TW200533745A - Methods for the preparation of lysine by fermentation of corynebacterium glutamicum - Google Patents

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Oskar Zelder
Corinna Klopprogge
Hartwig Schroeder
Patrick Kiefer
Stefan Haefner
Burkhard Kroeger
Elmar Heinzle
Christoph Wittmann
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Description

200533745 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明之特徵在於藉由解除一酵素編碼基因（即，果糖 -1，6-二磷酸酶基因）調節作用提高獲自微生物（例如，棒狀 桿菌）之精細化學品（例如，離胺酸）產量之方法。在一較佳 具體實施例中，本發明提供藉由增強1，6-二磷酸果糖酶活性 之表現來提高穀胺酸棒狀桿菌中離胺酸產量之方法。本發 明亦提供一種藉由調節碳流向草酸乙酸（oxaloacetate acid ; 0AA)之流量來生產離胺酸之新穎方法。在一較佳具 體實施例中，本發明提供藉由使用果糖或蔗糖為碳源來製 備離胺酸之方法。 【先前技術】 以工業方式生產胺基酸離胺酸已成為在經濟上具重要性 之工業製程。離胺酸在商業上係作為動物飼料補充品（乃因 其具有提高其他胺基酸吸收來提高饋料品質之能力）、用於 人類醫學（尤其作為灌注溶液成份）及用於醫藥工業。 以商業利益生產該離胺酸主要係利用革蘭氏陽性菌穀胺 酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌 (Brevibacterium flavum)及乳糖發酵短桿菌（Brevibacterium lactofermentum)(Kleemann，A.等人，「Amino Acids，」in ULLMANN’S ENCYCLOPEDIA OF INDUSTRIAL CHEMISTRY， vol. A2, pp.57-97, Weinham : VCH- Verlagsgesellschaft (1985))。 目前每年由該等生物所生產之離胺酸約為250,000噸。極多 的研究業已投入用以分離可生產更大量離胺酸之細菌突變 98368.doc 200533745 株。胺基酸生產之微生物製程中所用微生物可分成四類： 野生型菌株、營養突變株、調節突變株及營養調節突變株 (K. Nakayama 等人 5 in Nutritional Improvement of Food and Feed Proteins, M. Friedman，ed·，（1978)，pp. 649-661)。棒狀 桿菌及相關微生物之突變株能藉由直接發酵作用從便宜的 碳源（例如糖蜜、乙酸及乙醇）以廉價方式製備出胺基酸。另 外，藉由發酵作用所產生的胺基酸之立體特異性（L異構體） 使該製程較合成製程更為有利。 改進離胺酸商業生產效率之另一方法係研究離胺酸生產 與通過戊糖磷酸途徑之代謝流量間之關係。鑒於以發酵製 程生產離胺酸之經濟重要性，離胺酸合成作用之生化途徑 已廣泛研究，顯而易見的目的是為了提高所生產離胺酸之 總量並降低生產成本（評論參見Sahm #、，（1996)Αηη.Ν· Υ· Acad· Sci· 782 : 25-3 9)。使用代謝性操縱方式將葡萄糖 衍生的碳素之流量引向形成芳香族胺基酸已有某些的成就 (Flores，N.等人，（1996) Nature Biotechnol. 14 : 620-623) 〇 在細胞吸收時，葡萄糖隨著磷酸烯醇式丙酮酸 (phosphoenolpyruvate)之消耗（磷酸轉移酶系統）而磷酸化 (Malin & Bourd, (1991) Journal of Applied Bacteriology 715 5 17-523)，然後細胞可獲得葡萄糖-6-磷酸。蔗糖會藉由磷 酸轉移酶糸統（Shio 等人，（1 990) Agricultural and Biological Chemistry 54，1513-1519)及轉化酶反應（Yamamoto等人， (1986) Journal of Fermentation Technology 64, 285-291)# 化成果糖及葡萄糖-6-鱗酸。 98368.doc 200533745 在葡萄糖刀解代謝期間，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（EC I·1·14·9)與葡萄糖磷酸異構酶（EC 5·3.1·9)會競爭受質葡 萄糖6喊酉文’葡萄糖-6-鱗酸異構酶會催化 Embden Meye]：liof-parnas途徑或糖解作用之第一個反應步 驟，即轉化成果糖鱗酸之步驟，葡萄糖冬填酸脫氫酶會 催化戍糖麟酸循環氧化部分之第一個反應步驟，即轉化成 6-磷酸葡糖酸内酯之步驟。 在戊糖文循環之氧化部分中，葡萄糖_6_填酸會轉化成 核酮糖-5 -鱗酸，蕪4 g \Τ Λ W 1 稭此產生呈NADPH形式之還原等效物。當 戊糖& S文循％進一步向前進行，戊糖磷酸、己糖磷酸及丙 糖鱗酸會相互轉化。舉例而言，在核苦酸生物合成作用中 需要戊糖鱗酸（諸如，5肩酸核糖小焦填酸）。此外，5_填酸 核糖小焦磷酸亦係芳香族胺基酸及胺基酸l'组胺酸之前驅 體。NADPH在許多合成代謝性生物合成作用中係作為還原 等效物。& ’從草醯乙酸生物合成—個離胺酸分子需消耗 個NADPH刀子。因此，不管系統干擾如何，流向草驢乙 酸（〇AA)之碳素流量保持不變（J· Vallino等人，（1993)
Biotechnol. Bioeng·，41，633-646)。 【發明内容】 广本發明係以（至少部分）對穀胺酸棒狀桿菌中戊糖鱗酸途 徑之重要酵素'編碼基因（例如，果糖H鱗酸酶基因）之 發現及解除調節作用（例如，增強果糖二磷酸酶之表現 或活性）會導致離胺酸產量增加之發現為基礎。此外，咸已 發現，在離胺酸生產期間藉由解除調節作用（例如，增強果 98368.doc 200533745 糖1，6- 一 Θ酸酶之表現或活性）來增加碳產量會導致離胺 酸產量增加。在一個具體實施例中，碳素來源係果糖或蔗 糖。因此，本發明提供藉由微生物（例如，穀胺酸棒狀桿菌） 提南離胺酸產量之方法，其中果糖或蔗糖係受質。 因此，在一個態樣中，本發明係提供增加微生物中通過 戊糖磷酸途徑之代謝流量之方法，其包含在使通過戊糖磷 酸途徑之代謝流量增加之條件下培養一包含一經解除調節 基因的微生物。在一個具體實施例中，該微生物經發酵以 生成一精細化學品（例如，離胺酸）。在另一具體實施例中， 使用果糖或蔗糖作為碳素來源。在另一具體實施例中，該 基因係果糖-1，6-二磷酸酶基因。在一相關具體實施例中， 該果糖-1，6-二磷酸酶基因係衍生自棒狀桿菌，例如穀胺酸 棒狀桿菌。在另-具體實施例中，果糖]，卜二麟酸酶基因 過度表現。在另-具體實施例中，果糖」，卜二魏酶基因 所編碼之蛋白質具有增強之活性。 在另-具體實施例中，該微生物進—步包含—或多種額 外經解除調節之基因。該__或多種額外經解除調節之基因 包括（但不限於）ask基因、dapA基因、_基因、基因、 ddh基因、lysA基因、lysE基因、pycA基因、基因、 基因'gap基因、ZWal基因、tkt基因、㈣基因、叫。基因、 叫基因、Pgk基因及sigC基因。在—特定具體實施例中，該 基因係過度表現或表現不；i。而且，該經解除調節之基因 可編碼-選自由下列組成之群之蛋白f:抗反饋天冬胺酸 激酶、二氳吡啶二羧酸醋合成酶、天冬胺酸半醛脫氫酶、 98368.doc 200533745 二氫吡啶二羧酸酯還原酶、二胺基庚二酸脫氫酶、二胺義 庚二酸表異構酶、離胺酸輪出子、丙，酸羧化酶、：二: -6-磷酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油 2唐 脫虱酶、RPF蛋白質前驅體、轉酮酶、轉二羥丙酮基酶、甲 基萘酿氧化還原酶、磷酸丙糖異構酶、3_磷酸甘油酸激酶 及RNA-聚合酶σ因子sigC。在一特定具體實施例中，該蛋 白質具有增強或降低之活性。 ~ 根據本發明方法，一或多種額外經解除調節之基因亦可 包括（但不限於）pepCK基因、malE基因、glgA基因、p幻基 因、dead基因、menE基因、cltE基因、mikEn基因、 基口 zwa2基因及succ基因。在一特定具體實施例中，至 少一個基因之表現受到上調、弱化、降低、下調或抑制。 而且，經解除調節之基因可編碼一選自由下列組成之群之 蛋白質·磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、蘋果酸酶、糖原合成 酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、Ατρ依賴性RNA解螺旋酶、… 琥珀醯苯甲酸-CoA連接酶、檸檬酸裂合酶^鏈、轉錄操縱因 子、丙酮酸脫氫酶、RPF蛋白質前驅體及琥珀醯_€〇八_合成 酶。在一特定具體實施例中，該蛋白質具有降低或增強之 活性。 在一個具體實施例中，本發明方法中所用微生物屬於棒 狀桿菌屬，例如，穀胺酸棒狀桿菌。 另一態樣中，本發明係提供生成一精細化學品之方法， 其包含發酵一微生物（其中果糖-；1，6-二磷酸酶經解除調節） 及在培養基或該等微生物之細胞中積聚該精細化學品（例 98368.doc -10- 200533745 如，離胺酸），藉此生成一精細化學品。在一個具體實施例 中’该方法包括回收該精細化學品。在另一具體實施例中， 該果糖-1，6-二磷酸酶基因過度表現。在另一具體實施例 中’使用果糖或蔗糖作為碳素來源。 在一態樣中，果糖-丨，^二磷酸酶基因衍生自穀胺酸棒狀 桿菌，且其包含SED m NO : 1核苷酸序列及編碼SED ID Ν Ο . 2胺基酸序列。 從下列實施方式及申請專利範圍可顯見本發明之其他特 徵及優點。 【實施方式】 本發明至少部分係以編碼戊糖磷酸途徑必需酵素之基因 (例如，殺胺酸棒狀桿菌基因）之鑑定為基礎。本發明之特徵 係操縱一微生物（例如，穀胺酸棒狀桿菌）之戊糖磷酸生物合 成途徑，以增加碳產量及生成（例如，以增量生成）某些所需 精細化學品（例如，離胺酸）之方法。具體而言，本發明包括 藉由酵具有經解除調節（例如，增加的）之果糖_丨，6_二 每牛I酶表現或活性之微生物（例如，穀胺酸棒狀桿菌）以製備 精細化學(例如，離胺酸）之方法。在—個具體實施例中， 使用果糖或I糖作為該微生物發酵作用之碳素來源。業已 確^果糖對於從微生物製備精細化學品（例如，離胺酸） 而:係 >文力幸乂低的党質。然而，本發明提供以其中果糖 或嚴糖為又貝处微生物（例如，穀胺酸棒狀桿菌）以最佳化量 活f生的调即作用（例如，擴增）會導致通過該戊糖礙酸途徑之 98368.doc -11 - 200533745 流量更高’由此增加NADPH之產量及增加離胺酸產量。 術語「戊糖磷酸途徑」包括與精細化學品 形成或合成中所以糖磷_素（例如，生物合成酵素 基因所編碼之多肽）、化合物（例如，前驅體、受質、中間產 物或產物辅助因子及類似物有關之途徑。該戊糖鱗酸途 徑會將葡萄糖分子轉化成生化學上有用之小分子。 為使本發明更料理解，首先在此處定義某些術語。 術語「戊糖麟酸生物合成途徑」包括與形成或合成精細 化學品（例如，離胺酸）中所用戊糖鱗酸生物合成基因（例 如，生物合成酵素-編碼基因所編碼之多肽）、化合物（例如， 刖驅體、受質、中間產物或產物)、輔助因子及類似物有關 之生物合成途徑。術語「戊糖磷酸生物合成途徑」包括可 導致微生物(例如，活體内)中合成精細化學品(例如，離胺 酸）之生物合成途徑及可在活體外導致合成精細化學品（例 如，離胺酸）之生物合成途徑。術語「戊糖磷酸生物合成途 徑蛋白質」或「戊糖磷酸生物合成途徑酵素」包括彼等直 接或間接與戊糖磷酸生物合成途徑有關之肽、多肽、蛋白 質、酶及其片段，例如果糖-1，6-二磷酸酶。 術語「戊糖磷酸生物合成途徑基因」包括彼等編碼直接 或間接與戍糖磷酸生物合成途徑有關之肽、多肽、蛋白質 及酶的基因及基因片段，例如果糖_丨，6_二磷酸酶基因。 術語「胺基酸生物合成途徑基因」係指彼等編碼直接與 胺基酸合成有關之肽、多肽、蛋白質及酶的基因及基因片 段，例如果糖-1，6-二磷酸酶基因。該等基因與彼等天然存 98368.doc -12- 200533745 在於値主細胞内且與宿主細胞内任何胺基酸（尤其是離胺 酸）之合成有關之基因完全相同。 術語「離胺酸生物合成途徑基因」包括彼等編碼直接與 離胺酉夂合成有關之肽 '多肽、蛋白質及酶的基因及基因片 段例如果糖-1，6-二磷酸酶基因。該等基因與彼等天然存 在於佰主細胞内且與宿主細胞内離胺酸之合成有關之基因 兀王相同。另一選擇為，此等基因可經修飾或突變，例如， 3等基因可含有不會明顯影響經編碼蛋白質生物活性之修 飾或突變。舉例而[天然基因可藉由誘變或藉由引入或 取代一或多個核苷酸或藉由移除基因之非必需區加以修 飾。此等修飾可以標準技術輕易達成。 術語「離胺酸生物合成途徑蛋白質」係指包括彼等直接 ”離fee酉夂口成有關之月太、多狀、蛋白質、酶及其片段。該 等蛋白貝與彼等天然存在於宿主細胞内且與宿主細胞内離 胺酸之合成有關之蛋白質完全相同。另一選擇為，此等蛋 :吳：經修飾或突t，例如，該等蛋白質可含有不會明顯 p S忒蛋白貝生物活性之修飾或突變。舉例而言，天然蛋 白貝可藉由誘變或藉由引人或取代_或多個胺基酸（較佳 藉由保守胺基酸取代）或藉由移除蛋白質之非必需區加以 ㈣。此等㈣可以標準技術輕易達成。另_選擇為，離 =酸生物合成蛋白f對該特定宿主細胞而言為異源蛋白 貝此等蛋白質可來自任何具有編碼具相同或類似生物合 成作用的蛋白質之基因之生物。 桁^妷流$」係指相對於競爭途徑所進行的一特定代 98368.doc 200533745 謝途徑之葡萄糖分子數。具體而言，在微生物内所增加的 NADPH可藉由改變該生物之糖解作用與戊糖構酸途徑間 之碳流量分佈達成。 「果糖-1，6-二磷酸酶活性」包括任何由果糖，6_二磷酸 酶蛋白質、多肽或核酸分子施加之活性，其係根據標準技 術於活體内或活體外測定。果糖-1，6-二磷酸酶與多種不同 代謝途徑有關且存在於大多數生物體中。果糖4，6-二磷酸 酶活性較佳包括將果糖丨，6_二磷酸水解成果糖6_磷酸之催 化作用。 術語「精細化學品」已為熟諳此項技藝者所熟知，且其 包括應用於各種工業（諸如，但不限於醫藥、農業及化妝品 工業）上之生物體所產生之分子。此等化合物包括有機酸（例 如酒石酸、衣康酸及二胺基庚二酸）、蛋白原胺基酸及非蛋 白原胺基酸二者、嘌呤及嘧啶鹼基、核苷及核苷酸（例如， 如 Kuninaka，A· (1996) Nucleotides and related compounds， ρ· 561-612, in Biotechnology vol· 6, Rehm等人編輯 VCH : Weinheim及其中所含參考文獻所述）、脂質、飽和及不飽和 脂肪酸二者（例如，花生四烯酸）、二醇（例如，丙二醇及丁 二醇）、碳水化合物（例如，透明質酸及海藻糖）、芳香族化 合物（例如，芳香胺、香草醛及靛青）、維他命及輔助因子（如 Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，vol. A27, 「Vitamins」，p. 443.613 (1996) VCH : Weinheim及其中的 參考文獻；及 Ong，A.S·，Niki，Ε· & Packer，L· (1995) 「Nutrition，Lipids，Health，and Disease」 Proceedings of 98368.doc -14- 200533745 the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia，and the Society for Free Radical Research-Asia，1994年 9 月 1-3 日，舉行地點 Penang，Malaysia， AOCS Press，（1995)中所述）、酶、多肽（Cane 等人（1998) Science 282 : 63-68)及所有其他如 Gutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation， ISBN : 0818805086及其中的參考文獻所述之化學品。某些該等精 細化學品之代謝作用及用途將在下文中進一步詳細闡述。 胺基酸代謝及用途 胺基酸包含所有蛋白質之基本結構單位，因此其對於所 有生物體中的正常細胞機能而言必不可少。術語「胺基酸」 已為熟諳此項技藝者所熟知。蛋白原胺基酸有20種，其用 作蛋白質之結構單位，在蛋白質中它們以肽鍵連接，而非 蛋白原胺基酸（已知有成百上千種）通常不存於蛋白質中（參 見 Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，vol· A2，ρ· 5 7-97 VCH ·· Weinheim (1985))。胺基酸可呈 D-或L-光學構 型，但在天然存在蛋白質中通常僅含有L-胺基酸類型的胺 基酸。20種蛋白原胺基酸中每一胺基酸之生物合成及降解 途徑在原核及真核細胞二者中皆已有良好說明（參見，例 如，Stryer，L· Biochemistry，第 3版，578-590 頁（1988))。「必 需」胺基酸（組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺 酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色胺酸及纈胺酸）之所以如此命名 是因為該等胺基酸通常因其生物合成複雜性而成為營養需 求，其藉由簡單生物合成途徑可輕易地轉變為剩餘11種「非 98368.doc -15- 200533745 必需」胺基酸（丙胺酸、精胺酸、天門冬醯胺、天冬胺酸、 半胱胺酸、穀胺酸、穀胺醯胺、甘胺酸、脯胺酸、絲胺酸 及酪胺酸）。高等動物確實能保留合成某些該等胺基酸之能 力，但必需胺基酸則必須由飲食供應以確保正常的蛋白質 合成作用。 除在蛋白質生物合成中之功能外，該等胺基酸本身即係 令人感興趣之化學品，且已發現，許多胺基酸在食品、饋 料、化學品、化妝品、農業及醫藥工業中之有多種應用。 不僅對人類營養，而且對單胃動物（例如家禽及豬）營養而 言，離胺酸亦係一重要胺基酸。穀胺酸最常用作矯味添加 劑（穀胺酸單納鹽（mono-sodium glutamate ; MSG))，且廣泛 用於整個食品工業中，天冬胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸及半 胱胺酸亦如此。甘胺酸、L_甲硫胺酸及色胺酸皆可用於醫 藥工業中。穀胺醯胺、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、組胺 酸、精胺酸、脯胺酸、絲胺酸及丙胺酸皆可用於醫藥及化 妝品工業二者中。蘇胺酸、色胺酸及D/L-甲硫胺酸皆係常 用飼料添加劑。（Leuchtenberger，W. (1996) Amino aids-technical production and use，ρ· 466-502 in Rehm等人 (eds.)Biotechnology vol. 65 chapter 14a? VCH Weinheim) ° 另外，已發現，該等胺基酸可作為合成性胺基酸及蛋白質 合成作用之前驅體，例如，N-乙醯基半胱胺酸、S-羧甲基 -L -半胱胺酸、（S)-5 -經基色胺酸及其他闡述於Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A25 p. 57-97, VCH : Weinheim，1985 中者。 98368.doc -16- 200533745 5玄等天然胺基酸在能生成其之生物體（例如細菌）中之生 物合成作用已有良好說明（關於細菌胺基酸生物合成及其 口周節之汗論’參見Umbarger，Η.Ε·(1978) Ann. Rev. Biochem· 47 · 533-6〇6)。藉由^酮戊二酸（其係擰檬酸循環之中間產 物）之還原胺化作用可合成穀胺酸。穀胺醯胺、脯胺酸及精 月女fee中任一者隨後皆可從穀胺酸製備之。絲胺酸之生物合 成作用係為三步驟過程，由3-磷酸甘油酸（糖解作用之中間 產物）開始’在氧化反應、轉胺反應及水解步驟後可產生該 胺基酸。半胱胺酸及甘胺酸二者皆可自絲胺酸產生；前者 可藉由高半胱胺酸與絲胺酸之縮合反應產生，後者可藉由 絲胺酸轉羥曱基酶催化之反應中將側鏈心碳原子轉移至四 氫葉酸而產生。苯丙胺酸及酪胺酸係以9-步驟生物合成途 控從糖解作用及戊糖磷酸途徑的前驅體赤蘚糖4-麟酸及填 酸稀醇式丙酮酸合成的，其僅在預苯酸（prephenate)合成作 用後之最終兩步驟不同。色胺酸亦可從該等兩個起始分子 合成，但其合成係為11-步驟途徑。酪胺酸亦可由苯丙胺酸 經化酶催化反應中從苯丙胺酸合成。丙胺酸、纈胺酸及白 胺酸皆為丙酮酸（糖解作用之最終產物）之生物合成產物。天 冬胺酸可從草醯乙酸（檸檬酸循環之中間產物）生成。天門冬 驗胺、甲硫胺酸、蘇胺酸及離胺酸任一者皆可藉由轉化天 冬胺酸而產生。異白胺酸係從蘇胺酸生成。組胺酸的生成 係從一活化糖（5-磷酸核糖-1-焦磷酸）以複雜的9-步驟途徑 生成的。 超出細胞蛋白質合成需要量之胺基酸不能儲存起來，相 98368.doc -17- 200533745 反其受到降解以提供細胞主要代謝途徑之中間產物（評論 參見 Stryer，L. Biochemistry 3rd ed· Ch. 21「Amino Acid Degradation and the Urea Cycle」p. 495-516 (1988))。儘管 細胞能將不需要之胺基酸轉化成有用的代謝中間產物，但 就a成其所茜的能I、说驅體分子及酶而言，胺基酸的生 產成本很面。故，胺基酸生物合成可藉由反饋抑制調節並 不令人吃驚，其中特定胺基酸之存在可用於減緩或完全阻 止/、自身之生成（有關胺基酸生物合成途徑中反饋機制之 評論，參見 Stryer，L· Biochemistry，3rd ed. Ch. 24 : 「Biosynthesis 〇f Amino Acids and Heme」p. 575-600 (1988))。故，任何特定胺基酸之產量皆受細胞中所含該胺 基酸之量之限制。 維他命、辅助因子及營養保健品代謝及用途 維他命、輔助因子及營養保健品包含另一類分子，高等 動物已喪失合成該等分子之能力且因此必須攝取之，但是 其他生物體（例如細菌）則可輕易地合成該等分子。該等分子 本身係生物活性物質，或者係在各種代謝途徑中可作為電 子載體或中間產物之生物活性物質之前驅體。除其營養價 值外，該等化合物亦具重要工業價值，可用作著色劑、抗 氧化劑及催化劑或其他加工助劑。（有關該等化合物結構、 活f生及工業應用之评論，參見（例如）川匕抓，8 EnCycl〇pedia of Industrial Chemistry，「Vltamins」ν〇1· A27, p 443-613, VCH: Weinheim，1996.)。術語「維他命」已為熟諳此項技 藝者所熟知，其包括一為生物體執行正常機能所需但該生 98368.doc -18- 200533745 物體自身不能合成之營養素。維他命類包括輔助因子及營 養保健品化合物。詞語「輔助因子」包括正常酶活性出現 所需之非蛋白原化合物。此等化合物為有機物或無機物； 本發明之辅助因子分子較佳為有機物。術語「營養保健品」 包括在植物及動物（尤其是人類）中具健康益處之營養補充 品。此等分子之實例為維他命、抗氧化劑，且其亦包含脂 質（例如，多元不飽和脂肪酸）。 該等分子在能產生其之生物體（例如細菌）中之生物合成 作用大多已有說明（Ullman’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，1" Vitamins」vol_ A27, 443-613，VCH: Weinheim， 1996 ; Michal，G· (1999) Biochemical Pathways ·· An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons ; Ong，A.S·，Niki，E. & Packer，L. (1995)「Nutrition，Lipids， Health, and Disease 」 Proceedings of the UNESCO/Confe derati on of Scientific and Technological Associations in Malaysia，and the Society for Free Radical Res ear ch-Asia，19 94年 9 月 1 - 3 日，舉行地點 Penang，Malaysia， AOCS Press : Champaign，IL X，374 S) 〇 硫胺素（維他命：^)係藉由嘧啶與噻吩部分之化學偶合所 產生的。核黃素（維他命B2)係從鳥嘌呤核苷-5’-三磷酸（GTP) 及核糖-5’-磷酸合成。核黃素又可用於合成黃素單核苷酸 (FMN)及黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD)。統稱為「維他命B6」 之化合物家族（例如吡哆素、吡哆胺、吡哆醛-5^磷酸及商 業上所用之鹽酸吡哆素）皆係通用結構單位5-羥基-6-甲基 98368.doc -19- 200533745 吡啶之衍生物。泛酸（Pantothenate，pant〇themc acid，， (R)-(+)-N-(2,4-一髮基- 3,3-一甲基_!_氧代丁基）—心丙胺酸） 可藉由化學合成作用或藉由發酵作用產生。泛酸生物合成 之最終步驟由ATP驅動的心丙胺酸與泛解酸之縮合反應組 成。負責轉化成泛解酸、心丙胺酸之生物合成步驟之酵素 及負責縮合成泛酸之酵素係為吾人所熟知。泛酸之代謝活 性形式係輔酶A，其生物合成作用以5個酵素性步驟進行。 泛酸、吡吟醛-5，-磷酸、半胱胺酸及Ατρ係辅酶a之前驅體。籲 該等酵素不僅會催化泛酸之生成，而且可催化（幻_泛解酸、 (R)-泛内酯、（R)-泛醇（維他命原Bs)、泛醯巯基乙胺（及其衍 生物）及辅酶A之形成。 在生物中，生物素《鈾驅體分子庚二酿基_C〇A之生物 合成作用已經詳細研究，並已鑑定出數種所涉及的基因。 已1¾見°午夕對應蛋白質亦與Fe-蔟合成作用有關，且其係 nifS颂蛋白質之成員。硫辛酸衍生自辛酸，其在能量代謝中 係作為輔酶，在能量代謝中其成為丙酮酸脫氫酶複合物及 _ 仏酉同戊二酸脫氫酶複合物之—部分。葉酸類化合物_則 係類全為葉酸（folic acid)衍生物的物質，葉酸又衍生自 ί女酉文Ρ-月女基本甲酸及6-甲基蝶吟。葉酸及其衍生物 之生物合成由代謝中間產物鳥嘌呤核苷-5，-三磷酸（GTP)、 . L-穀胺酸及卜胺基_苯甲酸開始，該生物合成已在某些微生 物中經詳細研究。 類咕啉（例如鈷胺素及尤其維他命U及紫菜鹼屬於一類 特彳政為四吡咯環系統之化學品。維他命Β η之生物合成十分 98368.doc -20- 200533745 複雜以致目前尚無法徹底說明，但許多有關的酵素及受質 目前是已知的。 煙酸（nicotinic acid (nicotimate))及煙醯胺係喷σ定衍生 物’其亦被稱做「尼克酸」。尼克酸係重要輔酶NAD (煙醯 胺腺嘌呤二核苷駿）及NADP(煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸） 及其還原形式之前驅體。 儘管亦可以大規模培養微生物產生某些該等化學品，例 如核黃素、維他命B6、泛酸及生物素，但大規模生產該等 化合物仍極需依賴於無細胞的化學合成，僅有維他命B12係 單獨靠發酵作用產生，因其合成極為複雜。活體外方法需 要大量投入原料及時間，這通常花費巨大。 嘌呤、嘧啶、核苷及核苷酸代謝及用途 嘌呤及嘧啶代謝基因及其對應蛋白質係腫瘤疾病及病毒 感染療法之重要標靶。詞語「嘌呤」或「嘧啶」包括含氮 鹼基，其係核酸、輔酶及核苷酸之組份。術語「核普酸」 包括核酸分子之基本結構單位，其係由含氮鹼基、戊糖（在 RNA之狀況下，該糖係核糖；在DNA之狀況下，該糖係D-脫氧核糖）及磷酸組成。詞語「核苷」包括作為核苷酸前驅 體之分子，但其缺少核苷酸所具有之磷酸部分。藉由抑制 該等分子之生物合成或藉由抑制其形成核酸分子，可抑制 RNA及DNA合成；藉由以針對癌細胞之方式抑制該活性， 可抑制腫瘤細胞之分裂及複製能力。另外，有些核苦酸不 會形成核酸分子，而是作為能源庫（即，AMP)或作為輔酶 (即，FAD及NAD)之用。 98368.doc -21 - 200533745 數種出版物已闡述該等化學品藉由影響嘌呤及/或嘧啶 代謝於醫學適應病中之用途（例如Christopherson，R.I·及 Lyons，S.D· (1990)「Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents.」Med. Res_ Reviews 10 ·· 505-548)。有關嗓呤及1^密σ定代謝之酵素之 研究係集中於作為（例如）免疫抑制劑或抗增生劑之新藥開 發上（Smith，J.L·，（1995)「Enzymes in nucleotide synthesis.」 Curr. Opin. Struct. Biol. 5 ^ 752-757; (1995) Biochem Soc. Transact. 23 : 877-902)。然而，嗓吟及，咬驗基、核苷及 核苷酸具其他用途：作為數種精細化學品生物合成之中間 體（例如，硫胺素、S-腺苷甲硫胺酸、葉酸類化合物或核黃 素）、作為細胞之能量載體（例如ATP或GTP)，且化學品本身 通常用作增味劑（例如IMP或GMP)或用於數種醫學應用中 (參見，例如，Kuninaka，A. (1996) Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology vol. 6，Rehm等人，eds. VCH : Weinheim，p. 561 -612)。此夕卜，與σ票吟、°密咬、核苦或核皆 酸代謝有關之酵素逐漸地被用作靶物來開發用以保護作物 之化學品，該等化學品包括殺真菌劑、除草劑及殺蟲劑。 已說明該等化合物在細菌中之代謝（評論參見（例如） Zalkin，Η.及 Dixon，J.E. (1992)「de novo purine nucleotide biosynthesis」，in ·· Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology，vol. 42，Academic Press :，p. 259-287 ; 及 Mi chal，G. (1 99 9)「Nucleotides and Nucleosides」，Chapter 8 in * Biochemical Pathways · An Atlas of Biochemistry and 98368.doc -22- 200533745
Molecular Biology，Wiley : New York)。噪呤代謝已成為密 集研究之目標，其對於細胞執行正常功能而言必不可少。 高等動物中嘌呤代謝受損會導致嚴重疾病，例如痛風。嗓 " 呤核苷酸可自下述合成：由核糖-5-磷酸開始，在通過中間 體化合物肌苷-5匕磷酸（IMP)之一系列步驟中，產生鳥普_5，_ 單磷酸（GMP)或腺苷-5’-單磷酸（AMP)，自該化合物可容易 地生成作為核苷酸之三磷酸鹽形式。該等化合物亦可用作 能源庫，如此其降解作用可提供細胞中多種不同生化過程 _ 能量。嘧啶生物合成從核糖-5-磷酸生成尿苷_5，_單構酸 (UMP)開始。UMP又可轉化為胞苷_5’_三磷酸（CTp)。所有 該等核苷酸之脫氧形式皆可在自核苷酸之二磷酸核糖形式 至核苷酸之二磷酸脫氧核糖形式的一個還原反應步驟中產 生。鱗酸化後’該等分子能參與DNA合成。 海藻糖代謝及用途 海澡糖係由兩個葡萄糖分子以1，丨鍵連接組成。其通 常在食品工業中作為甜味劑，在乾燥或冷凍食品及飲料中 籲 作為添加劑之用。然而，其亦可用於醫藥、化妝品及生物 技術工業中（參見，例如，Nishimoto等人，（1998)美國專利 t % 5?759561〇#u ； Singer, M.A.^ Lindquist, S.(1998) Trends
Biotech. 16 : 460-467 ; Paiva，C.L.A.及 Panek，A.D· (1996)
Biotech· Ann。Rev· 2 : 293_314 ;及 M (i997) j
Japan 172 · 97-102)。海藻糖可由取自多種微生物之酶產生 且可谷易地釋放至周圍培養基中，使用此項技術中習知方 法可自該等培養基中收集海藻糖。 98368.doc •23- 200533745 ι·重組微生物及用以培養微生物以獲得一精細化學品之方 法 本發明方法之特徵在於微生物（例如，重組微生物），其 較佳包括本文所述載體或基因（例如，野生型及/或突變基因 及/或以可導致產生一所需精細化學品（例如，離胺酸）之培 養方式。術語「重組」微生物包括經遺傳學改變、修飾或 改這（例如，运傳改造）之微生物（例如，細菌、酵母細胞、 真菌細胞等），與所源自之天然存在微生物相比，其顯示經 改變、修飾或不同之基因型及/或表現型（例如，當遺傳修飾 影響微生物之編碼核酸序列時）。本發明之「重組」微生物
較佳經遺傳改造，以使其過度表現至少_個本文所述細菌 基因或基因產物，較佳為包含於本文所述重組載體中之生 物合成酵素'編碼基因（例如，果糖^二鱗酸酶基因⑷ 或從重組賴所表現之生物合成料㈣。，果糖·1，6-二碟 酸酶)。熟諳此項技術者應瞭解，表現或過度表現基因產物
^ U生物會由於編碼該基因產物之核酸序列及/或基因之 表現或過度表現而產生或超量產生哕 體實施例中，該重組微生物以物。在—個具 果糖活性。日強之生物合成酵素（例如， 在本發明之某此且體眚 美因…广 例中’除了果糖-1，6-二磷酸 基因或酵素外，至少一個其4、 千α夂 辦強L d Α 土 或蛋白質可經解除調節， 曰強L-fe基酸之生成。舉例而言， 一 解作用抵 物曰成途控（例如， 解作用、糖回補、檸檬酸循 屮、々甘η 衣戊糖碟酸循環、胺基酴 出）之基因或酵素可經解除 女基酉欠 即另外，調節性基因或蛋 98368.doc -24- 200533745 質可經解除調節。 在各種具體實施例中，可增強基因之表現以增強由該基 因所編碼之蛋白質之細胞内活性或濃度，藉此最終提高所 需胺基酸之生成。熟諳此項技術者可使用各種技術來達成 所需結果。舉例而言，熟諳此項技術者可增加基因之拷貝 數，使用一有效啟動子，及/或使用一用於編碼對應具高活 性酶之基因或等位基因。使用本發明之方法（例如，過度表 現一特定基因），以起始活性或濃度計，對應蛋白質之活性 或濃度可增加至少約10%、25%、50%、75%、100%、150%、 200%、300%、400%、500%、1000%或 2000% ° 在各種具體實施例中，該經解除調節基因包括（但不限於） 至少一個下列基因或蛋白質： •編碼抗反饋天冬胺酸激酶之ask基因（如國際公開案第 W02004069996號中所揭示）； •編碼二氫吼唆二羧酸g旨合成酶之dapA基因（如國際公 開案第W0200100843號中之SEQ ID NOs : 55及56中分別所 揭示）； •編碼天冬胺酸半醛脫氫酶之asd基因（如歐洲公開案第 1 108790號中之SEQ ID NOs : 343 5及6935中分別所揭示）； •編碼二氫吡啶二羧酸酯還原酶之dapB基因（如國際公 開案第W0200100843號中之SEQ ID NOs : 35及36中分別所 揭示）； •編碼二胺基庚二酸脫氫酶之ddh基因（如歐洲公開案第 1 108790號中之SEQ ID NOs : 3444及6944中分別所揭示）； 98368.doc -25- 200533745 •編碼二胺基庚二酸表異構酶之lysA基因（如歐洲公開案 第1108790號中之SEQ ID NOs: 3451及6951中分別所揭示）； •編碼離胺酸輸出之lysE基因（如歐洲公開案第1 108790 號中之SEQ ID NOs : 3455及6955中分別所揭示）； •編碼丙酮酸羧化酶之pycA基因（如歐洲公開案第 1108790號中之SEQ ID NOs ·· 765及4265中分別所揭示）； •編碼葡萄糖-6-填酸脫氫酶之zwf基因（如國際公開案第 W0200100844號中之SEQ ID NOs ·· 243及244中分別所揭 示）； •編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶之pepCL基因（如歐洲公 開案第1108790號中之SEQ ID NOs: 3470及6970中分別所揭 7F )， •編碼甘油醛-3-鱗酸脫氫酶之gap基因（如國際公開案第 W0200100844號中之SEQ ID NOs : 67及68中分別所揭示）； •編碼RPF蛋白質前驅體之zwal基因（如歐洲公開案第 1108790號中之SEQ ID NOs : 917及4417中分別所揭示）； •編碼轉嗣酶之tkt基因（如國際公開案第WO200100844 號中之SEQ ID NOs : 247及248中分別所揭示）； •編碼轉二經丙酮基酶之tad基因（如國際公開案第 W0200100844號中之SEQ ID NOs ·· 245及246中分別所揭 示）； •編碼甲基萘醌氧化還原酶之mqo基因（如國際公開案第 W0200100844號中之SEQIDN〇s:569及 5 70 中分別所揭 示）； 98368.doc -26- 200533745 •編碼鱗酸丙糖異構酶之tpi基因（如國際公開案第 W020〇l〇〇844號中之SEQ ID NOs : 61及62中分別所揭卞）· •編碼3-填酸甘油酸激酶之pgk基因（如國際公開案第 W0200100844號中之SEQ ID NOs : 69及70中分別所揭示）· •編碼RNA-聚合酶σ因子sigC之sigC基因（如歐洲公開案 第1108790號中之SEQ ID NOs : 284及3784中分別所揭示） 在特定具體實施例中，基因係過度表現及/或蛋白質之活 性係增強的。 或者，在其他具體實施例中，基因之表現係經弱化、降 低或抑制，以降低（例如，消除）該基因所編碼之蛋白質之細 胞内活性或濃度，藉此可最終提高所需胺基酸之生成。舉 例而言，熟諳此項技術者可使用一弱啟動子。另一選擇為 或與弱啟動子之使用相組合，熟諳此項技術者可使用一可 或者編碼相應具低活性之酶或者滅活相應基因或酶的基因 或等位基因。使用本發明之方法，對應蛋白質之活性或濃 度可降至為野生型蛋白質之活性或濃度的約〇至$ 〇 %、〇至 25%、〇至 1〇%、〇至 9%、〇至 8%、0至 7%、〇至 6%、〇至 5〇/〇、 0至4%、〇至3%、〇至2%或0至1%。 在某些具體實施例中，該經解除調節基因包括（但不限於） 至少一個下列基因或蛋白質： •編碼磷酸稀醇式丙酮酸魏激酶之pepCK基因（如國際公 開案弟W0200100844號中之SEQ ID NOs : 179及180中分別 所揭不）； •編碼蘋果酸酶之mal E基因（如歐洲公開案第11〇879〇號 98368.doc -27- 200533745 中之3£(^10!^〇5:3 328及3 828中分別所揭示）； •編碼糖原合成酶之glgA基因（如歐洲公開案弟11 〇 號中之SEQIDNOs: 1239及4739中分別所揭示）； •編碼葡萄糠-6-磷酸異構酶之pgi基因（如國際公開案第 W0200100844號中之SEQ ID NOs : 41 及 42中分別所揭710 ’ •編碼ATP依賴性RNA解螺旋酶之dead基因（如歐洲公開 案第 1108790號中之 SEQ ID NOs : 1278及4778中分別所揭 不）， •編碼〇-琥拍醯苯甲酸-CoA連接酶之menE基因（如歐洲 公開案第1108790號中之SEQ ID NOs : 505及4005中分別所 揭示）； •編碼檸檬酸裂合酶/3鏈之citE基因（如國際公開案第 W0200100844號中之SEQ ID NOs : 547及548中分別所揭 示）； •編碼轉錄操縱因子之mikE 1 7基因（如歐洲公開案第 1108790號中之SEQ ID NOs : 411及3911中分別所揭示）； •編碼丙酮酸脫氫酶之poxB基因（如國際公開案第 W0200100844號中之SEQ ID NOs : 85及86中分別所揭示）； •編碼RPF蛋白質前驅體之zwa2基因（如歐洲公開案第 1106693號中所揭示）；及 •編碼破珀醯-CoA-合成酶之sucC基因（如歐洲公開案第 1 10361 1號中所揭示）。 在特定具體實施例中，該基因之表現係經弱化、降低或 抑制及/或該蛋白質之活性係降低的。 98368.doc -28 - 200533745 「&操縱微生物」包括經改造（例如，遺傳改造）或 修錦之微生物，導致代謝途徑中斷或改變，藉此引起碳代 謝的改變。當醢I & 酵素在代谢改造細胞中以高於其在對應野生 型細胞中之表j貝匕i本 ^ 「、 現水千表現時，則該酶在該代謝改造細胞中 係過度表現」。在不以内源性方式表現特定酵素之細胞 中貝κ心為任何該酵素在細胞中之表現水平係為了本發明 目的之該料「過度表現」。過度表現會導致該基因所編碼 之蛋=之活性增強’例如，果糖·1,6·:碟酸酶。 此寺微生物之修飾或改造可根據任何本文所述方法達 成’包括解除（但不限於）生物合成途徑之調節仙及/或過 度表現至少-個生物合成酵素。「經操縱」酵素(例如，「經 #縱」生物合成酵素）包括其表現或生成與相應野生型或天 ㈣在的酵素相比已經改變或經修飾，以使該酵素之至少 —個上游或下游前驅體、受質或產物經改變或經修飾（例 如’具經增強之活性）的酵素。 :語二經過度表現」5戈「過度表現」包括以高於該微生 物細縱别或在尚未受到操縱之對應微生物中之表現水平來 ^現基因產物（例如’戊糖礙酸生物合成酵素）。在一個具體 實施例中’該微生物係在遺傳層次上受到操縱（例如，遺傳 M W高於㈣生物操縱前或在尚未受到操縱之對應微 生物中之表現水平來過度表現基因產物。 心 ^傳刼縱包括（但 限於)改變或修飾與特定基因表現相關之調節序列或位 例如，藉由加入強啟動子、誘導型啟動子或多啟動子或 猎由移除調節序列以使表現作用成為常態型）、修飾特定美 98368.doc -29- 200533745 =:!::::、改變與特定基因(例如-核糖體結合位點 =;=接之核酸序列、增加特定基因之拷貝數、 蛋白質(例如，調節蛋白、抑制因…之轉澤有關之 =:類)或任何其他該項技術中習知可解除調節特 : 現之方法(包括(但不限於)使用反義核酸分子(例 如）以阻斷抑制子蛋白質之表現）。 在另—具體實施例中，該御庄 縱方式以高於該微生物操縱 物叮I 基因產物過度表現。舉例而言，微生 物轉广增加特定基因轉錄及/或特定基因產 或在該試劑存在下培養明強或提高轉 A因轉奸一選擇為，微生物可於經選擇可增加特定 定基因產物轉譯之溫度下培養以增強或
敌Ν轉錄及/或轉譯。 A 微：：「經解除調節”戈「解除調節」包括在微生物中改 》飾至少一個可編碼生物合成途徑中的酵素之基因， :使該微生物中生物合成酵素之水平或活性改變或受到修 二個可編碼生物合成途徑中的酵素之基因較佳經 ㈣’以使該基因產物經增強或提高，藉此增強 包二;物之活性。用語「經解除調節之途徑」亦 σ 、徑’其中不止-種可編碼生物合成途徑中 ==經改變或經修飾’以使不止一種生物合成酵素 之水干或活性改變或受到修飾。在微生物中「解除調節」 98368.doc -30. 200533745 途# (例如，在一給定生物人忐 物口成述徑中同時解除調節不止一 種基因）之能力源自微生物 初之特疋現象，其中不止一種酵素 (Γ如’兩或三種生物合成酵素）可由在被稱做「操縱子」之 遠傳材料連續片段上彼此相鄰之基因編碼。 術語「操縱子」包括-基因表現之協同單位，其包含一 啟動子且可能包含一與_或多 乂夕種（車乂佳至少兩種）結構基因 (例如，基因編碼酶舉例而士 B生物δ成酵素）相關之調節因 子。結構基因之表現可铖協问％ a 、協同凋即，例如，藉由調節蛋白 質與調節因子結合或藉由轉錄之抗終止作用。可轉錄結構 基因以獲得-可編碼所有結構蛋白質之單細财。由於包 含於一操縱子中之基因之協同調節，改變或修飾單個啟動 子及/或調節因子可導致由該操縱子編碼之每—基因產物 皆改變或受到修飾。改變或修飾調節因子可包括（但不限於） 移除内源性啟動子及/或調節因子，添加強啟動子、誘導型 動子或夕啟動子或移除調節序列以修飾使該基因產物之 表現’修飾該操縱子之染色體位點，改變毗鄰該操縱子或 在該操縱子内的核酸序列（例如，—核㈣結合㈣ 操縱子之拷貝數’㈣與該操縱子轉錄及/或該操縱子美因 產物轉譯有關之蛋白質（例如，調節蛋白f、抑制因子、增 強子、轉錄激活因子及諸如此類）或任何其他該項技術中^ 知可解除調節基因表現之方法（包括（但不限於）使用反義核 酸分子（例如）以阻斷抑制子蛋白f之表現）。解除調節 涉及改變一或多藉其4 μ 〇； r— 土口之編碼區，從而產生（例如）一抗反铲 或具更高或更低比活性之酶。 貝 98368.doc -31 - 200533745 -特別佳之本發明Γ重組」微生物已經遺傳改造以過度· 表現一衍生自細菌之基因或基因產物。術語「衍生自細菌 之」或行生自」（例如）細菌包括一天然存在於細菌中之基 因或一可由一細菌基因編碼（例如，由果糖-1，6-二磷酸酶編 碼）之基因產物。 本叙月方法之特徵為重組微生物，其可過度表現一或多 種基因（例如丨糖-二填酸酶基因）或具有增加或增強之 果糖:1，6_二磷酸酶活性。—特佳之本發明之重組微生物（例 如’毅胺酸棒狀桿菌（c〇rnynebacterium咖匕耐腿）、醋穀 胺酸棒狀桿菌（C〇rynebaeterium aeetQglutamieum)、嗜乙酿 ^酉夂棒狀桿菌（c〇rynebacterium acet〇acid〇卿謂）及高溫 胺基化棒狀桿菌（Corynebacterium thermoaminogenes)等）已 經遺傳改造以過度表現—生物合成酵素（例如果糖-二 辑-夂酶SEQ ID NO : 2之胺基酸序列或由SEQ ID N〇 : ^ 之核酸序列編碼）。 /、他較么之本發明Γ重組」微生物具一在戊糖磷酸途徑籲 中解除调即之酶。用語「具經解除調節之戊糖碟酸途徑之 微生物」包括微生物’其在至少一可編碼戍糖碟酸途徑酶 之基因中有改變或受到修飾或在一包括不止一種可編碼戊 =酸途徑酶之基因之操縱子中有改變或受到修飾。一較 优j具一經解除調節之戊糖磷酸途徑之微生物」已經遺傳 . 、、X過度表現一棒狀桿菌（例如，穀胺酸棒狀桿菌）生物合 、酵素（例如已經改造以過度表現果糖-1，6-二填酸酶）。 在另#x L具體1施例中，重組微生物經設計或經改造 98368.do< -32- 200533745 以使一或多 /τλτ 即 ° 個戊糖磷酸生物合成酵素會過度表現或解除調 在另一較佳具體實施例中，本發明微生物會過度表現或 突變產生衍生自細菌之基因或生物合成酵素(例如，-戊糖 破酸生物合成酵素）。術語、生自細菌之」或「衍生自」 (例如)細菌包括一由-細菌基因編碼之基因產物(例如，果 糖-1，6-二碟酸酶）。
a在一具體實施例中’ -本發明之重組微生物係一革蘭氏 陽吐生物（例如，一因周圍存在一革蘭氏陽性壁而可保留驗 生木料（例如’結晶紫）之微生物）。在—較佳具體實施例中， 該重組微生物係屬於-選自由芽孢桿菌屬（版iUus)、短桿 菌屬⑻eVlbactenum)、棒狀桿g屬、乳桿菌屬 (LaCt〇bacillus)、乳球菌屬（Lact〇c〇cci)及鏈黴菌屬 (ptomyces)組成之群之屬#微生物。在一更佳具體實施 例中，該重組微生物屬於棒狀桿菌屬。在另—較佳具體實 &例中’肖重組微生物係選自由穀胺酸棒狀桿菌、醋穀胺 酸棒狀桿菌、嗜乙醯乙酸棒狀桿菌或高溫胺基化棒狀桿菌 組成之群。在一特佳具體實施例中，該重組微生物係穀胺 酸棒狀桿菌。 本發明之-重要態樣涉及培#本文所述重組微生物，以 產生一所需化合物（例如，一所需精細化學品）。術語「培養 包=維持及/或培育-本發明之活微生物（例如，維持及^或 培月一培養物或菌株）。在一具體實施例中，一本發明之微 生物可於液體培養基中培#。在另—具體實施财，一本 98368.doc -33- 200533745 發明之微生物可於固體培養基或半固體培養基中培養。在 一較佳具體實施例中，一本發明之微生物在包含對於維持 及/或培育該微生物所必需或有益之營養素之培養基（例 如，一無菌液體培養基）中培養。可使用之碳源包括糖類及 碳水化合物（例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖 ^ 贏物及纖維素）、油類及脂類（例如豆油、向日蔡油、花 生油及椰子油）、脂肪酸（例如棕櫚酸、硬脂酸及亞油酸）、 醇類（例如甘油及乙醇）及有機酸（例如乙酸）。在一較佳具體 實施例中，碳源係果糖或蔗糖。該等物質可單獨使用或作 為一混合物使用。 可使用之氮源包括含氮有機化合物（例如脒類、酵母抽提 物、肉汁、麥芽提取物、玉米漿、大豆粉及尿素）或無機化 合物（例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨）。氮 源了單獨使用或作為一混合物使用。可使用之鱗源係磷 酸、鱗酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應之含鈉鹽。培養基須 進步包έ生長所必需的金屬鹽，例如硫酸鎮或硫酸鐵。 最後，除上述規定物質外，亦可使用必需之促生長物質（例 如胺基酸及維他命）。可進一步向培養基中添加合適之前驅 體。所述饋料物質可以單批饋料形式添加至培養基中或在 培育期間於適當時饋料。 本發明微生物較佳係在經控制之ρΗ下培育。術語「經控 制之pH」包括任何可導致產生所需精細化學品（例如，離胺 酸）之pH。在一個具體實施例中，微生物於約7之？11下培育。 在另一具體實施例中，微生物於介於6·〇至8.5間之pH下培 98368.doc -34- 200533745 月所而pH可以熟諸此項技術者已知之諸多方法維持。舉 J而°、可使用驗性化合物（例如氫氧化納、氫氧化鉀、氨 或氨水）或酸性化合物（例如嶙酸或硫酸）適當地控制培養物 之pH。 另外&佳的是本發明微生物係在經控制之曝氣條件下培 養。術語「經控制之曝氣」包括充分曝氣（例如，氧氣）以產 生所而之精細化學品(例如，離胺酸)。在一個具體實施例 系藉由D周節培養物中之氧量（例如，藉由調節溶解於培 養物中之减量）來控㈣氣。培養基之曝氣較佳係以擾掉 培養物來控制。㈣可間拌㈣類似機㈣拌設備、以 旋轉或振盈培育容器(例如，發酵罐)或以各種果送設備提 供。曝氣可藉由使無菌空氣或氧氣通過培養基(例如，通過 發酵混合物）來進一步控制。另外較佳的是在不過度起泡之 狀況下(例如’經由添加消泡劑，例如聚乙二醇脂肪酸酯） 培養本發明微生物。 55°C之間，更佳介於儿^至^乂之間或介於3〇%至5〇。〔之 間。 而且，本發明微生物係在經控制之溫度下培養。術語「經 控制之溫度」包括任何可產生所需精細化學品(例如，離胺 酸。)之溫度。在—個具體實施例中，經控制之溫度包括介於 15 C至95°C間之溫度。在另—具體實施例中，經控制之溫 度包括介於㈣至7〇QC間之溫度。溫度較佳介於⑽至 微生物係在液體培養基中培養（例如，維持及/或培育）且 杈佳可藉由習知培養方法（例如，靜止培養、試管培養、振 98368.doc -35- 200533745 盪培養（例如，旋轉振盪培養、搖瓶培養等）、曝氣旋轉培養 或毛酵）連續或間歇培養。在一較佳具體實施例中，該微生 物係於搖動三角瓶中培養。在一更佳具體實施例中，該微 生物係於一發酵槽中培養（例如，發酵製程）。本發明之發酵 2程包括（但不限於）批式、饋料批式及連續式發酵方法。用 3批式製程」或「批式發酵」係指一閉合系統，其中培 養基之成份、營養素、補充添加劑及諸如此類在發酵開始 日守確疋’且在發酵期間不曝氣，然而，可嘗試控制諸如pH 及氧乱辰度等因數以阻止培養基過度酸化及/或微生物死 亡。用語「饋料批式製程」《「饋料批式」發酵係、指一批 式發酵，其不同之處為隨發酵進展添加一或多種受質或補 絲⑼如，增量添加或連續添加）。用語「連續式製程」或 一式發酵」係指一系統，其中向一發酵罐中連續添加 、疋成分之發酵培養基且同時移除等量已使用或「經調 理」之培養基，較佳用於回收所需精細化例 胺 酸）。已研製出多種此類方法且L 離胺 知。 /、已為熟諳此項技術者所熟 =「在可產生所需精細化學品(例如，離胺 下：養^包括在適合或足以獲得所需精細化學品之生成 獲得特定所生成精細化學品（ 或 下(例如，溫度、壓力、二^ 生物。舉例而言，培養:::二^ 化學品(例如，離胺酸)。培養捭’所需量之精細 細化學品產量之時間。在— 、、違丨取大精 具體貫施例中，培養可持續約 98368.doc -36 - 200533745 12至24小時。在另-具體實施例中，培養可持續約MB 小時、36至48小時、48至72小時、72至96小時、％至⑶ 小時、至U4小時或144小時以上。在另一具體實施例 中，培養可持續足以達到精細化學品產量之時間，例如培 養細胞以產生至少約15至20克/升之精細化學品，產生至少 約2〇至25克/升之精細化學品，產生至少約25至3〇克/升之二 細化學品，產生至少約30至35克/升之精細化學品，產生: 少約35至40克/升之精細化學品，產生至少約仙謂克/升之 精細化學品，產生至少約50至6〇克/升之精細化學品，產生 至少約60至70克/升之精細化學品，產生至少約謂克/ 升之精細化學品，產生至少約⑼至⑽克/升之精細化學。， 產生至少約90至刚克/升之精細化學品，產生至少約ι〇〇至 110克/升之精細化學品，產生至少約no至m克/升之精細 化學品，產生至少約12〇至13〇克/升之精細化學品產生至 少約130至⑽克/升之精細化學品，或產生至少約U0至⑽ 克/升之精細化學品。在再—具體實施例中，於使精細化學 品較佳產量（例如，一如上所述範圍内之收率）在下述時間内 ^生之條件下培養微生物··約24小時、約36小時、約4〇小 ¥、約48小時、約72小時、約96小時、約竭時、約122 小時或約144小時。 本^明方法可進-步包括回收所需精細化 胺酸）之步驟。術語「回一 離 收」所品精細化學品（例如，離胺 '"養基中提取、收穫、分離或純化該化合物。回 收#化合物可根據該項技術令習知之任何分離或純化方法 98368.doc -37- 200533745 達成，該等方法包括（但不限於）使用一習知樹脂（例如，陰 離子或陽離子交換樹脂、非離子型吸附樹脂等）處理，使用 一習知吸附劑（例如活性炭、矽酸、矽膠、纖維素、氧化鋁 ， 等）處理，改變pH、溶劑萃取（例如，使用一習知溶劑，例 士 醇、乙酸乙酯、己烷及諸如此類）、透析、過濾、濃縮、 結晶、重結晶、pH調節、低壓凍乾及諸如此類。舉例而言， 一精細化學品（例如，離胺酸）可藉由首先自培養物中移除微 生物而自培養基中回收。然後使培養基通過或經過一陽離 _ 子交換樹脂以移除不需要之陽離子，然後通過或經過一陰 ^子交換樹脂以移除不需要之無機陰離子及較目標精細化 學品（例如’離胺酸）具更強酸性之有機酸。 、本發明之所需精細化學品較佳可「經提取」、「經分離」 或經純化」以使所得製劑實質不含其他組份（例如，不含 培養基組份及/或發酵副產物）。用語「實質上不含其他組份」 ^括1備所需化合物’使其中該化合物與培養基組份或與 產生其之培養物之發酵副產物分離（例如，經純化或經部分 _ 純化）。 心在一具體實施例中，該製劑具約80。/。以上（以乾重計）之所 物（例如，約20%以下之其他培養基組份或發酵副產 物），更佳具約90%以上之所需化合物（例如，約1〇%以下之 · 其他培養基組份或發酵副產物），尤佳具約抓以上之所需 口物（例如，約5%以下之其他培養基組份或發酵副產 物）且取佳具約98-99%以上之所需化合物（例如，約卜以 以下之其他培養基組份或發酵副產物）。 98368.doc -38- 200533745 在一替代性具體實施例中，所需精細化學品（例如，離胺 酸）並未自微生物中純化，例如，當該微生物對生物無毒害 作用（例如，安全）時。舉例而言，全部培養物（或培養物上 清液）可用作一產物來源（例如，粗產物）。在一具體實施例 中，培養物（或培養物上清液）上清液可不加改變而直接使 用。在另一具體實施例中，培養物（或培養物上清液）經濃 縮。在再一具體實施例中，培養物（或培養物上清液）經乾燥 或低壓凍乾。 π·不受前驅體饋料要求限制的精細化學品生產方法 端視所操縱生物合成酵素或生物合成酵素之組合而定， 向本發明之微生物提供（例如，供給）至少一戊糖磷酸途徑生 物合成前驅體以製備精細化學品（例如，離胺酸）較為理想或 有必要。術語「戊糖磷酸途徑生物合成前驅體」或「前驅 體」包括-當提供給微生物之培養基、使其與微生物之培 養基接觸或包含於微生物之培養基中日寺，可用於增強或增 加戊糖磷酸生物合成的藥劑或化合物。在一具體實施例 中γ戊糖知馱生物合成前驅體或前驅體係葡萄糖。在另 :、體只知例巾，s亥戊糖4酸生物合成前驅體或前驅體係 果糖、。所添加葡萄糖或果糖之量較佳使其在培養基中之濃 度足以增強微生物產量（例如，濃度足以增強—精細化學品 (]離胺齔）之產1)。本發明之戊糖磷酸生物合成前驅 體可以-濃縮溶液或懸浮液形式(例如，在一適當溶劑(例 、天K或緩衝液）中）或以—固體形式（例如，以一粉末形式） 而且本發明之戊糖磷酸生物合成前驅體可以一單 98368.doc -39- 200533745 個等分忒樣形式在規定時間内連續或間歇式添加。 在本發明之戊糖磷酸生物合成方法中，提供戊糖磷酸生 物合成前驅體伴隨高成本，例如，當該方法用於產生高收 率之精、.田化干日可。因此，本發明較佳方法之特徵在於， 具至少一生物合成酵素或生物合成酵素組合（例如，至少一 戍搪碌酸生物合成酵素）之微生物，該（等）生物合成酵素經 操縱以使離胺酸或其他所需精細化學品以一不受前驅體饋 料限制之方式產生。用語「—不受前驅體饋料限制之方式」 (例如’當其係指_生成所需化合物之方法時）包括—生成所 *化合物之途徑或方式，該途徑或方法不依靠或依賴於提 供（例如，供給）至用於生成所需化合物之微生物的前驅體。 +例而口，係本發明方法特徵之微生物可用於以一無需饋 料珂驅體葡萄糖或果糖之方式生產精細化學品。 本毛月之#代I父佳方法之特徵在於具至少—生物合成酵 素或生物合成酵素之組合之微生物，該（等）生物合成酵㈣ ㈣以一實質上不受前驅體饋料限制之方式生成L-離胺酸 或其他精細化學品。用’f「一實質上不受前驅體饋料限制 之方式」：括一製備所需化合物之途徑或方法，其在更小 程度上依靠或依賴於向所用微生物提供（例如，供給）的前驅 體。舉例而言’係本發明方法特徵之微生物可用於以一需 要實質降低量之前驅體葡萄糖或果糖饋料之方式生產精細 化學品。 以一不受前驅體饋料限岳 版頭卄I艮制之方式或者以一實質不受前驅 體饋料限制之方式生產所需精細化學品之較佳方法涉及培 98368.doc 200533745 養已經操縱（例如，經設計或改造（例如，遺傳改造”之微生. 物’以使至少一戊糖磷酸生物合成酵素之表現受到修飾。 舉例而言，在一具體實施例中，微生物經操縱（例如，經設 計或改造）以解除調節至少一個戊糖碟酸生物合成酵素之 產生在—較佳具體實施例中’微生物經操縱（例如，經設 計或改造）以使其具一解除調節之生物合成途徑，例如，解 除調節之戊糖磷酸生物合成途徑，如本文所述。在另一較 佳具體實施例中，微生物經操縱（例如，經設計或改幻以過籲 度表現至少-戊糖磷酸生物合成酵素（例如，果糖十6-二磷 酸酶）。 III·高收率生產方法 本發明特別佳具體實施例係一用於生產一精細化學品 (例如，離胺酸)之高收率生產方法，其包含於使離胺酸以一 明㈣高之收率生產之條件下培養一經操縱微生物。用語 W收率生產方法」（例如，生產所需精細化學品（例如，離 Z)之高收率生產方法）包括一使該所需精細化學品以高 =過對照生產方法之通常水平的水平生產之方法。一 I用ΐ產方法較佳可以一明顯高之收率生產所需化合 太+、， 千」匕括足夠向的或超過對照生 產方法通常水平的生產或率 乂叹丰水千，例如，高至足以商業 Μ + 1列如以商業上可行之成本生產產 古 本t月之特徵在於一生產離胺酸 產率生產方法，其包括在使離胺酸以超過下述水平生 產之條件下培養一經操縱微生物:2克/升、i。克/升、15克/ 98368.doc -41 - 200533745 升、2〇克/升、25克/升、30克/升、35克/升、40克/升、45 克/升、50克/升、55克/升、6〇克/升、“克/升、川克/升、 Μ克/升、80克/升、85克/升、9〇克/升、％克/升、⑽克/ 升、no克/升、12G克/升、13{)克/升、…克/升、i5Q克/升、 160克/升、170克/升、18〇克/升、19〇克/升或2⑻克/升。 本發明之特徵進一步在於用於生產所需精細化學品（例 如，離胺酸）之高收率生產方法，其涉及於可在商業上所期 望時間内生產^夠高水平之化合物的條件下培養經操縱微 生物。在例不性具體實施例中，本發明之特徵在於生產離 胺酸之高收率生產方法，其包括於使離胺酸在5小時内以超 過15-20克/升水平產生條件下培養經操縱微生物。在另一具 體實轭例中，本發明之特徵在於生產離胺酸之高收率生產 方法，其包括於使離胺酸在1〇小時内以超過25_4〇克/升水平 產生之條件下培養經操縱微生物。在另一具體實施例中， 本發明之特徵在於生產離胺酸之高收率生產方法，其包括 於使離胺酸在20小時内以超過50-1〇〇克/升水平產生之條件 下培養經操縱微生物。在另一具體實施例中，本發明之特 徵在於生產離胺酸之高收率生產方法，其包括於使離胺酸 在40小時内以超過140-1 60克/升（例如，在40小時内超過150 克/升）水平產生之條件下培養經操縱微生物。在另一具體實 施例中，本發明之特徵在於生產離胺酸之高收率生產方 法，其包括於使離胺酸在40小時内以超過130-160克/升（例 如，在40小時内超過135、145或150克/升）水平產生之條件 下培養經操縱微生物。本文所述範圍中所包含之值及範圍 98368.doc -42- 200533745 及/或中間值亦涵笔於士政α 口 ^ 现、本舍明之乾圍内。舉例而言，於4〇小 時内至少 140、141、142、1 zu m 42 143、144、145、146、147、148、 149及150克/升之離胺酸產生水平意欲包括在40小時内 140-150克/升之範圍 145-150克/升之範圍 内。在另一實例中，140-145克/升或 意欲包括在40小時内140-150克/升之 fe圍内。而且’热諸此項技術者應瞭解，培養經操縱微生 物以獲得生產水平（例如，「於40小時内14〇_15〇克/升」）包 括額外培養Μ生物-段時間（例如，超過4()小時之時間），視 情況可使所產生離胺酸之收率甚至更高。 IV·分離的核酸分子及基因 所本發明另一方面之特徵在於用於本發明方法中編碼蛋白 貝（例如，毅胺酸棒狀桿菌蛋白質）之經分離核酸分子，例 =，棒狀桿菌戊糖磷酸生物合成酵素（例如，穀胺酸棒狀桿 菌戊糖磷酸酶）。在一個具體實施例中，本發明方法中所用 經分離核酸分子係果糖-丨，^二磷酸酶核酸分子。 術語「核酸分子」包分子（例如線性、環狀、cDna 或^色體DNA)及RNA分子（例如tRNA、rRNA、mRNA)及由 使用核苷酸類似物產生之DNA或RNA類似物。該核酸分子 可係單股或雙股，但較佳係雙股DNA。術語「經分離」核 酉欠为子包括此核酸分子，其缺少其所源自之生物體之染色 體DNA中天然位於核酸分子兩側之序列（即，位於核酸分子 5’及3’端之序列）。在各種具體實施例中，經分離核酸分子 可包含不到約 1〇 kb、5 kb、4kb、3kb、2kb、1 kb、0.5 kb、 kb、50 bp、25 bp或10 bp之核苷酸序列，該等序列天然 98368.doc -43- 200533745 位於3亥核酸分子所源自之微生物之染色體中核酸分子· 兩側。而且，當「經分離」核酸分子（例*cDNA分子）由重 組技術產生時’其可實質不包含其他分子物質，或當該核 酸分子係以化學合成法產生時，其實質上不包含化學前驅 體或其他化學品。 本文所用術語「基因」包括核酸分子（例如，dna分子或 其片段），例如，蛋白質或RNA編碼核酸分子，在生物體中 ”可藉由基因間DNA (即，天，然位於該生物體染色體DNA φ 中基因兩側及/或分隔基因之間插或間隔dna)與另一基因 或其他基因分離。基因可引導酵素或其他蛋白質分子之合 成（例如’可包含編碼序列，例如，可編碼蛋白質之連續開 放閱讀框架(〇RF))’或其本身可在該生物體中起作用。生 ，體中之基因可群集於操縱子中，如本文所述，該操縱子 藉由基□間DNA與其他基因及/或操縱子分離。在操縱子中 所含個別基因可重疊’在該等個別基因間無基因間腦。 本文所用「經分離基因」包括此基因，其基本上不含天然鲁 位於該基因所源自生物體之染色體舰中基因兩側之序列 (即’不含可編碼第二或獨特蛋白質或RNA分子、鄰近結構 =列或諸如此）且視情況包括5’及3’調節序列，例如啟動子 列及/或終止子序列。在一個具體實施例中，經分離基因 要L括蛋白貝之編碼序列（例如，可編碼棒狀桿菌蛋白質 之序列)。在另-具體實施例中，經分離基因包括蛋白質(例 “大枠囷蛋白質)之編碼序列及該基因所源自生物體之 體崎之相鄰5’及/或3,調節序列（例如相鄰5,及/或3i棒 98368.doc -44- 200533745 狀桿菌調節序列）。經分離基因較佳包含不到約i〇 kb、5 kb、2kb、1 kb、〇·5 kb、〇.2kb、0.1 kb、50 bp、25 bp或 10 bp之天然位於該基因所源自生物體染色體dna中基因之兩 側的核苷酸序列。 方面本發明方法之特徵在於分離的果糖-1,6-二填酸 S#核酸序列或基因之應用。 在較佳具體實施例中，該核酸或基因係衍生自芽孢桿菌 (Bacillus)(例如’係由棒狀桿菌衍生）。術語「衍生自棒狀 桿菌」或「由棒狀桿菌衍生」包括天然存在於棒狀桿菌屬 微生物中之核酸或基因。該核酸或基因較佳衍生自選自由 权胺馱棒狀杯菌（c〇rnynebacterium glWamicium)、醋穀胺酸 干菌（Corynebacterium acetoglutamicum)、嗜乙醯乙酸 棒狀杯囷（c〇rynebacterium acet〇acid〇phii·)或高溫胺基 化棒狀桿菌（C〇rynebacterium therm〇amin〇genes)組成之群 之微生物。在-尤佳具體實施例中，該核酸或基因係衍生 自穀胺酸棒狀桿菌（例如，其係由穀胺酸棒狀桿㈣旬。在 再具體實乾例中，該核酸或基因係棒狀桿菌基因相似物 (例如，其係衍生自不同於棒狀桿g之種屬，但與本發明之 棒狀桿菌基因(例如，—棒狀桿菌果糖一介二磷酸酶 具明顯同源性）。 、皿於本毛明I巳圍中者係細菌衍生之核酸分子或基因及 • /或棒狀桿菌衍生之核酸分子或基因（例如，由棒狀桿菌衍生 X欠刀子或基因），例如，由本發明發明者鑑定出之基因 (例如，棒狀桿菌或穀胺酸棒狀桿菌果糖'6-二磷酸酶基 98368.doc -45- 200533745 因）。進一步涵蓋於本發明範圍中者係細菌衍生之核酸分子 或基因及/或棒狀桿菌衍生之核酸分子或基因（例如，穀胺酸 棒狀桿菌衍生之核酸分子或基因）（例如穀胺酸棒狀桿菌核 酸分子或基因），其不同於天然存在之細菌及/或棒狀桿菌核 酸分子或基因（例如穀胺酸棒狀桿菌核酸分子或基因），例 如’具有經取代、插入或缺失之核酸的核酸分子或基因， 但其可編碼實質類似於天然存在之本發明基因產物之蛋白 貝。在一具體實施例中，經分離核酸分子包含如SEQ NO · 1中所不核苷酸序列，或可編碼如SEq π N〇 ·· 2中所 示胺基酸序列。 在另一具體實施例中，本發明經分離核酸分子包含核苷 酉文序列，其與如SEQ ID NO : 1所示核苷酸序列具至少約6〇 至65%，較佳至少約7〇至75%，更佳至少約8〇至85%，且尤 佳至少約90至95%或更高之等同性。在另一具體實施例 中，經分離核酸分子在嚴苛條件下與一具如SEQ①N〇 :工 所示核苷酸序列之核酸分子雜交。彼等熟諳此項技藝者習 知此等嚴苛條件，且該等條件可參見Current Protocols in
Molecular Biology (j〇hn Wiley & S〇ns? N.Y. (1989), 6·3·1-6.3.6)。嚴苛（例如，高嚴苛性）雜交條件之較佳非限制 性實例係在約45°C下於6Χ氯化鈉/擰檬酸鈉（ssc)中雜交， 隨後在50至65〇C下於0.2XSSC、0.1% SDS中洗滌一或多次。 可於嚴苛條件下與SEQ ID NO : 1序列雜交之本發明經分離 核酸分子較佳與天然存在之核酸分子一致。本文所用「天 然存在之」核酸分子係指具存在於自然界中之核苷酸序列 98368.doc -46- 200533745 之RNA或DNA分子。 本發明核酸分子（例如，具SEQ ID NO : 1之核苷酸序列之 核酸分子）可使用標準分子生物學技術及本文所提供之序 列信息分離。舉例而言，核酸分子可使用標準雜交及克隆 技術分離（例如，如 Sambrook，J·，Fritsh，E. F·及 Maniatis，T. Molecular Cloning ' A Laboratory Manual. 2nd，ed·，Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor, NY，1989 中所述）或可使用在 SEQ ID NO : 1序列基礎上設計之合成性寡核苷酸引子藉由 聚合酶鏈反應分離。本發明核酸可根據標準PCR擴增技術 使用cDNA、mRNA或者基因組DNA (作為模板）及合適之募 核苷酸引子擴增。在另一較佳具體實施例中，本發明經分 離核酸分子包含與SEQ ID NO : 1中所示核苷酸序列互補之 核酸分子。 在另一具體實施例中，經分離核酸分子係或包括果糖 -1，6-二磷酸酶基因或其一部分或其片段。在一個具體實施 例中，經分離果糖-1，6-二磷酸酶核酸分子或基因包含如 SEQ ID NO : 1所示核苷酸序列（例如，包含穀胺酸棒狀桿菌 果糖-1，6 -二鱗酸酶核苦酸序列）。在另一具體貫施例中’經 分離果糖-1，6-二磷酸酶核酸分子或基因包含編碼如SEQ ID NO : 2所示胺基酸序列之核苷酸序列（例如，可編碼穀胺酸 棒狀桿菌果糖-1，6-二磷酸酶胺基酸序列）。在再一具體實施 例中，經分離果糖-1，6 -二填酸酶核酸分子或基因編碼具 SEQ ID NO : 2之胺基酸序列之果糖-1，6-二磷酸酶蛋白質之 98368.doc -47- 200533745 相似物。本文所用術語「相似物」包括蛋白質或多肽，其 與本文所述野生型蛋白質或多肽之胺基酸序列具至少約30 至35%，較佳至少約35至40%，更佳至少約40至50%，且尤 佳至少約60%、70%、80%、90%或更高之等同性，且其具 實質上與該野生型蛋白質或多肽等效之功能或生物活性。 舉例而言，果糖-1，6-二磷酸酶相似物與具如SEQ ID NO : 2 所示胺基酸序列之蛋白質具有至少約30至35%，較佳至少 約35至40%，更佳至少約40至50%，且尤佳至少約60%、 70%、80%、90%或更高之等同性，且其具實質上與具如SEQ ID NO : 2所示胺基酸序列之蛋白質等效之功能或生物活性 (即，其係功能等效物）（例如，具有實質上等效之泛酸激酶 活性）。在較佳具體實施例中，經分離果糖-1,6-二磷酸酶核 酸分子或基因包含可編碼如SEQ ID NO : 2所示多肽之核苷 酸序列。在另一具體實施例中，經分離果糖-1,6-二磷酸酶 核酸分子可與具如SEQ ID NO : 1所示核苷酸序列之核酸分 子之全部或一部分雜交或可與具編碼多肽（其具SEQ ID NO : 2之胺基酸序列）之核苷酸序列之核酸分子的全部或一 部分雜交。此等雜交條件已為彼等熟諳此項技術者所熟知 且可見Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等 人，eds.，John Wiley & Sons，Inc. (1995)，sectioms 2，4 and 6。附加嚴苛條件可見 Molecular Cloning : A Laboratory Manual，Sambrook等人，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY (1989)，sections 7，9 and 11 中獲知。嚴苛 雜交條件之較佳非限制性實例包括在約65至70Τ下於4X氣 98368.doc -48- 200533745 化鈉/檸檬酸鈉（SSC)中雜交（或在約42至5〇〇c下於4χ SSC + 50%甲酿胺中雜父）’隨後在約65至70°C下於lxSSC中 洗條一或多次。較高嚴苛雜交條件之較佳非限制性實例包 括在約65至70 C下於1 X SSC中雜交（或在約42至5〇。c下於 1 X SSC + 50%甲醯胺中雜交），隨後在約65至7〇〇c下於〇·3χ SSC中洗滌一或多次。經降低嚴苛雜交條件之較佳非限制性 實例包括在約50至60°C下於4 X SSC中雜交（另一選擇為在 約40至45°C下於6XSSC + 50%甲醯胺中雜交），隨後在約5〇至 6〇°C下於2xSSC中洗滌一或多次。介於上述值之間之範圍 (例如65至70°C或42至50。〇亦欲涵蓋於本發明中。在雜交及 洗滌緩衝液中，SSPE (lxSSPE 係 0.15 M NaCl、10 mM NaH2P〇4及 1·25 mM EDTA，pH 7·4)可替代 SSC (lxSSC係 〇·15 MNaCl及15 mM檸檬酸鈉）；可在每次完成雜交後洗滌 15分鐘。長度預計不到50個鹼基對之雜合體之雜交溫度應 較5亥雜合體之溶點（Tm)低5至1 Ο。。，其中Tm可根據下述等 式確定。對於長度小於18個鹼基對之雜合體而言，Tm(〇c) = 2(A之數量+T鹼基）+4(G之數量+C鹼基）。對於長度介於18 至49個驗基對間之雜合體而言，Tm fC) = 81.5 + 16.6 〇〇g1Q 〔Na+)) + 0.41(%G+CH600/N)，其中N係該雜合體中之鹼基 數，且〔Na+〕係雜交緩衝液中之鈉離子濃度（對於lxSSc 而言，〔Na+)=0.165M)。熟諳此項技術者亦應瞭解，可在雜 父及/或洗滌緩衝液中添加輔助試劑以降低核酸分子與膜 (例如，硝酸纖維素或奈龍（nyl〇n)膜）之非特異性雜交，該 等輔助試劑包括（但不限於）封阻劑（例如，BSA或鮭魚或鯡 98368.doc -49- 200533745 魚精載體DNA)、洗滌劑（例如，SDS)、螯合劑（例如，EDTA)、 聚蔗糖（Ficoll)、PVP及諸如此類。具體而言，當使用奈龍 膜時，嚴苛雜交條件之額外較佳非限制性實例係於約65QC 下在0.25至0.5 M NaH2P04、7% SDS中雜交，然後於65°C 下在0·02Μ NaH2P04、1% SDS中洗滌一或多次，參見（例如） Church and Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 ： 1991-1995，（或另一選擇為，0.2X SSC、1% SDS)。在另一 較佳具體實施例中，經分離核酸分子包含與本文所示果糖 -1,6-二磷酸酶核苷酸序列互補之核苷酸序列（例如，如SEQ ID NO : 1所示核苷酸序列之全補體）。 本發明核酸分子（例如，果糖-1，6-二磷酸酶核酸分子或基 因）可使用標準分子生物學技術及本文所提供之序列信息 分離。舉例而言，核酸分子可使用標準雜交及克隆技術分 籬（例如，如 Sambrook，J·，Fritsh，E. F.及 Maniatis，T· Molecular Cloning ·· A Laboratory Manual· 2nd，ed·，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989 中所述）或使用在本文 所示果糖-1，6-二磷酸酶核苷酸序列或其側翼序列基礎上設 計之合成性寡核苷酸引子藉由聚合酶鏈反應分離。一本發 明核酸（例如，果糖-1，6·二磷酸酶核酸分子或基因）可根據 標準PCR擴增技術使用cDNA、mRNA或染色體DNA作為模 板及使用適當之募核苷酸引子擴增。 本發明之再一具體實施例之特徵在於突變型果糖-1，6-二 磷酸酶核酸分子或基因。本文所用用語「突變型核酸分子」 98368.doc -50- 200533745 或「突變型基因」包括具有核苷酸序列之核酸分子或基因， 該核苷酸序列包括至少一個改變（例如，取代、插入、缺失） 以使由该突變株編碼之多狀或蛋白質展示不同於由野生型 核酸分子或基因編碼之多肽或蛋白質之活性。突變型核酸 分子或突變型基因（例如，突變型果糖-丨，二磷酸酶基因） 較佳可編碼多肽或蛋白質，該多肽或蛋白質與由野生型核 酉欠刀子或基因編碼之多狀或蛋白質相比具有增強之活性 (例如’具有增強之果糖_ 1，6 -二碟酸酶活性），例如，當於 修 類似條件下分析（例如，於在相同溫度下培養之微生物中分 析）時。突變型基因亦可具增強之野生型多肽產生水平。 本文所用增加或增強之活性」或「增加或增強之酶活 性」係與野生型核酸分子或基因所編碼之多肽或蛋白質之 活f生相比，至少南5%之活性；較佳至少高5至1 ;更佳至 ’與該野生型核酸分子或基
少高10至25% ;且甚至更佳地，與 因編碼之多肽或蛋白質之活性相比 至75%或75至100%。介於上述規定< 至85%、85至90%、90HW丄允奋砂 或細胞外培養基中量測或分析。
98368.doc -51- 200533745 經編碼多肽或蛋白質之活性。本文所定義之突變型核酸或 突變型基因（例如，可編碼突變型多肽或蛋白質）可輕易與編 碼蛋白質相似物之核酸或基因區別開，如上所述，乃因與 表現野生型基因或核酸或產生該突變型蛋白質或多肽之相 應微生物相比，突變型核酸或突變型基因可編碼具活性改 變之蛋白質或多肽，視情況，在表現該突變型基因或核酸 或產生該突變型蛋白質或多肽之微生物（即，突變型微生物） 中可觀測到不同或獨特之表現型。相反，與表現該野生型 基因或核酸之相應微生物相比，蛋白質相似物具完全相同 或貫質類似之活性，視情況當其於微生物中產生時，其表 現型無法識別。因此，並非（例如）核酸分子、基因、蛋白質 或多肽間序列等同性之程度用來區別相似物及突變株，而 疋經編碼蛋白質或多肽之活性可區別相似物及突變株··相 似物具（例如）較低（例如，30至5〇%序列等同性）序列等同性 但仍具實質等效之功能活性，突變株（例如）具99%序列等同 性但仍具明顯不同或改變之功能活性。 V·重組核酸分子及載艘 本發明之特徵進一步在於重組核酸分子（例如，重組 7刀子），其包括本文所述核酸分子及/或基因（例如，分離的 核I分子及/或基因），較佳包括棒狀桿菌基因，更佳包括穀 月女酉夂棒狀桿菌基因，尤佳包括穀胺酸棒狀桿菌果糖]，6-二 磷酸酶基因。 本I月之特徵進一步在於載體（例如，重組載體），其包 括本文所述核酸分子（例如，分離或重組的核酸分子及/或基 98368.doc 200533745 口） /、體而a，重組載體之特徵在於包括可編碼本文所述· 菌基口產物之核酸序列，該基因產物較佳係棒狀桿菌基_ 因產物’更佳係穀胺酸棒狀桿菌基因產物（例如，戊糖石粦酸 酶，舉例而吕，果糖-1，6-二磷酸酶）。 術語「重組核酸分子」包括經改變、經修倚或經改造之 核酉义/刀子（例如’ DNA分子），該重組核酸分子在核苦酸序 列上與其所源自之自然或天然核酸分子不同（例如，藉由增 4缺失或者取代一或多個核苷酸）。重組核酸分子（例如，籲 重組DNA分子）較佳包括可有效連接至調節序列之本發明 分離核酸分子或基因(例如，經分離果糖巧冬二磷酸酶基 因）。 術語「重組載體」包括經改變、經修飾或經改造之載體（例 如’質粒、喧菌體、嗤菌粒、病毒、黏粒或其他純化核酸 載體)，與彼等包含於該重組載體所源自之自然或天然核酸 分子中的載體相比相比，其包含更多、更少或不同之核酸 序列。該重組載體較佳包括果糖-1,6-二磷酸酶基因或包括鲁 含此果糖二磷酸酶基因之重組核酸分子，其能以有效 方式連接至調節序列’例如，啟動子序列、終止子序列及/ 或人工核糖體結合位點（RBs)。 用語「以有效方式連接至調節序列」係指相關核酸分？ t 或基因之料酸序列以容㈣㈣序料現（例如，增彡纟、 增加、常態型、基本、經減弱、降低或抑制之表現）之方式 連接至該調節序列’較佳可以容許由該核苦酸序列編碼基 因產物表現(例如’當該重組核酸分子包括於本文所定義重 98368.doc -53- 200533745 200533745 組載體中且其被引 列0 入微生物中時）之方式連接至該調節序 術語「調節序列」包括可影響（例如，操縱或調節）置他 核酸序列表現之核酸序列。在—個具體實施例中，相對於 2调節序列中觀測到之相關基因及在自然界中出現之相關 土口 4即序列可在類似或完全相同之位置及/或方向上包 含於重組核酸分子或重組載體中’例如’在天然位置及/或 方向上。舉例而言’相關基因可包含於重組核酸分子或重 :載體中以有效方式連接至天然生物中伴隨或鄰近此相關 土因之調節序列(例如’以有效方式連接至「天然」調節序 列，例如，連接至「天然」啟動子）。另_選擇為，相關基 因可包含於重組核酸分子或重組载體中⑼效方式連接至 在天然生物中伴隨或鄰近另_(例如，_不同）基因之調節序 列。另-選擇為，相關基因可包括於重組核酸分子或重组 載體中以有效方式連接至另_生物調節序列。舉例而言， 來自其他微生物之調節序列(例如，其他細菌調節序列、噬 菌體調節序列及諸如此類）能以有效方式連接至相關特定 基因。 在-個具體實施例中，調節序列係非天然或非自然存在 之序列（例如，業經修飾、突變、取代、衍生、缺失之序列， 其包括化學合成之序列）。調節序列較佳包括啟動子、增強 子，’、止仏號、杬終止信號及其他表現控制因子（例如，可 與抑制子或㈣子結合之序肢/或轉錄及/或翻譯調節蛋 白之結合位點’例如’在轉錄mRNA中）。該等調節序列已 98368.doc -54- 200533745
闡述於（例如）Sambrook，J.，Fritsh，E_ F.及Maniatis，T
Molecular Cloning ·· A Laboratory Manual. 2nd，ed.，Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989 中。調節序列包括彼等 在微生物中指導核苷酸序列常態型表現者（例如，常態型啟
動子及強常態型啟動子），彼等在微生物中指導核苷酸序列 誘導型表現者（例如，誘導型啟動子（例如）木糖誘導型啟動 子）及彼等在微生物中弱化或抑制核苷酸序列表現者（例 如，弱化信號或抑制子序列）。本發明範圍亦涵蓋藉由移除 或缺失調節序列來調節相關基因之表現。舉例而言，可移 除與轉錄負調節有關之序列以使相關基因之表現增強。
在-具體實施例中，本發明重組核酸分子或重組載體包 括可編碼至少-個細菌基因產物（例如，戊料酸生物合成 酵素’例如’果糖」，6_二碟酸酶）之核酸序列或基因，其以 有效方式連接於啟動子或啟動子序列。本發明較佳啟動子 ^棒狀桿g啟料及/或”體啟動·如，可感染棒狀 囷之工囷體)。在一個具體實施例中，啟動子係棒狀桿菌 啟=，較佳係強棒狀桿菌啟動子（例如，與棒狀桿菌中生 化管豕基因有關之啟動子戋盥；+ m A共棒狀杯囷中糖解作用途徑美 因有關之啟動子^ 啟動子。 一 /、體贯施例中，啟動子係噬菌體 在另一具體實施你丨φ，士於 包括炊止1 5明重組核酸分子或重組載體 G枯、、X止子序列或甚+故 列）。術語「终止早皮 子序列（例如，轉錄終止子序 、 列」包括用於終止基因轉錄之調節序 98368.doc -55- 200533745 列。終止子序列（或串聯轉錄終止子）可進一步用於穩定 Mma (例如，藉由在被财上加上結構），例如，抗核酸酶。 在再-具體實施例中，本發明重組核酸分子或重組載體 ^括容許檢測包含該序列之載體之序列（即，可檢測及/或可 選擇之標記，例如，可克服營養型突變之序列，例如，ura3 或vE赏光;^ 5己及/或色度標記（例如，心半乳糖芽酶） 及/或抗生素抗性基因（例如，amp或tet)。 在再-具體實施例中，本發明重組載體包括抗生素抗性 土口術。口抗生素抗性基因」包括可促進或賦予宿主生 物（例如，芽孢桿菌）產生抗生素抗性之序列。在—個具體實 施例中’該抗生素抗性基因係選自由下述各基因組成之 群/at(氣黴素抗性）基目、tet(四環素抗性）基因、叫紅黴 素抗!生）基Θ neo(新磁素抗性）基因及spec(大觀黴素抗性） :因。本發明重組載體可進—步包括同源重組序列⑼如， 设计成為容許相關基因重組入宿主生物染色體内之序 列舉例而言’amy_列可作為同源性標乾，以便重組至 宿主染色體。 /熟諳此項技術者應進-步瞭解，載體之設計可根據諸如 待遺傳改造微生物之選擇、所需基因產物之表現水平等因 素修改。 VI·分離的蛋白質 本發明另-態樣之特徵在於經分離蛋白質（例如，婉分離 戊糖碟酸生物合成料，例如，經分離果m填酸 心(例如，經分離戊糖填酸 98368.doc -56- 200533745 酶，例如，經分離果糖-i，6_二磷酸酶）可以重組dna技術製 備之，並可以使用標準蛋白純化技術之適當純化流程從本 發明微生物中分離。在另一具體實施例中，蛋白質可使用 標準肽合成技術以化學方式合成。 「經分離」或「經純化」蛋白質(例如，經分離或經純化 的生物合成酵素）實質上不含細胞物質或蛋白質所源自之 微生物之其他雜質蛋白質，或當以化學合成時，每質上不 含化學前驅體或其他化學品。在一個具體實施例中：姐分 離或經純化蛋白質具低㈣3G% (以乾重計）之雜質蛋白質 或化學品，更佳具低於約2〇%之雜質蛋白質或品 二具低於約H)%之雜質蛋白質或化學品，且最佳具：於約 5 /〇之雜質蛋白質或化學品。 狀^^具體實施财，該蛋白質或基因產物衍生自棒 Γ:如::系㈣桿菌衍生)。術語「衍生自棒狀桿菌」 質或杯困何生」包括一由棒狀桿菌基因編碼之蛋白 物=自Γ。該基因產物較佳衍生自一微生物，該微生 乙=穀胺酸棒狀桿菌、醋穀胺酸棒狀桿Η 且體=才干因或高溫胺基化棒狀桿菌組成之群。在-尤佳 菌體Ρ财’該蛋白f或基因產物衍生自 係嶋桿心）。術心生自穀胺: 酸棒二菌棒狀桿菌衍生」包括-可由穀胺 =固基因編瑪之蛋白質或基因產物。在再 體男、轭例中，該蛋白質哎 罕仏，、 物(例如，一、一物由一棒狀桿菌基因相似 一何生自不同於棒狀桿菌之種屬但與本發明棒狀 98368.doc -57- 200533745 桿菌基因（例如，一槔 顯同源性之基因)編碼。，磷酸酶基因)具明 物2=本广月範圍中者係由細菌衍生之蛋白質或基因產 囷衍生之基因產物），該等物質可由天然存在之細 困及/或棒狀桿®基因（例如，穀胺酸棒狀桿菌基因）編碼， =如，由本發明之發明㈣別之基因，例如，棒狀桿菌或 :㈣棒狀桿菌果糖]，6_二磷酸酶基因。進一步涵蓋於本 發:㈣中者係、由細菌及/或棒狀桿菌基因（例如，穀胺酸棒 狀^囷基因）編碼之由細菌衍生之蛋白質或基因產物及，或 曰=狀+干菌々丁生之蛋白質或基因產物（例&，由榖胺酸棒狀 私囷何生之基因產物)，該等基因不同於天然存在之細菌及 /戶或棒狀才干囷基因（例如，穀胺酸棒狀桿菌基因），例如，該 J 土口 /、、、、工大變、插入或缺失之核酸，但其可編碼實質上 颂似於本發明天然存在基因產物之蛋白質。舉例而言，眾 所周知，熟諳此項技術者可突變（例如取代）核酸，而由於遺 傳松碼具有簡併性，核酸可編碼與由天然存在基因編碼之 安土酉夂7G王相同之胺基酸。而且，眾所周知，熟諳此項技 術者可突變（例如，取代）編碼保守胺基酸取代之核酸。亦眾 所周知，熟諳此項技術者可在一定程度上取代、增添或缺 失胺基酸而不實質影響一基因產物之功能（與天然存在之 基因產物相比），其中每一實例皆意欲包含於本發明之範圍 内。 在車乂佳具體實施例中，本發明經分離蛋白質（例如，經 98368.doc -58- 200533745 分離的戊糖磷酸生物合赤触^主 σ成酵素，例如經分離的果糖-1，6-二 磷酸酶）具有SEQ ID NO : ?由^ V 2中所示之胺基酸序列。在其他具 體實施例中，本發明經分雜 、工刀離蛋白質係如SEq ID NO ·· 2中所 示之蛋白質之相似物（例如， 包含與SEQ ID NO : 2之胺基酸 序列，、有至夕約30至40%之等同性之胺基酸序列，較佳約 40至50%之等同性，更佳約5()至㈣。之等同性，且尤佳約 至70%、70至80%、80至9〇〇/0、9〇至95%或更高之等同性， 且其活性貝質上類似於由SEQ ID n〇 ·· 2之胺基酸序列所編 碼蛋白質之活性）。 為測定兩個胺基酸序列或兩個核酸間之相似性百分比， 比對該等序列以進行最佳比較（例如，可在第一胺基酸序列 或核酸序列中引入缺口以與第二胺基酸或核苷酸序列進行 最佳比對）。當該第一序列中之位置與該第二序列中之相應 位置由相同胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則在該位置處該 等分子相同。兩個序列間之等同性百分比係該等序列共有 的完全相同位置之數目之函數（即，％等同性=相同位置數量 /總位置數量X100)，較佳應考量用於生成最佳比對之缺口數 目及缺口大小。 使用數學算法完成序列比較及兩序列間相似百分比測 定。用於序列比較之數學算法之較佳非限制性實例係Kariin 及 Altschul (1990) Pr〇c. Natl· Acad. Sci· USA 87 : 2264-68 之算法，並如 Karlin 及 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 5873-77中經修改。此算法納入Altschul等人（199〇) J.Mol_Biol.215··403-10之NBLAST及XBLAST程式（2.0版） 98368.doc -59- 200533745 中。BLAST核苷酸搜索可藉助NBLAST程式（分值=100，字 長=12)完成，以獲得與本發明核酸分子相似之核苷酸序 列。BLAST蛋白質搜索可藉助XBLAST程式（分值=50,字長 =3)完成，以獲得與本發明蛋白質分子相似之胺基酸序列。 為獲得缺口比對來進行比較，可使用Altschul等人（1997) Nucleic Acids Research 25(17): 3389-3402 中所述之 Gapped BLAST。當使用BLAST及Gapped BLAST程式時，可使用各 自程式（例如，XBLAST及NBLAST)之預設參數。參見http : //www.ncbi.nlm.nih.gov。用於序列比較之數學算法之另一 較佳非限制性實例係Myers及Miller (1988) Comput Appl Biosci· 4 : 11-17之算法。將此一算法納入可使用之ALIGN 程式中，例如，在GENESTREAM網絡伺服器、IGH Montpellier、FRANCE (http : //vega.igh.cnrs.fr)上或在 ISREC伺月艮器（http : //www.ch.embnet.org)上。當使用 ALIGN 程式用於胺基酸序列比較時，可使用PAM 120重量殘餘表 (缺口長度罰數為12且缺口罰數為4)。 在另一較佳具體實施例中，使用GCG套裝軟體（獲自 http: //www.gcg.com)之 GAP 程式及使用 Blossom 62基質或 PAM 25 0基質及缺口加權為12、10、8、6或4，長度加權為 2、3或4來測定兩個胺基酸序列間之相似性百分比。在再一 較佳具體實施例中，使用GCG套裝軟體（獲自1!”？·· //www.gcg.com)之GAP程式，利用缺口加權為50，長度加權 為3來比較兩個核酸序列間之相似性百分比。 本發明可進一步藉由下述實例闡述，但不應將該等實施 98368.doc -60- 200533745 理解為限制本發明之範圍。 考文獻、專利案、序列表、 皆以引用的方式併入本文中 在本申請案中所引用之所有參 圖形及公開專利申請案之内容 通用方法： 菌株穀胺酸棒狀桿菌ATCC 21526獲自美國菌種保藏中 -(the Amencan Type and Culture Collectl〇n)(Manassas5 USA)。當限制l-蘇胺酸時，由於避開協同—致性的天久胺 酸激酶抑制作用，此高絲胺酸營養型菌株會分泌出離胺 酸。將預先培養之培養物生長在包含5公克/公升之果糖或 匍萄糖之複雜培養基中。以瓊脂平板而言，複雜培養基則 另外添加12克/升之瓊脂。以製備作為追蹤實驗用接種物之 細胞及追蹤研究本身而言，基本培養基中添加使用丨毫克/ 宅升泛酸鈣.HC1 (Wittmann，C.及 E. Heinzle. 2002. Appl. Environ· Microbiol· 68: 5843-5859)。在該培養基中，碳源 葡萄糖或果糖之濃度、必需胺基酸蘇胺酸、甲硫胺酸及白 胺酸之濃度及檸檬酸之濃度可依下述變化。 培養預先培養由三個步驟組成，其包括：⑴以瓊脂平板 上細胞為接種物於複雜培養基上初始培養，（H)用以適應基 本培養基之短期培養及（iii)在具高必需胺基酸濃度之基本 培養基上延長培養。自瓊脂平板接種之預先培養物於1 〇〇 毫升帶擋板搖瓶内之1 0毫升複雜培養基中隔夜培育。然後 藉由離心（8800g，2分鐘，30QC)收穫細胞，接種於基本培養 基中，且使其生長至光密度達到2，以獲得適用於基本培養 98368.doc -61 - 200533745 基之指數生長期的細胞。然後藉由離心（8800 g，30QC及2 分鐘）收穫細胞，包括使用無菌0.9%氯化鈉之洗滌步驟。然 後將其接種於50毫升帶擋板搖瓶内之6毫升基本培養基 中，初始濃度為0.30克/升蘇胺酸、0.08克/升甲硫胺酸、0.20 克/升白胺酸及0.5 7克/升擰檬酸。分別添加70 mM葡萄糖或 80 mM果糖以為碳源。細胞生長直至以HPLC分析檢測出必 需胺基酸耗盡為止。在生長期末期，收穫細胞，並用無菌 氯化鈉（0.9%)洗滌。繼而將其轉移至25毫升帶擋板搖瓶内 之4毫升基本追蹤培養基中，在離胺酸生成條件下進行代謝 流量分析。該追蹤培養基不包含任何蘇胺酸、甲硫胺酸、 白胺酸及擰檬酸。對於每一種碳源而言，同時並行培育兩 個搖瓶，其分別含有：⑴40 mM〔 1-13C〕標記受質及（ii) 20 mM〔 13C6〕標記受質+ 20 mM天然標記受質。所有培養皆 於30°C及150轉/分下在一旋轉振盪器（Inova 4230，New Brunswick，Edison，NJ，USA)上進行。 化學物質99%〔 1-13C〕葡萄糖、99%〔 1-13C〕果糖、99% 〔13C6〕葡萄糖及 99%〔 13C6〕果糖皆購自 Campro Scientific (Veenendaal，Netherlands)。酵母抽提物及蛋白脒獲自Difco Laboratories (Detroit，Michigan USA)。所使用之所有其他 化學品分別購自 Sigma (St. Louis，MI USA)、Merck (Darmstadt，Germany)或 Fluka (Buchs，Switzerland)且其皆 係分析純度。 义貝及產口口刀析藉由使用光度計（Marsha Pharmacia Motech，Freiburg，Germany)於 66〇奈米（〇D66〇nm)處量測細 98368.doc -62, 200533745 胞密度或藉由重力計確定細胞濃度，後者係在室溫下自培 養液中收集10毫升細胞以3700g離心10分鐘測定之，其包括 用水洗滌之步驟。經洗滌細胞於80Y下乾燥直至恒重。乾 燥細胞乾重與〇D66Gnm間之相關因數（克生物量/〇D66Gnm)經 量測係0.353。 確定在經16000 g下3分鐘離心獲得之培養上清液中細胞 外受質與產物之濃度。果糖、葡萄糖、蔗糖及海藻糖衍生 成三甲基甲矽烷基肟衍生物後，以GC定量。對於此目的， 使用配有HP 5MS柱（5%苯基-甲基-矽氧烷-聯苯基二甲基聚 石夕氧烧，30米 x250微米，Hewlett Packard，Paolo Alto，CA， USA)之 HP 6890 氣相色譜儀（Hewlett Packard，Palo Alto, USA)及配有70 eV下電子碰撞電離之四極質量選擇性檢測 器（Agilent Technologies，Waldbronn，Germany)。樣品製備 包括凍乾該培養上清液，於吡啶中溶解，繼而用羥胺及（三 甲基曱矽烷基）三氟乙醯胺（BSTFA)進行糖的兩步驟衍生作 用（Macherey & Nagel，Dtiren，Germany)(13，14)。/3_D-核糖 係用為定量用之内標。注射樣品體積為0.2微升。GC分析之 時間程序係如下所述：150QC (0-5分鐘）、8QC/分鐘（5-25分 鐘）、310QC (25-35分鐘）。氦用作載氣，流速為1.5升/分鐘。 入口溫度係310°C，而檢測器溫度係320°C。藉由使用一 Aminex-HPX-87H Biorad 管柱（300x7.8毫米，Hercules，CA， USA)之HPLC量測醋酸、乳酸、丙酮酸、2-草醯戊二酸及二 羥丙酮，其中以流速為0.8毫升/分鐘之4 mM硫酸作為流動 相，於2 10奈米下進行紫外檢測。甘油以酵素測定法定量 98368.doc -63- 200533745 (Boehringer，Mannheim，Germany)。胺基酸藉由使用一
Zorbax Eclypse-AAA 柱（15〇χ4·6 毫米 ’ 5 微米 ’ Agilent
Technologies, Waldbronn Germany)之 HPLC (Agilent Technologies，Waldbronn，Germany)分析，其中在2¾:升/分 鐘之流速下進行自動在線衍生（〇-鄰苯二甲酸-疏基丙 酸），並用螢光檢測。詳情可參見操作手冊。使用…胺基丁 酸作為定量用内標。 13C標記分析以GC-MS定量培養上清液中離胺酸及海藻 糖之標記模式，藉此確定單個質量同位素異構物部分。在 本文中，定義該等部分為M〇 (未經標記之質量同位素異構 物部分之相對量）、^^ (單個經標記之質量同位素異構物部 分之相對量）及用於更多標記之相應術語。在轉化為先前所 述第三丁基-二甲基矽烷基（TBDMS)衍生物後（Rubino, F· M. 1989. J· Chromatogr. 473 : 125_133)，進行離胺酸之 GC-MS 分析。質量同位素異構物分佈可在針對離子簇m/z 431-437 之選擇性離子探測（SIM)模式下量化。該離子簇對應於一片 段離子，其藉由第三丁基自衍生殘基中丟失而製備，且其 因此包括離胺酸之完整碳架（Wittmann，C·，M. Hans及E. Heinzle. 2002· Analytical Biochem. 307 : 379-382)。海藻糖 之標記模式可如先前所述由三曱基甲矽烷基（TMS)衍生物 石崔定（Wittmann，C·，Η. M. Kim及 E. Heinzle. 2003. Metabolic flux analysis at miniaturized scale, submitted) 〇 海藻糖之標 記模式藉由在對應於一片段離子之m/z 36 1-367處之離子簇 評估，其中該離子簇包含一海藻糖之完整單體單位，且因 98368.doc -64- 200533745 此包含一等於葡萄糖_6-磷酸之碳架的碳架。所有樣品首先 以掃描模式量測，以此排除經分析產品與其他樣品組份間 之同量異位素干涉。所有用SIM實施之量測皆重複兩次。在 果糖追蹤實驗中單個質量同位素異構物部分之實驗誤差對 於〔i-13c〕果糖上之離胺酸係0.85% (Mq)、0.16% 、 0.27% (M2)、0.35% (M3)、0_45% (M4)，對於〔l-13C〕果糖 上之海 /喿糖係 〇·87% (M〇)、0.19% (Μι)、0.44% (Μ〗）、0 45% (Μ3)、0·88% (Μ4)，對於5〇%〔 13C6〕果糖上之海藻糖係〇 44% (M〇)、0.54% (MJ、0.34% (M2)、0.34% (Μ3)、〇·19% (M4)、 〇·14% (Ms)及〇·52% (M6)。葡萄糖追蹤實驗中MS量測之實 驗誤差對於〔l-nC〕葡萄糖上之離胺酸係0.47% (M〇)、0.44% (M〇、0.21% (Μ2)、0.26% (M3)、0.77% (M4)，對於〔i_nc 〕葡萄糖上之海藻糖係0.71% (M〇)、0.85% (MD、〇·ΐ7% (M2)、0.32% (M3)、0.46% (M4)，對於50%〔 13C6〕葡萄糖 上之海藻糖係 1.29% (M〇)、0.50% (Mi)、0.83% CM2)、〇.84〇/。 (M3)、1.71% (M4)、1.84% (M5)及 0.58% (M6)。 代謝模擬及參數評估所有代謝模擬皆在個人電腦上實 施。在 Matlab 6.1 及 Simulink 3.0 (Mathworks，Inc” Natick， MA USA)中實現產生離胺酸之穀胺酸棒狀桿菌之代謝網 絡。軟體實施包括一於Simulink中之同位素異構物模型以計 算網絡中13C標記分佈。就參數評估而言，將該同位素異構 物模型與一 Matlab中之迭代最優化算法相結合。所用計算 工具之具體情況參見Wittmann及Heinzle (Wittmann，C·及E. Heinzle. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68 ： 5843-5859) 〇 98368.doc -65- 200533745 该代謝組織關係係以先前工作為基礎，且其包含糖解作 用、戊糖石粦酸途徑（pentose phosphate pathway ; ppp)、二竣 酸（tricarboxylic acid ; TCA)循環、丙酮酸之回補羧化作用、 離胺酸及其他分泌產品（表丨）之生物合成及自中間產物前驅 體至生物量之合成代謝流量。另外，交替執行葡萄糖及果 糖之吸收系統。葡萄糖吸收與經由PTS磷酸化至葡萄糖6_ 磷酸有關（Ohnishi，J.，S. Mitsuhashi，M· Hayashi，S· Ando， Η· Y〇k〇1，Κ· Ochiai及 Μ· A· Ikeda. 2002· Appl. Microbiol· ·
Bwtechnol· 58 : 217-223)。對於果糖而言，應考慮兩種吸 收系統：分別為⑴由PTS果糖吸收及果糖經由^磷酸果糖轉 化為果糖1，6-二磷酸及（ii)由PTS甘w吸收，產生果糖卜磷酸 (Dominguez，H·，C. Rollin，A. Guyonvarch，J. L· Guerquin-Kern，M. Cocaign-Bousquet及 Ν· D. Undley· 1998.
Eur· J· Biochem· 254: 96_1〇2)。另外，在模型中使用果糖 1，6-一磷酸酶，以容許碳流在上游糖解作用中雙向流動。視 作可逆反應者係ppp巾之轉三經丙_基酶與轉酮酶。另外，φ 對於在葡萄糖上之貫驗，葡萄糖6_磷酸異構酶被視為可逆 者，由此海藻糖標記可靈敏地反映出該酵素之可逆性。相 反地，葡萄糖6-磷酸異構酶之可逆性無法在果糖上測定。 以果糖培育的細胞中，葡萄糖6_磷酸僅由果糖6_磷酸形成，· 導致兩庫之標記模式完全相同。因此，藉由可逆性葡萄糖 荈酉文/、構_:在葡萄糖填酸及果糖鱗酸間之相互轉化 亚不會導致用於評估葡萄糖6-磷酸異構酶可逆性之標記差 異。離胺酸及㈣糖之量測標記對下述並不«··⑴碟酸 98368.doc -66- 200533745 稀醇式丙酮酸/丙酮酸與蘋果酸/草酸乙酸集總庫間流量之 可逆性及（ii)TCA循環中蘋果酸脫氫酶與延胡索酸水合酶 之可逆性。因此，該等反應應視為不可逆。自天然標記及 〔UC6〕標記受質之混合物之丙氨酸標記對該等流量參數敏 感’其在該項研究中無法利用。基於先前結果，推定乙醛 酸途徑無活性（Wittmann，C·及 E· Heinzle. 2002. Appl.
Environ· Microbiol. 68 : 5843-5859) 〇 使用毅胺酸棒狀桿菌生長、產物形成及生物量組成之化 學計量數據以及經分泌離胺酸及海藻糖之質量光譜儀標記 數據計算代謝流量分佈。在兩組平行實驗離胺酸及海藻糖 之實驗組（Mi，exp)與模擬組（Mu cale)質量同位素異構物部分 間提供最小偏差之流量集合作為細胞内流量分佈之最佳評 估。如附錄中所述，由葡萄糖培育及由果糖培育細胞之兩 個網絡可由多種因素決定。由此最小二乘法係可能的。作 為誤差標準，使用最小二乘法加權總和（SLS)，其中心， 係量測結果之標準偏差（等式丨）。 SLS = vfe^exp -Micalc)2 1 ~xp (等式 1) 應用多參數初始化來研究所獲得之流量分佈是否代表一 整體最優值。對於所有菌株，離胺酸生成期間之葡萄糖吸 收流量設定為100%且網絡中其他流量用以葡萄糖吸收流 量為基準標準化之相對莫耳流量表示。 統計學評估所得代謝流量之統計學分析可藉由一如先前 所述之 Monte-Carlo 法達成（Wittmann，C·及 Ε· Heinzle 2〇〇2 98368.doc -67- 200533745
Appl. Environ· Microbiol· 68 : 5843_5859)。對於每一菌株， 析皆藉由貫施_次參數評估達成，其中包括經量 測質ϊ同位素異構物比率及經量測流量之實驗數據在統計 子上各有不同。自所得數據，計算單個參數之卯％信賴界 限。 貝例I ·在果糖及葡萄糖上由穀胺酸棒狀桿菌製備離胺酸 在葡萄糖及果糖上之對照批式培養物中分析產生離胺酸 之穀胺酸棒狀桿菌之代謝流量。對於此㈣，將預培育細 胞轉移至追㈣養基巾並培翻5小時。在追財驗開始及 、’口束犄之5：貝及產物分析揭示兩碳源間存在顯著差異。在 匍祠糖上總共製備1M mM離胺酸，而在果糖上僅獲得8·6 mM之低濃度。在5小時之培養期間，細胞濃度自39克/升增 至6.0克/升（葡萄糖）及自3·5克/升增至4·4克/升（果糖）。鑒於 在培養基中未出現蘇胺酸及曱硫胺酸這一事實，細胞可能 使用内部資源進行生物量合成。與在葡萄糖上之平均比糖 吸收率（1.71毫莫耳/克.小時）相比，在果糖上之平均比糖吸 收率（1·93毫莫耳/克·小時）更高。如表1所述，穀胺酸棒狀 桿菌ATCC 21526之所得產量在果糖與萄糖間明顯不同。這 涉及主要產物離胺酸及各種副產物。就離胺酸而言，在果 糖上之產量係244毫莫耳/莫耳且因此與在葡萄糖上之產量 (28 1尾莫耳/莫耳）相比要低。另外，碳源對生物量產量有明 顯衫％，與葡萄糖相比，生物量產量在果糖上幾乎降低 50%。在二羥丙酮、甘油及乳酸上可最顯著地觀測到碳源 對副產物形成之影響。在果糖上，該等副產物之積累顯著 98368.doc • 68- 200533745 增加。甘油產量高至1G倍，而二經丙_及乳酸分泌增加至6 七。在果糖上，二羥丙酮係主要副產物。對於由果糖培育 之細胞而t，由於生物量產量低，導致對合成代謝前驅體 之需求明顯降低（表2)。 表1··由穀胺酸棒狀桿菌ATCC 21526 g葡萄糖（左）及果糖 (右）製備離胺酸階段中之生物量及代謝產物。實驗產量係兩 組平行培養之平均值：⑴在4〇 mM〔 i_i3c〕標記受質上及 (11)在20 mM〔 13c6〕標記受質+ 20 mM天然標記受質上， 在兩組培養間有相應偏差。除生物量產量（其以毫克乾生物 里/毫莫耳表示）外，其他所有產量皆以毫莫耳產物/莫耳表 不 〇 由葡萄糖製備離胺酸 由果糖製備離胺酸 54.1 土 0.8 28.5 土 0·0 281.0 土 2.0 244.4 士 23.3 0.1 士 0.0 〇·〇 土 〇·〇 0·1 土 0·0 0.4 土 0.1 6.6 ± 0.0 7.1 ±0.4 26.3 土 15·3 156.6 土 25.8 3.8 土 2·4 38.4 土 3.9 3.3 ± 0.5 〇·9 士 0.1 L6 土 0.4 6.5 士 0.3 45.1 士 0.3 36.2 士 5.7 1·2 士 0.4 2·1 士 0.5 7.1 ±1.7 38.3 土 3·5 ~ϊϊ~ 離胺酸 纈胺酸 丙胺酸 甘胺酸 二輕丙_ 甘油 海藻糖 α 戊二酸 醋酸 丙_酸 乳酸 表2 :在由葡萄糖（左）及果糖（右）製備離胺酸階段中，對 於細胞内代謝產物之穀胺酸棒狀桿菌ATCC 2 1526之合成代 謝需求。實驗數據係兩組平行培養之平均值：⑴在〔1 -13C 〕標記受質上及（ii)在天然標記與〔13C6〕受質之1 : 1混合 物上，兩組培養間有偏差。 98368.doc -69- 200533745 前驅體需求"C 由葡萄糖製備離胺 由果糖製備離胺 毫莫耳/莫耳葡萄糖 酸 酸 葡萄糖6-磷酸 11.09 土 0.16 5.84 ±0.05 果糖6-磷酸 3.84 ±0.06 2.02 土 0.02 戊糖5-磷酸 47.50 ± 0.70 25.05 ±0.21 赤鮮糖4-填酸 14.50 ±0·22 7.64 土 0.06 甘油醛3-磷酸 6.98 ±0.10 3.68 ±0.03 3-填酸甘油酸 59.95 ±0.89 36·85 ±0·31 丙酮酸/填酸烯醇式丙酮酸 107.80 士 1·60 56.80 ± 0.48 α-酉同戊二酸 92.51 ±1.37 48.73 ±0.41 草醯乙酸 48.91 ±0.72 45.76 ±0.38 乙驢CoA 135.30 士 2.00 71.25 ±0.60 二胺基庚二酸+離胺酸^ 18.83 ±0.28 9.92 ± 0.08 *)前驅體需求之評估係基於所獲得的每一菌株之實驗生 物量產量（表1)及先前量測之穀胺酸棒狀桿菌之生物量組成 (Marx，A·，A. A. de Graaf，W. Wiechert，L. Eggeling及 H. Sahm. 1996. Biotechnol. Bioeng. 49 · 111-129) o **)二胺基庚二酸及離胺酸被視作是單獨的合成代謝前 驅體。這是基於下述事實··除離胺酸分泌流量外，自丙酮 酸及草醯乙酸至二胺基庚二酸（細胞壁）及離胺酸（蛋白質） 之合成代謝流量對經由離胺酸生物合成途徑之總流量起作 用。 實例II:追蹤實驗中13C6標記模式之手動檢查 借助GC-MS定量所分泌離胺酸及海藻糖之相對質量同位 素異構物部分。該等質量同位素異構物部分對細胞内流量 敏感且因此對所研究生物系統之流通組顯示指紋。如圖2 所示，所分泌離胺酸及海藻糖之標記模式在由葡萄糖及由 果糖培育之穀胺酸棒狀桿菌細胞間有顯著差異。在兩種所 用追蹤標記及兩種量測產物中皆存在該等差異。此揭示碳 98368.doc -70- 200533745 流量模式視所用碳源而存在實質差異。如前所示，自兩組 在〔1 - C〕與〔13 &〕葡萄糖之混合物上之平行穀胺酸棒 狀桿菌培養物獲得之質量同位素異構物部分幾乎完全相同 (Wittmann，C·，Η· M· Kim及 E· Heinzle. 2003. Metabolic flux analysis at miniaturized scale· submitted)。故，所觀測之差 異明顯與代謝流量中之受質特定差異相關。 實例III ··細胞内流量之評估 所實施研究之中心問題係在分別以葡萄糖及果糖作碳源 製備離胺酸期間，穀胺酸棒狀桿菌細胞内流量之比較研 究。對於此目的，應用上述流量評價軟體，使用自追蹤實 驗獲得之實驗數據計算每一受質之代謝流量分佈。參數評 估藉由使實驗質量同位素異構物部分與計算質量同位素異 構物部分間之偏差最小化實施。在每一最優化步驟期間， 所實施方法使用代謝平衡。此包括：⑴產物分泌之化學計 量數據（表2)及（ii)對生物量前驅體合成代謝需求之化學計 ϊ數據（表3)。給出實驗與模擬標記模式間最小偏差之細胞 内流量集合被視作細胞内流量分佈之最佳評估。對於兩種 方案，使用多種初始化值可獲得相同流量分佈，這表明確 疋出總體最小值。很明顯，在經實驗測定及經計算質量同 位素異構物比率間達成高度一致（表4)。 表3 ··離胺酸生成菌穀胺酸棒狀桿菌ATCC 21526分別在 葡萄糖及果糖上培育時分泌離胺酸及海藻糖之相對質量同 位素異構物部分。對於兩種碳源而言，皆在⑴〔i — Uc〕標 记及（ii)一天然13C標記與〔〕標記追蹤劑受質之i ·· i混 98368.doc -71 - 200533745 合物上實施兩組平行追蹤貫驗。GC/MS實驗數據（exp)及藉 由對應於最優化流量集合之數學模擬方法預測之預測值 (calc)。M〇代表未標記質量同位素異構物部分之相對量， Mi代表單個標記之質量同位素異構物部分之相對量，且相 應術語代表更高標記
κ例IV ·離fe酸製備期間果糖及葡萄糖上之代謝流量 生成離胺酸菌之榖胺酸棒狀桿菌在葡萄糖及果糖上所獲 得之細胞内流量分佈如圖（4、5)所示。很明顯，細胞内流量 視所用碳源而差異極大。對於葡萄糖而言，有62%之碳流 里流向PPP，而僅有36%被引導通過糖解作用鏈（圖4)。因 此’由该PPP酶葡萄糖6·碟酸脫氫酶及6_填酸葡萄糖酸脫氫 酶可產生相對高（124%)之NADPH。果糖之情況完全不同（圖 5)。所實施流量分析揭示兩種PTS吸收果糖之活體内活性， 其中92.3%之果糖由果糖專一性pTS果糖吸收。相對少量 (7.7%)之果糖由PTS甘露糖吸收。故，大部分果糖在果糖Μ — 二磷酸酶水平進入糖解作用，而僅有-較小部分在果糖6-構酸上游進入糖解作用鍵。與由葡萄糖培育之細胞相比， 該PPP展示僅丨4.4%之顯著降低之活性。葡萄糖卜磷酸異構 酶在該兩種碳源上以不同方向運行。在由葡萄糖培育之細 胞中，有36.2%之淨流量自葡萄糖㈣酸流向果糖6_填酸， 98368.doc -72- 200533745 而在果糖上觀測到有15.2%之解除淨流量。 在果糖上’通過葡萄糖6-磷酸異構酶及ppp之流量約係通 過PTS甘露糖流量之兩倍。然而，其並非由碳自果糖丨，6-二填 酸至6-磷酸果糖之糖原異生流量造成，糖原異生流量原本 可提供流向PPP之額外碳流量。事實上，通過催化該反應之 果糖1，6-二磷酸酶之流量係〇。負責流向ppp額外流量之代 謝反應係PPP中之可逆酶轉二經丙g同基酶及轉酮酶。約3 ·5〇/0 之該額外流量可由轉酮酶2提供，其將源自ppp之碳流循環 回該途徑。而且，轉二羥丙酮基酶之作用使4·2%之流量流 向果糖6-磷酸及ΡΡΡ。 端視碳源而定，在離胺酸生成菌穀胺酸棒狀桿菌中，亦 可觀測到環繞丙酮酸節點之完全不同之流量模式（圖4、5)。 在葡萄糖上，進入離胺酸途徑之流量係3〇·〇%，而在果糖上 该流量降低’為25.4%。與果糖相比，在葡萄糖上之高離胺 酸產量係該流量差異之主要原因，而且導致對用於細胞壁 合成之一胺基庚二酸及用於蛋白質合成之離胺酸有更高需 求之更高生物量產量亦導致該差異。在葡萄糖上之回補流 量係44.5%且因此其與果糖上之流量（33·5%)相比明顯更 高。這主要是由於對離胺酸生成用草醯乙酸之需求更高， 且亦由於在葡萄糖上對草醯乙酸及2_草醯戊二酸之合成代 謝需求更高。另一方面，與在果糖上（95.2%)相比，在葡萄 糖上（70.9°/〇)通過丙酮酸脫氫酶之流量實質上要低。該進入 TC Α循環之碳流量降低可導致在葡萄糖上通過tc a循環酶 之流量降低30°/〇以上（圖3、4)。 98368.doc -73- 200533745 使用由一Monte_Carlo法獲得流量之統計學評價來計算· 絰確疋机$芩數之90%信賴區間。如表5中各種關鍵流量所 · T ’信賴區間通常較窄。作為實例，通過葡萄糖6_構酸脫 氫酶之級里之信賴區間，對由葡萄糖培育細胞係僅1 ， 對由果糖培育細胞係3.5°/。。故，所選方法容許精確之流量 ^^由此可得出結論··分別在葡萄糖及果糖上觀測到之 流量差異明顯係由所用碳源引起。 已發現，果糖上之平均比受質吸收〇·93毫莫耳/(克·小 φ 日守））稍回於葡萄糖（1·77毫莫耳/(克·小時））。此使得，與上 述相對流量相比，葡萄糖的用毫莫耳/(克.小時）表示之絕對 細胞内流量略有增加。離胺酸生成穀胺酸棒狀桿菌分別在 果糖及葡萄糖上之流量分佈截然不同，以致所有上述比較 亦適用於絕對碳流量。 表4在果糖（左）及葡萄糖（右）上培育之離胺酸生成菌穀 胺酸棒狀桿菌ATCC 21526之代謝流量之統計學評價，其藉 由使用貝里光譜之％追縱研究及代謝產物平衡確定：對於 φ 每一受質’藉由-包含⑽次獨立參數評估之MGnte_Cari〇 法並使用在統計學上有所不同的實驗數據可獲得關鍵流量 參數之90%信賴區間。 98368.doc -74- 200533745 流量參數 葡萄糖 果糖 淨流量 通過PTSFre之果糖吸收 - [90.0 96.1] 通過PTSMan之果糖吸收 [3.9 10.0] 葡萄糖6-磷酸異構酶 |；35.7 36.8] [13.4 16.9] 填酸果糖激酶 |：35·7 36.8] - 果糖1,6-二磷酸酶1 - [-2.1 3.4] 果糖1，6-二磷酸酶醛縮酶 [73.7 73.8] [91.7 92.9] 葡萄糖6-磷酸脫氫酶 [62.5 63.7] [12.6 16.1] 轉二羥丙酮基酶 [19.4 19.8] [3.6 4.1] 轉酮酶1 [19.4 19.8] [3.6 4.1] 轉酮酶2 [17.9 18.3] [2·9 4.0] 甘油醛3-磷酸脫氫酶 [158.1 164.5] [163.3 174.6] 丙酮酸激酶 [156.2 167.4] [158.9 168.2] 丙酮酸脫氫酶 [69.5 72.5] [87.1 102.3] 丙酮酸羧化酶 [43.7 44.8] [29.9 37.3] 檸檬酸合成酶 [51.2 54.8] [76.5 91.5] 異檸檬酸脫氫酶 [51.2 54.8] [76.5 91.5] 草醯戊二酸脫氫酶 [41.6 45.6] [70·9 86.0] 天冬胺酸激酶 [29.6 30.3] [21.8 29.2] 流量可逆性2 葡萄糖6-磷酸異構酶 [4.5 5.1] - 轉二羥丙酮基酶 [4.3 4.9] [14.5 18.2] 轉酮酶1 [0.0 0.0] [0.0 0.1] 轉酮酶2 [0.4 0.6] [0.0 0.1] 98368.doc -75- 1 較低信賴界限之負流量等於相反方向中之正流量（通過果 糖磷酸激酶）。 2 流量可逆性定義為回流流量與淨流量之比率。 實例I-IV之討論： A.受質專一性培養特性 在果糖及葡萄糖上分別培養離胺酸產生菌穀胺酸棒狀桿 菌揭示生長及產物形成強烈依賴於所用碳源。與葡萄糖相 200533745 比，先前亦已報道另一穀胺酸棒狀桿菌菌株在果糖上之離 胺酸與生物量產量皆明顯降低，其中離胺酸及生物量產量 分別降低30% 及 20% (Kiefer，P·，E· Heinzle 及 C. Wittmann. 2002. J. Ind. Microbiol. Biotechnol· 28 : 338-43) 〇 與葡萄糖 相比’在果糖上培養穀胺酸棒狀桿囷及C. melassecola可獲 得更高二氧化碳產量（Dominguez, Η.，C. Rollin，A. Guyonvarch，J. L· Guerquin-Kern，M. Cocaign-Bousquet及 Ν· D. Lindley. 1998. Eur. J. Biochem. 254 ： 96-102 ； Kiefer, P.5 E. Heinzle 及 C. Wittmann. 2002. J. Ind. Microbiol. Biotechnol· 28: 338-43)。就該碳源而言，這與在本文中所 觀測到之通過TC A循環之高流量相一致。受質專一性差異 亦可在副產物中觀測到。與葡萄糖相比，在果糖上，海藻 糖之生成更低。這可能與葡萄糖及果糖進入糖解作用之點 不同有關（Kiefer，P.，E. Heinzle及 C· Wittmann. 2002· J. Ind· Microbiol. Biotechnol· 28 : 338-43)。就穀胺酸棒狀桿菌中 之吸收系統而言，使用葡萄糖可導致形成海藻糖前驅體葡 萄糖6-磷酸，而果糖則轉化為果糖1，6-二磷酸並由此自葡萄 糖6-鱗酸下游進入中心代謝（Dominguez, H.，C. Rollin，A. Guyonvarch，J. L· Guerquin-Kern，M. Cocaign-Bousquet及 Ν· D. Lindley· 1998· Eur. J. Biochem. 254 : 96-102)。當使用果 糖作碳源時，其他副產物（例如二羥丙酮、甘油及乳酸）急劇 增加。從離胺酸製備觀點來看，這並不理想，因為相當一 部分碳離開中心代謝形成副產物。在果糖上之比受質吸收 (1.93毫莫耳/(克·小時））高於在葡萄糖上之比受質吸收 98368.doc -76- 200533745 (1.77毫莫耳/(克·小時））。這一結果與對指數生長C. melassecola ATCC 17965 之先前研究（Dominguez，Η.，C·
Rollin， A. Guyonvarch, J. L. Guerquin-Kern, M. Cocaign-Bousquet及 N. D. Lindley. 1998. Eur· J. Biochem. 254 : 96-102)不同，在先前研究中對於果糖及葡萄糖觀測 到類似的比吸收速率。我們的研究中所觀測到之果糖之更 高吸收率可能歸因於所研究菌株不同這一事實。 C.Melassecola及穀胺酸棒狀桿菌係近緣物種，但它們可能 在某些代謝特性上不同。本文中所研究菌株預先由經典菌 株最優化法衍生。這可能會引入影響受質吸收之突變。另 一解釋係培養條件之差異。在限制生長及離胺酸產生之條 件下使用果糖可能更有效。 B.代謝流量分佈 對於離胺酸生成榖胺酸棒狀桿菌而言，在葡萄糖及果糖 上所得細胞内流量分佈揭示出極大差異。所得流量之統計 學評估揭示狹窄之90%信賴區間，所觀測之流量差異明顯 可歸因於所用碳源。最明顯差異之一與糖解作用和PPP間之 流量分割有關。對於葡萄糖而言，有62,3%之碳被引導通過 PPP。先前已在不同研究中觀測到在該受質上離胺酸生成菌 穀胺酸棒狀桿菌之PPP之優勢（Marx，A·，A. A. de Graaf，W. Wiechert，L. Eggeling及 Η· Sahm· 1996. Biotechnol. Bioeng. 49 : 111-129 ; Wittmann，C·及 E. Heinzle. 2001. Eur· J. Biochem. 268 · 2441-2455; Wittmann, C.AE. Heinzle. 2002. Appl. Environ. Microbiol· 68 :5843-5859)0 對於果糖而言， 98368.doc -77- 200533745
進入PPP之流量降至14.4%。如藉由所實施之代謝流量分析 所鑒定，這主要歸因於果糖在果糖1，6-二磷酸水平之進入與 果糖· 1，6-二磷酸酶之失活之不利結合。所觀測到之果糖 -1，6-二磷酸酶之失活與分別在果糖及葡萄糖上指數生長期 間C. melassecola ATCC 17965之酶測定結果高度一致 (Dominguez， H” C. Rollin， A. Guyonvarch， J. L
Guerquin-Kern，M· Cocaign_Bousquet及 N· D· Lindley· 1998
Eur· J· Biochem· 254 : 96-102)。 令人吃驚地，當在果糖上培養穀胺酸棒狀桿菌時，通過 葡萄糖6-磷酸異構酶及PPP之流量約係通過pts甘“流量之 兩倍。由於果糖1，6-二構酸酶失去活性，這不會由糖原異生 流量引發。事實上，穀胺酸棒狀桿菌具有一經由果糖6-攝 酸、葡萄糖-6-構酸及核糖5-填酸運行之代謝循環。進入ppp 之額外流量由轉酮酶2 (其將源自ppp之碳循環回該途徑）及 轉'一經丙嗣基轉之作用（其可使甘油酸3 -鱗酸改變方向回到 P P P ’藉此繞開糖原異生）提供。該循環活性有助於細胞克 服NADPH對果糖限制。對於由果糖培育之穀胺酸棒狀桿菌 而δ ’到達葡萄糖6 -麟酸之流量顯著降低亦可解釋在該受 質上海藻糖之生成減少（Kiefer，Ρ·，E. Heinzle及C. Wittmann. 2002. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 28 ： 33 8-43)。視碳源而定，葡萄糖6_磷酸異構酶向相反方向運 行。在葡萄糖培育物中，淨流量自葡萄糖6-磷酸流向果糖 6-磷酸，而在果糖上可觀測到一相反之淨流量。這強調了 該酶之可逆性對穀胺酸棒狀桿菌代謝彈性之重要性。 98368.doc -78- 200533745 C.NADPH 代謝 下述計算提供在果糖及葡萄糖上離胺酸生成菌穀胺酸棒 狀桿菌之NADPH代謝之比較。NADPH之總供應量自通過葡 萄糖6_鱗酸脫氫酶、6-填酸葡萄糖酸脫氫酶及異檸檬酸脫氫 酶之估計流量計算。在葡萄糖上，PPP酶葡萄糖6-磷酸脫氫 酶（62.0%)及葡萄糖6-磷酸脫氫酶（62.0%)提供大部分 NADPH。異檸檬酸脫氫酶（52.9%)僅提供小部分NADPH。 在果糖上可觀測到PPP及TCA循環對NADPH供應之作用大 小完全不同，其中異檸檬酸脫氫酶（83.3°/〇)係NADPH之主要 來源。在果糖上，葡萄糖6-磷酸脫氫酶（14.4%)及葡萄糖6-石粦酸脫氫酶（14.4%)產生少得多之NADPH。在離胺酸生長及 形成時需要NADPH。生長所需NADPH自11.51毫莫耳 NADPH/(克生物量）（假定對於葡萄糖及果糖完全相同）之化 學計量需求（Dominguez，H·，C· Rollin，A. Guyonvarch，J. L. Guerquin-Kern，M. Cocaign-Bousquet及 N. D. Lindley. 1998. £111\厂：8丨〇^^111.254:96-102)及本文之實驗性生物量產量 (表1)計算。在葡萄糖上穀胺酸棒狀桿菌消耗62.3%之 NADPH用於生物量生產，此與果糖作為碳源（32.8%)相比高 許多。產物合成所需NADPH量自估計進入離胺酸之流量（表 1)及4莫耳/(莫耳離胺酸）之相應NADPH化學計量需求確 定。自葡萄糖生產離胺酸之產量係112.4%，而自果糖生產 離胺酸之產量係97.6%。在葡萄糖上提供之總NADPH量 (176.9%)明顯高於果糖（112.1%)，其主要歸因於在葡萄糖上 PPP流量增加。在葡萄糖上NADPH平衡幾乎關閉。相反， 98368.doc -79- 200533745 在果糖上可觀測到明顯表現不足之NADPH (18.3%)。這為 除上述提及之酶葡萄糖6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫 酶及異檸檬酸脫氫酶外亦可提供NADPH之酶催化代謝反 應提出問題。一可能候選者係NADPH依賴性蘋果酸酶。先 前，與由葡萄糖培育之細胞相比，在由果糖培育之C· melassecola上檢測到該酶之比活性增加（Dominguez，H·，C· Rollin， A. Guyonvarch, J. L. Guerquin-Kern， M. Cocaign-Bousquet lN.D.Lindley.l998.Eur.J.Biochem· 254 : 96-102)。然而，在當前研究工作中，通過該特定酶之 流量無法由實驗設置解決。假定蘋果酸酶係缺失之NADPH 產生酶，則18.3%之流量將足以提供明顯缺失之NADPH。 以葡萄糖作為碳源之榖胺酸棒狀桿菌之詳盡流量研究揭示 蘋果酸酶無明顯活性（peteΓsen，S·，A·A·deGraaf，L· Eggeling，M. MMlney，W. Wiechert&H.Sahm.2000.J.Biol·
Chem· 75 : 35932-3 5941)。然而，在果糖上之情形可能與該 酶之高活體内活性相關。 D.NADH代謝 在果糖上，穀胺酸棒狀桿菌揭示NADH形成酶活性增 強。在果糖上，由甘油醛3 -磷酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶， 2-草醯戊二酸脫氫酶及蘋果酸脫氫酶可形成421.2%之 NADH。在葡萄糖上，NADH產量僅為322.4%。另外，合成 代謝NADH需求在果糖上明顯較在葡萄糖上低。NADH產量 顯著增強與合成代謝需求降低相結合可導致NADH/NAD比 率增加。就C. melassecola而言，先前發現，與葡萄糖相比’ 98368.doc -80- 200533745 果糖可導致NADH/NAD 比率增加（Dominguez, Η·, C. Rollin， A. Guyonvarch，J. L. Guerquin-Kern, M. Cocaign-Bousquet AN. D. Lindley. 1998. Eur· J. Biochem. 254 ·· 96-102)。這 對在果糖上離賴酸生成期間NADH之再生機理造成問題。由 果糖培育之細胞展示經增強之二經丙_、甘油及乳酸分 泌。二經丙酮及甘油之生成增加可歸因於更高之 NADH/NAD比率。先前發現，NADH可抑制甘油醛脫氫酶， 因此二羥丙酮及甘油之過量可能與該酶之流量能力降低有 關。另外，高NADH/NAD比率有利於將二羥丙酮還原成甘 油，且藉此有助於過量NADH之再生。自丙酮酸形成乳酸之 NADH需求與形成甘油類似。與指數生長相比，在特徵為相 對高TC A循環活性及低生物量產量之離胺酸生產條件下， NADH之過剩量可能甚至更高。 E.用於在果糖上最優化離胺酸產生菌穀胺酸棒狀桿菌之潛 在目標 基於所得流量模式，可系統地闡述數個用於最優化在葡 萄糖上由榖胺酸棒狀桿菌生產離胺酸之潛在目標。中心要 點係NADPH之供應量。果糠-1，6-二磷酸酶係一用於增加 NADPH供應量之目標。解除調節（例如，增大）其活性可使 通過PPP之流量更高，藉此引起NADPH生成增加及離胺酸 產量增加。經由擴增果糖1，6-二磷酸酶使通過PPP之流量增 加亦有助於芳香族胺基酸之生產（Ikeda，M· 2003· Adv· Biochem. Eng. Biotechnol. 79 ·· 1 - 3 6)。自離胺酸產量觀點來 看，在果糖上於生長期間果糖1，6-二磷酸酶失去活性係有害 98368.doc -81 - 200533745 的，但這並不令人吃驚，乃因在糖上生長期間並不需要該 糖原異生酶且其可能受到抑制。在原核生物中，該酶處在 (例如）果糖1，6-二磷酸酶、果糖2,6-二磷酸酶、金屬離子及 AMP之有效代謝控制下（Skrypal，I. G·&O.V.Iastrebova. 2002. Mikrobiol Ζ· 64 : 82-94) 〇眾所周知，穀胺酸棒狀桿 菌可在醋酸上生長（Wendisch，V· F·，A· A· de Graaf，Η· Sahm Η·及 B. Eikmans· 2000· J. Bacteriol. 182 ·· 3088-3096)，其中該酶對維持糖原異生而言必不可少。用於 增加通過PPP之流量之另一潛在目標係用於果糖吸收之 PTS 〇對PTS果糖及PTS*露糖間之流量分隔實施修飾可產生更 高比例之果糖，其可在果糖6-磷酸水平進入且因此亦可使 PPP流量增加。在果糖上可能明顯有助於提供NADPH之蘋 果酸酶之額外擴增可能是一令人感興趣之目標。 另一瓶頸包含二羥丙酮、甘油及乳酸之強分泌。解除調 節（例如缺失）相應酶可阻斷二羥丙酮及甘油之生成。磷酸二 羥丙酮至二羥丙酮之轉化可藉由一相應之磷酸酶來催化。 然而，尚未在穀胺酸棒狀桿菌中解釋二羥丙酮磷酸酶（參見 the National Center for Biotechnology Information (NCBI) Taxonomy矣罔站：http : //www3.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/)。該 反應亦可由一激酶（例如，甘油激酶）催化。目前，穀胺酸棒 狀桿菌之基因組數據庫中有兩項與二羥丙酮激酶相關（參 見 the National Center for Biotechnology Information (NCBI) Taxonomy多罔站：http : //www3.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/)。 乳酸分泌亦可藉由乳酸脫氫酶之解除調節（例如，剔除） 98368.doc -82- 200533745 消除。既然甘油及乳酸之生成對NADH再生很重要，則無論 如何不能排除對生物總性能之負面影響。在通過更低糖解 作用鏈之碳流量如先前推測受甘油醛3-磷酸脫氫酶能力限 制的情況下（Dominguez，H·，C· Rollin，A. Guyonvarch，J· L. Guerquin-Kern，M. Cocaign-Bousquet及 N. D. Lindley· 1998. Eur· J. Biochem. 254 : 96_102)，則抑制二羥丙酮與甘油產 生最終可導致果糖1，6-二磷酸酶活化及通過PPP之碳流量 改變方向。應瞭解，在穀胺酸棒狀桿菌培養期間二羥丙酮 未再次受到使用，且因此就產物合成而言會浪費碳，而在 乳酸中，情況並非如此（Cocaign-Bousquet，M.及N· D. Lindley. 1995. Enz. Microbiol. Technol. 17 ·· 260-267) 〇 在一具體實施例中，以組合方式解除調節一或多種上述 基因在製備一精細化學品（例如離胺酸）時很有效。 另外，蔗糖亦可用作由榖胺酸棒狀桿菌製備離胺酸之碳 源（例如，與本發明方法聯合使用）。蔗糖係糖蜜中之主要碳 源。如先前所示，蔗糖之果糖單位可在果糖1，6-二磷酸酶水 平進入糖解作用（Dominguez，H.及 N· D· Lindley. 1996_ Appl. Environ. Microbiol. 62 : 3878-3880) 〇 故，該部分簾糖分子 (假定為一無活性果糖1，6-二磷酸酶）可能並不進入PPP，這 樣在離胺酸製備菌株中NADPH之供應係有限的。
實例V :構建質粒pCIS lysC 菌株構建之第一步需要榖胺酸棒狀桿菌ATCC 13032中 lysC野生型基因之等位基因置換。其中，在lysC基因中進行 一核苷酸置換，這樣（所得蛋白質）311位置處之胺基酸Thr 98368.doc -83- 200533745 由lie置換。自作為PCR反應模板之ATCC 13032之染色體 DNA開始，並使用寡核苷酸引子SEQ ID NO ·· 3及SEQ ID NO : 4，根據製造商之說明書，使用pfu Turbo PCR系統 (Stratagene USA)擴增 lysC。根據 Tauch 等人（1995) Plasmid 33 : 168-179 或 Eikmanns 等人（1994) Microbiology 140 ： 1817-1828，自穀胺酸棒狀桿菌ATCC 13032製備染色體 DNA。擴增片段在其5f端由Sail限制酶酶切且在其3’端由 Mlul限制酶酶切。克隆前，擴增片段用該等兩種限制酶消 化並使用GFXTM PCR DNA及Gel Band純化試劑盒 (Amersham Pharmacia，Freiburg)系屯 4匕。 SEQ ID NO : 3
5，-GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC -3' SEQ ID NO : 4 5f-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3f 所得多核苷酸通過在具完整SacB之pCLIK5 MCS中用 Sail及Mlul限制酶切割克隆（其在下文中係指pCIS (SEQ ID NO: 5))並在大腸桿菌XL-1 blue中轉化。在包含卡那黴素（20 微克/毫升）之LB瓊脂上平板培養，可完成對攜帶質粒細胞 之選擇（Lennox，1955，Virology，1 : 190)。分離質粒並通過 定序確定該預期核苷酸序列。該質粒DNA之製備可根據 Quiagen公司之方法並使用該公司之原料實施。定序反應可 根據 Sanger 等人（1977)之 Proceedings of the National Academy of Sciences USA74: 5463-5467實現。定序反應借 98368.doc -84- 200533745 助 ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems，Weiterstadt)法分 開並分析之。所得質粒pCIS lysC列示為SEQ ID NO : 6。 實例VI ··誘變榖胺酸棒狀桿菌之lysC基因 根據製造商之說明書，使用QuickChange試劑盒（公司： Stratagene/USA)定向誘變榖胺酸棒狀桿菌之lysC基因。該 誘變可在質粒pCIS lysC，SEQ IDNO : 6中實施。合成下述 募核苷酸引子，以借助QuickChange法（Stratagene)用311 ile 置換丨1^311·· SEQ ID NO ： 7 5 丨-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTC CG-3f SEQ ID NO ： 8
5，-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTG CCG-31 在QuickChange反應中使用該等寡核苷酸引子可在lysC 基因（SEQ ID NO : 9)中導致於932位置處置換核苷酸（自C至 T)。於大腸桿菌XL 1-blue中轉化及製備質粒後，借助〔a〕 定序反應可確認在lysC基因中所得胺基酸置換Thr3 11 lie。 該質粒被命名為pCIS lysC thr311ile，並列示為SEQ ID NO : 10。 如 Liebl 等人（1989) FEMS Microbiology Letters 53 : 299-3 03所述，該質粒pCIS lysC thr3 11 ile可在穀胺酸棒狀桿 菌ATCC 13032中藉助電穿孔轉化。該方案之修正闡述於德 國專利第 10046870號中。如 Sambrook等人（1989)，Molecular 98368.doc -85- 200533745
Cloning. A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor 中所述， 使用Southern印跡及雜交標準方法檢測個別轉化株卜…座 位之染色體排列。藉此可確定，所涉及轉化株係彼等在lysc 座位處藉由同源重組整合轉化質粒者。在該等菌落於不含 抗生素之培養基中培養過夜後，於一蔗糖CM瓊脂培養基 (10°/。蔗糖）上平板接種細胞並於3〇°c下培養24小時。由於包 含於載體pCIS lysC thr311ile中之sacB基因可將蔗糖轉變成 一有毒產物，故僅彼等藉由野生型08〇基因與經突變基因 lysC thr311ile間之第二同源重組步驟缺失sacB基因之菌落 可生長。在同源重組期間，野生型基因或經突變基因可與 sacB基因一起缺失。若一起移除sacB基因及野生型基因， 則可產生一突變轉化株。 挑選生長菌落並檢測是否存在一對卡那黴素敏感之表現 型。具經缺失sacB基因之克隆必須同時顯示對卡那黴素敏 感之生長行為。可於一搖瓶内研究此等對卡那黴素敏感之 克隆株之離胺酸產量（參見實例◦。作為對照，使用未經處 理之穀胺酸棒狀桿菌ATCC 13032。與該對照相比，選擇具 一高離胺酸產量之克隆體，回收染色體DNA，並由pcr反 應擴增該lysC基因之相應區域及定序。此一具高離胺酸合 成特性及在lysC中932位置處經檢測突變之克隆株可命名 為 ATCC 13032 lysCfbr。 實例VII:製備質粒pkl9 MOB SACB PEFTU果糖-l，6-二填 酸酶 根據 Tauch 等人（1995) Plasmid 33 : 168-179 或 Eikmamis 等 98368.doc -86- 200533745 人（1994) Microbiology 140 : 1817-1828所述，自穀胺酸棒 · 狀桿菌ATCC 13032製備染色體DNA。 . PCR1 :藉助寡核苷酸引子SEQ ID NO : 11及SEQ ID NO : 12、作為模板之染色體DNA及Pfu Turbo聚合酶（公司·· Stratagene)，根據 Innis等人（1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications，Academic Press所述之標準方 法，借助聚合酶鏈反應（PCR)擴增一位於延伸因子TU之起 始密碼子上游之區域。 _ SEQ ID NO 11 5,-TGGCCGTTACCCTGCGAATG-3f 及 SEQ ID NO 12 5，-TGTATGTCCTCCTGGACTTC-3, 根據製造商之說明書，使用GFXTM PCR DNA及Gel Band 純化試劑盒（Amersham Pharmacia，Freiburg)純化所得約 200 bp大小之DNA片段。 ® PCR2 :藉助募核苷酸引子SEQ ID NO ·· 13及SEQ ID NO ·· 14、作為模板之染色體DNA及Pfu Turbo聚合酶（公司： Stratagene)，根據 Innis 等人（1990)PCR Protocols· A Guide to Methods and Applications，Academic Press所述之標準方 法，借助聚合酶鏈反應（PCR)擴增果糖-1，6-二磷酸酶基因之 5丨區。 SEQ ID NO 13
5f-GAAGTCCAGGAGGACATACAATGAACCTAAAGAAC 98368.doc -87- 200533745 CCCGA-3f 及 SEQ ID NO 14 5,-ATCTACGTCGACCCAGGATGCCCTGGATTTC-3, 根據製造商之說明書，使用GFXTM PCR DNA及Gel Band 純化試劑盒（Amersham Pharmacia，Freiburg)純化所得約 740 bp大小之DNA片段。 PCR3 :藉助寡核苷酸引子SEQ ID NO ·· 15及SEQ ID NO : 16、作為模板之染色體DNA及Pfu Turbo聚合酶（公司： Stratagene)，根據 Innis 等人（1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press所述之標準方 法，借助聚合酶鏈反應（PCR)可擴增一位於果糖-1，6-二磷酸 酶起始密碼子上游之區域。 SEQ ID NO 15 5f-TATCAACGCGTTCTTCATCGGTAGCAGCACC-3, 及 SEQ ID NO 16
5f-CATTCGCAGGGTAACGGCCACTGAAGGGCCTCCTG GG-31 根據製造商之說明書，使用GFXTM PCR DNA及Gel Band 純化試劑盒（Amersham Pharmacia，Freiburg)純化所得約 720 bp大小之DNA片段。 PCR4 :藉助募核苷酸引子SEQ ID NO : 17及SEQ ID NO : 14、作為模板之來自PCR 1及2之PCR產物及Pfu Turbo聚合 98368.doc -88- 200533745 酶（公司：Stratagene)，根據 Innis 等人（1 990) PCR Protocols· · A Guide to Methods and Applications，Academic Press戶斤述 . 之標準方法，借助聚合酶鏈反應（PCR)實施融合PCR。 根據製造商之說明書，使用GFXTM PCR DNA及Gel Band 純化試劑盒（Amersham Pharmacia，Freiburg)純化所得約 920 bp大小之DNA片段。 PCR5 :藉助寡核苷酸引子SEQ ID NO : 15及SEQ ID NO : 14、作為模板之來自PCR 3及4之PCR產物及Pfu Turbo聚合 隹 酶（公司：Stratagene)，根據 Innis等人（1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications，Academic Press戶斤述 之標準方法，借助聚合酶鏈反應（PCR)實施融合PCR。 根據製造商之說明書，使用GFXTM PCR DNA及Gel Band 純化試劑盒（Amersham Pharmacia，Freiburg)純化所得約 1640 bp大小之DNA片段。然後，使用限制酶Mlul及Sail (Roche Diagnostics，Mannheim)酶切，並使用 GFXTM PCR DNA及Gel Band純化試劑盒純化DNA片段。 ® 用限制酶Mlul及Sail酶切載體pCIS，在電穿孔分離後， 借助GFXTM PCR DNA及Gel Band純化試劑盒分離4.3 kb大 小之片段。 根據製造商之說明書，藉由快速DNA連接試劑盒（Rapid DNA Ligation Kit)(Roche Diagnostics，Mannheim)，使該載 體片段與來自PCR5之PCR片段相連接，且根據如Sambrook 等人（Molecular Cloning· A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor. (1989))所述之標準方法，在感受態大腸桿菌XL-1 98368.doc -89- 200533745
Blue(Stratagene，La Jolla，USA)中轉化該批連接物。藉由在 包含卡那黴素（20微克/毫升）之LB瓊脂上平板培養完成對 攜帶質粒細胞之選擇（Lennox，1955, Virology, 1 : 190)。 質粒DNA之製備可根據Qiagen公司之方法並使用該公司 之原料達成。定序反應根據Sanger等人（1977)之Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74 : 5463-5467實 施。借助 ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems，Weiterstadt) 分離定序反應並分析之。 所得質粒pCIS Peftu果糖-1，6-二磷酸酶可列示為SEQ ID NO : 17。 實例VIII :離胺酸之製備 在穀胺酸棒狀桿菌ATCC 13032 lysCfbr中，藉由電穿孔法 轉化質粒pCIS Peftu果糖-1，6_二磷酸酶，如Liebl等人（1989) FEMS Microbiology Letters 53 : 299-303 中所述。該方案之 修正闡述於德國專利第10046870號中。如Sambrook等人 (1989) 5 Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor中戶斤述，藉由Southernep跡及雜交使用標準方 法檢測個別轉化株之果糖-1，6-二磷酸酶基因座位之染色體 排列。藉此可確定，該等轉化株涉及彼等在果糖-1，6-二磷 酸酶基因座位處藉由同源重組整合轉化質粒者。在此等菌 落於不含抗生素之培養基中培養過夜後，於一蔗糖CM瓊脂 培養基（10%蔗糖）上平板培養細胞，於3〇QC下培養24小時。 由於包含於載體pCIS Peftu果糖-1，6-二磷酸酶中之sacB 基因可將蔗糖轉變成一有毒產物，故僅彼等藉由野生型果 98368.doc -90- 200533745 糖-1，6-二磷酸酶基因與peftu果糖」，卜二磷酸酶融合基因 間之第二同源重組步驟缺失sacB基因之菌落可生長。在同 源重組期間，野生型基因或融合基因可與“』基因一起缺 失。若sacB基因與野生型基因一起移除，則可產生一 轉化株。 挑選生長菌落並檢測是否存在一對卡那黴素敏感之表現 型。具經缺失sacB基因之克隆株必須同時顯示對卡那黴素 敏感之生長行為。藉助聚合酶鏈反應（pCR)法檢測由 啟動子置換天然啟動子之預期置換是否發生。對於該分 析，可自起始菌株及所得克隆株分離染色體dna。為此， 可使用牙籤自瓊脂平板上移除相應克隆株，並將其懸浮於 100微升水中，且於95γ下煮沸1〇分鐘。在每一狀況下，皆 使用10微升所得溶液作為在PCR中之模板。可用作引子的 疋與Peftu啟動子及果糖二磷酸酶基因同源之募核苷 酸。所選PCR條件如下·· 95〇c下初始變性5分鐘；95γ下變 秒鐘；55。(：下雜交30秒鐘；72γ下擴增2分鐘；3〇個循 %，72 C下終止延伸5分鐘。在具起始菌株之DNA之批中， 由於募核苷酸之選擇，不能形成PCR產物。僅對於通過第 二重組可完成由Peftu置換天然啟動子之克隆株，可預期一 大小為340 bp之條帶。在所有測試克隆株中，2個克隆株係 陽性。該等克隆株被命名為ATCC 13〇321ysCfbrPeftu果糖 -1，6-二磷酸酶1及2。 為研究Peftu果糖-1，6-二磷酸酶構築體對離胺酸產量之 影響，菌株ATCC 13032、ATCC 13032 lysCfbr 及 ATCC 13032 98368.doc -91- 200533745 lysCfbr Peitu果糖-1，6-二磷酸酶1在〇]^平板（1〇〇克/升d 葡萄糖、2.5克/升NaCl、2.0克/升尿素、⑺力克/升細菌蛋白 腺（bacto pept〇n)(DifCO)、5.0 克 / 升酵母抽提物（Difc〇)、5〇 克/升牛肉抽提物（Difco)、22.0克/升瓊脂（Difc〇)，高壓滅菌 (於121。0下20分鐘））上於30°C下培養2天。然後，自平板上 刮下細胞，並重懸浮於鹽水中。對於主要培養物，將1〇毫 升培養基I及0.5克高壓滅菌之CaC〇3 (Riedel和Haen)接種 於loo毫升錐形瓶中，使懸浮細胞之OD600達到15，並於22〇 轉/分鐘下在一 InforsAJllS型〔振盪培養器〕（公司· Inf〇rs, Bottmingen，Switzerland)上培養39小時。然後，測定由培養 基中分離出之離胺酸之濃度。 培養基I : 4〇克/升 蔗糖 60克/升 糖蜜（相對於100%糖含量計算） W 克/升 （NH4)2S04 0·4 克/升 MgS04*7H20 0·6 克/升 ΚΗ2Ρ04 0·3毫克/升硫胺素*鹽酸 ^ 1毫克/升生物素（1毫克/毫升經無菌過濾之儲備原液， 該儲備原液用NH4〇H調節至ΡΗ 8.0) 2毫克/升 FeS04 2毫克/升 MnS04 用以114〇11調節至1)117.8，高壓滅菌（121。(：，2〇分鐘）。 卜了自儲備原液（2⑻微克/ ¾升，無菌過濾）添加維他 98368.doc 200533745 命B12 (經錄胺Sigma Chemicals)至最終濃度為1 〇〇微克/升。 根據 Agilent 在一 Agilent 1100 Series LC System HPLC 上 藉由高壓液相層析法實施胺基酸濃度之測定。使用鄰苯二 甲醛實施柱前衍生可定量已生成胺基酸；胺基酸混合物之 分離在Hypersil AA柱（Agilent)上實施。 等效物 熟習此項技術者使用常規實驗即可瞭解或能確定本文所 述本發明特定具體實施例之諸多等效物。該等等效物意欲鲁 由下述申請專利範圍涵蓋。 【圖式簡單說明】 圖1 :係一戊糖生物合成途徑之示意圖。 圖2 ·在於葡萄糖及果糖上製備離胺酸期間，於穀胺酸棒 狀桿菌八1^0 21526追蹤實驗中藉由（}(：：/]^3量測之所分泌離 胺酸與海藻糖之相對質量同位素異構物部分之比較。
圖3 :在於葡萄糖上製備離胺酸期間，榖胺酸棒狀桿 ATCC 21526中心代謝中之活體内碳流量分佈，其使用一 合代謝產物平衡與藉由⑽崎別標記測定所分泌離胺 及海蒸糖之％追縱劑實驗之同位素異構物模擬的综合 自隶適合貫驗結果者評估、| 乎流罝以正方形符號給出， 此對於可逆反應，淨流| 里之方向由相應黑框旁箭頭指出 在轉二羥丙酮基酶、轉_醢 得W鲰及匍萄糖6_磷酸異構酶流 括號内之數字指示流量可逆 ^ 疋。所有流夏皆可以一平 葡萄糖吸收率（1.77毫簟：!：/* t ^ . 毛矣耳/克.小時）之莫耳百分比表示。 圖4 ·在於果糖上製Μ 備離胺酸期間，穀胺酸棒狀桿菌ΑΤ( 98368.doc -93- 200533745 215财心代财之活體内破流量分佈，其使用―組合代謝 產物：衡與藉由GC/MS分別標記測定所分泌離胺酸及海藻 糖之c追縱劑實驗之同位素異構物模擬的综合法自最適 合實驗結果者評估。淨流量以正方形符號給出，藉此對於 可逆反應，淨流量之方向由相應黑框㈣頭指出。在轉二
'丙=酶酶及葡萄糖6_磷酸異構酶流量下括號内 =文子^不流！可逆性。全部流量可用-平均比果糖吸收 率（1·93毫莫耳/克·小時）之莫耳百分比表示。 对^妒:葡萄糖培育（A)及經果糖培育（B)之離胺酸生成菌 :=狀桿菌中心代謝之代謝網絡，其包括輸送流量、 5成代謝流量及中間代謝產物庫間之流量。
98368.doc -94- 200533745 【序列表】 <110> BASF AicDiengeselischafx and University Saarbrucken<12Q藉由發酵製備精細化學品之方法 <130> BG1-153TO < 140> 093 1 39526 < 141 > 2004-12-17 <160> 17 <170> FastSEO for Windows Version 4.0 <2I0> 1<21墩胺酸棒狀桿菌 <212^ 一一 <213 > CoryBebacterium glu*tami.cum. <220> <221> CDS <2Z2> (22) ... (1029) <400> 1 gvgccccagg aggcccttca g atg aac cz& aag aac ccc gaa acg cca gac Her Asn Leu Lvs Asn Pro GIu Ihr Pro Asp 1 5 10 cgt aac ctr get 茂tg gag ctg gt:g c'ga gtt aeg gaa gca get gca ctg Arg Asn Leu Ala Met Gin Leu Val Arg Val Thr Glu Ala Ala Ala Leu 15 20 25 get ret gga cgz tgg gtt gga cgt ggc atg aag aat; gaa ggc gac ggt Ala Ser Gly Arg Trp Val Gly Arg Glv Met: Lys Asn Glu Glv Asp Gly 30 35 40 gcc get gtt g^ac gcc atg ege csg crc ertc aac tea gtg acc atg aag Ala Ala Val Asp Ala Met Arg Gin Leu lie ilsn Ser Val Thr Her Lys 45 50 55 gcrc gtc gtt gxr ate ggc gag ggc gaa aaa gac gaa get cca atg ctg Glv Val Val Val lie Gly Glu Gly Glu Lys Asp Glu Ala Pro Met Lea 60 €5 70 tac aac ggc gaa gag gtc gga acc ggc ttt. gga cct g&g gtt: gar ate Tyr Asn Glv Gl*a Glu Val Gly Thr Gly Phe Gly Pro Glu Val Asp lie 75 60 85 90 gca gtt gac cca gtt gac ggc acc acc ctg atg get crag gcit ege ccc Ala Val Asp Pro Val Asp Gly Thr Thr Leu Met Ala Glu Gly Arg Pro 95 100 105 51 99 1-57 195 243 291 339 aac gca att tee att etc gca get gca gag cgt ggc acc atg tac gat Asn Ala lie Ser lie Leu A1在 Ala Ala Glu Arg Gly Thr Met Tyr Asp 110 115 120 387 cca tee tee gtc ttc tac atcr aag aag ate gee gtg gga cct cracf gee 435 98368.doc 200533745
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ggcgagcggt atc&gctcac tc&aaggcgg taauacggut arccacagaa tcaggggata 312D 98368.doc 200533745 acgcaggaaa. gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 3180 cgttgciDggc gzzzzzcc&Xr aggct^Gcgcc cccctg&cga gcatc&caaa aatcgacgct; 3240 caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagai;a ccaggcgttt ccccctggaa 3300 gctccctcgt gcgctctccr gt-tccgaccc tgccgcttac cggal:acct:g tccgccrttc 3360 tcccttcggg >aagc：gtggcg ct;t;t:ct:cat:>a gcrtca;cgc:t;g t;aggtsat;crtc agttcggtgt 3:420 aggrtcgutcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgug 3480 ccrtatccgg t:aact:atcgi: cttgagt-cca acccggtaag acacgact^ta tcgccactgg 3540 cagcagccac i:ggtaacagg ai:tagcagag cgagg-tatgt： aggcggtgci: acagagttct 3600 tgaagt：ggi:g gcctaactac ggcracacta gaaggacagt; at-ttggtat:c tgcgctctgc 3660 tgaagccagt t-accttcgga aa&agagttg gtagctci:t;g atccggcaaa caaaccaccg 3720 ct:ggtaigcgg tggttrtttt: gt-ttgcaagc agcagatt:ac gcgcagaaaa aaaggatctc 3780 aagaagatcc crt-garcttr tctaoggggr ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgitt 3840 aagggarttt ggt^catgaga tt;at.caaaaa ggarc^tcac ct-agatcctt; t;^aaaggccg 3900 gccgcggccg ccatcggcat: tttcMttgc gtt-aactgtt aatt;gt:ccl;t: 3:960 gttcaaggat gct-gtctttg acaacagatg t-ttt-cttgcc tttgatgt^tc agcaggaagc 4020 tcggcgeaaa egrtgat^gt: ttgtctgcgt: agaatcGtcrt: gitttgtcata ta^gct^gtaa 4080 tcacgacati: gzzzcatzzc gctt-gaggta cagcgaagt:g tgagt;aagt:a aagg^tacat: 4140 cgttaggatc aagatccatt; tttaacacaa ggccagttrt: gt-t-cagcggc t.i;gtai:gggG 4200 cagttaaaga attagaaaca taaccaagca t.grtaaatat;c gt:t;aga；cgt:a atgccgrcaa 4260 tGgtcatttt tgdtccgcgg gagtcagtga acaggt&cca tttgccgutc atttxaaaga 43:2:0 cgttcgcgcg t;tcaattt:ca tctgrtacrg tgtt-agatgc aatcagcggi; trcatcact-t 43S0 ttt;t;caLgt:gt: gta&tesrtcg tttagctcaa tcataccgsg aigcgccgttt: geta啟ctcag 4440 ccgtgGgttt t:tt:at:cgct:i: tgc违gaagtt: tttgacttic ttgacgga氐g a在tgaitgtgc 4500 ttttgcGatet gtatgctttg tt&aaita茂沒g atrtcttcgcc ttggt:agcca zctzcELqtZc 4560 c孜gtgtt^gc ttcaata：t;aci: aagt茂tttgt gg^ctttatc; ttctacgn&ag t;gsggai:ci:c 4620 tcagcgrtarg gtrgtcgcct. gagct-gtagr t:gcctt.cat;c gatgaactgc tgtacattet 4680 gataocrtttt itccgtcaccg tcaaagattg ct-ctacaccg t:t^gatg;t：tca 4740 aagagctgrtc tgatgctgat: acgtt-aacl:i: gtgcagt:t:gt: cagtgtl：itgt. tzgccgz&az 4800 gut-taccgga gaaatc&gtg tagaataaac ggautrtrcG gtcagat-gta aatgtggct;g 4860 aaGctgacca ittcttgtgtt: tggtctttt-a ggat-agaat;c at-ttgcatcg aatttgtcgc 4920 tgtcttt-aaa gacgcggcca gcgtt-tttcc agct-gtcaat agaagtl^tcg ccgactrtet: 4980 gatagaacat gta&atcg&t: gtgtcat.ccg catt.tt:tagg atctccggct; aatgcaaaga 5040 cgargtggt:a gccgtgatag tt-tgcgaoag tgccgtcagc gt-tt^gtaat ggccagctgt: 5100 cccaatacgt;c caggcet:i:t;t: gcagaagaga tgitggacgiaa tcaa孩t:t;cagf 5160 aaacttgata zzzzzoaztz ttttgctgrtt. cagggatrug cagcatarca i;ggcgt;gt:aa 5220 tatgggaaat gccgtatgtt: tcctitaratg gci:t;tt:ggt.t: cgrttct:t:t:c gcaaacgct-t 5280 gagttgcgcc tcctgccagc agtgcggtag t;aaaggt:taa tactgttgci: tgtl:t:i:gGa& S340 actttttgat gt:t:cai:cgtt: cargrctcct; t^tt-targra ctgtgttagc ggtctgctvc 5400 trccagccct cci:gt：t-tgaa gatggcaagt; tagttacgca caataaaaaa agaccisaaa& 5460
tatgt;aaggg ci:tr&tcagi: tggattgcaa gaci;acgggc tagpt:ttctgt: ratctcattr gcggccgctc gtgacgccaa aacaaacccg ctggt：ctatt; ct:a&agaact- itgc&tgggca cact^aaaraa gart:t«iaatc agtiatacact· cgcgat:ttaczzcczczzzz aaaaaarcra taaagtrgcc tagrtgaacgg tcgagaggcc rt;gccctt;t;a ttrt-cgacct: gti:i:gat.aga ttitttaartca caggtataug cgacgxcggg cacamrag cartctarta s^Latcataaa trcartcrct. caatrcagaa tgatgggrta gt.c^tgcct;g gacrctcgt;t aggat:t.tgca aatatcataa aaaaggatcg 5520 5530 5640 5700 5760 5S20 5S60
<210〉 11 <2il> 20 <2I2> DMA人工序歹[J <220> <223寡核苷酸 <400> 11 tggccgttac cci:gcgaatg <210> 12 98368.doc -9- 20 200533745 <2：1> 20 <2：2> DBA <2:3:人工序列 <220 > <223寡核苷酸 <4ΰ0> 12 tgt.at>gl:cct cctggacttc <21.0) 13 <2I1> 40 <212> IMA <213:人工序歹[j <220;> <22;3寡核苷酸 < 400:) 13 gaagmccagg aggacataca at;gaacct;aa agaaccccga
40 <210> 14 <2il> 31 <212> <213:人工序列 <22:0> <223寡核苷酸 <4M> 14 atctacgtcg acccaggatg ccctggatt.t: c <21.00 15 <2I1> 31 <2I2> ΌΒΑ <2i3:人工序列 <220> <223寡核苷酸 <400> 15 tatcaacgcg t;t;cttcatcg gtagcagcac c <210> 16 <211> 37 <2I2> DNik 人工序列 <22 0> <223寡核苷酸 <400> 1€ catt-cgcagg gtaacggcca ct-gaagggcc t-ccrggg <210> 17 <211> 5928 <212> DMA穀胺酸棒狀桿菌 i 3.1
31 98368.doc -10- 37 200533745 <400> 17 tcgagaggcc t;gacgt;cggg cccggtacca cgcgttct;t;c at-cggtagca gcacccgaga 60 ccsatgacgcg ggcatcgccc a^srtccatca cacgcagat^c acgcacarca gattcct:gt.g 120 agcrtgtaaat t:cccacgtcg tggccarcaa gatcataaga ct-cagaaaga tcacgccagc 180 gagtatcata accagccaca gcat.cct.caa cggt-ttcacc agt：tt-gagt;g agctgaatat 240 agcccticatc t:gcgg^gaca ta^ccaacrta cagatgccgg ggi^gt;cat；Gc accatggtgc 300 gt-cgagctga atrtgt-ggrc cagcetrcag gagtt:t:ccgg caacctagti: gcat-gaitcag 3€0 tcial:t;^gcg cgcttccatt; gacat^aaaag t;ggaa^cat:c aacttcaggt: acctgccc&t 420 trtcagggga t;cct;gt;attg aa.dgaacaca t;t.cccgtgaa tcccaccgciD accaacatga 480 t:gat;cgcgga gact;acGa&c gagataatca tgtctcgact: gccat^caaaa at:tt:t;cgg«c 540 gxtitctcagc cacccgccta gtatgtcacg agrrrtggtac gaaaccccci: tt-tgggtgrc 600 cagaatccaa. aartccgggc acaaaagtgc aacaa.t:agat:： gacgt-gcggg ttgatacagc €〇0 ccaagcgccg atacai^ttat a.atgugcct:a gatacgtgca acccacgtaa ccaggrcaga 720 tcaagtgccc caggaggccc ttcagtggoc gt:t-accct;gc gaatgtccac agggtagctg 780 gt;aLgt.tt.gaa aatcaacgcc gt:tgucctt:a ggat-tcagt:a act^ggcacal: l:t-tgtaatgc 840 gctagat-ctg zgtrgczcagz cttccaggcr gci:i：.at;caca gtgaaagcaa aaccaat-tcg 900
Gggctgcgaa a〇rDcgt.agcc a.ccacgaagt: ccaggaggac atacaatgaa cctaaagaac 960
Gccgaaacgc cagaccgtaa ccttgctat;g gagctggtgc gagtracgga agcagct;gca 1020
ctggctt-ctg gacgrt-gggt: tggacgrggc atgaa.gaat:g aaggcgacgg rgccgctgtt I OSD
gacgccatgc gccagctcat; caacttcagtg accatgaagg gcgtcgtt:gl: tatcggcgag 114 D ggcgaaaaag acgaagctcc aatgctgtac aacggcgaag aggtcggaac cggcttugga 1200 cctgaggtt-g atatcgcagt tgacccagtt· gacggcacca ccctgettggc t;gagggt;cgc 1260 cccaacgcaa t,t:t.cGattci: cgcagctgca gagcgi:ggcs ccatgtacga t-cGatcctcc 1320 gt:ct.tGi:aca tgaagaagar cgccgtggga cctgaggccg caggc&agar cgacatcgaa 1380 gcticcagtitg ccc&caacat caacgcggtg gcaaa：gtcca agggaaitcaa cccrtccgac 1440 gi;c:accgt:t:g rcgt;gctt:ga ccgtcctcgc cacatcgaac tgatcgcaga catt^cgiccgt 1500 gcaggcgcaa aggttcgtct catct.ccgac ggcgacgtt:g caggtgcagi; t:gcagcaigct 1560 caggattcca act.ccgtgga catcatgatg ggcaccggcg gaaccccaga aggcat;cat;c 1620 actgcg^gcg ccatgasgtg catgggt;ggc gaaatccagg gcatcct:ggg rcgacat:cga 1680 tgctcttctg cgttaattaa caattgggai: cczct,a.ga.cc cgggattt-aa atcgcragcg 1740 ggctgcr-aaa ggaagcggaa cacgi:agaaa gccagtccgc agaaacggtg ci;gaccccgg 1800 argaatgtea gcl:actgggc tatci;ggaca agggaaaacg caagcgcaaa gagaaagcag I860 gragetrgea gtgggcttac atggegatag ctagactggg cggtcttatg gacagcaage 1920 gaaccggaat t:gccagctgg ggcgccctcr ggtaaggrtg ggaagccctg caaagraaac 1980 tggatggctt： t,czzqc.cqcc aaggatctga tggcgcsggg gat-caagatc tgatcaagag 2040 acaggargag gai:cgt;tt:cg catgartgaa caagat-ggat; t;gcacgcagg tt-ctccggcc 2100 gct；i;gg^gtgg agaggetatt. egge^atgae t:gggcacaac agacaatcgg ctgctciDgat: 2160 gccgccgrgr uccggctgtc agcgcagggg cgcccggtrc ti;t.tt;gtcaa gaccgacct;g 2220 tccggtgccc t;gaatgaact: gcaggacgag gcagcgcggc tat-cgtggct: ggccacgacg 2280 ggcgutcctt gcgcagctgt getegaegtr gtcactgaag cgiggaaggga ctggct>gct;a 2340 trgggcgaag t;gccggggca ggatctccrg rcarctcacc t,t;gci:ccrgc egagaaagra 2400 tccatcatgg ctgatgcaat: geggeggetg catacgctrg at;ccggci:ac c^gcccatrc 2460 gaccaccaag cgaaacarcg cat;cgagcga gcacgrtacrc ggatggaagc cggtcl:tgxc 2520 gatcaggatg atctggacga agagemteag gggctcgcgc cagccgaact. gt:tcgccagg 2580 crcaaggcgc gcatgcccga eggegaggar ctcgtcgrtga cccarggcga tgcct;gctt;g 2640 ccgaatatca t;ggt;ggaaaa tggccgctrt tctggattca tcgactgrgg ccggczgggz 2700 guggcggacc gcratcagga catagcgt^rg gct-acccgrg atattgct;ga agagcriDggc 2760 ggcgaarggg ctgaccgctt: ccrcgtgci:t: racggt:at:cg ccgct;cccga trcgcagcgc 2820 atcgcct：tct: atcgccttct. tgacga-gttc ttet-gagegg gactctgggg tt;cgaaatga 2880 ccgaccaagc gacgcccaac ctgccatcac gagatttega ttccaccgcc gccttct:ai:g 2S40 aaaggtt^ggg ct^cggaatc gi;t：rt;ccggg acgccggcrg gatgatcctc cagcgcgggg 3000 arct:cai:gct ggagtt-cttc gcccacgcta gcggcgcgcc grgccggcccg gtgrgaaai:^ 3060 ccgcacagat geguaagg萏g aaaia_taccgc atcaggcgct； crttcegciDtc dcgctcact: 3120 gactcgctgc gci:cggtcgt. teggertgegg egageggtat eagercactc aaaggcggi:& 3180 aracggttat: ccacagaatc aggggataac gcagga&aga acatgtgagc aaaaggccag 3240 caaaa.ggGC& gga&ccgtaa aaeiggccgcg ttgctggcgt； tutccatag getcc，gecc：c 3300 cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agt-cagaggt: ggcgaaaccc gacaggaG*ua 3360 taaagax-acc aggcgt;t：rcc ccctggaagc t-ccctcgtgc gctczccvgz t-ccg&cccrg 342 0 ccgcrtaccg garacctgtc cgccrtrcrc ccxt^cgggaa gcgtggcgc^ t.t;ci：GatagG 3480 tcacgct;gt;a ggt-atctcag ttcggtgtag gtcgttcgct: ccaagc^ggg ci:gi:gt:gcaG 3540 gaaccccccg t:tcagcccga ccgct;gcgcc ttat^ccggra aLCtatcg^ci: tgagtccaac 3600 11 -
98368.doc 200533745 ccggt：fiagac acgaci:tat:c gccactggca gcagccact-g gl:aa.catggat. tagcagagcg 3660 aggtatgtag gcggtgcrac agagic-tcttg aagt^gtggc craactacgg cracacraga 3720 aggacagtat: tt:ggt^t：Gtg cgcXGtgc.t:g aagcicagti^i cdtcg^aaa a沒gagttggt: 3780 agctct：t:gat ccggcaaaca aaccaccgct· ggt.agcggt^g gt:rrt-t：t.l:gt; t;l^gcaagGag 3S40 cagattacgc gcagaaaaaa aggaitct-caa gaagatccrt tgatcttt^tc l:acggggt:ct: 3900 gacgctcagt ggaacgaaaa ct-cacgttaa gggatt-ttgg tcatgagat;t: at-caaaaagg 3 §60 at-cttcacct agatcct；t:t.i: aaaggccggc cgcggccgcc at-cggcarti: zctzzzgcgz 4020 tttt;茂trtgt: taactgttaia tcaagg&tgc tgtct^l^gac asLcagaL^g^t: 4080 tt:ci:t:gcct>l: cagg孜迕gctc grgcgca茂asg tt;gratt:gt;tt; gtcrgcgtag 4140 aatcctctgt ttgtcatatai gcttgtaatG acgacattgt: ttcctttcgc tl:g^ggt:ac：a 4200 gcgaagt:gt.g agtaagtaaa ggttacatcg l:taggatcaa garccctttti: taac&caagg 4260 cc：agi:t；t：-t:gi: iDcagcggcti: gi:ai:gg^cGa grtaaagaat tagaaacata accaagcarg 4320 taaatarcgt t-agacgtaat: gccgi:ca&t:c gtcatttti^g atccgcggga gt^cagtgaac 4380 aggtacGa'tt: tgccgttcait· tttaaagsicg ttiGgcgcgtt: ca迕ttxcatc tgtx&ct;gtg 4440 tragat:gcaa tcagcggrt-tt catcactttt. t;tcagl:gtgt aatcatcgtr tagctcaarc 4500 a*.accgpgag cgccgi:t:i:gc taact;cagcc gtgcgt-ttt-t tatcgctttg 4560 tgacfttctt gacggaagaa tgargt:gct:t. rtgccatagt azgcz-vtgzz· aaat-aaagai: 4620 tcttcgcctt ggtagccatc tt:cagtt;cca gtgt;tt;gct;t caaat-ac^aa gz&zzzgzgg 4680 cctrtatct-t ctacgtagtg aggaccrct;c agcgtatggt tgrcgcct-ga gctgtagtt;g 4740
ccttcatcgd tgaact.gctg tacat^tttga tiSicgti:tt.tc cgtcaccgtc aaaga.t:t:gat 4SOO tt;at;aat.Gct ctacaccgtt. gatgrtcaaa gagctgtct:g a*tgct;gal:ac gt-taacrtgt 4860 gcagtitgtca gccgitaatgt rmccggaga aat;cagtgt;a gaaiDaaacgg 4920 attti:t；ccgt; cagatgtaaa tgtggctgaa cctgaccat^t gt;ct;tt;tagg 4980 atagaatcat ttgcarcgaa tttgt^cgctg t;ctt;taaaga cgcggccagc gi:ttt;t;ccag S040 ctgtcaatag aagtttcgcc g:acl：itt:t:tg孜 rsigaac^tgt: aiaatsgatgt: gtcatccgca 5100 ctccggctsa· tgcaa^g&cg 石tgitggtagc cgtgatagtt· tgcga：c^gt;g 5160 cogtcagcgt ettgtaatgg ccagctgtcc caaacgtcca ggcct;tt;i;gc agaagagat-a 5220 tttttaattg tggacgaatc aaat;itcagaa ad：t;gatart zzzcsLtzzzz t:t：g^ctgt:tca 5260 gggattt:gca gcatarcatg gcgtgtaata t:gggaaat:gc ogiitattgt^tc ct：tatarggc 5340 trttggutcg luttctt-tcgc aaacgcttga gttgcgcct-c crgcca^cag i:gcggtagra 5400 aaggrtaatta crtgt;t:gct:i;g tttrtgca茂ac tcatcgtitca tgtctcctt^t: 5460 trtatgtact crtgctagcgg tctgcttcri: ccagcccrcc tgrtt-gaaga t;ggcaagtt;a S520 gt:tacgcaca ataaaiaaa&g acctaaa&ta tgrtaeiggggt: gacgccaaag tatacactit: 5580 gccctttaica carttittagfgt· ct:tgcct;gct; rtarcagtaa caaacccgcg cgat;tt:act;t 5640 trcgacctca ttcrartaga ctctcgtttg gartigcaact: ggi&ctartttt cci:cti:t:t:gt 57Ό0 trgatagaaa atcataaaag gatrt^gcaga ctacgggcct aaagaact-aa aaaatctat;c S760 cartcrci:^ SLZZ^zzaza. gxzvczgzzg ca-Dgggcata aagt^tgccrt 5820 trtaatcaca at tcagaada tat cat a&ta tcrtcertt: t ea ctaaiaLt: aata gtga^&cggca 5380
ggtataitgtg atgggst^aia aaggategge： grgccgctcga 艺titaaattc 592B 12-
98368.doc

Claims (1)

  1. 200533745 十、申請專利範圍： 1· 一種方法，其係用以增加微生物中通過戊糖磷酸途徑之 代4丨机1，其包括於使通過戊糖鱗酸途徑之代謝流量增 加之條件下培養一含有經解除調節基因之微生物。 2·如請求項1之方法，其中果糖或蔗糖係作為碳源。 3·如請求項丨之方法，其中果糖係作為碳源。 月求項1之方法，其中該基因係果糖_丨，6-二礙酸酶基 因。 士明求項4之方法，其中該果糖_丨，6-二磷酸酶基因係衍生 自棒狀桿菌（Corynebacterium)。 士明求項4之方法，其中該果糖_丨，6-二填酸酶基因係過度 表現的。 Ί·如请求項1之方法，其中該基因編碼果糖-1，6-二磷酸酶。 8·如請求項7之方法，其中果糖-丨，6_二磷酸酶具有增強之活 性。 9.如請求項1之方法，其中該微生物係革蘭氏陽性微生物。 10·如請求項丨之方法，其中該微生物屬於棒狀桿菌屬。 U.如請求項10之方法，其中該微生物係穀胺酸棒狀桿菌 (C〇rynebacterium glutamicum)。 12.如请求項丨之方法，其中該微生物經發酵以生成一精細化 學品。 、 13·如請求項1之方法，其中該微生物進一步包含一或多種額 外經解除調節作用之基因。 14.如凊求項13之方法，其中該一或多種額外經解除調節之 98368.doc 200533745 基因係選自由ask基因、dapA基因、asd基因、dapB基因、 ddh基因、lySA基因、lysE基因、pycA基因、zwf基因、pepCL 基因、gap基因、zwal基因、tkt基因、tad基因、mqo基因、 tpi基因、pgk基因及sigC基因組成之群。 15. 16. 17. 18. 19. 20. 如凊求項14之方法，其中該一或多種額外經解除調節之 基因係過度表現的。 如請求項13之方法，其中該一或多種額外經解除調節之 基因編碼一選自由以下組成之群之蛋白質··抗反饋天冬 胺酸激酶、二氫吡啶二羧酸酯合成酶、天冬胺酸半醛脫 氫酶、二氫吡啶二羧酸酯還原酶、二胺基庚二酸脫氫酶、 一胺基庚二酸表異構酶、離胺酸輸出子、丙酮酸魏化酶、 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油 醛-3-磷酸脫氫酶脫氫酶、RpF蛋白質前驅體、轉酮酶、 轉一羥丙酮基酶、曱基萘醌氧化還原酶、磷酸丙糖異構 酶、夂磷酸甘油酸激酶及⑽冬聚合酶^因子“π。 如請求項16之方法，其中該蛋白質具有增強之活性。 士 π求項13之方法，其中該一或多種額外經解除調節之 基因係選自由pepCK基因、mal Ε基因、glgA基因、⑽基 因、dead基因、menE基因、⑽基因、偷⑴基因、州β 基因、zWa2基因及sucC基因組成之群。 如凊求項18之方法，其中該—或多種額外經解除調節之 基因係經弱化、降低或抑制。 如明求項13之方法’其中該—或多種額外經解除調節之 基因可編碼-選自由以下組成之群之蛋白#:碟酸稀醇 98368.doc 200533745 —硬激_、蘋果酸酶、糖原 旦構酸、Ατρ分 7 匍萄糖_6·石粦酸 異構酶ATP依賴性讀解 iM M SM ^ ^ ^ 姆〇琥珀觚本甲酸-CoA 連㈣^酸裂合_鏈、轉錄調控因子 酶、咖蛋白質前驅體及號轴醯_c〇a_合成酶。狀脫义 21.如請求項2G之方法’其中該蛋白質具有降低之活性。 22· -種用於生產_精細化學品之方法，其包含： a) 培養其中果糖]，6_二碟酸酶經解除調節之微生物；及 b) 在培養基中或微生物之細胞中積聚該精細化學品，藉 此生產一精細化學品。 23. -種用於製備一精細化學品之方法’其包含在生成該精 細化學品之條件下培養一微生物，其中該微生物中至少 一個戊糖磷酸生物合成途徑基因或酵素係經解除調節。 24. 如請求項23之方法，其中該生物合成途徑基因係丨，6_二磷 酸果糖酶基因。 25 ·如睛求項23之方法’其中該生物合成途徑酵素係果糖 -1，6 -二鱗酸酶。 26·如請求項22或24之方法，其中果糖-1，6_二構酸酶表現作 用係增強的。 27·如請求項22或25之方法，其中果糖-1，6-二填酸酶活性增 強0 28.如請求項22或23之方法，其進一步包含回收該精細化學 品。 29·如請求項22或23之方法，其中一或多種額外基因係經解 除調節。 98368.doc 200533745 3〇·如明求項29之方法，其中該一或多種額外經解除調節之 基因係選自由ask基因、dapA基因、asd基因、dapB基因、 ddh基因、lysA基因、lysE基因、pycA基因、zwf基因、p^cL 基因、gap基因、zwal基因、tkt基因、tad基因、啊〇基因、 ipi基因、pgk基因及sigC基因組成之群。 31.如請求項30之方法，其中該一或多種額外經解除調節之 基因係過度表現的。 32·如明求項29之方法，其中該一或多種額外經解除調節之 基因可編碼一選自由以下組成之群之蛋白質：抗反饋天 冬胺酸激酶、二氫吡啶二羧酸酯合成酶、天冬胺酸半醛 脫氫酶、二氫吡啶二羧酸酯還原酶、二胺基庚二酸脫氫 _ 一胺基庚一酸表異構酶、離胺酸輸出子、丙_酸羧 化酶、葡萄糖-6_磷酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、 甘油醛-3-磷酸脫氫酶脫氫酶、RPF蛋白質前驅體、轉酮 酶、轉二羥丙酮基酶、甲基萘醌氧化還原酶、磷酸丙糖 異構酶、3-磷酸甘油酸激酶及RNA-聚合酶σ因子sigC。 33·如請求項32之方法，其中該蛋白質具有增強之活性。 34.如,求項29之方法，其中該一或多種額外經解除調節之 基因係選自由pepCK基因、mal E基因、glgA基因、_基 因、dead基因、menE基因、citE基因、加迚17基因、ρ〇χΒ 基因、zwa2基因及sueC基因組成之群。 35·如請求項34之方法，其中該一或多種額外經解除調節之 基因係經弱化、降低或抑制。 36.如請求項29之方法，其中該一或多種額外經解除調節之 98368.doc 200533745 基因可編碼一選自由以下組成之群之蛋白質：磷酸烯醇 丙酮酸羧激酶、蘋果酸酶、糖原合成酶、葡萄糖_6_磷酸 異構酶、ATP依賴性RNA解螺旋酶、〇_琥珀醯苯甲酸_c〇a 連接酶、檸檬酸裂合酶/3鏈、轉錄調控因子、丙酮酸脫氫 酶、RPF蛋白質前驅體及琥珀醯_〇〇八_合成酶。 37·如請求項36之方法，其中該蛋白質具有降低之活性。 38·如請求項22或23之方法，其中該微生物係革蘭氏陽性微 生物。 3 9 ·如明求項2 2或2 3之方法’其中该微生物屬於棒狀桿菌屬。 40·如請求項39之方法，其中該微生物係穀胺酸棒狀桿菌。 41 ·如明求項22或23之方法，其中该精細化學品係離胺酸。 42.如請求項41之方法，其中離胺酸生產產量至少為ι〇〇公克 /公升。 43·如請求項41之方法，其中離胺酸生產產量至少為ι5〇公克 /公升。 44. 如請求項22或23之方法，其中果糖或蔗糖係作為碳源。 45. 如請求項22或23之方法，其中果糖係作為碳源。 46. 如請求項22或24之方法，其中果糖-丨芥二磷酸酶基因包 含SEQ ID NO : 1之核苷酸序列。 47. 如請求項22或24之方法’其中果糖_丨，6_二磷酸酶編碼包 含SEQ ID NO : 2之胺基酸序列之多肽。 48· —種重組微生物，其具有經解除調節之戊糖磷酸生物合 成途徑。 4 9 · 一種重組微生物’其包含經解除调郎之戊糖鱗酸生物合 98368.doc 200533745 成基因。 50·如請求項49之重組微生物，其中該經解除調節之基因係 果糖-1，6-二磷酸酶基因。 5 1 ·如請求項50之重組微生物，其中果糖-1，6-二磷酸酶表現 作用係增強的。 52·如請求項50之重組微生物，其中該果糖-i，6_二磷酸酶基 因編碼具增強活性之果糖-i，6_二磷酸酶蛋白質。 53·如請求項49之重組微生物，其中該微生物屬於棒狀桿菌 屬。 54·如請求項53之重組微生物，其中該微生物係榖胺酸棒狀 桿菌。 55· —種由SEq ID NO : i之核苷酸序列編碼之多肽，其中該 多肽具有果糖·1，6-二磷酸酶活性。 98368.doc
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