KR20170088927A

KR20170088927A - 골수형성이상 증후군 및 철적혈모구 빈혈을 치료하기 위한 방법

Info

Publication number: KR20170088927A
Application number: KR1020177017082A
Authority: KR
Inventors: 케네쓰 엠. 아티에; 크리스토퍼 로버츠 로발디
Original assignee: 악셀레론 파마 인코포레이티드
Priority date: 2014-12-03
Filing date: 2015-12-03
Publication date: 2017-08-02
Also published as: CN107405383A; JP2017537921A; JP6737786B2; WO2016090188A1; EP3226887A4; AU2021290319A1; KR102603899B1; US10829531B2; US20190233486A1; TWI758237B; US10189882B2; CA2969413A1; AU2015358398A1; MA41119A; JP2020169217A; US20160289286A1; AU2015358398B2; TW202220689A; EP3226887A1; HK1247115A1

Abstract

일정한 양상에서, 본 발명은 설치류 및 영장류를 비롯한 척추동물에서, 그리고 특히 인간에서 적혈구 및/또는 헤모글로빈 수준을 증가시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 철적혈모구 빈혈 및 골수형성이상 증후군, 또는 철적혈모구 빈혈 및 골수형성이상 증후군과 연관된 하나 또는 그 이상의 합병증을 치료하거나 예방하는데 이용될 수 있다.

Description

골수형성이상 증후군 및 철적혈모구 빈혈을 치료하기 위한 방법{METHODS FOR TREATING MYELODYSPLASTIC SYNDROMES AND SIDEROBLASTIC ANEMIAS}

관련된 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2014년 12월 3일자 제출된 미국 가출원 일련 번호 62/086,977; 2014년 12월 5일자 제출된 미국 가출원 일련 번호 62/088,087; 그리고 2015년 4월 30일자 제출된 미국 가출원 일련 번호 62/155,395에 우선권을 주장한다. 전술한 출원 각각의 개시는 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.

발명의 배경

본 발명은 적혈구, 호중구, 그리고 혈소판을 비롯한 혈액 세포 성분의 조절장애된 생산의 치료에 관계한다. 조혈은 출생후 수명 동안 주로 골수, 비장, 또는 림프절 내에 위치된 자기-재생하는 조혈 줄기 세포로부터 혈액의 세포 성분의 형성이다. 혈액 세포는 림프 계통, 골수 계통, 또는 적혈구 계통에 속하는 것으로 분류될 수 있다. 림프구형성으로서 알려져 있는 과정에 의해, 통상적인 림프구양 선조체 세포는 T-세포, B-세포, 자연 살해 세포, 그리고 수지상 세포를 발생시킨다. 골수형성으로 명명된 과정에 의해, 통상적인 골수성 선조체 세포는 대식세포, 과립구 (호염기구, 호중구, 호산구, 그리고 비만 세포), 그리고 혈소판 (혈소판)을 발생시킨다. 최종적으로, 적혈구생성으로서 알려져 있는 과정에 의해, 적혈구 선조체 세포는 적혈구 (RBC, 적혈구)를 발생시킨다.

출생후 적혈구생성은 일차적으로 골수에서 및 비장의 적색 속질에서 발생한다. 다양한 신호전달 경로의 협조된 작용이 세포 증식, 분화, 생존, 그리고 사망의 균형을 제어한다. 정상적인 조건 하에, 적혈구는 체내에서 일정한 적혈구 질량을 유지하는 비율에서 생산되고, 그리고 생산은 증가된 또는 감소된 산소 분압 또는 조직 요구를 비롯한 다양한 자극에 대한 응답으로 증가 또는 감소할 수 있다. 적혈구생성의 과정은 계통-수임된 전구체 세포의 형성으로 시작되고, 그리고 일련의 상이한 전구체 세포 유형을 통해 진행된다. 적혈구생성의 최종 시기는 망상적혈구가 혈류 내로 방출되고, 그리고 성숙 적혈구의 형태를 취하긴 하지만 그들의 미토콘드리아 및 리보솜을 상실할 때 발생한다. 혈액 내에 상승된 수준의 망상적혈구, 또는 상승된 망상적혈구:적혈구 비율은 증가된 적혈구 생산율을 지시한다. 성숙 적혈구 (RBC)는 척추동물의 순환계에서 산소 수송을 책임진다. 적혈구는 높은 농도의 헤모글로빈을 내포하는데, 상기 단백질은 산소의 상대적으로 높은 분압 (pO₂)에서 폐에서 산소에 결합하고 상대적으로 낮은 pO₂를 갖는 신체 구역에 산소를 전달한다.

에리트로포이에틴 (EPO)은 척추동물에서 출생후 적혈구생성의 유의미한 양성 조절인자로서 폭넓게 인식된다. EPO는 감소된 조직 산소 분압 (저산소증) 및 낮은 적혈구 수준 또는 낮은 헤모글로빈 수준에 대한 보상 적혈구형성 반응을 조절한다. 인간에서, 상승된 EPO 수준은 골수 및 비장에서 적혈구 선조체의 산출을 자극함으로써 적혈구 형성을 증진한다. 생쥐에서, EPO는 일차적으로 비장에서 적혈구생성을 증강한다.

EPO의 효과는 사이토킨 수용체 상과에 속하는 세포 표면 수용체에 의해 매개된다. 인간 EPO 수용체 유전자는 483개 아미노산 막경유 단백질을 인코딩한다; 하지만, 활성 EPO 수용체는 심지어 리간드의 부재에서도 다중결합 복합체로서 존재하는 것으로 생각된다 (가령, U.S. 특허 번호 6,319,499를 참조한다). 포유류 세포에서 발현된 클로닝된 전장 EPO 수용체는 적혈구 선조체 세포 상에서 선천적 수용체의 것과 유사한 친화성으로 EPO에 결합한다. 수용체에 대한 EPO의 결합은 수용체 활성화, 그리고 미성숙 적모구의 증가된 증식, 미성숙 적모구의 증가된 분화 및 적혈구 선조체 세포에서 감소된 아폽토시스를 비롯한 생물학적 효과를 유발하는 입체형태적 변화를 야기한다 [가령, Liboi et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:11351-11355; Koury et al. (1990) Science 248:378-381을 참조한다].

다양한 형태의 재조합 EPO가 다양한 임상적 세팅에서, 특히 빈혈의 치료에서 적혈구 수준을 증가시키기 위해 의사에 의해 이용된다. 빈혈은 혈액 내에 정상보다 낮은 수준의 헤모글로빈 또는 적혈구에 의해 특징화되는 광범위하게-규정된 질환이다. 일부 경우에, 빈혈은 적혈구의 생산 또는 생존에서 일차적 장애 (가령, 골수형성이상 증후군)에 의해 유발된다. 더욱 통상적으로, 빈혈은 다른 시스템의 질환에 이차적이다 [가령, Weatherall & Provan (2000) Lancet 355, 1169-1175를 참조한다]. 빈혈은 적혈구의 감소된 비율의 생산 또는 증가된 비율의 파괴로부터 또는 출혈로 인한 적혈구의 상실에 의해 발생할 수 있다. 빈혈은 예로서, 급성 또는 만성 신부전 또는 말기 신장병, 화학요법 치료, 골수형성이상 증후군, 류마티스성 관절염, 그리고 골수 이식을 비롯한 다양한 장애로부터 발생할 수 있다.

EPO로 치료는 전형적으로, 건강한 인간에서 수주의 기간에 걸쳐 약 1-3 g/dL 정도 헤모글로빈의 증가를 유발한다. 빈혈 개체에 투여될 때, 이러한 치료 섭생은 종종, 헤모글로빈 및 적혈구 수준에서 실제적인 증가를 제공하고 삶의 질에서 향상 및 연장된 생존을 야기한다. 하지만, EPO는 균일하게 효과적이지 않고, 그리고 많은 개체가 심지어 고용량에도 난치성이다 [가령, Horl et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15, 43-50을 참조한다]. 가령, 50% 초과의 암 환자가 EPO에 부적당한 반응을 나타내고, 그리고 말기 신장병에서 대략 10%가 EPO에 저반응성이다 [가령, Glaspy et al. (1997) J Clin Oncol 15, 1218-1234; Demetri et al. (1998) J Clin Oncol 16, 3412-3425를 참조한다]. 비록 EPO에 대한 내성의 분자 기전이 여전히 불분명하긴 하지만, 염증, 철분 및 비타민 결핍증, 부적당한 투석, 알루미늄 독성, 그리고 부갑상선 기능항진증을 비롯한 여러 인자는 불량한 치료적 반응을 예측할 수 있다. 이에 더하여, 최근 증거는 더욱 높은 용량의 EPO가 일부 환자 개체군에서 심혈관 이환상태, 종양 성장, 그리고 사망의 증가된 위험과 연관될 수 있다는 것을 암시한다 [가령, Krapf et al. (2009) Clin J Am Soc Nephrol 4:470-480; Glaspy (2009) Annu Rev Med 60:181-192를 참조한다]. 이런 이유로, EPO-기초된 치료 화합물 (가령, 에리트로포이에틴-자극 작용제, ESAs)는 환자가 적혈구 수혈을 피하도록 하는 가장 낮은 용량에서 투여되도록 권장되었다 [가령, Jelkmann et al. (2008) Crit Rev Oncol. Hematol 67:39-61을 참조한다].

유전된 및 획득된 형태 둘 모두에서 발생하는 철적혈모구 빈혈은 골수 내에 "환상 철적혈모구"의 존재에 의해 특징화된다. 이들 특유한 적혈구 전구체 (적모구)는 핵주위 철침착 과립의 존재에 의해 확인될 수 있는데, 이들은 프러시안 블루로 조직학 염색에 의해 드러나고 미토콘드리아에서 병리학적 철 침착물을 지시한다 [가령, Mufti et al. (2008) Haematologica 93:1712-1717; Bottomley et al. (2014) Hematol Oncol Clin N Am 28:653-670을 참조한다]. 획득된 철적혈모구 빈혈은 골수형성이상 증후군 (MDS)의 맥락에서 가장 빈번하게 발생하는데, 상기 질환은 미국 연간 30,000 내지 40,000명 환자에게 영향을 주는 것으로 추정되는 조혈 줄기-세포 장애의 이질성 군이다 [Bejar et al. (2014) Blood 124:2793-2803]. 이들 장애는 무효한 조혈, 비정상적인 "형성장애" 세포 형태, 그리고 급성 골수성 백혈병으로의 클론 진화에 대한 잠재력에 의해 특징화된다. 아래에 논의된 바와 같이, MDS의 유전자 기초에서 최근 진전은 이의 진단 및 치료를 크게 향상시키는 잠재력을 갖는다.

MDS, 철적혈모구 빈혈 및 이들 장애의 합병증에 대한 효과적인 요법에 대한 높은 요구가 충족되지 않고 있다. 내인성 EPO 수준은 통상적으로, MDS를 앓는 환자의 부분집합에서 상승되고, 따라서 EPO가 이들 환자에서 축소된 유용성을 갖는다는 것을 암시한다. MDS를 앓는 환자 중에서 10%보다 적은 환자가 EPO에 우호적으로 반응하는 것으로 추정되었지만 [Estey (2003) Curr Opin Hematol 10, 60-67], 더욱 최근의 메타분석은 연구에 따르면, EPO 반응률이 30% 내지 60%의 범위에 있다는 것을 발견하였다 [Moyo et al (2008) Ann Hematol 87:527-536]. 다른 MDS 환자와 비교하여, 환상 철적혈모구를 갖는 환자는 급성 골수성 백혈병이 발생할 위험이 훨씬 낮은 경향이 있고, 그리고 이런 이유로, 전신 철분 부담에 기여하지 않고, 그 대신에 이런 환자에서 빈번하게 존재하는 철분 과부하를 감소시키는데 도움을 주는 항-빈혈 치료적 작용제로부터 연장된 기간 동안 이익을 얻는 상태로 유지될 것이다 [가령, Temraz et al., 2014, Crit Rev Oncol Hematol 91:64-73을 참조한다].

따라서, 본 발명의 목적은 MDS 및 철적혈모구 빈혈을 앓는 환자를 본원에서 개시된 ActRII 길항제로 치료하는 방법을 제공하고 그리고 특히, 치료의 결과로서 적혈구, 호중구 및 다른 혈액 세포에서 치료적으로 유익한 증가를 아마도 보여주는 MDS 환자의 선별을 보도하는 것이다.

발명의 요약

부분적으로, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제로 MDS 및 철적혈모구 빈혈을 치료하는, 특히 골수에서 철적혈모구의 존재에 의해 특징화되는 MDS 환자를 비롯하여 MDS의 하나 또는 그 이상의 합병증 또는 아형을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.

부분적으로, 본 발명은 SF3B1에서 생식계열 또는 체성 돌연변이와 연관되는 장애 또는 장애의 합병증, 예를 들면, 골수형성이상 증후군 (MDS), 만성 림프성 백혈병 (CLL) 및 급성 골수성 백혈병 (AML)뿐만 아니라 유방암, 췌장암, 위암, 전립선암 및 포도막 흑색종을 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제로 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공한다. 일정한 양상에서 장애는 SF3B1 돌연변이, 특히 골수형성이상 증후군, CLL 및 AML에 대한 시험에서 양성인 골수 세포를 갖는 개체에 있을 수 있다. 임의선택적으로 SF3B1 유전자에서 돌연변이는 엑손, 인트론 또는 5' 및/또는 3' 비번역 영역 내에 있다. 가령, 일부 구체예에서, SF3B1 유전자에서 돌연변이는 SF31B의 엑손 14, 15 및/또는 16 내에 있다. 임의선택적으로 SF3B1에서 돌연변이는 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 아미노산 서열에서 변화를 유발하거나 또는 아미노산 서열에서 변화를 유발하지 않는다. 임의선택적으로 SF3B1 유전자에서 돌연변이는 다음의 변화에서 선택되는, 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 아미노산에서 변화를 유발한다: K182E, E491G, R590K, E592K, R625C, R625G, N626D, N626S, H662Y, T663A, K666M, K666Q, K666R, Q670E, G676D, V701I, I704N, I704V, G740R, A744P, D781G, A1188V, N619K, N626H, N626Y, R630S, I704T, G740E, K741N, G742D, D894G, Q903R, R1041H, I1241T, G347V, E622D, Y623C, R625H, R625L, H662D, H662Q, T663I, K666E, K666N, K666T, K700E, E783K, 그리고 V701F.

일정한 양상에서, 본 발명은 인간 개체에서 철적혈모구 빈혈을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공하고, 이들 방법은 서열 번호: 1의 아미노산 29-109와 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대하여 위치 79에서 산성 아미노산 [자연발생 아미노산 (가령, D 또는 E) 또는 인공 아미노산]을 포함하고, 여기서 상기 개체는 0.125 내지 1.75 mg/kg (가령, 0.75 내지 1.75 mg/kg)의 폴리펩티드를 개체에 투여하는 것을 포함하는 투약 일정에 있다. 다른 양상에서, 본 발명은 인간 개체에서 철적혈모구 빈혈을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공하고, 이들 방법은 서열 번호: 1의 아미노산 25-125와 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대하여 위치 79에서 산성 아미노산 [자연발생 아미노산 (가령, D 또는 E) 또는 인공 아미노산]을 포함하고, 여기서 상기 개체는 0.125 내지 1.75 mg/kg (가령, 0.75 내지 1.75 mg/kg)의 폴리펩티드를 개체에 투여하는 것을 포함하는 투약 일정에 있다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 인간 개체에서 철적혈모구 빈혈을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공하고, 이들 방법은 서열 번호: 44의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기 서열로 구성되는 폴리펩티드를 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대하여 위치 79에서 산성 아미노산 [자연발생 아미노산 (가령, D 또는 E) 또는 인공 아미노산]을 포함하고, 여기서 상기 개체는 0.125 내지 1.75 mg/kg (가령, 0.75 내지 1.75 mg/kg)의 폴리펩티드를 개체에 투여하는 것을 포함하는 투약 일정에 있다. 일정한 양상에서, 본 발명은 인간 개체에서 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공하고, 이들 방법은 서열 번호: 1의 아미노산 29-109와 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대하여 위치 79에서 산성 아미노산 [자연발생 아미노산 (가령, D 또는 E) 또는 인공 아미노산]을 포함하고, 여기서 상기 개체는 0.125 내지 1.75 mg/kg (가령, 0.75 내지 1.75 mg/kg)의 폴리펩티드를 개체에 투여하는 것을 포함하는 투약 일정에 있다. 다른 양상에서, 본 발명은 인간 개체에서 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공하고, 이들 방법은 서열 번호: 1의 아미노산 25-125와 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대하여 위치 79에서 산성 아미노산 [자연발생 아미노산 (가령, D 또는 E) 또는 인공 아미노산]을 포함하고, 여기서 상기 개체는 0.125 내지 1.75 mg/kg (가령, 0.75 내지 1.75 mg/kg)의 폴리펩티드를 개체에 투여하는 것을 포함하는 투약 일정에 있다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 인간 개체에서 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공하고, 이들 방법은 서열 번호: 44의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기 서열로 구성되는 폴리펩티드를 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대하여 위치 79에서 산성 아미노산 [자연발생 아미노산 (가령, D 또는 E) 또는 인공 아미노산]을 포함하고, 여기서 상기 개체는 0.125 내지 1.75 mg/kg (가령, 0.75 내지 1.75 mg/kg)의 폴리펩티드를 개체에 투여하는 것을 포함하는 투약 일정에 있다. 일정한 바람직한 구체예에서, 본원에서 설명된 방법에 따라서 이용되는 폴리펩티드는 이합체 (가령, 공유 또는 비공유 상호작용에 의해 연관된 서열 번호: 44의 아미노산 서열에 상응하는 2개의 폴리펩티드를 포함하는 동종이합체)이다. 임의선택적으로 폴리펩티드는 TGFβ 상과의 하나 또는 그 이상의 리간드에 결합할 수 있다. 가령, 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드뿐만 아니라 이들의 변이체, 예를 들면, GDF 트랩(trap))는 GDF11에 결합할 수 있다. 다른 구체예에서, 본원에서 설명된 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드뿐만 아니라 이들의 변이체, 예를 들면, GDF 트랩)는 GDF8에 결합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본원에서 설명된 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드뿐만 아니라 이들의 변이체, 예를 들면, GDF 트랩)는 GDF11 및 GDF8에 결합할 수 있다. 임의선택적으로 폴리펩티드는 다음에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다: 당화된 아미노산, 페길화된 아미노산, 파르네실화된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 비오틴화된 아미노산, 그리고 지질 모이어티에 접합된 아미노산. 일정한 바람직한 구체예에서 폴리펩티드는 당화되고 포유류 당화 패턴을 갖는다. 임의선택적으로 폴리펩티드는 중국 햄스터 난소 세포주로부터 획득가능한 당화 패턴을 갖는다. 임의선택적으로 이들 방법은 폴리펩티드를 개체에 피하 투여하는 것을 포함한다. 임의선택적으로 투약 일정은 폴리펩티드를 환자에 주 2회, 주 1회, 3 주마다 1회, 4 주마다 1회, 5 주마다 1회, 6 주마다 1회, 7 주마다 1회, 8 주마다 1회, 9 주마다 1회, 10 주마다 1회, 12 주마다 1회, 14 주마다 1회, 16 주마다 1회, 18 주마다 1회, 20 주마다 1회, 24 주마다 1회, 26 주마다 1회, 28 주마다 1회, 30 주마다 1회, 32 주마다 1회, 34 주마다 1회, 또는 36 주마다 1회 투여하는 것을 더욱 포함한다. 일정한 바람직한 구체예에서 투약 일정은 폴리펩티드를 환자에 3 주마다 1회 투여하는 것을 더욱 포함한다. 임의선택적으로 개체는 바람직하지 않게 높은 수준의 내인성 EPO를 갖는다. 임의선택적으로 개체는 하나 또는 그 이상의 EPO 수용체 효현제로 이전에 치료되었다. 임의선택적으로 개체는 EPO 수용체 효현제에 부적당한 반응을 나타낸다. 임의선택적으로 개체는 EPO 수용체 효현제에 더 이상 반응하지 않는다. 임의선택적으로 EPO 수용체 효현제는 EPO이다. 임의선택적으로 치료는 적혈구 수준을 증가시킨다. 임의선택적으로 치료는 헤모글로빈 수준을 증가시킨다. 임의선택적으로 치료는 ≥ 2 주 동안 ≥ 1.5 g/dL의 헤모글로빈 증가를 유발한다. 임의선택적으로 치료는 ≥ 8 주 동안 ≥ 1.5 g/dL의 헤모글로빈 증가를 유발한다. 임의선택적으로 개체는 치료의 시작에 앞서 하나 또는 그 이상의 혈액 세포 수혈이 투여되었다. 임의선택적으로 개체는 낮은 수혈 부담 개체이다. 임의선택적으로 개체는 높은 수혈 부담 개체이다. 임의선택적으로 치료는 혈액 세포 수혈 부담을 감소시킨다. 임의선택적으로 치료는 치료의 시작에 앞서 동등한 시간에 비하여, 최소한 4 주 동안 혈액 세포 수혈을 ≥ 50% 감소시킨다. 임의선택적으로 치료는 치료의 시작에 앞서 동등한 시간에 비하여, 최소한 8 주 동안 혈액 세포 수혈을 ≥ 50% 감소시킨다. 임의선택적으로 환자는 골수형성이상 증후군을 앓는다. 임의선택적으로 환자는 낮음 또는 중간의 국제 예후 점수 시스템 (IPSS) 또는 IPSS-R 점수를 갖는다. 임의선택적으로 철적혈모구 빈혈 개체는 자신의 골수 내에 골수 적혈구 전구체의 백분율로서 최소한 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 환상 모구를 갖는다. 임의선택적으로 치료는 호중구 수준을 증가시킨다. 임의선택적으로 개체는 SF3B1에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이에 대한 시험에서 양성인 골수 세포를 갖는다. 임의선택적으로 개체는 DNMT3A에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이에 대한 시험에서 양성인 골수 세포를 갖는다. 임의선택적으로 개체는 TET2에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이에 대한 시험에서 양성인 골수 세포를 갖는다. 임의선택적으로 치료는 철분 과부하를 감소시킨다. 일부 구체예에서, 치료는 조직 철분 과부하 (가령, 신장, 간 및/또는 비장에서 철분 과부하)를 감소시킨다. 일부 구체예에서, 치료는 혈청 철분 과부하를 감소시킨다.

부분적으로, 본 발명은 DNMT3A에서 생식계열 또는 체성 돌연변이와 연관되는 장애 또는 장애의 합병증, 예를 들면, 골수형성이상 증후군 (MDS), 만성 림프성 백혈병 (CLL), 그리고 급성 골수성 백혈병 (AML)을 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제로 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공한다. 일정한 양상에서 장애는 DNMT3A 돌연변이, 특히 골수형성이상 증후군, CLL 및 AML에 대한 시험에서 양성인 골수 세포를 갖는 개체에 있을 수 있다. 임의선택적으로 DNMT3A 유전자에서 돌연변이는 엑손, 인트론 및/또는 5' 또는 3' 비번역 영역 내에 있다. 가령, 일부 구체예에서, DNMT3A 유전자에서 돌연변이는 DNMT3A의 엑손 10, 18 및/또는 22 내에 있다. 임의선택적으로 DNMT3A에서 돌연변이는 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 아미노산 서열에서 변화를 유발하거나 또는 아미노산 서열에서 변화를 유발하지 않는다. 임의선택적으로 DNMT3A 유전자에서 돌연변이는 다음의 변화에서 선택되는, 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 아미노산에서 변화를 유발한다: R882C, R882H, P904L, 그리고 P905P. 임의선택적으로 DNMT3A 유전자에서 돌연변이는 미성숙 종결 코돈을 도입한다. 가령, 일부 구체예에서, 미성숙 종결 코돈을 도입하는 DNMT3A 유전자에서 돌연변이는 다음의 위치에서 선택된다: Y436X 및 W893X.

부분적으로, 본 발명은 TET2에서 생식계열 또는 체성 돌연변이와 연관되는 장애 또는 장애의 합병증, 예를 들면, 골수형성이상 증후군 (MDS), 만성 림프성 백혈병 (CLL), 그리고 급성 골수성 백혈병 (AML)을 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제로 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공한다. 일정한 양상에서 장애는 TET2 돌연변이, 특히 골수형성이상 증후군, CLL 및 AML에 대한 시험에서 양성인 골수 세포를 갖는 개체에 있을 수 있다. 임의선택적으로 TET2 유전자에서 돌연변이는 엑손, 인트론 및/또는 5' 또는 3' 비번역 영역 내에 있다. 가령, 일부 구체예에서, TET2 유전자에서 돌연변이는 TET2의 엑손 1, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8 및/또는 엑손 9 내에 있다. 임의선택적으로 TET2에서 돌연변이는 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 아미노산 서열에서 변화를 유발하거나 또는 아미노산 서열에서 변화를 유발하지 않는다. 임의선택적으로 TET2 유전자에서 돌연변이는 다음의 변화에서 선택되는, 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 아미노산에서 변화를 유발한다: E47Q, Q1274R, W1291R, G1370R, N1387S, 그리고 Y1724H. 임의선택적으로 TET2 유전자에서 돌연변이는 미성숙 종결 코돈을 도입한다. 가령, 일부 구체예에서, 미성숙 종결 코돈을 도입하는 TET2 유전자에서 돌연변이는 다음의 위치에서 선택된다: R550X, Q1009X, Y1337X, R1404X, R1516X, 그리고 Q1652X.

일정한 양상에서, 본 발명은 개체에서 골수 장애를 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공하고, 이들 방법은 효과량의 ActRII 길항제를 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 개체는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 유전자에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이에 대한 시험에서 양성인 골수 세포를 갖는다: SF3B1, DNMT3A, 그리고 TET2. 일부 구체예에서, 개체는 하나 또는 그 이상의 SF3B1 돌연변이에 대한 시험에서 양성이다. 임의선택적으로 SF3B1 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 SF3B1 엑손 내에 있다. 임의선택적으로 SF3B1 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 SF3B1 인트론 내에 있다. 임의선택적으로 SF3B1 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 SF3B1 5' 및/또는 3' 영역 내에 있다. 임의선택적으로 SF3B1 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 돌연변이된 SF3B1 유전자에 의해 인코딩된 단백질 내에서 아미노산의 결실, 부가 및/또는 치환을 유발한다. 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 SF3B1 돌연변이는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 유발한다: K182E, E491G, R590K, E592K, R625C, R625G, N626D, N626S, H662Y, T663A, K666M, K666Q, K666R, Q670E, G676D, V701I, I704N, I704V, G740R, A744P, D781G, A1188V, N619K, N626H, N626Y, R630S, I704T, G740E, K741N, G742D, D894G, Q903R, R1041H, I1241T, G347V, E622D, Y623C, R625H, R625L, H662D, H662Q, T663I, K666E, K666N, K666T, K700E, V701F, 그리고 E783K. 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 SF3B1 돌연변이는 엑손 14, 엑손 15 및 엑손 16으로 구성된 군에서 선택되는 SF3B1 엑손 내에 있다. 일부 구체예에서, 개체는 하나 또는 그 이상의 DNMT3A 돌연변이에 대한 시험에서 양성이다. 임의선택적으로 DNMT3A 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 DNMT3A 엑손 내에 있다. 임의선택적으로 DNMT3A 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 DNMT3A 인트론 내에 있다. 임의선택적으로 DNMT3A 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 DNMT3A 5' 및/또는 3' 영역 내에 있다. 임의선택적으로 DNMT3A 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 돌연변이된 DNMT3A 유전자에 의해 인코딩된 단백질 내에서 아미노산의 결실, 부가 및/또는 치환을 유발한다. 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 DNMT3A 돌연변이는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 유발한다: R882C, R882H, P904L, 그리고 P905P. 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 DNMT3A 돌연변이는 엑손 10, 엑손 18 및 엑손 22로 구성된 군에서 선택되는 DNMT3A 엑손 내에 있다. 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 DNMT3A 돌연변이는 미성숙 종결 코돈을 도입한다. 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 DNMT3A 돌연변이는 Y436X 및 W893X로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 개체는 하나 또는 그 이상의 TET2 돌연변이에 대한 시험에서 양성이다. 임의선택적으로 TET2 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 TET2 엑손 내에 있다. 임의선택적으로 TET2 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 TET2 인트론 내에 있다. 임의선택적으로 TET2 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 TET2 5' 및/또는 3' 영역 내에 있다. 임의선택적으로 TET2 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 돌연변이된 TET2 유전자에 의해 인코딩된 단백질 내에서 아미노산의 결실, 부가 및/또는 치환을 유발한다. 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 TET2 돌연변이는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 유발한다: E47Q, Q1274R, W1291R, G1370R, G1370E, N1387S, 그리고 Y1724H. 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 TET2 돌연변이는 엑손 1, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 그리고 엑손 9로 구성된 군에서 선택되는 TET2 엑손 내에 있다. 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 TET2 돌연변이는 미성숙 종결 코돈을 도입한다. 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 TET2 돌연변이는 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: R550X, Q1009X, Y1337X, R1404X, R1516X, 그리고 Q1652X. 임의선택적으로 개체는 빈혈을 앓는다. 임의선택적으로 개체는 바람직하지 않게 높은 수준의 내인성 EPO를 갖는다. 임의선택적으로 개체는 하나 또는 그 이상의 EPO 수용체 효현제로 이전에 치료되었다. 임의선택적으로 개체는 EPO 수용체 효현제에 부적당한 반응을 나타낸다. 임의선택적으로 개체는 EPO 수용체 효현제에 더 이상 반응하지 않는다. 임의선택적으로 EPO 수용체 효현제는 EPO이다. 임의선택적으로 치료는 백혈병으로의 전환을 지연시킨다. 임의선택적으로 치료는 급성 골수성 백혈병으로의 전환을 지연시킨다. 임의선택적으로 개체는 전백혈병 환자이다. 임의선택적으로 치료는 개체에서 적혈구 수준 및/또는 헤모글로빈 수준을 증가시킨다. 임의선택적으로 개체는 ActRII 길항제 치료의 시작에 앞서 하나 또는 그 이상의 혈액 세포 수혈이 투여되었다. 임의선택적으로 치료는 혈액 세포 수혈 부담을 감소시킨다. 임의선택적으로 치료는 ActRII 길항제 치료의 시작에 앞서 동등한 시간에 비하여, 4 내지 8 주 동안 혈액 세포 수혈을 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%보다 크게 감소시킨다. 임의선택적으로 치료는 ActRII 길항제 치료의 시작에 앞서 동등한 시간에 비하여, 4 내지 8 주 동안 혈액 세포 수혈을 약 50%보다 크게 감소시킨다. 임의선택적으로 치료는 철분 과부하를 감소시킨다. 임의선택적으로 치료는 간 및/또는 비장 내에 철분 함량을 감소시킨다.

일정한 양상에서, 본 발명은 골수형성이상 증후군 (MDS) 및/또는 MDS의 하나 또는 그 이상의 합병증을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공하고, 이들 방법은 효과량의 ActRII 길항제를 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 개체는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 유전자에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이에 대한 시험에서 양성인 골수 세포를 갖는다: SF3B1, DNMT3A, 그리고 TET2. 일부 구체예에서, 개체는 하나 또는 그 이상의 SF3B1 돌연변이에 대한 시험에서 양성이다. 임의선택적으로 이들 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 SF3B1 엑손 내에 있다. 임의선택적으로 SF3B1 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 SF3B1 인트론 내에 있다. 임의선택적으로 SF3B1 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 SF3B1 5' 및/또는 3' 영역 내에 있다. 임의선택적으로 SF3B1 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 돌연변이된 SF3B1 유전자에 의해 인코딩된 단백질 내에서 아미노산의 결실, 부가 및/또는 치환을 유발한다. 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 SF3B1 돌연변이는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 유발한다: K182E, E491G, R590K, E592K, R625C, R625G, N626D, N626S, H662Y, T663A, K666M, K666Q, K666R, Q670E, G676D, V701I, I704N, I704V, G740R, A744P, D781G, A1188V, N619K, N626H, N626Y, R630S, I704T, G740E, K741N, G742D, D894G, Q903R, R1041H, I1241T, G347V, E622D, Y623C, R625H, R625L, H662D, H662Q, T663I, K666E, K666N, K666T, K700E, V701F, 그리고 E783K. 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 SF3B1 돌연변이는 엑손 14, 엑손 15 및 엑손 16으로 구성된 군에서 선택되는 SF3B1 엑손 내에 있다. 일부 구체예에서, 개체는 하나 또는 그 이상의 DNMT3A 돌연변이에 대한 시험에서 양성이다. 임의선택적으로 DNMT3A 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 DNMT3A 엑손 내에 있다. 임의선택적으로 DNMT3A 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 DNMT3A 인트론 내에 있다. 임의선택적으로 DNMT3A 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 DNMT3A 5' 및/또는 3' 영역 내에 있다. 임의선택적으로 DNMT3A 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 돌연변이된 DNMT3A 유전자에 의해 인코딩된 단백질 내에서 아미노산의 결실, 부가 및/또는 치환을 유발한다. 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 DNMT3A 돌연변이는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 유발한다: R882C, R882H, P904L, 그리고 P905P. 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 DNMT3A 돌연변이는 엑손 10, 엑손 18 및 엑손 22로 구성된 군에서 선택되는 DNMT3A 엑손 내에 있다. 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 DNMT3A 돌연변이는 미성숙 종결 코돈을 도입한다. 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 DNMT3A 돌연변이는 Y436X 및 W893X로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 개체는 하나 또는 그 이상의 TET2 돌연변이에 대한 시험에서 양성이다. 임의선택적으로 TET2 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 TET2 엑손 내에 있다. 임의선택적으로 TET2 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 TET2 인트론 내에 있다. 임의선택적으로 TET2 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 TET2 5' 및/또는 3' 영역 내에 있다. 임의선택적으로 TET2 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 돌연변이된 TET2 유전자에 의해 인코딩된 단백질 내에서 아미노산의 결실, 부가 및/또는 치환을 유발한다. 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 TET2 돌연변이는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 유발한다: E47Q, Q1274R, W1291R, G1370R, G1370E, N1387S, 그리고 Y1724H. 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 TET2 돌연변이는 엑손 1, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 그리고 엑손 9로 구성된 군에서 선택되는 TET2 엑손 내에 있다. 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 TET2 돌연변이는 미성숙 종결 코돈을 도입한다. 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 TET2 돌연변이는 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: R550X, Q1009X, Y1337X, R1404X, R1516X, 그리고 Q1652X. 임의선택적으로 개체는 빈혈을 앓는다. 임의선택적으로 개체는 바람직하지 않게 높은 수준의 내인성 EPO를 갖는다. 임의선택적으로 개체는 하나 또는 그 이상의 EPO 수용체 효현제로 이전에 치료되었다. 임의선택적으로 개체는 EPO 수용체 효현제에 부적당한 반응을 나타낸다. 임의선택적으로 개체는 EPO 수용체 효현제에 더 이상 반응하지 않는다. 임의선택적으로 EPO 수용체 효현제는 EPO이다. 임의선택적으로 치료는 백혈병으로의 전환을 지연시킨다. 임의선택적으로 치료는 급성 골수성 백혈병으로의 전환을 지연시킨다. 임의선택적으로 치료는 개체에서 적혈구 수준 및/또는 헤모글로빈 수준을 증가시킨다. 임의선택적으로 개체는 ActRII 길항제 치료의 시작에 앞서 하나 또는 그 이상의 혈액 세포 수혈이 투여되었다. 임의선택적으로 치료는 혈액 세포 수혈 부담을 감소시킨다. 임의선택적으로 치료는 ActRII 길항제 치료의 시작에 앞서 동등한 시간에 비하여, 4 내지 8 주 동안 혈액 세포 수혈을 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%보다 크게 감소시킨다. 임의선택적으로 치료는 ActRII 길항제 치료의 시작에 앞서 동등한 시간에 비하여, 4 내지 8 주 동안 혈액 세포 수혈을 약 50%보다 크게 감소시킨다. 임의선택적으로 치료는 철분 과부하를 감소시킨다. 임의선택적으로 치료는 간 및/또는 비장 내에 철분 함량을 감소시킨다. 임의선택적으로 개체는 다음에서 선택되는 MDS의 아형을 앓는다: 환상 철적혈모구 불응성 빈혈 (RARS)을 동반한 MDS; 환상 철적혈모구 불응성 빈혈 및 혈소판증가증 (RARS-T)을 동반한 MDS; 단계열 형성장애 불응성 혈구감소증 (RCUD)을 동반한 MDS; 다계열 형성장애 불응성 혈구감소증 및 환상 철적혈모구 (RCMD-RS)를 동반한 MDS; SF3B1, SRSF2, DNMT3A, 그리고 TET2 중에서 하나 또는 그 이상에서 체성 돌연변이를 동반한 MDS; ASXL1 또는 ZRSR2에서 체성 돌연변이가 없는 MDS; 철분 과부하를 동반한 MDS; 그리고 호중구감소증을 동반한 MDS. 임의선택적으로 개체는 다음에서 선택되는 국제 예후 점수 시스템 (IPSS) 점수를 갖는다: 낮음, 중간 1, 또는 중간 2. 임의선택적으로 개체는 철적혈모구를 갖는다. 임의선택적으로 개체는 자신의 골수 내에 골수 적혈구 전구체의 백분율로서 최소한 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 철적혈모구를 갖는다.

본 발명의 ActRII 길항제는 예로서, 신호 전달 경로의 ActRII 수용체 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체) 매개된 활성화 (가령, 세포내 매개체, 예를 들면, SMAD 1, 2, 3, 5 및/또는 8을 통한 신호 전달의 활성화)를 저해할 수 있는 작용제; 하나 또는 그 이상의 ActRII 리간드 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, GDF11, GDF8, BMP6, BMP7, Nodal 등)가 예로서, ActRII 수용체에 결합하고 및/또는 이를 활성화하는 것을 저해할 수 있는 작용제; ActRII 리간드 및/또는 ActRII 수용체의 발현 (가령, 전사, 번역, 세포 분비, 또는 이들의 조합)을 저해하는 작용제; 그리고 ActRII 신호전달 경로의 하나 또는 그 이상의 세포내 매개체 (가령, SMADs 1, 2, 3, 5 및/또는 8)를 저해할 수 있는 작용제를 포함한다.

특히, 본 발명은 예로서, 빈혈, 호중구감소증, 비장비대, 수혈 요구, 급성 골수성 백혈병의 발달, 철분 과부하, 그리고 철분 과부하의 합병증을 비롯한 MDS 및 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증, 그 중에서도 특히 울혈성 심부전, 심장 부정맥, 심근 경색, 다른 형태의 심장 질환, 진성 당뇨병, 호흡 곤란, 간 질환, 그리고 철 킬레이트화 요법의 부정적인 효과를 치료하거나 예방하고, 그리고 다른 실례로서, 치료가 필요한 개체에서 적혈구 수준을 증가시키고, 치료가 필요한 개체에서 빈혈을 치료하거나 예방하고 (가령, 수혈 부담의 감소 포함), 치료가 필요한 개체에서 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하고 및/또는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증 (가령, 빈혈, 수혈 요구, 호중구감소증, 철분 과부하, 급성 심근 경색, 간부전, 간비대, 비장비대, 급성 골수성 림프종으로의 진행)을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 개체에서 SF3B1, DNMT3A 및/또는 TET2 돌연변이와 연관된 장애를 치료하거나 예방하기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제의 조합을 이용하기 위한 방법을 제공한다.

특히, 본 발명은 골수 내에 상승된 숫자의 적모구 (세포과다성)을 갖는 MDS 환자; 골수 내에 적혈구 전구체의 백분율로서 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%보다 많은 철적혈모구를 갖는 MDS 환자; 환상 철적혈모구 불응성 빈혈 (RARS)을 동반한 MDS 환자; 환상 철적혈모구 불응성 빈혈 및 혈소판증가증 (RARS-T)을 동반한 MDS 환자; 단계열 형성장애 불응성 혈구감소증 (RCUD)을 동반한 MDS 환자; 다계열 형성장애 불응성 혈구감소증 및 환상 철적혈모구 (RCMD-RS)를 동반한 MDS 환자; SF3B1, SRSF2, DNMT3A, TET2, 또는 SETBP1에서 체성 돌연변이를 갖는 MDS 환자; ASXL1 또는 ZRSR2에서 체성 돌연변이가 없는 MDS 환자; 철분 과부하를 동반한 MDS 환자; 그리고 호중구감소증을 동반한 MDS 환자를 비롯하여, MDS의 아형에서 합병증을 치료하거나 예방하기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제의 조합을 이용하기 위한 방법을 제공한다.

또한 특히, 본 발명은 환상 철적혈모구 불응성 빈혈 (RARS); 환상 철적혈모구 불응성 빈혈 및 혈소판증가증 (RARS-T); 다계열 형성장애 불응성 혈구감소증 및 환상 철적혈모구 (RCMD-RS); 알코올중독과 연관된 철적혈모구 빈혈; 약물 유발된 철적혈모구 빈혈; 구리 결핍 (아연 독성)으로부터 발생하는 철적혈모구 빈혈; 저체온증으로부터 발생하는 철적혈모구 빈혈; X 연관된 철적혈모구 빈혈 (XLSA); SLC25A38 결함; 글루타레독신 5 결함; 적혈구형성 프로토포르피린증; 운동실조를 동반한 X 연관된 철적혈모구 빈혈 (XLSA/A); B-세포 면역 결핍, 열병 및 발달 지체를 동반한 철적혈모구 빈혈 (SIFD); 피어슨 골수-췌장 증후군; 근병증, 젖산 산증, 그리고 철적혈모구 빈혈 (MLASA); 티아민-반응성 거대적혈구모세포성 빈혈 (TRMA); 그리고 원인불명의 증후군적/비증후군적 철적혈모구 빈혈을 비롯하여, 철적혈모구 빈혈의 합병증을 치료하거나 예방하기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제의 조합을 이용하기 위한 방법을 제공한다.

일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 방법에 따라서 이용되는 바람직한 ActRII 길항제는 GDF11 및/또는 GDF8에 결합하고 및/또는 이를 저해하는 작용제 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 GDF11- 및/또는 GDF8-매개된 활성화를 저해하는 작용제)이다. 이런 작용제는 GDF-ActRII 길항제로서 총칭된다. 임의선택적으로, 이런 GDF-ActRII 길항제는 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, GDF11, GDF8, BMP6, BMP7, 그리고 Nodal 중에서 하나 또는 그 이상을 더욱 저해할 수 있다. 이런 이유로, 일부 구체예에서, 본 발명은 치료가 필요한 개체에서 적혈구 수준 및/또는 헤모글로빈 수준을 증가시키고, 치료가 필요한 개체에서 빈혈을 치료하거나 예방하고, 치료가 필요한 개체에서 철적혈모구 빈혈 또는 MDS를 치료하고, 또는 치료가 필요한 개체에서 철적혈모구 빈혈 또는 MDS의 하나 또는 그 이상의 합병증을 치료하고, 그리고 다른 실례로서, 치료가 필요한 개체에서 적혈구 수준을 증가시키고, 치료가 필요한 개체에서 빈혈을 치료하거나 예방하고 (가령, 수혈 부담의 감소 포함), 치료가 필요한 개체에서 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하고 및/또는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증 (가령, 빈혈, 수혈 요구, 호중구감소증, 철분 과부하, 급성 심근 경색, 간부전, 간비대, 비장비대, 급성 골수성 림프종으로의 진행)을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 개체에서 SF3B1, DNMT3A 및/또는 TET2 돌연변이와 연관된 장애를 치료하거나 예방하기 위해, 예로서 가용성 ActRIIA 폴리펩티드, 가용성 ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 폴리펩티드, 항-ActRIIA 항체, 항-ActRIIB 항체, 항-ActRII 리간드 항체 (가령, 항-GDF11 항체, 항-GDF8 항체, 항-액티빈 A 항체, 항-액티빈 B 항체, 항-액티빈 AB 항체, 항-액티빈 C 항체, 항-액티빈 E 항체, 항-BMP6 항체, 항-BMP7 항체, 그리고 항-Nodal 항체), ActRIIA의 소형 분자 저해제, ActRIIB의 소형 분자 저해제, 하나 또는 그 이상의 ActRII 리간드 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, GDF11, GDF8, BMP6, BMP7, Nodal 등)의 소형 분자 저해제, ActRIIA의 저해제 뉴클레오티드 (뉴클레오티드-기초된 저해제), ActRIIB의 저해제 뉴클레오티드, 하나 또는 그 이상의 ActRII 리간드 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, GDF11, GDF8, BMP6, BMP7, Nodal 등)의 저해제 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 비롯하여, 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제를 이용하는 방법을 제공한다. 일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 방법에 따라서 이용되는 ActRII 길항제는 액티빈 A에 실제적으로 결합하지 않고 및/또는 액티빈 A 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 액티빈 A-매개된 활성화)을 저해하지 않는다.

부분적으로, 본 발명은 GDF11에 결합하고 GDF11 활성 (가령, GDF11-매개된 ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달)을 저해하는 변이체, 세포외 (가용성) ActRIIB 도메인을 포함하는 ActRII 길항제가 생체내에서 적혈구 수준을 증가시키고, 다양한 질환/장애로부터 발생하는 빈혈을 치료하고, 그리고 철적혈모구 빈혈 또는 MDS을 치료하는데 이용될 수 있다는 것을 증명한다. 이런 이유로, 일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 방법 (가령, 치료가 필요한 개체에서 적혈구 수준을 증가시키고, 치료가 필요한 개체에서 빈혈을 치료하거나 예방하고 (가령, 수혈 부담의 감소 포함), 치료가 필요한 개체에서 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하고 및/또는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증 (가령, 빈혈, 수혈 요구, 호중구감소증, 철분 과부하, 급성 심근 경색, 간부전, 간비대, 비장비대, 급성 골수성 림프종으로의 진행)을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 개체에서 SF3B1 돌연변이와 연관된 장애를 치료하거나 예방하고, 기타 등등의 방법)에 따라서 이용되는 바람직한 ActRII 길항제는 GDF11에 결합하고 및/또는 GDF11 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 GDF11-매개된 활성화)을 저해하는 가용성 ActRII 폴리펩티드 (가령, 가용성 ActRIIA 또는 ActRIIB 폴리펩티드)이다. 가용성 ActRIIA 및 가용성 ActRIIB ActRII 길항제가 GDF11 길항작용 이외의 기전을 통해 적혈구 형성 및/또는 형태에 영향을 줄 수 있긴 하지만, 본 발명은 그럼에도 불구하고, 본원에서 개시된 방법에 대하여 바람직한 치료적 작용제가 GDF11 길항작용 또는 ActRII 길항작용 또는 둘 모두의 기초에서 선별될 수 있다는 것을 증명한다. 임의선택적으로, 이런 가용성 ActRII 폴리펩티드 길항제는 GDF8에 더욱 결합하고 및/또는 이를 더욱 저해할 수 있다 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 GDF8-매개된 활성화를 저해할 수 있다). 일부 구체예에서, GDF11 및/또는 GDF8에 결합하고 및/또는 이를 저해하는 본 발명의 가용성 ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드는 다음에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 추가 ActRII 리간드에 더욱 결합하고 및/또는 이를 더욱 저해할 수 있다: 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, 그리고 Nodal.

일정한 양상에서, 본 발명은 아미노- 및 카르복시 말단 절두 및/또는 다른 서열 변경 (하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가, 결실, 또는 이들의 조합)을 갖는 ActRII 폴리펩티드를 비롯하여, 변이체 ActRII 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드)인 GDF 트랩을 제공한다. 임의선택적으로, 본 발명의 GDF 트랩은 ActRII 수용체의 하나 또는 그 이상의 리간드, 예를 들면, GDF8 (미오스타틴으로 또한 불림), GDF11, Nodal, BMP6, 그리고 BMP7 (OP-1으로 또한 불림)을 우선적으로 길항작용하도록 설계될 수 있다. 본원에서 개시된 바와 같이, GDF 트랩의 실례는 액티빈, 특히 액티빈 A에 대한 크게 축소된 친화성을 갖는, ActRIIB로부터 유래된 한 세트의 변이체를 포함한다. 이들 변이체는 다른 조직에 대한 효과를 감소시키면서 적혈구에 대한 바람직한 효과를 전시한다. 이런 변이체의 실례는 서열 번호:1의 위치 79에 상응하는 위치에서 산성 아미노산 [가령, 아스파르트산 (D) 또는 글루타민산 (E)]을 갖는 것들을 포함한다. 일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 방법 (가령, 치료가 필요한 개체에서 적혈구 수준을 증가시키고, 치료가 필요한 개체에서 빈혈을 치료하거나 예방하고 (가령, 수혈 부담의 감소 포함), 치료가 필요한 개체에서 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하고 및/또는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증 (가령, 빈혈, 수혈 요구, 호중구감소증, 철분 과부하, 급성 심근 경색, 간부전, 간비대, 비장비대, 급성 골수성 림프종으로의 진행)을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 개체에서 SF3B1, DNMT3A 및/또는 TET2 돌연변이와 연관된 장애를 치료하거나 예방하고, 기타 등등의 방법)에 따라서 이용되는 바람직한 GDF 트랩은 GDF11에 결합하고 및/또는 GDF11을 저해한다. 임의선택적으로, 이런 GDF 트랩은 GDF8에 더욱 결합하고 및/또는 이를 더욱 저해할 수 있다. 일부 구체예에서, GDF11 및/또는 GDF8에 결합하고 및/또는 이를 저해하는 GDF 트랩은 하나 또는 그 이상의 추가 ActRII 리간드 (가령, 액티빈 B, 액티빈 E, BMP6, BMP7 및 Nodal)에 더욱 결합하고 및/또는 이를 더욱 저해할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법에 따라서 이용되는 GDF 트랩은 액티빈 A에 실제적으로 결합하지 않고 및/또는 액티빈 A 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 액티빈 A-매개된 활성화)을 저해하지 않는다. 일정한 구체예에서, GDF 트랩 폴리펩티드는 서열 번호: 36, 37, 41, 44, 45, 50 또는 51의 아미노산 서열, 그리고 전술한 것들 중에서 한 가지와 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 구성되거나, 또는 이것으로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, GDF 트랩 폴리펩티드는 서열 번호: 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 22, 26, 28, 29, 31, 또는 49의 아미노산 서열, 그리고 전술한 것들 중에서 한 가지와 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 구성되거나, 또는 이것으로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, GDF 트랩 폴리펩티드는 서열 번호: 2, 3, 4, 5, 6, 29, 31, 또는 49의 아미노산 서열, 그리고 전술한 것들 중에서 한 가지와 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 서열 번호: 1, 4, 또는 50 내에 79에 상응하는 위치는 산성 아미노산이다. GDF 트랩은 자연 ActRII 폴리펩티드의 기능적 단편, 예를 들면, 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11 또는 49에서 선택되는 서열, 또는 C 말단에서 1, 2, 3, 4, 5 또는 10 내지 15개 아미노산을 결여하고 N 말단에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산을 결여하는 서열 번호: 2, 5, 10, 11, 또는 49의 서열의 최소한 10, 20, 또는 30개 아미노산을 포함하는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 폴리펩티드는 서열 번호: 2 또는 5에 비하여 N 말단에서 2 내지 5개 아미노산 및 C 말단에서 3개 이내 아미노산의 절두를 포함할 것이다. 이런 제조에서 이용을 위한 바람직한 GDF 트랩은 서열 번호: 36의 아미노산 서열로 구성되거나, 또는 이것으로 본질적으로 구성된다.

임의선택적으로, 변경된 ActRII 리간드-결합 도메인을 포함하는 GDF 트랩은 야생형 리간드-결합 도메인에 대한 비율에 비하여 최소한 2-, 5-, 10-, 20, 50-, 100-, 또는 심지어 1000-배 큰, 액티빈 A 결합에 대한 K_d 대 GDF11 및/또는 GDF8 결합에 대한 K_d의 비율을 갖는다. 임의선택적으로, 변경된 리간드-결합 도메인을 포함하는 GDF 트랩은 야생형 ActRII 리간드-결합 도메인에 비하여 최소한 2-, 5-, 10-, 20-, 25-, 50-, 100-, 또는 심지어 1000-배 큰, 액티빈 A 저해에 대한 IC₅₀ 대 GDF11 및/또는 GDF8 저해에 대한 IC₅₀의 비율을 갖는다. 임의선택적으로, 변경된 리간드-결합 도메인을 포함하는 GDF 트랩은 액티빈 A 저해에 대한 IC₅₀보다 최소한 2, 5, 10, 20, 50, 또는 심지어 100 배 적은 IC₅₀으로 GDF11 및/또는 GDF8을 저해한다. 이들 GDF 트랩은 면역글로불린 Fc 도메인 (야생형 또는 돌연변이체)을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일정한 경우에, 개별 가용성 GDF 트랩은 GDF8 및/또는 GDF11의 길항제 (저해제)이다.

일정한 양상에서, 본 발명은 변경된 리간드-결합 (가령, GDF11-결합) 도메인을 포함하는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드인 GDF 트랩을 제공한다. 변경된 리간드-결합 도메인을 갖는 GDF 트랩은 예로서, 인간 ActRIIB의 아미노산 잔기, 예를 들면, E37, E39, R40, K55, R56, Y60, A64, K74, W78, L79, D80, F82 및 F101에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다 (넘버링은 서열 번호: 1에 상대적이다). 임의선택적으로, 변경된 리간드-결합 도메인은 ActRIIB 수용체의 야생형 리간드-결합 도메인에 비하여, 리간드, 예를 들면, GDF8/GDF11에 대한 증가된 선택성을 가질 수 있다. 예시로서, 다음 돌연변이는 본원에서, 액티빈에 비하여 GDF11 (및 이런 이유로, 아마도, GDF8)에 대한 변경된 리간드-결합 도메인의 선택성을 증가시키는 것으로 증명된다: K74Y, K74F, K74I, L79D, L79E, 그리고 D80I. 다음의 돌연변이는 역효과를 갖는데, GDF11에 비하여 액티빈 결합의 비율을 증가시킨다: D54A, K55A, L79A 및 F82A. 전반적인 (GDF11 및 액티빈) 결합 활성은 "꼬리" 영역 또는 아마도, 비구조화된 링커 영역의 포함에 의해, 그리고 또한, K74A 돌연변이의 이용에 의해 증가될 수 있다. 리간드 결합 친화성에서 전반적인 감소를 유발한 다른 돌연변이는 다음을 포함한다: R40A, E37A, R56A, W78A, D80K, D80R, D80A, D80G, D80F, D80M 및 D80N. 돌연변이는 원하는 효과를 달성하기 위해 합동될 수 있다. 가령, GDF11:액티빈 결합의 비율에 영향을 주는 많은 돌연변이는 리간드 결합에 대한 전반적인 부정적인 효과를 갖고, 그리고 이런 이유로, 이들은 리간드 선택성을 갖는 향상된 결합 단백질을 생산하기 위해, 리간드 결합을 일반적으로 증가시키는 돌연변이와 합동될 수 있다. 한 예시적인 구체예에서, GDF 트랩은 임의선택적으로, 추가 아미노산 치환, 부가 또는 결실과 합동으로 L79D 또는 L79E 돌연변이를 포함하는 ActRIIB 폴리펩티드이다.

일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 방법에 따라서 이용되는 ActRII 길항제는 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드이다. 일반적으로 이런 ActRIIB 폴리펩티드 및 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 서열 번호:1, 4, 또는 49의 ActRIIB 서열로부터 유래된 부분/도메인, 특히 서열 번호:1, 4, 또는 49의 ActRIIB 서열로부터 유래된 세포외, 리간드-결합 부분/도메인을 포함하는 가용성 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, ActRIIB로부터 유래된 부분은 서열 번호:1 또는 4의 아미노산 21-29 (가령, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29) 중에서 한 가지에서 시작하고 [임의선택적으로, 서열 번호:1 또는 4의 22-25 (가령, 22, 23, 24, 또는 25)에서 시작하고], 그리고 서열 번호: 1 또는 4의 아미노산 109-134 (가령, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134) 중에서 한 가지에서 끝나는 서열에 상응한다. 일부 구체예에서, ActRIIB로부터 유래된 부분은 서열 번호:1 또는 4의 아미노산 20-29 (가령, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29) 중에서 한 가지에서 시작하고 [임의선택적으로, 서열 번호:1 또는 4의 22-25 (가령, 22, 23, 24, 또는 25)에서 시작하고], 그리고 서열 번호: 1 또는 4의 아미노산 109-133 (가령, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 또는 133) 중에서 한 가지에서 끝나는 서열에 상응한다. 일부 구체예에서, ActRIIB로부터 유래된 부분은 서열 번호:1 또는 4의 아미노산 20-24 (가령, 20, 21, 22, 23, 또는 24) 중에서 한 가지에서 시작하고 [임의선택적으로, 서열 번호:1 또는 4의 22-25 (가령, 22, 23, 24, 또는 25)에서 시작하고], 그리고 서열 번호: 1 또는 4의 아미노산 109-133 (가령, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 또는 133) 중에서 한 가지에서 끝나는 서열에 상응한다. 일부 구체예에서, ActRIIB로부터 유래된 부분은 서열 번호:1 또는 4의 아미노산 21-24 (가령, 21, 22, 23, 또는 24) 중에서 한 가지에서 시작하고, 그리고 서열 번호: 1 또는 4의 아미노산 109-134 (가령, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134) 중에서 한 가지에서 끝나는 서열에 상응한다. 일부 구체예에서, ActRIIB로부터 유래된 부분은 서열 번호:1 또는 4의 아미노산 20-24 (가령, 20, 21, 22, 23, 또는 24) 중에서 한 가지에서 시작하고, 그리고 서열 번호: 1 또는 4의 아미노산 118-133 (가령, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 또는 133) 중에서 한 가지에서 끝나는 서열에 상응한다. 일부 구체예에서, ActRIIB로부터 유래된 부분은 서열 번호:1 또는 4의 아미노산 21-24 (가령, 21, 22, 23, 또는 24) 중에서 한 가지에서 시작하고, 그리고 서열 번호: 1 또는 4의 아미노산 118-134 (가령, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134) 중에서 한 가지에서 끝나는 서열에 상응한다. 일부 구체예에서, ActRIIB로부터 유래된 부분은 서열 번호:1 또는 4의 아미노산 20-24 (가령, 20, 21, 22, 23, 또는 24) 중에서 한 가지에서 시작하고, 그리고 서열 번호: 1 또는 4의 아미노산 128-133 (가령, 128, 129, 130, 131, 132, 또는 133) 중에서 한 가지에서 끝나는 서열에 상응한다. 일부 구체예에서, ActRIIB로부터 유래된 부분은 서열 번호:1 또는 39의 아미노산 20-24 (가령, 20, 21, 22, 23, 또는 24) 중에서 한 가지에서 시작하고, 그리고 서열 번호: 1 또는 39의 아미노산 128-133 (가령, 128, 129, 130, 131, 132, 또는 133) 중에서 한 가지에서 끝나는 서열에 상응한다. 일부 구체예에서, ActRIIB로부터 유래된 부분은 서열 번호:1 또는 4의 아미노산 21-29 (가령, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29) 중에서 한 가지에서 시작하고, 그리고 서열 번호: 1 또는 4의 아미노산 118-134 (가령, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134) 중에서 한 가지에서 끝나는 서열에 상응한다. 일부 구체예에서, ActRIIB로부터 유래된 부분은 서열 번호:1 또는 4의 아미노산 20-29 (가령, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29) 중에서 한 가지에서 시작하고, 그리고 서열 번호: 1 또는 4의 아미노산 118-133 (가령, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 또는 133) 중에서 한 가지에서 끝나는 서열에 상응한다. 일부 구체예에서, ActRIIB로부터 유래된 부분은 서열 번호:1 또는 4의 아미노산 21-29 (가령, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29) 중에서 한 가지에서 시작하고, 그리고 서열 번호: 1 또는 4의 아미노산 128-134 (가령, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134) 중에서 한 가지에서 끝나는 서열에 상응한다. 일부 구체예에서, ActRIIB로부터 유래된 부분은 서열 번호:1 또는 4의 아미노산 20-29 (가령, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29) 중에서 한 가지에서 시작하고, 그리고 서열 번호: 1 또는 4의 아미노산 128-133 (가령, 128, 129, 130, 131, 132, 또는 133) 중에서 한 가지에서 끝나는 서열에 상응한다. 놀랍게도, 서열 번호: 1 또는 4의 22-25 (가령, 22, 23, 24, 또는 25)에서 시작하는 ActRIIB 및 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 구조체는 인간 ActRIIB의 완전한 세포외 도메인을 갖는 단백질보다 큰 활성 수준을 갖는다. 바람직한 구체예에서, ActRIIB 폴리펩티드 및 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 서열 번호: 1 또는 4의 아미노산 위치 25에서 시작하고, 그리고 서열 번호: 1 또는 4의 아미노산 위치 131에서 끝나는 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성된다. 임의의 전술한 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 동종이합체로서 생산될 수 있다. 임의의 전술한 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 IgG 중쇄로부터 불변 영역, 예를 들면, Fc 도메인을 포함하는 이종성 부분을 더욱 포함할 수 있다. 임의의 전술한 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 임의선택적으로, 서열 번호: 1에 비하여 하나 또는 그 이상의 추가 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입과 합동으로, 서열 번호: 1의 위치 79에 상응하는 위치에서 산성 아미노산을 포함할 수 있다. 임의의 전술한 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드뿐만 아니라 이들의 동종이합체 및/또는 융합 단백질은 세포-기초된 검정에서 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 또는 액티빈 AB)에 결합하고 및/또는 액티빈에 의한 신호전달을 저해할 수 있다. 임의의 전술한 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드뿐만 아니라 이들의 동종이합체 및/또는 융합 단백질은 세포-기초된 검정에서 GDF11 및/또는 GDF8에 결합하고 및/또는 GDF11 및/또는 GDF8에 의한 신호전달을 저해할 수 있다. 임의선택적으로, 임의의 전술한 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드뿐만 아니라 이들의 동종이합체 및/또는 융합 단백질은 세포-기초된 검정에서 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, 그리고 Nodal 중에서 하나 또는 그 이상에 결합하고 및/또는 이의 신호전달을 저해할 수 있다.

다음과 같은 다른 ActRIIB 폴리펩티드 및 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드가 예기된다. 서열 번호: 1 또는 4의 아미노산 29-109의 서열과 최소한 80% (가령, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 ActRIIB 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드, 여기서 서열 번호: 1의 64에 상응하는 위치는 R 또는 K이고, 그리고 여기서 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 세포-기초된 검정에서 액티빈, GDF8 및/또는 GDF11에 의한 신호전달을 저해한다. 상기와 같은 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드, 여기서 서열 번호: 1 또는 4의 서열에 대하여 최소한 하나의 변경은 리간드-결합 주머니의 외측에 배치된다. 상기와 같은 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드, 여기서 서열 번호: 1 또는 4의 서열에 대하여 최소한 하나의 변경은 리간드-결합 주머니 내에 배치된 보존성 변경이다. 상기와 같은 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드, 여기서 서열 번호: 1 또는 4의 서열에 대하여 최소한 하나의 변경은 K74, R40, Q53, K55, F82, 그리고 L79로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 위치에서 변경이다.

다음과 같은 다른 ActRIIB 폴리펩티드 및 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드가 예기된다. 서열 번호: 1 또는 4의 아미노산 29-109의 서열과 최소한 80% (가령, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드, 여기서 상기 단백질은 ActRIIB의 내인성 N-X-S/T 서열 이외의 위치에서 및 리간드 결합 주머니의 외측 위치에서 최소한 하나의 N-X-S/T 서열을 포함한다. 상기와 같은 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 서열 번호: 1 또는 4의 위치 24에 상응하는 위치에서 N 및 서열 번호: 1 또는 4의 위치 26에 상응하는 위치에서 S 또는 T를 포함하고, 그리고 여기서 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 세포-기초된 검정에서 액티빈, GDF8 및/또는 GDF11에 의한 신호전달을 저해한다. 상기와 같은 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 서열 번호: 1 또는 4의 위치 64에 상응하는 위치에서 R 또는 K를 포함한다. 상기와 같은 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 서열 번호: 1 또는 4의 위치 79에 상응하는 위치에서 D 또는 E를 포함하고, 그리고 여기서 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 세포-기초된 검정에서 액티빈, GDF8 및/또는 GDF11에 의한 신호전달을 저해한다. 상기와 같은 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드, 여기서 서열 번호: 1 또는 4의 서열에 대하여 최소한 하나의 변경은 리간드-결합 주머니 내에 배치된 보존성 변경이다. 상기와 같은 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드, 여기서 서열 번호: 1 또는 4의 서열에 대하여 최소한 하나의 변경은 K74, R40, Q53, K55, F82, 그리고 L79로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 위치에서 변경이다. 상기와 같은 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 이종성 부분을 더욱 포함하는 융합 단백질이다. 임의의 전술한 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드, 또는 이들의 융합 단백질은 동종이합체로서 생산될 수 있다. 임의의 전술한 ActRIIB 융합 단백질 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 융합 단백질은 IgG 중쇄로부터 불변 영역, 예를 들면, Fc 도메인을 포함하는 이종성 부분을 가질 수 있다.

일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 방법에 따른 이용을 위한 바람직한 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 2, 3, 5, 6, 29, 31, 또는 49의 아미노산 서열, 그리고 전술한 것들 중에서 한 가지와 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 구성되거나, 또는 이것으로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열을 포함한다. ActRIIB 폴리펩티드는 자연 ActRIIB 폴리펩티드의 기능적 단편, 예를 들면, 서열 번호: 2, 3, 5, 6, 29, 31, 또는 49에서 선택되는 서열, 또는 C 말단에서 1, 2, 3, 4, 5 또는 10 내지 15개 아미노산을 결여하고 N 말단에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산을 결여하는 서열 번호: 2 또는 5의 서열의 최소한 10, 20, 또는 30개 아미노산을 포함하는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 폴리펩티드는 서열 번호: 2 또는 5에 비하여 N 말단에서 2 내지 5개 아미노산 및 C 말단에서 3개 이내 아미노산의 절두를 포함할 것이다. 본원에서 설명된 방법에 따른 이용을 위한 바람직한 GDF 트랩은 서열 번호: 29의 아미노산 서열로 구성되거나, 또는 이것으로 본질적으로 구성된다.

활성 (가령, 리간드 결합) ActRIIA 폴리펩티드에 대한 일반식은 서열 번호:9의 아미노산 30에서 시작하고 아미노산 110에서 끝나는 폴리펩티드를 포함하는 것이다. 따라서, 본 발명의 ActRIIA 폴리펩티드 및 ActRIIA-기초된 GDF 트랩은 서열 번호:9의 아미노산 30-110과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 구성되거나, 또는 이것으로 본질적으로 구성될 수 있다. 임의선택적으로, 본 발명의 ActRIIA 폴리펩티드 및 ActRIIA-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 임의선택적으로, 각각 서열 번호:9의 1-5 (가령, 1, 2, 3, 4, 또는 5) 또는 3-5 (가령, 3, 4, 또는 5) 범위에서 변하는 위치에서 시작하고 110-116 (가령, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 또는 116) 또는 110-115 (가령, 110, 111, 112, 113, 114, 또는 115) 범위에서 변하는 위치에서 끝나고, 그리고 서열 번호:9에 대하여 리간드 결합 주머니 내에 1, 2, 5, 10 또는 15개 이내 보존성 아미노산 변화 및 리간드-결합 주머니 내에 위치 40, 53, 55, 74, 79 및/또는 82에서 0개, 1개 또는 그 이상의 비보존성 변경을 포함하는 서열 번호:9의 아미노산 12-82와 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산인 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 구성되거나, 또는 이것으로 본질적으로 구성된다. 임의의 전술한 ActRIIA 폴리펩티드 또는 ActRIIA-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 동종이합체로서 생산될 수 있다. 임의의 전술한 ActRIIA 폴리펩티드 또는 ActRIIA-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 IgG 중쇄로부터 불변 영역, 예를 들면, Fc 도메인을 포함하는 이종성 부분을 더욱 포함할 수 있다. 임의의 전술한 ActRIIA 폴리펩티드 또는 ActRIIA-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드뿐만 아니라 이들의 동종이합체 및/또는 융합 단백질은 세포-기초된 검정에서 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 또는 액티빈 AB)에 결합하고 및/또는 액티빈에 의한 신호전달을 저해할 수 있다. 임의의 전술한 ActRIIA 폴리펩티드 또는 ActRIIA-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드뿐만 아니라 이들의 동종이합체 및/또는 융합 단백질은 세포-기초된 검정에서 GDF11 및/또는 GDF8에 결합하고 및/또는 GDF11 및/또는 GDF8에 의한 신호전달을 저해할 수 있다. 임의선택적으로, 임의의 전술한 ActRIIA 폴리펩티드 또는 ActRIIA-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드뿐만 아니라 이들의 동종이합체 및/또는 융합 단백질은 세포-기초된 검정에서 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, GDF7, 그리고 Nodal 중에서 하나 또는 그 이상에 결합하고 및/또는 이의 신호전달을 저해할 수 있다.

일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 방법에 따른 이용을 위한 바람직한 ActRIIA 폴리펩티드 및 ActRIIA-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 서열 번호: 9, 10, 22, 26, 또는 28의 아미노산 서열, 그리고 전술한 것들 중에서 한 가지와 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 구성되거나, 또는 이것으로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열을 포함한다. ActRIIA 폴리펩티드 또는 ActRIIA-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 자연 ActRIIA 폴리펩티드의 기능적 단편, 예를 들면, 서열 번호: 9, 10, 22, 26, 또는 28에서 선택되는 서열, 또는 C 말단에서 1, 2, 3, 4, 5 또는 10 내지 15개 아미노산을 결여하고 N 말단에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산을 결여하는 서열 번호: 10의 서열의 최소한 10, 20, 또는 30개 아미노산을 포함하는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 폴리펩티드는 서열 번호: 10에 비하여 N 말단에서 2 내지 5개 아미노산 및 C 말단에서 3개 이내 아미노산의 절두를 포함할 것이다. 본원에서 설명된 방법에서 이용을 위한 바람직한 ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 26 또는 28의 아미노산 서열로 구성되거나, 또는 이것으로 본질적으로 구성된다.

본 발명의 ActRII 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 또는 ActRIIB 폴리펩티드) 또는 GDF 트랩 폴리펩티드는 자연발생 ActRII 폴리펩티드에 비하여 ActRII 폴리펩티드의 아미노산 서열 (가령, 리간드-결합 도메인)에서 하나 또는 그 이상의 변경 (가령, 아미노산 부가, 결실, 치환, 또는 이들의 조합)을 포함할 수 있다. 아미노산 서열에서 변경은 예로서, 포유류, 곤충, 또는 다른 진핵 세포에서 생산될 때 폴리펩티드의 당화를 변경하거나 또는 자연발생 ActRII 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 단백질분해 개열을 변경한다.

임의선택적으로, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 또는 ActRIIB 폴리펩티드) 및 GDF 트랩 폴리펩티드는 다음에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 변형된 아미노산 잔기를 포함한다: 당화된 아미노산, 페길화된 아미노산, 파르네실화된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 비오틴화된 아미노산, 지질 모이어티에 접합된 아미노산, 그리고 유기 유도체화 작용제에 접합된 아미노산.

일부 구체예에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 또는 ActRIIB 폴리펩티드) 또는 GDF 트랩 폴리펩티드는 한 도메인으로서, ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드 (가령, 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 서열 변이를 갖는, ActRII 수용체의 리간드-결합 도메인) 및 바람직한 성질, 예를 들면, 향상된 약물동력학, 더욱 쉬운 정제, 특정 조직에 표적화 등을 제공하는 하나 또는 그 이상의 추가 이종성 도메인을 갖는 융합 단백질일 수 있다. 가령, 융합 단백질의 도메인은 생체내 안정성, 생체내 반감기, 흡수/투여, 조직 국부화 또는 분포, 단백질 복합체의 형성, 융합 단백질의 다합체화 및/또는 정제 중에서 하나 또는 그 이상을 증강할 수 있다. ActRII 폴리펩티드 및 GDF 트랩 융합 단백질은 면역글로불린 Fc 도메인 (야생형 또는 돌연변이체) 또는 혈청 알부민을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, ActRII 폴리펩티드 및 GDF 트랩 융합 단백질은 Fc 도메인 및 ActRII 또는 GDF 트랩 도메인 사이에 배치된 상대적으로 비구조화된 링커를 포함한다. 이러한 비구조화된 링커는 ActRII 또는 GDF 트랩의 세포외 도메인의 C 말단 단부에서 거의 15개 아미노산 비구조화된 영역 ("꼬리")에 상응할 수 있거나, 또는 이것은 이차 구조가 상대적으로 없는 3 및 5, 15, 20, 30, 50개 또는 그 이상 아미노산 사이의 인공 서열일 수 있다. 링커는 글리신 및 프롤린 잔기가 풍부할 수 있고, 그리고 예로서, 트레오닌/세린 및 글리신의 반복 서열 [가령, TG₄ (서열 번호:52), TG₃ (서열 번호:53), 또는 SG₄ (서열 번호:54) 단일항 또는 반복] 또는 일련의 3개 글리신을 내포할 수 있다. 융합 단백질은 정제 하위서열, 예를 들면, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 서열, 그리고 GST 융합을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, ActRII 융합 단백질 또는 GDF 트랩 융합은 리더 서열을 포함한다. 리더 서열은 선천적 ActRII 리더 서열 (가령, 선천적 ActRIIA 또는 ActRIIB 리더 서열) 또는 이종성 리더 서열일 수 있다. 일정한 구체예에서, 리더 서열은 조직 플라스미노겐 활성제 (TPA) 리더 서열이다. 일부 구체예에서, ActRII 융합 단백질 또는 GDF 트랩 융합 단백질은 화학식 A-B-C에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. B 부분은 본원에서 설명된 바와 같은 N- 및 C 말단 절두된 ActRII 또는 GDF 트랩 폴리펩티드이다. A 및 C 부분은 독립적으로, 0개, 1개 또는 1개 이상의 아미노산일 수 있고, 그리고 A 및 C 부분 둘 모두 B에 이종성이다. A 및/또는 C 부분은 링커 서열을 거쳐 B 부분에 부착될 수 있다.

임의선택적으로, 본원에서 개시된 방법에 따라 이용되는 ActRII 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드) 또는 GDF 트랩 폴리펩티드뿐만 아니라 이들의 변이체 및 융합 단백질은 10 마이크로몰보다 적은, 1 마이크로몰보다 적은, 100 나노몰보다 적은, 10 나노몰보다 적은, 또는 1 나노몰보다 적은 Kd로 하나 또는 그 이상의 ActRIIB 리간드 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, GDF11, GDF8, BMP6, BMP7 및/또는 Nodal)에 결합한다. 임의선택적으로, 이런 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드는 ActRII 리간드에 의해 촉발된 ActRII 신호전달, 예를 들면, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 세포내 신호 전달 사건 (가령, SMAD 2/3 및/또는 SMAD 1/5/8 신호전달)을 저해한다.

일정한 양상에서, 본 발명은 본 발명의 ActRII 길항제 (가령, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 폴리펩티드) 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 제조물을 제공한다. 제약학적 제조물은 또한, 하나 또는 그 이상의 추가 화합물, 예를 들면, 본원에서 설명된 장애 또는 질환을 치료하는데 이용되는 화합물 (가령, 치료가 필요한 개체에서 적혈구 수준을 증가시키고, 치료가 필요한 개체에서 빈혈을 치료하거나 예방하고 (가령, 수혈 부담의 감소 포함), 치료가 필요한 개체에서 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하고 및/또는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증 (가령, 빈혈, 수혈 요구, 호중구감소증, 철분 과부하, 급성 심근 경색, 간부전, 간비대, 비장비대, 급성 골수성 림프종으로의 진행)을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 개체에서 SF3B1 돌연변이와 연관된 장애를 치료하거나 예방하는 추가 화합물)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 제약학적 제조물은 실제적으로 발열원이 없다. 일반적으로, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, 또는 GDF 트랩 폴리펩티드는 환자에서 불리한 면역 반응의 가능성을 축소하기 위해, 폴리펩티드의 자연 당화를 적절하게 매개하는 포유류 세포주에서 발현되는 것이 바람직하다. 인간 및 CHO 세포주가 성공적으로 이용되었고, 그리고 다른 통상적인 포유류 발현 벡터가 유용할 것으로 예상된다. 일부 구체예에서, 바람직한 ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, 그리고 GDF 트랩 폴리펩티드는 당화되고, 그리고 포유류 세포, 바람직하게는 CHO 세포로부터 획득가능한 당화 패턴을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 본원에서 설명된 제약학적 제조물을 포함하고, 그리고 포유동물 (바람직하게는 인간)에서 적혈구 수준 및/또는 헤모글로빈을 증가시키고, 포유동물 (바람직하게는 인간)에서 빈혈을 치료하거나 예방하고, 포유동물 (바람직하게는 인간)에서 철적혈모구 빈혈 또는 MDS를 치료하고 및/또는 포유동물 (바람직하게는 인간)에서 철적혈모구 빈혈 또는 MDS의 하나 또는 그 이상의 합병증 (가령, 빈혈, 혈관폐색 위기 등)을 치료하거나 예방하고, 또는 포유동물 (바람직하게는 인간)에서 SF3B1 돌연변이와 연관된 장애를 치료하거나 예방하는 것 중에서 하나 또는 그 이상에서 이용 목적으로 표지화된 포장된 약제를 제공한다.

일정한 양상에서, 본 발명은 ActRII 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 또는 ActRIIB 폴리펩티드) 또는 GDF 트랩 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 예로서, 본원에서 설명된 가용성 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 가령, 단리된 핵산은 하나 또는 그 이상의 서열 변이를 갖는 ActRII 폴리펩티드의 세포외 도메인 (가령, 리간드-결합 도메인)을 포함하는 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩을 코딩하는 서열 및 막경유 도메인 또는 세포질 도메인 이내에 배치된, 또는 세포외 도메인 및 막경유 도메인 또는 세포질 도메인 사이에 배치된 종결 코돈을 제외하고, ActRII 폴리펩티드의 막경유 도메인 및/또는 세포질 도메인의 일부 또는 전부를 코딩할 서열을 포함할 수 있다. 가령, GDF 트랩을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 변이를 갖는 전장 ActRII 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 서열 번호: 1, 4, 또는 9, 또는 부분적으로 절두된 이형을 포함할 수 있고, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 3' 말단 앞에 최소한 600개 뉴클레오티드의 전사 종결 코돈을 더욱 포함하거나 또는 만약 그렇지 않으면, 폴리뉴클레오티드의 번역이 임의선택적으로 전장 ActRII의 절두된 부분에 융합된 세포외 도메인을 발생시키도록 배치된다. 본원에서 개시된 핵산은 발현을 위해 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있고, 그리고 본 발명은 이런 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포를 제공한다. 바람직하게는 세포는 포유류 세포, 예를 들면, CHO 세포이다.

일정한 양상에서, 본 발명은 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩을 만들기 위한 방법을 제공하고. 이런 방법은 본원에서 개시된 핵산 중에서 한 가지 (가령, 서열 번호: 8, 13, 27, 32, 39, 42, 46, 또는 48)를 적합한 세포, 예를 들면, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현하는 것을 포함할 수 있다. 이런 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다: a) GDF 트랩 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 세포를 배양하는 단계, 여기서 상기 세포는 GDF 트랩 발현 구조체로 형질전환되고; 그리고 b) 이렇게 발현된 GDF 트랩 폴리펩티드를 회수하는 단계. GDF 트랩 폴리펩티드는 세포 배양액으로부터 단백질을 획득하기 위한 널리 공지된 기술 중에서 한 가지를 이용하여, 미가공, 부분적으로 정제된 또는 고도로 정제된 분획물로서 회수될 수 있다.

일정한 양상에서, 본 발명은 ActRII 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 및/또는 SMAD 1/5/8 신호전달의 저해)을 길항작용하는 항체, 또는 항체의 조합에 관계한다. 특히, 본 발명은 예로서, 치료가 필요한 개체에서 적혈구 수준을 증가시키고, 치료가 필요한 개체에서 빈혈을 치료하거나 예방하고 (가령, 수혈 부담의 감소 포함), 치료가 필요한 개체에서 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하고 및/또는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증 (가령, 빈혈, 수혈 요구, 호중구감소증, 철분 과부하, 급성 심근 경색, 간부전, 간비대, 비장비대, 급성 골수성 림프종으로의 진행)을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 개체에서 SF3B1, DNMT3A 및/또는 TET2 돌연변이와 연관된 장애를 치료하거나 예방하기 위해, 항체 ActRII 길항제, 또는 항체 ActRII 길항제의 조합을 이용하는 방법을 제공한다.

일정한 구체예에서, 본 발명의 바람직한 항체 ActRII 길항제는 최소한 GDF11에 결합하고 및/또는 이의 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 GDF11-매개된 활성화)을 저해하는 항체, 또는 항체의 조합이다. 임의선택적으로, 항체, 또는 항체의 조합은 특히, GDF11 및 GDF8 둘 모두에 대한 결합 친화성을 갖는 다중특이적 항체의 경우에, 또는 하나 또는 그 이상의 항-GDF11 항체 및 하나 또는 그 이상의 항-GDF8 항체의 조합의 맥락에서 GDF8에 더욱 결합하고 및/또는 이의 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 GDF8-매개된 활성화)을 저해한다. 임의선택적으로, 본 발명의 항체, 또는 항체의 조합은 액티빈 A에 실제적으로 결합하지 않고 및/또는 이의 활성 (가령, ActRIIA 또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 액티빈 A-매개된 활성화)을 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, GDF11 및/또는 GDF8에 결합하고 및/또는 이의 활성을 저해하는 본 발명의 항체, 또는 항체의 조합은 특히, 복수 ActRII 리간드에 대한 결합 친화성을 갖는 다중특이적 항체의 경우에, 또는 조합 복수 항체 (각각은 상이한 ActRII 리간드에 대한 결합 친화성을 가짐)의 맥락에서 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, 그리고 Nodal 중에서 하나 또는 그 이상에 더욱 결합하고 및/또는 이의 활성 (가령, ActRIIA 또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 및/또는 SMAD 1/5/8 신호전달의 활성화)을 저해한다.

부분적으로, 본 발명은 ActRII 길항제가 적혈구 수준 (적혈구생성)을 증가시키거나 또는, 실례로서, 치료가 필요한 개체에서 빈혈을 치료하거나 예방하고 (가령, 수혈 부담의 감소 포함), 치료가 필요한 개체에서 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하고 및/또는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증 (가령, 빈혈, 수혈 요구, 호중구감소증, 철분 과부하, 급성 심근 경색, 간부전, 간비대, 비장비대, 급성 골수성 림프종으로의 진행)을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 개체에서 SF3B1, DNMT3A 및/또는 TET2 돌연변이와 연관된 장애를 치료하거나 예방하기 위해, EPO 수용체 활성체와 합동으로 (가령, 동일한 시점 또는 상이한 시점에 투여되지만, 일반적으로 중복 약리학적 효과를 달성하는 방식으로) 이용될 수 있다는 것을 증명한다. 부분적으로, 본 발명은 GDF 트랩이 환자, 특히 철적혈모구 빈혈 또는 MDS 환자에서 적혈구의 형성을 상승적으로 증가시키기 위해 EPO 수용체 활성체와 합동으로 투여될 수 있다는 것을 증명한다. 따라서, 이러한 합동된 치료의 효과는 ActRII 길항제 및 EPO 수용체 활성체가 그들의 개별 용량에서 별개로 투여될 때 효과의 합보다 훨씬 클 수 있다. 일정한 구체예에서, 이러한 상승작용은 유리할 수 있는데, 그 이유는 이것이 적혈구의 표적 수준이 더욱 낮은 용량의 EPO 수용체 활성체로 획득될 수 있게 하고, 따라서 잠재적인 부정적인 효과 또는 더욱 높은 수준의 EPO 수용체 활성화와 연관된 다른 문제점을 방지하기 때문이다. 따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명의 방법 (가령, 치료가 필요한 개체에서 적혈구 수준을 증가시키고, 치료가 필요한 개체에서 빈혈을 치료하거나 예방하고 (가령, 수혈 부담의 감소 포함), 치료가 필요한 개체에서 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하고 및/또는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증 (가령, 빈혈, 수혈 요구, 호중구감소증, 철분 과부하, 급성 심근 경색, 간부전, 간비대, 비장비대, 급성 골수성 림프종으로의 진행)을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 개체에서 SF3B1, DNMT3A 및/또는 TET2 돌연변이와 연관된 장애를 치료하거나 예방하는 방법)은 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 (가령, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드 및/또는 GDF 트랩 폴리펩티드)를 하나 또는 그 이상의 EPO 수용체 활성체와 합동으로 치료가 필요한 환자에 투여하는 것을 포함한다.

EPO 수용체 활성체는 EPO 수용체에 직접적으로 접촉하고 이를 활성화시킴으로써 적혈구생성을 자극할 수 있다. 일정한 구체예에서, EPO 수용체 활성체는 선천적 EPO의 165개 아미노산 서열에 근거된 한 부류의 화합물 중에서 한 가지이고, 그리고 일반적으로, 적혈구생성-자극 작용제 (ESAs)로서 알려져 있는데, 이들의 실례는 에포에틴 알파, 에포에틴 베타, 에포에틴 델타, 그리고 에포에틴 오메가이다. 다른 구체예에서, ESAs는 바람직한 약동학적 성질 (연장된 순환 반감기)을 부여하는 비펩티드성 변형을 갖는 합성 EPO 단백질 (SEPs) 및 EPO 유도체를 포함하는데, 이들의 실례는 다베포에틴 알파 및 메톡시-폴리에틸렌-글리콜 에포에틴 베타이다. 일정한 구체예에서, EPO 수용체 활성체는 EPO 폴리펩티드 중추를 통합하지 않거나 또는 ESA로서 일반적으로 분류되지 않는 EPO 수용체 효현제일 수 있다. 이런 EPO 수용체 효현제는 EPO의 펩티드성 및 비펩티드성 모방체, 효현성 항체 표적화 EPO 수용체, EPO 모방 도메인을 포함하는 융합 단백질, 그리고 에리트로포이에틴 수용체 연장된-지속 기간 제한된 효현제 (EREDLA)를 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

일정한 구체예에서, EPO 수용체 활성체는 EPO 수용체 그 자체에 접촉하지 않으면서 내인성 EPO의 생산을 증강함으로써, 적혈구생성을 간접적으로 자극할 수 있다. 가령, 저산소증-유도성 전사 인자 (HIFs)는 정상산소 조건 하에 세포 조절 기전에 의해 억제되는 (불안정화되는) EPO 유전자 발현의 내인성 자극기이다. 부분적으로, 본 발명은 GDF 트랩 및 HIF 안정화 성질을 갖는 간접적인 EPO 수용체 활성체, 예를 들면, 프로릴 수산화효소 저해제로 합동된 치료에 의해 환자에서 증가된 적혈구생성을 제공한다.

일정한 사례에서, 이들 다른 치료적 징후를 위해 GDF 트랩 폴리펩티드를 투여할 때, 적혈구에 대한 바람직하지 않은 효과를 감소시키기 위해, ActRII 길항제의 투여 동안 적혈구에 대한 효과를 모니터링하거나, 또는 ActRII 길항제의 투약을 결정하거나 조정하는 하는 것이 바람직할 수 있다. 가령, 적혈구 수준, 헤모글로빈 수준, 또는 헤마토크리트 수준에서 증가는 혈압에서 증가를 유발할 수 있다.

도면의 간단한 설명
제출된 본 특허 또는 출원은 유색으로 작성된 최소한 하나의 도면을 내포한다. 유색 도면(들)을 갖는 이러한 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요구 및 수수료의 납부 시에 사무국에 의해 제공될 것이다.
도면 1은 본원에서 복수 ActRIIB 및 ActRIIA 결정 구조의 복합 분석에 근거하여, 상자로 표시된 리간드에 직접적으로 접촉하는 것으로 추론되는 잔기를 갖는 인간 ActRIIA (서열 번호: 56) 및 인간 ActRIIB (서열 번호: 2)의 세포외 도메인의 정렬을 보여준다.
도면 2는 다양한 척추동물 ActRIIB 단백질 및 인간 ActRIIA (서열 번호: 57-64)의 복수 서열 정렬을 보여준다.
도면 3은 CHO 세포에서 발현된 ActRIIA-hFc의 정제를 보여준다. 상기 단백질은 크기산정 칼럼 (위쪽 패널) 및 쿠마시 염색된 SDS-PAGE (아래쪽 패널)에 의해 가시화될 때, 단일한 충분히 규정된 피크로서 정제된다 (왼쪽 레인: 분자량 표준; 오른쪽 레인: ActRIIA-hFc).
도면 4는 Biacore^TM 검정에 의해 계측될 때, 액티빈 및 GDF-11에 대한 ActRIIA-hFc의 결합을 보여준다.
도면 5a 및 5b는 암컷 비인간 영장류 (NHPs)에서 적혈구 수치에 대한 ActRIIA-hFc의 효과를 보여준다. 암컷 시노몰구스 원숭이 (각각 5마리 원숭이의 4가지 군)는 0 일자, 7 일자, 14 일자 및 21 일자에 위약 또는 1 mg/kg, 10 mg/kg 또는 30 mg/kg의 ActRIIA-hFc로 처리되었다. 도면 5a는 적혈구 (RBC) 수치를 보여준다. 도면 5b는 헤모글로빈 수준을 보여준다. 통계학적 유의성은 각 처리군에 대한 기준선에 상대적이다. 57 일자에, 2마리 원숭이가 각 군에 남겨졌다.
도면 6a 및 6b는 수컷 비인간 영장류에서 적혈구 수치에 대한 ActRIIA-hFc의 효과를 보여준다. 수컷 시노몰구스 원숭이 (각각 5마리 원숭이의 4가지 군)는 0 일자, 7 일자, 14 일자 및 21 일자에 위약 또는 1 mg/kg, 10 mg/kg 또는 30 mg/kg의 ActRIIA-hFc로 처리되었다. 도면 6a는 적혈구 (RBC) 수치를 보여준다. 도면 6b는 헤모글로빈 수준을 보여준다. 통계학적 유의성은 각 처리군에 대한 기준선에 상대적이다. 57 일자에, 2마리 원숭이가 각 군에 남겨졌다.
도면 7a 및 7b는 암컷 비인간 영장류에서 망상적혈구 수치에 대한 ActRIIA-hFc의 효과를 보여준다. 시노몰구스 원숭이 (각각 5마리 원숭이의 4가지 군)는 0 일자, 7 일자, 14 일자 및 21 일자에 위약 또는 1 mg/kg, 10 mg/kg 또는 30 mg/kg의 ActRIIA-hFc로 처리되었다. 도면 7a는 절대적 망상적혈구 수치를 보여준다. 도면 7b는 RBC에 비하여 망상적혈구의 백분율을 보여준다. 통계학적 유의성은 각 군에 대한 기준선에 상대적이다. 57 일자에, 2마리 원숭이가 각 군에 남겨졌다.
도면 8a 및 8b는 수컷 비인간 영장류에서 망상적혈구 수치에 대한 ActRIIA-hFc의 효과를 보여준다. 시노몰구스 원숭이 (각각 5마리 원숭이의 4가지 군)는 0 일자, 7 일자, 14 일자 및 21 일자에 위약 또는 1 mg/kg, 10 mg/kg 또는 30 mg/kg의 ActRIIA-hFc로 처리되었다. 도면 8a는 절대적 망상적혈구 수치를 보여준다. 도면 8b는 RBC에 비하여 망상적혈구의 백분율을 보여준다. 통계학적 유의성은 각 군에 대한 기준선에 상대적이다. 57 일자에, 2마리 원숭이가 각 군에 남겨졌다.
도면 9는 실시예 5에서 설명된 인간 임상 시험으로부터 결과를 보여주는데, 여기서 ActRIIA-hFc의 곡선 아래 면적 (AUC) 및 투여된 용량은 ActRIIA-hFc가 정맥내 (IV) 또는 피하 (SC) 투여되었는지에 상관없이 선형 상관을 갖는다.
도면 10은 IV 또는 SC 투여된 환자에서 ActRIIA-hFc의 혈청 수준의 비교를 보여준다.
도면 11은 상이한 용량 수준의 ActRIIA-hFc에 대한 응답으로 뼈 알칼리 인산분해효소 (BAP) 수준을 보여준다. BAP는 동화작용 뼈 성장에 대한 마커이다.
도면 12는 실시예 5에서 설명된 인간 임상 시험으로부터 헤마토크리트 수준의 기준선으로부터 중앙 변화를 묘사한다. ActRIIA-hFc는 지정된 용량에서 정맥내 (IV) 투여되었다.
도면 13은 실시예 5에서 설명된 인간 임상 시험으로부터 헤모글로빈 수준의 기준선으로부터 중앙 변화를 묘사한다. ActRIIA-hFc는 지정된 용량에서 정맥내 (IV) 투여되었다.
도면 14는 실시예 5에서 설명된 인간 임상 시험으로부터 RBC (적혈구) 수치의 기준선으로부터 중앙 변화를 묘사한다. ActRIIA-hFc는 지정된 용량에서 정맥내 (IV) 투여되었다.
도면 15는 실시예 5에서 설명된 인간 임상 시험으로부터 망상적혈구 수치의 기준선으로부터 중앙 변화를 묘사한다. ActRIIA-hFc는 지정된 용량에서 정맥내 (IV) 투여되었다.
도면 16은 TPA 리더 서열 (이중 밑줄 표시됨), ActRIIB 세포외 도메인 (서열 번호: 1에서 잔기 20-134; 밑줄 표시됨) 및 hFc 도메인을 포함하는, GDF 트랩 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc의 완전한 아미노산 서열 (서열 번호:38)을 보여준다. 선천적 서열 내에 위치 79에서 치환된 아스파르트산염은 이중 밑줄 표시되고 강조되며, 염기서열결정에 의해 성숙 융합 단백질 내에 N 말단 잔기인 것으로 드러난 글리신 역시 그러하다.
도면 17a 및 17b는 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여준다. 서열 번호:39는 센스 가닥에 상응하고, 그리고 서열 번호:40은 안티센스 가닥에 상응한다. TPA 리더 (뉴클레오티드 1-66)는 이중 밑줄 표시되고, 그리고 ActRIIB 세포외 도메인 (뉴클레오티드 76-420)은 밑줄 표시된다.
도면 18은 TPA 리더 (이중 밑줄 표시됨), 절두된 ActRIIB 세포외 도메인 (서열 번호:1에서 잔기 25-131; 밑줄 표시됨) 및 hFc 도메인을 포함하는, 절두된 GDF 트랩 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc에 대한 완전한 아미노산 서열 (서열 번호:41)을 보여준다. 선천적 서열 내에 위치 79에서 치환된 아스파르트산염은 이중 밑줄 표시되고 강조되며, 염기서열결정에 의해 성숙 융합 단백질 내에 N 말단 잔기인 것으로 드러난 글루타민산염 역시 그러하다.
도면 19a 및 19b는 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여준다. 서열 번호:42는 센스 가닥에 상응하고, 그리고 서열 번호:43은 안티센스 가닥에 상응한다. TPA 리더 (뉴클레오티드 1-66)는 이중 밑줄 표시되고, 그리고 절두된 ActRIIB 세포외 도메인 (뉴클레오티드 76-396)은 밑줄 표시된다. ActRIIB 세포외 도메인 (서열 번호: 1에서 잔기 25-131)에 대한 아미노산 서열 역시 도시된다.
도면 20은 리더가 없는 절두된 GDF 트랩 ActRIIB(L79D 25131)hFc에 대한 아미노산 서열 (서열 번호:44)을 보여준다. 절두된 ActRIIB 세포외 도메인 (서열 번호:1에서 잔기 25-131)은 밑줄 표시된다. 선천적 서열 내에 위치 79에서 치환된 아스파르트산염은 이중 밑줄 표시되고 강조되며, 염기서열결정에 의해 성숙 융합 단백질 내에 N 말단 잔기인 것으로 드러난 글루타민산염 역시 그러하다.
도면 21은 리더, hFc 도메인 및 링커가 없는 절두된 GDF 트랩 ActRIIB(L79D 25131)에 대한 아미노산 서열 (서열 번호:45)을 보여준다. 선천적 서열 내에 위치 79에서 치환된 아스파르트산염은 밑줄 표시되고 강조되며, 염기서열결정에 의해 성숙 융합 단백질 내에 N 말단 잔기인 것으로 드러난 글루타민산염 역시 그러하다.
도면 22a 및 22b는 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc를 인코딩하는 대안적 뉴클레오티드 서열을 보여준다. 서열 번호:46은 센스 가닥에 상응하고, 그리고 서열 번호:47은 안티센스 가닥에 상응한다. TPA 리더 (뉴클레오티드 1-66)는 이중 밑줄 표시되고, 절두된 ActRIIB 세포외 도메인 (뉴클레오티드 76-396)은 밑줄 표시되고, 그리고 세포외 도메인의 야생형 뉴클레오티드 서열에서 치환은 이중 밑줄 표시되고 강조된다 (서열 번호:42와 비교하여, 도면 19a 및 19b). ActRIIB 세포외 도메인 (서열 번호: 1에서 잔기 25-131)에 대한 아미노산 서열 역시 도시된다.
도면 23은 도면 22a 및 22b에서 도시된 대안적 뉴클레오티드 서열 (서열 번호:46)의 뉴클레오티드 76-396 (서열 번호:48)을 보여준다. 도면 22a 및 22b에서 지시된 동일한 뉴클레오티드 치환 역시 밑줄 표시되고 강조된다. 서열 번호:48은 L79D 치환을 갖는 절두된 ActRIIB 세포외 도메인 (서열 번호:1에서 잔기 25-131에 상응), 예를 들면, ActRIIB(L79D 25-131)를 인코딩한다.
도면 24는 시노몰구스 원숭이에서 기준선으로부터 적혈구 농도에서 절대적 변화에 대한 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc (회색) 또는 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (흑색)로 처리의 효과를 보여준다. VEH = 운반제. 데이터는 평균 + SEM이다. n = 군마다 4-8.
도면 25는 시노몰구스 원숭이에서 기준선으로부터 헤마토크리트에서 절대적 변화에 대한 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc (회색) 또는 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (흑색)로 처리의 효과를 보여준다. VEH = 운반제. 데이터는 평균 + SEM이다. n = 군마다 4-8.
도면 26은 시노몰구스 원숭이에서 기준선으로부터 헤모글로빈 농도에서 절대적 변화에 대한 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc (회색) 또는 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (흑색)로 처리의 효과를 보여준다. VEH = 운반제. 데이터는 평균 + SEM이다. n = 군마다 4-8.
도면 27은 시노몰구스 원숭이에서 기준선으로부터 순환하는 망상적혈구 농도에서 절대적 변화에 대한 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc (회색) 또는 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (흑색)로 처리의 효과를 보여준다. VEH = 운반제. 데이터는 평균 + SEM이다. n = 군마다 4-8.
도면 28은 생쥐에서 헤마토크리트에 대한 72 시간 동안 에리트로포이에틴 (EPO) 및 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc로 합동된 처리의 효과를 보여준다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 군마다 4)이고, 그리고 서로 유의미하게 상이한 평균 (p < 0.05, 비대칭 t 검증)은 상이한 문자에 의해 지정된다. 합동된 처리는 운반제와 비교하여 헤마토크리트를 23% 증가시켰는데, 이것은 EPO 및 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc의 별개의 효과의 합보다 큰 상승적 증가이다.
도면 29는 생쥐에서 헤모글로빈 농도에 대한 72 시간 동안 EPO 및 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc로 합동된 처리의 효과를 보여준다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 군마다 4)이고, 그리고 서로 유의미하게 상이한 평균 (p < 0.05)은 상이한 문자에 의해 지정된다. 합동된 처리는 운반제와 비교하여 헤모글로빈 농도를 23% 증가시켰는데, 이것 역시 상승 효과이었다.
도면 30은 생쥐에서 적혈구 농도에 대한 72 시간 동안 EPO 및 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc로 합동된 처리의 효과를 보여준다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 군마다 4)이고, 그리고 서로 유의미하게 상이한 평균 (p < 0.05)은 상이한 문자에 의해 지정된다. 합동된 처리는 운반제와 비교하여 적혈구 농도를 20% 증가시켰는데, 이것 역시 상승 효과이었다.
도면 31은 생쥐 비장에서 적혈구형성 전구체 세포의 숫자에 대한 72 시간 동안 EPO 및 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc로 합동된 처리의 효과를 보여준다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 군마다 4)이고, 그리고 서로 유의미하게 상이한 평균 (p < 0.01)은 상이한 문자에 의해 지정된다. EPO 단독은 후기 단계 전구체 성숙의 희생으로 호염기성 적혈모구 (BasoE)의 숫자를 극적으로 증가시키는 반면, 합동된 처리는 후기 단계 전구체의 축소되지 않은 성숙을 뒷받침하면서, BasoE 숫자를 더욱 적긴 하지만 여전히 유의미한 정도까지 증가시켰다.
도면 32는 GDF 트랩이 MDS의 생쥐 모형에서 무효한 적혈구생성을 경감하고, 그리고 질환 심각도의 복수 시기에서 빈혈을 개선할 수 있다는 것을 보여준다. (A) 운반제로 처리된 야생형 (Wt) 생쥐 (Tris-완충된 식염수, TBS, n = 5), TBS로 처리된 MDS 생쥐 (n = 5), 그리고 대략 6 개월령 (초기 단계)에서 종결되는 8 주 동안 주 2회 ActRIIB(L79D 25-131)-mFc (RAP-536, 10 mg/kg, n = 6)로 처리된 MDS 생쥐에서 RBC 숫자와 헤모글로빈 농도 (위쪽) 및 골수에서 조혈 전구체의 형태학적 열거 (아래쪽). TBS-처리된 MDS 생쥐와 대비하여 ^*P < 0.05, ^**P < 0.01; 야생형 생쥐와 대비하여 ^###P < 0.001. (B) 대략 12 개월령 (후기 단계)에서 종결되는 7 주 동안 RAP-536 (10 mg/kg, 주 2회, n = 5) 또는 TBS (n = 4)로 처리된 MDS 생쥐에서 패널 A에서와 동일한 종결점. TBS-처리된 MDS 생쥐와 대비하여 ^*P < 0.05. 데이터는 평균 ± SEM이다.

발명의 상세한 설명

1. 개요

전환 성장 인자-베타 (TGF-베타) 상과는 통상적인 서열 요소 및 구조적 모티프를 공유하는 다양한 성장 인자를 내포한다. 이들 단백질은 척추동물 및 무척추동물 둘 모두에서 매우 다양한 세포 유형에 대한 생물학적 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다. 이러한 상과의 구성원은 배아 발달 동안 패턴 형성 및 조직 특징화에서 중요한 기능을 수행하고, 그리고 지질생성, 근육발생, 연골형성, 심장발생, 조혈, 신경발생 및 상피 세포 분화를 비롯한 다양한 분화 과정에 영향을 줄 수 있다. TGF-베타 패밀리의 구성원의 활성을 조작함으로써, 생물체에서 유의미한 생리학적 변화를 유발하는 것이 종종 가능하다. 가령, 피에몬테 및 벨기에 블루 소 품종은 근육 질량에서 현저한 증가를 유발하는, GDF8 (미오스타틴으로 또한 불림) 유전자에서 기능 상실 돌연변이를 보유한다 [가령, Grobet et al. (1997) Nat Genet. 17(1):71-4를 참조한다]. 게다가, 인간에서, GDF8의 비활성 대립형질은 증가된 근육 질량, 그리고 보고된 바에 따르면, 이례적인 힘과 연관된다 [가령, Schuelke et al. (2004) N Engl J Med, 350:2682-8을 참조한다].

TGF-β 신호는 유형 I 및 유형 II 세린/트레오닌 키나아제 수용체의 이형화학 복합체에 의해 매개되는데, 이들은 리간드 자극 시에 하류 SMAD 단백질 (가령, SMAD 단백질 1, 2, 3, 5, 및 8)을 인산화하고 활성화시킨다 [가령,Massague (2000) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178을 참조한다]. 이들 유형 I 및 유형 II 수용체는 시스테인-풍부한 영역을 갖는 리간드-결합 세포외 도메인, 막경유 도메인, 그리고 예측된 세린/트레오닌 특이성을 갖는 세포질 도메인으로 구성된 막경유 단백질이다. 유형 I 수용체는 신호전달에 필수적이다. 유형 II 수용체는 리간드 결합 및 유형 I 수용체의 활성화에 필요하다. 유형 I 및 II 액티빈 수용체는 리간드 결합 후 안정된 복합체를 형성하고, 유형 II 수용체에 의한 유형 I 수용체의 인산화를 유발한다.

2개의 관련된 유형II 수용체 (ActRII), ActRIIA 및 ActRIIB는 액티빈에 대한 유형 II 수용체로서 확인되었다 [가령, Mathews and Vale (1991) Cell 65:973-982; 그리고 Attisano et al. (1992) Cell 68: 97-108을 참조한다]. 액티빈 이외에, ActRIIA 및 ActRIIB는예로서, BMP6, BMP7, Nodal, GDF8, 그리고 GDF11을 포함하는 여러 다른 TGF-β 패밀리 단백질과 생화학적으로 상호작용할 수 있다 [가령, Yamashita et al. (1995) J. Cell Biol. 130:217-226;Lee and McPherron (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9306-9311; Yeo and Whitman (2001) Mol. Cell 7: 949-957; 그리고 Oh et al. (2002) Genes Dev. 16:2749-54을 참조한다]. ALK4는 액티빈, 특히 액티빈 A에 대한 일차 유형 I 수용체이고, 그리고 ALK-7은 다른 액티빈, 특히 액티빈 B에 대한 수용체로서 역할을 할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 저해제 작용제, 특히 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, GDF11 및/또는 GDF8 중에서 하나 또는 그 이상을 길항작용할 수 있는 저해제 작용제로 ActRII 수용체의 리간드 (ActRII 리간드로서 또한 지칭됨)를 길항하는 것에 관계한다.

액티빈은 TGF-베타 상과에 속하는 이합체성 폴리펩티드 성장 인자이다. 2가지 밀접하게 관련된 β 아단위의 동종/이형이합체 (각각, β_Aβ_A, β_Bβ_B, 그리고 β_Aβ_B)인 3가지 주요 액티빈 형태 (A, B, 그리고 AB)가 있다. 인간 유전체는 또한, 액티빈 C 및 액티빈 E를 인코딩하는데, 이들은 간에서 일차적으로 발현되고, 그리고 β_C 또는 β_E를 내포하는 이형이합체성 형태 역시 알려져 있다.

TGF-베타 상과에서, 액티빈은 난소 및 태반 세포에서 호르몬 생산을 자극하고, 뉴런 세포 생존을 뒷받침하고, 세포 유형에 따라 세포-주기 진행에 긍정적으로 또는 부정적으로 영향을 주고, 그리고 최소한 양서류 배아에서 중배엽 분화를 유도할 수 있는 독특한 다중기능성 인자이다 [DePaolo et al. (1991) Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dyson et al. (1997) Curr Biol. 7:81-84; 그리고 Woodruff (1998) Biochem Pharmacol. 55:953-963]. 게다가, 자극된 인간 단핵구성 백혈병 세포로부터 단리된 적혈구 분화 인자 (EDF)는 액티빈 A와 동일한 것으로 밝혀졌다 [Murata et al. (1988) PNAS, 85:2434]. 액티빈 A는 골수에서 적혈구생성을 증진하는 것으로 제안되었다. 여러 조직에서, 액티빈 신호전달은 이의 관련된 이형이합체, 인히빈에 의해 길항된다. 가령, 뇌하수체로부터 난포-자극 호르몬 (FSH)의 방출 동안, 액티빈은 FSH 분비 및 합성을 증진하는 반면, 인히빈은 FSH 분비 및 합성을 예방한다. 액티빈 생물활성을 조절하고 및/또는 액티빈에 결합할 수 있는 다른 단백질은 폴리스타틴 (FS), 폴리스타틴-관련된 단백질 (FSRP, FLRG 또는 FSTL3으로서 또한 알려져 있음), 그리고 α₂-마크로글로불린을 포함한다.

본원에서 설명된 바와 같이, "액티빈 A"에 결합하는 작용제는 단리된 β_A 아단위의 맥락에서 또는 이합체성 복합체 (가령, β_Aβ_A 동종이합체 또는 β_Aβ_B 이형이합체)로서 인지에 상관없이, β_A아단위에 특이적으로 결합하는 작용제이다. 이형이합체 복합체 (가령, β_Aβ_B이형이합체)의 경우에, "액티빈 A"에 결합하는 작용제는 β_A 아단위 내에 존재하는 에피토프에 특이적이지만, 상기 복합체의 비-β_A 아단위 (가령, 상기 복합체의 β_B아단위) 내에 존재하는 에피토프에 결합하지 않는다. 유사하게, "액티빈 A"를 길항작용하는 (저해하는) 본원에서 개시된 작용제는 단리된 β_A 아단위의 맥락에서 또는 이합체성 복합체 (가령, β_Aβ_A 동종이합체 또는 β_Aβ_B 이형이합체)로서 인지에 상관없이, β_A 아단위에 의해 매개될 때 하나 또는 그 이상의 활성을 저해하는 작용제이다. β_Aβ_B 이형이합체의 경우에, "액티빈 A"를 저해하는 작용제는 β_A 아단위의 하나 또는 그 이상의 활성을 특이적으로 저해하지만, 상기 복합체의 비-β_A 아단위 (가령, 상기 복합체의 β_B아단위)의 활성을 저해하지 않는 작용제이다. 이러한 원리는 "액티빈 B", "액티빈 C", 그리고 "액티빈 E"에 결합하고 및/또는 이들을 저해하는 작용제에도 적용된다. "액티빈 AB"를 길항작용하는 본원에서 개시된 작용제는 β_A 아단위에 의해 매개될 때 하나 또는 그 이상의 활성 및 β_B 아단위에 의해 매개될 때 하나 또는 그 이상의 활성을 저해하는 작용제이다.

Nodal 단백질은 중배엽 및 내배엽 유도 및 형성뿐만 아니라 초기 배아형성에서 축 구조, 예를 들면, 심장 및 위의 차후 조직화에서 기능을 갖는다. 발달 중인 척추동물 배아에서 등쪽 조직은 척삭 및 척삭앞판의 축 구조에 지배적으로 기여하면서, 주변 세포를 모집하여 비-축 배아 구조를 형성하는 것으로 증명되었다. Nodal은 유형 I 및 유형 II 수용체 둘 모두 및 SMAD 단백질로서 알려져 있는 세포내 작동체를 통해 신호전달하는 것으로 보인다. 여러 연구가 ActRIIA 및 ActRIIB가 Nodal에 대한 유형 II 수용체로서 역할을 한다는 개념을 뒷받침한다 [가령, Sakuma et al. (2002) Genes Cells. 2002, 7:401-12를 참조한다]. Nodal 리간드가 그들의 보조인자 (가령, 크립토)와 상호작용하여 액티빈 유형 I 및 유형 II 수용체를 활성화시키고, 이들이 SMAD2를 인산화하는 것으로 제안된다. Nodal 단백질은 중배엽 형성, 전방 패턴화, 그리고 왼쪽-오른쪽 축 특성화를 비롯하여, 초기 척추동물 배아에 결정적인 많은 사건에 관여한다. 실험적 증거는 Nodal 신호전달이 액티빈 및 TGF-베타에 특이적으로 반응하는 것으로 이전에 밝혀진 루시페라아제 리포터, pAR3-Lux를 활성화시킨다는 것을 증명하였다. 하지만, Nodal은 뼈 형성 단백질에 특이적으로 반응성인 리포터, pTlx2-Lux를 유도할 수 없다. 최근 결과는 Nodal 신호전달이 양쪽 액티빈-TGF-베타 경로 SMAD, SMAD2 및 SMAD3에 의해 매개된다는 직접적인 생화학적 증거를 제공한다. 추가 증거는 세포외 크립토 단백질이 Nodal 신호전달에 필요하고, 상기 신호전달을 액티빈 또는 TGF-베타 신호전달과 상이하게 만든다는 것을 보여주었다.

성장 및 분화 인자-8 (GDF8)은 미오스타틴으로서 또한 알려져 있다. GDF8은 골격근 질량의 음성 조절인자이다. GDF8은 발달 중인 골격근 및 성체 골격근에서 고도로 발현된다. 유전자도입 생쥐에서 GDF8 정지 돌연변이는 골격근의 현저한 비대 및 과형성에 의해 특징화된다 [McPherron et al., Nature (1997) 387:83-90]. 골격근 질량에서 유사한 증가가 소에서 [가령, Ashmore et al. (1974) Growth, 38:501-507; Swatland and Kieffer (1994) J. Anim. Sci. 38:752-757; McPherron and Lee (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12457-12461; 그리고 Kambadur et al. (1997) Genome Res. 7:910-915를 참조한다]에서 및 두드러지게는, 인간에서 [가령, Schuelke et al. (2004) N Engl J Med 350:2682-8을 참조한다] GDF8의 자연발생 돌연변이에서 분명하다. 여러 연구에서 인간에서 HIV-감염과 연관된 근육 쇠약은 GDF8 단백질 발현에서 증가를 동반하는 것으로 또한 밝혀졌다 [가령, Gonzalez-Cadavid et al. (1998) PNAS 95:14938-43을 참조한다]. 이에 더하여, GDF8은 근육-특이적 효소 (가령, 크레아틴 키나아제)의 생산을 조정하고 근모세포 세포 증식을 조정할 수 있다 [가령, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/43781을 참조한다]. GDF8 프로펩티드는 성숙 GDF8 도메인 이합체에 비공유적으로 결합하고, 이의 생물학적 활성을 비활성화시킬 수 있다 [가령, Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem., 263: 6407-6415; Wakefield et al. (1988) J. Biol. Chem., 263: 7646-7654; 그리고 Brown et al. (1990) Growth Factors, 3: 35-43을 참조한다]. GDF8 또는 구조적으로 관련된 단백질에 결합하고 이들의 생물학적 활성을 저해하는 다른 단백질은 폴리스타틴, 그리고 잠재적으로, 폴리스타틴-관련된 단백질을 포함한다 [가령, Gamer et al. (1999) Dev. Biol., 208: 222-232를 참조한다].

BMP11로서 또한 알려져 있는 성장 및 분화 인자-11 (GDF11)는 분비된 단백질이다 [McPherron et al. (1999) Nat. Genet. 22: 260-264]. GDF11은 생쥐 발달 동안 미아, 지아, 상악골 및 하악궁, 그리고 배근 신경절에서 발현된다 [가령, Nakashima et al. (1999) Mech. Dev. 80: 185-189를 참조한다]. GDF11은 중배엽 및 신경 조직 둘 모두를 패턴화함에 있어서 독특한 역할을 수행한다 [가령, Gamer et al. (1999) Dev Biol., 208:222-32를 참조한다]. GDF11은 발달하는 병아리 사지에서 연골형성 및 근육발생의 음성 조절인자인 것으로 밝혀졌다 [가령, Gamer et al. (2001) Dev Biol. 229:407-20을 참조한다]. 근육에서 GDF11의 발현은 또한, GDF8과 유사한 방식으로 근육 성장을 조절하는데 있어서 이의 역할을 암시한다. 이에 더하여, 뇌에서 GDF11의 발현은 GDF11이 신경계의 기능에 관계하는 활성을 또한 소유할 수 있다는 것을 암시한다. 흥미롭게도, GDF11은 후각 상피에서 신경발생을 저해하는 것으로 밝혀졌다 [가령, Wu et al. (2003) Neuron. 37:197-207를 참조한다].

골원성 단백질-1 (OP-1)로 또한 불리는 뼈 형성 단백질 (BMP7)은 연골 및 뼈 형성을 유도하는 것으로 널리 알려져 있다. 이에 더하여, BMP7은 넓은 어레이의 생리학적 과정을 조절한다. 가령, BMP7은 상피 골형성의 현상을 책임지는 뼈유도성 인자이다. BMP7은 칼슘 조절 및 뼈 항상성에서 일정한 역할을 수행하는 것으로 또한 확인된다. 액티빈과 유사하게, BMP7은 유형 II 수용체, ActRIIA 및 ActRIIB에 결합한다. 하지만, BMP7 및 액티빈은 상이한 유형 I 수용체를 이형화학 수용체 복합체 내로 모집한다. 관찰된 주요 BMP7 유형 I 수용체는 ALK2인 반면, 액티빈은 ALK4 (ActRIIB)에 배타적으로 결합하였다. BMP7 및 액티빈은 상이한 생물학적 반응을 유도하고 상이한 SMAD 경로를 활성화시켰다 [가령, Macias-Silva et al. (1998) J Biol Chem. 273:25628-36을 참조한다].

본원에서 증명된 바와 같이, ActRII 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드)는 생체내에서 적혈구 수준을 증가시키는데 이용될 수 있다. 일정한 실례에서, GDF 트랩 폴리펩티드 (구체적으로, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드)는 야생형 (변형되지 않은) ActRII 폴리펩티드의 상응하는 표본과 비교하여 독특한 생물학적 성질에 의해 특징화되는 것으로 나타난다. 이러한 GDF 트랩은 부분적으로, 액티빈 A에 대한 결합 친화성의 실제적인 상실, 그리고 이런 이유로, 액티빈 A 활성을 길항작용하는 유의미하게 축소된 능력에 의해 특징화되지만, GDF11의 결합 및 저해의 야생형 수준과 가까운 수준을 유지한다. 생체내에서, GDF 트랩은 야생형 ActRIIB 폴리펩티드와 비교하여 적혈구 수준을 증가시키는데 더욱 효과적이고, 그리고 빈혈에 대한 다양한 모형에서 유익한 효과를 갖는다. 조혈은 에리트로포이에틴, G-CSF, 그리고 철분 항상성을 비롯한 다양한 인자에 의해 조절되는 복잡한 과정인 것으로 유의되어야 한다. 용어 "적혈구 수준을 증가시킨다" 및 "적혈구 형성을 증진한다"는 임상적으로 식별가능한 메트릭스, 예를 들면, 헤마토크리트, 적혈구 수치, 그리고 헤모글로빈 치수를 지칭하고, 그리고 이런 변화가 발생하는 기전에 대해 중립적인 것으로 의도된다.

본 발명의 데이터는 이런 이유로, 적혈구 수준에 대하여 ActRII 폴리펩티드의 관찰된 생물학적 활성이 액티빈 A 저해에 의존하지 않는다는 것을 지시한다. 하지만, 주목할 만한 것은 액티빈 A 결합을 유지하는 변형되지 않은 ActRIIB 폴리펩티드는 생체내에서 적혈구를 증가시키는 능력을 여전히 보여준다는 점이다. 게다가, 액티빈 A 저해를 유지하는 ActRIIB 또는 ActRIIA 폴리펩티드는 적혈구 수준에서 더욱 근소한 증가가 바람직하고 및/또는 일부 수준의 부정확한 활성이 허용되는 (또는 심지어 바람직한) 일부 적용에서, 액티빈 A에 대한 축소된 결합 친화성을 갖는 GDF 트랩과 비교하여 더욱 바람직할 수 있다.

따라서, 본 발명의 방법은 전반적으로, 치료가 필요한 개체에서 적혈구 형성을 증가시키고, 치료가 필요한 개체에서 빈혈을 치료하거나 예방하고, 골수형성이상 증후군을 치료하고, 치료가 필요한 개체에서 철적혈모구 빈혈을 치료하고, 그리고 철적혈모구 빈혈 또는 골수형성이상 증후군의 하나 또는 그 이상의 합병증 (가령, 빈혈, 수혈 요구, 철분 과부하, 호중구감소증, 비장비대, 급성 골수성 백혈병으로의 진행)을 치료하거나 예방하기 위해, 그리고 임의선택적으로, 골수 세포 내에 환상 철적혈모구 및/또는 SF3B1, DNMT3A 및/또는 TET2 유전자에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 갖는 환자의 하위군에서, 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 지지 요법과 합동으로 본원에서 설명된 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제의 용도에 관계한다. ActRII 길항제에 반응할 개연성이 특히 있는 것으로 확인되는 환자의 다른 하위군은 EPO 요법 또는 다른 EPO 수용체 활성체 요법으로 이전 치료에 실패한 환자이다.

본원에서 증거된 바와 같이, 설명된 ActRII 길항제 작용제는 EPO 수용체 활성체와 합동으로, 또는 EPO 수용체 활성체로 치료에 실패한 환자에서 이용될 수 있다. EPO는 적혈구 선조체 세포의 성장 및 이들의 적혈구로의 성숙에 관련된 당단백질 호르몬이다. EPO는 태아기 동안 간에 의해 및 성체에서 신장에 의해 생산된다. 신부전의 결과로서 성체에서 통상적으로 발생하는 EPO의 감소된 생산은 빈혈을 야기한다. EPO는 EPO 유전자로 형질감염된 숙주 세포로부터 상기 단백질의 발현 및 분비에 근거된 유전공학 기술에 의해 생산되었다. 이런 재조합 EPO의 투여는 빈혈의 치료에 효과적이었다. 가령, Eschbach 등 (1987, N Engl J Med 316:73)은 만성 신부전에 의해 유발된 빈혈을 교정하기 위한 EPO의 용도를 설명한다.

EPO의 효과는 사이토킨 수용체 상과에 속하고 EPO 수용체로서 지정된 세포 표면 수용체에 결합, 그리고 이의 활성화를 통해 매개된다. 인간 및 뮤린 EPO 수용체가 클로닝되고 발현되었다 [가령, D'Andrea et al. (1989) Cell 57:277; Jones et al. (1990) Blood 76:31; Winkelman et al. (1990) Blood 76:24; 그리고 U.S. Pat. No. 5,278,065를 참조한다]. 인간 EPO 수용체 유전자는 대략 224개 아미노산의 세포외 도메인을 포함하는 483-아미노산 막경유 단백질을 인코딩하고, 그리고 뮤린 EPO 수용체와 대략 82% 아미노산 서열 동일성을 전시한다 (가령, U.S. 특허 번호 6,319,499를 참조한다). 포유류 세포 (66-72 kDa)에서 발현된 클로닝된, 전장 EPO 수용체는 적혈구 선조체 세포 상에서 선천적 수용체의 것과 유사한 친화성 (K_D = 100-300 nM)으로 EPO에 결합한다. 따라서, 이러한 형태는 주요 EPO 결합 결정인자를 내포하는 것으로 생각되고 EPO 수용체로서 지칭된다. 다른 밀접하게 관련된 사이토킨 수용체에서 유추하여, EPO 수용체는 효현제 결합 시에 이합체화하는 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고, 다중결합 복합체일 수 있는 EPO 수용체의 상술된 구조, 그리고 이의 특정한 활성화 기전이 완전하게 이해된 것은 아니다 (가령, U.S. 특허 번호 6,319,499를 참조한다).

EPO 수용체의 활성화는 여러 생물학적 효과를 유발한다. 이들은 미성숙 적모구의 증가된 증식, 미성숙 적모구의 증가된 분화, 그리고 적혈구 선조체 세포에서 감소된 아폽토시스를 포함한다 [가령, Liboi et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:11351-11355; Koury et al. (1990) Science 248:378-381]을 참조한다. 증식 및 분화를 매개하는 EPO 수용체 신호 전달 경로는 상이한 것으로 보인다 [가령, Noguchi et al. (1988) Mol Cell Biol 8:2604; Patel et al. (1992) J Biol Chem, 267:21300; 그리고 Liboi et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:11351-11355를 참조한다]. 일부 결과는 분화 신호의 매개를 위해 보조 단백질이 필요할 수 있다는 것을 암시한다 [가령, Chiba et al. (1993) Nature 362:646; 그리고 Chiba et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:11593을 참조한다]. 하지만, 분화에서 보조 단백질의 역할에 관해 논란이 있는데, 그 이유는 수용체의 구조성으로 활성화된 형태가 증식 및 분화 둘 모두를 자극할 수 있기 때문이다 [가령, Pharr et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:938을 참조한다].

EPO 수용체 활성체는 소형 분자 적혈구생성-자극 작용제 (ESAs)뿐만 아니라 EPO-기초된 화합물을 포함한다. 전자의 실례는 폴리에틸렌 글리콜에 공유 연결된 이합체성 펩티드-기초된 효현제 (상품명 Hematide™ 및 Omontys®)인데, 이것은 건강한 지원자에서 및 만성 신장병 및 내인성 항-EPO 항체 둘 모두를 갖는 환자에서 적혈구생성-자극 성질을 보여주었다 [가령, Stead et al. (2006) Blood 108:1830-1834; 그리고 Macdougall et al. (2009) N Engl J Med 361:1848-1855를 참조한다]. 다른 실례는 비펩티드-기초된 ESAs를 포함한다 [가령, Qureshi et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:12156-12161을 참조한다].

EPO 수용체 활성체는 또한, EPO 수용체 그 자체에 접촉하지 않으면서 내인성 EPO의 생산을 증강함으로써, 적혈구생성을 간접적으로 자극하는 화합물을 포함한다. 가령, 저산소증-유도성 전사 인자 (HIFs)는 정상산소 조건 하에 세포 조절 기전에 의해 억제되는 (불안정화되는) EPO 유전자 발현의 내인성 자극기이다. 이런 이유로, HIF 프로릴 수산화효소 효소의 저해제가 생체내에서 EPO-유도 활성에 대해 조사되고 있다. EPO 수용체의 다른 간접적인 활성체는 다음을 포함한다: GATA-2 전사 인자의 저해제 [가령, Nakano et al. (2004) Blood 104:4300-4307을 참조한다], 이것은 EPO 유전자 발현을 긴장성으로 저해하고, 그리고 조혈 세포 포스파타아제 (HCP 또는 SHP-1)의 저해제, 이것은 EPO 수용체 신호 전달의 음성 조절인자로서 기능한다 [가령, Klingmuller et al. (1995) Cell 80:729-738을 참조한다].

본원에서 설명된 바와 같이, 환상 철적혈모구를 전시하는 환자는 ActRII 길항제로 치료에 특히 적합할 수 있다. 철적혈모구 빈혈은 선천성 (유전된) 및 획득된 형태로 대별될 수 있고, 이들은 표 1에서 보여지는 바와 같이 더욱 세분될 수 있다.

MDS는 성체에서 획득된 골수 부전 증후군의 가장 흔한 부류를 나타낸다. 비록 MDS가 생물학적 관점으로부터 점점 더 이해되고 있긴 하지만, 향상된 병리학적 통찰력이 이들 장애로 고통받는 대부분의 환자에 대한 고도로 효과적인 또는 치유력 있는 요법으로 아직 변환되지는 않고 있다. MDS에서 세포 분화의 증가하는 실패는 이차성 급성 골수성 백혈병 (AML)으로의 진화와 연관되는데, 이것은 현재 WHO에 의해, 혈액 또는 골수 내에 최소한 20% 골수모세포, 또는 모구 비율에 상관없이 여러 AML-규정 핵형 이상 중에서 한 가지의 존재를 갖는 것으로 규정된다 [가령, Vardiman et al. (2009) Blood 114:937-951을 참조한다]. AML은 많게는 MDS 환자의 30%에서 궁극적으로 진단된다. MDS의 원인이 되는 생물학적 이질성이 임상적 결과에서 넓은 변이로 해석되기 때문에, MDS의 자연 코스를 예측하고 환자를 상담하기 위한 예후적 분류 체계가 개발되었다 [Zeidan et al (2013) Curr Hematol Malig Rep 8:351-360]. 국제 예후 점수 시스템 (IPSS)은 환자를 낮음 (5.7 년의 중앙 생존) 내지 중간 1 (3.5 년의 중앙 생존) 내지 중간 2 (1.2 년의 중앙 생존) 내지 높음 (0.4 년의 중앙 생존) 범위에서 변하는 위험 프로필에 따라 분류하는 이와 같은 한 가지 분류의 실례이다. IPSS-R로서 지칭되는 대체 시스템 역시 환자 층화에 이용될 수 있다. 환자의 관점으로부터, 예후는 질환의 심각도를 규정하고, 그리고 이것이 그들에게 얼마나 충격을 줄 가능성이 있는 지에 대한 예상을 설정하는데 도움을 준다. 의사의 관점으로부터, 예후는 요법을 주도하도록 도움을 주는데 이용될 수 있는 방식으로 질환의 병기결정 수단을 제공한다. 특히, 이런 계획은 전형적으로 환자 동시이환을 고려하지 않고, 그리고 특정한 요법에 관계하여 임상적 유익성을 예측하는 것으로 의도되지 않는다.

MDS를 앓는 환자의 적절한 치료 및 관리를 용이하게 하는 추가 MDS 분류 체계가 제안되었다. 분류는 이들 복합 증후군을 이해함에 있어서 진전을 통합하기 위해 여러 수십 년에 걸쳐 진화하였다. MDS에 대한 프랑스인 미국인 영국인 (FAB) 분류 체계가 1982년에 제안되었고 [Bennett et al. (1982) Br J Haematol 51:189-199], 그리고 2001년에 WHO에 의해 확립된 변형된 분류 체계에 대한 기초로서 역할을 하였다. 아래 표 2에서 요약된 바와 같이, WHO 분류의 현재 버전 (2008년에 개정됨)은 (1) 골수 및 말초혈에서 골수모세포의 백분율, (2) 형성장애의 유형 및 정도, (3) 환상 철적혈모구의 존재, 그리고 (4) 세포유전학적 이상의 존재에 근거된다. 따라서, 환상 철적혈모구는 RARS의 특징을 이루지만, MDS의 다른 아형에서도 존재할 수 있다 [가령, Juneja et al. (1983) J Clin Pathol 36:566-569; Malcovati et al. (2013) Best Pract Res Clin Haematol 26:377-385을 참조한다]. MDS 아형에 따라, 빈혈이 예로서, 환상 철적혈모구의 존재 또는 부재에서, 단독으로, 또는 비정상적으로 낮은 숫자의 호중구 (호중구감소증), 낮은 숫자의 혈소판 (혈소판감소증), 또는 상승된 수준의 혈소판 (혈소판증가증)과 합동으로 일어날 수 있다. 현저한 혈소판증가증과 연관된 환상철모구 불응성 빈혈 (RARS-T)은 현재, WHO 분류 (표 2)에서 분류할 수 없는 MDS 신생물의 군 (MDS-U) 내에 임시 항목으로서 포함된다. RARS-T는 형성장애 무효한 적혈구생성 및 적혈구 전구체의 ≥ 15% 환상 철적혈모구, 말초혈에서 모구 없음 및 골수에서 < 5%, 그리고 혈소판 수치 ≥ 450 x 10⁹/L를 갖는 혈소판증가증을 동반한 빈혈로서 규정된다 [Malcovati et al. (2013) Best Pract Res Clin Haematol 26:377-385]. 약화된 면역계로 인해, 호중구감소증을 앓는 환자는 감염 및 심지어 패혈증의 심각한 위험에 처해 있을 수 있고, 그리고 이런 이유로, 이러한 질환을 치료하는 것이 중요하다. 혈소판감소증을 앓는 환자는 내출혈의 증가된 위험에 처해 있고, 그리고 심각도에 따라, 이러한 질환을 치료하는 것이 또한 유익할 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, ActRII 길항제는 MDS 환자 또는 철적혈모구 빈혈을 앓는 환자를 비롯한 환자에서 빈혈을 치료하는데 유용하고, 여기서 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%보다 많은 적혈구 전구체가 예로서, 환상철모구 불응성 빈혈 (RARS), 현저한 혈소판증가증과 연관된 RARS (RARS-T), 또는 다중계통 형성장애 불응성 혈구감소증 (RCMD, 환상 철적혈모구가 두드러지는 환자에서 RCMD-RS로서 또한 알려져 있음)에서 환상 철적혈모구이다.

빈혈이 MDS에서 빈번하게 발생한다. MDS 환자 중에서 대략 80%는 빈혈을 나타내고, 그리고 이들 중에서 실제적인 백분율이 그들의 질환 코스 동안 수혈에 의존하게 된다 [Steensma et al. (2006) Mayo Clin Proc 81:104-130]. 일부 MDS 아형은 "무효한 적혈구생성"에 의해 특징화되는데, 여기서 조직 저산소증에 대한 응답으로 초기 단계 적혈구 선조체 세포의 EPO-자극된 과다증식에도 불구하고 후기 단계 적혈구 전구체 세포의 손상된 분화 (성숙)이 존재한다. 따라서, 무효한 적혈구생성의 핵심 징후는 내인성 EPO의 상승된 수준에도 불구하고 지속적인 빈혈이다. 무효한 적혈구생성은 MDS의 RARS 아형에서는 빈번하게 발생하지만, 적혈구 골수의 상대적 저증식에 의해 특징화되는 RAEB 아형에서는 그렇지 않다 [Cazzola et al. (1982) Br J Haematol 50:55-62]. 철분 항상성의 결정적인 조절인자인 헵시딘의 순환 수준은 RAEB에서보다 RARS에서 약 1 크기 자릿수 낮다 [Santini et al. (2011) PLoS One 6:e23109]. 낮은 수준의 헵시딘이 철분 흡수를 증진하기 때문에, RARS 및 지중해빈혈과 같은 장애에서 계측된 부적절하게 낮은 수준의 헵시딘은 심지어 수혈의 부재에서도 이들 장애에서 관찰되는 철분 과부하를 설명하는 것으로 생각된다.

장기 적혈구 수혈은 빈혈을 경감하지만, 환자를 감염성 질환, 알레르기성 또는 용혈 반응, 그리고 철분 과부하의 악화를 비롯한 복수의 위험에 노출시킨다 [Rawn (2008) Curr Opin Anaesthesiol 21:664-668; Ozcan et al. (2013) Expert Rev Hematol 6:165-189]. 전신 철분 수준이 증가함에 따라서, 신체는 철분 저장을 위한 페리틴 생산을 증가시키고 트랜스페린 수용체 생산을 감소시켜 세포 내로 철분 진입을 감소시킨다. 순환하는 트랜스페린의 철 결합능이 초과될 때, 철분은 혈장 내에서 비-트랜스페린 결합된 철분 (NTBI)으로서 발견된다. MDS에서, 비-트랜스페린 결합된 철의 수준은 높은 위험 아형보다 낮은 위험 아형에서 더욱 높고 RARS에서 가장 높다 [Santini et al. (2011) PLoS One 6:e23109]. 철분이 신체로부터 능동적으로 분비될 수 없기 때문에, 이것은 초기에, 세망내피 대식세포 내에 축적되고, 그리고 추후, 일차적으로 심장, 간 및 내분비선의 실질성 세포에서 침적된다 [Siah et al. (2006) Clin Biochem Rev 27:5-16]. 철분 과부하의 조건 하에, 비-트랜스페린 결합된 철분은 불안정 혈장철로서 알려져 있는 이의 산화환원-활성 형태로 변하는데, 이것은 세포 내로 수송되고, 여기서 이것은 반응성 산소 종의 형성을 증진한다. 이들 고도로 독성 분자는 조혈에 부정적인 충격을 주고, 그리고 특히, 심장, 간 및 내분비 조직에 피해를 입힌다.

MDS 환자 개체군은 동시이환 질환 - 심부전증, 감염, 출혈, 그리고 간경화증에 대한 성향 포함 -을 앓는 노인으로 주로 구성되고, 그리고 철분 과부하가 이런 기존 질환을 급속히 악화시킬 수 있다. AML이 발생할 높은 위험에 처해 있는 MDS 환자와 비교하여, 낮은 또는 중간-1 위험에 처해 있는 환자는 그들의 더욱 긴 기대 수명으로 인해, 철분 과부하에 더욱 취약할 수 있다. 이들 이유로 인해, 철분 부담을 감소시키기 위한 철 킬레이트화 요법은 긴 기대 수명을 갖고 20회 이상 RBC 수혈을 제공받을 것으로 기대되는, 낮은- 또는 중간-1 위험 MDS 아형을 앓는 환자에서 권할만한 것으로 고려된다 [Temraz et al. (2014) Crit Rev Oncol Hematol 91:64-73].

신규한 염기서열결정 기술은 과거 수년간, MDS에서 재발성으로 돌연변이되는 수십 개 유전자의 확인을 야기하였다. 유형에 의해 분류된 이런 유전자의 2013 목록은 표 3에서 도시된다. 하나 또는 그 이상의 이런 돌연변이는 MDS를 앓는 거의 모든 환자에서 발견될 수 있고, 그리고 관련된 유전자의 본성을 이해하는 것은 비록 이것이 치료에 대한 어떠한 충격도 준 것은 아니지만, MDS가 어떻게 발생하고 진전하는 지에 관한 이해를 향상시켰다. MDS 환자 표본에 적용된 전체-유전체 염기서열결정은 mRNA 스플라이싱 (스플라이오솜) 인자를 인코딩하는 암-연관된 유전자의 완전하게 신규한 부류를 확인하였다. MDS에서 확인된 첫 번째 이런 유전자는 SF3B1인데, 이것은 RARS를 앓는 환자에서 특히 빈번하게 돌연변이된다 [Papaemmanuil et al. (2011) N Engl J Med 365:1384-1395]. 돌연변이된 유전자의 다른 주요 범주는 후성적 (DNA 메틸화) 조절인자, 전사 인자, 그리고 신호전달 분자이다 [Cazzola et al. (2013) Blood 122:4021-4034; Bejar et al. (2014) Blood 124:2793-2803]. MDS 환자에서 이들 돌연변이가 동시발생하는 정도는 유전자 유형에 따라 변하는 것으로 보인다. 가령, MDS 환자 중에서 대략 50%는 돌연변이 스플라이싱 인자를 인코딩하는 현재까지 확인된 10개 유전자 중에서 한 가지를 소유하지만, 이들 돌연변이 유전자는 동일한 환자에서 드물게 동시발생한다 [Bejar et al. (2014) Blood 124:2793-2803]. 따라서, 이들 돌연변이 유전자는 동일한 개체에 대한 극히 드문 잉여 마커이다. 돌연변이 후성적 조절인자를 인코딩하는 유전자는 서로 및 동일한 환자에서 돌연변이 스플라이싱 인자 유전자와 더욱 빈번하게 동시발생한다. 본원에서 개시된 바와 같이, 돌연변이 유전자, 예를 들면, 표 3에서 열거된 것들의 차별적 발생은 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 앓는 어떤 환자가 ActRII 길항제에 치료적으로 반응성 또는 무반응성일 가능성이 높은 지를 예측하는데 보조할 수 있는 유전자 서명을 제공한다.

표 3에서 열거된 유전자 중에서, 스플라이싱 인자 3B1을 인코딩하는 유전자 (SF3B1)는 최근에, MDS에서, 특히 RARS, RARS-T, 그리고 RCMD-RS 아형에서 결정적인 것으로 시사되었다 [Malcovati et al. (2011) Blood 118:6239-6246; Dolatshad et al. (2014) Leukemia doi: 10.1038/leu.2014.331 epub ahead of print]. SF3B1에서 체성 돌연변이는 또한, 만성 림프성 백혈병 (CLL) 및 급성 골수성 백혈병 (AML)을 비롯한 혈액학적 암에서뿐만 아니라 유방암, 췌장암, 위암, 전립선암 및 포도막 흑색종에서 발생한다 [Malcovati et al. (2011) Blood 118:6239-6246; Wang et al. (2011) N Engl J Med 365:2497-2506; The Cancer Genome Atlas Network (2012) Nature 490:61-70; Biankin et al. (2012) Nature 491:399-405; Chesnais et al. (2012) Oncotarget 3:1284-1293; Furney et al. (2013) Cancer Discov 3:1122-1129; Je et al. (2013) Int J Cancer 133:260-266]. 대부분이 단백질 내에 소수의 위치에서 군집되는 SF3B1 돌연변이의 스펙트럼이 임상적 표본에서 또는 높은 농도의 플라디에놀라이드에 노출된 세포주에서 확인되었다 [Webb et al. (2013) Drug Discov Today 18:43-49]. MDS에서 확인된 SF3B1 돌연변이는 예로서, K182E, E491G, R590K, E592K, R625C, R625G, N626D, N626S, H662Y, T663A, K666M, K666Q, K666R, Q670E, G676D, V701I, I704N, I704V, G740R, A744P, D781G, 그리고 A1188V를 포함한다. 암에서 확인된 SF3B1 돌연변이는 예로서, N619K, N626H, N626Y, R630S, I704T, G740E, K741N, G742D, D894G, Q903R, R1041H, 그리고 I1241T를 포함한다. 최종적으로, MDS 및 암 둘 모두에서 발견된 SF3B1 돌연변이는 예로서, G347V, E622D, Y623C, R625H, R625L, H662D, H662Q, T663I, K666E, K666N, K666T, K700E, 그리고 V701F를 포함한다.

본 명세서에서 이용된 용어는 일반적으로, 본 발명의 맥락 내에서 및 각 용어가 이용되는 특정한 맥락 내에서, 당분야에서 그들의 일상적인 의미를 갖는다. 일정한 용어는 본 발명의 조성물과 방법 및 이들을 어떻게 만들고 이용하는 지를 설명함에 있어서 의사에게 추가 보도를 제공하기 위해, 아래에서 또는 명세서 내에 다른 곳에서 논의된다. 용어의 임의의 이용의 범위 또는 의미는 이들이 이용되는 특정한 맥락으로부터 명백할 것이다.

모든 문법적 형태 및 스펠링 변이에서 "상동성"은 동일한 종의 생물체에서 상과로부터 단백질뿐만 아니라 상이한 종의 생물체로부터 동종 단백질을 비롯하여, "공통의 진화적 기원"을 소유하는 두 단백질 사이에 관계를 지칭한다. 이런 단백질 (및 이들의 인코딩 핵산)은 퍼센트 동일성의 면에서 또는 특정한 잔기 또는 모티프 및 보존된 위치의 존재에 의해서 인지에 상관없이, 그들의 서열 유사성에 의해 반영된 바와 같은 서열 상동성을 갖는다.

모든 이의 문법적 형태에서 용어 "서열 유사성"은 공통의 진화적 기원을 공유하거나 또는 공유하지 않을 수 있는 핵산 또는 아미노산 서열 사이에 동일성 또는 대응의 정도를 지칭한다.

하지만, 통상적인 용법에서 및 본 출원에서, 용어 "상동성"은 부사, 예를 들면, "고도로"로 수식될 때, 서열 유사성을 지칭할 수 있고, 그리고 공통의 진화적 기원에 관계하거나 또는 관계하지 않을 수 있다.

참조 폴리펩티드 (또는 뉴클레오티드) 서열에 대하여 "퍼센트 (%) 서열 동일성"은 서열을 정렬하고, 그리고 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 필요하면, 갭을 도입한 후, 임의의 보존성 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 참조 폴리펩티드 (뉴클레오티드) 서열 내에 아미노산 잔기 (또는 핵산)와 동일한, 후보 서열 내에 아미노산 잔기 (또는 핵산)의 백분율로서 규정된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 당분야의 기술 범위 안에 있는 다양한 방식으로, 예를 들면, 공개적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 하지만, 본원에서 목적을 위해, % 아미노산 (핵산) 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 산출된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 저술되었고, 그리고 소스 코드가 사용자 문서로 U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559에 제출되었는데, 여기서 이것은 U.S. Copyright 등록 번호 TXU510087 하에 등록된다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif.로부터 공개적으로 가용하거나, 또는 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 운영 체계에서 이용을 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 세팅되고 변하지 않는다.

모든 문법적 형태에서 "효현작용한다"는 단백질 및/또는 유전자를 활성화하는 (가령, 단백질의 유전자 발현을 활성화하거나 또는 증폭함으로써, 또는 비활성 단백질이 활성 상태로 들어가도록 유도함으로써) 또는 단백질의 및/또는 유전자의 활성을 증가시키는 과정을 지칭한다.

모든 문법적 형태에서 "길항작용한다"는 단백질 및/또는 유전자를 저해하는 (가령, 단백질의 유전자 발현을 저해하거나 또는 감소시킴으로써, 또는 활성 단백질이 비활성 상태로 들어가도록 유도함으로써) 또는 단백질의 및/또는 유전자의 활성을 감소시키는 과정을 지칭한다.

본원에서 이용된 바와 같이, 달리 명시되지 않으면, "X에 실제적으로 결합하지 않는다"는 "X"에 대한 약 10^-7, 10^-6, 10^-5, 10^-4, 또는 그 이상보다 큰 (가령, K_D를 결정하는데 이용된 검정에 의해 검출가능한 결합 없음) K_D를 갖거나, 또는 "X"에 대한 상대적으로 근소한 결합, 예를 들면, 약 1 x 10^-8 M 또는 약 1 x 10^-9 M을 갖는 작용제를 의미하는 것으로 의도된다.

명세서 및 청구항 전반에서 수치 값과 관련하여 이용될 때 용어 "약" 및 "대략"은 당업자에게 익숙하고 허용되는 정확도 구간을 표시한다. 일반적으로, 이런 정확도 구간은 ± 10%이다. 대안으로 및 특히, 생물학적 시스템에서, 용어 "약" 및 "대략"은 소정의 값의 1 크기 자릿수, 바람직하게는 ≤ 5-배 및 더욱 바람직하게는 ≤ 2-배 범위 안에 있는 값을 의미할 수 있다.

본원에서 개시된 수치 범위는 이들 범위를 규정하는 숫자를 포괄한다.

단수 ("a" 및 "an")는 상기 용어가 이용되는 맥락에서 명확하게 달리 구술되지 않으면, 복수 지시대상을 포함한다. 단수 ("a" 또는 "an"), "하나 또는 그 이상" 및 "최소한 하나"는 본원에서 교체가능하게 이용될 수 있다. 게다가, "및/또는"는 본원에서 이용되는 경우에, 다른 특질 또는 성분과 함께 또는 다른 특질 또는 성분 없이 2개 또는 그 이상의 특정된 특질 또는 성분 각각의 특정한 개시로서 간주된다. 따라서, 본원에서 관용구, 예를 들면, "A 및/또는 B"에서 이용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A와 B," "A 또는 B," "A (단독)", 그리고 "B" (단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 유사하게, 관용구, 예를 들면, "A, B 및/또는 C"에서 이용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 다음의 양상 각각을 포괄하는 것으로 의도된다: A, B, 그리고 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A와 C; A와 B; B와 C; A (단독); B (단독); 그리고 C (단독).

본 명세서 전반에서, 단어 "포함한다" 또는 변이, 예를 들면, "포함한다" 또는 "포함하는"은 언급된 완전체 또는 완전체의 군의 포함, 하지만 임의의 다른 완전체 또는 완전체의 군의 배제하지 않음을 암시하는 것으로 이해될 것이다.

2. ActRII 길항제

본원에서 제공된 데이터는 ActRII의 길항제 (저해제) (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB SMAD 2/3 및/또는 SMAD 1/5/8 신호전달의 길항제)가 생체내에서 적혈구 수준을 증가시키고 다른 유익성을 환자에 제공하는데 이용될 수 있다는 것을 증명한다. 특히, 이런 ActRII 길항제는 다양한 빈혈뿐만 아니라 MDS 및 철적혈모구 빈혈의 다양한 합병증 (가령, 장애/질환)을 치료하는데 효과적인 것으로 본원에서 확인된다. 따라서, 본 발명은 부분적으로, 단독으로, 또는 하나 또는 그 이상의 적혈구생성 자극제 (가령, EPO) 또는 다른 지지 요법 [가령, 조혈 성장 인자 (가령, G-CSF 또는 GM-CSF), 적혈구 또는 전혈의 수혈, 철 킬레이트화 요법]과 합동으로, 치료가 필요한 개체에서 적혈구 수준을 증가시키고, 치료가 필요한 개체에서 빈혈을 치료하거나 예방하고 (가령, 수혈 부담의 감소 포함), 치료가 필요한 개체에서 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하고 및/또는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증 (가령, 빈혈, 수혈 요구, 호중구감소증, 철분 과부하, 급성 심근 경색, 간부전, 간비대, 비장비대, 급성 골수성 림프종으로의 진행)을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 개체에서 SF3B1, DNMT3A 및/또는 TET2 돌연변이와 연관된 장애를 치료하거나 예방하는데 이용될 수 있는 다양한 ActRII 길항제 작용제를 제공한다.

일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 방법에 따라서 이용되는 바람직한 ActRII 길항제는 GDF-ActRII 길항제 (가령, GDF-매개된 ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 길항제, 특히 GDF11- 및/또는 GDF8-매개된 ActRII 신호전달의 길항제)이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 바람직한 ActRII 길항제는 가용성 ActRII 폴리펩티드 (가령, 가용성 ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드) 및 GDF 트랩 폴리펩티드, 예를 들면, ActRIIA-Fc 융합 단백질, ActRIIB-Fc 융합 단백질, 그리고 GDF 트랩-Fc 융합 단백질이다.

비록 본 발명의 가용성 ActRII 폴리펩티드 및 GDF 트랩 폴리펩티드가 GDF (가령, GDF11 및/또는 GDF8) 길항작용 이외의 기전을 통해 적혈구 수준 및/또는 MDS 및 철적혈모구 빈혈의 다양한 합병증에 영향을 줄 수 있긴 하지만 [가령, GDF11 및/또는 GDF8 저해는 아마도, TGF-베타 상과의 다른 구성원 (가령, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7 및/또는 Nodal)을 비롯한 추가 작용제 스펙트럼의 활성을 저해하는 작용제의 성향의 지표일 수 있고, 그리고 이런 집합적인 저해는 예로서, 조혈에 대한 원하는 효과를 야기할 수 있다], 예로서 항-GDF11 항체; 항-GDF8 항체; 항-액티빈 A, B, C 및/또는 E 항체, 항-ActRIIA 항체; 항-ActRIIB 항체; 항-ActRIIA/IIB 항체, 안티센스, RNAi, 또는 GDF11, GDF8, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 생산을 저해하는 리보자임 핵산; 그리고 GDF11, GDF8, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 다른 저해제 (가령, 소형 분자 저해제), 특히 GDF11- 및/또는 GDF8-ActRIIA 결합 및/또는 GDF11- 및/또는 GDF8-ActRIIB 결합을 교란하는 작용제뿐만 아니라 GDF11, GDF8, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 발현을 저해하는 작용제를 비롯한 다른 유형의 GDF-ActRII 길항제가 유용할 것으로 예상된다. 임의선택적으로, 본 발명의 GDF-ActRII 길항제는 예로서, 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7 및/또는 Nodal을 비롯한 다른 ActRII 리간드에 결합하고 및/또는 이들의 활성 (또는 발현)을 저해할 수 있다. 임의선택적으로, 본 발명의 GDF-ActRII 길항제는 예로서, 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7 및/또는 Nodal을 비롯한 하나 또는 그 이상의 추가 ActRII 리간드에 결합하고 및/또는 이들의 활성 (또는 발현)을 저해하는 최소한 하나의 추가 ActRII 길항제 작용제와 합동으로 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법에 따라서 이용되는 ActRII 길항제는 액티빈 A에 실제적으로 결합하지 않고 및/또는 액티빈 A 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 액티빈 A-매개된 활성화)을 저해하지 않는다.

A. ActRII 폴리펩티드 및 GDF 트랩

일정한 양상에서, 본 발명은 ActRII 폴리펩티드에 관계한다. 특히, 본 발명은 예로서, 치료가 필요한 개체에서 적혈구 수준을 증가시키고, 치료가 필요한 개체에서 빈혈을 치료하거나 예방하고 (가령, 수혈 부담의 감소 포함), 치료가 필요한 개체에서 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하고 및/또는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증 (가령, 빈혈, 수혈 요구, 호중구감소증, 철분 과부하, 급성 심근 경색, 간부전, 간비대, 비장비대, 급성 골수성 림프종으로의 진행)을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 개체에서 SF3B1, DNMT3A 및/또는 TET2 돌연변이와 연관된 장애를 치료하거나 예방하기 위해, 단독으로, 또는 하나 또는 그 이상의 적혈구생성 자극제 (가령, EPO) 또는 다른 지지 요법 [가령, 조혈 성장 인자 (가령, G-CSF 또는 GM-CSF), 적혈구 또는 전혈의 수혈, 철 킬레이트화 요법]과 합동으로 ActRII 폴리펩티드를 이용하는 방법을 제공한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "ActRII"은 유형 II 액티빈 수용체의 패밀리를 지칭한다. 이러한 패밀리는 액티빈 수용체 유형 IIA 및 액티빈 수용체 유형 IIB 둘 모두를 포함한다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "ActRIIB"는 임의의 종으로부터 액티빈 수용체 유형 IIB (ActRIIB) 단백질, 그리고 돌연변이유발 또는 다른 변형에 의해 이런 ActRIIB 단백질로부터 유래된 변이체의 패밀리를 지칭한다. 본원에서 ActRIIB에 대한 언급은 현재 확인된 형태 중에서 한 가지에 대한 언급인 것으로 이해된다. ActRIIB 패밀리의 구성원은 일반적으로, 시스테인-풍부한 영역을 포함하는 리간드-결합 세포외 도메인, 막경유 도메인, 그리고 예측된 세린/트레오닌 키나아제 활성을 갖는 세포질 도메인으로 구성된 막경유 단백질이다.

용어 "ActRIIB 폴리펩티드"는 ActRIIB 패밀리 구성원의 임의의 자연발생 폴리펩티드뿐만 아니라 유용한 활성을 유지하는 이의 임의의 변이체 (돌연변이체, 단편, 융합 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 이런 변이체 ActRIIB 폴리펩티드의 실례는 본 발명 전역에서뿐만 아니라 전체적으로 본원에 참조로서 편입되는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2006/012627에서 제공된다. 임의선택적으로, 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드는 개체에서 적혈구 수준을 증가시키는데 이용될 수 있다. 본원에서 설명된 모든 ActRIIB-관련된 폴리펩티드에 대한 아미노산의 넘버링은 달리 특정적으로 지정되지 않으면, 아래에 제공된 인간 ActRIIB 전구체 단백질 서열 (서열 번호:1)의 넘버링에 근거된다.

인간 ActRIIB 전구체 단백질 서열은 다음과 같다:

1 MTAPWVALAL LWGSLCAGS G RGEAETRECI YYNANWELER T N QSGLERCE

51 GEQDKRLHCY ASWR N SSGTI ELVKKGCWLD DFNCYDRQEC VATEENPQVY

101 FCCCEGNFCN ERFTHLPEAG GPEVTYEPPP TAPTLLTVLA YSLLPIGGLS

151 LIVLLAFWMY RHRKPPYGHV DIHEDPGPPP PSPLVGLKPL QLLEIKARGR

201 FGCVWKAQLM NDFVAVKIFP LQDKQSWQSE REIFSTPGMK HENLLQFIAA

251 EKRGSNLEVE LWLITAFHDK GSLTDYLKGN IITWNELCHV AETMSRGLSY

301 LHEDVPWCRG EGHKPSIAHR DFKSKNVLLK SDLTAVLADF GLAVRFEPGK

351 PPGDTHGQVG TRRYMAPEVL EGAINFQRDA FLRIDMYAMG LVLWELVSRC

401 KAADGPVDEY MLPFEEEIGQ HPSLEELQEV VVHKKMRPTI KDHWLKHPGL

451 AQLCVTIEEC WDHDAEARLS AGCVEERVSL IRRSVNGTTS DCLVSLVTSV

501 TNVDLPPKES SI (서열 번호:1)

신호 펩티드는 단일 밑줄로 표시된다; 세포외 도메인은 굵은 글꼴로 표시된다; 그리고 잠재적, 내인성 N-연결된 당화 부위는 이중 밑줄로 표시된다.

처리된 가용성 (세포외) 인간 ActRIIB 폴리펩티드 서열은 다음과 같다:

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (서열 번호:2).

일부 구체예에서, 상기 단백질은 N 말단에서 "SGR…" 서열로 생산될 수 있다. 세포외 도메인의 C 말단 "꼬리"는 단일 밑줄에 의해 표시된다. "꼬리" 결실된 서열 (△15 서열)은 다음과 같다:

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEA (서열 번호:3).

서열 번호:1의 위치 64에서 알라닌(A64)을 갖는 ActRIIB의 형태 역시 기존 문헌에서 보고된다 [가령, Hilden et al. (1994) Blood, 83(8): 2163-2170을 참조한다]. 출원인은 A64 치환을 갖는 ActRIIB의 세포외 도메인을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질이 액티빈 및 GDF11에 대한 상대적으로 낮은 친화성을 갖는다는 것을 확인하였다. 대조적으로, 위치 64에서 아르기닌 (R64)을 갖는 동일한 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 낮은 나노몰 내지 높은 피코몰 범위에서 액티빈 및 GDF11에 대한 친화성을 갖는다. 이런 이유로, R64를 갖는 서열은 본 발명에서 인간 ActRIIB에 대한 "야생형" 참조 서열로서 이용된다.

위치 64에서 알라닌을 갖는 ActRIIB의 형태는 다음과 같다:

1 MTAPWVALAL LWGSLCAGS G RGEAETRECI YYNANWELER TNQSGLERCE

51 GEQDKRLHCY ASWANSSGTI ELVKKGCWLD DFNCYDRQEC VATEENPQVY

101 FCCCEGNFCN ERFTHLPEAG GPEVTYEPPP TAPTLLTVLA YSLLPIGGLS

151 LIVLLAFWMY RHRKPPYGHV DIHEDPGPPP PSPLVGLKPL QLLEIKARGR

201 FGCVWKAQLM NDFVAVKIFP LQDKQSWQSE REIFSTPGMK HENLLQFIAA

251 EKRGSNLEVE LWLITAFHDK GSLTDYLKGN IITWNELCHV AETMSRGLSY

301 LHEDVPWCRG EGHKPSIAHR DFKSKNVLLK SDLTAVLADF GLAVRFEPGK

351 PPGDTHGQVG TRRYMAPEVL EGAINFQRDA FLRIDMYAMG LVLWELVSRC

401 KAADGPVDEY MLPFEEEIGQ HPSLEELQEV VVHKKMRPTI KDHWLKHPGL

451 AQLCVTIEEC WDHDAEARLS AGCVEERVSL IRRSVNGTTS DCLVSLVTSV

501 TNVDLPPKES SI (서열 번호:4).

신호 펩티드는 단일 밑줄에 의해 표시되고, 그리고 세포외 도메인은 굵은 글꼴에 의해 표시된다.

대안적 A64 형태의 처리된 가용성 (세포외) ActRIIB 폴리펩티드 서열은 다음과 같다:

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (서열 번호:5).

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEA (서열 번호:6).

ActRIIB 전구체의 아미노산 1-513을 인코딩하는, Genbank 참조 서열 NM_001106.3의 뉴클레오티드 25-1560으로 구성되는 인간 ActRIIB 전구체 단백질을 인코딩하는 핵산 서열 (서열 번호: 7)은 아래에 도시된다. 보여지는 바와 같은 서열은 위치 64에서 아르기닌을 제공하고, 그리고 그 대신에 알라닌을 제공하도록 변형될 수 있다. 신호 서열은 밑줄 표시된다.

1 ATGACGGCGC CCTGGGTGGC CCTCGCCCTC CTCTGGGGAT CGCTGTGCGC

51 CGGCTCTGGG CGTGGGGAGG CTGAGACACG GGAGTGCATC TACTACAACG

101 CCAACTGGGA GCTGGAGCGC ACCAACCAGA GCGGCCTGGA GCGCTGCGAA

151 GGCGAGCAGG ACAAGCGGCT GCACTGCTAC GCCTCCTGGC GCAACAGCTC

201 TGGCACCATC GAGCTCGTGA AGAAGGGCTG CTGGCTAGAT GACTTCAACT

251 GCTACGATAG GCAGGAGTGT GTGGCCACTG AGGAGAACCC CCAGGTGTAC

301 TTCTGCTGCT GTGAAGGCAA CTTCTGCAAC GAACGCTTCA CTCATTTGCC

351 AGAGGCTGGG GGCCCGGAAG TCACGTACGA GCCACCCCCG ACAGCCCCCA

401 CCCTGCTCAC GGTGCTGGCC TACTCACTGC TGCCCATCGG GGGCCTTTCC

451 CTCATCGTCC TGCTGGCCTT TTGGATGTAC CGGCATCGCA AGCCCCCCTA

501 CGGTCATGTG GACATCCATG AGGACCCTGG GCCTCCACCA CCATCCCCTC

551 TGGTGGGCCT GAAGCCACTG CAGCTGCTGG AGATCAAGGC TCGGGGGCGC

601 TTTGGCTGTG TCTGGAAGGC CCAGCTCATG AATGACTTTG TAGCTGTCAA

651 GATCTTCCCA CTCCAGGACA AGCAGTCGTG GCAGAGTGAA CGGGAGATCT

701 TCAGCACACC TGGCATGAAG CACGAGAACC TGCTACAGTT CATTGCTGCC

751 GAGAAGCGAG GCTCCAACCT CGAAGTAGAG CTGTGGCTCA TCACGGCCTT

801 CCATGACAAG GGCTCCCTCA CGGATTACCT CAAGGGGAAC ATCATCACAT

851 GGAACGAACT GTGTCATGTA GCAGAGACGA TGTCACGAGG CCTCTCATAC

901 CTGCATGAGG ATGTGCCCTG GTGCCGTGGC GAGGGCCACA AGCCGTCTAT

951 TGCCCACAGG GACTTTAAAA GTAAGAATGT ATTGCTGAAG AGCGACCTCA

1001 CAGCCGTGCT GGCTGACTTT GGCTTGGCTG TTCGATTTGA GCCAGGGAAA

1051 CCTCCAGGGG ACACCCACGG ACAGGTAGGC ACGAGACGGT ACATGGCTCC

1101 TGAGGTGCTC GAGGGAGCCA TCAACTTCCA GAGAGATGCC TTCCTGCGCA

1151 TTGACATGTA TGCCATGGGG TTGGTGCTGT GGGAGCTTGT GTCTCGCTGC

1201 AAGGCTGCAG ACGGACCCGT GGATGAGTAC ATGCTGCCCT TTGAGGAAGA

1251 GATTGGCCAG CACCCTTCGT TGGAGGAGCT GCAGGAGGTG GTGGTGCACA

1301 AGAAGATGAG GCCCACCATT AAAGATCACT GGTTGAAACA CCCGGGCCTG

1351 GCCCAGCTTT GTGTGACCAT CGAGGAGTGC TGGGACCATG ATGCAGAGGC

1401 TCGCTTGTCC GCGGGCTGTG TGGAGGAGCG GGTGTCCCTG ATTCGGAGGT

1451 CGGTCAACGG CACTACCTCG GACTGTCTCG TTTCCCTGGT GACCTCTGTC

1501 ACCAATGTGG ACCTGCCCCC TAAAGAGTCA AGCATC

(서열 번호: 7).

처리된 가용성 (세포외) 인간 ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 (서열 번호: 8)은 다음과 같다. 보여지는 바와 같은 서열은 위치 64에서 아르기닌을 제공하고, 그리고 그 대신에 알라닌을 제공하도록 변형될 수 있다.

1 GGGCGTGGGG AGGCTGAGAC ACGGGAGTGC ATCTACTACA ACGCCAACTG

51 GGAGCTGGAG CGCACCAACC AGAGCGGCCT GGAGCGCTGC GAAGGCGAGC

101 AGGACAAGCG GCTGCACTGC TACGCCTCCT GGCGCAACAG CTCTGGCACC

151 ATCGAGCTCG TGAAGAAGGG CTGCTGGCTA GATGACTTCA ACTGCTACGA

201 TAGGCAGGAG TGTGTGGCCA CTGAGGAGAA CCCCCAGGTG TACTTCTGCT

251 GCTGTGAAGG CAACTTCTGC AACGAACGCT TCACTCATTT GCCAGAGGCT

301 GGGGGCCCGG AAGTCACGTA CGAGCCACCC CCGACAGCCC CCACC

(서열 번호:8).

일정한 구체예에서, 본 발명은 ActRIIA 폴리펩티드에 관계한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "ActRIIA"는 임의의 종으로부터 액티빈 수용체 유형 IIA (ActRIIA) 단백질, 그리고 돌연변이유발 또는 다른 변형에 의해 이런 ActRIIA 단백질로부터 유래된 변이체의 패밀리를 지칭한다. 본원에서 ActRIIA에 대한 언급은 현재 확인된 형태 중에서 한 가지에 대한 언급인 것으로 이해된다. ActRIIA 패밀리의 구성원은 일반적으로, 시스테인-풍부한 영역을 포함하는 리간드-결합 세포외 도메인, 막경유 도메인, 그리고 예측된 세린/트레오닌 키나아제 활성을 갖는 세포질 도메인으로 구성된 막경유 단백질이다.

용어 "ActRIIA 폴리펩티드"는 ActRIIA 패밀리 구성원의 임의의 자연발생 폴리펩티드뿐만 아니라 유용한 활성을 유지하는 이의 임의의 변이체 (돌연변이체, 단편, 융합 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 이런 변이체 ActRIIA 폴리펩티드의 실례는 본 발명 전역에서뿐만 아니라 전체적으로 본원에 참조로서 편입되는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2006/012627에서 제공된다. 임의선택적으로, 본 발명의 ActRIIA 폴리펩티드는 개체에서 적혈구 수준을 증가시키는데 이용될 수 있다. 본원에서 설명된 모든 ActRIIA-관련된 폴리펩티드에 대한 아미노산의 넘버링은 달리 특정적으로 지정되지 않으면, 아래에 제공된 인간 ActRIIA 전구체 단백질 서열 (서열 번호:9)의 넘버링에 근거된다.

인간 ActRIIA 전구체 단백질 서열은 다음과 같다:

1 MGAAAKLAFA VFLISCSSGA ILGRSETQEC LFFNANWEKD RT N QTGVEPC

51 YGDKDKRRHC FATWK N ISGS IEIVKQGCWL DDINCYDRTD CVEKKDSPEV

101 YFCCCEGNMC NEKFSYFPEM EVTQPTSNPV TPKPPYYNIL LYSLVPLMLI

151 AGIVICAFWV YRHHKMAYPP VLVPTQDPGP PPPSPLLGLK PLQLLEVKAR

201 GRFGCVWKAQ LLNEYVAVKI FPIQDKQSWQ NEYEVYSLPG MKHENILQFI

251 GAEKRGTSVD VDLWLITAFH EKGSLSDFLK ANVVSWNELC HIAETMARGL

301 AYLHEDIPGL KDGHKPAISH RDIKSKNVLL KNNLTACIAD FGLALKFEAG

351 KSAGDTHGQV GTRRYMAPEV LEGAINFQRD AFLRIDMYAM GLVLWELASR

401 CTAADGPVDE YMLPFEEEIG QHPSLEDMQE VVVHKKKRPV LRDYWQKHAG

451 MAMLCETIEE CWDHDAEARL SAGCVGERIT QMQRLTNIIT TEDIVTVVTM

501 VTNVDFPPKE SSL (서열 번호:9)

신호 펩티드는 단일 밑줄에 의해 표시된다; 세포외 도메인은 굵은 글꼴로 표시된다; 그리고 잠재적, 내인성 N-연결된 당화 부위는 이중 밑줄에 의해 표시된다.

처리된 가용성 (세포외) 인간 ActRIIA 폴리펩티드 서열은 다음과 같다:

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPP (서열 번호:10)

세포외 도메인의 C 말단 "꼬리"는 단일 밑줄에 의해 표시된다. "꼬리" 결실된 서열 (△15 서열)은 다음과 같다:

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEM (서열 번호:11)

Genbank 참조 서열 NM_001616.4의 뉴클레오티드 159-1700로서, 인간 ActRIIA 전구체 단백질을 인코딩하는 핵산 서열 (서열 번호: 12)은 아래에 도시된다. 신호 서열은 밑줄 표시된다.

1 atgggagctg ctgcaaagtt ggcgtttgcc gtctttctta tctcctgttc

51 ttcaggtgct atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta

101 atgctaattg ggaaaaagac agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt

151 tatggtgaca aagataaacg gcggcattgt tttgctacct ggaagaatat

201 ttctggttcc attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg gatgatatca

251 actgctatga caggactgat tgtgtagaaa aaaaagacag ccctgaagta

301 tatttttgtt gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt

351 tccggagatg gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc

401 caccctatta caacatcctg ctctattcct tggtgccact tatgttaatt

451 gcggggattg tcatttgtgc attttgggtg tacaggcatc acaagatggc

501 ctaccctcct gtacttgttc caactcaaga cccaggacca cccccacctt

551 ctccattact aggtttgaaa ccactgcagt tattagaagt gaaagcaagg

601 ggaagatttg gttgtgtctg gaaagcccag ttgcttaacg aatatgtggc

651 tgtcaaaata tttccaatac aggacaaaca gtcatggcaa aatgaatacg

701 aagtctacag tttgcctgga atgaagcatg agaacatatt acagttcatt

751 ggtgcagaaa aacgaggcac cagtgttgat gtggatcttt ggctgatcac

801 agcatttcat gaaaagggtt cactatcaga ctttcttaag gctaatgtgg

851 tctcttggaa tgaactgtgt catattgcag aaaccatggc tagaggattg

901 gcatatttac atgaggatat acctggccta aaagatggcc acaaacctgc

951 catatctcac agggacatca aaagtaaaaa tgtgctgttg aaaaacaacc

1001 tgacagcttg cattgctgac tttgggttgg ccttaaaatt tgaggctggc

1051 aagtctgcag gcgataccca tggacaggtt ggtacccgga ggtacatggc

1101 tccagaggta ttagagggtg ctataaactt ccaaagggat gcatttttga

1151 ggatagatat gtatgccatg ggattagtcc tatgggaact ggcttctcgc

1201 tgtactgctg cagatggacc tgtagatgaa tacatgttgc catttgagga

1251 ggaaattggc cagcatccat ctcttgaaga catgcaggaa gttgttgtgc

1301 ataaaaaaaa gaggcctgtt ttaagagatt attggcagaa acatgctgga

1351 atggcaatgc tctgtgaaac cattgaagaa tgttgggatc acgacgcaga

1401 agccaggtta tcagctggat gtgtaggtga aagaattacc cagatgcaga

1451 gactaacaaa tattattacc acagaggaca ttgtaacagt ggtcacaatg

1501 gtgacaaatg ttgactttcc tcccaaagaa tctagtcta

(서열 번호:12)

처리된 가용성 (세포외) 인간 ActRIIA 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 다음과 같다:

1 atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta atgctaattg

51 ggaaaaagac agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt tatggtgaca

101 aagataaacg gcggcattgt tttgctacct ggaagaatat ttctggttcc

151 attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg gatgatatca actgctatga

201 caggactgat tgtgtagaaa aaaaagacag ccctgaagta tatttttgtt

251 gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt tccggagatg

301 gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc caccc

(서열 번호:13).

인간 ActRIIB 가용성 세포외 도메인 및 인간 ActRIIA 가용성 세포외 도메인의 아미노산 서열의 정렬은 도면 1에서 예시된다. 이러한 정렬은 ActRII 리간드에 직접적으로 접촉하는 것으로 생각되는 양쪽 수용체 내에 아미노산 잔기를 지시한다. 도면 2는 다양한 척추동물 ActRIIB 단백질 및 인간 ActRIIA의 복수 서열 정렬을 보여준다. 이들 정렬로부터 정상적인 ActRII-리간드 결합 활성에 중요한 리간드-결합 도메인 내에 핵심 아미노산 위치를 예측할 뿐만 아니라 정상적인 ActRII-리간드 결합 활성을 유의미하게 변경하지 않으면서 치환에 내성일 가능성이 높은 아미노산 위치를 예측하는 것이 가능하다.

다른 양상에서, 본 발명은 예로서, 치료가 필요한 개체에서 적혈구 수준을 증가시키고, 치료가 필요한 개체에서 빈혈을 치료하거나 예방하고 (가령, 수혈 부담의 감소 포함), 치료가 필요한 개체에서 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하고 및/또는 치료가 필요한 개체에서 MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증 (가령, 빈혈, 수혈 요구, 호중구감소증, 철분 과부하, 급성 심근 경색, 간부전, 간비대, 비장비대, 급성 골수성 림프종으로의 진행)을 치료하거나 예방하기 위해, 단독으로, 또는 하나 또는 그 이상의 적혈구생성 자극제 (가령, EPO) 또는 다른 지지 요법 [가령, 조혈 성장 인자 (가령, G-CSF 또는 GM-CSF), 적혈구 또는 전혈의 수혈, 철 킬레이트화 요법]과 합동으로 이용될 수 있는 GDF 트랩 폴리펩티드 ("GDF 트랩"으로서 또한 지칭됨)에 관계한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 GDF 트랩은 변이체 ActRII 폴리펩티드가 상응하는 야생형 ActRII 폴리펩티드보다 하나 또는 그 이상의 변경된 리간드-결합 활성을 갖도록, ActRII 폴리펩티드 (가령, "야생형" ActRII 폴리펩티드)의 세포외 도메인 (리간드-결합 도메인으로서 또한 지칭됨) 내에 하나 또는 그 이상의 돌연변이 (가령, 아미노산 부가, 결실, 치환, 그리고 이들의 조합)를 포함하는 가용성, 변이체 ActRII 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드)이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 GDF 트랩 폴리펩티드는 상응하는 야생형 ActRII 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 또는 ActRIIB 폴리펩티드)와 유사한 최소한 하나의 활성을 유지한다. 가령, GDF 트랩은 하나 또는 그 이상의 ActRII 리간드에 결합하고 및/또는 이들의 기능을 저해할 수 있다 (가령, 길항작용할 수 있다) (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 및/또는 SMAD 1/5/8 신호전달 경로의 ActRII 리간드-매개된 활성화를 저해할 수 있다). 일부 구체예에서, 본 발명의 GDF 트랩은 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, Nodal, GDF8, GDF11, BMP6 및/또는 BMP7 중에서 하나 또는 그 이상에 결합하고 및/또는 이를 저해한다.

일정한 구체예에서, 본 발명의 GDF 트랩 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 특정한 ActRII 리간드 (가령, GDF8, GDF11, BMP6, Nodal 및/또는 BMP7)에 대한 상승된 결합 친화성을 갖는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 GDF 트랩 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 특정한 ActRII 리간드 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C 및/또는 액티빈 E)에 대한 감소된 결합 친화성을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 GDF 트랩 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 특정한 ActRII 리간드에 대한 상승된 결합 친화성 및 하나 또는 그 이상의 상이한/다른 ActRII 리간드에 대한 감소된 결합 친화성을 갖는다. 따라서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 ActRII 리간드에 대한 변경된 결합 특이성을 갖는 GDF 트랩 폴리펩티드를 제공한다.

일정한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 GDF 트랩은 예로서, 야생형 ActRII 폴리펩티드와 비교하여 GDF11 및/또는 GDF8 (미오스타틴으로서 또한 알려져 있음)에 우선적으로 결합하고 및 이를 길항작용하도록 설계된다. 임의선택적으로, 이런 GDF11 및/또는 GDF8-결합 트랩은 Nodal, GDF8, GDF11, BMP6 및/또는 BMP7 중에서 하나 또는 그 이상에 더욱 결합하고 및/또는 이를 길항작용할 수 있다. 임의선택적으로, 이런 GDF11 및/또는 GDF8-결합 트랩은 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, Nodal, GDF8, GDF11, BMP6 및/또는 BMP7 중에서 하나 또는 그 이상에 더욱 결합하고 및/또는 이를 길항작용할 수 있다. 임의선택적으로, 이런 GDF11 및/또는 GDF8-결합 트랩은 액티빈 A, 액티빈 A/B, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, Nodal, GDF8, GDF11, BMP6 및/또는 BMP7 중에서 하나 또는 그 이상에 더욱 결합하고 및/또는 이를 길항작용할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 GDF 트랩은 예로서, 야생형 ActRII 폴리펩티드와 비교하여 액티빈 (가령, 액티빈 A, 액티빈 A/B, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E )에 대한 축소된 결합 친화성을 갖는다. 일정한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 GDF 트랩 폴리펩티드는 액티빈 A에 대한 축소된 결합 친화성을 갖는다.

가령, 본 발명은 액티빈 A에 비하여 GDF8/GDF11에 우선적으로 결합하고 및/또는 이를 길항작용하는 GDF 트랩 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 실례에 의해 증명된 바와 같이, 이런 GDF 트랩 폴리펩티드는 액티빈 A에 대한 높은 결합 친화성을 유지하는 ActRII 폴리펩티드와 비교하여 생체내에서 적혈구생성의 더욱 강력한 활성체이다. 게다가, 이들 비-액티빈-A-결합 GDF 트랩 폴리펩티드는 다른 조직에 대한 감소된 효과를 보여준다. 이런 이유로, 이런 GDF 트랩은 액티빈 A에 결합하고/이를 길항하는 것과 연관된 잠재적인 부정확한 효과를 감소시키면서 개체에서 적혈구 수준을 증가시키는데 유용할 수 있다. 하지만, 이런 선택적 GDF 트랩 폴리펩티드는 치료 효과를 위해 적혈구 수준에서 더욱 근소한 증가가 필요한 일부 적용 및 일부 수준의 부정확한 효과가 허용되는 (또는 심지어 바람직한) 일부 적용에서 덜 바람직할 수 있다.

ActRIIB 단백질의 아미노산 잔기 (가령, E39, K55, Y60, K74, W78, L79, D80, 및 F101)는 ActRIIB 리간드-결합 주머니 내에 있고, 그리고 예로서, 액티빈 A, GDF11 및 GDF8을 비롯한 이의 리간드에 대한 매개된 결합에 도움을 준다. 따라서 본 발명은 아미노산 잔기에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함하는, ActRIIB 수용체의 변경된-리간드 결합 도메인 (가령, GDF8/GDF11-결합 도메인)을 포함하는 GDF 트랩 폴리펩티드를 제공한다.

임의선택적으로, 변경된 리간드-결합 도메인은 ActRIIB 수용체의 야생형 리간드-결합 도메인에 비하여, 리간드, 예를 들면, GDF11 및/또는 GDF8에 대한 증가된 선택성을 가질 수 있다. 예시로서, 하나 또는 그 이상의 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C 및/또는 액티빈 A), 특히 액티빈 A에 비하여 GDF11 및/또는 GDF8에 대한 변경된 리간드-결합 도메인의 선택성을 증가시키는 하나 또는 그 이상의 돌연변이가 선별될 수 있다. 임의선택적으로, 변경된 리간드-결합 도메인은 야생형 리간드-결합 도메인에 대한 비율에 비하여 최소한 2-, 5-, 10-, 20-, 50-, 100-, 또는 심지어 1000-배 큰, 액티빈 결합에 대한 K_d 대 GDF11 및/또는 GDF8 결합에 대한 K_d의 비율을 갖는다. 임의선택적으로, 변경된 리간드-결합 도메인은 야생형 리간드-결합 도메인에 비하여 최소한 2-, 5-, 10-, 20-, 50-, 100-, 또는 심지어 1000-배 큰, 액티빈 저해에 대한 IC₅₀ 대 GDF11 및/또는 GDF8 저해에 대한 IC₅₀의 비율을 갖는다. 임의선택적으로, 변경된 리간드-결합 도메인은 액티빈 저해에 대한 IC₅₀보다 최소한 2-, 5-, 10-, 20-, 50-, 100- 또는 심지어 1000 배 적은 IC₅₀으로 GDF11 및/또는 GDF8을 저해한다.

특정한 실례로서, ActRIIB의 리간드-결합 도메인의 양성으로 하전된 아미노산 잔기 Asp (D80)는 GDF8에 우선적으로 결합하지만 액티빈에는 그렇지 않은 GDF 트랩 폴리펩티드를 생산하기 위해 상이한 아미노산 잔기로 돌연변이될 수 있다. 바람직하게는, 서열 번호:1에 대하여 D80 잔기가 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 아미노산 잔기로 변화된다: 하전되지 않은 아미노산 잔기, 음성 아미노산 잔기, 그리고 소수성 아미노산 잔기. 추가의 특정한 실례로서, 서열 번호:1의 소수성 잔기 L79는 변경된 액티빈-GDF11/GDF8 결합 성질을 부여하도록 변경될 수 있다. 가령, L79P 치환은 액티빈 결합보다 더욱 큰 정도로 GDF11 결합을 감소시킨다. 대조적으로, 산성 아미노산으로 L79의 대체 [아스파르트산 또는 글루타민산; L79D 또는 L79E 치환]은 GDF11 결합 친화성을 유지하면서 액티빈 A 결합 친화성을 크게 감소시킨다. 예시적인 구체예에서, 본원에서 설명된 방법은 임의선택적으로, 하나 또는 그 이상의 추가 아미노산 치환, 부가, 또는 결실과 합동으로 서열 번호: 1의 위치 79에 상응하는 위치에서 산성 아미노산 (가령, D 또는 E)을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드인 GDF 트랩 폴리펩티드를 활용한다.

당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 본원에서 설명된 돌연변이, 변이체 또는 변형 중에서 대부분은 핵산 수준에서 또는, 일부 경우에, 번역후 변형 또는 화학적 합성에 의해 만들어질 수 있다. 이런 기술은 당분야에서 널리 공지되고, 그리고 이들 중에서 일부가 본원에서 설명된다.

일정한 구체예에서, 본 발명은 가용성 ActRII 폴리펩티드인 ActRII 폴리펩티드 (ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드)에 관계한다. 본원에서 설명된 바와 같이, 용어 "가용성 ActRII 폴리펩티드"는 일반적으로, ActRII 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "가용성 ActRII 폴리펩티드"는 ActRII 단백질의 임의의 자연발생 세포외 도메인뿐만 아니라 유용한 활성을 유지하는 이의 임의의 변이체 (돌연변이체, 단편, 및 펩티드모방체 형태 포함) (가령, 본원에서 설명된 바와 같은 GDF 트랩 폴리펩티드)를 포함한다. 가용성 ActRII 폴리펩티드의 다른 실례는 ActRII 또는 GDF 트랩 단백질의 세포외 도메인에 더하여 신호 서열을 포함한다. 가령, 신호 서열은 ActRIIA 또는 ActRIIB 단백질의 선천적 신호 서열, 또는 예로서, 조직 플라스미노겐 활성제 (TPA) 신호 서열 또는 꿀벌 멜리틴 (HBM) 신호 서열을 비롯한 다른 단백질로부터 신호 서열일 수 있다.

부분적으로, 본 발명은 본원에서 설명된 방법의 범위 내에서 ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, 그리고 GDF 트랩 폴리펩티드를 산출하고 및 이용하기 위한 보도로서 이용될 수 있는 ActRII 폴리펩티드의 기능적으로 활성 부분 및 변이체를 확인한다.

ActRII 단백질은 구조적 및 기능적 특징의 면에서, 특히 리간드 결합에 대하여 당분야에서 특징화되었다 [가령, Attisano et al. (1992) Cell 68(1):97-108; Greenwald et al. (1999) Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allendorph et al. (2006) PNAS 103(20: 7643-7648; Thompson et al. (2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566; 그리고 U.S. Patent Nos: 7,709,605, 7,612,041, and 7,842,663을 참조한다].

가령, Attisano 등은 ActRIIB의 세포외 도메인의 C 말단에서 프롤린 매듭의 결실이 액티빈에 대한 수용체의 친화성을 감소시킨다는 것을 보여주었다. 서열 번호:1의 아미노산 20-119를 내포하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질, "ActRIIB(20-119)-Fc"는 프롤린 매듭 영역 및 완전한 막근접 도메인을 포함하는 ActRIIB(20-134)-Fc에 비하여 GDF-11 및 액티빈에 대한 감소된 결합을 갖는다 (가령, U.S. 특허 번호 7,842,663을 참조한다). 하지만, ActRIIB(20-129)-Fc 단백질은 비록 프롤린 매듭 영역이 붕괴되지만, 야생형에 비하여 유사하지만 다소간 감소된 활성을 유지한다. 따라서, 아미노산 134, 133, 132, 131, 130 및 129 (서열 번호:1에 대하여)에서 정지하는 ActRIIB 세포외 도메인 모두 활성일 것으로 예상되지만, 134 또는 133에서 정지하는 구조체가 최대 활성일 수 있다. 유사하게, 잔기 129-134 (서열 번호:1에 대하여) 중에서 한 가지에서 돌연변이는 리간드-결합 친화성을 큰 차이로 변경할 것으로 예상되지 않는다. 이를 뒷받침하듯, P129 및 P130 (서열 번호:1에 대하여)의 돌연변이는 리간드 결합을 실제적으로 감소시키지 않는다. 이런 이유로, 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 빠르게는 아미노산 109 (최종 시스테인)에서 끝날 수 있지만, 109 및 119에서 또는 이들 사이 (가령, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 또는 119)에서 끝나는 형태는 감소된 리간드 결합을 가질 것으로 예상된다. 아미노산 119 (서열 번호:1에 대하여)는 불량하게 보존되고, 그리고 따라서, 쉽게 변경되거나 또는 절두된다. 128 (서열 번호:1에 대하여) 또는 그 이후에서 끝나는 ActRIIB 폴리펩티드 및 ActRIIB-기초된 GDF 트랩은 리간드 결합 활성을 유지할 것이다. 서열 번호:1에 대하여 119 및 127에서 또는 이들 사이 (가령, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 또는 127)에서 끝나는 ActRIIB 폴리펩티드 및 ActRIIB-기초된 GDF 트랩은 중간 결합 능력을 가질 것이다. 임상적 또는 실험적 세팅에 따라, 이들 형태 중에서 한 가지가 이용에 바람직할 수 있다.

ActRIIB의 N 말단에서, 아미노산 29 또는 그 이전 (서열 번호:1에 대하여)에서 시작하는 단백질은 리간드-결합 활성을 유지할 것으로 예상된다. 아미노산 29는 초기 시스테인을 나타낸다. 위치 24 (서열 번호:1에 대하여)에서 알라닌에서 아스파라긴으로 돌연변이는 리간드 결합에 실제적으로 영향을 주지 않으면서 N-연결된 당화 서열을 도입한다 (가령, U.S. 특허 번호 7,842,663을 참조한다). 이것은 아미노산 20-29에 상응하는, 신호 개열 펩티드 및 시스테인 교차연결된 영역 사이의 영역에서 돌연변이가 충분히 용인된다는 것을 확증한다. 특히, 위치 20, 21, 22, 23 및 24 (서열 번호:1에 대하여)에서 시작하는 ActRIIB 폴리펩티드 및 ActRIIB-기초된 GDF 트랩은 전반적인 리간드-결합 활성을 유지할 것이고, 그리고 위치 25, 26, 27, 28 및 29 (서열 번호:1에 대하여)에서 시작하는 ActRIIB 폴리펩티드 및 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 역시 리간드-결합 활성을 유지할 것으로 예상된다. 본원에서뿐만 아니라 예로서, U.S. 특허 번호 7,842,663에서 도시된 데이터는 놀랍게도, 22, 23, 24, 또는 25에서 시작하는 ActRIIB 구조체가 최대 활성을 가질 것이라는 것을 증명한다.

종합하면, ActRIIB의 활성 부분 (가령, 리간드-결합 활성)은 서열 번호:1의 아미노산 29-109를 포함한다. 이런 이유로, 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드 및 ActRIIB-기초된 GDF 트랩은 예로서, 서열 번호: 1의 아미노산 20-29 (가령, 시작하는 at 아미노산 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29)에 상응하는 잔기에서 시작하고 서열 번호: 1의 아미노산 109-134에 상응하는 위치에서 끝나는 (가령, 아미노산 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134에서 끝나는) ActRIIB의 부분과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 서열 번호:1의 아미노산 29-109을 포함하거나 또는 이들로 구성되지 않는다. 다른 실례는 서열 번호: 1의 20-29 (가령, 위치 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29) 또는 21-29 (가령, 위치 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29)로부터 위치에서 시작하고 119-134 (가령, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134), 119-133 (가령, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 또는 133), 129-134 (가령, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134), 또는 129-133 (가령, 129, 130, 131, 132, 또는 133)으로부터 위치에서 끝나는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실례는 서열 번호: 1의 20-24 (가령, 20, 21, 22, 23, 또는 24), 21-24 (가령, 21, 22, 23, 또는 24), 또는 22-25 (가령, 22, 22, 23, 또는 25)로부터 위치에서 시작하고 109-134 (가령, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134), 119-134 (가령, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134) 또는 129-134 (가령, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134)로부터 위치에서 끝나는 구조체를 포함한다. 이들 범위 내에서 변이체, 특히 서열 번호: 1의 상응하는 부분에 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 것들 또한 예기된다. 일부 구체예에서, ActRIIB 폴리펩티드 및 ActRIIB-기초된 GDF 트랩은 서열 번호: 1의 아미노산 잔기 25-131과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일정한 구체예에서, ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 25-131을 포함하지 않거나 또는 이들로 구성되지 않는다.

본 발명은 도면 1에서 도시된 복합 ActRIIB 구조의 분석 결과를 포함하는데, 이들 결과는 리간드-결합 주머니가 부분적으로, 잔기 Y31, N33, N35, L38 내지 T41, E47, E50, Q53 내지 K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 내지 N83, Y85, R87, A92, 그리고 E94 내지 F101에 의해 규정된다는 것을 증명한다. 이들 위치에서, 비록 R40A, K55A, F82A 및 위치 L79에서 돌연변이가 그러한 것처럼 K74A 돌연변이가 충분히 용인되긴 하지만, 보존성 돌연변이가 용인될 것으로 예상된다. R40은 손톱개구리 (Xenopus)에서 K인데, 이것은 이러한 위치에서 염기성 아미노산이 용인될 것이라는 것을 지시한다. Q53은 소 ActRIIB에서 R이고 손톱개구리 (Xenopus) ActRIIB에서 K이고, 그리고 이런 이유로, R, K, Q, N 및 H를 포함하는 아미노산이 이러한 위치에서 용인될 것이다. 따라서, 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드 및 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드에 대한 일반식은 임의선택적으로, 20-24 (가령, 20, 21, 22, 23, 또는 24) 또는 22-25 (가령, 22, 23, 24, 또는 25) 범위에서 변하는 위치에서 시작하고 129-134 (가령, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134) 범위에서 변하는 위치에서 끝나고, 그리고 리간드-결합 주머니 내에 1, 2, 5, 10 또는 15 이내 보존성 아미노산 변화 및 리간드-결합 주머니 내에 위치 40, 53, 55, 74, 79 및/또는 82에서 0개, 1개 또는 그 이상의 비보존성 변경을 포함하는 서열 번호: 1의 아미노산 29-109와 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 가변성이 특히 충분히 용인되는 결합 포켓 외부의 부위는 세포외 도메인의 아미노 및 카르복시 말단 (전술한 바와 같음), 그리고 위치 42-46 및 65-73 (서열 번호:1에 대하여)을 포함한다. 위치 65에서 아스파라긴에서 알라닌으로 변경 (N65A)은 A64 배경에서 리간드 결합을 실질적으로 향상시키고, 그리고 따라서, R64 배경에서 리간드 결합에 대한 어떤 유해한 효과도 갖지 않을 것으로 예상된다 (가령, U.S. 특허 번호 7,842,663을 참조한다). 이러한 변화는 아마도, A64 배경에서 N65에서 당화를 제거하고, 따라서 이러한 영역에서 유의미한 변화가 용인될 가능성이 높다는 것을 증명한다. R64A 변화는 불량하게 용인되는 반면, R64K는 충분히 용인되고, 그리고 따라서, 다른 염기성 잔기, 예를 들면, H가 위치 64에서 용인될 수 있다 (가령, U.S. 특허 번호 7,842,663을 참조한다).

ActRIIB는 거의 모든 척추동물에 걸쳐 충분히 보존되고, 세포외 도메인의 큰 스트레치가 완전하게 보존된다. ActRIIB에 결합하는 많은 리간드가 또한 고도로 보존된다. 따라서, 다양한 척추동물 생물체로부터 ActRIIB 서열의 비교는 변경될 수 있는 잔기에 대한 통찰력을 제공한다. 이런 이유로, 본원에서 개시된 방법에 따라서 유용한 활성, 인간 ActRIIB 변이체 폴리펩티드 및 ActRIIB-기초된 GDF 트랩은 다른 척추동물 ActRIIB의 서열로부터 상응하는 위치에서 하나 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 인간 또는 다른 척추동물 서열에서 잔기와 유사한 잔기를 포함할 수 있다. 다음 실례는 활성 ActRIIB 변이체를 규정하는 이러한 접근법을 예시한다. L46은 손톱개구리 (Xenopus) ActRIIB에서 발린이고, 따라서, 이러한 위치는 변경될 수 있고, 그리고 다른 소수성 잔기, 예를 들면, V, I 또는 F, 또는 비극성 잔기, 예를 들면, A로 임의선택적으로 변경될 수 있다. E52는 손톱개구리 (Xenopus)에서 K인데, 이것은 이러한 부위가 극성 잔기, 예를 들면, E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y 및 아마도 A를 비롯한 매우 다양한 변화를 용인할 수 있다는 것을 지시한다. T93은 손톱개구리 (Xenopus)에서 K인데, 이것은 넓은 구조적 변이가 이러한 위치에서 선호된 극성 잔기, 예를 들면, S, K, R, E, D, H, G, P, G 및 Y를 용인한다는 것을 지시한다. F108은 손톱개구리 (Xenopus)에서 Y이고, 그리고 이런 이유로, Y 또는 다른 소수성 기, 예를 들면, I, V 또는 L가 용인될 것이다. E111은 손톱개구리 (Xenopus)에서 K인데, 이것은 이러한 위치에서 D, R, K 및 H 뿐만 아니라 Q 및 N을 비롯한 하전된 잔기가 용인될 것이라는 것을 지시한다. R112는 손톱개구리 (Xenopus)에서 K인데, 이것은 R 및 H를 비롯한 염기성 잔기가 이러한 위치에서 용인된다는 것을 지시한다. 위치 119에서 A는 상대적으로 불량하게 보존되고, 그리고 설치류에서 P 및 손톱개구리 (Xenopus)에서 V인 것으로 보이는데, 따라서 본질적으로 임의의 아미노산이 이러한 위치에서 용인될 것이다. 추가 N-연결된 당화 부위 (NXS/T)의 부가는 ActRIIB(R64)-Fc 형태에 비하여 충분히 용인되는 것으로 이전에 증명되었다 (가령, U.S. 특허 번호 7,842,663을 참조한다). 이런 이유로, N-X-S/T 서열은 일반적으로, 도면 1에서 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드 및 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 내에 규정된 리간드 결합 주머니 외부의 위치에서 도입될 수 있다. 비-내인성 N-X-S/T 서열의 도입에 특히 적합한 부위는 아미노산 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134 또는 129-134 (서열 번호:1에 대하여)를 포함한다. N-X-S/T 서열은 또한, ActRIIB 서열 및 Fc 도메인 또는 다른 융합 성분 사이에 링커 내로 도입될 수 있다. 이런 부위는 기존 S 또는 T에 대하여 정확한 위치에서 N을 도입함으로써, 또는 기존 N에 상응하는 위치에서 S 또는 T를 도입함으로써 최소의 노력으로 도입될 수 있다. 따라서, N-연결된 당화 부위를 창출할 바람직한 변경은 다음과 같다: A24N, R64N, S67N (아마도 N65A 변경과 합동됨), E105N, R112N, G120N, E123N, P129N, A132N, R112S 및 R112T (서열 번호:1에 대하여). 당화될 것으로 예측되는 임의의 S는 당화에 의해 제공된 보호 때문에, 면역원성 부위를 창출하지 않으면서 T로 변경될 수 있다. 유사하게, 당화될 것으로 예측되는 임의의 T는 S로 변경될 수 있다. 따라서 변경 S67T 및 S44T (서열 번호:1에 대하여)가 예기된다. 유사하게, A24N 변이체에서, S26T 변경이 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드 및 ActRIIB-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 앞서 설명된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 추가, 비-내인성 N-연결된 당화 공통 서열을 갖는 변이체일 수 있다.

본원에서 설명된 변이는 다양한 방식으로 합동될 수 있다. 추가적으로, 본원에서 설명된 돌연변이유발 프로그램의 결과는 ActRIIB 내에 보존하는데 종종 유익한 아미노산 위치가 있다는 것을 지시한다. 서열 번호:1에 대하여, 이들은 위치 64 (염기성 아미노산), 위치 80 (산성 또는 소수성 아미노산), 위치 78 (소수성 및 특히, 트립토판), 위치 37 (산성 및 특히, 아스파르트산 또는 글루타민산), 위치 56 (염기성 아미노산), 위치 60 (소수성 아미노산, 특히 페닐알라닌 또는 티로신)을 포함한다. 따라서, 본원에서 개시된 ActRIIB 폴리펩티드 및 ActRIIB-기초된 GDF 트랩에서, 본 발명은 보존될 수 있는 아미노산의 프레임워크를 제공한다. 보존하는 것이 바람직할 수 있는 다른 위치는 다음과 같다: 서열 번호:1에 대하여 위치 52 (산성 아미노산), 위치 55 (염기성 아미노산), 위치 81 (산성), 98 (극성 또는 하전된, 특히 E, D, R 또는 K).

활성 (가령, 리간드 결합) ActRIIA 폴리펩티드에 대한 일반식은 아미노산 30에서 시작하고 서열 번호:9의 아미노산 110에서 끝나는 폴리펩티드를 포함하는 것이다. 따라서, 본 발명의 ActRIIA 폴리펩티드 및 ActRIIA-기초된 GDF 트랩은 서열 번호:9의 아미노산 30-110과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 ActRIIA-기초된 GDF 트랩은 서열 번호:9의 아미노산 30-110을 포함하거나 또는 이들로 구성되지 않는다. 임의선택적으로, 본 발명의 ActRIIA 폴리펩티드 및 ActRIIA-기초된 GDF 트랩 폴리펩티드는 임의선택적으로, 각각 1-5 (가령, 1, 2, 3, 4, 또는 5) 또는 3-5 (가령, 3, 4, 또는 5) 범위에서 변하는 위치에서 시작하고 110-116 (가령, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 또는 116) 또는 110-115 (가령, 110, 111, 112, 113, 114, 또는 115) 범위에서 변하는 위치에서 끝나고, 그리고 서열 번호:9에 대하여 리간드 결합 주머니 내에 1, 2, 5, 10 또는 15개 이내 보존성 아미노산 변화 및 리간드-결합 주머니 내에 위치 40, 53, 55, 74, 79 및/또는 82에서 0개, 1개 또는 그 이상의 비보존성 변경을 포함하는 서열 번호:9의 아미노산 12-82와 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산인 폴리펩티드를 포함한다.

일정한 구체예에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드) 및 GDF 트랩 폴리펩티드의 기능적으로 활성 단편은 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 상응하는 단편으로부터 재조합적으로 생산된 폴리펩티드 (가령, 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 27, 32, 39, 40, 42, 46 및 48)를 선별검사함으로써 획득될 수 있다. 이에 더하여, 단편은 당분야에서 공지된 기술, 예를 들면, 전통적인 Merrifield 고체상 f-Moc 또는 t-Boc 화학을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이들 단편은 생산될 수 있고 (재조합적으로 또는 화학적 합성에 의해), 그리고 ActRII 수용체 및/또는 하나 또는 그 이상의 ActRII 리간드 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7 및/또는 Nodal)의 길항제 (저해제)로서 기능할 수 있는 펩티딜 단편을 확인하기 위해 시험될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9, 10, 11, 22, 26 및 28에서 선택되는 아미노산 서열과 최소한 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일정한 구체예에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9, 10, 11, 22, 26 및 28에서 선택되는 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9, 10, 11, 22, 26 및 28에서 선택되는 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성된다.

일부 구체예에서, 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호:1, 2, 3, 4, 5, 6, 29, 31 및 49에서 선택되는 아미노산 서열과 최소한 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일정한 구체예에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 29, 31 및 49에서 선택되는 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 29, 31 및 49에서 선택되는 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성된다.

일부 구체예에서, 본 발명의 GDF 트랩 폴리펩티드는 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 29, 30, 31, 36, 37, 38, 41, 44, 45, 49, 50 및 51에서 선택되는 아미노산 서열과 최소한 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드이다. 일정한 구체예에서, GDF 트랩은 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 29, 30, 31, 36, 37, 38, 41, 44, 45, 49, 50 및 51에서 선택되는 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, GDF 트랩은 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 29, 30, 31, 36, 37, 38, 41, 44, 45, 49, 50 및 51에서 선택되는 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 서열 번호:1, 4, 또는 49의 L79에 상응하는 위치는 산성 아미노산 (D 또는 E 아미노산 잔기)이다. 일정한 구체예에서, GDF 트랩은 서열 번호: 36, 37, 38, 41, 44, 45, 50, 및 51에서 선택되는 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성된다. 일정한 구체예에서, GDF 트랩은 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 29, 및 31에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 구성되지 않는다.

일부 구체예에서, 본 발명의 GDF 트랩 폴리펩티드는 서열 번호: 9, 10, 11, 22, 26, 28, 29 및 31에서 선택되는 아미노산 서열과 최소한 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIA 폴리펩티드이다. 일정한 구체예에서, GDF 트랩은 서열 번호: 9, 10, 11, 22, 26, 28, 29 및 31에서 선택되는 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, GDF 트랩은 서열 번호: 9, 10, 11, 22, 26, 28, 29 및 31에서 선택되는 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성된다. 일정한 구체예에서, GDF 트랩은 서열 번호: 9, 10, 11, 22, 26, 28, 29 및 31에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 구성되지 않는다.

일부 구체예에서, 본 발명은 치료 효력, 또는 안정성 (가령, 저장 수명 및 생체내에서 단백질분해 분해에 대한 내성)을 증강하는 것과 같은 목적으로 ActRII 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 또는 ActRIIB 폴리펩티드) 또는 GDF 트랩의 구조를 변형함으로써 기능적 변이체를 만드는 것을 예기한다. 변이체는 아미노산 치환, 결실, 부가, 또는 이들의 조합에 의해 생산될 수 있다. 가령, 이소류신 또는 발린으로 류신의 단리된 대체, 글루타민산염으로 아스파르트산염의 단리된 대체, 세린으로 트레오닌의 단리된 대체, 또는 구조적으로 관련된 아미노산으로 아미노산의 유사한 대체 (가령, 보존성 돌연변이)가 결과의 분자의 생물학적 활성에 대한 주요한 효과를 갖지 않을 것이라고 예상하는 것은 합리적이다. 보존성 대체는 측쇄에서 관련되는 아미노산의 패밀리 내에서 발생하는 것들이다. 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 변화가 기능적 동족체를 유발하는 지의 여부는 야생형 폴리펩티드와 유사한 방식으로 세포에서 반응을 발생시키거나, 또는 변형되지 않은 또는 야생형 폴리펩티드와 비교하여, 하나 또는 그 이상의 리간드, 예를 들면, GDF11, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, GDF8, BMP6 및 BMP7에 결합하는 변이체 폴리펩티드의 능력을 사정함으로써 쉽게 결정될 수 있다.

일정한 구체예에서, 본 발명은 폴리펩티드의 당화를 변경하기 위한, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드 및 GDF 트랩 폴리펩티드의 특정한 돌연변이를 예기한다. 이런 돌연변이는 하나 또는 그 이상의 당화 부위, 예를 들면, O-연결된 또는 N-연결된 당화 부위를 도입하거나 또는 제거하기 위해 선별될 수 있다. 아스파라긴-연결된 당화 인식 부위는 일반적으로, 적절한 세포 당화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-트레오닌 또는 아스파라긴-X-세린 (여기서 "X"는 임의의 아미노산이다)을 포함한다. 변경은 또한, 폴리펩티드 서열에 하나 또는 그 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 또는 이들에 의한 치환에 의해 만들어질 수 있다 (O-연결된 당화 부위의 경우). 당화 인식 부위의 첫 번째 또는 세 번째 아미노산 위치 중에서 어느 하나 또는 둘 모두에서 다양한 아미노산 치환 또는 결실 (및/또는 두 번째 위치에서 아미노산 결실)은 변형된 트리펩티드 서열에서 비-당화를 유발한다. 폴리펩티드 상에서 탄수화물 모이어티의 숫자를 증가시키는 다른 수단은 폴리펩티드에 글리코시드의 화학적 또는 효소적 커플링이다. 이용된 연계 방식에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘; (b) 유리 카르복실 기; (c) 유리 술피드릴 기, 예를 들면, 시스테인의 것들; (d) 유리 히드록실 기, 예를 들면, 세린, 트레오닌, 또는 히드록시프롤린의 것들; (e) 방향족 잔기, 예를 들면, 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판의 것들; 또는 (f) 글루타민의 아미드 기에 부착될 수 있다. 폴리펩티드 상에 존재하는 하나 또는 그 이상의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 및/또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈당화는 예로서, 화합물 트리플루오로메탄술폰산, 또는 동등한 화합물에 단백질의 노출을 수반할 수 있다. 이러한 처리는 아미노산 서열을 무손상 상태로 남겨놓으면서, 연결 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외하고 대부분의 또는 모든 당의 개열을 유발한다. 폴리펩티드 상에서 탄수화물 모이어티의 효소적 개열은 Thotakura et al. [Meth. Enzymol. (1987) 138:350]에 의해 설명된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다아제의 이용에 의해 달성될 수 있다. 폴리펩티드의 서열은 이용된 발현 시스템의 유형에 따라, 적절하게 조정될 수 있는데, 그 이유는 포유류, 효모, 곤충, 및 식물 세포 모두 상기 펩티드의 아미노산 서열에 의해 영향을 받을 수 있는 상이한 당화 패턴을 도입할 수 있기 때문이다. 일반적으로, 인간에서 이용을 위한 본 발명의 ActRII 폴리펩티드 및 GDF 트랩 폴리펩티드는 비록 다른 포유류 발현 세포주 역시 유용할 것으로 예상되긴 하지만, 적절한 당화를 제공하는 포유류 세포주, 예를 들면, HEK293 또는 CHO 세포주에서 발현될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 ActRII 폴리펩티드 및 GDF 트랩 폴리펩티드의 돌연변이체, 특히 조합 돌연변이체의 세트뿐만 아니라 절두 돌연변이체를 산출하는 방법을 더욱 예기한다. 조합 돌연변이체의 풀이 특히, ActRII 및 GDF 트랩 서열을 확인하는데 유용하다. 이런 조합 라이브러리를 선별검사하는 목적은 예로서, 변경된 성질, 예를 들면, 변경된 약동학적 또는 변경된 리간드 결합을 갖는 폴리펩티드 변이체를 산출하는 것일 수 있다. 다양한 선별검사 검정이 아래에 제공되고, 그리고 이런 검정은 변이체를 평가하는데 이용될 수 있다. 가령, ActRII 폴리펩티드 및 GDF 트랩 폴리펩티드는 ActRII 수용체에 결합하거나, ActRII 폴리펩티드에 ActRII 리간드 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP7, BMP6 및/또는 Nodal)의 결합을 예방하거나, 또는 ActRII 리간드에 의해 유발된 신호전달을 간섭하는 능력에 대해 선별검사될 수 있다.

ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드의 활성은 또한, 세포-기초된 또는 생체내 검정에서 시험될 수 있다. 가령, 조혈에 관련된 유전자의 발현에 대한 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드의 효과가 사정될 수 있다. 이것은 필요에 따라, 하나 또는 그 이상의 재조합 ActRII 리간드 단백질 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP7, BMP6 및/또는 Nodal)의 존재에서 수행될 수 있고, 그리고 세포는 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드 및 임의선택적으로, ActRII 리간드를 생산하기 위해 형질감염될 수 있다. 유사하게, ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드는 생쥐 또는 다른 동물에 투여될 수 있고, 그리고 하나 또는 그 이상의 혈액 치수, 예를 들면, RBC 수치, 헤모글로빈, 또는 망상적혈구 수치가 당분야에서 인정된 방법을 이용하여 사정될 수 있다.

참조 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드에 비하여 선택적인 또는 일반적으로 증가된 효능을 갖는 조합-유래된 변이체가 산출될 수 있다. 이런 변이체는 재조합 DNA 구조체로부터 발현될 때, 유전자 요법 프로토콜에서 이용될 수 있다. 유사하게, 돌연변이유발은 상응하는 변형되지 않은 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드와 극적으로 상이한 세포내 반감기를 갖는 변이체를 발생시킬 수 있다. 가령, 변경된 단백질은 변형되지 않은 폴리펩티드의 파괴, 또는 만약 그렇지 않으면 비활성화를 유발하는 단백질분해 분해 또는 다른 세포 과정에 더욱 안정하거나 또는 덜 안정하도록 만들어질 수 있다. 이런 변이체, 그리고 이들을 인코딩하는 유전자는 폴리펩티드의 반감기를 조정함으로써 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드 수준을 변경하는데 활용될 수 있다. 가령, 짧은 반감기는 더욱 일시적인 생물학적 효과를 발생시킬 수 있고, 그리고 유도성 발현 시스템의 일부일 때, 세포 내에서 재조합 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드 수준의 더욱 엄격한 제어를 허용할 수 있다. Fc 융합 단백질에서, 돌연변이는 상기 단백질의 반감기를 변경하기 위해 링커 (만약 존재하면) 및/또는 Fc 부분 내에서 만들어질 수 있다.

조합 라이브러리는 잠재적 ActRII 또는 GDF 트랩 서열 중에서 최소한 일부를 각각 포함하는 폴리펩티드의 라이브러리를 인코딩하는 유전자의 축중성 라이브러리에 의하여 생산될 수 있다. 가령, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물은 뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 잠재적 ActRII 또는 GDF 트랩 폴리펩티드의 축중성 세트가 개별 폴리펩티드로서, 또는 대안으로, 한 세트의 더욱 큰 융합 단백질 (가령, 파지 전시의 경우)로서 발현가능하도록, 유전자 서열 내로 효소적으로 결찰될 수 있다.

잠재적 동족체의 라이브러리가 축중성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 산출될 수 있는 많은 방식이 있다. 축중성 유전자 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 합성장치에서 실행될 수 있고, 그리고 이들 합성 유전자는 이후, 발현을 위해 적절한 벡터 내로 결찰될 수 있다. 축중성 올리고뉴클레오티드의 합성은 당분야에서 널리 공지된다. 가령, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477을 참조한다. 이런 기술은 다른 단백질의 지향된 진화에서 이용되었다. 가령, Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al. (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; 그리고 U.S. 특허 번호: 5,223,409, 5,198,346 및 5,096,815를 참조한다.

대안으로, 다른 형태의 돌연변이유발이 조합 라이브러리를 산출하는데 활용될 수 있다. 가령, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드는 예로서, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 이용한 선별검사 [가령, Ruf et al. (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al. (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al. (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al. (1991) Biochemistry 30:10832-10838; 그리고 Cunningham et al. (1989) Science 244:1081-1085를 참조한다]에 의해, 링커 주사 돌연변이유발 [가령, Gustin et al. (1993) Virology 193:653-660; 그리고 Brown et al. (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et al. (1982) Science 232:316을 참조한다]에 의해, 포화 돌연변이유발 [가령, Meyers et al., (1986) Science 232:613을 참조한다]에 의해; PCR 돌연변이유발 [가령, Leung et al. (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19를 참조한다]; 또는 화학적 돌연변이유발을 비롯한 무작위 돌연변이유발 [가령, Miller et al. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; 그리고 Greener et al. (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34를 참조한다]에 의해, 라이브러리로부터 산출되고 단리될 수 있다. 특히 조합 세팅에서 링커 주사 돌연변이유발은 ActRII 폴리펩티드의 절두된 (생리활성) 형태를 확인하기 위한 매력적인 방법이다.

점 돌연변이 및 절두에 의해 만들어진 조합 라이브러리의 유전자 산물을 선별검사하고, 그리고 그 점에 있어서, 일정한 성질을 갖는 유전자 산물에 대한 cDNA 라이브러리를 선별검사하기 위한 넓은 범위의 기술이 당분야에서 공지된다. 이런 기술은 본 발명의 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드의 조합 돌연변이유발에 의해 산출된 유전자 라이브러리의 신속한 선별검사를 위해 일반적으로 조정될 수 있을 것이다. 큰 유전자 라이브러리를 선별검사하기 위한 가장 폭넓게 이용되는 기술은 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터 내로 클로닝하고, 적절한 세포를 결과의 벡터 라이브러리로 형질전환하고, 그리고 원하는 활성의 검출이 산물이 검출된 유전자를 인코딩하는 벡터의 상대적으로 쉬운 단리를 용이하게 하는 조건 하에 조합 유전자를 발현하는 것을 전형적으로 포함한다. 바람직한 검정은 ActRII 리간드 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP7, BMP6 및/또는 Nodal) 결합 검정 및/또는 ActRII 리간드-매개된 세포 신호전달 검정을 포함한다.

일정한 구체예에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드는 ActRII (가령, ActRIIA 또는 ActRIIB 폴리펩티드) 또는 GDF 트랩 폴리펩티드 내에 자연적으로 존재하는 것에 더하여 번역후 변형을 더욱 포함할 수 있다. 이런 변형은 아세틸화, 카르복실화, 당화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 결과적으로, ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드는 비-아미노산 요소, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 지질, 다당류 또는 단당류, 그리고 인산염을 내포할 수 있다. 리간드 트랩 폴리펩티드의 기능성에 대한 이런 비-아미노산 요소의 효과는 다른 ActRII 또는 GDF 트랩 변이체에 대해 본원에서 설명된 바와 같이 시험될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드가 폴리펩티드의 미성숙 형태를 개열함으로써 세포에서 생산될 때, 번역후 처리 또한 상기 단백질의 정확한 접힘 및/또는 기능에 중요할 수 있다. 상이한 세포 (가령, CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 또는 HEK293)는 이런 번역후 활성을 위한 특정한 세포 기구 및 특징적인 기전을 갖고, 그리고 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드의 정확한 변형 및 처리를 담보하도록 선택될 수 있다.

일정한 양상에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드는 ActRII 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 또는 ActRIIB 폴리펩티드) 또는 GDF 트랩 폴리펩티드의 최소한 일부 (도메인) 및 하나 또는 그 이상의 이종성 부분 (도메인)을 갖는 융합 단백질을 포함한다. 이런 융합 도메인의 널리 공지된 실례는 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타티온 S-전달효소 (GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 (Fc), 말토오스 결합 단백질 (MBP), 또는 인간 혈청 알부민을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 융합 도메인은 원하는 성질을 부여하기 위해 선별될 수 있다. 가령, 일부 융합 도메인은 친화성 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 단리에 특히 유용하다. 친화성 정제의 목적으로, 친화성 크로마토그래피를 위한 유관한 매트릭스, 예를 들면, 글루타티온-, 아밀라아제-, 그리고 니켈- 또는 코발트- 접합된 수지가 이용된다. 이런 매트릭스 중에서 다수는 (HIS₆) 융합 상대와 함께 이용할 때 유용한 "키트" 형태, 예를 들면, Pharmacia GST 정제 시스템 및 QIAexpress^TM 시스템 (Qiagen)에서 가용하다. 다른 실례로서, 융합 도메인은 리간드 트랩 폴리펩티드의 검출을 용이하게 하기 위해 선별될 수 있다. 이런 검출 도메인의 실례는 다양한 형광 단백질 (가령, GFP) 뿐만 아니라 특이적 항체가 가용한 통상적으로 짧은 펩티드 서열인 "에피토프 태그"를 포함한다. 특정한 단일클론 항체가 쉽게 가용한 널리 공지된 에피토프 태그는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 적혈구응집소 (HA) 및 c-myc 태그를 포함한다. 일부 경우에, 융합 도메인은 유관한 프로테아제가 융합 단백질을 부분적으로 소화하고, 따라서 재조합 단백질을 그것으로부터 해방시키도록 허용하는 프로테아제 개열 부위, 예를 들면, 인자 Xa 또는 트롬빈에 대한 프로테아제 개열 부위를 갖는다. 해방된 단백질은 이후, 차후 크로마토그래피 분리에 의해 융합 도메인으로부터 단리될 수 있다. 일정한 바람직한 구체예에서, ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드는 생체내에서 상기 폴리펩티드를 안정시키는 도메인 ("안정자" 도메인)과 융합된다. "안정시키는"은 감소된 파괴, 신장에 의한 감소된 소실, 또는 다른 약동학적 효과에 기인하는 지에 상관없이, 혈청 반감기를 증가시키는 것으로 의미된다. 면역글로불린의 Fc 부분과의 융합은 넓은 범위의 단백질에 바람직한 약동학적 성질을 부여하는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 인간 혈청 알부민에 융합은 바람직한 성질을 부여할 수 있다. 선별될 수 있는 융합 도메인의 다른 유형은 다합체화 (가령, 이합체화, 사합체화) 도메인 및 기능적 도메인 (추가 생물학적 기능, 예를 들면, 근육 성장의 추가 자극을 부여)을 포함한다.

일정한 구체예에서, 본 발명은 다음의 IgG1 Fc 도메인 서열을 포함하는 ActRII 또는 GDF 트랩 융합 단백질을 제공한다:

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

101 VSNKALPVPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF

151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (서열 번호:14).

다른 구체예에서, 본 발명은 다음의 IgG1 Fc 도메인 변이체를 포함하는 ActRII 또는 GDF 트랩 융합 단백질을 제공한다:

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF

151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (서열 번호:64)

또 다른 구체예에서, 본 발명은 다음의 IgG1 Fc 도메인 변이체를 포함하는 ActRII 또는 GDF 트랩 융합 단백질을 제공한다:

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVD(A)VSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK(A)

101 VSNKALPVPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF

151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG PFFLYSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HN(A)HYTQKSLS LSPGK (서열 번호:15).

임의선택적으로, IgG1 Fc 도메인은 잔기, 예를 들면, Asp-265, 리신 322 및 Asn-434에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 갖는다. 일정한 경우에, 이들 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상 (가령, Asp-265 돌연변이)을 갖는 돌연변이체 IgG1 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비하여 Fcγ 수용체에 결합하는 감소된 능력을 갖는다. 다른 경우에, 이들 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상 (가령, Asn-434 돌연변이)을 갖는 돌연변이체 Fc 도메인은 야생형 IgG1 Fc 도메인에 비하여 MHC 클래스 I-관련된 Fc-수용체 (FcRN)에 결합하는 증가된 능력을 갖는다.

일정한 다른 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는, IgG2 Fc 도메인의 변이체를 포함하는 ActRII 또는 GDF 트랩 융합 단백질을 제공한다:

1 VECPPCPAPP VAGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVQ

51 FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTFRVVS VLTVVHQDWL NGKEYKCKVS

101 NKGLPAPIEK TISKTKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP

151 SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPMLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS

201 CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK (서열 번호:65)

융합 단백질의 상이한 요소는 원하는 기능성과 일치하는 임의의 방식으로 배열될 수 있는 것으로 이해된다. 가령, ActRII 폴리펩티드 도메인 또는 GDF 트랩 폴리펩티드 도메인은 이종성 도메인의 C 말단에 배치될 수 있거나, 또는 대안으로, 이종성 도메인은 ActRII 폴리펩티드 도메인 또는 GDF 트랩 폴리펩티드 도메인의 C 말단에 배치될 수 있다. ActRII 폴리펩티드 도메인 또는 GDF 트랩 폴리펩티드 도메인 및 이종성 도메인은 융합 단백질 내에서 인접할 필요가 없고, 그리고 추가 도메인 또는 아미노산 서열은 도메인의 C- 또는 N 말단에 또는 도메인 사이에 포함될 수 있다.

가령, ActRII 또는 GDF 트랩 융합 단백질은 화학식 A-B-C에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. B 부분은 ActRII 폴리펩티드 도메인 또는 GDF 트랩 폴리펩티드 도메인에 상응한다. A 및 C 부분은 독립적으로, 0개, 1개 또는 1개 이상의 아미노산일 수 있고, 그리고 A 및 C 부분 둘 모두 존재할 때 B에 이종성이다. A 및/또는 C 부분은 링커 서열을 거쳐 B 부분에 부착될 수 있다. 예시적인 링커는 짧은 폴리펩티드 링커, 예를 들면, 2-10, 2-5, 2-4, 2-3 글리신 잔기, 예를 들면, 예로서, Gly-Gly-Gly 링커를 포함한다. 다른 적합한 링커는 상기에서 설명된다 [가령, TGGG 링커 (서열 번호: 53)]. 일정한 구체예에서, ActRII 또는 GDF 트랩 융합 단백질은 화학식 A-B-C에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 A는 리더 (신호) 서열이고, B는 ActRII 또는 GDF 폴리펩티드 도메인으로 구성되고, 그리고 C는 생체내 안정성, 생체내 반감기, 흡수/투여, 조직 국부화 또는 분포, 단백질 복합체의 형성 및/또는 정제 중에서 하나 또는 그 이상을 증강하는 폴리펩티드 부분이다. 일정한 구체예에서, ActRII 또는 GDF 트랩 융합 단백질은 화학식 A-B-C에서 진술된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 A는 TPA 리더 서열이고, B는 ActRII 또는 GDF 폴리펩티드 도메인으로 구성되고, 그리고 C는 면역글로불린 Fc 도메인이다. 바람직한 융합 단백질은 서열 번호: 22, 26, 29, 31, 36, 38, 41, 44, 및 51 중에서 한 가지에서 진술된 아미노산 서열을 포함한다.

일정한 구체예에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드는 이들 폴리펩티드를 안정시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 변형을 내포한다. 가령, 이런 변형은 폴리펩티드의 시험관내 반감기를 증강하고, 폴리펩티드의 순환 반감기를 증강하고 및/또는 폴리펩티드의 단백질분해 분해를 감소시킨다. 이런 안정화 변형은 융합 단백질 (가령, ActRII 폴리펩티드 도메인 또는 GDF 트랩 폴리펩티드 도메인 및 안정자 도메인을 포함하는 융합 단백질 포함), 당화 부위의 변형 (가령, 본 발명의 폴리펩티드에 당화 부위의 부가 포함), 그리고 탄수화물 모이어티의 변형 (가령, 본 발명의 폴리펩티드로부터 탄수화물 모이어티의 제거 포함)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "안정자 도메인"은 융합 단백질의 경우에서처럼 융합 도메인 (가령, 면역글로불린 Fc 도메인)을 지칭할 뿐만 아니라, 비단백질성 변형, 예를 들면, 탄수화물 모이어티, 또는 비단백질성 모이어티, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 본원에서 설명된 방법에 따라서 이용되는 ActRII 폴리펩티드 및 GDF 트랩은 단리된 폴리펩티드이다. 본원에서 이용된 바와 같이, 단리된 단백질 또는 폴리펩티드는 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 예로서, 전기영동 (가령, SDS-PAGE, 등전위 초점 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (가령, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정될 때, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%보다 큰 순도까지 정제된다. 항체 순도의 사정을 위한 방법은 당분야에서 널리 공지된다 [가령, Flatman et al., (2007) J. Chromatogr. B 848:79-87을 참조한다].

일정한 구체예에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드 및 GDF 트랩은 다양한 공지된 기술에 의해 생산될 수 있다. 가령, 본 발명의 폴리펩티드는 표준 단백질 화학 기술, 예를 들면, Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) 및 Grant G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992)에서 설명된 것들을 이용하여 합성될 수 있다. 이에 더하여, 자동화된 펩티드 합성장치가 상업적으로 가용하다 (가령, Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600을 참조한다). 대안으로, 단편 또는 변이체를 비롯한 본 발명의 폴리펩티드는 당분야에서 널리 공지된 바와 같이, 다양한 발현 시스템 [가령, 대장균 (E. coli), 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, COS 세포, 배큘로바이러스]을 이용하여 재조합적으로 생산될 수 있다. 추가 구체예에서, 본 발명의 변형된 또는 변형되지 않은 폴리펩티드는 예로서, 프로테아제, 예를 들면, 트립신, 서몰리신, 키모트립신, 펩신, 또는 짝짓기된 염기성 아미노산 전환 효소 (PACE)를 이용함으로써 재조합적으로 생산된 전장 ActRII 또는 GDF 트랩 폴리펩티드의 소화에 의해 생산될 수 있다. 컴퓨터 분석 (상업적으로 가용한 소프트웨어, 예를 들면, MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc. 이용)이 단백질분해 개열 부위를 확인하는데 이용될 수 있다. 대안으로, 이런 폴리펩티드는 화학적 개열 (가령, 브롬화시안, 히드록실아민 등)을 이용하여, 재조합적으로 생산된 전장 ActRII 또는 GDF 트랩 폴리펩티드로부터 생산될 수 있다.

본원에서 개시된 ActRII 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 또는 ActRIIB 폴리펩티드) 중에서 한 가지는 원하는 효과를 달성하기 위해 (가령, 치료가 필요한 개체에서 적혈구 수준 및/또는 헤모글로빈을 증가시키고, 빈혈을 치료하거나 예방하고, MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하고, MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증을 치료하거나 예방하기 위해), 본 발명의 하나 또는 그 이상의 추가 ActRII 길항제 작용제와 합동될 수 있다. 가령, 본원에서 개시된 ActRII 폴리펩티드는 i) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 추가 ActRII 폴리펩티드, ii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 GDF 트랩; iii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 항체 (가령, 항-액티빈 A 항체, 항-액티빈 B 항체, 항-액티빈 C 항체, 항-액티빈 E 항체, 항-GDF11 항체, 항-GDF8 항체, 항-BMP6 항체, 항-BMP7 항체, 항-ActRIIA 항체 및/또는 항-ActRIIB 항체); iv) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 소형 분자 ActRII 길항제 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 소형 분자 길항제); v) 본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 길항제) 중에서 하나 또는 그 이상; vi) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 폴리스타틴 폴리펩티드; 및/또는 vii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 FLRG 폴리펩티드와 합동으로 이용될 수 있다.

유사하게, 본원에서 개시된 GDF 트랩 중에서 한 가지는 원하는 효과를 달성하기 위해 (가령, 치료가 필요한 환자에서 적혈구 수준 및/또는 헤모글로빈을 증가시키고, 빈혈을 치료하거나 예방하고, MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하고, MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증을 치료하거나 예방하기 위해), 본 발명의 하나 또는 그 이상의 추가 ActRII 길항제 작용제와 합동될 수 있다. 가령, 본원에서 개시된 GDF 트랩은 i) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 추가 GDF 트랩, ii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 ActRII 폴리펩티드 (가령, 본원에서 개시된 ActRIIA 또는 ActRIIB 폴리펩티드); iii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 항체 (가령, 항-액티빈 A 항체, 항-액티빈 B 항체, 항-액티빈 C 항체, 항-액티빈 E 항체, 항-GDF11 항체, 항-GDF8 항체, 항-BMP6 항체, 항-BMP7 항체, 항-ActRIIA 항체 및/또는 항-ActRIIB 항체); iv) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 소형 분자 ActRII 길항제 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 소형 분자 길항제); v) 본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 길항제) 중에서 하나 또는 그 이상; vi) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 폴리스타틴 폴리펩티드; 및/또는 vii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 FLRG 폴리펩티드와 합동으로 이용될 수 있다.

B. ActRII 폴리펩티드 및 GDF 트랩을 인코딩하는 핵산

일정한 구체예에서, 본 발명은 본원에서 개시된 ActRII 폴리펩티드 및 GDF 트랩 폴리펩티드 (이들의 단편, 기능적 변이체 및 융합 단백질 포함)를 인코딩하는 단리된 및/또는 재조합 핵산을 제공한다. 가령, 서열 번호:12는 자연발생 인간 ActRIIA 전구체 폴리펩티드를 인코딩하고, 반면 서열 번호:13은 ActRIIA의 처리된 세포외 도메인을 인코딩한다. 이에 더하여, 서열 번호:7은 자연발생 인간 ActRIIB 전구체 폴리펩티드 (앞서 설명된 R64 변이체)를 인코딩하고, 반면 서열 번호:8은 ActRIIB (앞서 설명된 R64 변이체)의 처리된 세포외 도메인을 인코딩한다. 주제 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이런 핵산은 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 이들 핵산은 예로서, 본 발명의 ActRII-기초된 리간드 트랩 폴리펩티드를 만들기 위한 방법에서 이용될 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, 단리된 핵산(들)은 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산에는 핵산 분자를 통상적으로 내포하는 세포에 내포된 핵산 분자가 포함되지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.

일정한 구체예에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드 및 GDF 트랩을 인코딩하는 핵산은 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 27, 32, 39, 40, 42, 43, 46, 47 및 48 중에서 한 가지의 변이체인 핵산을 포함하는 것으로 이해된다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 대립형질 변이체를 비롯한 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가, 또는 결실에 의해 상이한 서열을 포함하고, 그리고 이런 이유로, 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 27, 32, 39, 40, 42, 43, 46, 47 및 48 중에서 한 가지에서 지정된 뉴클레오티드 서열과 상이한 코딩 서열을 포함할 것이다.

일정한 구체예에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드 및 GDF 트랩은 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 27, 32, 39, 40, 42, 43, 46, 47 및 48과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 단리된 또는 재조합 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 GDF 트랩은 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 27 및 32 중에서 한 가지에 상응하는 뉴클레오티드 서열 중에서 한 가지를 포함하거나 또는 이것으로 구성되는 핵산 서열에 의해 인코딩되지 않는다. 당업자는 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 27, 32, 39, 42, 47 및 48에 상보적인 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 그리고 이들의 변이체 역시 본 발명의 범위 내에 있다는 것을 인지할 것이다. 추가 구체예에서, 본 발명의 핵산 서열은 단리되고, 재조합이고 및/또는 이종성 뉴클레오티드 서열과 융합되거나, 또는 DNA 라이브러리 내에 있을 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 핵산은 또한, 고도로 엄격한 조건 하에, 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 27, 32, 39, 40, 42, 43, 46, 47 및 48에서 지정된 뉴클레오티드 서열, 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 27, 32, 39, 40, 42, 43, 46, 47 및 48의 보체 서열, 또는 이들의 단편에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 앞서 논의된 바와 같이, 당업자는 DNA 혼성화를 증진하는 적절한 엄격함 조건이 변할 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 당업자는 DNA 혼성화를 증진하는 적절한 엄격함 조건이 변할 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 가령, 약 45 ℃에서 6.0 x 염화나트륨/구연산나트륨 (SSC)에서 혼성화, 그 이후에 50 ℃에서 2.0 x SSC의 세척을 수행할 수 있다. 가령, 세척 단계에서 염 농도는 50 ℃에서 약 2.0 x SSC의 낮은 엄격함 내지 50 ℃에서 약 0.2 x SSC의 높은 엄격함에서 선택될 수 있다. 이에 더하여, 세척 단계에서 온도는 실온, 약 22 ℃에서 낮은 엄격함 조건으로부터 약 65 ℃에서 높은 엄격함 조건으로 증가될 수 있다. 온도 및 염 둘 모두 변할 수 있거나, 또는 온도 또는 염 농도가 일정하게 유지되지만, 다른 변수가 변화된다. 한 구체예에서, 본 발명은 실온에서 6 x SSC의 낮은 엄격함 조건 하에 혼성화, 그 이후에 실온에서 2 x SSC에서 세척이 수행되는 핵산을 제공한다.

유전자 코드에서 축중성으로 인해 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 27, 32, 39, 40, 42, 43, 46, 47 및 48에서 진술된 바와 같은 핵산과 상이한 단리된 핵산 역시 본 발명의 범위 내에 있다. 가령, 다수의 아미노산이 하나 이상의 삼중항에 의해 지정된다. 동일한 아미노산을 명시하는 코돈, 또는 동의어 (예로서, CAU 및 CAC는 히스티딘에 대한 동의어이다)는 단백질의 아미노산 서열에 영향을 주지 않는 "침묵" 돌연변이를 유발할 수 있다. 하지만, 본 단백질의 아미노산 서열에서 변화를 야기하는 DNA 서열 다형성이 포유류 세포 사이에서 존재할 것으로 예상된다. 당업자는 특정 단백질을 인코딩하는 핵산의 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 (약 3-5%까지의 뉴클레오티드)에서 이들 변이가 자연 대립형질 변이로 인해 소정의 종의 개체 사이에서 존재할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 임의의 모든 이런 뉴클레오티드 변이 및 결과의 아미노산 다형성은 본 발명의 범위 안에 있다.

일정한 구체예에서, 본 발명의 재조합 핵산은 발현 구조체 내에서 하나 또는 그 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 조절 뉴클레오티드 서열은 일반적으로, 발현에 이용된 숙주 세포에 적합할 것이다. 다양한 유형의 적절한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열이 다양한 숙주 세포에 대해 당분야에서 공지된다. 전형적으로, 상기 하나 또는 그 이상의 조절 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 시작 및 종결 서열, 번역 시작 및 종결 서열, 그리고 인핸서 또는 활성체 서열을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 당분야에서 공지된 바와 같은 구조성 또는 유도성 프로모터가 본 발명에 의해 예기된다. 프로모터는 자연발생 프로모터이거나, 또는 하나 이상의 프로모터의 요소를 합동하는 하이브리드 프로모터일 수 있다. 발현 구조체는 세포 내에 에피솜, 예를 들면, 플라스미드에서 존재할 수 있거나, 또는 발현 구조체는 염색체 내에 삽입될 수 있다. 일부 구체예에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선별을 허용하는 선별가능 마커 유전자를 내포한다. 선별가능 마커 유전자는 당분야에서 널리 공지되고, 그리고 이용된 숙주 세포에 따라 변할 것이다.

본 발명의 일정한 양상에서, 주제 핵산은 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩을 인코딩하고 최소한 하나의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 내에 제공된다. 조절 서열은 당분야에서 인식되고, 그리고 ActRII 또는 GDF 트랩 폴리펩티드의 발현을 주도하도록 선별된다. 따라서, 용어 조절 서열은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소를 포함한다. 예시적인 조절 서열은 Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990)에서 설명된다. 가령, DNA 서열에 작동가능하게 연결될 때 이의 발현을 제어하는 매우 다양한 발현 제어 서열 중에서 한 가지가 ActRII 또는 GDF 트랩 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열을 발현하기 위해 이들 벡터에서 이용될 수 있다. 이런 유용한 발현 제어 서열은 예로서, SV40의 초기 및 후기 프로모터, tet 프로모터, 아데노바이러스 또는 시토메갈로바이러스 극초기 프로모터, RSV 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, 발현이 T7 RNA 중합효소에 의해 주도되는 T7 프로모터, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 외피 단백질에 대한 제어 영역, 3-포스포글리세린산 키나아제 또는 다른 해당효소에 대한 프로모터, 산성 인산분해효소의 프로모터, 예를 들면, Pho5, 효모 α-교배 인자의 프로모터, 배큘로바이러스 시스템의 다면체 프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 제어하는 것으로 공지된 다른 서열, 그리고 다양한 이들의 조합을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 형질전환되는 숙주 세포의 선택 및/또는 발현이 요망되는 단백질의 유형과 같은 인자에 의존할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 게다가, 벡터의 사본수, 상기 사본수를 제어하는 능력 및 상기 벡터에 의해 인코딩된 임의의 다른 단백질, 예를 들면, 항균성 마커의 발현 역시 고려되어야 한다.

본 발명의 재조합 핵산은 클로닝된 유전자, 또는 이의 부분을 원핵 세포, 진핵 세포 (효모, 조류, 곤충 또는 포유류), 또는 둘 모두에서 발현에 적합한 벡터 내로 결찰함으로써 생산될 수 있다. 재조합 ActRII 또는 GDF 트랩 폴리펩티드의 생산을 위한 발현 수송체는 플라스미드 및 다른 벡터를 포함한다. 가령, 적합한 벡터는 다음의 유형의 플라스미드를 포함한다: 원핵 세포, 예를 들면, 대장균 (E. coli)에서 발현을 위한 pBR322-유래된 플라스미드, pEMBL-유래된 플라스미드, pEX-유래된 플라스미드, pBTac-유래된 플라스미드 및 pUC-유래된 플라스미드.

일부 포유류 발현 벡터는 세균에서 벡터의 증식을 용이하게 하는 원핵 서열, 그리고 진핵 세포에서 발현되는 하나 또는 그 이상의 진핵 전사 단위 둘 모두를 내포한다. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg 유래된 벡터는 진핵 세포의 형질감염에 적합한 포유류 발현 벡터의 실례이다. 이들 벡터 중에서 일부는 원핵 및 진핵 세포 둘 모두에서 복제 및 약제 내성 선별을 용이하게 하기 위해, 세균 플라스미드, 예를 들면, pBR322로부터 서열로 변형된다. 대안으로, 바이러스, 예를 들면, 소 유두종 바이러스 (BPV-1), 또는 엡스타인 바르 바이러스 (pHEBo, pREP-유래된 및 p205)의 유도체가 진핵 세포에서 단백질의 일시적인 발현에 이용될 수 있다. 다른 바이러스 (레트로바이러스 포함) 발현 시스템의 실례는 유전자 요법 전달 시스템에 관한 아래의 설명에서 발견될 수 있다. 플라스미드의 제조 및 숙주 생명체의 형질전환에서 이용되는 다양한 방법은 당분야에서 널리 공지된다. 원핵 및 진핵 세포 둘 모두에 대한 다른 적합한 발현 시스템뿐만 아니라 일반적인 재조합 절차에 관해, 가령, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)을 참조한다. 일부 경우에, 배큘로바이러스 발현 시스템의 이용에 의해 재조합 폴리펩티드를 발현하는 것이 바람직할 수 있다. 이런 배큘로바이러스 발현 시스템의 실례는 pVL-유래된 벡터 (가령, pVL1392, pVL1393 및 pVL941), pAcUW-유래된 벡터 (가령, pAcUW1), 그리고 pBlueBac-유래된 벡터 (가령, β-gal 내포 pBlueBac III)를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 벡터는 CHO 세포에서 주제 ActRII 또는 GDF 트랩 폴리펩티드를 생산하도록 설계될 것이다, 예를 들면, Pcmv-스크립트 벡터 (Stratagene, La Jolla, Calif.), pcDNA4 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) 및 pCI-neo 벡터 (Promega, Madison, Wisc.)이다. 명백한 바와 같이, 주제 유전자 구조체는 예로서, 정제를 위한, 융합 단백질 또는 변이체 단백질을 비롯한 단백질을 생산하기 위해, 배양액에서 증식된 세포에서 주제 ActRII 폴리펩티드의 발현을 유발하는데 이용될 수 있다.

본 발명은 또한, 주제 ActRII 또는 GDF 트랩 폴리펩티드 중에서 하나 또는 그 이상에 대한 코딩 서열을 포함하는 재조합 유전자로 형질감염된 숙주 세포와 관련된다. 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 가령, 본 발명의 ActRII 또는 GDF 트랩 폴리펩티드는 세균 세포, 예를 들면, 대장균 (E. coli), 곤충 세포 (가령, 배큘로바이러스 발현 시스템 이용), 효모, 또는 포유류 세포 [가령, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주]에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있다.

따라서, 본 발명은 주제 ActRII 및 GDF 트랩 폴리펩티드를 생산하는 방법과 더욱 관련된다. 가령, ActRII 또는 GDF 트랩 폴리펩티드를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포는 ActRII 또는 GDF 트랩 폴리펩티드의 발현이 발생하도록 허용하는 적절한 조건 하에 배양될 수 있다. 폴리펩티드는 폴리펩티드를 내포하는 세포 및 배지의 혼합물로부터 분비되고 단리될 수 있다. 대안으로, ActRII 또는 GDF 트랩 폴리펩티드는 세포질에서 또는 막 분획물 내에서 유지될 수 있고, 그리고 세포는 수확되고, 용해되고, 단백질이 단리될 수 있다. 세포 배양액은 숙주 세포, 배지 및 다른 부산물을 포함한다. 세포 배양에 적합한 배지는 당분야에서 널리 공지된다. 주제 폴리펩티드는 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과, 전기이동, ActRII 또는 GDF 트랩 폴리펩티드의 특정 에피토프에 특이적인 항체로 면역친화성 정제, 그리고 ActRII 또는 GDF 트랩 폴리펩티드에 융합된 도메인에 결합하는 작용제로 친화성 정제 (가령, 단백질 A 칼럼이 ActRII-Fc 또는 GDF 트랩-Fc 융합 단백질을 정제하는데 이용될 수 있다)를 비롯하여, 단백질을 정제하기 위한 당분야에서 공지된 기술을 이용하여 세포 배양 배지, 숙주 세포, 또는 둘 모두로부터 단리될 수 있다. 일부 구체예에서, ActRII 또는 GDF 트랩 폴리펩티드는 이의 정제의 용이하게 하는 도메인을 내포하는 융합 단백질이다.

일부 구체예에서, 정제는 예로서, 다음 중에서 3가지 또는 그 이상을 임의의 순서로 포함하는 일련의 칼럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성된다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로오스 크로마토그래피, 페닐세파로오스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 그리고 양이온 교환 크로마토그래피. 정제는 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 완결될 수 있었다. ActRII-Fc 또는 GDF 트랩-Fc 단백질은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정될 때 >90%, >95%, >96%, >98%, 또는 >99%, 그리고 SDS PAGE에 의해 결정될 때 >90%, >95%, >96%, >98%, 또는 >99%의 순도까지 정제될 수 있다. 순도의 목표 수준은 포유류 시스템, 특히 비인간 영장류, 설치류 (생쥐) 및 인간에서 바람직한 결과를 달성하는데 충분한 것이어야 한다.

다른 구체예에서, 재조합 ActRII 또는 GDF 트랩 폴리펩티드의 원하는 부분의 N 말단에서 정제 리더 서열, 예를 들면, 폴리-(His)/엔테로키나아제 개열 부위 서열을 코딩하는 융합 유전자는 Ni²⁺ 금속 수지를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의한 발현된 융합 단백질의 정제를 허용할 수 있다. 정제 리더 서열은 이후, 정제된 ActRII 또는 GDF 트랩 폴리펩티드를 제공하기 위해 엔테로키나아제로 처리에 의해 차후 제거될 수 있다. 가령, Hochuli et al. (1987) J. Chromatography 411:177; 그리고 Janknecht et al. (1991) PNAS USA 88:8972를 참조한다.

융합 유전자를 만들기 위한 기술은 널리 알려져 있다. 본질적으로, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 다양한 DNA 단편의 연결은 결찰을 위한 평활 말단 또는 스태거 말단, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 소화, 적절하면 점착 말단의 채움, 바람직하지 않은 연결을 방지하기 위한 알칼리 인산분해효소 처리, 그리고 효소적 결찰을 이용하여, 전통적인 기술에 따라서 수행된다. 다른 구체예에서, 융합 유전자는 자동화된 DNA 합성장치를 포함하는 전통적인 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 2개의 연속 유전자 단편 사이에 상보성 오버행을 발생시키는 앵커 프라이머를 이용하여 실행될 수 있고, 이들 단편은 키메라 유전자 서열을 산출하기 위해 차후에 어닐링될 수 있다. 가령, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992를 참조한다.

C. 항체 길항제

일정한 양상에서, 본 발명은 ActRII 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 및/또는 SMAD 1/5/8 신호전달의 저해)을 길항작용하는 항체, 또는 항체의 조합에 관계한다. 이런 항체는 하나 또는 그 이상의 리간드 (가령, GDF8, GDF11, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7 또는 Nodal) 또는 하나 또는 그 이상의 수용체 (가령, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5)에 결합하고 이를 저해할 수 있다. 특히, 본 발명은 예로서, 치료가 필요한 개체에서 적혈구 수준을 증가시키고, 치료가 필요한 개체에서 빈혈을 치료하거나 예방하고 (가령, 수혈 부담의 감소 포함), 치료가 필요한 개체에서 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하고 및/또는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증 (가령, 빈혈, 수혈 요구, 호중구감소증, 철분 과부하, 급성 심근 경색, 간부전, 간비대, 비장비대, 급성 골수성 림프종으로의 진행)을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 개체에서 SF3B1, DNMT3A 및/또는 TET2 돌연변이와 연관된 장애를 치료하거나 예방하기 위해, 단독으로, 또는 하나 또는 그 이상의 적혈구생성 자극제 (가령, EPO) 또는 다른 지지 요법 [가령, 조혈 성장 인자 (가령, G-CSF 또는 GM-CSF), 적혈구 또는 전혈의 수혈, 철 킬레이트화 요법]과 합동으로 항체 ActRII 길항제, 또는 항체 ActRII 길항제의 조합을 이용하는 방법을 제공한다.

일정한 구체예에서, 본 발명의 바람직한 항체 ActRII 길항제는 최소한 GDF11에 결합하고 및/또는 이의 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 GDF11-매개된 활성화)을 저해하는 항체, 또는 항체의 조합이다. 임의선택적으로, 항체, 또는 항체의 조합은 특히, GDF11 및 GDF8 둘 모두에 대한 결합 친화성을 갖는 다중특이적 항체의 경우에, 또는 하나 또는 그 이상의 항-GDF11 항체 및 하나 또는 그 이상의 항-GDF8 항체의 조합의 맥락에서 GDF8에 더욱 결합하고 및/또는 이의 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 GDF8-매개된 활성화)을 저해한다. 임의선택적으로, 본 발명의 항체, 또는 항체의 조합은 액티빈 A에 실제적으로 결합하지 않고 및/또는 이의 활성 (가령, ActRIIA 또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 액티빈 A-매개된 활성화)을 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, GDF11 및/또는 GDF8에 결합하고 및/또는 이의 활성을 저해하는 본 발명의 항체, 또는 항체의 조합은 특히, 복수 ActRII 리간드에 대한 결합 친화성을 갖는 다중특이적 항체의 경우에, 또는 복수 항체의 조합 (각각은 상이한 ActRII 리간드에 대한 결합 친화성을 가짐)의 맥락에서 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, 그리고 Nodal 중에서 하나 또는 그 이상에 더욱 결합하고 및/또는 이의 활성 (가령, ActRIIA 또는 ActRIIB SMAD 2/3 및/또는 SMAD 1/5/8 신호전달의 활성화)을 저해한다.

일정한 양상에서, 본 발명의 ActRII 길항제는 최소한 GDF8에 결합하고 및/또는 이의 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 GDF8-매개된 활성화)을 저해하는 항체, 또는 항체의 조합이다. 임의선택적으로, 항체, 또는 항체의 조합은 특히, GDF8 및 GDF11 둘 모두에 대한 결합 친화성을 갖는 다중특이적 항체의 경우에, 또는 하나 또는 그 이상의 항-GDF8 항체 및 하나 또는 그 이상의 항-GDF11 항체의 조합의 맥락에서 GDF11에 더욱 결합하고 및/또는 이의 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 GDF11-매개된 활성화)을 저해한다. 임의선택적으로, 본 발명의 항체, 또는 항체의 조합은 액티빈 A에 실제적으로 결합하지 않고 및/또는 이의 활성 (가령, ActRIIA 또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 액티빈 A-매개된 활성화)을 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, GDF8 및/또는 GDF11에 결합하고 및/또는 이의 활성을 저해하는 본 발명의 항체, 또는 항체의 조합은 특히, 복수 ActRII 리간드에 대한 결합 친화성을 갖는 다중특이적 항체의 경우에, 또는 조합 복수 항체 (각각은 상이한 ActRII 리간드에 대한 결합 친화성을 가짐)의 맥락에서 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, 그리고 Nodal 중에서 하나 또는 그 이상에 더욱 결합하고 및/또는 이의 활성 (가령, ActRIIA 또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 및/또는 SMAD 1/5/8 신호전달의 활성화)을 저해한다.

다른 양상에서, 본 발명의 ActRII 길항제는 ActRII 수용체 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체)에 결합하고 및/또는 이의 활성을 저해하는 항체, 또는 항체의 조합이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항-ActRII 수용체 항체 (가령, 항-ActRIIA 또는 항-ActRIIB 수용체 항체), 또는 항체의 조합은 ActRII 수용체에 결합하고, 그리고 최소한 GDF11에 의한 ActRII 수용체의 결합 및/또는 활성화 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 GDF11-매개된 활성화)를 예방한다. 임의선택적으로, 본 발명의 항-ActRII 수용체 항체, 또는 항체의 조합은 GDF8에 의한 ActRII 수용체의 결합 및/또는 활성화를 더욱 예방한다. 임의선택적으로, 본 발명의 항-ActRII 수용체 항체, 또는 항체의 조합은 액티빈 A가 ActRII 수용체에 결합하고 및/또는 이를 활성화하는 것을 실제적으로 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, ActRII 수용체에 결합하고, 그리고 GDF11 및/또는 GDF8에 의한 ActRII 수용체의 결합 및/또는 활성화를 예방하는 본 발명의 항-ActRII 수용체 항체, 또는 항체의 조합은 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7 및 Nodal 중에서 하나 또는 그 이상에 의한 ActRII 수용체의 결합 및/또는 활성화를 더욱 예방한다.

용어 항체는 본원에서 가장 넓은 의미에서 이용되고, 그리고 원하는 항원 결합 활성을 전시하기만 하면, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다. 항체 단편은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 실례는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (가령, scFv); 그리고 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 가령, Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134; Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); WO 93/16185; 그리고 U.S. 특허 번호 5,571,894, 5,587,458 및 5,869,046을 참조한다. 본원에서 개시된 항체는 다중클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 항체는 거기에 부착되고 검출될 수 있는 표지를 포함한다 (가령, 표지는 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조인자일 수 있다). 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 단리된 항체이다.

디아바디는 이가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 가령, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134 (2003); 그리고 Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디 역시 Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134에서 설명된다.

단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부, 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 일정한 구체예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다. 가령, U.S. 특허 번호 6,248,516을 참조한다.

항체 단편은 본원에서 설명된 바와 같이, 무손상 항체의 단백질분해 소화뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (가령, 대장균 (E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다.

본원에서 항체는 임의의 부류일 수 있다. 항체의 부류는 중쇄에 의해 소유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 그리고 IgM이 있고, 그리고 이들 중에서 몇몇은 하위부류 (아이소타입), 예를 들면, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂로 더욱 세분될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 알파, 델타, 엡실론, 감마, 그리고 뮤로 불린다.

일반적으로, 본원에서 개시된 방법에서 이용을 위한 항체는 바람직하게는 높은 결합 친화성으로 이의 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 친화성은 K_D 값으로서 표현될 수 있고 내재성 결합 친화성 (가령, 최소화된 결합능 효과에서)을 반영한다. 전형적으로, 결합 친화성은 무세포 또는 세포-연관된 세팅에서 인지에 상관없이, 시험관내에서 계측된다. 본원에서 개시된 것들을 비롯하여, 당분야에서 공지된 다수의 검정 중에서 한 가지, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명 (Biacore™ 검정), 방사성표지화된 항원 결합 검정 (RIA) 및 ELISA가 결합 친화성 치수를 획득하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 그들의 표적 항원 (가령, GDF11, GDF8, ActRIIA, ActRIIB 등)에 최소한 1x 10^-7 또는 더욱 강한, 1x10^-8 또는 더욱 강한, 1x10^-9 또는 더욱 강한, 1x10^-10 또는 더욱 강한, 1x10^-11 또는 더욱 강한, 1x10^-12 또는 더욱 강한, 1x10^-13 또는 더욱 강한, 또는 1x10^-14 또는 더욱 강한 K_D로 결합한다.

일정한 구체예에서, K_D는 다음의 검정에 의해 설명된 바와 같이, 관심되는 항체의 Fab 이형 및 이의 표적 항원으로 수행된 RIA에 의해 계측된다. 항원에 대한 Fab의 용해 결합 친화성은 Fab를 표지화되지 않은 항원의 적정 연속의 존재에서 최소 농도의 방사성표지화된 항원 (가령, ¹²⁵I-표지화)과 평형시키고, 이후 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 평판으로 포획함으로써 계측된다 [가령, Chen et al. (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881을 참조한다]. 검정에 대한 조건을 확립하기 위해, 다중웰 평판 (가령, Thermo Scientific으로부터 MICROTITER^®)이 포획 항-Fab 항체 (가령, Cappel Labs로부터)로 코팅되고 (가령, 하룻밤 동안), 그리고 바람직하게는 실온 (대략 23 ℃)에서 소 혈청 알부민으로 차후에 차단된다. 비-흡착 평판에서, 방사성표지화된 항원은 관심되는 Fab의 연속 희석액과 혼합된다 [가령, Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599에서 항-VEGF 항체, Fab-12의 사정과 일치]. 관심되는 Fab는 이후, 바람직하게는 하룻밤 동안 배양되지만, 배양은 평형이 도달되도록 담보하기 위해 더욱 긴 기간 (가령, 약 65 시간) 동안 계속될 수 있다. 그 후에, 혼합물은 바람직하게는 실온에서 약 1 시간 동안 배양을 위해 포획 평판으로 이전된다. 용액은 이후 제거되고, 그리고 평판은 바람직하게는 폴리소르베이트 20 및 PBS 혼합물로 수회 세척된다. 평판이 건조될 때, 신틸란트 (가령, Packard로부터 MICROSCINT^®)가 첨가되고, 그리고 이들 평판은 감마 계수기 (가령, Packard로부터 TOPCOUNT^®)에서 계수된다.

다른 구체예에 따라, K_D는 예로서, 약 10 반응 단위 (RU)에서 고정된 항원 CM5 칩이 구비된 BIACORE^®2000 또는 BIACORE^®3000 (Biacore, Inc., Piscataway, N.J.)을 이용한 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 계측된다. 간단히 말하면, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, Biacore, Inc.)은 공급업체의 사용설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화된다. 가령, 항원은 대략 10 반응 단위 (RU)의 연계된 단백질을 달성하기 위해 5 μl/분의 유속에서 주입 전에 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.8로 5 μg/ml (약 0.2 μM)까지 희석될 수 있다. 항원의 주입 이후에, 반응하지 않은 그룹을 차단하기 위해 1 M 에탄올아민이 주입된다. 동역학 계측을 위해, Fab의 2-배 연속 희석액 (0.78 nM에서 500 nM로)이 대략 25 μl/분의 유속에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20^®) 계면활성제 (PBST)와 함께 PBS에서 주입된다. 연관률 (k_on) 및 해리율 (k_off)은 예로서, 연관 및 해리 센서그램을 동시에 적합시킴으로써 단순한 1 대 1 랭뮤어 결합 모형 (BIACORE^® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 계산된다. 평형 해리 상수 (K_D)는 비율 k_off / k_on로서 계산된다 [가령, Chen et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881을 참조한다]. 온 레이트가 예로서, 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 10⁶ M^-1 s^-1를 초과하면, 온 레이트는 분광계, 예를 들면, 정지-유동 구비된 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반된 큐벳이 구비된 8000-계열 SLM-AMINCO^® 분광광도계 (ThermoSpectronic)에서 계측될 때 증가하는 농도의 항원의 존재에서 PBS에서 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 형광 방출 강도 (가령, 여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역)에서 증가 또는 감소를 계측하는 형광 퀀칭 기술을 이용함으로써 결정될 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, 항-GDF11 항체는 일반적으로, 항체가 GDF11을 표적화하는데 있어서 진단적 및/또는 치료적 작용제로서 유용할 만큼 충분한 친화성으로 GDF11에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 일정한 구체예에서, 관련 없는, 비-GDF11 단백질에 항-GDF11 항체의 결합 정도는 예로서, 방사면역검정 (RIA)에 의해 계측될 때, GDF11에 상기 항체의 결합의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%보다 적다. 일정한 구체예에서, 항-GDF11 항체는 상이한 종으로부터 GDF11 사이에서 보존되는 GDF11의 에피토프에 결합한다. 일정한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항-GDF11 항체는 GDF11 활성을 저해할 수 있는 길항제 항체이다. 가령, 본 발명의 항-GDF11 항체는 GDF11이 동계 수용체 (가령, ActRIIA 또는 ActRIIB 수용체)에 결합하는 것을 저해하고 및/또는 ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체에 의한 동계 수용체의 GDF11-매개된 신호 전달 (활성화), 예를 들면, SMAD2/3 신호전달을 저해할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항-GDF11 항체는 액티빈 A에 실제적으로 결합하지 않고 및/또는 이의 활성을 저해하지 않는다. GDF11은 GDF8에 높은 서열 상동성을 갖고, 그리고 이런 이유로, GDF11에 결합하고 및/또는 이를 저해하는 항체는 일부 경우에, 또한 GDF8에 결합하고 및/또는 이를 저해할 수 있는 것으로 유의되어야 한다.

항-GDF8 항체는 항체가 GDF8을 표적화하는데 있어서 진단적 및/또는 치료적 작용제로서 유용할 만큼 충분한 친화성으로 GDF8에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 일정한 구체예에서, 관련 없는, 비-GDF8 단백질에 항-GDF8 항체의 결합 정도는 예로서, 방사면역검정 (RIA)에 의해 계측될 때, GDF8에 상기 항체의 결합의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%보다 적다. 일정한 구체예에서, 항-GDF8 항체는 상이한 종으로부터 GDF8 사이에서 보존되는 GDF8의 에피토프에 결합한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항-GDF8 항체는 GDF8 활성을 저해할 수 있는 길항제 항체이다. 가령, 본 발명의 항-GDF8 항체는 GDF8이 동계 수용체 (가령, ActRIIA 또는 ActRIIB 수용체)에 결합하는 것을 저해하고 및/또는 ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체에 의한 동계 수용체의 GDF8-매개된 신호 전달 (활성화), 예를 들면, SMAD2/3 신호전달을 저해할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항-GDF8 항체는 액티빈 A에 실제적으로 결합하지 않고 및/또는 이의 활성을 저해하지 않는다. GDF8은 GDF11에 높은 서열 상동성을 갖고, 그리고 이런 이유로, GDF8에 결합하고 및/또는 이를 저해하는 항체는 많은 경우에, 또한 GDF11에 결합하고 및/또는 이를 저해할 수 있는 것으로 유의되어야 한다.

항-ActRIIA 항체는 항체가 ActRIIA을 표적화하는데 있어서 진단적 및/또는 치료적 작용제로서 유용할 만큼 충분한 친화성으로 ActRIIA에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 일정한 구체예에서, 관련 없는, 비-ActRIIA 단백질에 항-ActRIIA 항체의 결합 정도는 예로서, 방사면역검정 (RIA)에 의해 계측될 때, ActRIIA에 상기 항체의 결합의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%보다 적다. 일정한 구체예에서, 항-ActRIIA 항체는 상이한 종으로부터 ActRIIA 사이에서 보존되는 ActRIIA의 에피토프에 결합한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항-ActRIIA 항체는 ActRIIA 활성을 저해할 수 있는 길항제 항체이다. 가령, 본 발명의 항-ActRIIA 항체는 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, GDF11, GDF8, 액티빈 A, BMP6 및 BMP7에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 ActRIIA 리간드가 ActRIIA 수용체에 결합하는 것을 저해하고 및/또는 이들 리간드 중에서 한 가지가 ActRIIA 신호전달 (가령, SMAD2/3 및/또는 SMAD 1/5/8 ActRIIA 신호전달)을 활성화하는 것을 저해할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항-ActRIIA 항체는 GDF11이 ActRIIA 수용체에 결합하는 것을 저해하고 및/또는 GDF11이 ActRIIA 신호전달을 활성화하는 것을 저해한다. 임의선택적으로, 본 발명의 항-ActRIIA 항체는 GDF8이 ActRIIA 수용체에 결합하는 것을 더욱 저해하고 및/또는 GDF8이 ActRIIA 신호전달을 활성화하는 것을 더욱 저해한다. 임의선택적으로, 본 발명의 항-ActRIIA 항체는 액티빈 A가 ActRIIA 수용체에 결합하는 것을 실제적으로 저해하지 않고 및/또는 ActRIIA 신호전달의 액티빈 A-매개된 활성화를 실제적으로 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, GDF11 및/또는 GDF8이 ActRIIA 수용체에 결합하고 및/또는 이를 활성화하는 것을 저해하는 본 발명의 항-ActRIIA 항체는 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 A, GDF8, BMP6 및 BMP7 중에서 하나 또는 그 이상이 ActRIIA 수용체에 결합하고 및/또는 이를 활성화하는 것을 더욱 저해한다.

항-ActRIIB 항체는 항체가 ActRIIB을 표적화하는데 있어서 진단적 및/또는 치료적 작용제로서 유용할 만큼 충분한 친화성으로 ActRIIB에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 일정한 구체예에서, 관련 없는, 비-ActRIIB 단백질에 항-ActRIIB 항체의 결합 정도는 예로서, 방사면역검정 (RIA)에 의해 계측될 때, ActRIIB에 상기 항체의 결합의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%보다 적다. 일정한 구체예에서, 항-ActRIIB 항체는 상이한 종으로부터 ActRIIB 사이에서 보존되는 ActRIIB의 에피토프에 결합한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항-ActRIIB 항체는 ActRIIB 활성을 저해할 수 있는 길항제 항체이다. 가령, 본 발명의 항-ActRIIB 항체는 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, GDF11, GDF8, 액티빈 A, BMP6 및 BMP7에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 ActRIIB 리간드가 ActRIIB 수용체에 결합하는 것을 저해하고 및/또는 이들 리간드 중에서 한 가지가 ActRIIB 신호전달 (가령, SMAD2/3 및/또는 SMAD 1/5/8 ActRIIB 신호전달)을 활성화하는 것을 저해할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항-ActRIIB 항체는 GDF11이 ActRIIB 수용체에 결합하는 것을 저해하고 및/또는 GDF11이 ActRIIB 신호전달을 활성화하는 것을 저해한다. 임의선택적으로, 본 발명의 항-ActRIIB 항체는 GDF8이 ActRIIB 수용체에 결합하는 것을 더욱 저해하고 및/또는 GDF8이 ActRIIB 신호전달을 활성화하는 것을 더욱 저해한다. 임의선택적으로, 본 발명의 항-ActRIIB 항체는 액티빈 A가 ActRIIB 수용체에 결합하는 것을 실제적으로 저해하지 않고 및/또는 ActRIIB 신호전달의 액티빈 A-매개된 활성화를 실제적으로 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, GDF11 및/또는 GDF8이 ActRIIB 수용체에 결합하고 및/또는 이를 활성화하는 것을 저해하는 본 발명의 항-ActRIIB 항체는 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 A, GDF8, BMP6 및 BMP7 중에서 하나 또는 그 이상이 ActRIIB 수용체에 결합하고 및/또는 이를 활성화하는 것을 더욱 저해한다.

인간 GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, GDF8, BMP6, BMP7, ActRIIB 및 ActRIIA의 핵산 및 아미노산 서열은 당분야에서 널리 공지되고, 따라서 본 발명에 따른 용도를 위한 항체 길항제는 당분야에서 지식 및 본원에서 제공된 교시에 근거하여 당업자에 의해 일과적으로 만들어질 수 있다.

일정한 구체예에서, 본원에서 제공된 항체 (가령, 항-GDF11 항체, 항-GDF8 항체, 항-ActRIIA 항체 또는 항-ActRIIB 항체)는 키메라 항체이다. 키메라 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되고, 반면 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 일정한 키메라 항체는 예로서, U.S. 특허 번호 4,816,567; 그리고 Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855에서 설명된다. 일부 구체예에서, 키메라 항체는 비인간 가변 영역 (가령, 생쥐, 쥐, 햄스터, 토끼, 또는 비인간 영장류, 예를 들면, 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 부모 항체의 것으로부터 변화된 "클래스 전환된" 항체이다. 일반적으로, 키메라 항체는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.

일정한 구체예에서, 본원에서 제공된 키메라 항체 (가령, 항-GDF11 항체, 항-GDF8 항체, 항-ActRIIA 항체 또는 항-ActRIIB 항체)는 인간화 항체이다. 인간화 항체는 비인간 초가변 영역 (HVRs)으로부터 아미노산 잔기 및 인간 프레임워크 영역 (FRs)으로부터 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 일정한 구체예에서, 인간화 항체는 최소한 하나, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실제적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 HVR (가령, CDR)의 전부 또는 실제적으로 전부가 비인간 항체의 것들에 상응하고, 그리고 FR의 전부 또는 실제적으로 전부가 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화 항체는 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역 중에서 최소한 일부를 임의선택적으로 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.

인간화 항체 및 이들을 만드는 방법은 예로서, Almagro and Fransson (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633에서 리뷰되고, 그리고 예로서, Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-329; Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; U.S. Pat. Nos. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409; Kashmiri et al., (2005) Methods 36:25-34 [SDR (a-CDR) 합체를 설명]; Padlan, Mol. Immunol. (1991) 28:489-498 ("표면치환"을 설명); Dall'Acqua et al. (2005) Methods 36:43-60 ("FR 뒤섞음"을 설명); Osbourn et al. (2005) Methods 36:61-68; 그리고 Klimka et al. Br. J. Cancer (2000) 83:252-260 (FR 뒤섞음에 대한 "보도된 선별" 접근법을 설명)에서 더욱 설명된다.

인간화에 이용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: "최고 적합" 방법을 이용하여 선별된 프레임워크 영역 [가령, Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296을 참조한다]; 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위군의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 [가령, Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; 그리고 Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623을 참조한다]; 인간 성숙 (체성으로 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역 [가령, Almagro and Fransson (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633을 참조한다]; 그리고 FR 라이브러리 선별검사로부터 유래된 프레임워크 영역 [가령, Baca et cd., (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; 그리고 Rosok et cd., (1996) J. Biol. Chem. 271:22611-22618을 참조한다].

일정한 구체예에서, 본원에서 제공된 항체 (가령, 항-GDF11 항체, 항-GDF8 항체, 항-ActRIIA 항체 또는 항-ActRIIB 항체)는 인간 항체이다. 인간 항체는 당분야에서 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 van Dijk and van de Winkel (2001) Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 및 Lonberg (2008) Curr. Opin. Immunol. 20:450-459에서 전반적으로 설명된다.

인간 항체는 항원 공격에 대한 응답으로 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 유전자도입 동물에 면역원 (가령, GDF11 폴리펩티드, GDF8 폴리펩티드, ActRIIA 폴리펩티드, 또는 ActRIIB 폴리펩티드)을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이런 동물은 전형적으로, 인간 면역글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 내포하는데, 이들은 내인성 면역글로불린 좌위를 대체하거나, 또는 이들은 염색체외로 존재하거나 또는 동물의 염색체 내로 무작위로 통합된다. 이런 유전자도입 동물에서, 내인성 면역글로불린 좌위는 일반적으로 비활성화된다. 유전자도입 동물로부터 인간 항체를 획득하기 위한 방법의 리뷰를 위해, 가령 Lonberg (2005) Nat. Biotechnol. 23:1117-1125; U.S. 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (XENOMOUSE™ 기술을 설명); U.S. 특허 번호 5,770,429 (HuMab^® 기술을 설명); U.S. 특허 번호 7,041,870 (K-M 생쥐 기술을 설명); 그리고 U.S. 특허 출원 공개 번호 2007/0061900 (VelociMouse^®기술을 설명)을 참조한다. 이런 동물에 의해 산출된 무손상 항체로부터 인간 가변 영역은 예로서, 상이한 인간 불변 영역과 합동함으로써 더욱 변형될 수 있다.

본원에서 제공된 인간 항체는 또한, 하이브리도마-기초된 방법에 의해 만들어질 수 있다. 인간 단일클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 생쥐-인간 헤테로골수종 세포주가 설명되었다 [가령, Kozbor J. Immunol., (1984) 133: 3001; Brodeur et al. (1987) Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York; 그리고 Boerner et al. (1991) J. Immunol., 147: 86을 참조한다]. 인간 B-세포 하이브리도마 기법을 통해 산출된 인간 항체 역시 Li et al., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562에서 설명된다. 추가 방법은 예로서, U.S. 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 단일클론 인간 IgM 항체의 생산을 설명) 및 Ni, Xiandai Mianyixue (2006) 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마를 설명)에서 설명된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기법 (트리오마 기술) 역시 Vollmers and Brandlein (2005) Histol. Histopathol., 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein (2005) Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 27(3):185-91에서 설명된다.

본원에서 제공된 인간 항체 (가령, 항-GDF11 항체, 항-액티빈 B 항체, 항-ActRIIA 항체 또는 항-ActRIIB 항체)는 또한, 인간-유래된 파지 전시 라이브러리에서 선택되는 Fv 클론 가변적-도메인 서열을 단리함으로써 산출될 수 있다. 이런 가변적-도메인 서열은 이후, 원하는 인간 불변 도메인과 합동될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하기 위한 기술은 본원에서 설명된다.

가령, 본 발명의 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 선별검사함으로써 단리될 수 있다. 파지 전시 라이브러리를 산출하고 원하는 결합 특징을 소유하는 항체에 대해 이런 라이브러리를 선별검사하기 위한 다양한 방법이 당분야에서 공지된다. 이런 방법은 예로서, Hoogenboom et al. (2001) in Methods in Molecular Biology 178:1-37, O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J.에서 리뷰되고, 그리고 예로서, McCafferty et al. (1991) Nature 348:552-554; Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628; Marks et al. (1992) J. Mol. Biol. 222:581-597; Marks and Bradbury (2003) in Methods in Molecular Biology 248:161-175, Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J.; Sidhu et al. (2004) J. Mol. Biol. 338(2):299-310; Lee et al. (2004) J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093; Fellouse (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472; 그리고 Lee et al. (2004) J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132에서 더욱 설명된다.

일정한 파지 전시 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별개로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되는데, 이들은 이후, Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455에서 설명된 바와 같이 항원 결합 파지에 대해 선별검사될 수 있다. 파지는 전형적으로, 항체 단편을 단일 사슬 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 전시한다. 면역화된 공급원으로부터 라이브러리는 하이브리도마를 작제해야 하는 요구 없이, 높은 친화성 항체를 면역원 (가령, GDF11, 액티빈 B, ActRIIA, 또는 ActRIIB)에 제공한다. 대안으로, Griffiths et al. (1993) EMBO J, 12: 725-734에 의해 설명된 바와 같이, 면역화 없이 넓은 범위의 비자가 항원 및 또한 자가항원에 대해 지향된 항체의 단일 공급원을 제공하기 위해, 미경험 레퍼토리가 클로닝될 수 있다 (가령, 인간으로부터). 최종적으로, 미경험 라이브러리는 또한, Hoogenboom 및 Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381-388에 의해 설명된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 그리고 고도로 가변적 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내에서 재배열을 달성하는 무작위 서열을 내포하는 PCR 프라이머를 이용함으로써 합성적으로 만들어질 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 설명하는 특허 공보는 예로서: U.S. 특허 번호 5,750,373, 그리고 U.S. 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360을 포함한다.

일정한 구체예에서, 본원에서 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체 (전형적으로, 단일클론 항체)는 하나 또는 그 이상 (가령, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상)의 항원 상에서 최소한 2개의 상이한 에피토프 (가령, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개 또는 그 이상)에 대한 결합 특이성을 갖는다.

일정한 구체예에서, 본 발명의 다중특이적 항체는 2개 또는 그 이상의 결합 특이성을 포함하는데, 이들 결합 특이성 중에서 최소한 하나는 GDF11 에피토프에 대한 것이고, 그리고 임의선택적으로, 하나 또는 그 이상의 추가 결합 특이성은 상이한 ActRII 리간드 (가령, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7 및/또는 Nodal) 및/또는 ActRII 수용체 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체 상에서 에피토프에 대한 것이다). 일정한 구체예에서, 다중특이적 항체는 GDF11의 2개 또는 그 이상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 부분적으로 GDF11 에피토프에 대한 결합 친화성을 갖는 본 발명의 다중특이적 항체는 GDF11 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체에 결합하고 및/또는 이를 활성화시키는 능력)을 저해하고, 그리고 임의선택적으로, 하나 또는 그 이상의 상이한 ActRII 리간드 (가령, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7 및/또는 Nodal) 및/또는 ActRII 수용체 (가령, ActRIIA 또는 ActRIIB 수용체)의 활성을 저해하는데 이용될 수 있다. 일정한 바람직한 구체예에서, GDF11에 결합하고 및/또는 이를 저해하는 본 발명의 다중특이적 항체는 최소한 GDF8에 더욱 결합하고 및/또는 이를 더욱 저해한다. 임의선택적으로, GDF11에 결합하고 및/또는 이를 저해하는 본 발명의 다중특이적 항체는 액티빈 A에 실제적으로 결합하지 않고 및/또는 실제적으로 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, GDF11 및 GDD8에 결합하고 및/또는 이들을 저해하는 본 발명의 다중특이적 항체는 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7 및/또는 Nodal 중에서 하나 또는 그 이상에 더욱 결합하고 및/또는 이를 더욱 저해한다.

일정한 구체예에서, 본 발명의 다중특이적 항체는 2개 또는 그 이상의 결합 특이성을 포함하는데, 이들 결합 특이성 중에서 최소한 하나는 GDF8 에피토프에 대한 것이고, 그리고 임의선택적으로, 하나 또는 그 이상의 추가 결합 특이성은 상이한 ActRII 리간드 (가령, GDF11, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7 및/또는 Nodal) 및/또는 ActRII 수용체 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체) 상에서 에피토프에 대한 것이다. 일정한 구체예에서, 다중특이적 항체는 GDF8의 2개 또는 그 이상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 부분적으로 GDF8 에피토프에 대한 결합 친화성을 갖는 본 발명의 다중특이적 항체는 GDF8 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체에 결합하고 및/또는 이를 활성화시키는 능력)을 저해하고, 그리고 임의선택적으로, 하나 또는 그 이상의 상이한 ActRII 리간드 (가령, GDF11, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7 및/또는 Nodal) 및/또는 ActRII 수용체 (가령, ActRIIA 또는 ActRIIB 수용체)의 활성을 저해하는데 이용될 수 있다. 일정한 바람직한 구체예에서, GDF8에 결합하고 및/또는 이를 저해하는 본 발명의 다중특이적 항체는 최소한 GDF11에 더욱 결합하고 및/또는 이를 더욱 저해한다. 임의선택적으로, GDF8에 결합하고 및/또는 이를 저해하는 본 발명의 다중특이적 항체는 액티빈 A에 실제적으로 결합하지 않고 및/또는 이를 실제적으로 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, GDF8 및 GDF11에 결합하고 및/또는 이들을 저해하는 본 발명의 다중특이적 항체는 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7 및/또는 Nodal 중에서 하나 또는 그 이상에 더욱 결합하고 및/또는 이를 더욱 저해한다.

"문어 항체"를 비롯하여, 3개 또는 그 이상의 기능 항원 결합 부위를 갖는 가공된 항체 역시 본원에서 포함된다 (가령, US 2006/0025576A1을 참조한다).

일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 항체 (가령, 항-GDF11 항체, 항-액티빈 B 항체, 항-ActRIIA 항체 또는 항-ActRIIB 항체)는 단일클론 항체이다. 단일클론 항체는 실제적으로 균질한 항체의 개체군으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 다시 말하면, 상기 개체군을 구성하는 개별 항체는 예로서, 단일클론 항체 제조의 생산 동안 발생하는 자연발생 돌연변이를 내포하는 가능한 변이체 항체를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합하고, 이런 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 에피토프에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제조물과 대조적으로, 단일클론 항체 제조물의 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 에피토프에 대해 지향된다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 실제적으로 균질한 개체군으로부터 획득되는 것으로서 항체의 특징을 지시하고, 그리고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 가령, 본 발명 방법에 따라서 이용되는 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 전시 방법, 그리고 인간 면역글로불린 좌위 중에서 전부 또는 일부를 내포하는 유전자도입 동물을 활용하는 방법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있고, 이런 방법 및 단일클론 항체를 만들기 위한 다른 예시적인 방법은 본원에서 설명된다.

가령, GDF11 또는 GDF8로부터 유래된 면역원을 이용함으로써, 항단백질/항-펩티드 항혈청 또는 단일클론 항체가 표준 프로토콜에 의해 만들어질 수 있다 [가령, Antibodies: A Laboratory Manual (1988) ed. by Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Press를 참조한다]. 포유동물, 예를 들면, 생쥐, 햄스터, 또는 토끼는 GDF11 또는 GDF8 폴리펩티드의 면역원성 형태, 항체 반응을 이끌어낼 수 있는 항원성 단편, 또는 융합 단백질로 면역화될 수 있다. 면역원성을 단백질 또는 펩티드에 부여하기 위한 기술은 담체에 접합 또는 당분야에서 널리 공지된 다른 기술을 포함한다. GDF11 또는 GDF8 폴리펩티드의 면역원성 부분은 어쥬번트의 존재에서 투여될 수 있다. 면역화의 진행은 혈장 또는 혈청에서 항체 역가의 검출에 의해 모니터링될 수 있다. 표준 ELISA 또는 다른 면역검정은 항체 생산의 수준 및/또는 결합 친화성의 수준을 사정하기 위한 항원으로서 면역원용으로 이용될 수 있다.

GDF11 또는 GDF8의 항원성 제조물로 동물의 면역화 이후에, 항혈청이 획득될 수 있고, 그리고 원하는 경우에, 다중클론 항체가 혈청으로부터 단리될 수 있다. 단일클론 항체를 생산하기 위해, 항체 생산 세포 (림프구)가 면역화된 동물로부터 수확될 수 있고, 그리고 표준 체세포 융합 절차에 의해 영속화 세포, 예를 들면, 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마 세포가 산출될 수 있다. 이런 기술은 당분야에서 널리 공지되고, 그리고 예로서, 하이브리도마 기술 [가령, Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-497을 참조한다], 인간 B 세포 하이브리도마 기술 [가령, Kozbar et al. (1983) Immunology Today, 4:72를 참조한다], 그리고 인간 단일클론 항체를 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술 [Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96]을 포함한다. 하이브리도마 세포는 GDF11 또는 GDF8 폴리펩티드와 특이적으로 반응성인 항체의 생산을 위해 면역화학적으로 선별검사될 수 있고, 그리고 단일클론 항체는 이런 하이브리도마 세포를 포함하는 배양액으로부터 단리될 수 있다.

일정한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형이 본원에서 제공된 항체 (가령, 항-GDF11 항체, 항-액티빈 B 항체, 항-ActRIIA 항체 또는 항-ActRIIB 항체)의 Fc 영역 내로 도입되고, 따라서 Fc-영역 변이체가 산출될 수 있다. Fc-영역 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (가령, 치환, 결실, 및/또는 부가)을 포함하는 인간 Fc-영역 서열 (가령, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.

가령, 본 발명은 항체 변이체를 적용을 위한 바람직한 후보로 만드는 전부가 아닌 일부 작동체 기능을 소유하는 항체 변이체를 예기하고, 여기서 생체내에서 항체의 반감기가 중요하지만, 일정한 작동체 기능 [가령, 보체 의존성 세포독성 (CDC) 및 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)]은 불필요하거나 또는 유해하다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확증하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정이 수행될 수 있다. 가령, 항체가 FcγR 결합을 결여 (따라서, 아마도 ADCC 활성을 결여)하지만, FcRn 결합 능력을 유지하도록 담보하기 위해 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정이 수행될 수 있다. ADCC를 매개하기 위한 일차 세포, NK 세포는 단지 FcγRIII만을 발현하고, 반면 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서 FcR 발현은 예로서, Ravetch and Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-492에서 요약된다. 관심되는 분자의 ADCC 활성을 사정하는 시험관내 검정의 무제한적 실례는 U.S. 특허 번호 5,500,362; Hellstrom, I. et al. (1986) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063; Hellstrom, I et al. (1985) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502; U.S. Pat. No. 5,821,337; 그리고 Bruggemann, M. et al. (1987) J. Exp. Med. 166:1351-1361에서 설명된다. 대안으로, 비방사성 검정 방법이 이용될 수 있다 (가령, ACTI™, 유세포분석법을 위한 비방사성 세포독성 검정; CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.; 그리고 CytoTox 96^®비방사성 세포독성 검정, Promega, Madison, Wis.). 이런 검정을 위한 유용한 작동체 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안으로, 또는 부가적으로, 관심되는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 동물 모형, 예를 들면, Clynes et al. (1998) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656에서 개시된 것에서 사정될 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성을 결여한다는 것을 확증하기 위해, C1q 결합 검정이 또한 실행될 수 있다 [가령, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다]. 보체 활성화를 사정하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다[가령, Gazzano-Santoro et al. (1996) J. Immunol. Methods 202:163; Cragg, M. S. et al. (2003) Blood 101:1045-1052; 그리고 Cragg, M. S, and M. J. Glennie (2004) Blood 103:2738-2743을 참조한다]. FcRn 결합 및 생체내 소실/반감기 결정 역시 당분야에서 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다 [가령, Petkova, S. B. et al. (2006) Int. Immunol. 18(12):1759-1769를 참조한다].

감소된 작동체 기능을 갖는 본 발명의 항체 (가령, 항-GDF11 항체, 항-액티빈 B 항체, 항-ActRIIA 항체 또는 항-ActRIIB 항체)는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중에서 하나 또는 그 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (U.S. 특허 번호 6,737,056). 이런 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 이른바 "DANA" Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중에서 2개 또는 그 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (U.S. 특허 번호 7,332,581).

일정한 구체예에서, 시스테인-가공된 항체, 예를 들면, "thioMAbs,"를 창출하는 것이 바람직할 수 있는데, 여기서 항체의 하나 또는 그 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된다. 특정한 구체예에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 이들 잔기를 시스테인으로 대체함으로써, 반응성 티올 기가 따라서, 항체의 접근가능한 부위에서 배치되고, 그리고 본원에서 더욱 설명된 바와 같이, 항체를 다른 모이어티, 예를 들면, 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합하여 면역접합체를 창출하는데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 다음의 잔기 중에서 임의의 하나 또는 그 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 그리고 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 가공된 항체는 예로서, U.S. 특허 번호 7,521,541에서 설명된 바와 같이 산출될 수 있다.

이에 더하여, 바람직한 항체를 확인하기 위해 항체를 선별검사하는데 이용되는 기술은 획득된 항체의 성질에 영향을 줄 수 있다. 가령, 항체가 용해 상태에서 항원에 결합하는데 이용되면, 용해 결합을 시험하는 것이 바람직할 수 있다. 특히 바람직한 항체를 확인하기 위해 항체 및 항원 사이에 상호작용을 시험하기 위한 다양한 상이한 기술이 가용하다. 이런 기술은 ELISAs, 표면 플라스몬 공명 결합 검정 (가령, Biacore™ 결합 검정, Biacore AB, Uppsala, Sweden), 샌드위치 검정 (가령, IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland의 상자성 비드 시스템), 웨스턴 블롯, 면역침전 검정, 그리고 면역조직화학을 포함한다.

일정한 구체예에서, 본원에서 제공된 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체가 예기된다. 가령, 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이런 변형은 예로서, 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열로부터 결실, 및/또는 이들 서열 내로 삽입, 및/또는 이들 서열 내에 잔기의 치환을 포함한다. 최종 구조체가 원하는 특징, 예를 들면, 표적-결합 (GDF11, GDF8, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 결합)을 소유한다면, 이러한 최종 구조체에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 만들어질 수 있다.

예로서, 항체 친화성을 향상시키기 위해, HVR에서 변경 (가령, 치환)이 만들어질 수 있다. 이런 변경은 HVR "핫스팟", 다시 말하면, 체성 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩된 잔기 (가령, Chowdhury (2008) Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)을 참조한다) 및/또는 SDR (a-CDRs)에서 만들어질 수 있고, 결과의 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대해 시험된다. 이차 라이브러리를 작제하고 이들로부터 재선별함에 의한 친화성 성숙은 당분야에서 설명되었다 [가령, Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178:1-37, O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., (2001)를 참조한다]. 친화성 성숙의 일부 구체예에서, 다양성이 다양한 방법 (가령, 오류 가능성 PCR, 사슬 뒤섞음, 또는 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이) 중에서 한 가지에 의해 성숙을 위해 선택된 가변적 유전자 내로 도입된다. 이차 라이브러리가 이후 창출된다. 상기 라이브러리는 이후, 원하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 선별검사된다. 다양성을 도입하는 다른 방법은 HVR-지향된 접근법을 수반하고, 여기서 여러 HVR 잔기 (가령, 한 번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관련된 HVR 잔기는 예로서, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모형화를 이용하여 특이적으로 확인될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 빈번하게 표적화된다.

일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이런 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실제적으로 감소시키지 않으면, 하나 또는 그 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 가령, 결합 친화성을 실제적으로 감소시키지 않는 보존성 변경 (가령, 본원에서 제시된 바와 같은 보존성 치환)이 HVR에서 만들어질 수 있다. 이런 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외측에 있을 수 있다. 앞서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 일정한 구체예에서, 각 HVR은 변경되지 않거나, 또는 단지 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 내포한다.

돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 의해 설명된 바와 같이, "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이러한 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군 (가령, 하전된 잔기, 예를 들면, arg, asp, his, lys 및 glu)이 확인되고, 그리고 항체 또는 결합 폴리펩티드 및 항원의 상호작용이 영향을 받는 지를 결정하기 위해, 중성 또는 음성으로 하전된 아미노산 (가령, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체된다. 추가 치환이 초기 치환에 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치에서 도입될 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 항원 항체 복합체의 결정 구조가 항체 및 항원 사이에 접촉 포인트를 확인하는데 이용될 수 있다. 이런 접촉 잔기 및 인접한 잔기는 치환의 후보로서 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 원하는 성질을 내포하는 지를 결정하기 위해 선별검사될 수 있다.

아미노산 서열 삽입은 길이에서 1개 잔기로부터 100개 또는 그 이상의 잔기를 내포하는 폴리펩티드까지의 범위에서 변하는 아미노- 및/또는 카르복실 말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 복수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 실례는 N 말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 (가령, ADEPT의 경우) 또는 폴리펩티드에 항체의 N- 또는 C 말단의 융합을 포함한다.

일정한 구체예에서, 본원에서 제공된 항체 및/또는 결합 폴리펩티드는 당분야에서 공지되고 쉽게 가용한 추가 비단백질성 모이어티를 내포하도록 더욱 변형될 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 수용성 중합체의 무제한적 실례는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 그리고 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤릴프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (가령, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 그리고 이들의 혼합물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서 안정성으로 인해 제조하는데 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 그리고 분지되거나 또는 분지되지 않을 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드에 부착된 중합체의 숫자는 변할 수 있고, 그리고 하나 이상의 중합체가 부착되면, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 이용된 중합체의 숫자 및/또는 유형은 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 향상되는 특정 성질 또는 기능, 항체 유도체 및/또는 결합 폴리펩티드 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 이용될 것인지의 여부를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 고려 사항에 근거하여 결정될 수 있다.

본원에서 개시된 ActRII 길항제 항체 중에서 한 가지 (가령, 항-액티빈 A 항체, 항-액티빈 B 항체, 항-액티빈 C 항체, 항-액티빈 E 항체, 항-GDF11 항체, 항-GDF8 항체, 항-BMP6 항체, 항-BMP7 항체, 항-ActRIIA 항체 및/또는 항-ActRIIB 항체)는 원하는 효과를 달성하기 위해 본 발명의 하나 또는 그 이상의 추가 ActRII 길항제 작용제와 합동될 수 있다. 가령, 본원에서 개시된 ActRII 길항제 항체 (가령, 항-GDF11 항체, 항-액티빈 B 항체, 항-액티빈 C 항체, 항-액티빈 E 항체, 항-GDF11 항체, 항-GDF8 항체, 항-BMP6 항체, 항-BMP7 항체, 항-ActRIIA 항체 또는 항-ActRIIB 항체)는 i) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 추가 ActRII 길항제 항체, ii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 ActRII 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 폴리펩티드), iii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 GDF 트랩; iv) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 소형 분자 ActRII 길항제 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 소형 분자 길항제); v) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 길항제); vi) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 폴리스타틴 폴리펩티드; 및/또는 vii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 FLRG 폴리펩티드와 합동으로 이용될 수 있다.

D. 소형 분자 길항제

다른 양상에서, 본 발명은 ActRII 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 및/또는 SMAD 1/5/8 신호전달의 저해)을 길항작용하는 소형 분자, 또는 소형 분자의 조합에 관계한다. 특히, 본 발명은 예로서, 치료가 필요한 개체에서 적혈구 수준을 증가시키고, 치료가 필요한 개체에서 빈혈을 치료하거나 예방하고 (가령, 수혈 부담의 감소 포함), 치료가 필요한 개체에서 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하고 및/또는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증 (가령, 빈혈, 수혈 요구, 호중구감소증, 철분 과부하, 급성 심근 경색, 간부전, 간비대, 비장비대, 급성 골수성 림프종으로의 진행)을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 개체에서 SF3B1, DNMT3A 및/또는 TET2 돌연변이와 연관된 장애를 치료하거나 예방하기 위해, 단독으로, 또는 하나 또는 그 이상의 적혈구생성 자극제 (가령, EPO) 또는 다른 지지 요법 [가령, 조혈 성장 인자 (가령, G-CSF 또는 GM-CSF), 적혈구 또는 전혈의 수혈, 철 킬레이트화 요법]과 합동으로 소형 분자 길항제, 또는 ActRII의 항체 길항제의 조합을 이용하는 방법을 제공한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 바람직한 ActRII 길항제는 최소한 GDF11 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 저해하는 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합이다. 임의선택적으로, 이런 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 GDF8을 직접적으로 또는 간접적으로 더욱 저해할 수 있다. 임의선택적으로, 본 발명의 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 액티빈 A 활성을 실제적으로 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, GDF11 및/또는 GDF8 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 저해하는 본 발명의 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 더욱 저해한다.

일정한 구체예에서, 본 발명의 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, Nodal, ActRIIA 및 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 간접적인 저해제이다. 가령, 본 발명의 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 최소한 GDF11의 발현 (가령, 전사, 번역, 세포 분비, 또는 이들의 조합)을 저해할 수 있다. 임의선택적으로, 이런 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 GDF8의 발현을 더욱 저해할 수 있다. 임의선택적으로, 본 발명의 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 액티빈 A의 발현을 실제적으로 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, GDF11 및/또는 GDF8의 발현을 저해하는 본 발명의 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 발현을 더욱 저해할 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 직접적인 저해제이다. 가령, 본 발명의 바람직한 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 최소한 GDF11에 직접적으로 결합하고 이의 활성을 저해한다 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체에 결합하는 GDF11의 능력을 저해한다; ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 GDF11-매개된 활성화를 저해한다). 임의선택적으로, 본 발명의 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 GDF8에 더욱 결합하고 이의 활성을 더욱 저해할 수 있다 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체에 결합하는 GDF8의 능력을 저해한다; ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 GDF8-매개된 활성화를 저해한다). 임의선택적으로, 본 발명의 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 액티빈 A에 실제적으로 결합하지 않거나 또는 이의 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체에 결합하는 액티빈 A의 능력; ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달 경로의 액티빈 A-매개된 활성화)을 실제적으로 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, GDF11 및/또는 GDF8에 결합하고 이의 활성을 저해하는 본 발명의 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상에 더욱 결합하고 이의 활성을 더욱 저해한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 최소한 GDF8에 직접적으로 결합하고 이의 활성을 저해한다 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체에 결합하는 GDF8의 능력을 저해한다; ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 GDF8-매개된 활성화를 저해한다). 임의선택적으로, 본 발명의 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 GDF11에 더욱 결합하고 이의 활성을 더욱 저해할 수 있다 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체에 결합하는 GDF11의 능력을 저해한다; ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 GDF11-매개된 활성화를 저해한다). 임의선택적으로, 본 발명의 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 액티빈 A에 실제적으로 결합하지 않거나 또는 이의 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체에 결합하는 액티빈 A의 능력; ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 액티빈 A-매개된 활성화)를 실제적으로 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, GDF8 및/또는 GDF11에 결합하고 이의 활성을 저해하는 본 발명의 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상에 더욱 결합하고 이의 활성을 더욱 저해한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 최소한 ActRIIA에 직접적으로 결합하고 이의 활성 (가령, ActRIIA 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 ActRII 리간드-매개된 활성화)을 저해한다. 가령, 본 발명의 바람직한 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 ActRIIA 수용체에 결합하고, 그리고 최소한 GDF11이 ActRIIA 수용체에 결합하고 및/또는 이를 활성화하는 것을 저해한다. 임의선택적으로, 이런 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 GDF8이 ActRIIA 수용체에 결합하고 및/또는 이를 활성화하는 것을 더욱 저해할 수 있다. 임의선택적으로, 본 발명의 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 액티빈 A가 ActRIIA 수용체에 결합하고 및/또는 이를 활성화하는 것을 실제적으로 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, GDF11 및/또는 GDF8이 ActRIIA 수용체에 결합하고 및/또는 이를 활성화하는 것을 저해하는 본 발명의 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7 및 Nodal 중에서 하나 또는 그 이상이 ActRIIA 수용체에 결합하는 및/또는 이를 활성화하는 것을 더욱 저해한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 최소한 ActRIIB에 직접적으로 결합하고 이의 활성 (가령, ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 신호전달의 ActRII 리간드-매개된 활성화)을 저해한다. 가령, 본 발명의 바람직한 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 ActRIIB 수용체에 결합하고 최소한 GDF11이 ActRIIB 수용체에 결합하고 및/또는 이를 활성화하는 것을 저해한다. 임의선택적으로, 이런 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 GDF8가 ActRIIB 수용체에 결합하고 및/또는 이를 활성화하는 것을 더욱 저해할 수 있다. 임의선택적으로, 본 발명의 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 액티빈 A가 ActRIIB 수용체에 결합하고 및/또는 이를 활성화하는 것을 실제적으로 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, GDF11 및/또는 GDF8이 ActRIIB 수용체에 결합하고 및/또는 이를 활성화하는 것을 저해하는 본 발명의 소형 분자 길항제, 또는 소형 분자 길항제의 조합은 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7 및 Nodal 중에서 하나 또는 그 이상이 ActRIIB 수용체에 결합하고 및/또는 활성화하는 것을 더욱 저해한다.

본 발명의 결합 유기 소형 분자 길항제는 공지된 방법을 이용하여 확인되고 화학적으로 합성될 수 있다 (가령, PCT 공개 번호 WO 00/00823 및 WO 00/39585를 참조한다). 일반적으로, 본 발명의 소형 분자 길항제는 통상적으로, 크기에서 약 2000 달톤보다 적고, 대안으로 크기에서 약 1500, 750, 500, 250 또는 200 달톤보다 적고, 여기서 이런 유기 소형 분자는 바람직하게는, 본원에서 설명된 바와 같은 폴리펩티드 (가령, GDF11, GDF8, ActRIIA 및 ActRIIB)에 특이적으로 결합할 수 있다. 이런 소형 분자 길항제는 널리 공지된 기술을 이용하여 과도한 실험 없이 확인될 수 있다. 이점에 관하여, 주목할 만한 것은 폴리펩티드 표적에 결합할 수 있는 분자에 대해 유기 소형 분자 라이브러리를 선별검사하기 위한 기술이 당분야에서 널리 공지된다는 점이다 (가령, 국제 특허 공개 번호 WO00/00823 및 WO00/39585를 참조한다).

본 발명의 결합 유기 소형 분자는 예로서, 알데히드, 케톤, 옥심, 히드라존, 세미카르바존, 카르바지드, 일차 아민, 이차 아민, 삼차 아민, N-치환된 히드라진, 히드라지드, 알코올, 에테르, 티올, 티오에테르, 이황화물, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 요소, 카바메이트, 탄산염, 케탈, 티오케탈, 아세탈, 티오아세탈, 아릴 할로겐화물, 아릴 술폰산염, 알킬 할로겐화물, 알킬 술폰산염, 방향족 화합물, 헤테로환상 화합물, 아닐린, 알켄, 알킨, 디올, 아미노 알코올, 옥사졸리딘, 옥사졸린, 티아졸리딘, 티아졸린, 에나민, 술폰아미드, 에폭시드, 아지리딘, 이소시안산염, 술포닐 염화물, 디아조 화합물, 및 산 염화물일 수 있다.

본원에서 개시된 소형 분자 ActRII 길항제 중에서 한 가지 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 소형 분자 길항제)는 원하는 효과를 달성하기 위해 (가령, 치료가 필요한 개체에서 적혈구 수준 및/또는 헤모글로빈을 증가시키고, 빈혈을 치료하거나 예방하고, MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하고, MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증을 치료하거나 예방하기 위해), 본 발명의 하나 또는 그 이상의 추가 ActRII 길항제 작용제와 합동될 수 있다. 가령, 본원에서 개시된 소형 분자 ActRII 길항제 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 소형 분자 길항제)는 i) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 추가 소형 분자 ActRII 길항제, ii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 ActRII 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 폴리펩티드), iii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 GDF 트랩; iv) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 항체 (가령, 항-GDF11 항체, 항-액티빈 B 항체, 항-액티빈 C 항체, 항-액티빈 E 항체, 항-GDF11 항체, 항-GDF8 항체, 항-BMP6 항체, 항-BMP7 항체, 항-ActRIIA 항체 또는 항-ActRIIB 항체); v) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 길항제); vi) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 폴리스타틴 폴리펩티드; 및/또는 vii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 FLRG 폴리펩티드와 합동으로 이용될 수 있다.

E. 길항제 폴리뉴클레오티드

다른 양상에서, 본 발명은 ActRII 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달 형질도입, 예를 들면, SMAD 2/3 및/또는 SMAD 1/5/8 신호전달의 저해)을 길항작용하는 폴리뉴클레오티드, 또는 폴리뉴클레오티드의 조합에 관계한다. 특히, 본 발명은 예로서, 치료가 필요한 개체에서 적혈구 수준을 증가시키고, 치료가 필요한 개체에서 빈혈을 치료하거나 예방하고 (가령, 수혈 부담의 감소 포함), 치료가 필요한 개체에서 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하고 및/또는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증 (가령, 빈혈, 수혈 요구, 호중구감소증, 철분 과부하, 급성 심근 경색, 간부전, 간비대, 비장비대, 급성 골수성 림프종으로의 진행)을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 개체에서 SF3B1, DNMT3A 및/또는 TET2 돌연변이와 연관된 장애를 치료하거나 예방하기 위해, 단독으로, 또는 하나 또는 그 이상의 적혈구생성 자극제 (가령, EPO) 또는 다른 지지 요법 [가령, 조혈 성장 인자 (가령, G-CSF 또는 GM-CSF), 적혈구 또는 전혈의 수혈, 철 킬레이트화 요법]과 합동으로 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제의 조합을 이용하는 방법을 제공한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제의 조합은 GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상에서 활성 및/또는 발현을 저해하는데 이용될 수 있다. 일정한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제의 조합은 GDF-ActRII 길항제이다.

일부 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 최소한 GDF11의 활성 및/또는 발현 (가령, 전사, 번역, 분비, 또는 이들의 조합)을 저해한다. 임의선택적으로, 이런 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 GDF8의 활성 및/또는 발현을 더욱 저해할 수 있다. 임의선택적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 액티빈 A의 활성 및/또는 발현을 실제적으로 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, GDF11 및/또는 GDF8의 활성 및/또는 발현을 저해하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 활성 및 또는 발현을 더욱 저해할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 최소한 GDF8의 활성 및/또는 발현 (가령, 전사, 번역, 분비, 또는 이들의 조합)을 저해한다. 임의선택적으로, 이런 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 GDF11의 활성 및/또는 발현을 더욱 저해할 수 있다. 임의선택적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 액티빈 A의 활성 및/또는 발현을 실제적으로 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, GDF8 및/또는 GDF11의 활성 및/또는 발현을 저해하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 활성 및 또는 발현을 더욱 저해할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 최소한 ActRIIA의 활성 및/또는 발현 (가령, 전사, 번역, 분비, 또는 이들의 조합)을 저해한다. 임의선택적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 액티빈 A의 활성 및/또는 발현을 실제적으로 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, ActRIIA의 활성 및/또는 발현을 저해하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 활성 및 또는 발현을 더욱 저해할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 최소한 ActRIIB의 활성 및/또는 발현 (가령, 전사, 번역, 분비, 또는 이들의 조합)을 저해한다. 임의선택적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 액티빈 A의 활성 및/또는 발현을 실제적으로 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, ActRIIB의 활성 및/또는 발현을 저해하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합은 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, 및/또는 ActRIIA 중에서 하나 또는 그 이상의 활성 및 또는 발현을 더욱 저해할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 길항제는 안티센스 핵산, RNAi 분자 [가령, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 작은-헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA)], 앱타머 및/또는 리보자임]. 인간 GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및 ActRIIB의 핵산 및 아미노산 서열은 당분야에서 공지되고, 그리고 따라서, 본 발명의 방법에 따라서 이용을 위한 폴리뉴클레오티드 길항제는 당분야에서 지식 및 본원에서 제공된 교시에 근거하여 당업자에 의해 일과적으로 만들어질 수 있다.

가령, 안티센스 기술이 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해, 또는 삼중-나선 형성을 통해 유전자 발현을 제어하는데 이용될 수 있다. 안티센스 기술은 예로서, Okano (1991) J. Neurochem. 56:560; Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)에서 논의된다. 삼중 나선 형성은 예로서, Cooney et al. (1988) Science 241:456; 그리고 Dervan et al., (1991)Science 251:1300에서 논의된다. 이들 방법은 상보성 DNA 또는 RNA에 폴리뉴클레오티드의 결합에 근거된다. 일부 구체예에서, 안티센스 핵산은 본원에서 개시된 유전자 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및 ActRIIB)의 RNA 전사체의 최소한 일부에 상보적인 단일 가닥 RNA 또는 DNA 서열을 포함한다. 하지만, 절대적 상보성은 비록 바람직하긴 하지만, 요구되지는 않는다.

본원에서 지칭된 "RNA의 최소한 일부에 상보적인" 서열은 RNA와 혼성화하여 안정된 이중나선을 형성할 수 있을 만큼 충분한 상보성을 갖는 서열을 의미한다; 본원에서 개시된 유전자 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및 ActRIIB)의 이중 가닥 안티센스 핵산의 경우에, 이중나선 DNA의 단일 가닥이 따라서 시험되거나, 또는 삼중 형성이 검정될 수 있다. 혼성화하는 능력은 상보성의 정도 및 안티센스 핵산의 길이 둘 모두에 의존할 것이다. 일반적으로, 혼성화하는 핵산이 더욱 클수록, 이것은 RNA와 더욱 많은 염기 부정합을 내포하고 안정된 이중나선 (또는 경우에 따라 삼중나선)을 여전히 형성할 수 있다. 당업자는 혼성화된 복합체의 융점을 결정하는 표준 절차의 이용에 의해 부정합의 용인 정도를 확인할 수 있다.

메시지의 5' 단부에 상보적인 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, AUG 개시 코돈까지 및 이를 포함하는 5'-번역되지 않은 서열은 번역을 저해하는데 가장 효율적으로 작동할 것이다. 하지만, mRNA의 3'-번역되지 않은 서열에 상보적인 서열 역시 mRNA의 번역을 저해하는데 효과적인 것으로 나타났다 [가령, Wagner, R., (1994) Nature 372:333-335를 참조한다]. 따라서, 본 발명의 유전자 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및 ActRIIB)의 5'- 또는 3'-번역되지 않은, 비코딩 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 내인성 mRNA의 번역을 저해하는 안티센스 접근법에서 이용될 수 있었다. mRNA의 5'-비번역 영역에 상보적인 폴리뉴클레오티드는 AUG 개시 코돈의 보체를 포함할 것이다. mRNA 코딩 영역에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오티드는 번역의 덜 효율적인 저해제이지만, 본 발명의 방법에 따라서 이용될 수 있었다. 본 발명의 mRNA (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및 ActRIIB mRNA)의 5'-비번역 영역, 3'-비번역 영역, 또는 코딩 영역에 혼성화하도록 설계되는 지에 상관없이, 안티센스 핵산은 길이에서 최소한 6개 뉴클레오티드이어야 하고, 그리고 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 길이에서 6 내지 약 50개 뉴클레오티드 범위에서 변한다. 특정한 양상에서, 올리고뉴클레오티드는 최소한 10개 뉴클레오티드, 최소한 17개 뉴클레오티드, 최소한 25개 뉴클레오티드, 또는 최소한 50개 뉴클레오티드이다.

한 구체예에서, 본 발명의 안티센스 핵산 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 또는 ActRIIB 안티센스 핵산)은 외인성 서열로부터 전사에 의해 세포내에서 생산된다. 가령, 벡터 또는 이의 부분은 전사되어, 본 발명의 유전자의 안티센스 핵산 (RNA)을 생산한다. 이런 벡터는 원하는 안티센스 핵산을 인코딩하는 서열을 내포할 것이다. 이런 벡터는 원하는 안티센스 RNA를 생산하도록 전사될 수 있기만 하면, 에피솜으로 남아있거나 또는 염색체로 통합될 수 있다. 이런 벡터는 당분야에서 재조합 DNA 기술 방법 표준에 의해 작제될 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스, 또는 척추동물 세포에서 복제 및 발현에 이용되는 당분야에서 공지된 다른 것일 수 있다. 본 발명의 원하는 유전자를 인코딩하는 서열, 또는 이의 단편의 발현은 척추동물, 바람직하게는 인간 세포에서 행동하는 것으로 당분야에서 공지된 임의의 프로모터에 의해 이루어질 수 있다. 이런 프로모터는 유도성 또는 구조성일 수 있다. 이런 프로모터는 SV40 초기 프로모터 영역 [가령, Benoist and Chambon (1981) Nature 29:304-310을 참조한다], 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복에서 내포된 프로모터 [가령, Yamamoto et al. (1980) Cell 22:787-797을 참조한다], 헤르페스 티미딘 프로모터 [가령, Wagner et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445를 참조한다], 그리고 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열 [가령, Brinster, et al. (1982) Nature 296:39-42를 참조한다]을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 길항제는 GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 발현을 표적으로 하는 간섭 RNA 또는 RNAi 분자이다. RNAi는 표적화된 mRNA의 발현을 간섭하는 RNA의 발현을 지칭한다. 구체적으로, RNAi는 siRNA (짧은 간섭 RNA)를 통해 특정한 mRNA와 상호작용함에 의해, 표적화된 유전자를 침묵시킨다. ds RNA 복합체는 이후, 세포에 의한 분해를 위해 표적화된다. siRNA 분자는 충분히 상보성인 표적 유전자의 발현을 간섭하는, 길이에서 10 내지 50개 뉴클레오티드의 이중 가닥 RNA 이중나선이다 (가령, 상기 유전자에 최소한 80% 동일성). 일부 구체예에서, siRNA 분자는 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열과 최소한 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

추가 RNAi 분자는 짧은-헤어핀 RNA (shRNA); 또한 짧은-간섭 헤어핀 및 마이크로RNA (miRNA)를 포함한다. shRNA 분자는 루프에 의해 연결된 표적 유전자로부터 센스 및 안티센스 서열을 내포한다. shRNA는 핵으로부터 세포질 내로 수송되고, 그리고 이것은 mRNA와 함께 분해된다. Pol III 또는 U6 프로모터가 RNAi에 대한 RNA를 발현하는데 이용될 수 있다. Paddison et al. [Genes & Dev. (2002) 16:948-958, 2002]은 RNAi를 야기하는 수단으로서, 헤어핀으로 접힘된 작은 RNA 분자를 이용하였다. 따라서, 이런 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 분자 역시 본원에서 설명된 방법에서 유리하게 이용된다. 기능적 shRNA의 스템 및 루프의 길이는 변한다; 스템 길이는 약 25 내지 약 30 nt 어딘가의 범위에서 변할 수 있고, 그리고 루프 크기는 침묵 활성에 영향을 주지 않으면서 4 내지 약 25 nt 사이의 범위에서 변할 수 있다. 임의의 특정 이론에 의해 한정됨 없이, 이들 shRNA는 DICER RNA분해효소의 이중 가닥 RNA (dsRNA) 산물과 유사하고, 그리고 어떤 상황에서든, 특정 유전자의 발현을 저해하기 위한 동일한 능력을 갖는 것으로 생각된다. shRNA는 렌티바이러스 벡터로부터 발현될 수 있다. miRNA는 "스템-루프" 구조에 의해 특징화되는 프리-miRNA로서 초기에 전사되고, 그리고 RISC를 통한 추가 처리 후 성숙 miRNA로 차후에 가공되는 길이에서 약 10 내지 70개 뉴클레오티드의 단일 가닥 RNA이다.

제한 없이 siRNA를 비롯하여, RNAi를 매개하는 분자는 화학적 합성 (Hohjoh, FEBS Lett 521:195-199, 2002)에 의해, dsRNA의 가수분해 (Yang et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002)에 의해, T7 RNA 중합효소로 시험관내 전사 (Donzeet et al., Nucleic Acids Res 30:e46, 2002; Yu et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052, 2002)에 의해, 그리고 뉴클레아제, 예를 들면, 대장균 (E. coli) RNA분해효소 III을 이용한 이중 가닥 RNA의 가수분해 (Yang et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002)에 의해 시험관내에서 생산될 수 있다.

다른 양상에 따라, 본 발명은 미끼 DNA, 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, 복합화된 DNA, 피포된 DNA, 바이러스 DNA, 플라스미드 DNA, 나신 RNA, 피포된 RNA, 바이러스 RNA, 이중 가닥 RNA, RNA 간섭을 산출할 수 있는 분자, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 폴리뉴클레오티드 길항제를 제공한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 길항제는 앱타머이다. 앱타머는 이중 가닥 DNA 및 단일 가닥 RNA 분자를 포함하는 핵산 분자인데, 이들은 결합하여 표적 분자, 예를 들면, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 삼차 구조를 형성한다. 앱타머의 산출 및 치료적 용도는 당분야에서 충분히 확립된다. 가령, U.S. 특허 번호 5,475,096을 참조한다. 앱타머에 관한 추가 정보는 U.S. 특허 출원 공개 번호 20060148748에서 발견될 수 있다. 핵산 앱타머는 예로서 급격한 촉진에 의한 리간드 체계적인 진화 (SELEX) 과정을 통해 당분야에서 공지된 방법을 이용하여 선별된다. SELEX는 예로서, U.S. 특허 번호 5,475,096, 5,580,737, 5,567,588, 5,707,796, 5,763,177, 6,011,577 및 6,699,843에서 설명된 바와 같이, 표적 분자에 대한 고도로 특이적 결합을 갖는 핵산 분자의 시험관내 진화를 위한 방법이다. 앱타머를 확인하는 다른 선별검사 방법은 U.S. 특허 번호 5,270,163에서 설명된다. SELEX 과정은 다양한 2- 및 3차원 구조를 형성하기 위한 핵산의 능력뿐만 아니라 다른 핵산 분자 및 폴리펩티드를 비롯한 사실상 임의의 화학적 화합물 (단위체성 또는 중합성인지에 상관없이)과의 리간드 (특이적 결합 쌍을 형성함)로서 행동하는 뉴클레오티드 단위체 내에서 가용한 화학적 융통성에 근거된다. 임의의 크기 또는 조성의 분자가 표적으로서 역할을 할 수 있다. SELEX 방법은 원하는 결합 친화성 및 선택성을 달성하기 위해, 동일한 일반적인 선별 계획을 이용하여, 후보 올리고뉴클레오티드의 혼합물로부터 선별 및 결합, 분할과 증폭의 단계별 반복을 수반한다. 무작위화된 서열의 분절을 포함할 수 있는 핵산의 혼합물로부터 시작하여, SELEX 방법은 결합에 우호적인 조건 하에 혼합물을 표적과 접촉시키는 단계; 표적 분자에 특이적으로 결합한 핵산으로부터 결합되지 않은 핵산을 분할하는 단계; 핵산-표적 복합체를 해리하는 단계; 핵산-표적 복합체로부터 해리된 핵산을 증폭하여 핵산의 리간드 농축된 혼합물을 산출하는 단계를 포함한다. 결합하고, 분할하고, 해리하고, 증폭하는 단계는 표적 분자에 대한 고도로 특이적인 높은 친화성 핵산 리간드를 산출하기 위해 필요에 따라 많은 주기를 통해 반복된다.

전형적으로, 이런 결합 분자는 동물에 별도로 투여되지만 [가령, O'Connor (1991) J. Neurochem. 56:560을 참조한다], 이런 결합 분자는 또한, 숙주 세포에 의해 흡수되고 생체내에서 발현되는 폴리뉴클레오티드로부터 생체내 발현될 수 있다 [가령, Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)을 참조한다].

본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 길항제) 중에서 한 가지는 원하는 효과를 달성하기 위해 (가령, 치료가 필요한 개체에서 적혈구 수준 및/또는 헤모글로빈을 증가시키고, 빈혈을 치료하거나 예방하고, MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하고, MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증을 치료하거나 예방하기 위해), 본 발명의 하나 또는 그 이상의 추가 ActRII 길항제 작용제와 합동될 수 있다. 가령, 본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 길항제)는 i) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 추가 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, ii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 ActRII 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 폴리펩티드), iii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 GDF 트랩; iv) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 항체 (가령, 항-GDF11 항체, 항-액티빈 B 항체, 항-액티빈 C 항체, 항-액티빈 E 항체, 항-GDF11 항체, 항-GDF8 항체, 항-BMP6 항체, 항-BMP7 항체, 항-ActRIIA 항체 또는 항-ActRIIB 항체); v) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 소형 분자 ActRII 길항제 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 소형 분자 길항제); vi) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 폴리스타틴 폴리펩티드; 및/또는 vii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 FLRG 폴리펩티드와 합동으로 이용될 수 있다.

F. 다른 길항제

다른 양상에서, 본원에서 개시된 방법에 따라서 이용을 위한 작용제는 폴리스타틴 폴리펩티드이고, 이것은 예로서, 치료가 필요한 개체에서 적혈구 수준을 증가시키고, 치료가 필요한 개체에서 빈혈을 치료하거나 예방하고 (가령, 수혈 부담의 감소 포함), 치료가 필요한 개체에서 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하고 및/또는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증 (가령, 빈혈, 수혈 요구, 호중구감소증, 철분 과부하, 급성 심근 경색, 간부전, 간비대, 비장비대, 급성 골수성 림프종으로의 진행)을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 개체에서 SF3B1, DNMT3A 및/또는 TET2 돌연변이와 연관된 장애를 치료하거나 예방하기 위해, 단독으로, 또는 하나 또는 그 이상의 적혈구생성 자극제 (가령, EPO) 또는 다른 지지 요법 [가령, 조혈 성장 인자 (가령, G-CSF 또는 GM-CSF), 적혈구 또는 전혈의 수혈, 철 킬레이트화 요법]과 합동으로 이용될 수 있다. 용어 "폴리스타틴 폴리펩티드"는 폴리스타틴의 임의의 자연발생 폴리펩티드뿐만 아니라 유용한 활성을 유지하는 이의 임의의 변이체 (돌연변이체, 단편, 융합 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, 그리고 폴리스타틴의 임의의 기능적 단위체 또는 다합체를 더욱 포함한다. 일정한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리스타틴 폴리펩티드는 액티빈 (특히, 액티빈 A)에 결합하고 및/또는 액티빈 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB SMAD 2/3 신호전달의 액티빈-매개된 활성화)을 저해한다. 액티빈 결합 성질을 유지하는 폴리스타틴 폴리펩티드의 변이체는 폴리스타틴 및 액티빈 상호작용을 수반하는 이전 연구에 근거하여 확인될 수 있다. 가령, WO2008/030367은 액티빈 결합에 중요한 것으로 확인되는 특정한 폴리스타틴 도메인 ("FSDs")을 개시한다. 아래의 서열 번호: 18-20에서 나타나 있는 바와 같이, 폴리스타틴 N 말단 도메인 ("FSND" 서열 번호:18), FSD2 (서열 번호: 20), 그리고 정도가 덜하긴 하지만 FSD1 (서열 번호: 19)은 액티빈 결합에 중요한 폴리스타틴 내에 예시적인 도메인을 나타낸다. 이에 더하여, 폴리펩티드의 라이브러리를 만들고 시험하기 위한 방법은 ActRII 폴리펩티드의 맥락에서 전술되고, 그리고 이런 방법은 또한, 폴리스타틴의 변이체를 만들고 시험하는 것과 관련된다. 폴리스타틴 폴리펩티드는 폴리스타틴 폴리펩티드의 서열과 최소한 약 80% 동일한, 그리고 임의선택적으로, 최소한 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 갖는 임의의 공지된 폴리스타틴의 서열로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다. 폴리스타틴 폴리펩티드의 실례는 예로서, WO2005/025601에서 설명된 바와 같이, 인간 폴리스타틴 전구체 폴리펩티드 (서열 번호: 16)의 성숙 폴리스타틴 폴리펩티드 또는 더욱 짧은 동종형 또는 다른 변이체를 포함한다.

인간 폴리스타틴 전구체 폴리펩티드 동종형 FST344는 다음과 같다:

1 mvrarhqpgg lcllllllcq fmedrsaqag ncwlrqakng rcqvlyktel

51 skeeccstgr lstswteedv ndntlfkwmi fnggapncip cketcenvdc

101 gpgkkcrmnk knkprcvcap dcsnitwkgp vcgldgktyr necallkarc

151 keqpelevqy qgrckktcrd vfcpgsstcv vdqtnnaycv tcnricpepa

201 sseqylcgnd gvtyssachl rkatcllgrs iglayegkci kakscediqc

251 tggkkclwdf kvgrgrcslc delcpdsksd epvcasdnat yasecamkea

301 acssgvllev khsgscnsis edteeeeede dqdysfpiss ilew

(서열 번호: 16; NCBI Reference No. NP_037541.1)

신호 펩티드는 밑줄 표시된다; 이러한 폴리스타틴 동종형을 아래에 도시된 더욱 짧은 폴리스타틴 동종형 FST317로부터 구별짓는 C 말단 연장을 나타내는 마지막 27개 잔기 또한 상기에서 밑줄 표시된다.

인간 폴리스타틴 전구체 폴리펩티드 동종형 FST317은 다음과 같다:

1 MVRARHQPGG LCLLLLLLCQ FMEDRSAQAG NCWLRQAKNG RCQVLYKTEL

51 SKEECCSTGR LSTSWTEEDV NDNTLFKWMI FNGGAPNCIP CKETCENVDC

101 GPGKKCRMNK KNKPRCVCAP DCSNITWKGP VCGLDGKTYR NECALLKARC

151 KEQPELEVQY QGRCKKTCRD VFCPGSSTCV VDQTNNAYCV TCNRICPEPA

201 SSEQYLCGND GVTYSSACHL RKATCLLGRS IGLAYEGKCI KAKSCEDIQC

251 TGGKKCLWDF KVGRGRCSLC DELCPDSKSD EPVCASDNAT YASECAMKEA

301 ACSSGVLLEV KHSGSCN

(서열 번호: 17; NCBI Reference No. NP_006341.1)

신호 펩티드는 밑줄 표시된다.

폴리스타틴 N 말단 도메인 (FSND) 서열은 다음과 같다:

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWM

IFNGGAPNCIPCK (서열 번호: 18; FSND)

FSD1 및 FSD2 서열은 다음과 같다:

ETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCV (서열 번호: 19; FSD1)

KTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVT (서열 번호: 20; FSD2)

다른 양상에서, 본원에서 개시된 방법에 따라서 이용을 위한 작용제는 폴리스타틴-관련된 단백질 3 (FSTL3)으로서 또한 알려져 있는 폴리스타틴-유사 관련된 유전자 (FLRG)이다. 용어 "FLRG 폴리펩티드"는 FLRG의 임의의 자연발생 폴리펩티드뿐만 아니라 유용한 활성을 유지하는 이의 임의의 변이체 (돌연변이체, 단편, 융합 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일정한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 FLRG 폴리펩티드는 액티빈 (특히, 액티빈 A)에 결합하다 및/또는 이의 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB SMAD 2/3 신호전달의 액티빈-매개된 활성화)을 저해한다. 액티빈 결합 성질을 유지하는 FLRG 폴리펩티드의 변이체는 FLRG 및 액티빈 상호작용을 검정하는 일과적인 방법을 이용하여 확인될 수 있다 (가령, US 6,537,966을 참조한다). 이에 더하여, 폴리펩티드의 라이브러리를 만들고 시험하기 위한 방법은 ActRII 폴리펩티드의 맥락에서 전술되고, 그리고 이런 방법은 또한, FLRG의 변이체를 만들고 시험하는 것과 관련된다. FLRG 폴리펩티드는 FLRG 폴리펩티드의 서열과 최소한 약 80% 와 동일한, 그리고 임의선택적으로 최소한 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 갖는 임의의 공지된 FLRG의 서열로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다.

인간 FLRG 전구체 (폴리스타틴-관련된 단백질 3 전구체) 폴리펩티드는 다음과 같다:

1 MRPGAPGPLW PLPWGALAWA VGFVSSMGSG NPAPGGVCWL QQGQEATCSL

51 VLQTDVTRAE CCASGNIDTA WSNLTHPGNK INLLGFLGLV HCLPCKDSCD

101 GVECGPGKAC RMLGGRPRCE CAPDCSGLPA RLQVCGSDGA TYRDECELRA

151 ARCRGHPDLS VMYRGRCRKS CEHVVCPRPQ SCVVDQTGSA HCVVCRAAPC

201 PVPSSPGQEL CGNNNVTYIS SCHMRQATCF LGRSIGVRHA GSCAGTPEEP

251 PGGESAEEEE NFV

(서열 번호:21; NCBI Reference No. NP_005851.1)

신호 펩티드는 밑줄 표시된다.

일정한 구체예에서, 폴리스타틴 폴리펩티드 및 FLRG 폴리펩티드의 기능적 변이체 또는 변형된 형태는 폴리스타틴 폴리펩티드 또는 FLRG 폴리펩티드 중에서 최소한 일부 및 하나 또는 그 이상의 융합 도메인, 예를 들면, 예로서, 폴리펩티드의 단리, 검출, 안정화 또는 다합체화를 용이하게 하는 도메인을 갖는 융합 단백질을 포함한다. 적합한 융합 도메인은 ActRII 폴리펩티드에 관하여 상기에서 상세하게 논의된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 길항제 작용제는 Fc 도메인에 융합된 폴리스타틴 폴리펩티드의 액티빈-결합 부분을 포함하는 융합 단백질이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 길항제 작용제는 Fc 도메인에 융합된 FLRG 폴리펩티드의 액티빈 결합 부분을 포함하는 융합 단백질이다.

본원에서 개시된 폴리스타틴 폴리펩티드 중에서 한 가지는 원하는 효과를 달성하기 위해 (가령, 치료가 필요한 개체에서 적혈구 수준 및/또는 헤모글로빈을 증가시키고, 빈혈을 치료하거나 예방하고, MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하고, MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증을 치료하거나 예방하기 위해), 본 발명의 하나 또는 그 이상의 추가 ActRII 길항제 작용제와 합동될 수 있다. 가령, 본원에서 개시된 폴리스타틴 폴리펩티드는 i) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 추가 폴리스타틴 폴리펩티드, ii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 ActRII 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 폴리펩티드), iii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 GDF 트랩; iv) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 항체 (가령, 항-GDF11 항체, 항-액티빈 B 항체, 항-액티빈 C 항체, 항-액티빈 E 항체, 항-GDF11 항체, 항-GDF8 항체, 항-BMP6 항체, 항-BMP7 항체, 항-ActRIIA 항체 또는 항-ActRIIB 항체); v) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 소형 분자 ActRII 길항제 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 소형 분자 길항제); vi) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 길항제); 및/또는 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 FLRG 폴리펩티드와 합동으로 이용될 수 있다.

유사하게, 본원에서 개시된 FLRG 폴리펩티드 중에서 한 가지는 원하는 효과를 달성하기 위해, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 추가 ActRII 길항제 작용제와 합동될 수 있다. 가령, 본원에서 개시된 FLRG 폴리펩티드는 i) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 추가 FLRG 폴리펩티드, ii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 ActRII 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 폴리펩티드), iii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 GDF 트랩; iv) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 항체 (가령, 항-GDF11 항체, 항-액티빈 B 항체, 항-액티빈 C 항체, 항-액티빈 E 항체, 항-GDF11 항체, 항-GDF8 항체, 항-BMP6 항체, 항-BMP7 항체, 항-ActRIIA 항체 또는 항-ActRIIB 항체); v) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 소형 분자 ActRII 길항제 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 소형 분자 길항제); vi) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제 (가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, Nodal, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 중에서 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 길항제); 및/또는 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 폴리스타틴 폴리펩티드와 합동으로 이용될 수 있다.

3. 선별검사 검정

일정한 양상에서, 본 발명은 ActRIIB 폴리펩티드의 효현제 또는 길항제인 화합물 (작용제)을 확인하기 위해 주제 ActRII 폴리펩티드 (가령, ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드) 및 GDF 트랩 폴리펩티드의 이용에 관계한다. 이러한 선별검사를 통해 확인된 화합물은 생체내 또는 시험관내에서 적혈구, 헤모글로빈 및/또는 망상적혈구 수준을 조정하는 그들의 능력을 사정하기 위해 시험될 수 있다. 이들 화합물은 예로서, 동물 모형에서 시험될 수 있다.

ActRII 신호전달 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB SMAD 2/3 및/또는 SMAD 1/5/8 신호전달)을 표적으로 함으로써 적혈구 또는 헤모글로빈 수준을 증가시키기 위한 치료적 작용제에 대해 선별검사하는 다양한 접근법이 있다. 일정한 구체예에서, 화합물의 고처리량 선별검사는 선별된 세포주에서 ActRII-매개된 효과를 섭동하는 작용제를 확인하기 위해 실행될 수 있다. 일정한 구체예에서, 검정은 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드의 결합 상대, 예를 들면, ActRII 리간드 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, Nodal, GDF8, GDF11 또는 BMP7)로의 결합을 특이적으로 저해하거나 또는 감소시키는 화합물을 선별검사하고 확인하기 위해 실행된다. 대안으로, 검정은 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드의 결합 상대, 예를 들면, ActRII 리간드로의 결합을 증강하는 화합물을 확인하는데 이용될 수 있다. 추가 구체예에서, 화합물은 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드와 상호작용하는 그들의 능력에 의해 확인될 수 있다.

다양한 검정 형식이 충분할 것이고, 그리고 본 발명에 비추어, 본원에서 명시적으로 설명된 것들은 그럼에도 불구하고, 당업자에 의해 이해될 것이다. 본원에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 시험 화합물 (작용제)은 임의의 조합 화학적 방법에 의해 창출될 수 있다. 대안으로, 주제 화합물은 생체내에서 또는 시험관내에서 합성된 자연발생 생체분자일 수 있다. 조직 성장의 조절인자로서 행동하는 능력에 대해 시험되는 화합물 (작용제)은 예로서, 세균, 효모, 식물 또는 다른 생물체에 의해 생산되거나 (가령, 자연 산물), 화학적으로 생산되거나 (가령, 펩티드모방체를 비롯한 소형 분자), 또는 재조합적으로 생산될 수 있다. 본 발명에 의해 예기된 시험 화합물은 비-펩티딜 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드모방체, 당, 호르몬 및 핵산 분자를 포함한다. 일정한 구체예에서, 시험 작용제는 약 2,000 달톤보다 적은 분자량을 갖는 작은 유기 분자이다.

본 발명의 시험 화합물은 단일, 구별된 실체로서 제공되거나, 또는 예로서, 조합 화학에 의해 만들어진 더욱 큰 복잡성의 라이브러리에서 제공될 수 있다. 이들 라이브러리는 예로서, 알코올, 알킬 할로겐화물, 아민, 아미드, 에스테르, 알데히드, 에테르 및 다른 부류의 유기 화합물을 포함할 수 있다. 시험 시스템에 시험 화합물의 제공은 특히 초기 선별검사 단계에서 화합물의 단리된 형태로서 또는 혼합물로서 이루어질 수 있다. 임의선택적으로, 화합물은 임의선택적으로, 다른 화합물로 유도체화될 수 있고, 그리고 화합물의 단리를 용이하게 하는 유도체화 기를 갖는다. 유도체화 기의 무제한적 실례는 비오틴, 플루오레세인, 디곡시게닌, 녹색 형광 단백질, 동위원소, 폴리히스티딘, 자성 비드, 글루타티온 S-전달효소 (GST), 광활성화가능 교차연결제 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

화합물 및 자연 추출물의 라이브러리를 시험하는 많은 약물-선별검사 프로그램에서, 고처리량 검정은 소정의 기간에서 조사된 화합물의 숫자를 최대화하기 위해 바람직하다. 무세포 시스템에서 수행되는, 예를 들면, 정제된 또는 반정제된 단백질로 도출될 수 있는 검정은 이들이 시험 화합물에 의해 매개되는 분자 표적에서 변경의 신속한 발달 및 상대적으로 쉬운 검출을 허용하도록 산출될 수 있다는 점에서, 종종 "일차" 스크린으로서 바람직하다. 게다가, 시험 화합물의 세포 독성 또는 생체이용률의 효과는 시험관내 시스템에서 일반적으로 무시될 수 있고, 검정은 그 대신에, ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드 및 이의 결합 상대 (가령, ActRII 리간드) 사이에 결합 친화성의 변경에서 현성하는 한 바와 같이, 분자 표적의 약물의 효과에 일차적으로 집중된다.

단지 예시로서, 본 발명의 예시적인 선별검사 검정에서, 관심되는 화합물은 검정의 의도에 적절하면, 통상적으로 ActRIIB 리간드에 결합할 수 있는 단리된 및 정제된 ActRIIB 폴리펩티드와 접촉된다. 이후, 화합물 및 ActRIIB 폴리펩티드의 혼합물에, ActRIIB 리간드 (가령, GDF11)를 내포하는 조성물이 첨가된다. ActRIIB/ActRIIB 리간드 복합체의 검출 및 정량은 ActRIIB 폴리펩티드 및 이의 결합 단백질 사이에 복합체 형성을 저해하는 (또는 강력하게 만드는) 화합물의 효력을 결정하기 위한 수단을 제공한다. 화합물의 효력은 다양한 농도의 시험 화합물을 이용하여 획득된 데이터로부터 용량 반응 곡선을 산출함으로써 사정될 수 있다. 게다가, 비교를 위한 기준선을 제공하기 위한 대조 검정 역시 수행될 수 있다. 가령, 대조 검정에서, 단리된 및 정제된 ActRIIB 리간드가 ActRIIB 폴리펩티드를 내포하는 조성물에 첨가되고, 그리고 ActRIIB/ActRIIB 리간드 복합체의 형성이 시험 화합물의 부재에서 정량된다. 일반적으로, 반응물질이 혼합될 수 있는 순서는 변할 수 있고, 그리고 동시에 혼합될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 게다가, 정제된 단백질 대신에, 세포 추출물 및 용해물이 적합한 무세포 검정 시스템을 만드는데 이용될 수 있다.

ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드 및 이의 결합 단백질 사이에 복합체 형성은 다양한 기술에 의해 검출될 수 있다. 가령, 복합체의 형성의 조정은 예로서, 검출가능하게 표지화된 단백질, 예를 들면, 방사성표지화된 (가령, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C 또는 ³H), 형광으로 표지화된 (가령, FITC), 또는 효소적으로 표지화된 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 단백질을 이용하여, 면역검정에 의해, 또는 크로마토그래피 검출에 의해 정량될 수 있다.

일정한 구체예에서, 본 발명은 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드 및 이의 결합 단백질 사이에 상호작용의 정도를 직접적으로 또는 간접적으로 계측하는데 있어서 형광 분극 검정 및 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 검정의 이용을 예기한다. 게다가, 다른 방식의 검출, 예를 들면, 광학적 도파관 (가령, PCT 공개 WO 96/26432 및 U.S. 특허 번호 5,677,196을 참조한다), 표면 플라스몬 공명 (SPR), 표면 전하 센서 및 표면 힘 센서에 근거된 것들이 본 발명의 많은 구체예와 양립한다.

게다가, 본 발명은 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드 및 이의 결합 상대 사이에 상호작용을 교란하거나 또는 강력하게 만드는 작용제를 확인하기 위한, "이중 하이브리드 검정"으로서 또한 알려져 있는 상호작용 트랩 검정의 이용을 예기한다. 가령, U.S. 특허 번호 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; 그리고 Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696)을 참조한다. 특정한 구체예에서, 본 발명은 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 및 이의 결합 단백질 사이에 상호작용을 분리하는 화합물 (가령, 소형 분자 또는 펩티드)을 확인하기 위한 역 이중 하이브리드 시스템의 이용을 예기한다 [가령, Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; 그리고 U.S. 특허 번호 5,525,490; 5,955,280 및 5,965,368을 참조한다].

일정한 구체예에서, 주제 화합물은 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드와 상호작용하는 그들의 능력에 의해 확인된다. 화합물 및 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드 사이에 상호작용은 공유 또는 비공유일 수 있다. 가령, 이런 상호작용은 광교차연결, 방사성표지화된 리간드 결합 및 친화성 크로마토그래피를 비롯한 시험관내 생화학적 방법을 이용하여 단백질 수준에서 확인될 수 있다 [가령, Jakoby WB et al. (1974) Methods in Enzymology 46:1을 참조한다]. 일정한 경우에, 화합물은 기전-기초된 검정, 예를 들면, ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 검출하기 위한 검정에서 선별검사될 수 있다. 이것은 고체상 또는 유체상 결합 이벤트를 포함할 수 있다. 대안으로, ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자는 리포터 시스템 (가령, β-갈락토시다아제, 루시페라아제, 또는 녹색 형광 단백질)으로 세포 내로 형질감염될 수 있고, 그리고 바람직하게는 고처리량 선별검사에 의해 또는 라이브러리의 개별 구성원으로 라이브러리에 대하여 선별검사될 수 있다. 다른 기전-기초된 결합 검정이 이용될 수 있다; 예로서, 자유 에너지에서 변화를 검출하는 결합 검정. 결합 검정은 웰, 비드 또는 칩에 고정된, 또는 고정된 항체에 의해 포획된, 또는 모세관 전기영동에 의해 분해된 표적으로 수행될 수 있다. 결합된 화합물은 통상적으로, 비색 종결점 또는 형광 또는 표면 플라스몬 공명을 이용하여 검출될 수 있다.

4. 예시적인 치료적 용도

일정한 양상에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제로, 환상 철적혈모구의 존재 및/또는 SF3B1, DNMT3A 및/또는 TET2 유전자에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이에 의해 특징화되는 MDS를 앓는 환자의 치료를 비롯하여, MDS 및 철적혈모구 빈혈을 치료하는, 특히 MDS의 하나 또는 그 이상의 아형 또는 합병증을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 예로서, 빈혈, 호중구감소증, 비장비대, 수혈 요구, 급성 골수성 백혈병의 발달, 철분 과부하, 그리고 철분 과부하의 합병증을 비롯한 MDS 및 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증, 그 중에서도 특히 울혈성 심부전, 심장 부정맥, 심근 경색, 다른 형태의 심장 질환, 진성 당뇨병, 호흡 곤란, 간 질환, 그리고 철 킬레이트화 요법의 부정적인 효과를 치료하거나 예방하기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제의 조합을 이용하기 위한 방법을 제공한다.

특히, 본 발명은 골수 내에 상승된 숫자의 적모구 (세포과다성)을 갖는 MDS 환자; 골수 내에 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%보다 많은 철적혈모구를 갖는 MDS 환자; 환상 철적혈모구 불응성 빈혈 (RARS)을 동반한 MDS 환자; 환상 철적혈모구 불응성 빈혈 및 혈소판증가증 (RARS-T)을 동반한 MDS 환자; 단계열 형성장애 불응성 혈구감소증 (RCUD)을 동반한 MDS 환자; 다계열 형성장애 불응성 혈구감소증 및 환상 철적혈모구 (RCMD-RS)를 동반한 MDS 환자; SF3B1, SRSF2, DNMT3A, 또는 TET2에서 체성 돌연변이를 갖는 MDS 환자; ASXL1 또는 ZRSR2에서 체성 돌연변이가 없는 MDS 환자; 철분 과부하를 동반한 MDS 환자; 그리고 호중구감소증을 동반한 MDS 환자를 비롯하여, MDS의 아형에서 빈혈 또는 다른 합병증을 치료하거나 예방하기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제의 조합을 이용하기 위한 방법을 제공한다.

또한 특히, 본 발명은 환상 철적혈모구 불응성 빈혈 (RARS); 환상 철적혈모구 불응성 빈혈 및 혈소판증가증 (RARS-T); 다계열 형성장애 불응성 혈구감소증 및 환상 철적혈모구 (RCMD-RS); 알코올중독과 연관된 철적혈모구 빈혈; 약물 유발된 철적혈모구 빈혈; 구리 결핍 (아연 독성)으로부터 발생하는 철적혈모구 빈혈; 저체온증으로부터 발생하는 철적혈모구 빈혈; X 연관된 철적혈모구 빈혈 (XLSA); SLC25A38 결함; 글루타레독신 5 결함; 적혈구형성 프로토포르피린증; 운동실조를 동반한 X 연관된 철적혈모구 빈혈 (XLSA/A); B-세포 면역 결핍, 열병 및 발달 지체를 동반한 철적혈모구 빈혈 (SIFD); 피어슨 골수-췌장 증후군; 근병증, 젖산 산증, 그리고 철적혈모구 빈혈 (MLASA); 티아민-반응성 거대적혈구모세포성 빈혈 (TRMA); 그리고 원인불명의 증후군적/비증후군적 철적혈모구 빈혈을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 빈혈 또는 철적혈모구 빈혈의 다른 합병증을 치료하거나 예방하기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제의 조합을 이용하기 위한 방법을 제공한다.

일정한 양상에서, 본 발명은 SF3B1, DNMT3A 및/또는 TET2에서 생식계열 또는 체성 돌연변이와 연관되는 장애 또는 장애의 합병증, 예를 들면, 골수형성이상 증후군 (MDS), 만성 림프성 백혈병 (CLL) 및 급성 골수성 백혈병 (AML)뿐만 아니라 유방암, 췌장암, 위암, 전립선암 및 포도막 흑색종을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공한다. 일정한 양상에서 장애는 SF3B1, DNMT3A 및/또는 TET2 돌연변이, 특히 골수형성이상 증후군, CLL 및 AML에 대한 시험에서 양성인 골수 세포를 갖는 개체에 있을 수 있다. 임의선택적으로 SF3B1 유전자에서 돌연변이는 엑손, 인트론 또는 5' 또는 3' 비번역 영역 내에 있다. 임의선택적으로 SF3B1, DNMT3A 및/또는 TET2에서 돌연변이는 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 아미노산 서열에서 변화를 유발하거나 또는 아미노산 서열에서 변화를 유발하지 않는다. 임의선택적으로 SF3B1 유전자에서 돌연변이는 다음의 변화에서 선택되는, 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 아미노산에서 변화를 유발한다: K182E, E491G, R590K, E592K, R625C, R625G, N626D, N626S, H662Y, T663A, K666M, K666Q, K666R, Q670E, G676D, V701I, I704N, I704V, G740R, A744P, D781G, A1188V, N619K, N626H, N626Y, R630S, I704T, G740E, K741N, G742D, D894G, Q903R, R1041H, I1241T, G347V, E622D, Y623C, R625H, R625L, H662D, H662Q, T663I, K666E, K666N, K666T, K700E, 그리고 V701F. 임의선택적으로 DNMT3A 유전자에서 돌연변이는 다음의 변화에서 선택되는, 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 아미노산에서 변화를 유발한다: R882C, R882H, P904L, 그리고 P905P. 임의선택적으로 DNMT3A 유전자에서 돌연변이는 미성숙 종결 코돈을 도입한다. 가령, 일부 구체예에서, 미성숙 종결 코돈을 도입하는 DNMT3A 유전자에서 돌연변이는 다음의 위치에서 선택된다: Y436X 및 W893X. 임의선택적으로 TET2 유전자에서 돌연변이는 다음의 변화에서 선택되는, 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 아미노산에서 변화를 유발한다: E47Q, Q1274R, W1291R, G1370R, N1387S, 그리고 Y1724H. 임의선택적으로 TET2 유전자에서 돌연변이는 미성숙 종결 코돈을 도입한다. 가령, 일부 구체예에서, 미성숙 종결 코돈을 도입하는 TET2 유전자에서 돌연변이는 다음의 위치에서 선택된다: R550X, Q1009X, Y1337X, R1404X, R1516X, 그리고 Q1652X.

용어 "개체", "피험자" 또는 "환자"는 명세서 전반에서 교체가능하고, 그리고 일반적으로 포유동물을 지칭한다. 포유동물에는 가축 (가령, 소, 양, 고양이, 개, 그리고 말), 영장류 (가령, 인간과 비-인간 영장류, 예를 들면, 원숭이), 토끼, 그리고 설치류 (가령, 생쥐와 쥐)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본원에서 이용된 바와 같이, 장애 또는 질환을 "예방"하는 치료제는 통계학적 표본에서, 치료되지 않은 대조 표본에 비하여 치료된 표본에서 장애 또는 질환의 발생을 감소시키거나, 또는 치료되지 않은 대조 표본에 비하여 장애 또는 질환의 하나 또는 그 이상의 증상의 개시를 지연시키거나 또는 이러한 증상의 심각도를 감소시키는 화합물을 지칭한다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "치료하는"은 이미 확립된 질환의 개선 또는 제거를 포함한다. 어떠한 경우에도, 예방 또는 치료는 의사 또는 다른 건강 관리 제공자에 의해 제공된 진단 및 치료적 작용제의 투여의 의도된 결과에 의해 구별될 수 있다.

일반적으로, 본 발명에서 설명된 바와 같은 질환 또는 장애의 치료 또는 예방은 본 발명의 ActRII 길항제 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 길항제) 중에서 하나 또는 그 이상을 효과량으로 투여함으로써 달성된다. 작용제의 효과량은 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위해 필요한 용량에서 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 본 발명의 작용제의 "치료 효과량"은 인자, 예를 들면, 질환 상태, 개체의 연령, 성별과 체중, 그리고 개체에서 원하는 반응을 이끌어내는 상기 작용제의 능력에 따라 변할 수 있다. "예방적 효과량"은 원하는 예방적 결과를 달성하는데 필요한 용량에서 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.

골수형성이상 증후군 (MDS)은 골수성 혈액 세포의 무효한 생산 및 급성 골수성 백혈병으로 변환의 위험에 의해 특징화되는 혈액학적 장애의 다양한 집합이다. MDS 환자에서, 조혈 줄기 세포는 건강한 적혈구, 백혈구, 또는 혈소판으로 성숙하지 못한다. MDS 장애는 예로서, 불응성 빈혈, 단계열 형성장애 불응성 혈구감소증 (RCUD), 환상 철적혈모구 불응성 빈혈 (RARS), 현저한 혈소판증가증과 연관된 환상 철적혈모구 불응성 빈혈 (RARS-T), 과잉 모구 불응성 빈혈 (RAEB-1), 변환에서 과잉 모구 불응성 빈혈 (RAEB-2), 다중계통 형성장애 불응성 혈구감소증 (RCMD), 미분류 MDS (MDS-U), 그리고 단리된 5q 염색체 이상과 연관된 골수형성이상 증후군 [del(5q)을 동반한 MDS]을 포함한다.

동종이계 줄기-세포 이식은 MDS에 대한 유일하게 공지된 잠재적인 치유 요법이다. 하지만, 고령, 의학적 동시이환 및 적절한 줄기 세포 공여자의 제한된 이용가능성으로 인해, 단지 소수의 환자만 이러한 시술을 받는다. 심지어 동종이계 줄기-세포 이식까지 진행한 환자의 경우에도, 급성과 만성 이식편-대-숙주-질환 및 높은 재발률을 비롯한 유의미한 치료-관련된 사망 및 이환상태가 장기간 질환 없는 생존을 훼손한다 [Zeidan et al. (2013) Blood Rev 27:243-259]. 이들 이유로 인해, MDS를 앓는 대다수의 환자는 여전히 비-치유 의도 치료 패러다임에서 관리된다. 치료는 생존 또는 급성 골수성 백혈병으로의 진행을 예측하는 예후 인자에 근거된다. 더욱 낮은-위험 MDS 환자의 생존은 수개월 내지 10년 이상의 범위에서 변하고, 그리고 이들 환자 중에서 대부분은 MDS의 합병증에 직접적으로 관련된 원인으로 사망한다 [Dayyani et al. (2010) Cancer 116:2174-2179]. 이런 이유로, 더욱 낮은-위험 환자에 대한 치료 전략은 혈구감소증의 심각도와 유형 및 예상된 생존을 비롯한 특정한 환자의 환경에 맞게 조정된다. 더욱 낮은-위험 환자는 성장 인자, del(5q) 증후군의 경우에 레날리도미드, 탈리도미드, 포말리도미드, 저메틸화 작용제, 예를 들면, 아자시티딘 또는 데시티빈, 그리고 잠재적으로 치료 시험약으로 치료하는 것을 포함하는 복수의 치료적 옵션을 갖는다. 대조적으로, 동종이계 줄기-세포 이식에 적격이 아닌 더욱 높은-위험 MDS 환자는 전형적으로, 저메틸화 작용제, 집중 화학요법, 또는 치료 시험약으로 치료된다 [Garcia-Manero et al. (2011) 29:516-523].

MDS가 조혈 세포의 양 및 질 둘 모두에서 비가역성 결함으로서 현성하기 때문에, 대부분의 MDS 환자는 만성 빈혈로 고통받는다. MDS 환자의 대략 80% 내지 90%는 그들의 질환의 경과 동안 빈혈이 발달하고, 이들 중에서 최소한 40%는 RBC 수혈-의존성이 된다 [Santini (2011) Oncologist 16:35-42; Malcovati et al. (2005) J Clin Oncol 23:7594-7603; Leitch (2011) Blood Rev 25:17-31]. 더욱 높은-위험 MDS 군 (IPSS 분류에 따라)에서 환자는 수혈-의존성이 될 개연성이 훨씬 높다; 예로서, 한 연구에서 낮은 위험 환자 중에서 39%와 대비하여 높은 위험 범주 환자 중에서 79%는 심각한 빈혈을 치료하거나 예방하기 위해 만성 수혈을 필요로 하였다 [Oscan et al. (2013) Expert Rev Hematol 6:165-189]. 낮은 헤모글로빈 수준은 뇌 및 말초 장기에서 불량한 산소공급을 유발한다; 결과적으로, MDS 환자는 전형적으로, 기면, 감소된 정신적 각성도, 신체 허약, 그리고 불량한 집중력을 겪는다. 이들 증상은 감소된 건강-관련된 삶의 질에 연결된다. 이에 더하여, 헤모글로빈 역치가 MDS에서 유의미한 이환상태 및 사망과 독립적으로 연관된다. 각각, 8 g/dL 및 9 g/dL보다 낮은 헤모글로빈 수준을 갖는 여성 및 남성 환자에서, 이환상태 및 사망의 위험은 주로 심장 합병증의 증가된 위험으로 인해 증가한다 [Malcovati et al. (2011) Haematologica 96:1433-1440]. 낮은 헤모글로빈 수준 및 적혈구 수혈에 의존은 MDS를 앓는 환자에서 열등한 심혈관 결과 및 증가된 사망과 연관되었는데, 이것은 MDS에서 빈혈의 공격적 관리에 대한 강한 이론적 근거를 나타낸다 [Goldberg et al. (2010) J Clin Oncol 28:2847-2852; Leitch (2011) Blood Rev 25:17-31; Oliva et al. (2011) Am J Blood Res 1:160-166; Ozcan et al. (2013) Expert Rev Hematol 6:165-189].

MDS 환자는 단독으로, 또는 적혈구 수준을 증가시키는 집락 자극 인자 [가령, 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF)의 유사체, 예를 들면, 필그라스팀 또는 과립구 대식세포 집락 자극 인자 (GM-GSF)의 유사체, 예를 들면, 사르그라모스팀]와 합동으로 수혈 및/또는 적혈구형성 성장 인자 (가령, ESAs, 예를 들면, EPO)로 치료를 궁극적으로 필요로 한다. 수혈의 빈도는 질환의 정도 및 동시이환의 존재에 의존한다. 만성 수혈은 헤모글로빈 수준을 증가시키는 것으로 알려져 있는데, 이것은 차례로, 뇌 및 말초 조직 산소공급을 향상시키고, 따라서 신체 활동 및 정신적 각성도를 향상시킨다. 하지만, 많은 MDS 환자는 이런 요법의 이용으로부터 부작용이 발생한다. 가령, 빈번한 적혈구 수혈을 제공받는 환자는 철분 축적 및 독성 반응성 산소 종의 산출로부터 조직 및 장기 피해가 발생할 수 있다. 따라서, EPO 수용체 활성체와 임의선택적으로 합동된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)가 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 앓는 환자를 치료하는데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, MDS 또는 철적혈모구 빈혈로 고통받는 환자는 EPO 수용체 활성체와 임의선택적으로 합동으로, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)를 이용하여 치료될 수 있다. 다른 구체예에서, MDS 또는 철적혈모구 빈혈로 고통받는 환자는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등), 그리고 예로서, 에포에틴 알파, 에포에틴 베타 (가령, NeoRecormon), 에포에틴 델타 (가령, Dynepo), 에포에틴 오메가, 다베포에틴 알파 (가령, Aranesp), 메톡시-폴리에틸렌-글리콜 에포에틴 베타 (가령, Micera) 및 합성 적혈구생성 단백질 (SEP)을 비롯한 ESA; 필그라스팀을 비롯한 G-CSF 유사체; 사르그라모스팀을 비롯한 GM-CSF 유사체; 레날리도미드; 탈리도미드; 포말리도미드; 아자시티딘 및 데시타빈을 비롯한 저메틸화 작용제; 데페록사민 (별칭으로, 데스페리옥사민 B, 데스페록사민 B, DFO-B, DFOA, DFB, 또는 데스페랄), 데페리프론 (별칭으로, 페리프록스) 및 데페라시록스 (별칭으로, 비스-히드록시페닐-트리아졸, ICL670, 또는 Exjade™)를 비롯한 철-킬레이트화제; 로미플로스팀 및 엘트롬보패그를 비롯한 트롬보포이에틴 모방체; 단독으로, 또는 이다루비신, 토포테칸 또는 플루다라빈과 합동으로 시타라빈 (ara-C)을 비롯한 화학요법 작용제; 항흉선세포 글로불린, 알렘투주맙 및 시클로스포린을 비롯한 면역억제제; 보리노스탯, 발프로산, 페닐부티레이트, 엔티노스탯, MGCD0103, 다른 클래스 I 핵 HDAC 저해제, 클래스 II 비-핵 HDAC 저해제, 팬 (pan) HDAC 저해제, 그리고 동종형-특이적 HDAC 저해제를 비롯한 히스톤 탈아세틸화효소 저해제 (HDAC 저해제); 티피파르닙 및 로나파르닙을 비롯한 파르네실전달효소 저해제; 에타네르셉트 또는 인플릭시맙을 비롯한 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α) 저해제; 에자티오스탯을 비롯한 글루타티온-S-전달효소 (GST) P1-1의 저해제; 그리고 젬투주맙 오조가마이신을 비롯한 CD33의 저해제를 포함하는 MDS를 치료하기 위한 하나 또는 그 이상의 추가 치료적 작용제의 조합을 이용하여 치료될 수 있다.

EPO 수용체 활성체 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가 요법과 임의선택적으로 합동된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)는 빈혈 (MDS 또는 철적혈모구 빈혈)을 앓는 환자에서 적혈구 수준, 헤모글로빈 수준 및/또는 헤마토크리트 수준을 증가시키는데 이용될 수 있다. 인간에서 헤모글로빈 및/또는 헤마토크리트 수준을 모니터링할 때, 적절한 연령 및 성별 범주에 대한 정상보다 적은 수준은 비록 개체 변이가 고려되긴 하지만, 빈혈을 지시할 수 있다. 가령, 10-12.5 g/dl 및 전형적으로 약 11.0 g/dl 의 헤모글로빈 수준은 비록 치료의 면에서, 더욱 낮은 목표 수준이 더욱 적은 심혈관 부작용을 유발할 수 있긴 하지만, 건강한 성체에서 정상 범위 내에 있는 것으로 고려된다. 가령, Jacobs et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15, 15-19를 참조한다. 대안으로, 헤마토크리트 수준 (세포에 의해 점유된 혈액 표본의 용적의 백분율)이 빈혈의 척도로서 이용될 수 있다. 건강한 개체에 대한 헤마토크리트 수준은 성인 남성의 경우에 약 41-51% 및 성인 여성의 경우에 35-45% 범위에서 변한다. 일정한 구체예에서, 환자는 적혈구, 헤모글로빈 및/또는 헤마토크리트의 허용되는 수준을 유지하면서 환자를 적혈구, 헤모글로빈 및/또는 헤마토크리트의 목표 수준까지 회복시키거나 또는 적혈구 수혈의 감소 또는 제거를 허용하도록 의도된 투약 섭생으로 치료될 수 있다. 헤모글로빈 및 헤마토크리트 수준이 사람마다 다르기 때문에, 최적으로는, 목표 헤모글로빈 및/또는 헤마토크리트 수준은 각 환자에 대해 개별화될 수 있다.

호중구감소증은 순환 과립구의 비정상적으로 낮은 수준의 상태를 표시하고, 그리고 MDS 환자 중에서 대략 40%에서 발견된다 [Steensma et al. (2006) Mayo Clin Proc 81:104-130]. 호중구감소증을 앓는 환자의 공통적인 호소는 피로 및 특히, 피부의 빈번한 세균 감염을 포함한다. 하지만, 호중구감소증은 또한, MDS를 앓는 환자에서 심각한 합병증을 유발할 수 있고, 그리고 감염은 MDS-연관된 사망의 가장 흔한 원인이다. 과립구 집락 자극 인자 (필그라스팀)로 치료는 심각한 호중구감소성 환자의 경우에 호중구 수치를 1 x 10⁹/L 초과로 유지하는데 도움을 줄 수 있지만 [Akhtari (2011) Oncology (Williston Park) 25:480-486], 골수 성장 인자는 질환 병력을 명확하게 변화시키지 않고, 단지 살균 능력을 결여하는 기능적으로 결함성 호중구의 생산만을 증가시킬 수 있다 [Dayyani et al. (2010) Cancer 116:2174-2179; Steensma (2011) Semin Oncol 38:635-647]. 예방적 항생제는 MDS를 앓는 환자에서 역할이 입증되지 않았고 MDS에 관련된 호중구감소증을 앓는 환자에 대해 권장되지 않는다. 하지만, MDS 환자에서 호중구감소성 열병은 의학적 응급으로서 간주되어야 하고, 경험적 광범위 항생제의 즉각적인 투여 및 종종 입원을 필요로 한다 [Barzi et al. (2010) Cleve Clin J Med 77:37-44]. 일부 구체예에서, EPO 수용체 활성체 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가 요법, 예를 들면, G-CSF 또는 GM-CSF 요법과 임의선택적으로 합동된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)는 MDS 환자에서 호중구감소증을 치료하는데 이용될 수 있다. EPO 수용체 활성체 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가 요법과 임의선택적으로 합동된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)는 MDS 환자에서 과립구 수혈의 빈도를 감소시키는데 이용될 수 있다.

적혈구 또는 전혈의 빈번한 수혈을 제공받는, MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 앓는 환자는 수혈 철분 과부하가 발생하기 쉬운데, 이것은 MDS에서 수혈 의존성이 생존의 감소된 가능성과 연관되는 이유를 부분적으로 설명할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 수혈-의존성 MDS 환자에서 철 킬레이트화 요법의 이용은 여전히 논쟁이 되고 있는데, 그 이유는 후향 및 등록 데이터가 킬레이트화된 환자가 비킬레이트화된 환자보다 길게 생존할 수 있다는 것을 암시하기 때문인데, 하지만 킬레이트화로부터 이환상태 또는 사망 유용성을 증명하는 장래 무작위 시험 데이터가 없고, 그리고 현재 승인된 작용제는 불편 (데페록사민)하거나 또는 값비싸고 많은 환자에 의해 불량하게 용인 (데페라시록스)된다 [Steensma et al. (2013) Best Pract Res Clin Haematol 26:431-444; Lyons et al. (2014) Leuk Res 38:149-154].

일부 구체예에서, EPO 수용체 활성체 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가 요법과 임의선택적으로 합동된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 앓는 환자에서 철분 과부하의 합병증을 예방하거나 또는 반전시키는데 이용될 수 있다. 일정한 양상에서, EPO 수용체 활성체 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가 요법과 임의선택적으로 합동된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)는 예로서, 증가된 심장 박출량, 심장비대, 심근병증, 왼쪽 심실 비대, 급성 심근 경색, 부정맥 및 울혈성 심부전을 비롯한 철분 과부하의 심장 합병증을 예방하거나 또는 반전시키는데 이용될 수 있다. 일정한 양상에서, EPO 수용체 활성체 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가 요법과 임의선택적으로 합동된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)는 간 철분 함량을 감소시키고 및/또는 예로서, 간 확대 (간비대), 간 섬유증 (흉터 조직에서 증가) 및 간경변 (광범위한 흉터형성)을 비롯한 철분 과부하의 간 합병증을 예방하거나 또는 반전시키는데 이용될 수 있다. 일정한 양상에서, EPO 수용체 활성체 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가 요법과 임의선택적으로 합동된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)는 예로서, 진성 당뇨병을 비롯한 철분 과부하의 내분비 합병증을 예방하거나 또는 반전시키는데 이용될 수 있다.

일정한 양상에서, 본 발명의 ActRII 길항제 작용제는 MDS 및 철적혈모구 빈혈 또는 MDS 및 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증을 치료하기 위한 하나 또는 그 이상의 추가 작용제 [가령, ESAs; 필그라스팀을 비롯한 G-CSF 유사체; 사르그라모스팀을 비롯한 GM-CSF 유사체; 레날리도미드; 탈리도미드; 포말리도미드; 아자시티딘 및 데시타빈을 비롯한 저메틸화 작용제; 데페록사민 및 데페라시록스를 비롯한 철-킬레이트화제; 로미플로스팀 및 엘트롬보패그를 비롯한 트롬보포이에틴 모방체; 단독으로, 또는 이다루비신, 토포테칸 또는 플루다라빈과 합동으로 시타라빈 (ara-C)을 비롯한 화학요법 작용제; 항흉선세포 글로불린, 알렘투주맙 및 시클로스포린을 비롯한 면역억제제; 보리노스탯, 발프로산, 페닐부티레이트, 엔티노스탯, MGCD0103, 다른 클래스 I 핵 HDAC 저해제, 클래스 II 비-핵 HDAC 저해제, 팬 (pan) HDAC 저해제, 그리고 동종형-특이적 HDAC 저해제를 비롯한 히스톤 탈아세틸화효소 저해제 (HDAC 저해제); 티피파르닙 및 로나파르닙을 비롯한 파르네실전달효소 저해제; 에타네르셉트 또는 인플릭시맙을 비롯한 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α) 저해제; 에자티오스탯을 비롯한 글루타티온-S-전달효소 (GST) P1-1의 저해제; 그리고 젬투주맙 오조가마이신을 비롯한 CD33의 저해제] 또는 지지 요법 [가령, 적혈구 수혈, 과립구 수혈, 혈소판 (혈소판) 수혈]과 합동으로 치료가 필요한 개체에 투여될 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, "와 합동으로" 또는 "공동 투여"는 추가 요법 (가령, 두 번째, 세 번째, 네 번째 등)이 체내에서 여전히 효과적이도록 하는 임의의 투여 형태를 지칭한다 (가령, 복수 화합물은 환자에서 동시에 효과적이고, 이것은 이들 화합물의 상승 효과를 포함할 수 있다). 유용성은 혈액, 혈청, 또는 혈장에서 작용제의 계측가능한 농도와 상관하지 않을 수도 있다. 가령, 상이한 치료 화합물은 동일한 제제에서 또는 별개의 제제, 부수적으로 또는 순차적으로, 그리고 상이한 일정에서 투여될 수 있다. 따라서, 이런 치료를 제공받는 개체는 상이한 요법의 병용 효과로부터 이익을 얻을 수 있다. 본 발명의 하나 또는 그 이상의 GDF11 및/또는 액티빈 B 길항제 작용제 (임의선택적으로, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 C, 액티빈 E 및 BMP6 중에서 하나 또는 그 이상의 추가 길항제)는 하나 또는 그 이상의 다른 추가 작용제 또는 지지 요법과 동시에, 이들에 앞서, 또는 이들 다음에 투여될 수 있다. 일반적으로, 각 치료적 작용제는 상기 특정 작용제에 대해 결정된 용량에서 및/또는 시간 일정에서 투여될 것이다. 섭생에서 이용되는 특정 조합은 본 발명의 길항제와 요법의 양립성 및/또는 달성되는 원하는 치료 효과를 고려할 것이다.

일정한 구체예에서, EPO 수용체 활성체 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가 요법과 임의선택적으로 합동된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 항체 등)는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 앓는 환자에서 빈혈을 치료하기 위해 적혈구 또는 전혈의 수혈과 합동으로 이용될 수 있다. 전혈 또는 적혈구의 빈번한 수혈을 제공받는 환자에서, 철분 항상성의 정상적인 기전은 압도되어, 활력 조직, 예를 들면, 심장, 간 및 내분비선에서 철분의 독성 및 잠재적으로 치명적인 축적이 궁극적으로 야기될 수 있다. 규칙적인 적혈구 수혈은 혈액의 다양한 공여자 단위에 노출, 따라서 동종면역화의 더욱 높은 위험을 수반한다. 혈관 통로, 철 킬레이트화의 이용가능성 및 철 킬레이트의 순응도에서 어려움, 그리고 높은 비용은 적혈구 수혈의 횟수를 제한하는 것이 유익할 수 있는 이유 중에서 일부이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 ActRII 길항제 및 하나 또는 그 이상의 혈액 세포 수혈의 조합을 투여함으로써 치료가 필요한 개체에서 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 치료하는 것에 관계한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 ActRII 길항제 및 하나 또는 그 이상의 적혈구 수혈의 조합을 투여함으로써 치료가 필요한 개체에서 MDS 또는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증을 치료하거나 예방하는 것에 관계한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제로 치료는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 앓는 환자에서 수혈 요건을 감소시키는데, 예를 들면, MDS 또는 철적혈모구 빈혈 또는 하나 또는 그 이상의 이들의 합병증을 효과적으로 치료하는데 필요한 수혈의 빈도 및/또는 양을 감소시키는데 효과적이다.

일정한 구체예에서, EPO 수용체 활성체 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가 요법과 임의선택적으로 합동된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 앓는 환자에서 소변 및/또는 대변 내에 철분 배출을 증진하고 따라서, 조직 철분 과부하를 예방하거나 또는 반전시키기 위해 하나 또는 그 이상의 철-킬레이트화 분자와 합동으로 이용될 수 있다. 효과적인 철-킬레이트화제는 히드록실 라디칼 및 산화 산물의 촉매성 생산을 통한 대부분의 철 독성을 아마도 설명하는 비-트랜스페린 결합된 철의 산화된 형태인 제이철에 선별적으로 결합하고 이를 중화시킬 수 있어야 한다 [가령, Esposito et al. (2003) Blood 102:2670-2677을 참조한다]. 이들 작용제는 구조적으로 다양하지만, 이들 모두 1:1 (여섯자리 작용제), 2:1 (세자리), 또는 3:1 (두자리)의 화학량론에서 개별 철 원자와 중화 팔면체 배위 복합체를 형성할 수 있는 산소 또는 질소 공여자 원자를 소유한다 [Kalinowski et al. (2005) Pharmacol Rev 57:547-583]. 일반적으로, 효과적인 철-킬레이트화제는 또한, 상대적으로 적은 분자량 (가령, 700 달톤보다 적음)이고, 그리고 물 및 지질 둘 모두에서 용해도로 인해 영향을 받은 조직에 접근할 수 있다. 철-킬레이트화 분자의 특정한 실례는 매일 비경구 투여를 필요로 하는 세균 기원의 여섯자리 작용제인 데페록사민, 그리고 경구 활성 합성 작용제 데페리프론 (두자리) 및 데페라시록스 (세자리)를 포함한다. 2가지 철-킬레이트화제의 동일한-일자 투여로 구성되는 복합 요법은 킬레이트화 단일요법에 반응이 없는 환자에서, 그리고 또한, 데페록사민 단독에서 불량한 환자 순응도의 문제를 극복함에 있어서 희망을 보여준다 [Cao et al. (2011) Pediatr Rep 3(2):e17; 그리고 Galanello et al. (2010) Ann NY Acad Sci 1202:79-86].

EPO 수용체 활성체 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가 요법과 임의선택적으로 합동된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)은 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 앓는 환자에서 적혈구 수준, 헤모글로빈 수준 및/또는 헤마토크리트 수준을 증가시키는데 이용될 수 있다. 인간에서 헤모글로빈 및/또는 헤마토크리트 수준을 관찰할 때, 적절한 연령 및 성별 범주에 대한 정상보다 적은 수준은 비록 개체 변이가 고려되긴 하지만, 빈혈을 지시할 수 있다. 가령, 10-12.5 g/dl 및 전형적으로 약 11.0 g/dl 의 헤모글로빈 수준은 비록 치료의 면에서, 더욱 낮은 목표 수준이 더욱 적은 심혈관 부작용을 유발할 수 있긴 하지만, 건강한 성체에서 정상 범위 내에 있는 것으로 고려된다. 가령, Jacobs et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15, 15-19을 참조한다. 대안으로, 헤마토크리트 수준 (세포에 의해 점유된 혈액 표본의 용적의 백분율)이 빈혈의 척도로서 이용될 수 있다. 건강한 개체에 대한 헤마토크리트 수준은 성인 남성의 경우에 약 41-51% 및 성인 여성의 경우에 35-45% 범위에서 변한다. 일정한 구체예에서, 환자는 환자를 적혈구, 헤모글로빈 및/또는 헤마토크리트의 목표 수준까지 회복시키는 것으로 의도된 투약 섭생으로 치료될 수 있다. 헤모글로빈 및 헤마토크리트 수준이 사람마다 다르기 때문에, 최적으로는, 목표 헤모글로빈 및/또는 헤마토크리트 수준은 각 환자에 대해 개별화될 수 있다.

본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)는 빈혈을 치료하기 위해, EPO 수용체 활성체 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가 요법과 합동으로 이용될 수 있다. MDS를 앓는 일부 환자에서 준최적 에리트로포이에틴 반응은 ESAs로 MDS-관련된 빈혈을 치료하기 위한 한 가지 생물학적 이론적 근거인 것으로 고려된다 [Greenberg et al. (2011) J Natl Compr Canc Netw 9:30-56; Santini (2012) Semin Hematol 49:295-303]. MDS-연관된 빈혈에서 이용에 대해 FDA에 의해 승인되지 않았음에도 불구하고, ESAs는 임상적으로 폭넓게 이용되고, 그리고 MDS에 대한 가장 흔히 이용되는 요법이다 [Casadevall et al. (2004) Blood 104:321-327; Greenberg et al. (2009) Blood 114:2393-2400]. 2001년 및 2005년 사이에 연계된 SEER-Medicare 데이터의 분석에서, MDS를 앓는 Medicare 수혜자 중에서 62%가 ESAs를 제공받은 것으로 밝혀졌다 [Davidoff et al. (2013) Leuk Res 37:675-680]. Greenberg et al. (2009) Blood 114:2393-2400]. 일부 전임상 및 임상 연구는 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF)가 ESAs와 상승 효과를 가질 수 있고, 그리고 적은 용량의 G-CSF가 초기에 또는 유일 ESA 요법에 반응이 결여되는 경우에, 일부 환자, 특히 RARS를 앓는 환자에서 적혈구 반응을 향상시키는데 시도될 수 있다는 것을 제안하였다 [Negrin et al. (1996) Blood 87:4076-4081]. 추가적으로, 낮은 위험 MDS 및 더욱 낮은 수준의 혈청 EPO (< 200-500 mU/mL)갖는 환자 및 더욱 낮은 RBC 수혈 요건 (< 2 단위/월)을 갖는 환자는 ESAs로 적혈구 반응을 달성하는 더욱 높은 확률을 갖는다 [Hellstrom-Lindberg et al. (2003) Br J Haematol 120:1037-1046; Park et al. (2008) 111:574-582]. 이런 이유로, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)는 빈혈을 치료하기 위해, 과립구 집락 자극 인자 (가령, 필그라스팀) 또는 과립구 대식세포 집락 자극 인자 (가령, 사르그라모스팀)와 합동으로 이용될 수 있다.

일정한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등) 및 EPO 수용체 활성체의 치료 효과량을 개체에 투여함으로써, 치료가 필요한 개체에서 빈혈을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)는 ESAs의 부정적인 효과에 감수성인 환자에서 이들 활성체의 필요한 용량을 감소시키기 위해 EPO 수용체 활성체와 합동으로 이용될 수 있다. 이들 방법은 환자의 치료적 및 예방적 처치에 이용될 수 있다.

본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)는 특히 더욱 낮은 용량 범위에서 적혈구의 증가를 달성하기 위해 EPO 수용체 활성체와 합동으로 이용될 수 있다. 이것은 공지된 부정확한 효과 및 고용량의 EPO 수용체 활성체와 연관된 위험을 감소시키는데 유익할 수 있다. ESAs의 일차적인 부정적인 효과는 예로서, 헤마토크리트 또는 헤모글로빈 수준에서 과도한 증가 및 적혈구증가증을 포함한다. 상승된 헤마토크리트 수준은 고혈압 (더욱 구체적으로, 고혈압의 악화) 및 혈관 혈전증을 야기할 수 있다. 보고된 ESAs의 다른 부정적인 효과 (이들 중에서 일부는 고혈압에 관계한다)는 두통, 인플루엔자-유사 증후군, 션트 폐색, 혈전증으로 인한 심근 경색 및 대뇌 경련, 고혈압성 뇌병증, 그리고 적혈구 혈액 세포 형성부전증이다. 가령, Singibarti (1994) J. Clin Investig 72(suppl 6), S36-S43; Horl et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15(suppl 4), 51-56; Delanty et al. (1997) Neurology 49, 686-689; and Bunn (2002) N Engl J Med 346(7), 522-523)을 참조한다.

본 발명의 길항제가 ESAs와 상이한 기전에 의해 행동한다면, 이들 길항제는 ESAs 또는 다른 EPO 수용체 활성체에 잘 반응하지 않는 환자에서 적혈구 및 헤모글로빈 수준을 증가시키는데 유용할 수 있다. 가령, 본 발명의 ActRII 길항제는 정상 내지 증가된 (> 300 IU/kg/주) 용량의 ESA의 투여가 표적 수준까지 헤모글로빈 수준의 증가를 유발하지 못하는 환자에 유익할 수 있다. ESAs에 부적당한 반응을 갖는 환자는 모든 유형의 빈혈에서 발견되지만, 더욱 많은 숫자의 무반응자가 암을 앓는 환자 및 말기 신장병을 앓는 환자에서 특히 빈번하게 관찰되었다. ESAs에 대한 부적당한 반응은 구조성 (ESA로 첫 번째 치료 시에 관찰됨) 또는 후천성 (ESA로 반복된 치료 시에 관찰됨).

레날리도미드는 del5q 및 수혈-의존성 빈혈을 동반한 더욱 낮은-위험 MDS를 앓는 환자에 대해 승인된 탈리도미드 유도체이다. 포말리도미드는 다른 탈리도미드 유도체이다. U.S.에서 레날리도미드의 승인은 2 단계 시험의 결과에 근거되었는데, 여기서 수혈 독립이 연구된 환자의 약 2/3에서 달성되었고, 그리고 수혈 독립의 평균 지속 기간이 2.2 년이었다 [List et al. (2006) N Engl J Med 355:1456-1465]. 유럽 [Giagounidis et al. (2014) Eur J Haematol 93:429-438]에서도 차후에 승인된, 레날리도미드는 del5q 및 빈혈을 동반한 더욱 낮은-위험 MDS을 앓는 환자에 대한 일차 치료인 것으로 고려된다. 일정한 구체예에서, EPO 수용체 활성체 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가 요법과 임의선택적으로 합동된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)는 MDS를 앓는 환자를 치료하기 위해 레날리도미드와 합동으로 이용될 수 있다.

일탈적 DNA 메틸화는 MDS에서 불량한 예후적 특질이다 [Shen e al. (2010) J Clin Oncol 28:605-613]. 아자시티딘 및 데시타빈은 주로 높은 위험 MDS를 앓는 환자를 치료하는데 현재 이용되고 있는 DNA 저메틸화 활성을 갖는 2가지 작용제이다 [Kantarjian et al. (2007) Cancer 109:1133-1137; Fenaux et al. (2009) Lancet Oncol 10:223-232]. 이들의 치료 효과의 기초가 되는 기전이 불확실하기 때문에, 이들 작용제는 때때로, 그들의 화학 구조 (아자뉴클레오시드) 또는 공지된 시험관내 활성 (DNA 메틸전달효소 저해제)에 따라 분류된다. 비록 더욱 낮은-위험 MDS에서 아자시티딘 및 데시타빈을 이용한 치료적 경험이 덜하긴 하지만, 여러 연구는 아자시티딘 및 데시타빈이 더욱 낮은-위험 MDS를 앓는 ESA-내성 환자의 30% 내지 40%에서 적혈구 반응을 발생시킬 수 있다는 것을 지시한다 [Lyons et al. (2009) J Clin Oncol 27:1850-1856]. 혈소판 반응이 또한, 혈소판감소성 환자에서 관찰된다. 이들 결과의 기초에서, 아자시티딘 및 데시타빈은 미국에서 증후성 혈구감소증을 동반한 더욱 낮은-위험 MDS의 치료에 승인된다. 일정한 구체예에서, EPO 수용체 활성체 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가 요법과 임의선택적으로 합동된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)는 MDS를 앓는 환자를 치료하기 위해 아자시티딘, 데시타빈, 또는 다른 DNA 메틸전달효소 저해제와 합동으로 이용될 수 있다.

혈소판감소증은 MDS 환자 중에서 대략 35% 내지 45%에서 발생하는데, 이들은 쉽게 멍듬 또는 빈번한 경미한 점액피부 출혈을 호소할 수 있고, 그리고 자반병 또는 점상 출혈을 전시할 수 있다 [Steensma et al. (2006) Mayo Clin Proc 81:104-130]. 더욱 극심한 사례에서, 위장관 출혈 또는 두개내 출혈의 증가된 위험이 일어날 수 있다. 혈소판감소성 환자의 경우, 혈소판 수혈은 전형적으로, 혈소판 수준이 10,000 혈소판/μL보다 적게 하락할 때 처방된다 [Slichter (2007) Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2007:172-178]. 혈소판 수혈의 지지적 이용은 일시적이고, 그리고 장기적으로 수혈-의존성 MDS 환자에서 민감화의 빈발로 인해 항상 효과적인 것은 아니다. MDS의 요법에서 혈전형성 활성을 갖는 성장 인자를 이용하는데 상당한 관심이 집중되고 있다. 로미플로스팀 및 엘트롬보패그는 미국에서 특발성 혈소판감소성 자반병을 앓는 환자에서 승인된 혈전모방 작용제이고, 그리고 로미플로스팀은 MDS를 앓는 환자에서 광범위하게 연구되고 있다 [Kantarjian et al. (2010) J Clin Oncol 28:437-444; Santini (2012) Semin Hematol 49:295-303]. 단일 작용제로서 이용될 때, 로미플로스팀은 혈소판감소증을 동반한 더욱 낮은-위험 MDS를 앓는 환자 중에서 대략 50%에서 혈소판 수치를 유의미하게 향상시킬 수 있다. 하지만, 골수 모구 백분율에서 때때로 20%보다 큰 일시적인 증가가 15%의 환자에서 관찰될 수 있는데, 이것은 MDS에서 모세포 상에 트롬보포이에틴 수용체의 존재와 일치한다. 로미플로스팀은 또한, 아자시티딘, 데시타빈, 또는 레날리도미드, 탈리도미드 또는 포말리도미드를 제공받는 MDS 환자에서 혈소판감소증 및/또는 혈소판 수혈을 유의미하게 감소시킬 수 있고, 그리고 이들 치료에 중요한 보조약이 될 수 있었다 [Kantarjian et al. (2010) Blood 116:3163-3170]. 엘트롬보패그 역시, MDS에서 개발되고 있다. 일정한 구체예에서, EPO 수용체 활성체 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가 요법과 임의선택적으로 합동된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈을 앓는 환자를 치료하기 위해 혈전모방 작용제, 예를 들면, 로미플로스팀 또는 엘트롬보패그와 합동으로 이용될 수 있다.

일정한 구체예에서, EPO 수용체 활성체 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가 요법과 임의선택적으로 합동된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈, 특히 철분 과부하와 연관된 합병증을 앓는 환자를 치료하기 위해 헵시딘, 헵시딘 유사체, 또는 헵시딘 수용체 활성체와 합동으로 이용될 수 있다. 간에서 주로 생산되는 순환하는 폴리펩티드인 헵시딘은 흡수성 장세포, 간세포 및 대식세포에 국부화된 철분-이출 단백질인 페로포틴의 분해를 유도하는 능력에 의해서 철분 대사의 마스터 조절인자인 것으로 고려된다. 광범위한 용어에서, 헵시딘은 세포외 철분의 이용가능성을 감소시키고, 따라서 헵시딘, 헵시딘 유사체, 또는 헵시딘 수용체 활성체는 MDS 또는 철적혈모구 빈혈, 특히 철분 과부하와 연관된 합병증을 앓는 환자의 치료에서 유익할 수 있다.

MDS에 대한 치료 시험약은 개발 중에 있다. 이들은 면역억제-기초된 요법에 대한 규준에 부합하는 환자의 경우에, 히스톤 탈아세틸화효소의 단일-작용제 저해제, p38MAPK 저해제, 글루타티온 S-전달효소 π 저해제, 그리고 알렘투주맙을 포함한다 [Garcia-Manero et al. (2011) J Clin Oncol 29:516-523; ]. 가령, 높은 반응률이 항흉선세포 글로불린 또는 알렘투주맙을 통합하는 면역억제 요법으로 치료된 MDS 환자에서 보고되었다 [Sloand et al. (2010) J Clin Oncol 28:5166-5173]. 하지만, 이런 환자는 일반적으로, 전반적인 MDS 환자보다 더욱 어리고 더욱 높은 빈도의 정상적인 핵형을 갖는데, 이것은 이들 결과의 일반화 가능성을 제한한다. 조사 요법은 예로서, 보리노스탯, 발프로산, 페닐부티레이트, 엔티노스탯, MGCD0103, 다른 클래스 I 핵 HDAC 저해제, 클래스 II 비-핵 HDAC 저해제, 팬 (pan) HDAC 저해제, 그리고 동종형-특이적 HDAC 저해제를 비롯한 히스톤 탈아세틸화효소 저해제 (HDAC 저해제); 티피파르닙 및 로나파르닙을 비롯한 파르네실전달효소 저해제; 에타네르셉트 또는 인플릭시맙을 비롯한 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α); 에자티오스탯을 비롯한 글루타티온-S-전달효소 (GST) P1-1의 저해제; 그리고 젬투주맙 오조가마이신을 비롯한 CD33의 저해제를 포함한다. 일정한 구체예에서, EPO 수용체 활성체 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가 요법과 임의선택적으로 합동된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)은 MDS에 대한 이들 조사 요법 중에서 하나 또는 그 이상과 합동으로 이용될 수 있다.

증가하는 증거는 MDS 치료적 작용제 및 상이한 작용 기전의 합동된 이용이 축소된 부작용, 향상된 전체 생존, 그리고 급성 골수성 백혈병으로의 지연된 진행의 형태에서 실제적인 유익성을 제공한다는 것을 암시한다. 복수 연구는 전통적인 단일요법과 비교할 때, 다양한 약제를 비중복 작용 기전 및 독성과 합동하는 것이 MDS 환자에 대한 유의미한 유익성을 유발할 수 있다는 것을 지시한다. 성장 인자, DNA 메틸전달효소 저해제, 히스톤 탈아세틸화효소 저해제, 그리고 면역억제제 치료를 이용한 다양한 복합 요법은 고무적인 데이터를 제공한다 [Ornstein et al. (2012) Int J Hematol 95:26-33]. 이런 이유로, EPO 수용체 활성체와 임의선택적으로 합동된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)는 성장 인자, DNA 메틸전달효소 저해제, 히스톤 탈아세틸화효소 저해제, 또는 면역억제제 치료를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 2가지 또는 그 이상 작용제의 조합으로 부가적으로 치료된 MDS 환자에서 적혈구의 숫자를 증가시키는데 이용될 수 있다.

일정한 구체예에서, 본 발명은 환자에서 하나 또는 그 이상의 혈액학적 파라미터를 계측함으로써, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)로 치료되었던 환자, 또는 치료되는 후보인 환자를 관리하기 위한 방법을 제공한다. 혈액학적 파라미터는 본 발명의 길항제로 치료되는 후보인 환자에 대한 적절한 투약을 평가하고, 치료 동안 혈액학적 파라미터를 모니터링하고, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 길항제로 치료 동안 용량을 조정할 지의 여부를 평가하고 및/또는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 길항제의 적절한 유지 용량을 평가하는데 이용될 수 있다. 혈액학적 파라미터 중에서 하나 또는 그 이상이 정상적인 수준을 벗어나면, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)로 투약은 감소되거나, 지연되거나 또는 종결될 수 있다.

본원에서 제공된 방법에 따라서 계측될 수 있는 혈액학적 파라미터는 예로서, 적혈구 수준, 혈압, 철분 저장, 그리고 당분야에서 인정된 방법을 이용하여, 증가된 적혈구 수준과 상관하는 체액에서 발견된 다른 작용제를 포함한다. 이런 파라미터는 환자로부터 혈액 표본을 이용하여 결정될 수 있다. 적혈구 수준, 헤모글로빈 수준 및/또는 헤마토크리트 수준에서 증가는 혈압에서 증가를 유발할 수 있다.

한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 혈액학적 파라미터가 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)로 치료되는 후보인 환자에서 정상 범위를 벗어나거나 또는 정상의 높은 측면에 있으면, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 길항제의 투여의 개시는 혈액학적 파라미터가 자연적으로 또는 치료적 개입을 통해 정상적인 또는 허용되는 수준으로 복귀할 때까지 지연될 수 있다. 가령, 후보 환자가 고혈압성 또는 전고혈압성이면, 환자는 환자의 혈압을 감소시키기 위해 혈압 저하제로 치료될 수 있다. 예로서, 이뇨제, 아드레날린성 저해제 (알파 차단제 및 베타 차단제 포함), 혈관확장제, 칼슘 통로 차단제, 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 저해제, 또는 안지오텐신 II 수용체 차단제를 비롯하여, 개별 환자의 상태에 적절한 임의의 혈압 저하제가 이용될 수 있다. 혈압은 대안으로, 식이 및 운동 섭생을 이용하여 치료될 수 있다. 유사하게, 후보 환자가 정상보다 낮거나, 또는 정상의 낮은 측면에 있는 철분 저장을 가지면, 환자는 환자의 철분 저장이 정상적인 또는 허용되는 수준으로 복귀할 때까지 식이 및/또는 철분 보충제의 적절한 섭생으로 치료될 수 있다. 정상보다 높은 적혈구 수준 및/또는 헤모글로빈 수준을 갖는 환자의 경우, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 길항제의 이후 투여는 이들 수준이 정상적인 또는 허용되는 수준으로 복귀할 때까지 지연될 수 있다.

일정한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 혈액학적 파라미터가 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)로 치료되는 후보인 환자에서 정상 범위를 벗어나거나 또는 정상의 높은 측면에 있으면, 투여의 개시가 지연될 수 없을 수도 있다. 하지만, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 길항제의 투약의 복용량 또는 빈도는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 길항제의 투여 시에 발생하는 혈액학적 파라미터에서 받아들일 수 없는 증가의 위험을 감소시킬 양으로 세팅될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)를 바람직하지 않은 수준의 혈액학적 파라미터를 해소하는 치료적 작용제와 합동하는 치료적 섭생이 환자를 위해 개발될 수 있다. 가령, 환자가 상승된 혈압을 가지면, 치료적 섭생은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등) 및 혈압 저하제의 투여를 수반하도록 설계될 수 있다. 원하는 수준보다 낮은 철분 저장을 갖는 환자의 경우, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등) 및 철분 보충을 수반하는 치료적 섭생이 개발될 수 있다.

한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 혈액학적 파라미터에 대한 기준선 파라미터(들)가 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등) 및 기준선 값(들)에 근거하여 환자에 대해 확립된 적절한 투약 섭생으로 치료되는 후보인 환자에 대해 확립될 수 있다. 대안으로, 환자의 병력에 근거된 확립된 기준선 파라미터가 환자에 대한 적절한 길항제 투약 섭생을 통지하는데 이용될 수 있었다. 가령, 건강한 환자가 규정된 정상 범위를 초과하는 확립된 기준선 혈압 판독을 가지면, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 길항제로 치료에 앞서 환자의 혈압을 일반 개체군에 대해 정상적인 것으로 고려되는 범위로 가져오는 것이 필요하지 않을 수도 있다. 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)로 치료에 앞서 하나 또는 그 이상의 혈액학적 파라미터에 대한 환자의 기준선 값은 또한, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 길항제로 치료 동안 혈액학적 파라미터에서 임의의 변화를 모니터링하기 위한 유관한 비교 값으로서 이용될 수 있다.

일정한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 혈액학적 파라미터는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)로 치료되고 있는 환자에서 계측된다. 혈액학적 파라미터는 치료 동안 환자를 모니터링하고, 그리고 본 발명의 하나 또는 그 이상의 길항제로 투약 또는 다른 치료적 작용제로 추가 투약의 조정 또는 종결을 허용하는데 이용될 수 있다. 가령, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)의 투여가 혈압, 적혈구 수준 또는 헤모글로빈 수준에서 증가, 또는 철분 저장에서 감소를 유발하면, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 길항제의 용량은 하나 또는 그 이상의 혈액학적 파라미터에 대한 본 발명의 하나 또는 그 이상의 길항제의 효과를 감소시키기 위해 양 또는 빈도에서 감소될 수 있다. 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)의 투여가 환자에게 불리한 하나 또는 그 이상의 혈액학적 파라미터에서 변화를 유발하면, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 길항제의 투약은 일시적으로, 혈액학적 파라미터(들)가 허용되는 수준으로 복귀할 때까지, 또는 영구적으로 종결될 수 있다. 유사하게, 하나 또는 그 이상의 혈액학적 파라미터가 본 발명의 하나 또는 그 이상의 길항제의 용량 또는 투여 빈도를 감소시킨 후 허용되는 범위 내에 있지 않으면, 투약은 종결될 수 있다. 본 발명의 하나 또는 그 이상의 길항제로 투약을 감소시키는 또는 종결하는 것에 대안으로서, 또는 이에 더하여, 환자는 혈액학적 파라미터(들)에서 바람직하지 않은 수준을 해소하는 추가 치료적 작용제, 예를 들면, 예로서, 혈압 저하제 또는 철분 보충제가 투약될 수 있다. 가령, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)로 치료되는 환자가 상승된 혈압을 가지면, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 길항제로 투약이 동일한 수준에서 계속될 수 있고 혈압 저하제가 치료 섭생에 추가되거나, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 길항제로 투약이 감소될 수 있고 (가령, 양 및/또는 빈도에서) 혈압 저하제가 치료 섭생에 추가되거나, 또는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 길항제로 투약이 종결될 수 있고 환자가 혈압 저하제로 치료될 수 있다.

6. 제약학적 조성물

일정한 양상에서, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 ActRII 길항제 작용제 (가령, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)는 단독으로 또는 제약학적 제제 (치료 조성물 또는 제약학적 조성물로서 또한 지칭됨)의 성분으로서 투여될 수 있다. 제약학적 제제는 그 안에 내포된 활성 성분 (가령, 본 발명의 작용제)의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하고, 그리고 이러한 제제가 투여될 개체에 받아들이기 어려울 정도로 독성인 추가 성분을 내포하지 않는 형태의 제조물을 지칭한다. 주제 화합물은 인간 또는 수의학에서 이용을 위한 임의의 편의한 방식으로 투여용으로 조제될 수 있다. 가령, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 작용제는 제약학적으로 허용되는 담체로 조제될 수 있다. 제약학적으로 허용되는 담체는 제약학적 제제에서 개체에 일반적으로 비독성인, 활성 성분 이외의 성분을 지칭한다. 제약학적으로 허용되는 담체에는 완충액, 부형제, 안정제 및/또는 보존제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일반적으로, 본 발명에서 이용을 위한 제약학적 제제는 개체에 투여될 때 발열원이 없는, 생리학적으로 허용되는 형태이다. 앞서 설명된 바와 같이 제제 내에 임의선택적으로 포함될 수 있는, 본원에서 설명된 것들 이외에 치료적으로 유용한 작용제는 본 발명의 방법에서 주제 작용제와 합동으로 투여될 수 있다.

전형적으로, 화합물은 비경구 투여될 것이다 [가령, 정맥내 (I.V.) 주사, 동맥내 주사, 골내 주사, 근육내 주사, 척수강내 주사, 피하 주사, 또는 피내 주사에 의해]. 비경구 투여에 적합한 제약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 제약학적으로 허용되는 무균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 유제, 또는 이용 직전에 무균 주사가능 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 무균 분말과 합동으로 본 발명의 하나 또는 그 이상의 작용제를 포함할 수 있다. 주사가능 용액 또는 분산액은 항산화제, 완충액, 세균발육저지제, 현탁제, 농후제, 또는 제제를 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 만드는 용질을 내포할 수 있다. 본 발명의 제약학적 제제에서 이용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 실례는 물, 에탄올, 폴리올 (가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일 (가령, 올리브유), 주사가능 유기 에스테르 (가령, 에틸 올레산염), 그리고 이들의 적합한 혼합물을 포함한다. 적절한 유동성은 예로서, 코팅 물질 (가령, 레시틴)의 이용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 치료 방법은 제약학적 조성물을 이식물 또는 장치로부터 전신적으로, 또는 국부적으로 투여하는 것을 포함한다. 게다가, 제약학적 조성물은 표적 조직 부위 (가령, 골수 또는 근육)에 전달을 위한 형태에서 피포되거나 또는 주사될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 작용제 중에서 하나 또는 그 이상을 표적 조직 부위 (가령, 골수 또는 근육)에 전달하고, 발달하는 조직에 대한 구조를 제공하고, 그리고 신체 내로 최적으로 재흡수될 수 있는 매트릭스를 포함할 수 있다. 가령, 매트릭스는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 작용제의 느린 방출을 제공할 수 있다. 이런 매트릭스는 다른 이식된 의학적 적용을 위해 현재 이용되는 물질로 형성될 수 있다.

매트릭스 물질의 선택은 다음 중에서 하나 또는 그 이상에 근거될 수 있다: 생체적합성, 생물분해성, 기계적 성질, 미용 외관, 그리고 인터페이스 성질. 본 조성물의 특정 적용은 적절한 제제를 규정할 것이다. 조성물에 대한 잠재적 매트릭스는 생물분해성이고 화학적으로 규정된 황산칼슘, 인산삼칼슘, 수산화인회석, 폴리유산, 및 폴리무수물일 수 있다. 다른 잠재적 물질은 예로서, 뼈 또는 진피 콜라겐을 비롯한, 생물분해성이고 생물학적으로 충분히 규정된 물질이다. 추가 매트릭스는 순수한 단백질 또는 세포외 기질 성분으로 구성된다. 다른 잠재적 매트릭스는 예로서, 소결된 수산화인회석, 생체유리, 알루미나, 또는 다른 세라믹스를 비롯한, 비생물분해성이고 화학적으로 규정된 물질이다. 매트릭스는 예로서, 폴리유산 및 수산화인회석 또는 콜라겐 및 인산삼칼슘을 비롯한, 전술한 유형의 물질 중에서 한 가지의 조합으로 구성될 수 있다. 바이오세라믹스는 구멍 크기, 입자 크기, 입자 모양 및 생물분해성 중에서 하나 또는 그 이상을 변경하기 위해 조성 (가령, 칼슘-알루민산염-인산염) 및 처리에서 변경될 수 있다.

일정한 구체예에서, 본 발명의 제약학적 조성물은 예로서, 미리 결정된 양의 본 발명의 화합물 및 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 다른 활성 성분을 각각 내포하는 캡슐, 교갑, 알약, 정제, 로젠지 (향미 가미된 기초, 예를 들면, 수크로오스 및 아카시아 또는 트래거캔스 이용), 분말, 과립, 수성 또는 비수성 액체에서 용액 또는 현탁액, 수중유 또는 유중수 액체 유제, 또는 엘릭시르 또는 시럽, 또는 사탕형 알약 (비활성 기부, 예를 들면, 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로오스 및 아카시아 이용) 및/또는 구강 청결제의 형태에서 경구 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물 및 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 다른 활성 성분은 또한, 일시 주사, 연질약, 또는 페이스트로서 투여될 수 있다.

경구 투여를 위한 고체 약형 (가령, 캡슐, 정제, 알약, 당의정, 분말, 및 과립)에서, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물은 예로서, 구연산나트륨, 인산이칼슘, 충전제 또는 증량제 (가령, 전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨 및 규산), 결합제 (가령, 카르복시메틸셀룰로오스, 알긴산염, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로오스 및 아카시아), 보습제 (가령, 글리세롤), 붕해제 (가령, 한천-한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 규산염 및 탄산나트륨), 용해 지연제 (가령, 파라핀), 흡수 촉진제 (가령, 사차 암모늄 화합물), 적심제 (가령, 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트), 흡수제 (가령, 카올린 및 벤토나이트 점토), 윤활제 (가령, 활석, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 황산염), 착색제, 그리고 이들의 혼합물을 비롯한 하나 또는 그 이상의 제약학적으로 허용되는 담체와 혼합될 수 있다. 캡슐, 정제와 알약의 경우에, 제약학적 제제 (조성물)은 또한, 완충제를 포함할 수도 있다. 유사한 유형의 고체 조성물은 또한, 예로서, 락토오스 또는 유당을 비롯한 하나 또는 그 이상의 부형제뿐만 아니라 높은 분자량 폴리에틸렌 글리콜을 이용한 연성과 경성-충전된 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 이용될 수도 있다.

제약학적 조성물의 경구 투여를 위한 액체 약형은 제약학적으로 허용되는 유제, 마이크로유제, 용액, 현탁액, 시럽과 엘릭시르를 포함할 수 있다. 활성 성분(들)에 더하여, 액체 약형은 예로서, 물 또는 다른 용매, 가용화제 및/또는 유화제 [가령, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 탄산염, 에틸 아세트산염, 벤질 알코올, 벤질 벤조산염, 프로필렌 글리콜, 또는 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (가령, 목화씨, 땅콩, 옥수수, 배아, 올리브, 피마자 및 참깨 기름), 글리세롤, 테트라히드로푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르, 그리고 이들의 혼합물]을 비롯하여, 당분야에서 통상적으로 이용된 비활성 희석제를 내포할 수 있다. 비활성 희석제 이외에, 경구 제제는 또한, 예로서, 적심제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 풍미제, 착색제, 방향제, 보존제 작용제, 그리고 이들의 조합을 비롯한 어쥬번트를 포함할 수 있다.

현탁액은 활성 화합물에 더하여, 예로서, 에톡실화된 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨, 소르비탄 에스테르, 미정질 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천-한천, 트래거캔스, 그리고 이들의 조합을 비롯한 현탁제를 내포할 수 있다.

미생물의 작용 및/또는 성장의 예방은 예로서, 파라벤, 클로로부탄올 및 페놀 소르브산을 비롯한 다양한 항균제 및 항진균제의 포함에 의해 담보될 수 있다.

일정한 구체예에서, 예로서, 당 또는 염화나트륨을 비롯한 등장성 작용제를 조성물 내에 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 이에 더하여, 주사가능 제약학적 형태의 연장된 흡수는 예로서, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 비롯하여, 흡수를 지연시키는 작용제의 포함에 의해 달성될 수 있다.

투약 섭생은 본 발명의 작용제 중에서 하나 또는 그 이상의 작용을 변형하는 다양한 인자를 고려하여 주치의에 의해 결정될 것으로 이해된다. 다양한 인자는 환자의 적혈구 수치, 헤모글로빈 수준, 원하는 표적 적혈구 수치, 환자의 연령, 환자의 성별, 환자의 식이, 감소된 적혈구 수준에 기여할 수 있는 임의의 질환의 심각도, 투여 시간, 그리고 다른 임상적 인자를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 최종 조성물에 다른 공지된 활성제의 첨가 역시 용량에 영향을 줄 수 있다. 진행은 적혈구 수준, 헤모글로빈 수준, 망상적혈구 수준, 그리고 조혈 과정의 다른 지표 중에서 하나 또는 그 이상의 주기적 사정에 의해 모니터링될 수 있다.

일정한 구체예에서, 본 발명은 또한, 본 발명의 작용제 중에서 하나 또는 그 이상의 생체내 생산을 위한 유전자 요법을 제공한다. 이런 요법은 앞서 열거된 바와 같은 장애 중에서 하나 또는 그 이상을 갖는 세포 또는 조직 내로 작용제 서열의 도입에 의해 이의 치료 효과를 달성할 것이다. 작용제 서열의 전달은 예로서, 재조합 발현 벡터, 예를 들면, 키메라 바이러스 또는 콜로이드 분산 시스템을 이용함으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 작용제 서열 중에서 하나 또는 그 이상의 바람직한 치료적 전달은 표적화된 리포솜의 이용이다.

본원에서 교시된 바와 같은 유전자 요법에 활용될 수 있는 다양한 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 우두, 또는 RNA 바이러스 (가령, 레트로바이러스)를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 뮤린 또는 조류 레트로바이러스의 유도체일 수 있다. 단일 외래 유전자가 삽입될 수 있는 레트로바이러스 벡터의 실례는 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMuLV), 하비 뮤린 육종 바이러스 (HaMuSV), 뮤린 유방 종양 바이러스 (MuMTV), 그리고 라우스 육종 바이러스 (RSV). 다수의 추가 레트로바이러스 벡터는 복수 유전자를 통합할 수 있다. 이들 모든 벡터는 형질도입된 세포가 확인되고 산출될 수 있도록 선별가능 마커에 대한 유전자를 전달하거나 또는 통합할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 예로서, 당, 당지질, 또는 단백질을 부착함으로써, 표적-특이적으로 만들어질 수 있다. 바람직한 표적화는 항체를 이용함으로써 달성된다. 당업자는 특정한 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 작용제 중에서 하나 또는 그 이상을 내포하는 레트로바이러스 벡터의 표적 특정한 전달을 허용하기 위해, 레트로바이러스 유전체 내로 삽입되거나 또는 바이러스 외피에 부착될 수 있다는 것을 인식할 것이다.

대안으로, 조직 배양 세포는 전통적인 인산칼슘 형질감염에 의해, 레트로바이러스 구조 유전자 (gag, pol 및 env)를 인코딩하는 플라스미드로 직접적으로 형질감염될 수 있다. 이들 세포는 이후, 관심되는 유전자를 내포하는 벡터 플라스미드로 형질감염된다. 결과의 세포는 레트로바이러스 벡터를 배양 배지 내로 방출한다.

본 발명의 작용제 중에서 하나 또는 그 이상에 대한 다른 표적화된 전달 시스템은 콜로이드 분산 시스템이다. 콜로이드 분산 시스템은 예로서, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드, 그리고 수중유 유제, 미셀, 혼합된 미셀과 리포솜을 비롯한 지질-기초된 시스템을 포함한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 바람직한 콜로이드성 시스템은 리포솜이다. 리포솜은 시험관내 및 생체내에서 전달 수송체로서 유용한 인공 막 소포이다. RNA, DNA 및 무손상 비리온은 수성 내부에 피포되고 생물학적으로 활성 형태에서 세포에 전달될 수 있다 [가령, Fraley, et al. (1981) Trends Biochem. Sci., 6:77을 참조한다]. 리포솜 운반제를 이용한 효율적인 유전자 전달을 위한 방법은 당분야에서 공지된다 [가령, Mannino, et al. (1988) Biotechniques, 6:682, 1988을 참조한다].

리포솜의 조성물은 통상적으로 인지질의 조합인데, 이것은 스테로이드 (가령, 콜레스테롤)를 포함할 수 있다. 리포솜의 물리적 특징은 pH, 이온 강도, 및 이가 양이온의 존재에 의존한다. 예로서, 포스파티딜 화합물 (가령, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고지질, 세레브로시드, 또는 강글리오시드), 난 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디스테아로일포스파티딜콜린을 비롯한 다른 인지질 또는 다른 지질 역시 이용될 수 있다. 리포솜의 표적화는 또한, 예로서, 기관 특이성, 세포 특이적 및 소기관 특이성에 근거하여 가능하고, 그리고 당분야에서 공지된다.

실시예

본 발명이 전반적으로 설명되고, 다음 실시예를 참조하면 더욱 쉽게 이해될 것인데, 이들 실시예는 단지 본 발명의 일정한 구체예 및 구체예들의 예시의 목적으로 포함되고 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예 1: ActRIIa-Fc 융합 단백질

출원인은 중간에 최소 링커로 인간 또는 생쥐 Fc 도메인에 융합된 인간 ActRIIa의 세포외 도메인을 갖는 가용성 ActRIIA 융합 단백질을 작제하였다. 이들 구조체는 각각, ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc로서 지칭된다.

ActRIIA-hFc는 CHO 세포주로부터 정제된 바와 같이 아래에 도시된다 (서열 번호:22):

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc 단백질은 CHO 세포주에서 발현되었다. 3개의 상이한 리더 서열이 고려되었다:

(i) 꿀벌 멜리틴 (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (서열 번호:23)

(ii) 조직 플라스미노겐 활성제 (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (서열 번호:24)

(iii) 선천적: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (서열 번호:25).

선별된 형태는 TPA 리더를 이용하고 다음의 처리되지 않은 아미노산 서열을 갖는다:

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGAAILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호:26)

이러한 폴리펩티드는 다음의 핵산 서열에 의해 인코딩된다:

ACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGAATTC (서열 번호:27)

ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc 둘 모두 재조합 발현에 두드러지게 순응하였다. 도면 3에서 보여지는 바와 같이, 상기 단백질은 단백질의 단일, 충분히 규정된 피크로서 정제되었다. N 말단 염기서열결정은 -ILGRSETQE (서열 번호:34)의 단일 서열을 드러냈다. 정제는 예로서, 다음 중에서 3가지 또는 그 이상을 임의의 순서로 포함하는 일련의 칼럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성될 수 있었다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로오스 크로마토그래피, 페닐세파로오스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 그리고 양이온 교환 크로마토그래피. 정제는 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 완결될 수 있었다. ActRII-Fc 단백질은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정될 때 >98%, 그리고 SDS PAGE에 의해 결정될 때 >95%의 순도까지 정제되었다.

ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc는 리간드, 특히 액티빈 A에 대한 높은 친화성을 보여주었다. GDF-11 또는 액티빈 A는 표준 아민-연계 절차를 이용하여 Biacore™ CM5 칩 위에 고정되었다. ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc 단백질은 상기 시스템 위에 적하되었고, 그리고 결합이 계측되었다. ActRIIA-hFc는 5 x 10^-12의 해리 상수 (K_D)로 액티빈에 결합하고, 그리고 9.96 x 10^-9의 K_D로 GDF11에 결합하였다. 도면 4를 참조한다. ActRIIA-mFc는 유사하게 행동하였다.

ActRIIA-hFc는 약동학적 연구에서 매우 안정되었다. 쥐는 1 mg/kg, 3 mg/kg, 또는 10 mg/kg의 ActRIIA-hFc 단백질이 투약되었고, 그리고 상기 단백질의 혈장 수준이 24, 48, 72, 144 및 168 시간에서 계측되었다. 별개의 연구에서, 쥐는 1 mg/kg, 10 mg/kg, 또는 30 mg/kg에서 투약되었다. 쥐에서, ActRIIA-hFc는 11-14 일 혈청 반감기를 가졌고, 그리고 상기 약물의 순환 수준은 2 주 후 매우 높았다 (각각, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 또는 30 mg/kg의 초기 투여에 대해 11 μg/ml, 110 μg/ml, 또는 304 μg/ml). 시노몰구스 원숭이에서, 혈장 반감기는 14 일보다 훨씬 크고, 그리고 상기 약물의 순환 수준은 각각, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 또는 30 mg/kg의 초기 투여에 대해 25 μg/ml, 304 μg/ml, 또는 1440 μg/ml이었다.

실시예 2: ActRIIA-hFc 단백질의 특징화

ActRIIA-hFc 융합 단백질은 서열 번호:9의 조직 플라스미노겐 리더 서열을 이용하여, pAID4 벡터 (SV40 ori/인핸서, CMV 프로모터)로부터 안정되게 형질감염된 CHO-DUKX B11 세포에서 발현되었다. 실시예 1에서 앞서 설명된 바와 같이 정제된 상기 단백질은 서열 번호:22의 서열을 가졌다. Fc 부분은 서열 번호:22에서 보여지는 바와 같이, 인간 IgG1 Fc 서열이다. 단백질 분석은 ActRIIA-hFc 융합 단백질이 이황화 결합을 갖는 동종이합체로서 형성된다는 것을 드러낸다.

CHO-세포-발현된 물질은 인간 293 세포에서 발현된 ActRIIa-hFc 융합 단백질에 대해 보고된 것보다 액티빈 B 리간드에 대한 더욱 높은 친화성을 갖는다 [del Re et al. (2004) J Biol Chem. 279(51):53126-53135를 참조한다]. 추가적으로, TPA 리더 서열의 이용은 다른 리더 서열보다 큰 생산을 제공하였고, 그리고 선천적 리더로 발현된 ActRIIA-Fc와 달리, 고도로 순수한 N 말단 서열을 제공하였다. 선천적 리더 서열의 이용은 각각 상이한 N 말단 서열을 갖는 ActRIIA-Fc의 2가지 주요 종류를 유발하였다.

실시예 3. ActRIIA-hFc는 비인간 영장류에서 적혈구 수준을 증가시킨다

본 연구는 29 일자에 종결이 예정된 군마다 성별로 3마리씩, 그리고 57 일자에 종결이 예정된 군마다 성별로 2마리씩, 각각 5마리 수컷 및 5마리 암컷 시노몰구스 원숭이의 4개 군을 이용하였다. 각 동물은 1, 8, 15 및 22 일자에 정맥내 (IV) 주사를 통해 운반제 (군 1), 또는 1, 10 또는 30 mg/kg (각각, 군 2, 3 및 4)의 용량에서 ActRIIA-Fc가 투여되었다. 용량 용적은 3 mL/kg에서 유지되었다. 적혈구 수준의 다양한 척도가 첫 번째 투여 2 일 전에 및 첫 번째 투여 후 15, 29 및 57 일자에 (나머지 2마리 동물의 경우) 사정되었다.

ActRIIA-hFc는 모든 용량 수준에서 및 연구 동안 모든 시점에서 수컷 및 암컷에 대한 평균 적혈구 파라미터 [적혈구 수치 (RBC), 헤모글로빈 (HGB) 및 헤마토크리트 (HCT)]에서 통계학적으로 유의한 증가를 유발하고, 절대적 및 상대적 망상적혈구 수치 (ARTC; RTC)에서 상승을 동반하였다. 도면 5-8을 참조한다.

통계학적 유의성은 기준선에서 처리군에 대한 평균에 비하여 각 처리군에 대해 계산되었다.

특히, 적혈구 수치 및 헤모글로빈 수준에서 증가는 에리트로포이에틴에서 보고된 효과와 크기 면에서 거의 동등하다. 이들 효과의 개시는 에리트로포이에틴에서보다는 ActRIIA-Fc에서 더욱 신속하다.

유사한 결과가 쥐 및 생쥐에서 관찰되었다.

실시예 4: ActRIIA-hFc는 인간 환자에서 적혈구 수준 및 뼈 형성의 마커를 증가시킨다

실시예 1에서 설명된 ActRIIA-hFc 융합 단백질은 일차적으로, 건강한 폐경후 여성에서 상기 단백질의 안전성을 평가하기 위해 수행된 무작위화된, 이중 맹검, 위약 대조 연구에서 인간 개체에 투여되었다. 48명 개체는 단일 용량의 ActRIIA-hFc 또는 위약을 제공받도록 6개 코호트 (5 활성:1 위약)에서 무작위화되었다. 용량 수준은 0.01 내지 3.0 mg/kg 정맥내 (IV) 및 0.03 내지 0.1 mg/kg 피하 (SC) 범위에서 변하였다. 모든 개체는 120 일 동안 추적되었다. 약동학적 (PK) 분석에 더하여, ActRIIA-hFc의 생물학적 활성은 또한, 뼈 형성 및 재흡수의 생화학적 마커뿐만 아니라 FSH 수준의 계측에 의해 사정되었다.

잠재적 변화를 찾아내기 위해, 헤모글로빈 및 RBC 숫자가 연구의 코스에 걸쳐 및 기준선 수준과 비교하여 모든 개체에 대해 상세하게 조사되었다. 혈소판 수치는 동일한 시간에 걸쳐 대조로서 비교되었다. 혈소판 수치에 대한 시간의 추이에서 기준선 값으로부터 임상적으로 유의미한 변화가 없었다.

ActRIIA-hFc의 약동학적 (PK) 분석은 용량에서 선형 프로필 및 대략 25-32 일의 평균 반감기를 드러냈다. ActRIIA-hFc에 대한 곡선 아래 면적 (AUC)은 용량에 선형으로 관련되었고, 그리고 SC 투약 후 흡수는 본질적으로 완전하였다. 도면 9 및 10을 참조한다. 이들 데이터는 SC가 투약에 대한 바람직한 접근법이라는 것을 지시하는데, 그 이유는 이것이 IV 투약의 첫 며칠과 연관된 약물의 혈청 농도에서 스파이크를 방지하면서, 상기 약물에 대한 동등한 생체이용률 및 혈청-반감기를 제공하기 때문이다 (도면 10 참조). ActRIIA-hFc는 동화작용 뼈 성장에 대한 마커인 뼈-특이적 알칼리 인산분해효소 (BAP)의 혈청 수준에서 신속하고 지속된 용량 의존성 증가, 그리고 골 흡수에 대한 마커인 C 말단 유형 1 콜라겐 텔로펩티드 및 주석산염-내성 산성 인산분해효소 5b 수준에서 용량 의존성 감소를 유발하였다. 다른 마커, 예를 들면, P1NP는 결정적이지 않은 결과를 보여주었다. BAP 수준은 약물의 가장 높은 용량에서 포화에 근접한 효과를 보여주었는데, 이것은 이러한 동화작용 뼈 생물마커에 대한 반극대 효과가 0.3 mg/kg의 용량에서 달성될 수 있고, 증가 범위가 최대 3 mg/kg까지라는 것을 지시한다. 약물에 대한 약력학적 효과 대 AUC의 관계로서 계산된, EC50은 51,465 (일^*ng/ml) (도면 11 참조). 이들 뼈 생물마커 변화는 시험된 가장 높은 용량 수준에서 대략 120 일 동안 지속되었다. 또한, 액티빈의 저해와 일치하는 혈청 FSH 수준에서 용량 의존성 감소가 있었다.

전반적으로, IV 또는 SC 제공되는 지에 상관없이, 0.01 및 0.03 mg/kg 군에서 연구 정맥절개술에 아마도 관련된 연구의 첫 번째 주에 걸쳐 헤모글로빈에서 매우 작은 비-약물 관련된 감소가 있었다. 0.1 mg/kg SC 및 IV 헤모글로빈 결과는 안정되거나 또는 8-15 일자까지 근소한 증가를 보여주었다. 0.3 mg/kg IV 용량 수준에서, 빠르면 2 일자에 목격되는 HGB 수준에서 명백한 증가, 그리고 위약-치료된 개체에서 목격되지 않았던 15-29 일자에서 종종 피크가 있었다. 1.0 mg/kg IV 용량 및 3.0 mg/kg IV 용량에서, 1 g/dl보다 큰 헤모글로빈의 평균 증가가 RBC 수치 및 헤마토크리트에서 상응하는 증가와 함께, 단일 용량에 대한 응답으로 관찰되었다. 이들 혈액학적 파라미터는 투약 후 약 60 일에 피크에 도달하였고 120 일자까지 실제적으로 감소하였다. 이것은 적혈구 수준을 증가시키는 목적으로 투약이 120 일보다 적은 간격을 두고 (다시 말하면, 기준선으로 복귀에 앞서) 행위되면 더욱 효과적일 수 있고, 90 일 또는 그 이하 또는 60 일 또는 그 이하의 투약 간격이 바람직할 수 있다는 것을 지시한다. 혈액학적 변화의 요약을 위해, 도면 12-15를 참조한다.

전반적으로, ActRIIA-hFc는 적혈구 수치 및 망상적혈구 수치에 대한 용량 의존성 효과를 보여주었다.

실시예 5: ActRIIA-hFc로 빈혈성 환자의 치료

임상 연구는 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg 및 1.0 mg/kg의 3가지 용량 수준에서 ActRIIA-hFc의 복수 투약으로 환자를 치료하도록 설계되었는데, 투약은 30 일마다 발생하였다. 시험 동안 정상적인 건강한 개체는 일부 경우에 헤모글로빈 (Hg) 및 헤마토크리트 (Hct)가 정상 범위를 뛰어넘어 상승된다는 점을 제외하고, 실시예 4에서 보고된 I 단계 임상 시험에서 목격된 증가와 일치하는 헤모글로빈 및 헤마토크리트에서 증가를 전시하였다. 대략 7.5 g/dL의 헤모글로빈 수준을 갖는 빈혈성 환자는 또한, 1 mg/kg 수준에서 2회 용량을 제공받고, 2 개월 후 대략 10.5 g/dL의 헤모글로빈 수준이 유발되었다. 환자의 빈혈은 만성 철분 결핍에 의해 유발되는 것으로 생각되는 소적혈구 빈혈이었다.

ActRIIA-Fc 융합 단백질은 예로서, 화학요법-유도된 빈혈 및 만성 신장병과 연관된 빈혈을 비롯한 다양한 빈혈 모형에서 적혈구 수준을 증가시키는데 효과적인 것으로 더욱 증명되었다 (가령, U.S. 특허 출원 공개 번호 2010/0028331을 참조한다).

실시예 6: 대안적 ActRIIA-Fc 단백질

본원에서 설명된 방법에 따라 이용될 수 있는 다양한 ActRIIA 변이체는 전체적으로 본원에 참조로서 편입되는, WO2006/012627로서 공개된 국제 특허 출원 (가령, pp. 55-58을 참조한다)에서 설명된다. 대안 구조체는 ActRIIA의 세포외 도메인의 C 말단 꼬리 (최종 15개 아미노산)의 결실을 가질 수 있다. 이런 구조체에 대한 서열은 아래에 제공된다 (Fc 부분은 밑줄 표시됨) (서열 번호:28):

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

실시예 7: ActRIIB-Fc 융합 단백질의 산출

출원인은 중간에 최소 링커 (3개의 글리신 아미노산)로 인간 또는 생쥐 Fc 도메인에 융합된 인간 ActRIIB의 세포외 도메인을 갖는 가용성 ActRIIB 융합 단백질을 작제하였다. 이들 구조체는 각각, ActRIIB-hFc 및 ActRIIB-mFc로서 지칭된다.

ActRIIB-hFc는 CHO 세포주로부터 정제된 바와 같이 아래에 도시된다 (서열 번호:29):

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

ActRIIB-hFc 및 ActRIIB-mFc 단백질은 CHO 세포주에서 발현되었다. 3개의 상이한 리더 서열이 고려되었다:

(i) 꿀벌 멜리틴 (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (서열 번호:23)

(iii) 선천적: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (서열 번호:30).

선별된 형태는 TPA 리더를 이용하고 다음의 처리되지 않은 아미노산 서열 (서열 번호: 31)을 갖는다:

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGASGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

이러한 폴리펩티드는 다음의 핵산 서열 (서열 번호:32)에 의해 인코딩된다:

A TGGATGCAAT GAAGAGAGGG CTCTGCTGTG TGCTGCTGCT GTGTGGAGCA GTCTTCGTTT CGCCCGGCGC CTCTGGGCGT GGGGAGGCTG AGACACGGGA GTGCATCTAC TACAACGCCA ACTGGGAGCT GGAGCGCACC AACCAGAGCG GCCTGGAGCG CTGCGAAGGC GAGCAGGACA AGCGGCTGCA CTGCTACGCC TCCTGGCGCA ACAGCTCTGG CACCATCGAG CTCGTGAAGA AGGGCTGCTG GCTAGATGAC TTCAACTGCT ACGATAGGCA GGAGTGTGTG GCCACTGAGG AGAACCCCCA GGTGTACTTC TGCTGCTGTG AAGGCAACTT CTGCAACGAG CGCTTCACTC ATTTGCCAGA GGCTGGGGGC CCGGAAGTCA CGTACGAGCC ACCCCCGACA GCCCCCACCG GTGGTGGAAC TCACACATGC CCACCGTGCC CAGCACCTGA ACTCCTGGGG GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA CATGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG GCTGAATGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCCCAG TCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TATAGCAAGC TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAATGA

CHO-세포-생산된 물질의 N 말단 염기서열결정은 -GRGEAE (서열 번호:33)의 주요 서열을 드러냈다. 특히, 기존 문헌에서 보고된 다른 구조체는 -SGR… 서열로 시작한다.

정제는 예로서, 다음 중에서 3가지 또는 그 이상을 임의의 순서로 포함하는 일련의 칼럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성될 수 있었다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로오스 크로마토그래피, 페닐세파로오스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 그리고 양이온 교환 크로마토그래피. 정제는 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 완결될 수 있었다.

ActRIIB-Fc 융합 단백질은 또한, HEK293 세포 및 COS 세포에서 발현되었다. 비록 모든 세포주 및 합리적인 배양 조건으로부터 물질이 생체내에서 근육-구축 활성을 갖는 단백질을 제공하긴 했지만, 효능에서 가변성은 아마도, 세포주 선별 및/또는 배양 조건에 관련되는 것으로 관찰되었다.

출원인은 ActRIIB의 세포외 도메인에서 일련의 돌연변이을 산출하고, 그리고 이들 돌연변이체 단백질을 세포외 ActRIIB 및 Fc 도메인 사이에 가용성 융합 단백질로서 생산하였다. 배경 ActRIIB-Fc 융합은 서열 번호:29의 서열을 갖는다.

N- 및 C 말단 절두를 비롯한 다양한 돌연변이가 배경 ActRIIB-Fc 단백질 내로 도입되었다. 실시예 1에서 제공된 데이터에 근거하여, 이들 구조체는 TPA 리더로 발현되면, N 말단 세린을 결여할 것으로 예상된다. 돌연변이는 PCR 돌연변이유발에 의해 ActRIIB 세포외 도메인에서 산출되었다. PCR 후, 단편은 Qiagen 칼럼을 통해 정제되고, SfoI 및 AgeI로 소화되고, 그리고 겔 정제되었다. 이들 단편은 결찰 시에 인간 IgG1과의 융합 키메라가 창출되도록 발현 벡터 pAID4 (WO2006/012627 참조) 내로 결찰되었다. 대장균 (E. coli) DH5 알파 내로 형질전환 시에, 집락이 선발되고 DNA가 단리되었다. 뮤린 구조체 (mFc)의 경우, 뮤린 IgG2a가 인간 IgG1와 대체되었다. 모든 돌연변이체의 서열은 실증되었다.

모든 돌연변이체는 일시적인 형질감염에 의해 HEK293T 세포에서 생산되었다. 요약하면, 500ml 스피너에서, HEK293T 세포는 250ml 용적에서 Freestyle (Invitrogen) 배지에서 6x10⁵ 세포/ml로 설정되고 하룻밤 동안 성장되었다. 그 다음날, 이들 세포는 0.5 ug/ml 최종 DNA 농도에서 DNA:PEI (1:1) 복합체로 처리되었다. 4 시간 후, 250 ml 배지가 첨가되고, 그리고 세포가 7 일 동안 성장되었다. 조건부 배지는 이들 세포를 스핀 다운함으로써 수확되고 농축되었다.

돌연변이체는 예로서, 단백질 A 칼럼을 비롯한 다양한 기술을 이용하여 정제되고, 그리고 낮은 pH (3.0) 글리신 완충액으로 용리되었다. 중화 후, 이들은 PBS에 대해 투석되었다.

돌연변이체는 또한, 유사한 방법에 의해 CHO 세포에서 생산되었다. 돌연변이체는 본원에서 참조로서 편입된 WO 2008/097541 및 WO 2006/012627에서 설명된 결합 검정 및/또는 생물학적 검정에서 시험되었다. 일부 경우에, 검정은 정제된 단백질보다는 조건부 배지로 수행되었다. ActRIIB의 추가 변이는 U.S. 특허 번호 7,842,663에서 설명된다.

실시예 8: ActRIIB-Fc는 비인간 영장류에서 적혈구생성을 자극한다

시노몰구스 원숭이는 7개 군 (6/성별/군)으로 할당되고 9-개월 기간에 걸쳐 2 주마다 또는 4 주마다 0.6, 3, 또는 15 mg/kg의 용량에서 피하 주사로서 ActRIIB(20-134)-hFc가 투여되었다. 대조군 (6/성별/군)은 ActRIIB(20-134)-hFc-처리된 동물로서 동일한 용량 용적 (0.5 ml/kg/용량)에서 운반제를 제공받았다. 동물은 전반적인 임상 병리학 파라미터 (가령, 혈액학, 임상적 화학, 응고, 그리고 소변 분석 )에서 변화에 대해 모니터링되었다. 혈액학, 응고, 그리고 임상적 화학 파라미터 (철분 파라미터, 지질분해효소 및 아밀라아제 포함)가 투약의 개시에 앞서 2회, 그리고 59, 143, 199, 227 일자 및 267 일자 (4 주마다 투약된 군의 경우) 또는 281 일자 (2 주마다 투약된 군의 경우)에 평가되었다. 267/281 일자에 평가는 최종 용량이 투여된 후 2 주 시점에 일어났다.

ActRIIB(20-134)-hFc의 투여는 수컷 및 암컷 원숭이에서 혈액학 파라미터에 비-불리한, 용량-관련된 변화를 유발하였다. 이들 변화는 증가된 적혈구 수치, 망상적혈구 수치 및 적혈구 크기 분포폭, 그리고 감소된 평균 적혈구 용적, 평균 적혈구 혈색소량 및 혈소판 수치를 포함하였다. 수컷에서, RBC 수치는 모든 용량 수준에서 증가되었고, 그리고 증가의 크기는 ActRIIB(20-134)-hFc가 2 주마다 또는 4 주마다 투여되는 지와 상관없이 전반적으로 필적하였다. 평균 RBC 수치는 59 일자 및 267/281 일자 사이의 모든 시점에서 증가되었다 (RBC 수치가 281 일자에 군 2 수컷 [2 주마다 0.6 mg/kg]에서 증가되지 않은 것은 제외). 암컷에서, RBC 수치는 2 주마다 ≥ 3 mg/kg에서 증가되었고, 그리고 변화는 143 일자 및 281 일자 사이에 일어났다; 4 주마다 15 mg/kg에서 평균 RBC 수치는 59 일자 및 267 일자 사이에 증가되었다.

이들 효과는 적혈구생성을 자극하는 것에 대한 ActRIIB(20-134)-hFc의 긍정적인 효과와 일치한다.

실시예 9: GDF 트랩의 산출

출원인은 아래와 같이 GDF 트랩을 작제하였다. GDF11 및/또는 미오스타틴에 비하여 크게 감소된 액티빈 A 결합 (서열 번호:1에서 위치 79에서 류신에서 아스파르트산염으로 치환의 결과로서)을 갖는 ActRIIB의 변형된 세포외 도메인을 갖는 폴리펩티드 (L79D 치환을 갖는 서열 번호:1의 아미노산 20-134)는 중간에 최소 링커 (3개의 글리신 아미노산)로 인간 또는 생쥐 Fc 도메인에 융합되었다. 이들 구조체는 각각, ActRIIB(L79D 20-134)-hFc 및 ActRIIB(L79D 20-134)-mFc로서 지칭된다. 위치 79에서 아스파르트산염이 아닌 글루타민산염을 갖는 대안적 형태가 유사하게 수행하였다 (L79E). 서열 번호:36에 대하여 위치 226에서 발린이 아닌 알라닌을 갖는 대안적 형태 역시 아래에서 산출되고 시험된 모든 양상에서 동등하게 수행하였다. 위치 79 (서열 번호: 1에 비하여, 또는 서열 번호:36에 비하여 위치 60)에서 아스파르트산염은 아래에서 이중 밑줄로 표시된다. 서열 번호:36에 비하여 위치 226에서 발린 역시 아래에서 이중 밑줄에 의해 표시된다.

GDF 트랩 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc는 CHO 세포주로부터 정제된 바와 같이 아래에 도시된다 (서열 번호:36).

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

GDF 트랩의 ActRIIB-유래된 부분은 아래에 진술된 아미노산 서열 (서열 번호: 37)을 갖고, 그리고 상기 부분은 단위체로서, 또는 단위체, 이합체, 또는 그 이상-차수 복합체로서 비-Fc 융합 단백질로서 이용될 수 있었다.

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (서열 번호: 37)

GDF 트랩 단백질은 CHO 세포주에서 발현되었다. 3개의 상이한 리더 서열이 고려되었다:

(i) 꿀벌 멜리틴 (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (서열 번호:23)

(iii) 선천적: MTAPWVALALLWGSLCAGS (서열 번호:30).

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGASGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호:38)

이러한 폴리펩티드는 다음의 핵산 서열 (서열 번호:39)에 의해 인코딩된다:

A TGGATGCAAT GAAGAGAGGG CTCTGCTGTG TGCTGCTGCT GTGTGGAGCA GTCTTCGTTT CGCCCGGCGC CTCTGGGCGT GGGGAGGCTG AGACACGGGA GTGCATCTAC TACAACGCCA ACTGGGAGCT GGAGCGCACC AACCAGAGCG GCCTGGAGCG CTGCGAAGGC GAGCAGGACA AGCGGCTGCA CTGCTACGCC TCCTGGCGCA ACAGCTCTGG CACCATCGAG CTCGTGAAGA AGGGCTGCTG GGACGATGAC TTCAACTGCT ACGATAGGCA GGAGTGTGTG GCCACTGAGG AGAACCCCCA GGTGTACTTC TGCTGCTGTG AAGGCAACTT CTGCAACGAG CGCTTCACTC ATTTGCCAGA GGCTGGGGGC CCGGAAGTCA CGTACGAGCC ACCCCCGACA GCCCCCACCG GTGGTGGAAC TCACACATGC CCACCGTGCC CAGCACCTGA ACTCCTGGGG GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA CATGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG GCTGAATGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCCCAG TCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TATAGCAAGC TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAATGA

정제는 예로서, 다음 중에서 3가지 또는 그 이상을 임의의 순서로 포함하는 일련의 칼럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성될 수 있었다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로오스 크로마토그래피, 페닐세파로오스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 그리고 양이온 교환 크로마토그래피. 정제는 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 완결될 수 있었다. 정제 계획의 한 가지 실례에서, 세포 배양 배지는 단백질 A 칼럼 위에 통과되고, 150 mM Tris/NaCl (pH 8.0)에서 세척되고, 이후 50 mM Tris/NaCl (pH 8.0)에서 세척되고 0.1 M 글리신, pH 3.0으로 용리되었다. 낮은 pH 용출물은 바이러스 청소 단계로서 실온에서 30 분 동안 유지된다. 용출물은 이후, 중화되고, Q-세파로오스 이온-교환 칼럼 위에 통과되고, 50 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl에서 세척되고, 그리고 150 mM 및 300 mM 사이의 NaCl 농축물과 함께 50 mM Tris pH 8.0에서 용리되었다. 용출물은 이후, 50 mM Tris pH 8.0, 1.1 M 황산암모늄으로 변하고, 페닐 세파로오스 칼럼 위에 통과되고, 세척되고, 그리고 150 및 300 mM 사이의 황산암모늄과 함께 50 mM Tris pH 8.0에서 용리되었다. 용출물은 투석되고 이용을 위해 여과된다.

추가 GDF 트랩 (미오스타틴 또는 GDF11 결합에 비하여 액티빈 A 결합의 비율을 감소시키기 위해 변형된 ActRIIB-Fc 융합 단백질)은 본원에서 참조로서 편입된 WO 2008/097541 및 WO 2006/012627에서 설명된다.

실시예 10: GDF-11- 및 액티빈-매개된 신호전달에 대한 생물학적 검정

A-204 리포터 유전자 검정이 GDF-11 및 액티빈 A에 의한 신호전달에 대한 ActRIIB-Fc 단백질 및 GDF 트랩의 효과를 평가하는데 이용되었다. 세포주: 인간 횡문근육종 (근육으로부터 유래됨). 리포터 벡터: pGL3(CAGA)12 (Dennler et al, 1998, EMBO 17: 3091-3100에서 설명됨). CAGA12 모티프는 TGF-베타 반응성 유전자 (가령, PAI-1 유전자) 내에 존재하고, 따라서 이러한 벡터는 SMAD2 및 3을 통해 신호전달하는 인자에 대해 일반적으로 이용된다.

1 일자: A-204 세포를 48-웰 평판 내로 분할한다.

2 일자: 10 ug pGL3(CAGA)12 또는 pGL3(CAGA)12(10 ug) + pRLCMV (1 μg) 및 Fugene으로 형질감염된 A-204 세포.

3 일자: 인자를 추가한다 (배지 + 0.1 % BSA 내로 희석됨). 저해제는 세포에 첨가하기 전에 1 시간 동안 인자와 함께 전배양되어야 한다. 6 시간 후, 세포는 PBS로 헹굼되고 용해되었다.

이것은 루시페라아제 검정에 의해 이어진다. 임의의 저해제의 부재에서, 액티빈 A는 리포터 유전자 발현의 10-배 자극 및 ED50 ~ 2 ng/ml을 보여주었다. GDF-11: 16 배 자극, ED50: ~ 1.5 ng/ml.

ActRIIB(20-134)는 이러한 검정에서 액티빈 A, GDF-8 및 GDF-11 활성의 강력한 저해제이다. 아래에 설명된 바와 같이, ActRIIB 변이체 역시 이러한 검정에서 시험되었다.

실시예 11: ActRIIB - Fc 변이체 , 세포- 기초된 활성

ActRIIB-Fc 단백질 및 GDF 트랩의 활성은 앞서 설명된 바와 같은 세포-기초된 검정에서 시험되었다. 결과는 아래 표에서 요약된다. 일부 변이체는 상이한 C 말단 절두 구조체에서 시험되었다. 앞서 논의된 바와 같이, 5 또는 15개 아미노산의 절두는 활성에서 감소를 유발하였다. GDF 트랩 (L79D 및 L79E 변이체)은 GDF-11의 거의 야생형 저해를 유지하면서, 액티빈 A 저해의 실제적인 상실을 보여주었다.

여러 변이체가 쥐에서 혈청 반감기에 대해 사정되었다. ActRIIB(20-134)-Fc는 대략 70 시간의 혈청 반감기를 갖는다. ActRIIB(A24N 20-134)-Fc는 대략 100-150 시간의 혈청 반감기를 갖는다. A24N 변이체는 세포-기초된 검정 (상기) 및 생체내 검정 (아래에)에서 야생형 분자에 동등한 활성을 갖는다. 더욱 긴 반감기와 연계하여, 이것은 시간의 추이에서 A24N 변이체가 야생형 분자보다 단백질의 단위당 더욱 큰 효과를 제공할 것이라는 것을 의미한다. A24N 변이체, 그리고 상기 시험된 임의의 다른 변이체는 GDF 트랩 분자, 예를 들면, L79D 또는 L79E 변이체와 합동될 수 있다.

실시예 12: GDF-11 및 액티빈 A 결합.

리간드에 일정한 ActRIIB-Fc 단백질 및 GDF 트랩의 결합은 Biacore^TM 검정에서 시험되었다.

ActRIIB-Fc 변이체 또는 야생형 단백질은 항-hFc 항체를 이용하여 시스템 위에 포획되었다. 리간드가 주입되고 포획된 수용체 단백질 위로 흘러졌다. 결과는 아래 표에서 요약된다.

무세포 검정에서 획득된 이들 데이터는 세포-기초된 검정 데이터를 확증하고, A24N 변이체가 ActRIIB(20-134)-hFc 분자의 것과 유사한 리간드-결합 활성을 유지하고, 그리고 L79D 또는 L79E 분자가 미오스타틴 및 GDF11 결합을 유지하지만 액티빈 A에 현저하게 감소된 (비-정량가능) 결합을 보여준다는 것을 증명한다.

다른 변이체가 WO2006/012627 (전체적으로 본원에 참조로서 편입됨)에서 보고된 바와 같이 산출되고 시험되었다. 가령, 장치에 연계된 리간드 및 연계된 리간드 위에 유동 수용체를 이용하는 pp. 59-60을 참조한다. 특히, K74Y, K74F, K74I (및 아마도, K74에서 다른 소수성 치환, 예를 들면, K74L), 그리고 D80I는 야생형 K74 분자에 비하여, 액티빈 A (ActA) 결합 대 GDF11 결합의 비율에서 감소를 유발한다. 이들 변이체에 대하여 데이터의 표가 아래에 재현된다:

실시예 13: GDF 트랩은 생체내에서 적혈구 수준을 증가시킨다

12-주령 수컷 C57BL/6NTac 생쥐는 2개 처리군 (N=10) 중에서 하나에 배정되었다. 생쥐는 4 주 동안 주 2회 10 mg/kg에서 피하 주사 (SC)에 의해 운반제 또는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 ("GDF 트랩") [ActRIIB(L79D 20-134)-hFc]가 투약되었다. 연구 종결 시점에, 전혈이 심장 천자에 의해 EDTA 내포 튜브 내로 수집되고, 그리고 HM2 혈액학 분석기 (Abaxis, Inc)를 이용하여 세포 분포에 대해 분석되었다.

GDF 트랩으로 처리는 운반제 대조와 비교하여 백혈구 (WBC)의 숫자에 대한 통계학적으로 유의한 효과를 갖지 않았다. 적혈구 (RBC) 숫자는 대조에 비하여 처리군에서 증가되었다 (아래 표 참조). 헤모글로빈 함량 (HGB) 및 헤마토크리트 (HCT) 둘 모두 또한, 추가 적혈구로 인해 증가되었다. 적혈구 (RDWc)의 평균 너비는 처리된 동물에서 더욱 높았는데, 이것은 미성숙 적혈구의 풀에서 증가를 지시한다. 이런 이유로, GDF 트랩으로 처리는 백혈구 개체군에 대한 어떠한 식별가능한 효과 없이, 적혈구에서 증가를 야기한다.

실시예 14: GDF 트랩은 생체내에서 적혈구 수준을 증가시키는데 있어서 ActRIIB-Fc보다 뛰어나다.

19-주령 수컷 C57BL/6NTac 생쥐는 3개 군 중에서 하나에 무작위로 배정되었다. 생쥐는 3 주 동안 주 2회 피하 주사에 의해 운반제 (10 mM Tris-완충된 식염수, TBS), 야생형 ActRIIB(20-134)-mFc, 또는 GDF 트랩 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc가 투약되었다. 혈액은 기준선에서 및 3 주의 투약 후 협혈에 의해 수집되고, 그리고 혈액학 분석기 (HM2, Abaxis, Inc.)를 이용하여 세포 분포에 대해 분석되었다.

ActRIIB-Fc 또는 GDF 트랩으로 처리는 운반제 대조와 비교하여 백혈구 (WBC) 숫자에 대한 유의미한 효과를 갖지 않았다. 적혈구 수치 (RBC), 헤마토크리트 (HCT), 그리고 헤모글로빈 수준 모두 대조 또는 야생형 구조체와 비교하여 GDF 트랩으로 처리된 생쥐에서 상승하였다 (아래 표 참조). 이런 이유로, 직접적인 비교에서, GDF 트랩은 야생형 ActRIIB-Fc 단백질보다 훨씬 큰 정도로 적혈구의 증가를 증진한다. 실제로, 이러한 실험에서, 야생형 ActRIIB-Fc 단백질은 적혈구에서 통계학적으로 유의한 증가를 유발하지 않았는데, 이것은 이러한 효과를 드러내기 위해 더욱 긴 또는 더욱 높은 투약이 필요할 것이라는 것을 암시한다.

실시예 15: 절두된 ActRIIB 세포외 도메인을 갖는 GDF 트랩의 산출

실시예 9에서 설명된 바와 같이, ActRIIB(L79D 20-134)-hFc로서 지칭된 GDF 트랩은 류신에서 아스파르트산염으로 치환 (서열 번호:1에서 잔기 79에서)을 내포하는 ActRIIB 세포외 도메인 (서열 번호:1에서 잔기 20-134)에 TPA 리더의 N 말단 융합 및 최소 링커 (3개 글리신 잔기)로 인간 Fc 도메인의 C 말단 융합에 의해 산출되었다 (도면 16). 이러한 융합 단백질에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 도면 17a 및 17b에서 도시된다.

ActRIIB(L79D 25-131)-hFc로서 지칭된, 절두된 ActRIIB 세포외 도메인을 갖는 GDF 트랩은 류신에서 아스파르트산염으로 치환 (서열 번호:1에서 잔기 79)을 내포하는 절두된 세포외 도메인 (서열 번호:1에서 잔기 25-131)에 TPA 리더의 N 말단 융합 및 최소 링커 (3개 글리신 잔기)로 인간 Fc 도메인의 C 말단 융합 (도면 18)에 의해 산출되었다. 이러한 융합 단백질에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 도면 19a 및 19b에서 도시된다.

실시예 16: 이중-절두된 ActRIIB 세포외 도메인을 갖는 GDF 트랩에 의한 선택적 리간드 결합

여러 리간드에 대한 GDF 트랩 및 다른 ActRIIB-hFc 단백질의 친화성이 Biacore™ 기기로 시험관내에서 평가되었다. 결과는 아래 표에서 요약된다. Kd 값은 k_on 및 k_off의 정확한 결정을 방해하는 복합체의 매우 신속한 연관 및 해리로 인해 항정 상태 친화성 적합에 의해 획득되었다.

절두된 세포외 도메인을 갖는 GDF 트랩, ActRIIB(L79D 25-131)-hFc는 L79D 치환을 결여하는 ActRIIB-hFc 대응물과 비교하여 액티빈 A 결합의 확연한 상실, 액티빈 B 결합의 부분적인 상실, 그리고 GDF11 결합의 거의 완전한 유지로, 더욱 긴 변이체, ActRIIB(L79D 20-134)-hFc에 의해 전시된 리간드 선택성과 동등하거나 또는 이를 능가하였다. 주목할 것은 절두 단독 (L79D 치환 없음)이 여기에서 전시된 리간드 사이에서 선택성을 변경하지 않았다는 점이다 [ActRIIB(L79 25-131)-hFc를 ActRIIB(L79 20-134)-hFc와 비교한다].

실시예 17: 대안적 뉴클레오티드 서열을 갖는 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc의 산출

ActRIIB(L79D 25-131)-hFc를 산출하기 위해, 선천적 위치 79 (서열 번호:1)에서 아스파르트산염 치환 및 N 말단과 C 말단 절두 (서열 번호: 1에서 잔기 25-131)를 갖는 인간 ActRIIB 세포외 도메인은 N 말단에서 선천적 ActRIIB 리더 대신에 TPA 리더 서열 및 C 말단에서 최소 링커 (3개 글리신 잔기)를 통해 인간 Fc 도메인과 융합되었다 (도면 18). 이러한 융합 단백질을 인코딩하는 한 뉴클레오티드 서열은 도면 19a 및 19b (서열 번호: 42)에서 도시되고, 그리고 정확하게 동일한 융합 단백질을 인코딩하는 대안 뉴클레오티드 서열은 도면 22a 및 22b (서열 번호: 46)에서 도시된다. 이러한 단백질은 실시예 9에서 설명된 방법을 이용하여 발현되고 정제되었다.

실시예 18: 절두된 ActRIIB 세포외 도메인을 갖는 GDF 트랩은 생쥐에서 적혈구 선조체의 증식을 증가시킨다

ActRIIB(L79D 25-131)-hFc는 적혈구 선조체의 증식에 대한 이의 효과를 결정하기 위해 평가되었다. 수컷 C57BL/6 생쥐 (8 주령)는 1 및 4 일자에 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (10 mg/kg, s.c.; n = 6) 또는 운반제 (TBS; n = 6)로 처리되고, 이후 비장, 경골, 대퇴골 및 혈액의 수집을 위해 8 일자에 안락사되었다. 비장 및 골수의 세포는 단리되고, 5% 소 태아 혈청을 내포하는 Iscove의 변형된 Dulbecco의 배지에서 희석되고, 특수한 메틸셀룰로오스-기초된 배지에서 현탁되고, 그리고 각각, 집락 형성 단위-적혈구 (CFU-E) 및 대집락 형성 단위-적혈구 (BFU-E) 시기에서 클론원성 선조체의 수준을 사정하기 위해 2 또는 12 일 동안 배양되었다. BFU-E 결정을 위한 메틸셀룰로오스-기초된 배지 (MethoCult M3434, Stem Cell Technologies)는 재조합 뮤린 줄기 세포 인자, 인터류킨-3 및 인터류킨-6을 포함하였는데, 이들은 CFU-E 결정을 위한 메틸셀룰로오스 배지 (MethoCult M3334, Stem Cell Technologies) 내에 존재하지 않았고, 반면 양쪽 배지는 다른 성분 중에서도 특히, 에리트로포이에틴을 내포하였다. BFU-E 및 CFU-E 둘 모두의 경우, 집락의 숫자는 각 조직 표본으로부터 유래된 2중 배양 평판에서 결정되었고, 그리고 결과의 통계학적 분석은 처리군마다 생쥐의 숫자에 근거되었다.

ActRIIB(L79D 25-131)-hFc로 처리된 생쥐로부터 비장-유래된 배양액은 대조 생쥐로부터 상응하는 배양액에서의 CFU-E 집락의 2배 숫자를 가졌고 (P < 0.05), 반면 BFU-E 집락의 숫자는 처리와 생체내에서 유의미하게 다르지 않았다. 골수 배양액으로부터 CFU-E 또는 BFU-E 집락의 숫자 역시 처리와 유의미하게 다르지 않았다. 예상한 대로, 비장-유래된 배양액에서 CFU-E 집락의 증가된 숫자는 대조와 비교하여 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc로 처리된 생쥐에서 안락사 시에 적혈구 수준 (11.6% 증가), 헤모글로빈 농도 (12% 증가), 그리고 헤마토크리트 수준 (11.6% 증가)에서 고도로 유의미한 (P < 0.001) 변화를 동반하였다. 이들 결과는 절두된 ActRIIB 세포외 도메인을 갖는 GDF 트랩의 생체내 투여가 적혈구 수준을 증가시키는 이의 전반적인 효과의 일부로서 적혈구 선조체의 증식을 자극할 수 있다는 것을 지시한다.

GDF 트랩 융합 단백질은 예로서, 화학요법-유도된 빈혈, 신절제술-유도된 빈혈 및 혈액 상실 빈혈을 비롯한 다양한 빈혈 모형에서 적혈구 수준을 증가시키는데 효과적인 것으로 더욱 증명되었다 (가령, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2010/019261을 참조한다).

실시예 19: 절두된 ActRIIB 세포외 도메인을 갖는 GDF 트랩은 비인간 영장류에서 적혈구의 수준을 증가시킨다

2가지 GDF 트랩, ActRIIB(L79D 20-134)-hFc 및 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc는 시노몰구스 원숭이에서 적혈구 생산을 자극하는 그들의 능력에 대해 평가되었다. 원숭이는 1 및 8 일자에 GDF 트랩 (10 mg/kg; n = 4 수컷/4 암컷), 또는 운반제 (n = 2 수컷/2 암컷)으로 피하 치료되었다. 혈액 표본은 1 (선처리 기준선), 3, 8, 15, 29, 및 44 일자에 수집되고, 그리고 적혈구 수준 (도면 24), 헤마토크리트 (도면 25), 헤모글로빈 수준 (도면 26) 및 망상적혈구 수준 (도면 27)에 대해 분석되었다. 운반제-치료된 원숭이는 모든 치료후 시점에서 반복된 혈액 표본추출의 예상된 효과인 감소된 수준의 적혈구, 헤마토크리트 및 헤모글로빈을 전시하였다. 대조적으로, ActRIIB(L79D 20-134)-hFc 또는 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc로 치료는 이들 파라미터를 첫 번째 치료후 시점 (3 일자)까지 증가시키고, 그리고 이들을 연구의 지속 기간 동안 실제적으로 상승된 수준에서 유지시켰다 (도면 24-26). 중요하게는, ActRIIB(L79D 20-134)-hFc 또는 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc로 치료된 원숭이에서 망상적혈구 수준은 운반제와 비교하여 8, 15, 및 29 일자에 실제적으로 증가되었다 (도면 27). 이러한 결과는 GDF 트랩 치료가 적혈구 전구체의 생산을 증가시키고, 상승된 적혈구 수준을 유발하였다는 것을 증명한다.

종합하면, 이들 데이터는 절두된 GDF 트랩뿐만 아니라 전장 변이체가 생체내에서 적혈구 형성을 증가시키기 위한 GDF11의 선택적 길항제 및 잠재적으로 관련된 리간드로서 이용될 수 있다는 것을 증명한다.

실시예 20: ActRIIB5로부터 유래된 GDF 트랩

다른 문헌에서는 ActRIIB 막경유 도메인을 포함하는 엑손 4가 상이한 C 말단 서열에 의해 대체된 ActRIIB의 대체, 가용성 형태 (ActRIIB5로서 지정됨)를 보고하였다 (가령, WO 2007/053775를 참조한다).

리더가 없는 선천적 인간 ActRIIB5의 서열은 다음과 같다:

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVK

KGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEGPWAST

TIPSGGPEATAAAGDQGSGALWLCLEGPAHE (서열 번호:49)

류신에서 아스파르트산염으로 치환, 또는 다른 산성 치환이 변이체 ActRIIB5(L79D)를 작제하기 위해 설명된 바와 같이 선천적 위치 79 (밑줄 표시된)에서 수행될 수 있고, 상기 변이체는 다음의 서열을 갖는다:

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVK

KGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEGPWAST

TIPSGGPEATAAAGDQGSGALWLCLEGPAHE (서열 번호:50)

이러한 변이체는 다음의 서열을 갖는 인간 ActRIIB5(L79D)-hFc 융합 단백질을 산출하기 위해 TGGG 링커 (단일 밑줄)로 인간 Fc (이중 밑줄)에 연결될 수 있다:

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVK

KGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEGPWAST

TIPSGGPEATAAAGDQGSGALWLCLEGPAHETGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFL

FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN

STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP

PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY

SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호:51).

이러한 구조체는 CHO 세포에서 발현될 수 있다.

실시예 21: EPO 및 절두된 ActRIIB 세포외 도메인을 갖는 GDF 트랩으로 합동된 처리의 생쥐에서 효과

EPO는 적혈구 전구체의 증식을 증가시킴으로써 적혈구의 형성을 유도하고, 반면 GDF 트랩은 EPO의 효과를 보강하거나 또는 증강하는 방식으로 적혈구의 형성에 잠재적으로 영향을 줄 수 있었다. 이런 이유로, 출원인은 적혈구형성 파라미터에 대한 EPO 및 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc로 합동된 처리의 효과를 조사하였다. 수컷 C57BL/6 생쥐 (9 주령)는 재조합 인간 EPO 단독 (에포에틴 알파, 1800 단위/kg), ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 단독 (10 mg/kg), EPO 및 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 둘 모두, 또는 운반제 (Tris-완충된 식염수)의 단일 i.p. 주사가 제공되었다. 생쥐는 혈액, 비장 및 대퇴골의 수집을 위해 투약 후 72 시간에 안락사되었다.

비장 및 대퇴골은 유세포 계측 분석을 위한 적혈구 전구체 세포를 획득하기 위해 처리되었다. 제거 후, 비장은 5% 소 태아 혈청을 내포하는 Iscove의 변형된 Dulbecco의 배지에서 다져지고, 그리고 무균 1-mL 주입기로부터 플런저로 70-μm 셀 스트레이너를 추진함으로서 기계적으로 해리되었다. 대퇴골은 임의의 잔여 근육 또는 결합 조직이 청소되었고, 그리고 단부는 나머지 모간을 3-mL 주입기에 연결된 21-게이지 바늘을 통해 5% 소 태아 혈청을 내포하는 Iscove의 변형된 Dulbecco의 배지로 수세함으로써 골수의 수집을 허용하기 위해 손질되었다. 세포 현탁액은 원심분리되고 (10 분 동안 2000 rpm), 그리고 세포 펠렛은 5% 소 태아 혈청을 내포하는 PBS에서 재현탁되었다. 각 조직으로부터 세포 (10⁶)는 비특이적 결합을 차단하기 위해 항생쥐 IgG와 함께 배양되고, 이후 생쥐 세포 표면 마커 CD71 (트랜스페린 수용체) 및 Ter119 (세포 표면 글리코포린 A와 연관된 항원)에 대한 형광으로 표지화된 항체와 함께 배양되고, 세척되고, 그리고 유세포분석법에 의해 분석되었다. 표본 내에 죽은 세포는 프로피디움 요오드화물로 대비염색에 의해 분석으로부터 배제되었다. 비장 또는 골수에서 적혈구 분화는 CD71 표지화 (이것은 분화의 코스에 걸쳐 감소한다) 및 Ter119 표지화 (이것은 전적모구 시기에서 시작하는 말단 적혈구 분화 동안 증가된다)의 정도에 의해 사정되었다 (Socolovsky et al., 2001, Blood 98:3261-3273; Ying et al., 2006, Blood 108:123-133). 따라서, 유세포분석법이 설명된 바와 같이, 전적모구 (CD71^highTer119^low), 호염기성 적혈모구 (CD71^highTer119^high), 다염성 + 정염성 적모구 (CD71^medTer119^high), 그리고 후기 정염성 적모구 + 망상적혈구 (CD71^lowTer119^high)의 숫자를 결정하는데 이용되었다.

EPO 및 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc로 합동된 처리는 적혈구에서 놀랍게도 활발한 증가를 야기하였다. 이러한 실험의 72-시간 프레임에서, EPO와 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 단독 둘 모두 운반제와 비교하여 헤마토크리트를 유의미하게 증가시키지 않았고, 반면 2가지 작용제로 합동된 처리는 예상치 않게 상승적인, 다시 말하면, 그들의 별개의 효과의 합보다 큰 헤마토크리트에서 거의 25% 증가를 야기하였다 (도면 28). 이러한 유형의 상승작용은 일반적으로, 개별 작용제가 상이한 세포 기전을 통해 작용한다는 증거인 것으로 고려된다. 유사한 결과가 헤모글로빈 농도 (도면 29) 및 적혈구 농도 (도면 30)에 대해서도 관찰되었는데, 이들 각각 또한, 합동된 처리에 의해 상승적으로 증가하였다.

적혈구 전구체 수준의 분석은 더욱 복잡한 패턴을 드러냈다. 생쥐에서, 비장은 유도성 ("스트레스") 적혈구생성을 책임지는 일차 장기인 것으로 고려된다. 72 시간에 비장 조직의 유세포 계측 분석은 EPO가 운반제와 비교하여 적혈구형성 전구체 프로필을 현저하게 변경하고, 1/3 이상 감소하는 후기 전구체 (후기 정염성 적모구 + 망상적혈구)를 희생하면서 호염기성 적혈모구의 숫자를 170% 이상 증가시킨다는 것을 드러냈다 (도면 31). 중요하게는, 합동된 처리는 후기 단계 전구체의 축소되지 않은 성숙을 뒷받침하면서, EPO 단독보다 정도가 덜하긴 하지만 운반제와 비교하여 호염기성 적혈모구를 유의미하게 증가시켰다 (도면 31). 따라서, EPO 및 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc로 합동된 처리는 전구체 증식 및 성숙의 균형화된 증강을 통해 적혈구생성을 증가시켰다. 비장과 대조적으로, 합동된 처리 후 골수에서 전구체 세포 프로필은 EPO 단독 후에 것과 눈에 띄게 다르지 않았다. 출원인은 비장 전구체 프로필로부터, 실험이 72 시간을 초과하여 연장되면, 합동된 처리가 증가된 망상적혈구 수준을 야기하고 성숙 적혈구 수준의 지속된 상승을 동반할 것으로 예측한다.

종합하면, 이들 조사 결과는 절두된 ActRIIB 세포외 도메인을 갖는 GDF 트랩이 생체내에서 적혈구 형성을 상승적으로 증가시키기 위해 EPO와 합동으로 투여될 수 있다는 것을 증명한다. 상보성이지만 규정되지 않은 기전을 통해 작용함으로써, GDF 트랩은 EPO 수용체 활성체 단독의 강한 증식 효과를 누그러뜨리면서 더욱 낮은 용량의 EPO 수용체 활성체로 획득되는 적혈구의 목표 수준을 여전히 허용하고, 따라서 더욱 높은 수준의 EPO 수용체 활성화와 연관된 잠재적인 부정적인 효과 또는 다른 문제를 방지할 수 있다.

실시예 22: MDS의 생쥐 모형에서 무효한 적혈구생성 및 빈혈에 대한 GDF 트랩의 효과

출원인은 MDS의 NUP98-HOXD13 생쥐 모형에서 GDF 트랩 ActRIIB(L79D 25-131)-mFc (RAP-536)의 효과를 조사하였는데, 상기 모형은 불현 전구체 성숙 및 무효한 조혈에 의해 특징화된다. 이러한 모형에서, 질환 심각도는 늙어감에 따라 증가하고, 대다수의 생쥐에서 궁극적으로 급성 골수성 백혈병으로 진행하고, 그리고 이들은 대략 14 개월의 평균 수명을 갖는다. 대략 4 개월령에서부터, 이들 생쥐는 빈혈, 백혈구감소증, 무효한 적혈구생성, 그리고 정상세포성 내지 과세포성인 골수를 전시한다 [Lin et al. (2005) Blood 106:287-295]. 장기 투여의 효과를 모니터링하기 위해, MDS 생쥐는 4 개월령에서부터 주 2회 RAP-536 (10 mg/kg, s.c.) 또는 운반제로 처리되고 7 개월 동안 지속되었고, 반면 혈액 표본 (50 μL)은 전체 혈구 계산 분석을 위해 기준선에서 및 그 후에 월 1회 수집되었다. 예상한 대로, 6-개월령 MDS 생쥐는 야생형 생쥐와 비교하여 심각한 빈혈이 발생하였고 (도면 32a), 그리고 골수 분석은 연령-정합된 FVB 야생형 생쥐와 비교하여 MDS 생쥐에서 증가된 숫자의 적혈구 전구체 (도면 32a) 및 더욱 낮은 골수성/적혈구 (M/E) 비율을 드러냈는데 [Suragani et al. (2014) Nat Med 20:408-414], 이것은 무효한 적혈구생성을 지시한다. 6-개월령 MDS 생쥐에서, RAP-536으로 처리는 RBC 수치 (16.9%) 및 헤모글로빈 농도 (12.5%)를 유의미하게 증가시키고 (도면 32a), 골수에서 적혈구 전구체 세포 수치를 감소시키고 (도면 32a), 그리고 M/E 비율을 야생형 생쥐의 것으로 정상화시켰다 [Suragani et al. (2014) Nat Med 20:408-414].

12 개월령의 MDS 생쥐에서, RAP-536 처리는 운반제와 비교하여 RBC 수치 (18.3%) 및 헤모글로빈 수준 (13.0%)을 유의미하게 증가시키고 (도면 32b), 적혈구 전구체 세포 수치를 감소시키고 (도면 32b), 그리고 M:E 비율을 향상시켰다 [Suragani et al. (2014) Nat Med 20:408-414]. RAP-536 처리는 골수성 전구체의 절대 수에 영향을 주지 않았다. 유세포분석은 RAP-536 처리가 양쪽 연령의 MDS 생쥐에서 적혈구 과형성을 감소시킨다는 것을 확증하였다. 7 개월 동안 RAP-536으로 처리된 MDS 생쥐에서 시간-코스 분석은 연구의 지속 기간 동안 RBC 숫자에서 지속된 상승을 보여주었다 [Suragani et al. (2014) Nat Med 20:408-414]. 종합하면, 이들 결과는 GDF 트랩으로 처리가 질환 심각도에 상관없이 MDS 생쥐에서 빈혈, 적혈구 과형성 및 무효한 적혈구생성을 개선한다는 것을 지시한다.

실시예 23: GDF 트랩에 치료적으로 반응성인 MDS 환자에서 세포학적 및 유전학적 서명

변형된 액티빈 수용체 유형 IIB 및 IgG Fc를 내포하는 재조합 융합 단백질 [ActRIIB(L79D 25-131)-hFc, 루스파터셉트 또는 ACE-536으로서 또한 알려져 있음]이 무효한 적혈구생성, 예를 들면, 골수형성이상 증후군 (MDS)으로 인한 빈혈의 치료용으로 개발되고 있다. MDS를 앓는 환자는 종종, 상승된 수준의 EPO를 갖고, 그리고 적혈구생성-자극 작용제 (ESAs)에 무반응성이거나 또는 불응할 수 있다. MDS 환자는 GDF11의 증가된 혈청 수준 [Suragani et al. (2014) Nat Med 20:408-414] 및 골수에서 증가된 Smad 2/3 신호전달 [Zhou et al. (2008) Blood 112:3434-3443]을 갖는 것으로 또한 나타났다. ActRIIB(L79D 25-131)-hFc는 GDF11을 비롯한 TGFβ 상과에서 리간드에 결합하고, Smad2/3 신호전달을 저해하고, 그리고 ESAs와 상이한 기전을 통해 후기 단계 적혈구 분화를 증진한다. 뮤린 이형, ActRIIB(L79D 25-131)-mFc는 MDS의 생쥐 모형에서 Smad2 신호전달을 감소시키고, 헤모글로빈 (Hb) 수준을 증가시키고, 그리고 골수 적혈구 과형성을 감소시켰다 [Suragani et al. (2014) Nat Med 20:408-414]. 건강한-지원자 연구에서, ActRIIB(L79D 25-131)-hFc는 충분히 용인되고 Hb 수준을 증가시켰다 [Attie et al. (2014) Am J Hematol 89:766-770].

출원인은 높은 수혈 부담 (HTB, 기준선에 앞서 8 주마다 ≥ 4 단위 RBC로서 규정됨) 또는 낮은 수혈 부담 (LTB, 기준선에 앞서 8 주마다 < 4 단위 RBC로서 규정됨)을 갖는 낮은 또는 Int-1 위험 MDS 환자에서 빈혈에 대한 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc의 효과를 평가하기 위한 진행 중인, 2 단계, 다중심, 개방 표지, 용량 확인 연구를 수행하고 있다. 연구 결과는 적혈구 반응 (LTB 환자에서 Hb 증가 또는 HTB 환자에서 감소된 수혈 부담), 안전성, 내약성, 약물동력학, 그리고 약력학적 생물마커를 포함한다. 포함 기준은 다음을 포함한다: 낮은 또는 Int-1 위험 MDS, 연령 ≥ 18 세, 빈혈 (HTB 환자이거나 또는 LTB 환자에서 기준선 Hb < 10.0 g/dL을 갖는 것으로서 규정됨), EPO > 500 U/L 또는 ESAs에 무반응성/불응성, 이전 아자시티딘 또는 데시타빈 없음, 그리고 ESA, 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF), 또는 레날리도미드, 탈리도미드 또는 포말리도미드로 현재 치료 없음. 용량 증가 시기에서, ActRIIB(L79D 25-131)-hFc는 3-개월 추적에서 최대 5회 투약 동안 0.125, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.33 및 1.75 mg/kg의 용량 수준에서 7개 순차적 코호트 (n = 3-6)에서 3 주마다 1회 피하 주사에 의해 투여되었다.

데이터는 26명 환자 (7명 LTB/19명 HTB)에 대해 가용하였다. 평균 연령은 71 세 (범위: 27-88 세)이고, 50%는 여성이고, 54%는 이전 EPO 요법을 받았고, 그리고 15%는 이전 레날리도미드 요법을 받았다. WHO 서브타입에 의한 환자 분류는 다음과 같았다: 15% RARS, 46% RCMD-RS, 15% RCMD, 15% RAEB-1 (≥15% 환상 철적혈모구를 갖는 2명 환자 포함) 및 8% del (5q). LTB 환자 (n = 7)에 대한 평균 (SD) 기준선 Hgb는 9.1 (0.4) g/dL이었다. 치료에 앞서 8 주 동안 수혈된 평균 (SD) 단위 RBC는 LTB 환자의 경우 0.9 (1.1) 단위 및 HTB 환자의 경우 6.3 (2.4) 단위이었다. 7명 LTB 환자 중에서 2명은 기준선과 비교하여 8 주에 걸쳐 평균 Hb ≥ 1.5 g/dL에서 증가를 가졌다. LTB 환자에서 평균 최대 Hb 증가는 각각, 0.125 (n=1), 0.25 (n = 1), 0.75 (n = 3) 및 1.75 (n = 2) mg/kg 용량 군에서 0.8, 1.0, 2.2 및 3.5 g/dL이었다. 7명 LTB 환자 중에서 6명은 연구 동안 ≥ 8 주 동안 RBC 수혈 독립 (RBC-TI)을 달성하였다. 0.75 mg/kg 내지 1.75 mg/kg 범위에서 변하는 용량 수준은 활성 용량인 것으로 간주되었다. 활성 용량 군에서 5명 환자 사이에서, 4명 (80%)은 ≥ 2 주 동안 ≥ 1.5 g/dl의 Hgb 증가의 미리 특정된 종결점을 달성하였다. 2명 환자 (40%)는 LTB 환자에서 ≥ 8 주 동안 ≥ 1.5 g/dl의 Hgb 증가로서 규정된 HI-E 반응을 달성하였다 [International Working Group; Cheson et al. (2000) Blood 96:3671-3674; Cheson et al. (2006) Blood 108:419-425]. HTB 환자에서, HI-E 반응은 연구 시작에 앞서 8 주와 비교하여 8 주 기간에 걸쳐 수혈된 적혈구의 최소한 4개 단위의 수혈 부담에서 감소로서 규정된다. 활성 용량 군에서, 12명 HTB 환자 중에서 5명 (42%)은 치료에 앞서 8 주와 비교하여 치료 기간 동안 8-주 간격에 걸쳐 수혈된 RBC 단위에서 ≥ 4 RBC 단위의 감소 또는 ≥ 50% 감소의 미리 특정된 종결점에 부합하였고, 그리고 이들 동일한 환자 (12명 중에서 5명, 42%)는 HI-E 반응을 달성하였다; 활성 용량 군에서 12명 HTB 환자 중에서 3명 (25%)은 연구 동안 RBC-TI ≥ 8 주를 달성하였다. 연구 약물 투여 이후에 호중구 수치에서 증가가 일부 환자에서 관찰되었다. 최종적으로, ActRIIB(L79D 25-131)-hFc는 일반적으로 충분히 용인되었다. 현재까지 어떤 관련된 심각한 부작용도 보고되지 않았다. 인과성에 상관없이 가장 빈번한 부작용은 다음과 같았다: 설사 (n = 4, 등급 1/2), 뼈 통증, 피로, 근육 연축, 근육통, 그리고 비인두염 (각각 n = 3, 등급 1/2).

골수 흡인물의 사정은 활성 용량 군 (0.75 - 1.75 mg/kg)에서 환상 철적혈모구의 존재 (≥ 15%의 적혈구 전구체가 환상 철적혈모구 형태를 전시하면 양성으로 간주됨) 및 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc에 반응성 사이에 연관을 증명하였다. LTB 및 HTB 환자 둘 모두를 교차하여 전반적인 반응률 (HI-E 규준 이용, 앞서 설명됨)은 17명 중에서 7명 (41%)이었다. 기준선에서 환상 철적혈모구에 양성인 환자 사이에서, 13명 환자 중에서 7명 (54%)은 HI-E 반응을 달성하고, 그리고 특히, 기준선에서 환상 철적혈모구에 음성인 4명 환자 중에서 어느 누구도 HI-E 반응을 달성하지 못하였다.

환자로부터 골수 흡인물은 또한, MDS와 연관된 돌연변이 (일차적으로 체성 돌연변이)를 품는 것으로 알려져 있는 21개의 상이한 유전자에서 돌연변이의 존재에 대해 평가되었다. 유전체 DNA는 골수 흡인물로부터 단리되었고, 21개 유전자의 선별된 코딩 영역은 중합효소 연쇄 반응에 의해 증폭되었고, 그리고 이들 영역의 DNA 서열은 차세대 염기서열결정 (골수성 분자 프로필 21-유전자 패널, Genoptix, Inc., Carlsbad, CA)을 이용하여 결정되었다. 이러한 분석은 활성화된 신호전달 유전자 (KIT, JAK2, NRAS, CBL 및 MPL), 전사 인자 (RUNX1, ETV6), 후성적 유전자 (IDH1, IDH2, TET2, DNMT3A, EZH2, ASXL1 및 SETBP1), RNA 스플라이싱 유전자 (SF3B1, U2AF1, ZRSR2 및 SRSF2), 그리고 종양 억제인자/기타 (TP53, NPM1, PHF6)을 조사하였다. SF3B1의 분석은 엑손 13-16을 특이적으로 표적으로 하였다. 평가된 이들 21개 MDS-연관된 유전자 중에서, SF3B1에서 돌연변이는 무반응성 환자에서보다 반응성 환자에서 골수 세포에서 더욱 빈번하게 검출되었다. 이들 환자에서 검출된 개별 SF3B1 돌연변이는 다음의 표에서 도시된다. 동일한 돌연변이가 때때로 복수 환자에서 일어났다.

활성 용량 군에서 SF3B1 돌연변이를 갖는 환자에서, 8 주 이상 동안 수혈 독립을 달성한 3명 환자 모두를 비롯하여, 9명 중에서 6명 (67%)이 HI-E 반응을 달성하였다. SF3B1 돌연변이를 갖지 않는 환자에서, 8명 중에서 단지 1명 (13%)만 HI-E 반응을 달성하였다. SF3B1에서 돌연변이는 환상 철적혈모구를 갖는 MDS 환자에서 빈번하게 관찰되고 무효한 적혈구생성과 연관된다.

상기 제시된 과정에서 임상 시험의 초기 분석은 추후 분석에서 확증되었는데, 이것에 대한 데이터가 44명 환자 (15명 LTB/29명 HTB)에 대해 가용하였다. 평균 연령은 71 세 (범위: 27-88 세)이고, 43%는 여성이고, 61%는 이전 EPO 요법을 받았고, 그리고 21%는 이전 레날리도미드 요법을 받았다. LTB 환자 (n = 15)에 대한 평균 기준선 Hgb는 9.0 (범위: 6.8-10.1) g/dL이었다. 치료에 앞서 8 주 동안 수혈된 평균 단위 RBC는 수혈을 제공받았던 6명 LTB 환자의 경우 2 (범위 2-2) 단위 및 HTB 환자의 경우 6 (범위: 4-14) 단위이었다. 0.75 mg/kg 내지 1.75 mg/kg 범위에서 변하는 용량 수준은 활성 용량인 것으로 간주되었다. 활성 용량 군에서 35명 LTB 및 HTB 환자 사이에서, 22명 (63%)이 LTB 환자의 경우 ≥ 2 주 동안 ≥ 1.5 g/dl의 Hgb 증가 및 HTB 환자의 경우 8 주에 걸쳐 수혈 동안 ≥4 단위 또는 50% 감소의 미리 특정된 종결점을 달성하였다. 활성 용량 군에서 35명 환자 중에서 19명 (54%)은 LTB 환자에서 ≥ 8 주 동안 ≥ 1.5 g/dl의 Hgb 증가 및 HTB 환자에서 치료에 앞서 8 주와 비교하여 치료 기간 동안 8-주 간격에 걸쳐 수혈된 RBC 단위에서 ≥ 4 RBC 단위의 감소 또는 ≥ 50% 감소로서 규정된 HI-E 반응 [International Working Group; Cheson et al. (2000) Blood 96:3671-3674; Cheson et al. (2006) Blood 108:419-425]을 달성하였다. 기준선 수혈을 받은 활성 용량 군에서 10/28명 (36%) 환자가 최소한 8 주의 기간 동안 수혈 독립을 달성하였다. 골수 흡인물의 사정은 환상 철적혈모구 (≥ 15%의 적혈구 전구체가 환상 철적혈모구 형태를 전시하면 양성으로 간주됨) 또는 SF3B1 유전자에서 돌연변이의 존재 및 활성 용량 군 (0.75 - 1.75 mg/kg)에서 ActRIIB(L79D 25-131)- hFc에 반응성 사이에 연관을 증명하였다. LTB 및 HTB 환자 둘 모두를 교차하여 전반적인 반응률 (HI-E 규준 이용, 앞서 설명됨)은 19/35 (54%)이었다. 기준선에서 환상 철적혈모구에 양성인 환자 사이에서, 19/30 (63%)명 환자가 HI-E 반응을 달성하였고, 그리고 특히, 기준선에서 환상 철적혈모구에 음성인 4명 환자 중에서 어느 누구도 HI-E 반응을 달성하지 못하였다. 기준선에서 SF3B1 돌연변이에 양성인 환자 사이에서, 16/22 (73%)명 환자가 HI-E 반응을 달성하고, 그리고 특히, 기준선에서 SF3B1 돌연변이에 음성인 단지 3/13 (23%)명 환자만 HI-E 반응을 달성하였다. 최종적으로, ActRIIB(L79D 25-131)-hFc는 일반적으로 충분히 용인되었다. 인과성에 상관없이 가장 빈번한 부작용은 다음과 같았다: 설사, 비인두염, 근육통, 뼈 통증, 기관지염, 두통 및 근육 연축. 아마도 관련된 2가지 심각한 부작용 (SAEs)이 보고되었다: 등급 3 근육 통증; 전반적인 상태의 등급 3 악화. 모세포 수치 증가의 아마도 관련된 1가지 비-심각한 등급 3 부작용이 보고되었다.

추후 일자에서 수행된 추가 데이터 사정은 상기 결과를 확대하고 전체적으로 확증하였다. 전반적으로, 활성 용량 군에서 49명 환자 중에서 24명 (49%)이 낮은-수혈 부담 (LTB)을 갖는 환자에서 ≥ 8 주 동안 ≥ 1.5 g/dL의 헤모글로빈 농도에서 증가로서 규정되고, 그리고 높은-수혈 부담 (HTB)을 갖는 환자에서 치료에 앞서 8 주와 비교하여 치료 기간 동안 8-주 간격에 걸쳐 수혈된 ≥ 4 RBC 단위의 감소, 또는 ≥ 50% RBC 단위의 감소로서 규정된 HI-E 반응을 달성하였다. 기준선 수혈을 받은 활성 용량 군에서 40명 환자 중에서 14명 (35%)이 최소한 8 주의 기간 동안 수혈 독립을 달성하였다.

일정한 체성 유전자 돌연변이의 존재에서 반응률의 사정 역시 활성 용량 군에서 환자에 대해 수행되었다. SF3B1에서 돌연변이는 무반응성 환자로부터 보다는 반응성 환자로부터 골수 세포에서 더욱 빈번하게 검출되었다. SF3B1 돌연변이를 갖는 활성 용량 군에서 30명 환자 중에서 18명 (60%)이 HI-E 반응을 달성하였고, 반면 이러한 유전자에서 돌연변이가 검출되지 않은 이와 같은 19명 환자 중에서 단지 6명 (32%)만 HI-E 반응을 달성하였다. 이들 환자에서 검출된 개별 SF3B1 돌연변이는 다음의 표에서 도시된다. 동일한 돌연변이가 때때로 복수 환자에서 일어났다.

유사하게, DNMT3A에서 돌연변이는 무반응성 환자로부터 보다는 활성 용량 군에서 반응성 환자로부터 골수 세포에서 더욱 빈번하게 검출되었다. DNMT3A 돌연변이를 갖는 활성 용량 군에서 11명 환자 중에서 7명 (64%)이 HI-E 반응을 달성하였고, 반면 이러한 유전자에서 돌연변이가 검출되지 않은 이와 같은 38명 환자 중에서 17명 (45%)이 HI-E 반응을 달성하였다. 이들 환자에서 검출된 개별 DNMT3A 돌연변이는 다음의 표에서 도시된다 (IVS는 인트로닉 돌연변이를 지칭하고, 그리고 X는 미성숙 종결 코돈의 형성을 지시한다).

유사하게, TET2에서 돌연변이는 무반응성 환자로부터 보다는 활성 용량 군에서 반응성 환자로부터 골수 세포에서 더욱 빈번하게 검출되었다. TET2 돌연변이를 갖는 활성 용량 군에서 20명 환자 중에서 11명 (55%)이 HI-E 반응을 달성하였고, 반면 이러한 유전자에서 돌연변이가 검출되지 않은 이와 같은 29명 환자 중에서 13명 (45%)이 HI-E 반응을 달성하였다. 이들 환자에서 검출된 개별 TET2 돌연변이 (공지된 다형성 배제)는 다음의 표에서 도시된다.

다른 유전자에서 돌연변이는 무반응성 환자로부터 세포에서와 유사한 빈도로 반응성 환자로부터 골수 세포에서 검출되었다. 가령, ASXL1 돌연변이를 갖는 활성 용량 군에서 8명 환자 중에서 4명 (50%)이 HI-E 반응을 달성하였고, 반면 이러한 유전자에서 돌연변이가 검출되지 않은 유사한 백분율의 이와 같은 환자 (41명 중에서 20명, 49%)가 HI-E 반응을 달성하였다.

이들 결과는 ≥ 15% 환상 철적혈모구 (및 다른 형태의 철적혈모구 빈혈) 및/또는 SF3B1에서 최소한 하나의 돌연변이를 전시하는 MDS 환자는 < 15% 환상 철적혈모구 및/또는 SF3B1에서 돌연변이 없음을 갖는 MDS 환자보다 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc에 치료적으로 반응할 개연성이 더욱 높다는 것을 지시한다. 유사하게, ≥ 15% 환상 철적혈모구 (및 다른 형태의 철적혈모구 빈혈) 및/또는 DNMT3A 또는 TET2에서 최소한 하나의 돌연변이를 전시하는 환자는 < 15% 환상 철적혈모구 및/또는 DNMT3A 또는 TET2에서 돌연변이 없음을 갖는 MDS 환자보다 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc에 치료적으로 반응할 개연성이 더욱 높다. 이들 데이터에 근거하여, 이들 환자 하위군 중에서 한 가지의 선택적 치료는 ActRII 저해제로 치료의 유익성/위험 비율을 크게 증가시킬 것으로 예상된다.

참조로서 편입

본원에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 마치 각 개별 간행물 또는 특허가 참조로서 편입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시되는 것처럼 본원에 참조로서 편입된다.

요부의 특정한 구체예가 논의되긴 했지만, 상기 명세서는 예시이고 제한적이지 않다. 본 명세서 및 아래 청구항의 리뷰 시에 많은 변형이 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명의 전체 범위는 등가물의 전체 범위와 함께 청구항, 그리고 이런 변형과 함께 본 명세서를 참조하여 결정되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> ACCELERON PHARMA INC. <120> METHODS FOR TREATING MYELODYSPLASTIC SYNDROMES AND SIDEROBLASTIC ANEMIAS <130> PHPH-083-WO1 <140> PCT/US2015/063835 <141> 2015-12-03 <150> 62/155,395 <151> 2015-04-30 <150> 62/088,087 <151> 2014-12-05 <150> 62/086,977 <151> 2014-12-03 <160> 70 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 512 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15 Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr 20 25 30 Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45 Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg 50 55 60 Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80 Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn 85 90 95 Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg 100 105 110 Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro 115 120 125 Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 130 135 140 Pro Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ile Val Leu Leu Ala Phe Trp Met Tyr 145 150 155 160 Arg His Arg Lys Pro Pro Tyr Gly His Val Asp Ile His Glu Asp Pro 165 170 175 Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Val Gly Leu Lys Pro Leu Gln Leu 180 185 190 Leu Glu Ile Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys Ala Gln 195 200 205 Leu Met Asn Asp Phe Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Leu Gln Asp Lys 210 215 220 Gln Ser Trp Gln Ser Glu Arg Glu Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys 225 230 235 240 His Glu Asn Leu Leu Gln Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn 245 250 255 Leu Glu Val Glu Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser 260 265 270 Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Gly Asn Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys 275 280 285 His Val Ala Glu Thr Met Ser Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp 290 295 300 Val Pro Trp Cys Arg Gly Glu Gly His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg 305 310 315 320 Asp Phe Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val 325 330 335 Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro 340 345 350 Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu 355 360 365 Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg Ile 370 375 380 Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys 385 390 395 400 Lys Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu 405 410 415 Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gln Glu Val Val Val 420 425 430 His Lys Lys Met Arg Pro Thr Ile Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro 435 440 445 Gly Leu Ala Gln Leu Cys Val Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His Asp 450 455 460 Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Glu Glu Arg Val Ser Leu 465 470 475 480 Ile Arg Arg Ser Val Asn Gly Thr Thr Ser Asp Cys Leu Val Ser Leu 485 490 495 Val Thr Ser Val Thr Asn Val Asp Leu Pro Pro Lys Glu Ser Ser Ile 500 505 510 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys 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Leu Lys Pro Leu Gln Leu 180 185 190 Leu Glu Ile Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys Ala Gln 195 200 205 Leu Met Asn Asp Phe Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Leu Gln Asp Lys 210 215 220 Gln Ser Trp Gln Ser Glu Arg Glu Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys 225 230 235 240 His Glu Asn Leu Leu Gln Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn 245 250 255 Leu Glu Val Glu Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser 260 265 270 Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Gly Asn Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys 275 280 285 His Val Ala Glu Thr Met Ser Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp 290 295 300 Val Pro Trp Cys Arg Gly Glu Gly His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg 305 310 315 320 Asp Phe Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val 325 330 335 Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro 340 345 350 Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu 355 360 365 Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg Ile 370 375 380 Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys 385 390 395 400 Lys Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu 405 410 415 Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gln Glu Val Val Val 420 425 430 His Lys Lys Met Arg Pro Thr Ile Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro 435 440 445 Gly Leu Ala Gln Leu Cys Val Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His Asp 450 455 460 Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Glu Glu Arg Val Ser Leu 465 470 475 480 Ile Arg Arg Ser Val Asn Gly Thr Thr Ser Asp Cys Leu Val Ser Leu 485 490 495 Val Thr Ser Val Thr Asn Val Asp Leu Pro Pro Lys Glu Ser Ser Ile 500 505 510 <210> 5 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly 20 25 30 Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Ala Asn Ser Ser 35 40 45 Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn 50 55 60 Cys 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ccaactggga gctggagcgc 120 accaaccaga gcggcctgga gcgctgcgaa ggcgagcagg acaagcggct gcactgctac 180 gcctcctggc gcaacagctc tggcaccatc gagctcgtga agaagggctg ctggctagat 240 gacttcaact gctacgatag gcaggagtgt gtggccactg aggagaaccc ccaggtgtac 300 ttctgctgct gtgaaggcaa cttctgcaac gaacgcttca ctcatttgcc agaggctggg 360 ggcccggaag tcacgtacga gccacccccg acagccccca ccctgctcac ggtgctggcc 420 tactcactgc tgcccatcgg gggcctttcc ctcatcgtcc tgctggcctt ttggatgtac 480 cggcatcgca agccccccta cggtcatgtg gacatccatg aggaccctgg gcctccacca 540 ccatcccctc tggtgggcct gaagccactg cagctgctgg agatcaaggc tcgggggcgc 600 tttggctgtg tctggaaggc ccagctcatg aatgactttg tagctgtcaa gatcttccca 660 ctccaggaca agcagtcgtg gcagagtgaa cgggagatct tcagcacacc tggcatgaag 720 cacgagaacc tgctacagtt cattgctgcc gagaagcgag gctccaacct cgaagtagag 780 ctgtggctca tcacggcctt ccatgacaag ggctccctca cggattacct caaggggaac 840 atcatcacat ggaacgaact gtgtcatgta gcagagacga tgtcacgagg cctctcatac 900 ctgcatgagg atgtgccctg gtgccgtggc gagggccaca agccgtctat tgcccacagg 960 gactttaaaa gtaagaatgt attgctgaag agcgacctca cagccgtgct ggctgacttt 1020 ggcttggctg ttcgatttga gccagggaaa cctccagggg acacccacgg acaggtaggc 1080 acgagacggt acatggctcc tgaggtgctc gagggagcca tcaacttcca gagagatgcc 1140 ttcctgcgca ttgacatgta tgccatgggg ttggtgctgt gggagcttgt gtctcgctgc 1200 aaggctgcag acggacccgt ggatgagtac atgctgccct ttgaggaaga gattggccag 1260 cacccttcgt tggaggagct gcaggaggtg gtggtgcaca agaagatgag gcccaccatt 1320 aaagatcact ggttgaaaca cccgggcctg gcccagcttt gtgtgaccat cgaggagtgc 1380 tgggaccatg atgcagaggc tcgcttgtcc gcgggctgtg tggaggagcg ggtgtccctg 1440 attcggaggt cggtcaacgg cactacctcg gactgtctcg tttccctggt gacctctgtc 1500 accaatgtgg acctgccccc taaagagtca agcatc 1536 <210> 8 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gggcgtgggg aggctgagac acgggagtgc atctactaca acgccaactg ggagctggag 60 cgcaccaacc agagcggcct ggagcgctgc gaaggcgagc aggacaagcg gctgcactgc 120 tacgcctcct ggcgcaacag ctctggcacc atcgagctcg tgaagaaggg ctgctggcta 180 gatgacttca actgctacga taggcaggag tgtgtggcca ctgaggagaa cccccaggtg 240 tacttctgct gctgtgaagg caacttctgc aacgaacgct tcactcattt gccagaggct 300 gggggcccgg aagtcacgta cgagccaccc ccgacagccc ccacc 345 <210> 9 <211> 513 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ala Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe 20 25 30 Phe Asn Ala Asn Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu 35 40 45 Pro Cys Tyr Gly Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp 50 55 60 Lys Asn Ile Ser Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu 65 70 75 80 Asp Asp Ile Asn Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp 85 90 95 Ser Pro Glu Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu 100 105 110 Lys Phe Ser Tyr Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn 115 120 125 Pro Val Thr Pro Lys Pro Pro Tyr Tyr Asn Ile Leu Leu Tyr Ser Leu 130 135 140 Val Pro Leu Met Leu Ile Ala Gly Ile Val Ile Cys Ala Phe Trp Val 145 150 155 160 Tyr Arg His His Lys Met Ala Tyr Pro Pro Val Leu Val Pro Thr Gln 165 170 175 Asp Pro Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Leu Gly Leu Lys Pro Leu 180 185 190 Gln Leu Leu Glu Val Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys 195 200 205 Ala Gln Leu Leu Asn Glu Tyr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Ile Gln 210 215 220 Asp Lys Gln Ser Trp Gln Asn Glu Tyr Glu Val Tyr Ser Leu Pro Gly 225 230 235 240 Met Lys His Glu Asn Ile Leu Gln Phe Ile Gly Ala Glu Lys Arg Gly 245 250 255 Thr Ser Val Asp Val Asp Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Glu Lys 260 265 270 Gly Ser Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ala Asn Val Val Ser Trp Asn Glu 275 280 285 Leu Cys His Ile Ala Glu Thr Met Ala Arg Gly Leu Ala Tyr Leu His 290 295 300 Glu Asp Ile Pro Gly Leu Lys Asp Gly His Lys Pro Ala Ile Ser His 305 310 315 320 Arg Asp Ile Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Asn Asn Leu Thr Ala 325 330 335 Cys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Leu Lys Phe Glu Ala Gly Lys Ser 340 345 350 Ala Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro 355 360 365 Glu Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg 370 375 380 Ile Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Ala Ser Arg 385 390 395 400 Cys Thr Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu 405 410 415 Glu Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Asp Met Gln Glu Val Val 420 425 430 Val His Lys Lys Lys Arg Pro Val Leu Arg Asp Tyr Trp Gln Lys His 435 440 445 Ala Gly Met Ala Met Leu Cys Glu Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His 450 455 460 Asp Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Gly Glu Arg Ile Thr 465 470 475 480 Gln Met Gln Arg Leu Thr Asn Ile Ile Thr Thr Glu Asp Ile Val Thr 485 490 495 Val Val Thr Met Val Thr Asn Val Asp Phe Pro Pro Lys Glu Ser Ser 500 505 510 Leu <210> 10 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly 20 25 30 Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser 35 40 45 Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr 85 90 95 Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro 100 105 110 Lys Pro Pro 115 <210> 11 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 11 Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly 20 25 30 Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser 35 40 45 Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr 85 90 95 Phe Pro Glu Met 100 <210> 12 <211> 1539 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 atgggagctg ctgcaaagtt ggcgtttgcc gtctttctta tctcctgttc ttcaggtgct 60 atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta atgctaattg ggaaaaagac 120 agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt tatggtgaca aagataaacg gcggcattgt 180 tttgctacct ggaagaatat ttctggttcc attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg 240 gatgatatca actgctatga caggactgat tgtgtagaaa aaaaagacag ccctgaagta 300 tatttttgtt gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt tccggagatg 360 gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc caccctatta caacatcctg 420 ctctattcct tggtgccact tatgttaatt gcggggattg tcatttgtgc attttgggtg 480 tacaggcatc acaagatggc ctaccctcct gtacttgttc caactcaaga cccaggacca 540 cccccacctt ctccattact aggtttgaaa ccactgcagt tattagaagt gaaagcaagg 600 ggaagatttg gttgtgtctg gaaagcccag ttgcttaacg aatatgtggc tgtcaaaata 660 tttccaatac aggacaaaca gtcatggcaa aatgaatacg aagtctacag tttgcctgga 720 atgaagcatg agaacatatt acagttcatt ggtgcagaaa aacgaggcac cagtgttgat 780 gtggatcttt ggctgatcac agcatttcat gaaaagggtt cactatcaga ctttcttaag 840 gctaatgtgg tctcttggaa tgaactgtgt catattgcag aaaccatggc tagaggattg 900 gcatatttac atgaggatat acctggccta aaagatggcc acaaacctgc catatctcac 960 agggacatca aaagtaaaaa tgtgctgttg aaaaacaacc tgacagcttg cattgctgac 1020 tttgggttgg ccttaaaatt tgaggctggc aagtctgcag gcgataccca tggacaggtt 1080 ggtacccgga ggtacatggc tccagaggta ttagagggtg ctataaactt ccaaagggat 1140 gcatttttga ggatagatat gtatgccatg ggattagtcc tatgggaact ggcttctcgc 1200 tgtactgctg cagatggacc tgtagatgaa tacatgttgc catttgagga ggaaattggc 1260 cagcatccat ctcttgaaga catgcaggaa gttgttgtgc ataaaaaaaa gaggcctgtt 1320 ttaagagatt attggcagaa acatgctgga atggcaatgc tctgtgaaac cattgaagaa 1380 tgttgggatc acgacgcaga agccaggtta tcagctggat gtgtaggtga aagaattacc 1440 cagatgcaga gactaacaaa tattattacc acagaggaca ttgtaacagt ggtcacaatg 1500 gtgacaaatg ttgactttcc tcccaaagaa tctagtcta 1539 <210> 13 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta atgctaattg ggaaaaagac 60 agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt tatggtgaca aagataaacg gcggcattgt 120 tttgctacct ggaagaatat ttctggttcc attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg 180 gatgatatca actgctatga caggactgat tgtgtagaaa aaaaagacag ccctgaagta 240 tatttttgtt gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt tccggagatg 300 gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc caccc 345 <210> 14 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 14 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 10 15 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 20 25 30 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 35 40 45 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 50 55 60 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 65 70 75 80 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 85 90 95 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys 100 105 110 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 115 120 125 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 130 135 140 Cys Leu Val 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gattgtgtag aaaaaaaaga 300 cagccctgaa gtatatttct gttgctgtga gggcaatatg tgtaatgaaa agttttctta 360 ttttccggag atggaagtca cacagcccac ttcaaatcca gttacaccta agccacccac 420 cggtggtgga actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc 480 agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt 540 cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt 600 ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac 660 gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta 720 caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agtccccatc gagaaaacca tctccaaagc 780 caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac 840 caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt 900 ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga 960 ctccgacggc tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca 1020 ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa 1080 gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatgaga attc 1114 <210> 28 <211> 329 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ggccactgag 300 gagaaccccc aggtgtactt ctgctgctgt gaaggcaact tctgcaacga gcgcttcact 360 catttgccag aggctggggg cccggaagtc acgtacgagc cacccccgac agcccccacc 420 ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 480 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 540 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 600 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 660 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 720 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gtccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 780 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 840 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 900 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 960 tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1020 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1080 agcctctccc tgtctccggg taaatga 1107 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Gly Arg Gly Glu Ala Glu 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 34 Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu 1 5 <210> 35 <400> 35 000 <210> 36 <211> 343 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly 20 25 30 Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser 35 40 45 Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His 85 90 95 Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr 100 105 110 Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr 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caccaccggt gggggctgtc gggggtggct cgtacgtgac 720 ttccgggccc ccagcctctg gcaaatgagt gaagcgctcg ttgcagaagt tgccttcaca 780 gcagcagaag tacacctggg ggttctcctc agtggccaca cactcctgcc tatcgtagca 840 gttgaagtca tcatcccagc agcccttctt cacgagctcg atggtgccag agctgttgcg 900 ccaggaggcg tagcagtgca gccgcttgtc ctgctcgcct tcgcagcgct ccaggccgct 960 ctggttggtg cgctccagct cccagttggc gttgtagtag atgcactccc gtgtctcagc 1020 ctccccacgc ccagaggcgc cgggcgaaac gaagactgct ccacacagca gcagcacaca 1080 gcagagccct ctcttcattg catccat 1107 <210> 41 <211> 360 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 41 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr 20 25 30 Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu 35 40 45 Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp 65 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cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 480 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 540 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 600 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 660 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 720 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 780 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 840 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 900 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctat 960 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1020 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa 1080 tga 1083 <210> 43 <211> 1083 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 43 tcatttaccc ggggacaggg agaggctctt ctgcgtgtag tggttgtgca gagcctcatg 60 catcacggag catgagaaga cgttcccctg 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 45 Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg 1 5 10 15 Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg 20 25 30 Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu 35 40 45 Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln 50 55 60 Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys 65 70 75 80 Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly 85 90 95 Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr 100 105 <210> 46 <211> 1083 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 46 atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60 tcgcccggcg ccgccgaaac ccgcgaatgt atttattaca atgctaattg ggaactcgaa 120 cggacgaacc aatccgggct cgaacggtgt gagggggaac aggataaacg cctccattgc 180 tatgcgtcgt ggaggaactc ctccgggacg attgaactgg tcaagaaagg gtgctgggac 240 gacgatttca attgttatga ccgccaggaa tgtgtcgcga ccgaagagaa tccgcaggtc 300 tatttctgtt gttgcgaggg gaatttctgt aatgaacggt ttacccacct ccccgaagcc 360 ggcgggcccg aggtgaccta tgaacccccg cccaccggtg gtggaactca cacatgccca 420 ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 480 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 540 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 600 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 660 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 720 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 780 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 840 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 900 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctat 960 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1020 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa 1080 tga 1083 <210> 47 <211> 1083 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 47 tcatttaccc ggggacaggg agaggctctt ctgcgtgtag tggttgtgca gagcctcatg 60 catcacggag catgagaaga cgttcccctg ctgccacctg ctcttgtcca cggtgagctt 120 gctatagagg aagaaggagc cgtcggagtc cagcacggga ggcgtggtct tgtagttgtt 180 ctccggctgc ccattgctct cccactccac ggcgatgtcg ctgggataga agcctttgac 240 caggcaggtc aggctgacct ggttcttggt catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta 300 cacctgtggt tctcggggct gccctttggc tttggagatg gttttctcga tgggggctgg 360 gagggctttg ttggagacct tgcacttgta ctccttgcca ttcagccagt cctggtgcag 420 gacggtgagg acgctgacca cacggtacgt gctgttgtac tgctcctccc gcggctttgt 480 cttggcatta tgcacctcca cgccgtccac gtaccagttg aacttgacct cagggtcttc 540 gtggctcacg tccaccacca cgcatgtgac ctcaggggtc cgggagatca tgagggtgtc 600 cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtcccccc aggagttcag gtgctgggca 660 cggtgggcat gtgtgagttc caccaccggt gggcgggggt tcataggtca cctcgggccc 720 gccggcttcg gggaggtggg taaaccgttc attacagaaa ttcccctcgc aacaacagaa 780 atagacctgc ggattctctt cggtcgcgac acattcctgg cggtcataac aattgaaatc 840 gtcgtcccag caccctttct tgaccagttc aatcgtcccg gaggagttcc tccacgacgc 900 atagcaatgg aggcgtttat cctgttcccc ctcacaccgt tcgagcccgg attggttcgt 960 ccgttcgagt tcccaattag cattgtaata aatacattcg cgggtttcgg cggcgccggg 1020 cgaaacgaag actgctccac acagcagcag cacacagcag agccctctct tcattgcatc 1080 cat 1083 <210> 48 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 48 gaaacccgcg aatgtattta ttacaatgct aattgggaac tcgaacggac gaaccaatcc 60 gggctcgaac ggtgtgaggg ggaacaggat aaacgcctcc attgctatgc gtcgtggagg 120 aactcctccg ggacgattga actggtcaag aaagggtgct gggacgacga tttcaattgt 180 tatgaccgcc aggaatgtgt cgcgaccgaa gagaatccgc aggtctattt ctgttgttgc 240 gaggggaatt tctgtaatga acggtttacc cacctccccg aagccggcgg gcccgaggtg 300 acctatgaac ccccgcccac c 321 <210> 49 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 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Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr 20 25 30 Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45 Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg 50 55 60 Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80 Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn 85 90 95 Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg 100 105 110 Phe Thr His Leu Pro Glu Pro Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro 115 120 125 Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 130 135 140 Pro Ile Gly Gly Leu Ser 145 150 <210> 60 <211> 150 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15 Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr 20 25 30 Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45 Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg 50 55 60 Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80 Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn 85 90 95 Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg 100 105 110 Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro 115 120 125 Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 130 135 140 Pro Ile Gly Gly Leu Ser 145 150 <210> 61 <211> 150 <212> PRT <213> Bos sp. <400> 61 Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15 Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr 20 25 30 Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45 Cys Glu Gly Glu Arg Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg 50 55 60 Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80 Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn 85 90 95 Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg 100 105 110 Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro 115 120 125 Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 130 135 140 Pro Val Gly Gly Leu Ser 145 150 <210> 62 <211> 150 <212> PRT <213> Xenopus sp. <400> 62 Met Gly Ala Ser Val Ala Leu Thr Phe Leu Leu Leu Leu Ala Thr Phe 1 5 10 15 Arg Ala Gly Ser Gly His Asp Glu Val Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr 20 25 30 Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Lys Thr Asn Gln Ser Gly Val Glu 35 40 45 Arg Leu Val Glu Gly Lys Lys Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser 50 55 60 Trp Arg Asn Asn Ser Gly Phe Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp 65 70 75 80 Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Ile Ala Lys Glu 85 90 95 Glu Asn Pro Gln Val Phe Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 Lys Lys Phe Thr His Leu Pro Glu Val Glu Thr Phe Asp Pro Lys Pro 115 120 125 Gln Pro Ser Ala Ser Val Leu Asn Ile Leu Ile Tyr Ser Leu Leu Pro 130 135 140 Ile Val Gly Leu Ser Met 145 150 <210> 63 <211> 150 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ala Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe 20 25 30 Phe Asn Ala Asn Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu 35 40 45 Pro Cys Tyr Gly Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp 50 55 60 Lys Asn Ile Ser Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu 65 70 75 80 Asp Asp Ile Asn Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp 85 90 95 Ser Pro Glu Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu 100 105 110 Lys Phe Ser Tyr Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn 115 120 125 Pro Val Thr Pro Lys Pro Pro Tyr Tyr Asn Ile Leu Leu Tyr Ser Leu 130 135 140 Val Pro Leu Met Leu Ile 145 150 <210> 64 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 64 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 10 15 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 20 25 30 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 35 40 45 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 50 55 60 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 65 70 75 80 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 85 90 95 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 100 105 110 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 115 120 125 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 130 135 140 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 145 150 155 160 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 165 170 175 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 180 185 190 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 195 200 205 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 Lys 225 <210> 65 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 65 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 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gggacgatga cttcaactgc tacgataggc aggagtgtgt ggccactgag 300 gagaaccccc aggtgtactt ctgctgctgt gaaggcaact tctgcaacga gcgcttcact 360 catttgccag aggctggggg cccggaagtc acgtacgagc cacccccgac agcccccacc 420 ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 480 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 540 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 600 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 660 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 720 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gtccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 780 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 840 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 900 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 960 tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1020 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1080 agcctctccc tgtctccggg taaatga 1107 <210> 69 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Thr, Ala or not present <220> <221> MOD_RES <222> (121)..(121) <223> Pro, Ala, Val or Met <400> 69 Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Xaa Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu 1 5 10 15 Cys Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr 20 25 30 Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu 35 40 45 Arg Leu Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser 50 55 60 Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp 65 70 75 80 Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu 85 90 95 Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn 100 105 110 Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Xaa Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr 115 120 125 Glu Pro Lys Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr 130 135 140 Ser Leu Leu Pro Ile Gly Gly Leu Ser Met 145 150 <210> 70 <211> 11 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 accaccacca c 11

Claims

인간 환자에서 철적혈모구 빈혈을 치료하거나 예방하기 위한 방법에 있어서, 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 치료가 필요한 환자에 투여하는 것을 포함하고, 그리고 여기서 상기 환자는 환자에 0.75-1.75 mg/kg의 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는 투약 일정에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호: 44의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, 폴리펩티드는 이합체인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 3 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 GDF11에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 3 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 GDF8에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 3 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 GDF11 및 GDF8에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 6 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 다음에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: 당화된 아미노산, 페길화된 아미노산, 파르네실화된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 비오틴화된 아미노산, 그리고 지질 모이어티에 접합된 아미노산.
청구항 7에 있어서, 폴리펩티드는 당화되고 포유류 당화 패턴을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 8에 있어서, 폴리펩티드는 중국 햄스터 난소 세포주로부터 획득가능한 당화 패턴을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 9 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 환자에 피하 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 10 중에서 어느 한 항에 있어서, 투약 일정은 폴리펩티드를 환자에 3 주마다 1회 투여하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 11 중에서 어느 한 항에 있어서, 환자는 바람직하지 않게 높은 수준의 내인성 EPO를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 12 중에서 어느 한 항에 있어서, 환자는 하나 또는 그 이상의 EPO 수용체 효현제로 이전에 치료되었던 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 13에 있어서, 환자는 EPO 수용체 효현제에 부적당한 반응을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 13에 있어서, 환자는 EPO 수용체 효현제에 더 이상 반응하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 13 내지 15 중에서 어느 한 항에 있어서, EPO 수용체 효현제는 EPO인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 16 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 적혈구 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 17 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 헤모글로빈 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 18에 있어서, 치료는 ≥ 2 주 동안 ≥ 1.5 g/dL의 헤모글로빈에서 증가를 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 18에 있어서, 치료는 ≥ 8 주 동안 ≥ 1.5 g/dL의 헤모글로빈에서 증가를 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 20 중에서 어느 한 항에 있어서, 환자는 치료의 시작에 앞서 하나 또는 그 이상의 혈액 세포 수혈이 투여되었던 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 21 중에서 어느 한 항에 있어서, 환자는 낮은 수혈 부담 환자인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 21 중에서 어느 한 항에 있어서, 환자는 높은 수혈 부담 환자인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 21 내지 23 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 혈액 세포 수혈 부담을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 24에 있어서, 치료는 치료의 시작에 앞서 동등한 시간에 비하여, 최소한 4 주 동안 혈액 세포 수혈을 ≥ 50% 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 24에 있어서, 치료는 치료의 시작에 앞서 동등한 시간에 비하여, 최소한 8 주 동안 혈액 세포 수혈을 ≥ 50% 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 26 중에서 어느 한 항에 있어서, 환자는 골수형성이상 증후군을 앓는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 27에 있어서, 환자는 낮음 또는 중간의 국제 예후 점수 시스템 (IPSS) 또는 IPSS-R 점수를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 28 중에서 어느 한 항에 있어서, 철적혈모구 빈혈 환자는 자신의 골수 내에 골수 적혈구 전구체의 백분율로서 최소한 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 환상 모구를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 29 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 호중구 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 30 중에서 어느 한 항에 있어서, 환자는 SF3B1에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이에 대한 시험에서 양성인 골수 세포를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 31 중에서 어느 한 항에 있어서, 환자는 DNMT3A에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이에 대한 시험에서 양성인 골수 세포를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 32 중에서 어느 한 항에 있어서, 환자는 TET2에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이에 대한 시험에서 양성인 골수 세포를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 33 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 철분 과부하를 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
치료가 필요한 개체에서 골수 장애를 치료하거나 예방하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 ActRII 길항제를 개체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 개체는 SF3B1 돌연변이에 대한 시험에서 양성인 골수 세포를 갖고, 임의선택적으로 SF3B1 유전자에서 돌연변이는 엑손, 인트론 또는 5' 또는 3' 비번역 영역 내에 있고, 임의선택적으로 SF3B1에서 돌연변이는 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 아미노산 서열에서 변화를 유발하거나 또는 아미노산 서열에서 변화를 유발하지 않고, 그리고 임의선택적으로 SF3B1 유전자에서 돌연변이는 다음의 변화에서 선택되는, 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 아미노산에서 변화를 유발하는 것을 특징으로 하는 방법: K182E, E491G, R590K, E592K, R625C, R625G, N626D, N626S, H662Y, T663A, K666M, K666Q, K666R, Q670E, G676D, V701I, I704N, I704V, G740R, A744P, D781G, A1188V, N619K, N626H, N626Y, R630S, I704T, G740E, K741N, G742D, D894G, Q903R, R1041H, I1241T, G347V, E622D, Y623C, R625H, R625L, H662D, H662Q, T663I, K666E, K666N, K666T, K700E, 그리고 V701F.
청구항 35에 있어서, 개체는 철적혈모구 빈혈, 만성 림프성 백혈병 (CLL), 그리고 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 선택되는 장애를 앓는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 35 또는 36에 있어서, ActRII 길항제의 투여는 철적혈모구 빈혈의 하나 또는 그 이상의 합병증을 치료하거나 또는 예방하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 35에 있어서, 개체는 MDS를 앓는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 38에 있어서, 개체는 환상 모구를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 35 내지 39 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 SF3B1, SRSF2, DNMT3A 및 TET2 중에서 하나 또는 그 이상에서 체성 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 38 내지 40 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 낮음 또는 중간의 국제 예후 점수 시스템 (IPSS) 또는 IPSS-R 점수를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 35 내지 41 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 자신의 골수 내에 골수 적혈구 전구체의 백분율로서 최소한 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 환상 모구를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 35 내지 42 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 하나 또는 그 이상의 EPO 수용체 효현제로 이전에 치료되었던 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 43에 있어서, 개체는 EPO 수용체 효현제에 부적당한 반응을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 43에 있어서, 개체는 EPO 수용체 효현제에 더 이상 반응하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 43 내지 45 중에서 어느 한 항에 있어서, EPO 수용체 효현제는 EPO인 것을 특징으로 하는 방법.
치료가 필요한 개체에서 MDS를 치료하거나 예방하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 ActRII 길항제를 개체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 개체는 EPO 수용체 효현제로 이전에 치료되었던 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 47에 있어서, 개체는 다음에서 선택되는 MDS의 아형을 앓는 것을 특징으로 하는 방법: 단계열 형성장애 불응성 혈구감소증 (RCUD)을 동반한 MDS; 다계열 형성장애 불응성 혈구감소증 및 환상 철적혈모구 (RCMD-RS)를 동반한 MDS; SF3B1, SRSF2, DNMT3A, 그리고 TET2 중에서 하나 또는 그 이상에서 체성 돌연변이를 동반한 MDS; ASXL1 또는 ZRSR2에서 체성 돌연변이가 없는 MDS; 철분 과부하를 동반한 MDS; 그리고 호중구감소증을 동반한 MDS.
청구항 47 또는 48에 있어서, 개체는 낮음 또는 중간의 국제 예후 점수 시스템 (IPSS) 또는 IPSS-R 점수를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 47 내지 49 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 환상 모구를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 50에 있어서, 개체는 자신의 골수 내에 골수 적혈구 전구체의 백분율로서 최소한 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 환상 모구를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 47 내지 51 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 SF3B1 유전자에서 돌연변이에 대한 시험에서 양성인 골수 세포를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 47 내지 52 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 하나 또는 그 이상의 EPO 수용체 효현제로 이전에 치료되었던 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 53에 있어서, 개체는 EPO 수용체 효현제에 부적당한 반응을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 53에 있어서, 개체는 EPO 수용체 효현제에 더 이상 반응하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 53 내지 55 중에서 어느 한 항에 있어서, EPO 수용체 효현제는 EPO인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 47 내지 56 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 적혈구 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 47 내지 57 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 ActRII 길항제 치료의 시작에 앞서 하나 또는 그 이상의 혈액 세포 수혈이 투여되었던 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 47 내지 58 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 혈액 세포 수혈 부담을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 59에 있어서, 치료는 ActRII 길항제 치료의 시작에 앞서 동등한 시간에 비하여, 4 내지 8 주 동안 혈액 세포 수혈을 50%보다 크게 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 47 내지 60 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 철분 과부하를 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 47 내지 61 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 간 철분 함량을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 47 내지 62 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 호중구 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 47 내지 63 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 급성 골수성 백혈병 (AML)으로의 전환을 지연시키는 것을 특징으로 하는 방법.
개체에서 골수 장애를 치료하거나 예방하기 위한 방법에 있어서, 효과량의 ActRII 길항제를 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 개체는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 유전자에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이에 대한 시험에서 양성인 골수 세포를 갖는 것을 특징으로 하는 방법: SF3B1, DNMT3A, 그리고 TET2.
청구항 65에 있어서, 개체는 하나 또는 그 이상의 SF3B1 돌연변이에 대한 시험에서 양성인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 66에 있어서, SF3B1 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 SF3B1 엑손 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 66 또는 67에 있어서, SF3B1 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 SF3B1 인트론 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 66 내지 68 중에서 어느 한 항에 있어서, SF3B1 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 SF3B1 5' 및/또는 3' 영역 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 66 내지 69 중에서 어느 한 항에 있어서, SF3B1 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 돌연변이된 SF3B1 유전자에 의해 인코딩된 단백질 내에서 아미노산의 결실, 부가 및/또는 치환을 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 70에 있어서, 하나 또는 그 이상의 SF3B1 돌연변이는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 유발하는 것을 특징으로 하는 방법: K182E, E491G, R590K, E592K, R625C, R625G, N626D, N626S, H662Y, T663A, K666M, K666Q, K666R, Q670E, G676D, V701I, I704N, I704V, G740R, A744P, D781G, A1188V, N619K, N626H, N626Y, R630S, I704T, G740E, K741N, G742D, D894G, Q903R, R1041H, I1241T, G347V, E622D, Y623C, R625H, R625L, H662D, H662Q, T663I, K666E, K666N, K666T, K700E, V701F, 그리고 E783K.
청구항 67에 있어서, 하나 또는 그 이상의 SF3B1 돌연변이는 엑손 14, 엑손 15 및 엑손 16으로 구성된 군에서 선택되는 SF3B1 엑손 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 65 내지 72 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 하나 또는 그 이상의 DNMT3A 돌연변이에 대한 시험에서 양성인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 73에 있어서, DNMT3A 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 DNMT3A 엑손 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 73 또는 74에 있어서, DNMT3A 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 DNMT3A 인트론 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 73 내지 75 중에서 어느 한 항에 있어서, DNMT3A 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 DNMT3A 5' 및/또는 3' 영역 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 73 내지 76 중에서 어느 한 항에 있어서, DNMT3A 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 돌연변이된 DNMT3A 유전자에 의해 인코딩된 단백질 내에서 아미노산의 결실, 부가 및/또는 치환을 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 77에 있어서, 하나 또는 그 이상의 DNMT3A 돌연변이는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 유발하는 것을 특징으로 하는 방법: R882C, R882H, P904L, 그리고 P905P.
청구항 74에 있어서, 하나 또는 그 이상의 DNMT3A 돌연변이는 엑손 10, 엑손 18 및 엑손 22로 구성된 군에서 선택되는 DNMT3A 엑손 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 73에 있어서, 하나 또는 그 이상의 DNMT3A 돌연변이는 미성숙 종결 코돈을 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 80에 있어서, 하나 또는 그 이상의 DNMT3A 돌연변이는 Y436X 및 W893X로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 65 내지 81 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 하나 또는 그 이상의 TET2 돌연변이에 대한 시험에서 양성인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 82에 있어서, TET2 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 TET2 엑손 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 82 또는 83에 있어서, TET2 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 TET2 인트론 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 82 내지 84 중에서 어느 한 항에 있어서, TET2 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 TET2 5' 및/또는 3' 영역 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 82 내지 85 중에서 어느 한 항에 있어서, TET2 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 돌연변이된 TET2 유전자에 의해 인코딩된 단백질 내에서 아미노산의 결실, 부가 및/또는 치환을 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 86에 있어서, 하나 또는 그 이상의 TET2 돌연변이는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 유발하는 것을 특징으로 하는 방법: E47Q, Q1274R, W1291R, G1370R, G1370E, N1387S, 그리고 Y1724H.
청구항 83에 있어서, 하나 또는 그 이상의 TET2 돌연변이는 엑손 1, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 그리고 엑손 9로 구성된 군에서 선택되는 TET2 엑손 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 82에 있어서, 하나 또는 그 이상의 TET2 돌연변이는 미성숙 종결 코돈을 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 89에 있어서, 하나 또는 그 이상의 TET2 돌연변이는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법: R550X, Q1009X, Y1337X, R1404X, R1516X, 그리고 Q1652X.
청구항 65 내지 90 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 빈혈을 앓는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 65 내지 91 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 바람직하지 않게 높은 수준의 내인성 EPO를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 65 내지 92 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 하나 또는 그 이상의 EPO 수용체 효현제로 이전에 치료되었던 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 93에 있어서, 개체는 EPO 수용체 효현제에 부적당한 반응을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 93에 있어서, 개체는 EPO 수용체 효현제에 더 이상 반응하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 93 내지 95 중에서 어느 한 항에 있어서, EPO 수용체 효현제는 EPO인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 65 내지 96 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 백혈병으로의 전환을 지연시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 96에 있어서, 치료는 급성 골수성 백혈병으로의 전환을 지연시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 65 내지 98 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 전백혈병 환자인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 65 내지 99 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 개체에서 적혈구 수준 및/또는 헤모글로빈 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 65 내지 100 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 ActRII 길항제 치료의 시작에 앞서 하나 또는 그 이상의 혈액 세포 수혈이 투여되었던 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 65 내지 101 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 혈액 세포 수혈 부담을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 102에 있어서, 치료는 ActRII 길항제 치료의 시작에 앞서 동등한 시간에 비하여, 4 내지 8 주 동안 혈액 세포 수혈을 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%보다 크게 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 102에 있어서, 치료는 ActRII 길항제 치료의 시작에 앞서 동등한 시간에 비하여, 4 내지 8 주 동안 혈액 세포 수혈을 약 50%보다 크게 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 65 내지 104 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 철분 과부하를 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 65 내지 105 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 간 및/또는 비장 내에 철분 함량을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
골수형성이상 증후군 (MDS) 및/또는 MDS의 하나 또는 그 이상의 합병증을 치료하거나 예방하기 위한 방법에 있어서, 효과량의 ActRII 길항제를 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 개체는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 유전자에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이에 대한 시험에서 양성인 골수 세포를 갖는 것을 특징으로 하는 방법: SF3B1, DNMT3A, 그리고 TET2.
청구항 107에 있어서, 개체는 하나 또는 그 이상의 SF3B1 돌연변이에 대한 시험에서 양성인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 108에 있어서, 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 SF3B1 엑손 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 107 또는 108에 있어서, SF3B1 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 SF3B1 인트론 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 107 내지 110 중에서 어느 한 항에 있어서, SF3B1 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 SF3B1 5' 및/또는 3' 영역 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 107 내지 111 중에서 어느 한 항에 있어서, SF3B1 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 돌연변이된 SF3B1 유전자에 의해 인코딩된 단백질 내에서 아미노산의 결실, 부가 및/또는 치환을 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 112에 있어서, 하나 또는 그 이상의 SF3B1 돌연변이는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 유발하는 것을 특징으로 하는 방법: K182E, E491G, R590K, E592K, R625C, R625G, N626D, N626S, H662Y, T663A, K666M, K666Q, K666R, Q670E, G676D, V701I, I704N, I704V, G740R, A744P, D781G, A1188V, N619K, N626H, N626Y, R630S, I704T, G740E, K741N, G742D, D894G, Q903R, R1041H, I1241T, G347V, E622D, Y623C, R625H, R625L, H662D, H662Q, T663I, K666E, K666N, K666T, K700E, V701F, 그리고 E783K.
청구항 109에 있어서, 하나 또는 그 이상의 SF3B1 돌연변이는 엑손 14, 엑손 15 및 엑손 16으로 구성된 군에서 선택되는 SF3B1 엑손 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 107 내지 114 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 하나 또는 그 이상의 DNMT3A 돌연변이에 대한 시험에서 양성인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 115에 있어서, DNMT3A 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 DNMT3A 엑손 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 115 또는 116에 있어서, DNMT3A 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 DNMT3A 인트론 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 115 내지 117 중에서 어느 한 항에 있어서, DNMT3A 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 DNMT3A 5' 및/또는 3' 영역 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 115 내지 118 중에서 어느 한 항에 있어서, DNMT3A 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 돌연변이된 DNMT3A 유전자에 의해 인코딩된 단백질 내에서 아미노산의 결실, 부가 및/또는 치환을 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 119에 있어서, 하나 또는 그 이상의 DNMT3A 돌연변이는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 유발하는 것을 특징으로 하는 방법: R882C, R882H, P904L, 그리고 P905P.
청구항 116에 있어서, 하나 또는 그 이상의 DNMT3A 돌연변이는 엑손 10, 엑손 18 및 엑손 22로 구성된 군에서 선택되는 DNMT3A 엑손 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 115에 있어서, 하나 또는 그 이상의 DNMT3A 돌연변이는 미성숙 종결 코돈을 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 122에 있어서, 하나 또는 그 이상의 DNMT3A 돌연변이는 Y436X 및 W893X로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 107 내지 123 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 하나 또는 그 이상의 TET2 돌연변이에 대한 시험에서 양성인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 124에 있어서, TET2 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 TET2 엑손 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 124 또는 125에 있어서, TET2 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 TET2 인트론 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 124 내지 126 중에서 어느 한 항에 있어서, TET2 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 TET2 5' 및/또는 3' 영역 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 124 내지 127 중에서 어느 한 항에 있어서, TET2 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상은 돌연변이된 TET2 유전자에 의해 인코딩된 단백질 내에서 아미노산의 결실, 부가 및/또는 치환을 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 128에 있어서, 하나 또는 그 이상의 TET2 돌연변이는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 유발하는 것을 특징으로 하는 방법: E47Q, Q1274R, W1291R, G1370R, G1370E, N1387S, 그리고 Y1724H.
청구항 125에 있어서, 하나 또는 그 이상의 TET2 돌연변이는 엑손 1, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 그리고 엑손 9로 구성된 군에서 선택되는 TET2 엑손 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 124에 있어서, 하나 또는 그 이상의 TET2 돌연변이는 미성숙 종결 코돈을 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 131에 있어서, 하나 또는 그 이상의 TET2 돌연변이는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법: R550X, Q1009X, Y1337X, R1404X, R1516X, 그리고 Q1652X.
청구항 107 내지 132 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 빈혈을 앓는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 107 내지 133 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 바람직하지 않게 높은 수준의 내인성 EPO를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 107 내지 134 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 하나 또는 그 이상의 EPO 수용체 효현제로 이전에 치료되었던 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 135에 있어서, 개체는 EPO 수용체 효현제에 부적당한 반응을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 136에 있어서, 개체는 EPO 수용체 효현제에 더 이상 반응하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 135 내지 137 중에서 어느 한 항에 있어서, EPO 수용체 효현제는 EPO인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 107 내지 138 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 백혈병으로의 전환을 지연시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 139에 있어서, 치료는 급성 골수성 백혈병으로의 전환을 지연시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 107 내지 140 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 개체에서 적혈구 수준 및/또는 헤모글로빈 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 107 내지 141 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 ActRII 길항제 치료의 시작에 앞서 하나 또는 그 이상의 혈액 세포 수혈이 투여되었던 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 107 내지 142 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 혈액 세포 수혈 부담을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 143에 있어서, 치료는 ActRII 길항제 치료의 시작에 앞서 동등한 시간에 비하여, 4 내지 8 주 동안 혈액 세포 수혈을 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%보다 크게 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 143에 있어서, 치료는 ActRII 길항제 치료의 시작에 앞서 동등한 시간에 비하여, 4 내지 8 주 동안 혈액 세포 수혈을 약 50%보다 크게 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 107 내지 145 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 철분 과부하를 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 107 내지 145 중에서 어느 한 항에 있어서, 치료는 간 및/또는 비장 내에 철분 함량을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 107 내지 147 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 다음에서 선택되는 MDS의 아형을 앓는 것을 특징으로 하는 방법: 단계열 형성장애 불응성 혈구감소증 (RCUD)을 동반한 MDS; 다계열 형성장애 불응성 혈구감소증 및 환상 철적혈모구 (RCMD-RS)를 동반한 MDS; SF3B1, SRSF2, DNMT3A, 그리고 TET2 중에서 하나 또는 그 이상에서 체성 돌연변이를 동반한 MDS; ASXL1 또는 ZRSR2에서 체성 돌연변이가 없는 MDS; 철분 과부하를 동반한 MDS; 그리고 호중구감소증을 동반한 MDS.
청구항 107 내지 148 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 다음에서 선택되는 국제 예후 점수 시스템 (IPSS) 점수를 갖는 것을 특징으로 하는 방법: 낮음, 중간 1, 또는 중간 2.
청구항 107 내지 149 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 환상 모구를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 150에 있어서, 개체는 자신의 골수 내에 골수 적혈구 전구체의 백분율로서 최소한 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 환상 모구를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 151 중에서 어느 한 항에 있어서, ActRII 길항제는 ActRIIA 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 152에 있어서, ActRIIA 폴리펩티드는 다음에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
a) 서열 번호:10의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:10의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
b) 서열 번호:11의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:11의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
c) 서열 번호:22의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:22의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
d) 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:26의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
e) 서열 번호:28의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:28의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 그리고
f) 서열 번호:9의 아미노산 30-110과 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:9의 아미노산 30-110의 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
청구항 1 내지 151 중에서 어느 한 항에 있어서, ActRII 길항제는 ActRIIB 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 154에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드는 다음에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
a) 서열 번호:1의 아미노산 29-109과 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:1의 아미노산 29-109의 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
b) 서열 번호:1의 아미노산 25-131과 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:1의 아미노산 25-131의 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
c) 서열 번호:2의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:2의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
d) 서열 번호:3의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:3의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
e) 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:4의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
f) 서열 번호:5의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:5의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
g) 서열 번호:6의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:6의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
h) 서열 번호:36의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:36의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
i) 서열 번호:37의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:37의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
j) 서열 번호:38의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:38의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
k) 서열 번호:49의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:49의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
l) 서열 번호:50의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:50의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
m) 서열 번호:51의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:51의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
n) 서열 번호:41의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:41의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
o) 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:44의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
p) 서열 번호:45의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:45의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 그리고
q) 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:29의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
청구항 155에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호:1에 대하여 위치 79에서 산성 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 156 중에서 어느 한 항에 있어서, ActRII 길항제는 GDF 트랩 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 152 내지 157 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 ActRII 폴리펩티드 도메인에 더하여, 생체내 반감기, 시험관내 반감기, 투여, 조직 국부화 또는 분포, 단백질 복합체의 형성, 그리고 정제 중에서 하나 또는 그 이상을 증강하는 하나 또는 그 이상의 이종성 폴리펩티드 도메인을 포함하는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 158에 있어서, 융합 단백질은 면역글로불린 Fc 도메인 및 혈청 알부민에서 선택되는 이종성 폴리펩티드 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 159에 있어서, 면역글로불린 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 159에 있어서, 면역글로불린 Fc 도메인은 서열 번호: 15 또는 16에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 158 내지 161 중에서 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질은 ActRII 폴리펩티드 도메인 및 면역글로불린 Fc 도메인 사이에 배치된 링커 도메인을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 162에 있어서, 링커 도메인은 TGGG 또는 GGG 링커인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 158에 있어서, 폴리펩티드는 다음에서 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA-Fc 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 방법:
a) 서열 번호:22의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:22의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 그리고
b) 서열 번호:28의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:28의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
청구항 158에 있어서, 폴리펩티드는 다음에서 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 방법:
a) 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:29의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
b) 서열 번호:36의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:36의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
c) 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:29의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
d) 서열 번호:38의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:38의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
e) 서열 번호:41의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:41의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
f) 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:44의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
g) 서열 번호:45의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:45의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 그리고
h) 서열 번호:51의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호:51의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
청구항 165에 있어서, ActRIIB-Fc 융합 단백질은 서열 번호:1에 대하여 위치 79에서 산성 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 152 내지 166 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 다음에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: 당화된 아미노산, 페길화된 아미노산, 파르네실화된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 비오틴화된 아미노산, 지질 모이어티에 접합된 아미노산, 그리고 유기 유도체화 작용제에 접합된 아미노산.
청구항 167에 있어서, 폴리펩티드는 당화되고 포유류 당화 패턴을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 168에 있어서, 폴리펩티드는 당화되고, 그리고 중국 햄스터 난소 세포주로부터 획득가능한 당화 패턴을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 152 내지 169 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 GDF11에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 152 내지 170 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 GDF8에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 152 내지 171 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 액티빈에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 172에 있어서, 폴리펩티드는 액티빈 A에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 172 또는 173에 있어서, 폴리펩티드는 액티빈 B에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 151 중에서 어느 한 항에 있어서, ActRII 길항제는 항-GDF11 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 151 중에서 어느 한 항에 있어서, ActRII 길항제는 항-GDF8 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 151 중에서 어느 한 항에 있어서, ActRII 길항제는 항-액티빈 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 177에 있어서, ActRII 길항제는 액티빈 A에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 177에 있어서, ActRII 길항제는 액티빈 B에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 177에 있어서, ActRII 길항제는 액티빈 A 및 액티빈 B에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 175 내지 180 중에서 어느 한 항에 있어서, ActRII 길항제는 GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP7, GDF3 및 BMP6 중에서 하나 또는 그 이상에 더욱 결합하는 다중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 151 중에서 어느 한 항에 있어서, ActRII 길항제는 항-ActRII 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 182에 있어서, 항-ActRII 항체는 ActRIIA에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 182에 있어서, 항-ActRII 항체는 ActRIIB에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 182에 있어서, 항-ActRII 항체는 ActRIIA 및 ActRIIB에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 175 내지 185 중에서 어느 한 항에 있어서, 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 175 내지 186 중에서 어느 한 항에 있어서, 항체는 단일 사슬 항체, F(ab')₂ 단편, 단일 사슬 디아바디, 탠덤 단일 사슬 Fv 단편, 탠덤 단일 사슬 디아바디, 또는 단일 사슬 디아바디 및 면역글로불린 중쇄 불변 영역 중에서 최소한 일부를 포함하는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 187 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 철적혈모구 빈혈에 대한 하나 또는 그 이상의 지지 요법을 투여하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 187 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 MDS에 대한 하나 또는 그 이상의 지지 요법을 투여하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 188 또는 189에 있어서, 지지 요법은 적혈구, 과립구 및 혈소판 중에서 하나 또는 그 이상의 수혈인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 188 내지 190 중에서 어느 한 항에 있어서, 지지 요법은 철-킬레이트화 작용제 또는 복수 철-킬레이트화 작용제를 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 191에 있어서, 철-킬레이트화 작용제 또는 복수 철-킬레이트화 작용제는 다음에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
a) 데페록사민;
b) 데페리프론; 및
c) 데페라시록스.
청구항 188 내지 192 중에서 어느 한 항에 있어서, 지지 요법은 EPO 수용체 활성체를 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 193에 있어서, EPO 수용체 활성체는 다음에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법: EPO, 에포에틴 알파, 에포에틴 베타, 에포에틴 델타, 에포에틴 오메가, 다베포에틴 알파, 메톡시-폴리에틸렌-글리콜 에포에틴 베타, 그리고 합성 적혈구생성 단백질 (SEP).
청구항 188 내지 194 중에서 어느 한 항에 있어서, 지지 요법은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 작용제를 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: G-CSF 유사체, GM-CSF 유사체, 철-킬레이트화 작용제, 헵시딘 또는 헵시딘 수용체 활성체, 레날리도미드, 탈리도미드, 포말리도미드, 아자시티딘, 데시타빈, 항흉선세포 글로불린 및 혈전모방 작용제, 히스톤 탈아세틸화효소 저해제, p38MAPK 저해제, 글루타티온 S-전달효소 π 저해제, 알렘투주맙, DNA 메틸전달효소 저해제, 그리고 히스톤 탈아세틸화효소 저해제.