TW200526234A - Compositions comprising oligosaccharides - Google Patents
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Description
200526234 九、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於使用L 6 ^ ^ ^ ^ - (例如养醣類)作為病原體附著 於南礼動物細胞之抑制 7者 於抑制病原體附著於哺乳動二礼動物腸道細胞,·用 組成物;以及餘、登 包含醣(例如募醋)之 抑 、可用作為病原體附著於哺乳動物細胞之 抑制劑的醣(例如寡醣)之方法。 也之 【先别技術】(無) 【發明内容】 就許多腸道細菌而t,致病性的第—階段為附著於腸 二土。關於其發生,該細菌最初會附著在上皮細胞表面之 :受器分子,其係受上皮細胞之特定碳水化合物族群 斤周節才艮據本發明,已令人驚言牙地發現類似這些族群之 酿類’如寡醣自’可競爭性抑制細菌黏合和減少疾病 生與嚴重性。 a 4寸疋。之’本發明已鏗定出化合物,其通過胃腸道後 會繼續存留’並抑制特定之病原體附著於結腸上皮,而不 會不利地影響大腸微生物群落或共生有機體之附著。 本發明之一方面,驚奇地發現選自至少一種甘露寡 醋’例如〇Μ·2甘露募醣、α1_3甘露寡餹、α1_6甘露募醋, 例如CM-2甘露二糖、α1_3甘露二糖、〇1_6甘露二糖;甲 基甘露寡酿,例如甲基α甘露寡醣;豸蛋白醣巨肽(咖也 glycomacropeptide,CGMP);幾丁 募醣;果寡醣(F〇s);果膠 募醣,半乳寡醣(G0S);卡特蘭多醣(卢…^聚葡萄糖);唾液 200526234 酸寡醣;IL醣;乳酮糖;乳蔗糖;異麥芽寡醣.— 讓;部分水解之古柯豆膠;木寡醋;龍膽寒:半乳糖 伯寡醣;果膠及長鏈異麥芽㈣,下文皆 ,阿拉 之化合物,'顯示具強力之抗附著活性。4 “本發明 本毛明之一具體實例,本發明之較佳化合物。 露寡醣,例如α w甘露二糖、α w甘露二糖、=包括1 二糖:曱基甘露寡醣,例如甲基α甘露寡醣,= 券醣,果膠养醣;卡特蘭多醣;唾液酸寡醣;乳.<、_ 糖,礼蔗糖;異麥芽寡醣;寡半乳糖醛酸酐;部八欠解-s 古柯立膠;木寡醣;龍膽募醣;阿拉伯寡醣;長夂2 募醣;果膠或其混合物。 /、>芽 本毛月之另一具體實例,本發明之化合物 ., 」包括甘露 券醣,例如α 1-2甘露二糖、〇; 1-3甘露二糖、 认1 - β甘露 二糖,甲基甘露寡醣,例如曱基α甘露寡醣; ^ 不修养醣; 唾液酸寡醣;幾丁募醣;CGMP ; G0S ;部分水解夕士 Λ ^ I刀之古柯豆膠; 木寡醣,乳ig糖或其混合物。 本發明之另一具體實例,本發明之化合物可包括甘露 寡醣,例如α 1-2甘露二糖、α 1-3甘露二糖、α卜6甘露 二糠;曱基甘露募醣,例如甲基α甘露募醣;果膠募醣; 唾液酸寡醣;幾丁募醣;CGMP或其混合物。 本發明另一方面係關於使用包含本發明化合物之組成 物以製造營養或藥學組成物,用於抑制病原體附著於嗔乳 動物細胞,例如哺乳動物腸道細胞及/或減低或抑制病原體 侵入以及感染哺乳動物細胞,例如哺乳動物腸道細胞。 200526234 本發明之一具體實例,本發明 月之組成物可於治療哺乳 動物急性或慢性細菌相關之腸道疾 μ 庆病,特別是腸胃炎、清 瘍性結腸炎、腹瀉疾病。 視 糸提供含本發明化合物以 抗細菌及/或殺病毒劑組成物 本發明另一方面,係提供一種預 ^ 、_ 頂防及/或治療哺乳動物 心性或慢性病原體相關,如細菌相關之腸道疾病,特 腸胃炎或潰瘍性結腸炎之方法,兮古1A 1 ^ °亥方法包括對該哺乳動物 投予治療有效量之本發明化合物。 本發明之另一方面係提供一種預防,減低及/或或抑制 病原體mx及感㈣乳動物細胞,例如哺乳動物腸道細 胞,哺乳動物腸上皮細胞之方法,包括投予該喷乳動物治 療有效量之本發明化合物。 本發明之其他方面係提供一種篩選方法,例如黏著性 分析以試驗醣類,例如募醣之抗黏著活性,該方法包括·· a)將醣類(例如募醣)溶液加到於三重複槽(例如I〗样 組織培養平盤)中生長至9〇% + (例如⑽至ι〇〇%)細胞群集^ 人類結腸細胞系HT29的,細胞單層, 、,b)加入細菌培養物,例如在37t下厭氧生長在組織培 養基中,例如指數期的培養物,例如稀釋於磷酸鹽緩衝I 理食鹽水中,例如相當於其體積的量, 〇在37t:有氧,5 %⑶2下2小時後洗滌細胞層,例如 用磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS),例如數次,例如3次, d)分離細胞層,例如利用胰蛋白酶/ε])ΤΑ溶液, 200526234 e)計异細菌數,例如藉由平板計數,及 〇將具有醣類(例如募醣)之槽中的計數與那些不具有 醣類之槽比較。 根據本發明之筛選方法可進一步包括 g) 做出對醣類(例如寡酿)之劑量反應曲線,顯示抗黏 著活性,及/或 h) 決定醣類(例如寡醣)對於其他病原體之菌株的影 響,及/或 i) 決定對於有益細菌(例如共生菌)的影響。 於本發明之另一具體實例中,步驟&)和b)如下: a) 將醣類(例如寡醣)加入細菌培養物,例如在3rc下 厭氧生長在組織培養基中,例如指數期的培養物,例如稀 釋於磷酸緩衝生理食鹽水中, b) 將含有醣之細菌培養物(例如相當於其體積的量)加 到^一重複槽中(例如1 2槽組織培養平盤)生長至g(例 如95至100%)細胞群集之人類結腸細胞系HT29之細胞單 層。 於本發明另一方面,該細菌培養之製備可包含連續3 天製備次培養。 本發明之篩選方法係可靠和具再現性的,以及可使高 數量之細菌附著於細胞單層。 甘露寡可商業購自Alltech (UK)商品名為BioMos。 幾丁寡St可商業購自Primex Ingredients ASA,挪威或法 國幾丁((:}1丨1:丨1〇。唾液酸寡醣可商業購自31111幻31£:,丁30〇 200526234
Kagaku Co;LTD,日本。果募醣可商業購自商品名Raftilose 或是Actilite。半乳寡醣可商業購自Borculo Domo Ingredients(荷蘭)之商品名 Vivinal GOS,El ixor GOS, 或Oligomate。部分水解之古柯豆膠可商業購自Novartis
Nutrition Corporation 之商品名 Benefiber®。異麥芽募 釀可商業講自商口口名Isoroalto 900來自Showa Sangyo Co, 或IMO P900來自Hayashibara,日本。寡半乳糖駿酸酐可 商業購自商品名Galursan。木募醣可商業購自Sunt〇ry, 曰本或 Cuntory Limited 之商品名 xylo-〇lig〇 2〇p 或 35p 或95P。卡特蘭多醣(卢-1,3—聚葡萄糖)可商業購自 WAKO-Pure-Chemica卜Industries-LTD,日本。酪蛋白醣巨 肽可商業購自Aria Foods,丹麥。果膠寡醣可商業購自 Oranges,US。龍膽募醣可由商業上獲得。 根據本發明之幾丁寡醣係由幾丁質之水解所製造。其 :為前II物多醋之分解產物。較佳地,根據本發明之幾丁 係由Primex Ingredients ASA,挪威或法國㈤t 很锞本發明之唾液酸寡醣係一 (例如為不同之大…… 種複。养酿,例如⑽ 卜丨J <大小及結構)之混合物,1 殘基。根攄太於八末鳊可為唾液酉 ^ 本每明之唾液酸募醣可為蛋白質盥窠 物,例如_鍤疋人沐t 貝”券醣之混4 蛋白貝與唾液酸寡醣之混人你 , 之唾液酸寡醣諸之物。根據本發日) 哪J由蛋頁分離出。較佳去 液酸寡醣可A n 1 根據本發明之 田日本 Sunsial E , Taiv。 ι 造。 yo Kagaku Co ; LTD % 200526234 較佳言之,根據本發明之唾液酸寡聽不包括所習知為 唾液酸路易士 X(Sialyl Le X或是SLe X)及/或唾液酸路易 士 WLe 〇及/或其類似物之酿類。較佳的是,根據本發明 之該唾液酸寡醣不包括岩藻基。 根據本發明,CGMP係指於酪蛋白醣巨肽上攜帶有複合 唾液酸化寡醣類,CGMP可於乾酪製造期間釋出。 α I-6甘露二糖、α 1-2甘露二糖及α ^甘露二糖可 由甘露糖經酵素催化而得。 爲了取得U ^6甘露二糖,真菌株 P加印/Ck,例如於〇e/?/c/iS AKC Η”?,可於含礦物源培 養基中(例如於PH5),利用Bi〇M〇s (Alltech,υκ)做為單 一碳源(例如利用1% Bi〇M〇s)在震動下(例如於執道震動器 上)生長。培養條件可為例如在30°C數天的期間(例如三 天)此接種可在1〇E5孢子/毫升實行。產量約為⑽。然 後酵素產物可破濃縮,例如以超過濾(例^ 1〇〇剛w截斷) 口養基之無H夜。然後α j一6甘露二糖可由單醋分離出 (例如使用Ρ2凝膠過濾管柱)如熟習此技藝之人士所熟知 者。 ’ 爲了製備1,3-α-甘露糖苷酶,可利用Bi〇M0s於較長時 ,口養A_例如七天,導致製造一種第二酵青 了生成 〇ί- 1,6 和 1 ο -Γ i,0*兩種甘露募醣。α-1,3甘露募醣之種 可利用熟習此項枯蓺人丄β + 貝孜身人士所週知之技術來純化。 為了製備αΐ -2甘 oryzae),例如 ΡΜ-1 露二糖,可將米麴(Aspergillus 重組體,麴青黴(Penicillium 10 200526234
CltrinUm)a i-2甘露露糖苦酶之超級生產者培養於DpY培 養基’例如在包括3· 5和6.〇之間的邱值,以及包括甘露 糖,例如以培養溶液之總重量計之7〇重量%甘露糖。培養 環境在例如航’數天期間(例如8天)βΙ)ργ培養基係描述 於 Y〇shlda 等人,腦,Biosci Bi〇techn〇i. Bi〇chem62, 309-3 1 5,該内容以引用方式納入本文中。
根據本發明之果膠寡醣之製備係由幾丁質之水解而製 造。其可為前驅物多醣之分解產物。根據本發明之果膠寡 醣含有具不同鏈長之α-1-4連接之半乳糖醛酸殘基之骨 架。其可為複合募醣類(例如具有不同鏈長之寡醣類的混合 物。某些包含於根據本發明之果膠募醣中之募醣類可含有 含鼠李糖及半乳糖之募醣鏈。 果膠寡醣之取得可透過01ano_MartinE,Mountz〇uris KC,Gibson GR&Rastall RA (2〇〇1)中所描述之方法,M於 酵素膜反應器中連續製備果膠寡醣",J〇urnal 〇f F(^d
ScienCe 66 ’ 966-971,其内容以引用之方式納入本文中。
可理解的,該方法為熟習此項技藝者所週知。 本文中所使用之共生一詞係指藉由改善腸内微生物平 衡對寄主為有益之影響的微生物(例如活的微生物),例 如乳酸菌及雙又桿菌。 本文中所使用之病原體一詞係指非有益之細菌、病 毋〃菌單細胞或多細胞寄生物、毒素以及重金屬陽離 子例如大腸桿菌(E· col i)(例如佛羅細胞毒素大腸桿菌 (VTEC)、腸病原性大腸桿菌(EPEC)、腸毒性大腸桿菌(ETEC) 11 200526234 或疋知襲性大腸桿菌(EAggEC)、金黃色葡萄球菌,例如 抗青黴素金黃葡萄球菌(MRSA)、困難腸梭菌或是毒素型困 難腸梭菌、硫酸鹽還原菌,例如脫硫弧菌(DesuIf〇vibri〇 spp) ’ 例如脫硫螺菌(j)esuH〇bivrio desulfuricans)或是 Desulfovibrio Piger 。 關於本發明之篩選方法將於此有更詳細說明。
製備人類結腸細胞系HT29的培養物,並將該其加到如 1 2或24払組織培養平盤之槽中。該細胞可生長至或更 夕之、、田紀群术,較佳者為9〇%—^ 〇〇%,更佳者為^ 〇⑽。 可將该細胞予以沖洗(例如使用磷酸鹽緩衝生理食鹽水 (PBS))至少一次。製備細菌培養物,例如在祕調 整之Eagle氏培養基(_),或是在厭氧性組織培養基(例 如Postgate氏培養基〇,例如在阶下。該細菌培養物可 例如:由於實驗前-天由瓊脂培養物之接種,或藉由已經 ^母天人&養之肉汁(brQth)培養物之接種而製備。該細 囷i口養物可生县亩?丨#
ΰ 奸止^或對數期,較佳為直到指數 朋。在加至細胞之箭 Μ、,,田圉培養物可於細胞培養基中, 例如DMEM或PBS,較佳者A prq 更佳為 。可龄釋 1/5〇〇_ 1 /1 0000 , 體積之量…胞二:稀既細菌)培— 可將含細胞的培養物進行培養之前。或者, 液。該受試寡度單:並隨後立即添加細菌懸浮 毫升之間’較…G.°“σι°°毫克/ 笔克/耄升之間,較佳在約 12 200526234 U · 2 5 矛口 ] 5 a / _x- 之門^ 毫升之間,較佳在約〇.5和I〇毫克/毫升 之間,更佳在約2和5毫克/毫升之間, 克~升 =毫升。該募_在被加到細菌培養物之前可:=5 例如去蛋白質,例如使用蛋㈣ 、、二過純化’ 習知者。該細菌iiL差& 寻,,,屯化方法為技藝所 至約5小時,更佳“…:蚕數小…較佳為從约1 約40t之fUH、、%。相養可在包括從約35和 有氧(例如下進仃。培養環境可為 U妁戈i) %C〇2)。未附著於細 層而去除,例4 、、’菌可猎由洗滌細胞 古丨示例如利用PBS,例如赵+ y,, 該等細胞自培養盤移除,例^由人酵次。然後可將 在再度懸浮之後,可混勺0秒至約2分鐘的期間。 將…” 寺細胞以打碎凝結物。隨後可 、站者之細囷計數並與未 ra 养醣之對照組作比較。細菌 核了使用基於酵素之分析法進行,例半乳糖酶活 14,或鱟變形細胞溶解物(limulus 析法。將被理解的是此等分析 moe ocyte lysate)分 知去 寻刀析法為熟習此項技藝人士所孰 單Mm… 據本發明,在施用至HT29 早層則可將細囷染色例如螢光 動細胞儀計數。較佳是藉由直接叶數=者之細函可以流 塗佈於平板計數瓊脂培養基之後:數枯者之細胞’例如在 本發明之一方面,係提供一 〃 種包含本發明化合物之醫 条、營養或藥學調配物,例如飲人 人艮補充物。就本發明之目 化八吕 明之組成物"一詞包含包括至少一種本發明 化合物之組成物。 13 200526234 本發明組成物可進一步包括一種或多種如下之原花青 素’乳鐵蛋白’亞麻油酸以及次亞麻油酸。 本發明之醫藥、營養或藥學組成物可視需要包括藥學 上可接又之載體。再者,根據本發明提供一種組合的藥學 製d可同日寸、分開或是連續使用’用以抑制病原體附著 於哺乳動物細胞。例如控制,例如治療,預防或改善"甫 礼動物中急性或慢性細菌相關之腸道疾病。 本發明之組成物視需要包括習知的食品添加物,例如 =何之乳化劑、安㈣、甜味劑、調味劑、著色劑、防腐 背i、螯合劑、渗透劑、酸鹼調整緩衝液或是試劑、酸化劑、 增稠劑、質地改善劑等等。 /學組成物及飲食補充物可以呈習知劑型之軟凝谬、 小藥囊、粉末、糖漿、液體懸浮 ,, 予收礼化液以及溶劑的形 式提供。在軟膠囊中,有效成分 议往係,合解或懸浮於適當 勺液體,例如脂肪油、石蠟油或是 可加入安定劑。 U乙—酵。視需要 本發明之化合物併入本發明組成物中之量,可取決於 :性質及/或分子量’本發明組成物之形式,例如粉末哎 …消耗之組成物。於是’包含於本發明組 化合物之適當量’以組成物之總重量計,係高達約80 重里/。之範圍,例如高達約β〇重量%, 與仓丨 次呵達、力40重量%, 舉例而言從約〇· 05至約50重量% I旦。/ 』如攸約0·5至約2〇 更里/。,例如約2· 5至1 0%,例如約!重量%。 本發明之組成物投予的量與劑量瘁 展去係根據多種相關 14 200526234 因素,包括目的與投予之方式、個體之年齡、性別、體重 以及整體健康和情況以及個人症狀之嚴重度而決定。當根 據本發明之組成物係以食物或飲料的形式提供,本發 合物之合適的服用大小可為從約1毫克至約20克,較佳為 攸10笔克至約10克,更佳為從約10毫克至約i克。若二 条學f式提供,本發明化合物之合適的每日劑量為高達約 25〇毛克,較佳為高達約15〇毫克,更佳為高達約^⑻毫 而最適範圍為約1毫克至約⑽毫克。根據體重每曰劑量 可在約〇·05毫克至5克/公斤體重/天變化,較佳從約〇.5毫 克至約3克/公斤體重/天,更佳為超過1毫克/公斤體重/天, 以及甚至更佳Λ约1古士丨版里/大’ 罝… 、克,公斤體重/天。每曰劑量可相當於 -’::或可經由多單位劑量提供。根據本發明化合物 之石:置係可於廣範圍間變化,且即可由習知方式決定。 因辛技::發明化合物之量與劑量療法係根據多種相關之 口常’包括目的盘蔣; 扪一奴予之方式、個體之年齡、性 以及整體健康和情況 版重 的節障况以及個人症狀之嚴重度而決定。合適 的粑圍可在約50微券! n * / ^ 香和S古/ 克# 1〇克/天之間,較佳為在約0.5毫 克矛5克/天之間,更佳 對於公斤之患者而言。克克/天之間,例如 少或治療上有效量”係指該量可有效預防,減 ",%'、體(特別是病原性腸道細® )附著至哺乳動物 細肊(例如哺乳動物腸 預防或治療急性或是,心之物腸上皮細胞),亦即 腸道疾病。 ^之病原體相關(例如細菌相關)之 15 200526234 某车或是|人$補充物形式可藉由製藥技藝已知之習用 6成v ’驟亦即藉由混合有效物質與可食的藥學上可接受 之固態或液態载體及/或職形劑,例如填充物(如纖維素、乳 糖、蔑糖、甘露醇、山梨醇以及碟酸約)和黏結劑(如澱粉、 明膠、黃耆膠、甲基纖維素及/或聚乙稀吼钱酮(PVP)。視 而要的添加劑包括潤滑劑及流動調節劑,例如矽酸、二氧 化矽硬月曰酉夂、硬脂酸鎮,、聚乙二醇),稀釋劑, 崩解劑(如殿粉、緩曱其:奶I ^ … ^基灰粉、父聯PVP、緩脂、褐藻酸以 及褐藻酸鹽),著辛亦丨丨,4田+ 片凋味悧以及熔化劑。染料及顏料可 加至錠劑或糖衣丸塗層,例如爲辨識之目的或表明有效成 分之不同劑量。 視需要的’根據本發明之組成物可具備營養之完整 性,即可包含維生素、礦物質、微量元素以及氮、碳水化 合物和脂肪酸來源,因而可以作為營養之唯一來源,提供 基本上所有一天需要量之維生素、礦物質、碳水化合物、 月曰肪酸、蛋白質及類似物。因此,本發明之組成物可以營 養均衡完全勝食的形式提供’例如適用於口服或是管厳食。 或者,本發明之組成物可提供作為膳食的一部分,即 營養補充物,例如呈健康飲料的形式。 明之組錢合意的是以低卡路里膳食替代物或其 ::::的形式知供。在此情況下,該膳食替代物或其它 Γ低為低脂,即低於約iGen%,或實質上無脂肪, 以=2·Τ係由脂肪提供,例如約2en。墙 ,成物之總切里含㈣算1當地,單份低卡路里替 16 200526234 代物具有低於約10⑽仟卡(kcal)的卡值,及較佳為介於約 200仟卡和約5〇〇仟卡之間。 適當的本發明組成物,例如適當的低卡路里營養品, 可包含清涼飲料,例如果汁、思慕喜(sm〇〇thie)或以大豆為 勺奴料或分散在食物中之任何類型,例如乳品(dairy barS)湯、早餐穀類食品、五穀麥片(mUesli)、糖果、tabs、 餅乾、小餅乾、塗抹食果、嬰兒配方、斷奶食品、糕點糖
果、蛋糕、薄脆餅乾例如米果、以及乳製品,例如奶昔、 優袼飲料、發酵乳。 本么明之組成物視需要包括習知的食品添加物,例如 :何的乳化劑、安定劑、甜味劑、調味劑、著色劑、防腐 劑、整合劑、滲透劑、酸驗調整緩衝液或是試劑、酸化劑、 增稠劑、質地改善劑等等。 本^月在進一步方®,提供將本發明之化合物或組成 作為食品添加物之使用。 么明之合適的產品形式包含溶液、即可消耗
,,例如即可飲用之組成物、即溶飲料、液態食品 ::清涼飲料、果汁、運動飲料、乳品、奶昔、優格飲 本發明之另—具體例,本發明之組成物可以製 亚以浪縮物、粉末或是顆粒(例如冒 :::果:之其他液體稀釋’而形成即可消耗二 ρ可飲用之組成物或即溶飲料)的形式販售。 且特Π明之組成物可以呈任何合適於人類投予的形式 疋投予至胃腸道的任何部位。本發明組成物之腸 17 .200526234 杈予,且較佳為口服,以及經由管或是導管投予,皆涵蓋 於本發明内。 本發明之組成物可在醫療專家之監督下投予或是可以 自我投予。 含有根據本發明之化合物的藥學、食品或飲料能被任 何人安全地攝取,及特別建議給任何覺察有與下列有關之 =病、狀況及症狀之危險的人:炎症性腸病(ibd),特別是 潰瘍性結腸炎及克隆氏症、大腸癌、炎症性腸病㈤〇)、各 性或慢性與細菌有關之腸道疾病,例如胃腸道之感染。 T本發明一具體例中’本發明有關一種於需要此等治 療:哺乳動物包括人類,治療及/或預防例如急性或慢性血 細困有關之腸道疾病、IBD、及/或因屬 “丨(之月腸道細胞之損傷的方法,其包括投予該 哺乳動物有效2 I β α …二ί 本發明之化合物或組成物。用於此 2 效董一詞係指有效於達到所欲之治療效果的 「列如治療及/或預防急性或慢性與細菌有關之腸道疾 病,例如胃腸道之感染。 、 本^月之另I體例中’提供-種抑制病原體附著 《口礼動物細胞,例如腸道或腸上皮哺乳動物細胞之方法。 於本發明進一步夕 、例中’本發明係關於製造本發 、、 <方法,其中該方法包括將本發明組 :藥學上或是營養上可接受之賦形劑密切混合。該= 為熟習本項技者所習知者。 /寺方法 本·明所有組成物在例如上文中所描述之適應症之實 18 *200526234 用性可於標準臨床試驗中觀察到 j戈使用在下文中實施 例所描述的營養組成物,例如使用一 種或多種本發明之組 成物,範圍在約】克至15克(例如約1G克),㈣乳動物(例 如成年的動物)且在標準動物模式中。於標準動物試驗及臨 床試驗中,可觀察到該由該組成物所提供之急性或慢與細 菌有關之腸道疾病之特徵症狀之緩解,例如依任何熟習此 ,技藝者所習知的方法來監測’例如經由分析翼便微生物 囷叢,例如脫硫弧菌(Desulfobri〇)或硫酸鹽還原菌, 人類臨床試驗可受到如下之影塑· 可使用本發明之組成物進行於例如100名個體中之隨 機盲檢,安慰劑對照之平行研究。f亥等個體可接受數次(例 如三次)包含FOS之本發明組成物,例如範圍在約6克/天。 糞便樣品可於基線、治療14天後與治療28天後予以收 集,而糞便細菌例如梭狀桿菌之計數可以使用螢光原位雜 交(FlU〇rescent in situ Hybridizati〇n ; fish),例如以寡核苦 酸採針標乾1 6S rRNA。 【實施方式】 本發明現以下述實施例進一步說明·· 實施例: U生物培養基來自於 〇x〇id Ltd.,Basingstoke,UK : 瓊脂計數板(PCA) ; de Mann R〇g0sa Sharpe瓊脂及肉汁培 養液(MRSA及MRSB);最大回復稀釋(MRD);酵母萃取物; 於Postgate氏培養基之no. 1瓊脂;最大回復稀釋(MRD)。 全部是根據製造商指南製造,除了後者在從殺菌釜移出後 19 200526234 立即添加0. 1 g/ 1抗壞血酸及巯基醋酸鈉並移至厭氧氣小 室。 下列化學藥品是來自於Sigma-Aldrich Chemical Co. Ltd.,Poole UK :磷酸鹽緩衝生理食鹽水錠劑(PBS ;酸鹼值 7.2±0.2 , cat. no. P4417) ; MEM 与隹必、需月安基酉曼溶液(cat. no· M7145);胰蛋白酶一EDTA溶液(T4299,500 BAEE單位之 豬胰蛋白酶以及1 80微克EDTA/每毫升);Postgate氏培養 基。 下述者是來自於 GIBCO,Invitrogen Ltd·,Paisley,UK : Dulbecco’s,具有 Glutamx-1 經修飾之 Eagle 氏培養基 (DMEM ; cat. no· 61965-02);胎牛血清(FBS ; cat. no. 10106-169)。 HT29人類結腸腺癌上皮細胞係得自於歐洲細胞培養中 心(ECACC),應用微生物學及研究中心,Porton Down,UK (cat· no. 91072201)。細胞於 37〇C、5%C02 下之 SDMEM 之 25 cm2組織培養燒瓶中生長直到 90%細胞群集,依據 ECACC建議方法將細胞分離,並以液態氮覆蓋整分部分儲 存。這些整分部分係用於接種25cm2燒瓶,其在生長後再分 離到12-槽組織培養平盤中。該12-槽平盤再用於附著分析 之前,係生長至約90%細胞群集。 非產毒性埃希氏大腸桿菌co/z·) 0157: H7 分離物係得自於 National Collection of Type Cultures, Colindale,London,UK o 腸病原性大腸桿菌(EPEC)分離物係自1976年以來存 200526234 放在室溫之冷凍乾燥安瓿中再生。這些起初是得自於沙門 氏與志贺菌參考實驗室,公共衛生實驗室服務中心(現為衛 生防護處),Colindale,London,UK,以及由嬰兒腹瀉案例 所分離出,所使用之菌株列於表1 : 致病變型(pathovar) 血清型 菌株號碼 佛羅細胞毒素大腸桿菌 0157-.H7 NCTC 12900 (Stx") 0157:H7 NCTC 13128 (VTEC) 0157:H7 NCTC 13129 腸病原性大腸桿菌 0111:H27 E.4946/76 (EPEC) 0119:H4 E.4821/76 0128:H12 E4824/76 細菌分離物係於-80°C下儲存於低溫培養儲存珠上。於 一般瓶中之PCA斜面上的操作培養物是由該珠製備,並在4 °C儲存高達一個月。每次塗抹PCA平盤使用斜面培養物以 檢查培養物之純度。 脫硫螺菌NCIMB 1 2833係得自於工業和海洋細菌的國 家收集中心,UK。將該菌株培養在PEM於Hungate管中, 在3 7°C無氧下高達五天。在室溫下將操作培養物於Hungate 管中儲存高達兩個月。爲了製備附著分析之培養物,將1. 0 毫升之原培養物中接種至Hungate管,並培養24小時。從 此管中取出1毫升之等分部分,接種於新鮮Hungate管中 並再培養2 4小時。 所使用之碳水化合物列於表2 : 21 200526234
簡稱 全名/化學結構 ——- 起源 ----- Benefiber 部分水解之古柯豆膠 Novartis Consumer Health ______ BioMOS 甘露寡醣 Alltech,UK __-—一 CGMP 酪蛋白醣巨肽 Aria Foods,丹麥 __—--- ChOS 幾丁聚糖寡醣;97% 脫乙醯 Shrimp shells. Primex Ingredients ASA,挪威 一 卡特蘭多醣 >9·1,3·葡萄聚糖 Wako Pure Chemical Industries Ltd.,日本 葡聚糖11.6 kDa 葡聚糖11.6 kDa Sigma-Aldrich,UK 葡聚糖42kDa 葡聚糖42 kDa Sigma-Aldrich,UK IMO P900 異麥芽寡醣 Hayashibara,日本 乳醣 乳糖 Sigma-Aldrich , UK 乳酮糖 Sigma-Aldrich » UK 麥芽糊精G20 ABF,UK 麥芽糊精G30 ABF , UK 麥芽三糖 α·1,4-連接葡萄吡喃 糖單位 Sigma-Aldrich , UK Meth mann 甲基-a -D-甘露π比喃糖 苷 Sigma-Aldrich , UK POS 果膠寡醣 來自柳橙;USDA之贈與品 果膠 果膠 來自柳橙;USDA之贈與品 SiOS 唾液酸寡醣 Sunsia卜 Taiyo Kagaku Co. Ltd.,日丰 VGOS 半乳寡醣 Borculo Domo Ingredients,荷蘭 VGOS-mono 藉由超濾過移除單醣 之 vGOS BorculoDomo Ingredients,荷蘭,内部純化 xos 木寡醣 Suntory,日本 hm果膠 高甲氧基果膠(63-66 %) 掛橘皮;FlukaBiochemika LM果膠 低甲氧基果膠(6%) 蘋果;BDHLtd — 22 200526234 大腸桿菌附著之抑制 實施例1 HT29細胞於12-槽組織培養盤中生長至95 —loo%細胞 群集。細菌培養物係於37〇c下無氧生長在組織培養基中, 故些培養裱境可促進細菌附著之表現。將該細菌(於有或無 加入受試寡聽之緩衝液中)加至細胞單層,並在5% c〇2下37 C無氧培養2小時。培養之後,該細胞層於緩衝液中洗滌 三次並為該附著的細菌定量。分析係進行三重複。該受試 寡醣為甲基-α-甘露吡喃糖苷與cGMp。 在附著及洗綠階段之後,將該細胞懸浮並激烈混合以 打T凝、、Ό物所得懸浮液再分至適合受試微生物之非選擇 性瓊脂培養基。 初始接種物為 7.3 l0g cfu/ml-1(VTEC)以及 7·〇 i〇g
P付著的降低可藉由甲基一α一甘露吡喃糖苷達成。酪蛋白 酶巨狀會些微減少腸病原性大腸桿菌之附著。 實施例2 將冷康儲原料中之㈣㈣12_接種到添加 必需胺基酸(u v/v)與胎牛血清(5% v/vkDulb⑽氏調 23 200526234 正之Eagle氏培養基(題·)。該培養物於37它無氧下培養 1 8 ]、柃。將20微升整分試樣轉移到2毫升之新鮮腿中, 並於同樣環境下培養24小時。再重複此步驟兩次,以便使 有機體連Μ二天次培養。然後如同先前所述進行附著分 析其係使用2.5毫克毫升甲基一a—D 一甘露0比喃糖芽以及 D甘路糖’並利用平板計數器計數附著的細菌數目。 '纟#果顯示使用甲基U —甘露响喃糖苦及D〜甘露糖皆 良好抑制附著(圖。 α :1 -2甘露二糖及α卜6甘露二糖係利用上文所描述的鲁 方法來为析抗附著活性,具有修飾之處在於該vtec培養物 係如前述連續三天次培養。同時谓測甘露二糖與對照組之 抑制附著情形(圖2)。 已測試另外的寡醣(果膠寡醣、異麥芽寡醣、G〇s、部 刀水解之古柯丑膠、木寡醣及乳酮醣)對大腸桿菌(VTEC與 EPEC之致病變型)之抗附著活性。其方法如同上述,但是在 前述培養物製備階段包含三個次培養。所試驗之化合物包 含G0S與果膠寡醣,其已藉由超過濾去除硝酸鹽進一步純籲 化0 圓1藉由甲基-α-D-甘露吡喃糖苷及D_甘露糖抑制 VTEC對HT29細胞之附著,顯示該附著係以第一型纖毛(^^ I iimbnae)為媒介,誤差棒代表標準誤差。附著的細菌數 目是以各實驗中附著於不含募醣之對照組的數目之百分比 表示。 圓2藉由甲基一a—d 一甘露吡喃糖苷,…卜6及以一卜2甘 24 .200526234 路一糖抑制VTEC對HT29細胞之附著,誤差棒代表標準誤 差。 °、 圖3經選擇之醣類對VTEC與EpEC之抗附著活性。果 膠寡酿顯示對魔與·兩者有強力之抗附著活性(圖 測試醣類對抗大腸桿菌VTEC之一種菌株(0157: H7菌 朱CTC 1 2900)以及大腸桿菌EPEC之一種菌珠⑺119· Η 方法 用於附著分析之大腸桿菌肉汁培養物係生長於補充有 FBS及1 %非必需胺基酸溶液(SDMEM)之DMEM中。對 =:株囷株’從斜面培養接種,並於抓無氧下培養^一^ 小時。然後將隔夜之培養物接種(1%v/v)於新鮮3跗胧並 八才2 % i兄下再培養! 8 — 24小時。再重複此步驟一次。於 q7析田曰,將1〇% V/V接種物放置於預熱之SDMEM中並於 C無氧下培養4小時。 引所述製備受試菌株之培養物,然後於PBS以1 : 500 。數稀釋。該稀釋懸浮液之存活計數的測定係藉由 看於 ρ ρ Α μ 、、 ^ ,並視需要以MRD進行十進位稀釋。將受試之 =化合^容於_毫克/毫升)並藉由通過0.2微= +问過濾裔進行滅菌,該碳水化合物溶液若有需要則進一 二以,菌PBS稀釋。s删係從具有幾乎匯集成群之㈣ =早層的12-槽組織培養平盤中吸取(如前所述)。藉由將 笔升無菌PBS以移液吸管吸至每個槽中、以手動旋轉然後 25 .200526234 再吸1 以洗務該細胞單層。將〇. 5毫升等份試樣之碳水化 :物’会液加入槽中,接著再加入〇· 5毫升於PBS之細胞懸 子液對照組之製備係使用無菌m取代碳水化合物溶液。 所有的分析均經三重複進行。以手動旋轉該平盤使之混 合,然後在37t無氧下培養2小時。培養之後,自槽中吸 出細菌懸浮液’於每_槽中加人^毫料份試樣之m,手 t短暫㈣轉該平盤,然制咖移除。再重複此洗蘇步 H。於母—槽中加入70微升等份試樣之胰蛋白酶-EDTA 浴液’搖動該平盤以確保均勾覆蓋,然後在37t下i立養5 分鐘、。再们毫升等份試樣之m以移液吸管吸至每個槽 中,並以移液吸管混人亩$丨 〇直j 5亥早層元全移出且凝塊碎裂(以 目測決定)。然後將留在槽中的細菌經由於PCA上平板計數 而計算數目,若有需要則以勵進行十進位稀釋。於㈣ 計數财將所有的平盤在阶下培養18_24小時。 ^虞處理:對全部的槽及接種物計算存活計數,並以 母爱狀菌落形成單位(cfu/ml)表示。對每個測試,計算 二重複槽之平均值及標準誤差。就每一個槽而言,附著的 細菌數目是以對照組(不含碳水化合物)槽之平均值的百分 比計算,以及以接種物〔科、丨” # u儿人, 整)之百分比計算物(就以石厌水化合物溶液之稀釋予以調 之抗=r合物對大腸桿菌― 圖5碳水化合物對腸病原性大腸桿菌EPEC(〇119· H49) 之抗附著活性。誤差棒顯示三重複分析之平均值的標準誤) 26 .200526234 差。 結果: CGMP,ChOS及P〇s對大腸桿菌的兩種致病變型均為陽 性,vGOS對大腸桿菌VTEC (〇157: H7)為陽性,及卡特蘭 多醣,果膠和SiOS對大腸桿菌EPEC為陽性。相較於不含 石厌水化合物之對照組,數種化合物增加了附著的細菌數 目。這可能是由於存在有能在碳水化合物製備物中被同化 的基質,及在2小時受試培養期間大腸桿菌的接續生長。 硫酸鹽還原菌附著之抑制 · 實施例4 方法: 藉由於錐形瓶中合併下述成分製備p〇stagate氏E培 養基(PEM) : KH2P〇4 0.5 克、NH4C1 1_0 克、Na2S〇4 lo 克、
CaCl2 0·51克MgCl2. 7H2〇 2.0克、乳酸鈉3·5克、酵母萃 取物1· 0克、抗壞血酸〇· 1克、巯基醋酸鈉〇_ i克、FeSCk 7Η2〇 〇· 5克、自來水1公升。將培養基煮沸以溶解上述成分然後 q部至約50 C。以1 · 〇 M NaOH(aq)將pH值調整至7. 6。再次 鲁 煮沸該培養基並立即轉移至無氧小室(8〇% &、丨〇% c〇2、丨 L、37 C ),使之冷卻直到不燙手,並分配到Hungate管中 (10毫升/管)。將Hungate管於121。(:高壓蒸氣滅菌15分 鐘。Postgate氏E瓊脂(PEA)係如上所述製備,但添加有 1 5克瓊脂η〇· 1。在pH值調整之後,將瓊脂培養基分配至 螺旋加蓋瓶中並於12KC高壓蒸氣滅菌15分鐘。將該瓊脂 冷卻至50°C並分配至培養皿。一旦凝固,在使用前4天將 27 „200526234 該壤脂平板轉移至無氧小室中。 边u生物培養基係來自於〇x〇id Ltd.,Basingst〇ke, u:(彼等由殺菌釜移出之後立刻移至無氧小室。其最大回 /复稀釋(勵)之製備係根據製造商手冊,除了添加有各 克/升之維生素C與巯基醋酸鈉之外。 細菌附著分析之進行係如前所述(3· 3· 5節),除了單層 係在、、、田菌的存在下無氧培養一小時之外。如前所述進行數 據處理。 圖6化合物之抗附著活性。誤差棒顯示三重複分析之 籲 標準誤差。以a標示者係顯著(p<〇〇5)低於對照組。 結果 可注意到SRB附著係被幾丁募醣、半乳寡醣及果膠募 膽所抑制。果膠募醣實際上消除了 SRB附著到HT29細胞。 營養組成物 實施例5 以下列成分製備呈小餅乾形式之營養組成物:
FOS粉末⑴ 10克 小麥粉 58.9克 糠 8克 植物油 16克 小麥薄片 6克 蘇打粉 1克 鹽 0.1克 (1)來自 Borculo Domo Ingredient (荷蘭) 宜羞例6 即飲營養補充物,每100毫升 果膠募醣(2) 1.25克 28 200526234 蛋白質 9克 碳水化合物 21.4 克 蔗糖 5克 乳糖 〇·7克 脂肪 8.7克 飽和FA 0.8克 不飽和FA 7.4克 維生素混合物 7.5毫克 礦物質混合物 320毫克 ⑵來自Oranges(美國) 【圖式簡單說明】 圖1藉由曱基-ce-D-甘露吡喃糖苷及D-甘露糖抑制 VTEC對HT29細胞之附著,顯示該附著係以第一型纖毛 (type I ifimbriae)為媒介,誤差棒代表標準誤差。附著的細 菌數目是以各實驗中附著於不含寡醣之對照組的數目之百 分比表示。 圖2藉由曱基-α-d-甘露吡喃糖苷,1-6及〇!-1-2甘露 二糖抑制VTEC對ΗΤ29細胞之附著,誤差棒代表標準誤差。 圖3經選擇之醣類對VTEC與EPEC之抗附著活性。 圖 4碳水化合物對大腸桿菌 VTEC(0157: Η7 NCTC 12900)之抗附著活性 圖5碳水化合物對腸病原性大腸桿菌EPEC(0119: H49) 之抗附著活性。誤差棒顯示三重複分析之平均值的標準誤 差。 圖6化合物之抗附著活性。誤差棒顯示三重複分析之 標準誤差。以a標示者係顯著(p<0. 05)低於對照組。 29
Claims (1)
- 200526234 十、申請專利範圍: 1. 一種化合物之用途,該化合物係選自於至少—種 甘露寡醣、酪蛋白醣巨肽(CGMP)、甲基甘露寡醣、幾丁 = 醣、果膠寡醣、半乳寡醣(G0S)、卡特蘭多醣μη, 3—聚葡 萄糖)、唾液酸寡醣、異麥芽募醣、募半乳糖醛酸苦、=分 水解之古柯豆膠、龍膽寡醣、阿拉伯寡醣、果膠、乳醣: 礼_糖、乳蔗糖及長鏈異麥芽寡_,係用於製造抑制病原 體附著至喷乳動物細胞,及/或用於預防、減低或抑制哺乳 ㈣細胞被病原體侵人以及感染,特別是哺乳動物腸道及^ 或腸上皮細胞之營養或藥學組成物。 2· —種化合物之用途,該化合物係選自至少一種之 露寡醣、酪蛋白醣巨肽(CGMP)、曱基_甘露募醣、幾丁寡^甘 果膠寡醣、半乳寡醣则、卡特蘭多醣⑹,3-聚葡J 糖)、唾液酸募醣、異麥芽寡醣、寡半乳糖醛酸苦、部分: 解之古柯豆膠、龍膽寡酶、阿拉伯寡畴、果膠、乳聰^ s同糖、乳蔗糖及長鏈異麥芽募醣,係用於製造預防或户^ =動物急性或慢性之病原體相關之腸道疾病,特別= 用炎' 潰瘍性結腸炎、腹瀉疾病,或是預防或治: 物病原體微生物群落之增生的營養或藥學組成物。 3. —種化合物之用途,該化合物係選自至一 rffy» ^ 矛會 =、:蛋白.巨肽(⑽)、甲基_甘露募畴、幾丁募膽、 二 :!乳寡_(G0S)、卡特蘭多叫葡萄 二f液酸募醣、異麥芽募醣、募半乳糖醛酸苷 解之古柯豆膠、龍膽募醣、阿拉伯募醣、果膠、乳驗二 30 200526234 酮糖、乳蔗糖及長鏈異麥 5κ / 牙养醣,係用於抑制病原體附著 至哺礼動物細胞及/或預 m ^ ^ , u jx ^ , 減 > 或抑制哺乳動物細胞被病 原體k入及感染,特別是 在腸道與腸的哺乳動物細胞。 4 · 一種預防及/或底 哺礼動物急性或慢性之病原體 相關例如細囷相關之 主产 腸道疾病特別是腹瀉疾病、腸胃炎或 :場性腸炎的方法’該方法包括投予該哺乳動物治療有效 里之化合物,該化合物係選自至少―種之甘露寡聽、絡蛋 白醣巨肽(CGMP)、甲基-甘露寡酶、幾丁寡酿、㈣寡餹、 丰乳寡醣⑽S)、卡特蘭多畴⑹,3_聚葡萄糖)、唾液酸寡 醣、果膠、乳醣、乳酮糖、乳蔗糖、異麥芽寡醣、寡半乳 糖醛酸苷、部分水解之古柯豆膠、龍膽寡醣、阿拉伯^醣、 及長鏈異麥芽寡醣。 5·根據申請專利範圍第丨至3項中任一項之用途或根 據申請專利範圍第4項之方法,其中該化合物係選自至少 種之甘路养®I、果膠酸糖、唾液酸寡醣、幾丁寡驗、於 蛋白醣巨肽(CGMP)、半乳寡醣(G0S)、卡特蘭多醣及部分水 解之古柯豆膠。 U 6·根據申請專利範圍第5項之用途或方法,其中該化 合物係選自至少一種之酪蛋白醣巨肽(CGMP)、幾丁募聽、 果膠寡醣、唾液酸募醣及卡特蘭多醣。 7·根據申請專利範圍第卜5項中任一項之用途或方 法,其中該甘露寡醣係選自至少一種之α 1_2甘露寡醣、α 卜3甘露募醣及以ι_6甘露寡醣。 8· —種營養或藥學組成物,其包括至少一種選自於甘 31 200526234 QM-2甘露二 (X甘露寡醣之 露寡醣及/或甲基甘露募醣,特別是選自於 糖、Οί 1 -3甘露二糖、α 甘露二糖或甲基 化合物。 9· -種營養或藥學組成物,其包括至少一種選自於酪 蛋白醣巨肽(CGMP)、幾丁寡醣、果膠募醣、卡特蘭多醣 (/5-1,3-聚葡萄糖)、唾液酸募醣、異麥芽募醣、寡半乳糖 酪酸苷、龍膽寡醣、阿拉伯募醣及長鏈異 物,以及營養或藥學上可接受之賦形劑。牙养醣之化口10.根據申請專利範圍第9項之營養 苴 中該化合物選自於至少一種幾 $ 、、 ^種之成丁养醣、果膠寡醣、唾液 酸募醣及卡特蘭多醣。 Π· —種測試寡醣之抗附著活性的篩選方法,該方法包 二重複槽中之人類結腸細胞系 a)將募醣溶液添加到 HT29細胞單層, b)加入同體積量之細菌培養物,C)在37°c有氧,5% c〇2下2小時後洗滌細胞層, d) 用騰蛋白酶/EDTA溶液分離細胞層, e) 藉由平板計數計算細菌數, f) 將具有募醣之槽中的計數與那些不具有募醣之槽比 十一、圖式: 如次頁 32
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