGE-fusie-eiwit werd gekwantificeerd door het meten van de omzetting van PNPP naar para-nitrofenol (PNP) dat op spectrofotometrische wijze bij 405 nm werd gemeten.

Zoals in Figuur 7 is geïllustreerd vertonen de RAGE-fusie-eiwitten TTP-4000 15 (TT4) en TTP-3000 (TT3) specifieke interactie met bekende liganden van RAGE amy loïde-bèta (Abèta), SI00b (SI00) en amfoterine (Ampho). In de afwezigheid van ligand, d.w.z. alleen bekleding met BS A (BSA of BSA + was) was er geen toename van absorptie boven niveaus die toe te schrijven zijn aan niet-specifieke binding van het immunodetectiecomplex. Wanneer amyloïde bèta wordt gebruikt als het merkende li-20 gand kan het nodig zijn om het amyloïde-bèta voorafgaand aan de test te incuberen. Voorafgaande incubatie kan het mogelijk maken dat het amyloïde-bèta zelf aggregeert in de vorm van een pleated-sheet, daar amyloïde-bèta RAGE bij voorkeur bindt in de vorm van een pleated sheet.

Aanvullend bewijs voor een specifieke interactie tussen RAGE-fusie-eiwitten 25 TTP-4000 en TTP-3000 met liganden van RAGE wordt geïllustreerd in studies die to nen dat een ligand van RAGE in staat is om op effectieve wijze te concurreren met een bekende ligand van RAGE voor het binden aan de RAGE-fusie-eiwitten. Bij deze studies werd amyloïde-bèta (A-bèta) op een Maxisorb-plaat geïmmobiliseerd en RAGE-fusie-eiwit werd toegevoegd zoals hierboven is beschreven. In aanvulling werd aan 30 sommige van de putjes een ligand van RAGE toegevoegd op hetzelfde moment als het RAGE-fusie-eiwit.

Het werd gevonden dat het ligand van RAGE de binding van TTP-4000 (TT4) met ongeveer 25% tot 30% kon blokkeren wanneer TTP-4000 bij 123 pg/ml (1:3 ver- 77 dunning, Figuur 8) aanwezig was. Wanneer de initiële oplossing van TTP-4000 met een factor 10 of 30 werd verdund (1:10 of 1:30) werd de binding van het RAGE-fusie-eiwit aan het geïmmobiliseerde ligand volledig geremd door het ligand van RAGE. Op overeenkomstige wijze blokkeerde het ligand van RAGE binding van TTP-3000 (TT3) 5 met ongeveer 50% wanneer TTP-3000 bij 360 pg/ml (1:3 verdunning, Figuur 9) aanwezig was. Wanneer de initiële oplossing van TTP-3000 met een factor 10 werd verdund (1:10) werd de binding van het RAGE-fusie-eiwit aan het geïmmobiliseerde ligand volledig geremd door het ligand van RAGE. Specificiteit van binding van het RAGE-fusie-eiwit aan het ligand van RAGE was aldus dosis-afhankelijk. In Figuren 8 10 en 9 is ook getoond dat er in wezen geen binding werd gedetecteerd in de afwezigheid van RAGE-fusie-eiwitten, d.w.z. met het gebruik van alleen het immunodetectie-complex (“Complex alleen”).

B. Effect van RAGE-fusie-eiwit in cel-gebaseerde testen 15

Voorgaand werk heeft getoond dat de myeloïde THP-1-cellen TNF-α kunnen uitscheiden als reactie op RAGE-liganden. In deze test werden THP-1-cellen gekweekt in RPMI-1640 media dat is aangevuld met 10% FBS door het gebruik van een protocol dat wordt verschaft door ATCC. De cellen werden geïnduceerd TNF-α uit te scheiden 20 door middel van stimulatie van RAGE met 0,1 mg/ml SI00b zowel in de afwezigheid en aanwezigheid van RAGE-fusie-eiwitten TTP-3000 (TT3) of TTP-4000 (TT4) (10 pg), sRAGE (10 pg) en een humaan IgG (10 pg) (d.w.z. als een negatieve controle). De hoeveelheid TNF-α die door de THP-1-cellen werd uitgescheiden werd 24 uur na de toevoeging van de eiwitten aan de celkweek gemeten door het gebruik van een in de 25 handel verkrijgbare ELISA-kit voor TNF-α (R&D Systems, Minneapolis, MN). De resultaten in Figuur 10 tonen dat de RAGE-fusie-eiwitten de S100b/RAGE-geïnduceerde productie van TNF-α in deze cellen remde. Zoals in Figuur 10 is getoond werd door toevoeging van 10 pg van de RAGE-fusie-eiwitten TTP-3000 of TTP-4000 inductie van TNF-α door SI00b (0,1 mg/ml FAC) met respectievelijk ongeveer 45% tot 30 70% verlaagd. Fusie-eiwit TTP-4000 kan net zo effectief zijn in het blokkeren van in ductie van TNF-α door SI00b als sRAGE (Figuur 10). Specificiteit van de remming voor RAGE-sequenties van TTP-4000 en TTP-3000 is getoond door het experiment waarbij IgG alleen werd toegevoegd aan SI00b gestimuleerde cellen. Toevoeging van 78

IgG en SlOOb aan de test toont dezelfde niveaus van TNF-α als SI00b alleen. Specificiteit van de remming van inductie van TNF-α door TTP-4000 en TTP-3000 voor sequenties van het RAGE-fusie-eiwit is getoond door een experiment waarbij IgG alleen werd toegevoegd aan SlOOb-gestimuleerde cellen. Het kan worden gezien dat de toe-5 voeging van IgG, d.w.z. humaan IgG zonder de sequentie van RAGE (Humaan IgG van Sigma toegevoegd bij 10 pg/putje) en SlOOb aan de test dezelfde niveaus van TNF-a als SlOOb alleen toont.

Voorbeeld 3: Farmacokinetisch profiel van TTP-4000 10

Om te bepalen of TTP-4000 een superieur farmacokinetisch profiel zou hebben in vergelijking met humaan sRAGE, kregen ratten en niet-humane primaten een intraveneuze (IV) injectie van TTP-4000 (5 mg/kg) en vervolgens werd plasma getest op de aanwezigheid van TTP-4000. Bij deze experimenten kregen twee naïeve mannelijke 15 apen een enkele IV bolus dosis van TTP-4000 (5 mg/ml/kg) in een perifere ader gevolgd door een spoeling van zoutoplossing van bij benadering 1,0 milliliter (ml). Bloedmonsters (bij benadering 1 ml) werden voorafgaand aan de dosis (d.w.z. voorafgaand aan injectie van het TTP-4000) of na 0,083, 0,25, 0,5, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 288 en 336 uur na de dosis in buisjes die lithiumheparine bevatten ver-20 zameld. Volgend op verzameling werden de buisjes op nat ijs geplaatst (maximaal 30 minuten) tot centrifugatie onder koeling (bij 2 tot 8°C) bij 1500 x g gedurende 15 minuten. Elke geoogst plasmamonster werd vervolgens bevroren ( (-70°C ±10°C) opgeslagen totdat het op RAGE-polypeptide werd getest door het gebruik van een ELISA op verscheidene tijdstippen volgend op de injectie zoals in Voorbeeld 6 is beschreven.

25 Het kinetische profiel dat in Figuur 11 is getoond onthuld dat indien TTP-4000 eenmaal is verzadigd met de liganden ervan, zoals wordt getoond door de redelijke stijle hellingen van de alfa-fase bij 2 dieren, het een terminale halfwaardetijd behoudt van meer dan 300 uur. Deze halfwaardetijd is aanzienlijk hoger dan de halfwaardetijd van humaan sRAGE in plasma (in het algemeen ongeveer 2 uur) en verschaft een mo-30 gelijkheid voor enkele injecties voor acute en semi-chronische indicaties. In Figuur 11 vertegenwoordigt elke kromme een ander dier onder dezelfde experimentele omstandigheden.

79

Voorbeeld 4: TTP-4000 Fc-activering

Experimenten werden uitgevoerd voor het meten van de activering van de Fc-receptor door RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 in vergelijking met humaan IgG. Activering 5 van de Fc-receptor werd gemeten door het meten van uitscheiding van TNF-α van THP-1-cellen die de Fc-receptor tot expressie brengen. Bij deze experimenten werd een plaat met 96 putjes bekleed met 10 pg/putje TTP-4000 of humaan IgG. Fc stimulatie resulteert in uitscheiding van TNF-α. De hoeveelheid van TNF-α werd gemeten door een enzym-gekoppelde immuun-absorberende test (ELISA).

10 Bij deze test werd de myeloïde cellijn THP-1 (ATTC # TIB-202) aangehouden in RPMI-1640 media dat is aangevuld met 10% foetaal runderserum volgens instructies van het ATCC. Kenmerkend werden 40.000-80.000 cellen per putje geïnduceerd om TNF-alfa uit te scheiden door middel van stimulatie van de Fc-receptor door de putjes vooraf te bekleden met 10 pg/putje van ofwel door warmte geaggregeerde (63°C gedu- 15 rende 30 minuten) TTP-4000 of humaan IgGl. De hoeveelheid van TNF-alfa die werd uitgescheiden door de THP-1-cellen werd gemeten in supematanten die van kweken van cellen van 24 uur in de behandelde putjes werden verzameld door het gebruik van een in de handel verkrijgbare TNF ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN # DTA00C) volgens instructies.

20 Resultaten zijn in Figuur 12 getoond waar kan worden gezien dat TTP-4000 min der dan 2 ng/putje TNF genereerde en IgG meer dan 40 ng/putje genereerde.

Voorbeeld 5: In vivo activiteit van TTP-4000 25 De activiteit van TTP-4000 werd vergeleken met sRAGE in verscheidene in vivo modellen van humane ziekte.

A. TTP-4000 in een dierlijk model van restenose 30 Het RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 werd beoordeeld in een model van restenose bij een diabetische rat dat het meten van proliferatie van gladde spieren en intima uitbreiding 21 dagen volgend op vasculaire schade behelsde. Bij deze experimenten werd een schade van de linker algemene halsslagader door een ballon uitgevoerd bij Zucker dia- 80 betische en niet-diabetische ratten door het gebruik van een standaard werkwijze. Een loading-dosis (3 mg/rat) van IgG, TTP-4000 of fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) werd één dag voorafgaand aan de schade intraperitoneaal (IP) toegediend. Een onderhoudsdosis werd om de dag afgeleverd tot dag 7 na schade (d.w.z. op dagen 1, 3, 5 en 7 5 na schade). De onderhoudsdosis was hoog = 1 mg/dier voor één groep of laag = 0,3 mg/dier voor de tweede groep. Voor het meten van de proliferatie van vasculaire gladde spiercellen (VSMC) werden dieren 4 dagen en 21 dagen na de schade opgeofferd.

Voor de meting van celproliferatie kregen dieren na 4 dagen een intraperitoneale injectie van broomdeoxyuridine (BrDdU) 50 mg/kg op 18, 12 en 2 uur voorafgaand aan 10 euthanasie. Na het opofFeren werden de gehele linker en rechter halsslagaders geoogst. Monsters werd gedurende tenminste 24 uur in Histochoice opgeslagen voordat de monsters werden ingebed. Bepaling van proliferatie van VSMC werd uitgevoerd door het gebruik van anti-BrdU monoklonaal antilichaam van muis. Een fluorescent gemerkte anti-muis secundair antilichaam van geit werd toegediend. Het aantal BrdU-positieve 15 kernen per coupe werd geteld door twee waarnemers die niet op de hoogte waren van de behandelingsstrategieën.

De resterende ratten werden na 21 dagen opgeofferd voor morfometrische analyse. Morfometrische analysen werden uitgevoerd door een waarnemer die niet op de hoogte was van de groepen die werden bestudeerd, door het gebruik van gecompurteri-20 seerde digitale microscopische planimetrie software Image-Pro Plus op opeenvolgende coupes, (5 mm afstand) halsslagaders gekleurd met Van Gieson kleuring. Alle gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Statistische analyse werd uitgevoerd met het gebruik van SPSS software. Continue variabelen werden vergeleken door het gebruik van niet-gepaarde t-testen. Een waarde van P < 0,05 werd beschouwd statistisch 25 significant te zijn.

Zoals in Figuren 13A en 13B kan worden gezien verlaagde behandeling met TTP-4000 aanzienlijk de verhoudingen van intima/media en proliferatie van vasculaire gladde spiercellen op een dosis-afhankelijke wijze. In Figuur 13B vertegenwoordigt de y-as het aantal BrdU prolifererende cellen.

30 81

B. TTP4000 in een dierlijk model van AD

Experimenten werden uitgevoerd om te beoordelen of TTP-4000 vorming van amyloïde en cognitieve dysfunctie in een model van AD bij muis kon beïnvloeden. De 5 experimenten maakten gebruik van transgene muizen die het humane Swedish mutante amyloïde voorloper-eiwit (APP) tot expressie brachten onder de regulering van de PDGF-B-keten promoter. Gedurende de tijd genereerden deze muizen hoge niveaus van het ligand van RAGE, amyloïde bèta (Αβ). Hiervoor is getoond dat behandeling met sRAGE gedurende 3 maanden zowel de vorming van amyloïde plaques in de her-10 senen en de geassocieerde toename van merkers van ontsteking in dit model verlaagde.

De APP muizen (mannelijk) die in dit experiment werden gebruikt werden gemaakt door micro-injectie van het humane APP-gen (met de Swedish en London mutaties) in eieren van muis onder de regulering van de promoter van het gen voor van bloedplaatjes afkomstige groeifactor B (PDGF-B) keten. De muizen werden gegene-15 reerd op een C57BL/6 achtergrond en werden ontwikkeld door Molecular Therapeutics Inc. Dieren werd ad libitum gevoerd en aangehouden door kruisingen tussen broers en zusters. De muizen die van dit construct werden gegenereerd ontwikkelden amyloïde afzettingen beginnend op een leeftijd van 6 maanden. Dieren werden tot een leeftijd van 6 maanden gefokt en vervolgens gedurende 90 dagen aangehouden en opgeofferd 20 voor kwantificering van amyloïde.

APP transgene muizen kregen elke andere dag hulpstof of TTP4000 toegediend [qod (i.p.)] gedurende 90 dagen beginnend op een leeftijd van 6 maanden. Aan het einde van het experiment werden dieren opgeofferd en onderzocht op aanwezigheid van Αβ-plaques in de hersenen (d.w.z. aantal plaques). Een controle APP-groep van 6 25 maanden werd gebruikt voor het bepalen van de basislijn van afzetting van amyloïde. In aanvulling werden de dieren aan het einde van de studie onderworpen aan analyse van het gedrag (Morris water maze (doolhof)). De onderzoekers werden niet op de hoogte gebracht van de verbindingen die werden onderzocht. Monsters werden bij 0,25 ml/muis/elke andere dag aan de muizen gegeven. In aanvulling kreeg één groep van 30 muizen 200 pg/dag humaan sRAGE.

82 1. Afzetting van amyloïde-bèta

Voor histologisch onderzoek werden de dieren verdoofd met een intraperitoneale injectie (IP) van natriumpentobarbital (50 mg/kg). De dieren werd transcardiaal door 5 perfusie behandeld met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) van 4°C, gevolgd door 4% paraformaldehyde. De hersenen werden verwijderd en gedurende de nacht in 4% paraformaldehyde geplaatst. De hersenen werden opgewerkt naar paraffine en ingebed. Tien opeenvolgende coupes met een dikte van 30 pm door de hersenen werden verkregen. Coupes werden gedurende de nacht bij 4°C aan primair antilichaam (Αβ peptide 10 antilichaam) onderworpen teneinde de amyloïde afzettingen in de hersenen van de transgene dieren te detecteren (Guo et al, J. Neurosci., 22:5900-5909 (2002)). Coupes werden in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) gewassen en secundair antilichaam werd toegevoegd en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Na het wassen werden coupes geïncubeerd zoals wordt geïnstrueerd in de Vector ABC Elite kit (Vec-15 tor Laboratories) en gekleurd met diaminobenzoëzuur (DAB). De reacties werden gestopt in water en met een dekglaasje bedekt na behandeling met xyleen. Het amyloïde gebied in elke coupe werd bepaald met een computer-geassisteerd beeldanalysesys-teem, dat bestaat uit een Power Macintosh computer die is uitgerust met een Quick Capture frame grabber card, Hitachi CCD camera die is bevestigd op een Olympus 20 microscoop en een camera standaard. NIH Image Analysis Software, v. 1.55 werd gebruikt. De beelden werden vastgelegd en het totale gebied van amyloïde werd over de tien coupes bepaald. Een enkele onderzoeker die niet op de hoogte was van elke status van behandeling, voerde alle metingen uit. Het optellen van de amyloïde volumes van de coupes en het delen door het totaal aantal van coupes werd uitgevoerd voor het be-25 rekenen van het amyloïde volume.

Voor kwantitatieve analyse werd een enzym-gekoppelde immuun-absorberende test (ELISA) gebruikt voor het meten van de niveaus van humaan totaal Αβ, Αβ(0ΐΜΐ en Αβι-42 in de hersenen van APP transgene muizen (Biosource International, Camarillo, CA). Aftotaai en Αβι-42 werden van de hersenen van muis geëxtraheerd door guanidine-30 hydrochloride en gekwantificeerd zoals door de fabrikant is beschreven. Deze test extraheert het totale Αβ peptide van de hersenen (zowel oplosbaar en geaggregeerd).

83 2. Cognitieve functie

Het testen met de Morris water-maze (doolhof) werd als volgt uitgevoerd: Alle muizen werden eenmaal getest in de Morris water maze (doolhof) test aan het einde 5 van het experiment. Muizen werden in een waterdoolhof met een open veld van 1,2 m getraind. Het bad werd tot een diepte van 30 cm met water gevuld en het water werd op een temperatuur van 25 °C gehouden. Het ontsnappingsplatform (10 vierkante cm) werd 1 cm onder het wateroppervlak geplaatst. Gedurende de proefnemingen werd het platform van het bad verwijderd. De cued (met aanwijzingen) testen werd uitgevoerd in het 10 bad dat was omgeven met witte gordijnen voor het verbergen van alle extra cues (aanwijzingen) voor het doolhof. Alle dieren ondergingen niet-ruimtelijke voorafgaande training (“non-spatial pretraining”; NSP) gedurende drie opeenvolgende dagen. Deze proefnemingen zijn ervoor om de dieren voor te bereiden op de uiteindelijke gedrags-test voor het bepalen van de retentie van geheugen voor het vinden van het platform. 15 Deze proefnemingen werden niet geregistreerd, maar waren alleen voor doeleinden van training. Voor de studies van training en leren werden de gordijnen naar extra cues (aanwijzingen) van het doolhof verwijderd (dit maakte de identificatie mogelijk van dieren met beschadiging van het vermogen van zwemmen). Op dag 1 werden de muizen gedurende 20 seconden op het verborgen platform geplaatst (proefneming 1), gedu-20 rende proefnemingen 2-3 werden de dieren op een afstand van 10 cm van het cued (met aanwijzingen) platform of verborgen platform (proefneming 4) los gelaten en werden toegestaan naar het platform te zwemmen. Op de tweede dag van de proefnemingen werd het verborgen platform willekeurig verplaatst tussen het midden van het bad of het midden van elke kwadrant. De dieren werden in het bad los gelaten, willekeurig 25 met de kop naar de wand en werden toegestaan gedurende 60 seconden het platform te bereiken (3 proefnemingen). Bij de derde proefneming, de dieren kregen drie proefnemingen, twee met een verborgen platform en één met een cued (met aanwijzingen) platform. Twee dagen volgend op de NSP werden dieren onderworpen aan de uiteindelijke gedragstesten (Morris water maze (doolhof) test). Voor deze 3 proefnemingen (3 30 per dier), werd het platform in het midden van één kwadrant van het bad geplaatst en de dieren werden met de kop in de richting van de wand op een willekeurige wijze los gelaten. Het dier werd toegestaan het platform te vinden of gedurende 60 seconden te zwemmen (latentie periode, de tijd die het duurt om het platform te vinden). Alle dieren 84 werden binnen 4-6 uur van dosering getest en door een onderzoeker, die niet op de hoogte was van de testgroepen, willekeurig geselecteerd voor het testen.

De resultaten zijn uitgedrukt als het gemiddelde ± standaardafwijkingen (SD). De significantie van verschillen in de studies van amyloïde en de gedragsstudies werden 5 geanalyseerd door het gebruik van een t-test. Vergelijkingen werden gemaakt tussen de APP controle groep van 6 maanden oude muizen en de met TTP-4000 behandelde dieren alsook een APP met hulpstof behandelde groep en de met TTP-4000 behandelde dieren van 9 maanden oud. Verschillen van lager dan 0,05 werden als significant beschouwd. Percentage veranderingen in amyloïde en gedrag werden bepaald door het 10 optellen van de gegeven van elke groep en het delen door de vergelijking (d.w.z. 1 i.p./6 maanden controle = % verandering).

Figuren 14A en 14B tonen dat muizen die gedurende 3 maanden zijn behandeld met ofwel TTP-4000 of sRAGE van muis minder Αβ-plaques en minder cognitieve dysiunctie hebben dan dieren die zijn behandeld met hulpstof en humaan IgGl (IgGl) 15 dat als negatieve controle dient. Deze gegevens geven aan dat TTP-4000 effectief is in het verlagen van pathologie van AD bij een model van een transgene muis. Het werd ook gevonden dat net zoals sRAGE TTP-4000 de inflammatoire cytokinen IL-1 en TNF-α kan verlagen (gegevens niet getoond).

20 C. Werkzaamheid van TTP-4000 in een dierlijk model van beroerte TTP-4000 werd ook vergeleken met sRAGE in een dierlijk model voor beroerte, dat relevant is voor de ziekte. In dit model werd de middelste halsslagader van een muis gedurende 1 uur geligeerd gevolgd door reperfusie gedurende 23 uur, waarbij op 25 dat punt de muizen werden opgeofferd en het gebied van het infarct in de hersenen werd bepaald. Muizen werden vlak voorafgaand aan reperfusie behandeld met sRAGE of TTP-4000 of controle immunoglobuline.

Bij deze experimenten werden mannelijke C57BL/6 geïnjecteerd met hulpstof bij 250 μΐ/muis of TTP testartikelen (TTP-3000, TTP-4000 bij 250 μΐ/muis). Muizen wer-30 den intraperitoneaal geïnjecteerd, 1 uur na de initiatie van ischemie. Muizen werden aan één uur van cerebrale ischemie onderworpen gevolgd door reperfusie gedurende 24 uur. Voor het induceren van ischemie werd elke muis verdoofd en de lichaamstemperatuur werd op 36-37°C gehouden door externe verwarming. De linker algemene hals- 85 slagader (CCA) werd blootgelegd door een insnijding in de middellijn in de nek. Een microchirurgische klem werd rond de oorsprong van de arterie carotis interne (ICA) geplaatst. Het distale uiteinde van de ECA werd met zijde geligeerd en dwars doorgesneden. Een 6-0 zijde werd losjes rond het stompje van ECA geknoopt. Het door vuur 5 gepolijste uiteinde van een nylonhechtdraad werd voorzichtig in de ECA stompje geïn-sereerd. De lus van de 6-0 zijde werd strak getrokken rond het stompje en de hecht-draad van nylon werd verder in en door de interne halsslagader (ICA) gebracht totdat het in de anterieure cerebrale arterie was geplaatst waardoor de voorste communicerende en middelste hersenslagader werden afgesloten. Nadat de hechtdraad van nylon ge-10 durende 1 uur was ingebracht werd het dier opnieuw verdoofd, werd de rectale temperatuur geregistreerd en werd de hechtdraad verwijderd en de insnijding gesloten.

Het volume van het infarct werd bepaald door het verdoven van de dieren met een intraperitoneale injectie van natriumpentobarbital (50 mg/kg) en vervolgens het verwijderen van de hersenen. De hersenen werden vervolgens in vier coupes van 2 mm 15 gesneden door het gebied van het infarct en gedurende 30 minuten in 2% trifenyltetra-zoliumchloride (TTC) geplaatst. Daarna werden de coupes gedurende de nacht in 4% paraformaldehyde geplaatst. Het gebied van het infarct in elke coupe werd bepaald met een computer-geassisteerd beeldanalysesysteem dat bestaat uit een Power Macintosh computer die is uitgerust met een Quick Capture frame grabber card, Hitachi CCD ca-20 mera die is bevestigd op een camera standaard. NIH Image Analysis Software, v. 1.55 werd gebruikt. De beelden werden vastgelegd en het totale gebied van het infarct werd over de coupes bepaald. Een enkele onderzoeker die niet op de hoogte was van de status van behandeling, voerde alle experimenten uit. Het optellen van de volumes van het infarct van de coupes berekende het totale volume van het infarct. De resultaten zijn 25 uitgedrukt als het gemiddelde ± standaardafwijking (SD). De significantie van het verschil van de gegevens van het volume van het infarct werden geanalyseerd door het gebruik van een t-test.

Zoals door de gegeven in Tabel 2 is geïllustreerd was TTP-4000 meer werkzaam dan sRAGE bij het beperken van het gebied van het infarct bij deze dieren, dat sugge-30 reert dat TTP-4000, vanwege de betere halfwaardetijd ervan in plasma, in staat was een betere bescherming aan te houden bij deze muizen.

86

Voorbeeld 6: Detectie van RAGE-fusie-eiwit door ELISA

Eerst werd 50 μΐ van het RAGE-specifieke monoklonale antilichaam 1HB1011 bij een concentratie van 10 pg/ml in IX PBS pH 7,3 bekleed op platen door middel van 5 incubatie gedurende de nacht. Wanneer ze klaar zijn voor gebruik werden de platen drie keer gewassen met 300 μΐ van IX Imidazool-Tween wasbuffer en geblokkeerd met 1% BSA. De monsters (verdund) en standaardverdunningen van bekende verdunningen van TTP-4000 worden bij een uiteindelijk volume van 100 μΐ toegevoegd. De monsters worden toegestaan gedurende één uur bij kamertemperatuur te incuberen. Na incubatie 10 worden de platen drie keer gewassen. Een anti-humaan IgGl 1 (Sigma A3312) AP con-jugaat van geit in 1XPBS met 1% BSA wordt toegevoegd en toegestaan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur te incuberen. De platen worden drie keer gewassen. Kleur wordt ontwikkeld met paranitrofenylfosfaat.

15 Voorbeeld 7: Kwantificering van binding van ligand van RAGE aan RAGE-fusie-eiwit

Figuur 15 toont de verzadigingsbindingskrommen van TTP-4000 aan verscheidene geïmmobiliseerde bekende liganden van RAGE. De liganden zijn geïmmobiliseerd 20 aan een microtiterplaat en in de aanwezigheid van toenemende concentraties van RAGE-fusie-eiwit van 0 tot 360 nM geïncubeerd. De ilnteractie van RAGE-fusie-eiwit - ligand wordt gedetecteerd door het gebruik van een polyklonaal antilichaam dat is geconjugeerd met alkalische fosfatase, dat specifiek is voor het IgG deel van de fusie-chimeer. Relatieve Kds werden berekend door het gebruik van Graphpad Prizm softwa-25 re en komen overeen met de in de literatuur vastgestelde waarden voor waarden van RAGE-RAGE-ligand. HMGIB = Ampoterine, CML = Carboxymethyllysine, A bèta = Amyloïde bèta 1 -40.

Voorbeeld 8: Gebruik van RAGE-fusie-eiwit voor het voorkomen van allogene 30 transplantaatafstoting

Het kan worden verwacht dat blokkade van RAGE de allogene transplantaatafstoting blokkeert. Deze experimenten onderzochten of blokkade van interacties van 87 ligand-RAGE door het gebruik van een RAGE-fusie-eiwit van de uitvinding afstoting van cellen van eilandjes die zijn getransplanteerd van een gezonde donor naar een dia-betisch dier zou verzwakken zoals wordt gemeten door de tijdsduur waarbij het getransplanteerde dier een glucoseniveau van het bloed onder een doelwitconcentratie kan 5 aanhouden. Zoals hierin is besproken werd het gevonden dat toediening van een RAGE-fusie-eiwit (bijvoorbeeld TTP-4000) aan diabetische dieren die cel-transplantaten van eilandjes hadden gekregen aanzienlijk de terugkeer van hyperglyce-mie vertraagden en aldus afstoting van getransplanteerde cellen van eilandjes bij twee (allogene en syngene) modellen van dieren van transplantatie.

10 A. Allogene transplantatie van eilandjes bij muizen

In de eerste set van experimenten werd getest of toediening van een RAGE-fusie-eiwit (TTP-4000) de allogene afstoting van getransplanteerde cellen van eilandjes en de 15 terugkeer van diabetes in een model van diabetes van een C57BL/6J (B6) muis zou kunnen moduleren.

Dierlijk model van diabetes 20 C57BL/6J (6-8 weken oud) (B6) muizen werden diabetisch gemaakt door een en kele intraveneuze injectie van streptozotocine (STZ) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) bij 200 mg/kg. BALB/cJ (6-8 weken oud) (BALB) muizen dienden als donoren voor de transplantatie van eilandjes waardoor aldus een allogene mismatch voor transplantatie van eilandjes wordt verschaft.

25

Isolatie van eilandjes

Muizen (BALB/c) werden verdoofd met ketamine HCl/xylazine HC1 oplossing (Sigma, St. Louis MO). Na intraductale injectie van 3 ml van koude Hank’s gebalan-30 ceerde zoutoplossing (HBSS, Gibco, Grand Island, NY) die 1,5 mg/ml collagenase P (Roche Diagnostics, Branchburg, NJ) bevat, werden alvleesklieren chirurgisch verkregen en gedurende 20 minuten bij 37°C gedigereerd. De eilandjes werden gewassen met HBSS en gezuiverd door discontinue gradiëntcentrifugatie door het gebruik van Poly- 88 sucrose 400 (Cellgro, Herndon VA) die vier verschillende dichtheden heeft (26%, 23%, 20% en 11%). De weefselfragmenten op het raakvlak van de 20% en 23% lagen werden verzameld, gewassen en geresuspendeerd in HBSS. Afzonderlijke eilandjes die vrij zijn van verbonden acinaire, vasculaire en ductale weefsels werden zorgvuldig gekozen 5 onder een omgekeerde microscoop, waarbij sterk gezuiverde eilandjes voor transplantatie worden geleverd.

Transplantatie van eilandjes 10 Streptozotocine-geïnduceerde diabetische C57BL/6 (B6) muizen kregen binnen 2 dagen van de diagnose van diabetes transplantaten van eilandjes. BALB/cJ (6-8 weken oud) (BALB) muizen dienden als donors voor allogene transplantatie van eilandjes. Voor transplantatie werden 500-600 vers geïsoleerde eilandjes (d.w.z. bij benadering 550 eilandjes equivalenten) van donormuizen genomen met een infusieset en getrans-15 planteerd in de subcapsulaire ruimte van de rechter nier van een ontvanger.

Behandeling met testverbindingen

Testverbindingen werden toegediend op het moment dat de eilandjes werden ge-20 transplanteerd; toediening werd gedurende ongeveer 60 dagen voortgezet, afhankelijk van hoe het controle dier zich gedraagt. Muizen werden met 0,25 ml van ofwel fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), TTP-4000 in PBS of IgG in PBS volgens de strategie hieronder (Tabel 3) geïnjecteerd.

89

Tabel 3

Toediening van testverbindingen en/of hulpstof

Testgroep Aantal muizen Loading-dosis Onderhoudsdosis Strategie

Onbehandelde 8 controle

Controle met 8 0,25 ml/dosis/muis 0,25 ml/dosis/muis Eenmaal om de dag

hulpstof op dag 1 beginnend op dag 2 (QOD) x 60 dagen; IP

(PBS)

IgG 8 (300 pg) (100 pg) (100 pg)

0,25 ml/dosis/muis 0,25 ml/dosis/muis Eenmaal om de dag op dag 1 beginnend op dag 2 (QOD) x 60 dagen; IP

TTP-4000 8 (300 pg) (100 pg) (100 pg)

_____ _ (300 pg) (30 pg) (30 pg)

Het volgen van de functie van het transplantaat van eilandjes 5 Het functioneren van het transplantaat van de eilandjes werd gevolgd door het dagelijks opeenvolgend meten van glucose van het bloed gedurende de eerste 2 weken na transplantatie van de eilandjes, gevolgd daarna door om de dag te meten. Omkeer van diabetes werd gedefinieerd als bloed een glucoseniveau heeft van lager dan 200 mg/dl bij twee opeenvolgende metingen. Verlies van het transplantaat werd bepaald 10 wanneer glucose van het bloed 250 mg/dl overschrijdt gedurende twee opeenvolgende metingen. De resultaten zijn in Tabel 4 getoond.

90

Tabel 4

Effecten van TTP-4000 op transplantatie van allogene transplantatie van eilandjes* TTP-4000 PBS Ί TTP-4000 ïgG Niet- 300 pg LD + (Groep 2) 300 pg LD + 300 pg LD + behandelde 100 pg qod ip 30 pg qod ip 100 pg qod ip controle (Groep 1) (Groep 3) (Groep 4) 14 9 13 8 9 16 8 14 9 8 13 ÏÖ 12 ÏO 9 13 8 12 8 ÏÖ 12 Π Π 8 9 16 8 Π 8 8 _ __ _ _ _ 14 8 8 Π 9 7 9 8 9

Gemiddelde 14,125 8/75 11,125 p75 8,833333 ~SD 1,457738 1,164965 2,167124 1,125992 1,029857 8 8 8 8 Ï2 * Waarden weerspiegelen de dag van verlies van transplantaat voor elk dier zoals wordt gedefinieerd 5 door terugkeer van verhoogde niveaus van glucose in het bloed

De effecten van het toedienen van TTP-4000 op afstoting van allogene transplan-taten van eilandjes van BALB/c in B6-muizen zijn getoond als een Kaplan-Meier Cumulative overlevingsgrafiek in Figuur 21. Het kan worden gezien dat er een toename is 10 in de tijd voordat falen van het transplantaat wordt gedetecteerd voor dieren die zijn behandeld met TTP-4000 (Groepen 1 en 3) in tegenstelling tot dieren die in het geheel niet zijn behandeld (Controle) of dieren die zijn behandeld met de hulpstof (PBS) of humaan IgGl. Door het gebruik van een verscheidenheid van statistische analysen (Mantel-Cox Logrank, Breslow-Gehan-Wilcoxon; Tarone-Ware, Peto-Peto-Wilcoxin; 15 en Harrington-Fleming) waren de verschillen tussen de Controle en TTP-4000 (Groepen 1 en 3) significant (Tabel 5).

91

Tabel 5

Statistische werkwijze Controle versus Groep 1 (TTP- Controle versus Groep 3 (TTP-4000) 4000)

Chi-square DF* P-waarde Chi-square DF P-waarde

Logrank (Mantel-Cox) 18,777 1 <0,0001 7,662 1 0,0056

Breslow-Gehan- 15,092 1 0,0001 4,904 1 0,0268

Wilcoxon

Tarone-Ware 16,830 ï <0,0001 6,212 ï 0,0127

Peto-Peto-Wilcoxon 14,359 ï 0,0002 4,315 i 0,0378

Harrington-Fleming (rho 16,830 1 <0,0001 6,212 1 0,0127 = 0,5) * Niveaus van vrijheid B. Transplantatie van eilandjes in NOD-muizen als een model van auto-5 immuunziekte

Bij de tweede set van experimenten werd getest of toediening van RAGE-fusie-eiwit (d.w.z. TTP-4000 of TTP-3000) het verloop van terugkerende diabetes bij NOD-muizen zou moduleren door het gebruik van een syngeen NOD model van transplanta-10 tie.

Dierlijke modellen van diabetes

Spontane auto-immuun niet-zwaarlijvige diabetische muizen (NOD/LtJ) (12-25 15 weken oud) dienden als ontvangers van cellen van eilandjes, terwijl jonge pre-diabetische NOD/LtJ muizen (6-7 weken oud) als donoren dienden bij syngene transplantatie van eilandjes. Eilandjes voor transplantatie werden geïsoleerd zoals hierboven is beschreven in Deel A (Allogene transplantatie van eilandjes).

20 Transplantatie van eilandjes:

Diabetische NOD/LtJ muizen kregen transplantaten van eilandjes binnen 2 dagen van de diagnose van diabetes. 500-600 vers geïsoleerde eilandjes (bij benadering 550 eilandjes equivalenten) van donor muizen werden met een infusieset genomen en ge-25 transplanteerd in de subcapsulaire ruimte van de rechter nier.

92

Behandeling met testverbindingen

Testverbindingen werden op het moment dat de eilandjes werden getransplanteerd toegediend en gedurende bij benadering 8 weken voortgezet. Muizen werden met 5 0,25 ml van ofwel PBS, TTP-4000 in PBS of TTP-3000 in PBS geïnjecteerd volgens de strategie die hieronder uiteengezet is (Tabel 6).

Tabel 6

Testgroep Aantal muizen Volume loading- Volume onder- Strategie dosis houdsdosis TTP-4000 8 (300 pg) (100 pg) ~ (100 pg)

0,25 ml/dosis/muis 0,25 ml/dosis/muis Eenmaal om de dag op dag 1 beginnend op dag 2 (QOD) x 8 weken; IP

TTP-3000 8 (300 pg) (100 pg) (100 pg)

PBS 8 0,25 ml/dosis/muis 0,25 ml/dosis/muis Eenmaal om de dag

op dag 1 beginnend op dag 2 (QOD) x 8 weken; IP

10 Het volgen van de functie van het transplantaat van eilandjes

Het functioneren van het transplantaat van de eilandjes werd gevolgd door het dagelijks opeenvolgend meten van glucose van het bloed gedurende de eerste 2 weken na transplantatie van de eilandjes, gevolgd daarna door om de dag te meten. Omkeer 15 van diabetes werd gedefinieerd als bloed een glucoseniveau heeft van lager dan 200 mg/dl bij twee opeenvolgende metingen. Verlies van het transplantaat werd bepaald wanneer glucose van het bloed 250 mg/dl overschrijdt gedurende twee opeenvolgende metingen. De resultaten zijn in Tabel 7 getoond.

93

Tabel 7

Effecten van TTP-4000 en TTP-3000 op terugkeer van diabetes bij syngene transplantatie van eilandjes bij NOD-muizen* TTP-4000 TTP-4000 Controle 300 pg LD + 100 pg 300 pg + qod ip (Groep 1) 100 pg qod ip (Groep 2) 35 44 23 38 46 " 25 4Ö 42 26 43 41 22 36 34 22 45 32 24 44 30 2l 38 20 22 _ 24

Gemiddelde 39,875 38,42857 22,727273 “SD 3,758324 6,32079 1,8488326 ~N " 8 7 Π * Waarden weerspiegelen de dag van verlies van transplantaat voor elk dier zoals wordt gedefinieerd 5 door terugkeer van verhoogde niveaus van glucose in het bloed

De effecten van het toedienen van TTP-4000 op afstoting van syngeen getransplanteerde eilandjes bij diabetische NOD-muizen zijn getoond als een Kaplan-Meier Cumulative overlevingsgrafiek in Figuur 22. Zoals in de gegevens in Tabel 7 is ge-10 toond was er een toename van de tijd voordat falen van het transplantaat wordt gedetecteerd voor dieren die zijn behandeld met TTP-4000 (Groep 1) en TTP-3000 (Groep 2) in tegenstelling tot dieren die in het geheel niet zijn behandeld (Controle). Figuur 22 toont de toename in de tijd voorafgaand aan detectie van falen van het transplantaat voor dieren die zijn behandeld met TTP-4000 (Groep 1) en dieren die in het geheel niet 15 zijn behandeld. Door het gebruik van een verscheidenheid van statistische analysen (Mantel-Cox Logrank, Breslow-Gehan-Wilcoxon; Tarone-Ware, Peto-Peto-Wilcoxin; Harrington-Fleming) werd getoond dat de verschillen tussen de Controle en TTP-4000 (Groep 1) en de Controle en TTP-3000 (Groep 2) significant zijn (Tabel 8).

94

Tabel 8

Statistische werkwijze Controle versus Groep 1 (TTP- Controle versus Groep 2 (TTP-3000) 4000)

Chi-square DF* P-waarde Chi-square DF P-waarde Logrank (Mantel-Cox) 18,410 1 <0,0001 16,480 1 <0,0001

Breslow-Gehan- 14,690 ï 0,0001 12,927 ï 0,0001

Wilcoxon

Tarone-Warë 16,529 ï <0,0001 14,686 ï 0,0001

Peto-Peto-Wilcoxon 14,812 ï 0,0001 13,027 ï 0,0003

Harrington-Fleming (rho 16,529 1 <0,0001 14,686 1 0,0001 = 0,5) * Niveaus van vrijheid

Het voorgaande wordt alleen als illustratief voor het principe van de uitvinding 5 beschouwd. Omdat voor de deskundigen in het vakgebied talrijke modificaties en veranderingen eenvoudig duidelijk kunnen zijn, is het niet de bedoeling om de uitvinding te beperken tot de exacte uitvoeringsvormen zoals ze zijn getoond en zijn beschreven en alle geschikte modificaties en equivalenten die binnen de beschermingsomvang van de bij gevoegde conclusies vallen worden beschouwd binnen het concept van de onder-10 havige uitvinding te vallen.

2000476

Claims

1. RAGE-ftisie-eiwit dat een RAGE-polypeptide omvat dat direct is gekoppeld aan een polypeptide dat Ch2-domein van een immunoglobuline of een deel van een Ch2- 5 domein van een immunoglobuline omvat.

2. RAGE-fusie-eiwit volgens conclusie 1, waarbij het RAGE-polypeptide een inter-domein linker van RAGE gekoppeld aan een immunoglobuline-domein van RAGE omvat, zodanig dat het C-eindstandige aminozuur van het immunoglobuline-domein 10 van RAGE is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van de interdomein linker en het C-eindstandige aminozuur van de interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een Ch2-domein van een immunoglobuline of een deel daarvan omvat.

3. RAGE-fusie-eiwit volgens conclusie 1, waarbij het RAGE-polypeptide een li- gand-bindingsplaats omvat.

4. RAGE-fusie-eiwit volgens conclusie 3, waarbij de bindingsplaats voor het ligand van RAGE SEQ ID NO: 9 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of

5. RAGE-fusie-eiwit volgens conclusie 2, waarbij het RAGE-polypeptide een interdomein linker omvat die is gekoppeld aan een immunoglobuline-domein van RAGE die een fragment van een RAGE-eiwit met de volledige lengte omvat. 25

6. RAGE-fusie-eiwit volgens conclusie 5, dat verder een eerste immunoglobuline-domein van RAGE en een eerste interdomein linker van RAGE gekoppeld aan een tweede immunoglobuline-domein van RAGE en een tweede interdomein linker van RAGE omvat, zodanig dat het N-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein 30 linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het eerste immunoglobuline-domein van RAGE, het N-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobuline-domein van RAGE is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker, het N-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker is ge- 2000476 koppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobuline-domein van RAGE en het C-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van het CH2 immunoglobuline-domein of een deel van een Cn2-domein van een immunoglobuline. 5

7. RAGE-fusie-eiwit volgens conclusie 6, dat de aminozuursequentie SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, of SEQ ID NO: 56 omvat.

8. RAGE-fusie-eiwit volgens conclusie 6, dat de aminozuursequentie SEQ ID NO: 10 33 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine, SEQ ID NO: 34 zonder het C- eindstandige aminozuurresidu lysine, of SEQ ID NO: 56 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine omvat.

9. RAGE-fusie-eiwit volgens conclusie 6, waarbij de interdomein linker van RAGE 15 die op directe wijze is gekoppeld aan het immunoglobuline Cn2-domein of een deel daarvan SEQ ID NO: 22 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 24, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, omvat.

10 NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 56, of SEQ ID NO: 57 omvat.

10 NO: 37 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine, of SEQ ID NO: 57 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine omvat.

10. RAGE-fusie-eiwit volgens conclusie 5, dat een enkel immunoglobuline-domein 20 van RAGE omvat die is gekoppeld door middel van een interdomein linker van RAGE aan het N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een Ch2- immunoglobuline domein of een deel van een Ch2-domein van een immunoglobuline omvat.

11. RAGE-fusie-eiwit volgens conclusie 10, dat de aminozuursequentie SEQ ID NO: 25 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, of SEQ ID NO: 57 omvat.

12. RAGE-fusie-eiwit volgens conclusie 10, dat de aminozuursequentie SEQ ID NO: 36 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine, SEQ ID NO: 37 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine, of SEQ ID NO: 57 zonder het C-eindstandige 30 aminozuurresidu lysine omvat.

13. RAGE-fusie-eiwit volgens conclusie 10, waarbij de linker van RAGE die op directe wijze is gekoppeld aan het immunoglobuline Ch2, SEQ ID NO: 21 of een sequen- tie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 23 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is omvat.

14. Geïsoleerde nucleïnezuursequentie die codeert voor het RAGE-fusie-eiwit vol-5 gens conclusie 1.

15. Gesoleerde nucleïnezuursequentie volgens conclusie 14, waarbij het RAGE-polypeptide een interdomein linker van RAGE omvat die is gekoppeld aan een immu-noglobuline-domein van RAGE, zodanig dat het C-eindstandige aminozuur van het 10 immunoglobuline-domein van RAGE is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van de interdomein linker en het C-eindstandige aminozuur van de interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een C^-domein van een immunoglobuline of een deel daarvan omvat.

16. Nucleïnezuur volgens conclusie 15, dat de sequentie van SEQ ID NO: 30, of een fragment daarvan, of de sequentie van SEQ ID NO: 31, of een fragment daarvan, the sequentie van SEQ ID NO:54, of een fragment daarvan, of de sequentie van SEQ ID NO: 55, of een fragment daarvan omvat.

17. Expressievector die codeert voor het RAGE-fusie-eiwit volgens conclusie 1.

18. Expressievector volgens conclusie 17, waarbij het RAGE-polypeptide een interdomein linker van RAGE omvat die is gekoppeld aan een immunoglobuline-domein van RAGE, zodanig dat het C-eindstandige aminozuur van het immunoglobuline-25 domein van RAGE is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van de interdomein linker en het C-eindstandige aminozuur van de interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een Ch2-domein van een immunoglobuline of een deel daarvan omvat.

19. Expressievector volgens conclusie 17, die de sequentie SEQ ID NO:30, of een fragment daarvan, of SEQ ID NO: 31, of een fragment daarvan, SEQ ID NO:54, of een fragment daarvan, of SEQ ID NO: 55, of een fragment daarvan omvat.

20. Cel getransfecteerd met de expressievector volgens conclusie 17, zodanig dat de cel een RAGE-fusie-eiwit tot expressie brengt dat een RAGE-polypeptide omvat dat op directe wijze is gekoppeld aan een polypeptide dat een Cn2-domain van een immu-noglobuline of een deel van een CH2-domain van een immunoglobuline omvat. 5

20 SEQ ID NO: 10 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is omvat.

21. Cel getransfecteerd met de expressievector volgens conclusie 17, zodanig dat de cel een RAGE-fusie-eiwit tot expressie brengt dat de aminozuursequentie zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 56, of SEQ ID NO: 57 omvat. 10

22. Cel getransfecteerd met de expressievector volgens conclusie 17, zodanig dat de cel een RAGE-fusie-eiwit tot expressie brengt dat de aminozuursequentie SEQ ID NO: 33 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine, SEQ ID NO: 34 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine, SEQ ID NO: 36 zonder het C-eindstandige ami- 15 nozuurresidu lysine, SEQ ID NO: 37 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine, SEQ ID NO: 56 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine, of SEQ ID NO: 57 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine omvat.

23. Preparaat dat een therapeutisch effectieve hoeveelheid van het RAGE-fusie-eiwit 20 volgens conclusie 1 omvat.

24. Preparaat volgens conclusie 23, waarbij het RAGE-polypeptide een interdomein linker van RAGE omvat die is gekoppeld aan een immunoglobuline-domein van RAGE, zodanig dat het C-eindstandige aminozuur van het immunoglobuline-domein 25 van RAGE is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van de interdomein linker en het C-eindstandige aminozuur van de interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een Ch2-domein van een immunoglobuline of een deel daarvan omvat.

25. Preparaat volgens conclusie 23, waarbij het RAGE-polypeptide een ligand- bin- dingsplaats omvat.

26. Preparaat volgens conclusie 25, waarbij de bindingsplaats voor het ligand van RAGE ID NO: 9 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 10 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is omvat.

27. Preparaat volgens conclusie 24, waarbij het RAGE-polypeptide dat een interdo- mein linker omvat die is gekoppeld aan een immunoglobuline-domein van RAGE een fragment van een RAGE-eiwit met de volledige lengte omvat.

28. Preparaat volgens conclusie 23, waarbij het RAGE-polypeptide een eerste immu-10 noglobuline-domein van RAGE en een eerste interdomein linker van RAGE gekoppeld aan een tweede immunoglobuline-domein van RAGE en een tweede interdomein linker van RAGE omvat, zodanig dat het N-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het eerste immunoglobuline-domein van RAGE, het N-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglo-15 buline-domein van RAGE is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker, het N-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobuline-domein van RAGE en het C-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van het 20 CH2-immunoglobuline-domein of een deel van een Cn2-domein van een immunoglobu-line.

29. Preparaat volgens conclusie 28, waarbij the RAGE-fusie-eiwit de aminozuur-sequentie SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, of SEQ ID NO: 56 om- 25 vat.

30. Preparaat volgens conclusie 28, waarbij the RAGE-fusie-eiwit de aminozuurse-quentie SEQ ID NO: 33 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine, SEQ ID NO: 34 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine, of SEQ ID NO: 56 zonder 30 het C-eindstandige aminozuurresidu lysine omvat.

31. Preparaat volgens conclusie 27, waarbij het RAGE-fusie-eiwit een enkel immunoglobuline-domein van RAGE omvat dat is gekoppeld door middel van een interdo- mein linker van RAGE aan het N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een CH2-immunoglobuline domein of een deel van een Cn2-domein van een immunoglobu-line omvat.

32. Preparaat volgens conclusie 31, waarbij the RAGE-fusie-eiwit de aminozuurse- quentie SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, of SEQ ID NO: 57 omvat.

33. Preparaat volgens conclusie 31, waarbij the RAGE-fusie-eiwit de aminozuurse-quentie SEQ ID NO: 36 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine, SEQ ID

34. Preparaat volgens conclusie 23, waarbij the RAGE-fusie-eiwit is bereid als een injecteerbare oplossing. 15

35. Preparaat volgens conclusie 23, waarbij the RAGE-fusie-eiwit is bereid als een steriel gevriesdroogd poeder.

36. Werkwijze voor het maken van het RAGE-fusie-eiwit volgens conclusie 1, die de 20 stap omvat van het op covalente wijze koppelen van een RAGE-polypeptide aan een polypeptide dat een Cn2-domein van een immunoglobuline of een deel van een Ch2-domein van een immunoglobuline omvat.

37. Werkwijze volgens conclusie 36, waarbij het RAGE-polypeptide een interdomein 25 linker van RAGE omvat die is gekoppeld aan een immunoglobuline-domein van RAGE, zodanig dat het C-eindstandige aminozuur van het immunoglobuline-domein van RAGE is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van de interdomein linker en het C-eindstandige aminozuur van de interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een Ch2-30 domein van een immunoglobuline of een deel daarvan omvat.

38. Werkwijze volgens conclusie 36, waarbij the RAGE-polypeptide een ligand- bin-dingsplaats omvat.

39. Werkwijze volgens conclusie 38, waarbij de bindingsplaats voor een ligand van RAGE SEQ ID NO: 9 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 10 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is omvat.

40. Werkwijze volgens conclusie 37, waarbij het RAGE-polypeptide dat een inter- domein linker omvat die is gekoppeld aan een immunoglobuline-domein van RAGE een fragment van een RAGE-eiwit met de volledige lengte omvat.

41. Werkwijze volgens conclusie 40, waarbij het RAGE-polypeptide een eerste im-10 munoglobuline-domein van RAGE en een eerste interdomein linker van RAGE gekoppeld aan een tweede immunoglobuline-domein van RAGE en een tweede interdomein linker van RAGE omvat, zodanig dat het N-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het eerste immunoglobuline-domein van RAGE, het N-eindstandige aminozuur van het tweede immu- 15 noglobuline-domein van RAGE is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker, het N-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobuline-domein van RAGE en het C-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van 20 het Ch2 immunoglobuline-domein of een deel van een Cn2-domein van een immu-noglobuline.

42. Werkwijze volgens conclusie 40, waarbij het RAGE-polypeptide een enkel immunoglobuline-domein van RAGE omvat dat is gekoppeld door middel van een inter- 25 domein linker van RAGE aan het N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een CH2-immunoglobuline domein of een deel van een CH2-domein van een immu-noglobuline omvat.

43. Werkwijze volgens conclusie 36, waarbij het RAGE-fusie-eiwit wordt gecodeerd 30 door een recombinant DNA-construct.

44. Werkwijze volgens conclusie 43, die verder de stap van het incorporeren van het DNA-construct in een expressievector omvat.

45. Werkwijze volgens conclusie 44, die verder het transfecteren van de expressie-vector in een gastheercel omvat.

46. Werkwijze voor het produceren van het RAGE-fusie-eiwit volgens conclusie 1, 5 die het tot expressie brengen van het RAGE-fusie-eiwit in een cel omvat, waarbij de cel een nucleïnezuursequentie omvat die voor het RAGE-fusie-eiwit codeert.

47. Werkwijze volgens conclusie 46, waarbij het RAGE-fusie-eiwit dat tot expressie wordt gebracht de aminozuursequentie van SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID

48. Werkwijze volgens conclusie 46, waarbij het RAGE-fusie-eiwit dat tot expressie wordt gebracht de aminozuursequentie van SEQ ID NO: 33 zonder het C-eindstandige 15 aminozuurresidu lysine, SEQ ID NO: 34 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine, SEQ ID NO: 36 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine, SEQ ID NO: 37 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine, SEQ ID NO: 56 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine, of SEQ ID NO: 57 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine omvat. 20

49. Werkwijze voor het produceren van een RAGE-fusie-eiwit dat een RAGE-polypeptide omvat dat op directe wijze is gekoppeld aan een polypeptide dat een Ch2-domein van een immunoglobuline of een deel van een Ch2-domein van een immu-noglobuline van een RAGE-fusie-eiwit omvat, waarbij de werkwijze het tot expressie 25 brengen van het RAGE-fusie-eiwit dat wordt gecodeerd door het nucleïnezuur volgens conclusie 16 in een cel omvat.

50. Werkwijze volgens conclusie 49, waarbij de cel een zoogdierlijke cel is.

51. Werkwijze volgens conclusie 49, waarbij de cel is gekozen uit de groep die be staat uit een CHO-cel, een NSO-cel, een Hela-cel, een COS-cel en een SP2-cel.

52. Werkwijze volgens conclusie 51, waarbij de werkwijze verder het kweken van de cel en het terugwinnen van het eiwit daarvan omvat.

53. Gebruik van een RAGE-fusie-eiwit als gedefinieerd in conclusie 1, voor de be-5 reiding van een geneesmiddel voor het behandelen van een RAGE-bemiddelde stoornis.

54. Gebruik volgens conclusie 53, waarbij het RAGE-polypeptide een interdomein linker van RAGE gekoppeld aan een immunoglobuline-domein van RAGE omvat, zo- 10 danig dat het C-eindstandige aminozuur van het immunoglobuline-domein van RAGE aan het N-eindstandige aminozuur van de interdomein linker is gekoppeld en het C-eindstandige aminozuur van de interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een Cn2-domein van een immunoglobuline, of een deel daarvan omvat. 15

55. Gebruik volgens conclusie 53, waarbij het RAGE-polypeptide een bindingsplaats voor een ligand van RAGE omvat, waarbij de bindingsplaats voor een ligand van RAGE een aminozuursequentie zoals uiteengezet is in SEQ ID NO: 9 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 10 of een sequentie die tenmin- 20 ste 90% identiek daar aan is omvat.

56. Gebruik volgens conclusie 54, waarbij het RAGE-polypeptide dat een interdomein linker gekoppeld aan een immunoglobuline-domein van RAGE omvat een fragment van een RAGE-eiwit met de volledige lengte omvat. 25

57. Gebruik volgens conclusie 56, die verder een eerste immunoglobuline-domein van RAGE en een eerste interdomein linker van RAGE gekoppeld aan een tweede immunoglobuline domein van RAGE en een tweede interdomein linker van RAGE omvat, zodanig dat het N-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker is ge- 30 koppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het eerste immunoglobuline domein van RAGE, het N-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobuline-domein van RAGE is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker, het N-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobuline domein van RAGE en het C-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van het Ch2 immu-noglobuline-domein of een deel van een Ch2-domein van een immunoglobuline. 5

58. Gebruik volgens conclusie 57, waarbij het RAGE-fusie-eiwit de aminozuur-sequentie SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, of SEQ ID NO: 56 omvat.

59. Gebruik volgens conclusie 57, waarbij het RAGE-fusie-eiwit de aminozuurse-10 quentie SEQ ID NO: 33 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine, SEQ ID NO: 34 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine of SEQ ID NO: 56 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine omvat.

60. Gebruik volgens conclusie 57, waarbij de interdomein linker van RAGE die op 15 directe wijze is gekoppeld aan het immunoglobuline CH2-domein of een deel daarvan, SEQ ID NO: 22 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 24 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is omvat.

61. Gebruik volgens conclusie 56, dat een enkel immunoglobuline-domein van 20 RAGE omvat dat is gekoppeld door middel van een interdomein linker van RAGE aan het N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een CH2-immunoglobuline-domein of een deel van een Cn2-domein van een immunoglobuline omvat.

62. Gebruik volgens conclusie 61, waarbij het RAGE-fusie-eiwit de aminozuur-25 sequentie SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, of SEQ ID NO: 57 omvat.

63. Gebruik volgens conclusie 61, waarbij het RAGE-fusie-eiwit de aminozuur-sequentie SEQ ID NO: 36 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine, SEQ ID NO: 37 zonder het C-eindstandige aminozuurresidu lysine, of SEQ ID NO: 57 zonder 30 het C-eindstandige aminozuurresidu lysine omvat.

64. Gebruik volgens conclusie 61, waarbij de interdomein linker van RAGE die op directe wijze is gekoppeld aan het immunoglobuline CH2 of een deel daarvan, SEQ ID NO: 21 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 23 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is omvat.

65. Gebruik volgens conclusie 53, waarbij het geneesmiddel voor toediening is die is 5 gekozen uit tenminste één van intraveneuze toediening, intraperitoneale toediening of subcutane toediening.

66. Gebruik volgens conclusie 53, waarbij het geneesmiddel voor de behandeling van een symptoom van diabetes of een symptoom van late complicaties van diabetes is. 10

67. Gebruik volgens conclusie 66, waarbij het symptoom van diabetes of late complicaties van diabetes tenminste één van diabetische nefropathie, diabetische retinopathie, een diabetische voetzweer, een cardiovasculaire complicatie of diabetische neuropathie omvat. 15

68. Gebruik volgens conclusie 53, waarbij het geneesmiddel voor de behandeling van tenminste één van amyloïdoses of de ziekte van Alzheimer is.

69. Gebruik volgens conclusie 53, waarbij het geneesmiddel voor de behandeling van 20 kanker is.

70. Gebruik volgens conclusie 53, waarbij het geneesmiddel voor de behandeling van ontsteking is.

71. Gebruik volgens conclusie 53, waarbij het geneesmiddel voor de behandeling van ontsteking die is geassocieerd met tenminste één van auto-immuniteit, inflammatoire darmziekte, reumatoïde artritis, psoriasis, multipele sclerose, hypoxie, beroerte, hartaanval, hemorrhagische shock, sepsis, of verzwakte genezing van wonden is.

72. Gebruik volgens conclusie 71, waarbij de auto-immuniteit afstoting van tenmin ste één van huidcellen, alvleeskliercellen, zenuwcellen, spiercellen, endotheelcellen, hartcellen, levercellen, niercellen, hart, beenmergcellen, bot, bloedcellen, slagaderlijke cellen, aderlijke cellen, kraakbeencellen, schildkliercellen of stamcellen omvat.

73. Gebruik volgens conclusie 53, waarbij het geneesmiddel voor de behandeling van nierfalen is.

74. Gebruik volgens conclusie 53, waarbij het geneesmiddel voor de behandeling van 5 ontsteking en/of afstoting die is geassocieerd met transplantatie van tenminste één van een orgaan, een weefsel of een verscheidenheid van cellen van een eerste plaats naar een tweede plaats is.

75. Gebruik volgens conclusie 74, waarbij de eerste en tweede plaatsen in verschil- 10 lende patiënten zijn.

76. Gebruik volgens conclusie 74, waarbij de eerste en tweede plaatsen in dezelfde persoon zijn.

77. Gebruik volgens conclusie 74, waarbij de getransplanteerde cellen, weefsel of orgaan een cel, weefsel of orgaan van een alvleesklier, huid, lever, nier, hart, beenmerg, bloed, bot, spier, slagader, ader, kraakbeen, schildklier, zenuwstelsel of stamcellen omvat.

78. Gebruik van een RAGE-fusie-eiwit als gedefinieerd in conclusie 1 voor de berei ding van een geneesmiddel voor het voorkomen van transplantaatafstoting van een cel, weefsel of orgaan. 2000476 - SEQUENCE LISTING <110> TransTech Pharma, Inc. Mjalli, Adnan M.M. Rothlein, Robert Webster, Jeffrey C. Tian, Ye Edward <120> RAGE Fusion Proteins and Methods of Use <130> 57739-339019 <150> US 60/771,619 <151> 2006-02-09 cl60> 57 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 404 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu 1 5 10 15 Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu 20 25 30 Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg 35 40 45 Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu 50 55 60 Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro 65 70 75 80 Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie 85 90 95 Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn 100 105 110 Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp 115 120 125 Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys 130 135 140 »000476 - Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp 145 150 155 160 Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin 165 170 175 Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu 180 185 190 Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys 195 200 205 Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro 210 215 220 lie Gin Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu 225 230 235 240 Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr 245 250 255 Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gin Pro Ser Pro Gin He His Trp Met 260 265 270 Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu 275 280 285 Pro Glu lie Gly Pro Gin Asp Gin Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr 290 295 300 His Ser Ser His Gly Pro Gin Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile 305 310 315 320 lie Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser 325 330 335 Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly 340 345 350 Thr Ala Ala Leu Leu Ile Gly Val Ile Leu Trp Gin Arg Arg Gin Arg 355 360 365 Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Asn Gin Glu Glu Glu Glu Glu 370 375 380 2 Arg Ala Glu Leu Asn Gin Ser Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser 385 390 395 400 Thr Gly Gly Pro <210> 2 <211> 382 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15 Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30 Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45 Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60 Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80 Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95 Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110 Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr 115 120 125 Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro 130 135 140 Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu 145 150 155 160 Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg 165 170 175 Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu 180 185 190 3 Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin Pro Arg Val Trp 195 200 205 Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly 210 215 220 Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro 225 230 235 240 Ala Gin Pro Ser Pro Gin He His Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu 245 250 255 Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu lie Leu Pro Glu He Gly Pro Gin 260 265 270 Asp Gin Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro 275 280 285 Gin Glu Ser Arg Ala Val Ser He Ser He He Glu Pro Gly Glu Glu 290 295 300 Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly Leu Gly Thr Leu Ala 305 310 315 320 Leu Ala Leu Gly He Leu Gly Gly Leu Gly Thr Ala Ala Leu Leu He 325 330 335 Gly Val He Leu Trp Gin Arg Arg Gin Arg Arg Gly Glu Glu Arg Lys 340 345 350 Ala Pro Glu Asn Gin Glu Glu Glu Glu Glu Arg Ala Glu Leu Asn Gin 355 360 365 Ser Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser Thr Gly Gly Pro 370 375 380 <210 > 3 <211> 381 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Giri Asn He Thr Ala Arg He Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 1 5 10 15 4 Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30 Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60 Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn 65 70 75 80 Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin 85 90 95 lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala 100 105 110 Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro 115 120 125 Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn 130 135 140 Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu Thr 145 150 155 160 Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly 165 170 175 Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro 180 185 190 Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin Pro Arg Val Trp Glu 195 200 205 Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly 210 215 220 Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala 225 230 235 240 Gin Pro Ser Pro Gin lie His Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro 245 250 255 5 Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu lie Leu Pro Glu lie Gly Pro Gin Asp 260 265 270 Gin Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro Gin 275 280 285 Glu Ser Arg Ala Val Ser lie Ser lie lie Glu Pro Gly Glu Glu Gly 290 295 300 Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu 305 310 315 320 Ala Leu Gly lie Leu Gly Gly Leu Gly Thr Ala Ala Leu Leu lie Gly 325 330 335 Val lie Leu Trp Gin Arg Arg Gin Arg Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala 340 345 350 Pro Glu Asn Gin Glu Glu Glu Glu Glu Arg Ala Glu Leu Asn Gin Ser 355 360 365 Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser Thr Gly Gly Pro 370 375 380 <210s> 4 <211> 339 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu 15 10 15 Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu 20 25 30 Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg 35 40 45 Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu 50 55 60 Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro 65 70 75 80 Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie 85 90 95 6 Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn 100 105 110 Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp 115 120 125 Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys 130 135 140 Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp 145 150 155 160 Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin 165 170 175 Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu 180 185 190 Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys 195 200 205 Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro 210 215 220 He Gin Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu 225 230 235 240 Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr 245 250 255 Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gin Pro Ser Pro Gin lie His Trp Met 260 265 270 Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu lie Leu 275 280 285 Pro Glu lie Gly Pro Gin Asp Gin Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr 290 295 300 His Ser Ser His Gly Pro Gin Glu Ser Arg Ala Val Ser lie Ser lie 305 310 315 320 He Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser 325 330 335 7 Gly Leu Gly <210> 5 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15 Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30 Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45 Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60 Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80 Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95 Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110 Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr 115 120 125 Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro 130 135 140 Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu 145 150 155 160 Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg 165 170 175 Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu 180 185 190 8 Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin Pro Arg Val Trp 195 200 205 Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly 210 215 220 Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro 225 230 235 240 Ala Gin Pro Ser Pro Gin He His Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu 245 250 255 Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu lie Leu Pro Glu He Gly Pro Gin 260 265 270 Asp Gin Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro 275 280 285 Gin Glu Ser Arg Ala Val Ser lie Ser He He Glu Pro Gly Glu Glu 290 295 300 Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly Leu Gly 305 310 315 <210> 6 <211 > 316 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gin Asn He Thr Ala Arg He Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 1 5 10 15 Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30 Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60 Ala Val Gly He Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn 65 70 75 80 Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin 85 90 95 9 lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala 100 105 110 Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro 115 120 125 Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn 130 135 140 Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu Thr 145 150 155 160 Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly 165 170 175 Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro 180 185 190 Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin Pro Arg Val Trp Glu 195 200 205 Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly 210 215 220 Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala 225 230 235 240 Gin Pro Ser Pro Gin lie His Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro 245 250 255 Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu lie Leu Pro Glu lie Gly Pro Gin Asp 260 265 270 Gin Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro Gin 275 280 285 Glu Ser Arg Ala Val Ser lie Ser lie lie Glu Pro Gly Glu Glu Gly 290 295 300 Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly Leu Gly 305 310 315 <210> 7 <211> 94 <212> PRT 10 <213 > Homo sapiens <400> 7 Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15 Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30 Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45 Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60 Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80 Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg 85 90 <210> 8 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 15 10 15 Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30 Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60 Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn 65 70 75 80 Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg 85 90 <210 > 9 <211> 30 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15 Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys 20 25 30 <210> 10 <211> 29 <212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 15 10 15 Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys 20 25 <210> 11 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn 15 10 15 Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu 20 25 30 Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val 35 40 45 Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr 50 55 60 Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg 65 70 75 80 Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala 85 90 95 Leu Arg 12 <210> 12 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val 15 10 15 Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr 20 25 30 Cys Glu Val Pro Ala Gin Pro Ser Pro Gin lie His Trp Met Lys Asp 35 40 45 Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu lie Leu Pro Glu 50 55 60 lie Gly Pro Gin Asp Gin Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser 65 70 75 80 Ser His Gly Pro Gin Glu Ser Arg Ala Val Ser 85 90 <210> 13 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00 > 13 Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15 Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30 Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45 Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60 Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80 13 Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95 Gin lie Pro Gly Lys 100 <210> 14 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 15 10 15 Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30 Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60 Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn 65 70 75 80 Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin 85 90 95 lie Pro Gly Lys 100 <210> 15 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15 Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30 Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45 14 Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60 Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80 Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95 Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110 Ala Gly <210> 16 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gin Asn He Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 15 10 15 Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30 Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60 Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn 65 70 75 80 Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin 85 90 95 He Pro Gly Lys Pro Glu He Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala 100 105 110 Gly <210> 17 15 <211> 204 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15 Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30 Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45 Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60 Pro Ala Val Gly He Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80 Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95 Gin He Pro Gly Lys Pro Glu He Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110 Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr 115 120 125 Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro 130 135 140 Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu 145 150 155 160 Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg 165 170 175 Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu ISO 185 190 Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin 195 200 <210> 18 <211> 203 <212> PRT 16 <213> Homo sapiens <400> 18 Gin Asn lie Thr Ala Arg He Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 15 10 15 Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30 Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60 Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn 65 70 75 80 Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin 85 90 95 He Pro Gly Lys Pro Glu He Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala 100 105 110 Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro 115 120 125 Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn 130 135 140 Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu Thr 145 150 155 160 Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly 165 170 175 Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro 180 185 190 Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro He Gin 195 200 <210> 19 <211> 229 <212> PRT <213? Homo sapiens 17 <400> 19 Ala Gin Asn He Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15 Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30 Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45 Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60 Pro Ala Val Gly He Gin Asp Glu Gly He Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80 Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95 Gin He Pro Gly Lys Pro Glu He Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110 Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr 115 120 125 Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro 130 135 140 Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu 145 150 155 160 Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg 165 170 175 Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu 180 185 190 Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro He Gin Pro Arg Val Trp 195 200 205 Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly 210 215 220 Gly Ala Val Ala Pro 225 18 <210> 20 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 15 10 15 Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30 Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60 Ala Val Gly He Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn 65 70 75 80 Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin 85 90 95 He Pro Gly Lys Pro Glu He Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala 100 105 110 Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro 115 120 125 Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn 130 135 140 Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu Thr 145 150 155 160 Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly 165 170 175 Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro 180 185 190 Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin Pro Arg Val Trp Glu 195 200 205 19 Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly 210 215 220 Ala Val Ala Pro 225 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 > 21 Val Tyr Gin lie Pro Gly Lys 1 5 <210> 22 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Thr Ala Pro lie Gin Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu 15 10 15 Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro 20 25 30 <210> 23 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Val Tyr Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu 15 10 15 Leu Thr Ala Gly 20 <210:» 24 <211> 5 <212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Thr Ala Pro lie Gin 1 5 <210:» 25 20 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120 gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240 aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300 gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctac 354 <210> 26 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120 gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240 aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300 gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360 cctgggaag 369 <210 > 27 <211> 408 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120 gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240 aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300 gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360 cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggt 408 <210> 28 21 <211> 690 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120 gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240 aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300 gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360 cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtgt tcccaataag 420 gtggggacat gtgtgtcaga ggggagctac cctgcaggga ctcttagctg gcacttggat 480 gggaagcccc tggtgcctaa tgagaaggga gtatctgtga aggaacagac caggagacac 540 cctgagacag ggctcttcac actgcagtcg gagctaatgg tgaccccagc ccggggagga 600 gatccccgtc ccaccttctc ctgtagcttc agcccaggcc ttccccgaca ccgggccttg 660 cgcacagccc ccatccagcc ccgtgtctgg 690 <210> 29 <211> 753 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120 gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240 aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300 gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360 cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtgt tcccaataag 420 gtggggacat gtgtgtcaga ggggagctac cctgcaggga ctcttagctg gcacttggat 480 gggaagcccc tggtgcctaa tgagaaggga gtatctgtga aggaacagac caggagacac 540 cctgagacag ggctcttcac actgcagtcg gagctaatgg tgaccccagc ccggggagga 600 gatccccgtc ccaccttctc ctgtagcttc agcccaggcc ttccccgaca ccgggccttg 660 cgcacagccc ccatccagcc ccgtgtctgg gagcctgtgc ctctggagga ggtccaattg 720 gtggtggagc cagaaggtgg agcagtagct cct 753 22 <210> 30 <211> 1386 <212 > DNA <213 > Artificial <220> <223> Homo sapiens <400> 30 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120 gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240 aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300 gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360 cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtgt tcccaataag 420 gtggggacat gtgtgtcaga ggggagctac cctgcaggga ctcttagctg gcacttggat 480 gggaagcccc tggtgcctaa tgagaaggga gtatctgtga aggaacagac caggagacac 540 cctgagacag ggctcttcac actgcagtcg gagctaatgg tgaccccagc ccggggagga 600 gatccccgtc ccaccttctc ctgtagcttc agcccaggcc ttccccgaca ccgggccttg 660 cgcacagccc ccatccagcc ccgtgtctgg gagcctgtgc ctctggagga ggtccaattg 720 gtggtggagc cagaaggtgg agcagtagct cctccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 780 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 840 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 900 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 960 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1020 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1080 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 1140 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1200 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1260 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1320 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1380 aaatga 1386 <210> 31 23 <211> 1041 <212> DNA <213> Artificial <220 > <223> Homo sapiens <400> 31 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120 gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240 aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300 gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360 cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtcc gtcagtcttc 420 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 480 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 540 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 600 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 660 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 720 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 780 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 840 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 900 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 960 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1020 tccctgtctc cgggtaaatg a 1041 <210> 32 <211> 461 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Homo sapiens <400> 32 Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu 15 10 15 Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu 20 25 30 24 Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg 35 40 45 Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu 50 55 60 Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro 65 70 75 80 Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie 85 90 95 Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn 100 105 110 Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp 115 120 125 Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys 130 135 140 Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp 145 150 155 160 Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin 165 170 175 Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu 180 185 190 Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys 195 200 205 Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro 210 215 220 lie Gin Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu 225 230 235 240 Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Pro Ser Val Phe Leu 245 250 255 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu 260 265 270 25 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 275 280 285 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 290 295 300 Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 305 310 315 320 Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 325 330 335 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr Ile Ser Lys 340 345 350 Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 355 360 365 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 370 375 380 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 385 390 395 400 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 405 410 415 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 420 425 430 Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 435 440 445 His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 33 <211> 439 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Homo sapiens <400? 33 Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15 26 Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30 Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45 Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60 Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80 Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95 Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110 Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr 115 120 125 Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro 130 135 140 Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu 145 150 155 160 Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg 165 170 175 Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu 180 185 190 Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin Pro Arg Val Trp 195 200 205 Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly 210 215 220 Gly Ala Val Ala Pro Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 225 230 235 240 Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 245 250 255 27 Aap Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 260 265 270 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 275 280 285 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 290 295 300 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 305 310 315 320 Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 325 330 335 Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 340 345 350 Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 355 360 365 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 370 375 380 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 385 390 395 400 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 405 410 415 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 420 425 430 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 <210> 34 <211> 438 <212 > PRT <213> Artificial <220 > <223> Homo sapiens <400> 34 Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 15 10 15 28 Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30 Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60 Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn 65 70 75 80 Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin 85 90 95 He Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala 100 105 110 Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro 115 120 125 Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn 130 135 140 Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu Thr 145 150 155 160 Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly 165 170 175 Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro 180 185 190 Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin Pro Arg Val Trp Glu 195 200 205 Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly 210 215 220 Ala Val Ala Pro Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 225 230 235 240 Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 245 250 255 29 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 260 265 270 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 275 280 285 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 290 295 300 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 305 310 315 320 Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 325 330 335 Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 340 345 350 Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 355 360 365 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 370 375 380 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 385 390 395 400 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 405 410 415 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 420 425 430 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 <210> 35 <211> 346 <212> PRT <213> Artificial <220> <223 > Homo sapiens <400> 35 Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu 15 10 15 30 Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu 20 25 30 Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg 35 40 45 Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu 50 55 60 Ser pro Gin Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro 65 70 75 80 Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie 85 90 95 Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn 100 105 110 Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp 115 120 125 Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 130 135 140 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 145 150 155 160 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 165 170 175 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 180 185 190 Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 195 200 205 His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 210 215 220 Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 225 230 235 240 Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 245 250 255 31 Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 260 265 270 Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 275 280 285 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 290 295 300 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 305 310 315 320 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 325 330 335 Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser pro Gly Lys 340 345 <210> 36 <211> 324 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Homo sapiens <400> 36 Ala Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15 Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30 Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45 Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60 Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80 Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95 Gin He Pro Gly Lys Pro Glu He Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110 32 Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 115 120 125 Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 130 135 140 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 145 150 155 160 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 165 170 175 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 180 185 190 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 195 200 205 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 210 215 220 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val 225 230 235 240 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val 245 250 255 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 260 265 270 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 275 280 285 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 290 295 300 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 305 310 315 320 Ser Pro Gly Lys <210> 37 <211> 323 <212> PRT 33 <213> Artificial <220> <223> Homo sapiens <400> 37 Gin Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 15 10 15 Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30 Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60 Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met Asn 65 70 75 80 Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gin 85 90 95 lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala 100 105 110 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 115 120 125 lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 130 135 140 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 145 150 155 160 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 165 170 175 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 180 185 190 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie 195 200 205 Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val 210 215 220 34 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser 225 230 235 240 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu 245 250 255 Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 260 265 270 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 275 280 285 Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 290 295 300 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 305 310 315 320 Pro Gly Lys <210> 38 <211> 210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 15 10 15 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 20 25 30 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 35 40 45 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 50 55 60 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 65 70 75 80 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu 85 90 95 35 Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 100 105 110 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 115 120 125 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp 130 135 140 Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 145 150 155 160 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 165 170 175 Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 180 185 190 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 195 200 205 Gly Lys 210 <210> 39 <211> 633 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 60 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 120 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 180 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 240 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 300 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 360 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 420 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 480 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 540 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 600 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 633 36 <210> 40 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 15 10 15 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala 100 105 110 Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 115 120 125 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 130 135 140 Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 145 150 155 160 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 165 170 175 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 180 185 190 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 37 <210> 41 <211> 663 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 60 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 120 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 180 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 240 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 300 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 360 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 420 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 480 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 540 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 600 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 660 tga 663 <210> 42 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 15 10 15 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 38 Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala 100 105 110 Lys <210> 43 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 15 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 44 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 lie Ser lie lie Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val 15 10 15 Gly Gly Ser Gly Leu Gly Thr Leu Ala 20 25 39 <210> 45 <211> 317 <212 > PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa=pyroglutamic acid <4 00> 45 Xaa Glu Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15 Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30 Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45 Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60 Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80 Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95 Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110 Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr 115 120 125 Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro 130 135 140 Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu 145 150 155 160 Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg 165 170 175 Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu 180 185 190 40 Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin Pro Arg Val Trp 195 200 205 Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly 210 215 220 Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro 225 230 235 240 Ala Gin Pro Ser Pro Gin lie His Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu 245 250 255 Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu lie Leu Pro Glu lie Gly Pro Gin 260 265 270 Asp Gin Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro 275 280 285 Gin Glu Ser Arg Ala Val Ser lie Ser lie lie Glu Pro Gly Glu Glu 290 295 300 Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly Leu Gly 305 310 315 <210> 46 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222 > (1)..(1) <223> Xaa=pyroglutamic acid <400> 46 Xaa Glu Asn He Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15 Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30 Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45 Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 go 41 Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80 Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg 85 90 <210 > 47 <211> 30 <212 > PRT <213 > Homo sapiens <220> <221> MISCFEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa=pyroglutamic acid <400> 47 Xaa Glu Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15 Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys 20 25 30 <210> 48 <211> 101 <212> PRT <213 > Homo sapiens <220> <221> MISCFEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa=pyroglutamic acid <400> 48 Xaa Glu Asn He Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15 Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30 Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45 Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60 Pro Ala Val Gly He Gin Asp Glu Gly He Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80 42 Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95 Gin lie Pro Gly Lys 100 <210> 49 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> ΜISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa=pyroglutamic acid <400> 49 Xaa Glu Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15 Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30 Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45 Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60 Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80 Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95 Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110 Ala Gly <210> 50 <211> 204 <212> PRT <213> Homo sapiens 43 <220> <221> MISCFEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa=pyroglutamic acid <400> 50 Xaa Glu Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15 Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30 Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45 Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60 Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80 Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95 Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu He Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110 Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr 115 120 125 Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro 130 135 140 Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu 145 150 155 160 Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg 165 170 175 Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu 180 185 190 Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin 195 200 <210> 51 <211> 229 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_PEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa=pyroglutamic acid <400> 51 Xaa Glu Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15 Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30 Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45 Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60 Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly He Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80 Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95 Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110 Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr 115 120 125 Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro 130 135 140 Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu 145 150 155 160 Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg 165 170 175 Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu 180 185 190 Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro He Gin Pro Arg Val Trp 195 200 205 45 Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly 210 215 220 Gly Ala Val Ala Pro 225 <210> 52 <211> 633 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Homo sapiens <400> 52 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 60 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 120 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 180 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 240 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 300 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 360 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 420 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 480 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 540 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 600 cagaagagcc tctccctgtc tcccgggaaa tga 633 <210> 53 <211> 663 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Homo sapiens <400> 53 ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 60 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 120 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 180 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 240 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 300 46 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 360 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 420 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 480 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 540 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 600 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tcccgggaaa 660 tga 663 <210> 54 <211> 1386 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Homo sapiens <400> 54 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120 gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240 aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300 gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360 cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtgt tcccaataag 420 gtggggacat gtgtgtcaga ggggagctac cctgcaggga ctcttagctg gcacttggat 480 gggaagcccc tggtgcctaa tgagaaggga gtatctgtga aggaacagac caggagacac 540 cctgagacag ggctcttcac actgcagtcg gagctaatgg tgaccccagc ccggggagga 600 gatccccgtc ccaccttctc ctgtagcttc agcccaggcc ttccccgaca ccgggccttg 660 cgcacagccc ccatccagcc ccgtgtctgg gagcctgtgc ctctggagga ggtccaattg 720 gtggtggagc cagaaggtgg agcagtagct cctccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 780 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 840 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 900 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 960 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1020 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1080 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 1140 47 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1200 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1260 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1320 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctcccggg 1380 aaatga 1386 <210> 55 <211> 1041 <212> DNA <213> Artificial <220 > <223> Homo sapiens <400> 55 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120 gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240 aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300 gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360 cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtcc gtcagtcttc 420 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 480 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 540 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 600 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 660 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 720 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 780 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 840 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 900 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 960 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1020 tccctgtctc ccgggaaatg a 1041 <210> 56 <211> 439 <212> PRT 48 <213> Artificial <220> <223> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222 > (1) ..(1) <223> Xaa=pyroglutamic acid <400> 56 Xaa Glu Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 1 5 10 15 Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30 Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45 Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60 Pro Ala Val Gly lie Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80 Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95 Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu lie Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110 Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr 115 120 125 Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro 130 135 140 Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gin Thr Arg Arg His Pro Glu 145 150 155 160 Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gin Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg 165 170 175 Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu 180 185 190 49 Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro lie Gin Pro Arg Val Trp 195 200 205 Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gin Leu Val Val Glu Pro Glu Gly 210 215 220 Gly Ala Val Ala Pro Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 225 230 235 240 Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 245 250 255 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 260 265 270 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 275 280 285 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 290 295 300 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 305 310 315 320 Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 325 330 335 Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 340 345 350 Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 355 360 365 lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 370 375 380 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 385 390 395 400 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 405 410 415 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 420 425 430 50 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 <210> 57 <211> 324 <212> PRT <213> Artificial <220> <223s> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa=pyroglutamic acid <4 00> 57 Xaa Glu Asn lie Thr Ala Arg lie Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys 15 10 15 Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn 20 25 30 Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gin Gly Gly Gly 35 40 45 Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu 50 55 60 Pro Ala Val Gly He Gin Asp Glu Gly lie Phe Arg Cys Gin Ala Met 65 70 75 80 Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr 85 90 95 Gin lie Pro Gly Lys Pro Glu He Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr 100 105 110 Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 115 120 125 Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 130 135 140 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 145 150 155 160 51 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 165 170 175 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 180 185 190 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 195 200 205 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 210 215 220 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val 225 230 235 240 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val 245 250 255 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 260 265 270 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 275 280 285 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 290 295 300 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 305 310 315 320 Ser Pro Gly Lys 2000476