TW200404782A - Phenylalanine enamide derivatives - Google Patents

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玖、發明說明： 技術領域 本發明有關數種苯丙胺酸烯醯胺酿、含其之醫藥組合物、 其製備方法及其作為醫藥之用途。 先前技術 過去數年來，發炎白血球彼此之物理相互作用已逐漸明 朗且人體之其他細胞在調節免疫及發炎反應中扮演重要角 色[Springer，T.A·，Nature, 346, 425, (1990); Springer, T.A.? Cell, 76? 301 (1994)]。特定之細胞表面分子統稱為細胞黏著分子，其可調 節許多該等相互作用。 該黏著分子依據其結構而次分為不同組群。相信在調節 免疫及發炎反應中扮演特別重要角色之黏著分子之一族群 為整合素族群。此族群之細胞結構糖蛋白具有一般非共價 鍵結之雜二聚物結構。已鑑定出至少16種不同整合素α鏈及 8種不同整合素β鏈[Newman，Ρ.等人，今日分子醫藥，304, (1996)]。此族群成員一般依據其雜二聚物組成命名，但此領 域中有多種俗名。因此整合素α4β1由整合素α4鏈與整合素βΐ 鏈所聯合構成，但亦廣泛稱為極後期抗原4 (Very Late Antigen 4) 或VLA-4。並非整合素α及β鏈之所有潛在配對性質已觀察到 且整合素族群已依據目前已辨識支配對次分為數種亞族群 [Sonnenberg, Α.，微生物學及免疫學之現有標題，184, 7,（1993)]。 整合素功能在正常生理反應中之重要性由其中整合素功 能缺乏之兩種人類缺乏疾病可看出更顯著。因此在稱為白 血球黏著缺乏症（LAD)疾病中，在白血球上表現之整合素族 86141 200404782 群之一有缺陷[Marlm，S.D_ 等人，J. Exp_ Med. 164? 855 (1986)]。患 有此疾病之病患對發炎部位補充白血球之能力降低且患有 再發性感染，極端例子中可造成死亡。在患有稱為葛雷蒙 氏（Glanzman’s)血小板官能不足之疾病（β3整合素族群成員缺 陷）之病患之例中，有血液凝塊缺陷（Hodivala-Dilke，Κ.Μ.，J. Clin. Invest. 103, 229 (1999))。 使用可阻斷該等分子各種功能之特異抗體及肽，以有利 調節細胞黏著之方式改良整合素功能之潛力在動物模型中 廣為研究[如 Issekutz，T.B·，免疫學期刊，149, 3394(1992); Li，Z·等 人，Am· J· Physiol. 263? L723,（1992); Mitjans，F.等人，J· Cell Sci·型，2825 (1995) ; Brooks，P.C·等人，J. Clin. Invest. 96? 1815 (1995) ; Binns，R. M. 等人，免疫學期刊，112, 4094,（1996) ; Ha_es，R-P等人，天然 藥物足，529 (1996); Srivata，S·等人，心臟血管回顧，並，408 (1997)]。 尤其抗α4β7-抗體已證明在發炎活性及發炎性腸疾病之非人 類靈長類模型中之疾病具有臨床及組織學上之改良 [Hesterberg，Ρ.Ε.等人，Gastroenterol，111，1373-80 (1996)]。可阻斷整 合素功能之數種單株抗體目前已研究其在人類疾病中之治 療效力且一種抗血小板整合素αΙΛβ3之嵌合抗體ReoPro使用 於冠狀血管造型術後患有心臟血管併發症之病患中可作為 強效之抗血栓劑。 整合素可辨識細胞表面及胞外基質配位體兩者，且配位 體特異性藉分子之特定α-β次單元組合而決定[Newman, P.同上 文獻]。所關心之一種特定整合素次族群包含可與兩種不同 β鏈配對之α4鏈[Sonnenberg，A.，同上文獻]。該α4β1配對發生在 狀141 200404782 許多循環白血球上（例如淋巴細胞、單細胞、嗜酸性白血球 及嗜鹼性白血球），但其不存在於循環之嗜中性白血球上或 以低量存在。α4β1結合至黏著分子（血管細胞黏著分子-1亦 稱為VCAM-1)經常可對發炎部位之内皮細胞向上調節[Osbome， L.，Cell，位，3 (1990)]。該分子亦已顯示可結合至基質分子纖維 黏連蛋白中至少三個部位[Humphries，M.J.等人，Ciba Foundation Symposium，189, 177 (1995)]。基於動物模型中以單株抗體所得 之數據，相信α4β1與其他細胞上之配位體及胞外基質間之 相互作用在白血球遷移及活化中扮演重要角色[Yednock，Τ.Α· 等人，Nature，356, 63,（1992); Podolsky，D.K·等人，J· Clin. Invest· %，372 (1993) ; Abraham，W.M·等人，J. Clin. Invest £1，776 (1994)]。 藉α4及β7配對所產生之整合素已稱為LPAM-1 [Holzmann，B. 及 Weissman，I.L·，EMBO J·邑 1735 (1989)]。該 α4β7 配對表現在 T及 B 淋巴細胞之某種次部落上及嗜酸性白血球上[Erie，D.J.等人， 免疫學期刊，517 (1994)]。類似α4β1，α4β7結合至VCAM_1 及纖維黏連蛋白。此外，α4β7結合至黏著分子上，該黏著 分子相信與白血球返回黏膜組織如胃腸黏膜（稱為MAdCAM-1)有關[Berlin，C.等人，Cell，24, 185 (1993)]。MAdCAM-1在胃腸道 中較優勢地表現。α4β7與MAdCAM-Ι間之相互作用在黏膜組 織外部之發炎部位亦具重要性[Yang，Χ-D.等人，PNAS，£1，12604 (1994) ]。 當α4β1及α4β7結合至其配位體時由其所辨識之肽序列驅物 已被鑑定。α4β1似乎可辨識纖維黏連蛋白中之LDV、IDA或 REDV肽序列及VCAM-1中之QIDSP序列[Humphries, M.J.等人，同 86141 200404782 上文獻]，而α4β7可辨識MAdCAM-1中之LDT序列[Birskin， M.J.等人，免疫學期刊，從，719 (1996)]。已有數篇報導由該 質該等短肽序列所設計之該等相互作用之抑制劑[Cardarelli， Ρ·Μ·等人，J· Biol. Chem·，269, 18668 (1994) ; Schorff，H.N 等人，生 物有機醫藥化學通訊，么2495 (1995) ; Vanderslice，Ρ.等人，免疫 學期刊，1710 (1997)]。亦已報導衍生自纖維黏連蛋白中 α4β1結合部位之短肽序列可抑制三硝基氯苯敏化之小鼠中 接觸性高度過敏反應[Ferguson，Τ.Α·，等人，PNAS，Μ，8072 (1991)] 〇 由於整合素之α4次族群主要表現在白血球上，因此其抑 制作用預期在數種免疫或發炎疾病狀態中可能有利。然而， 由於由整合素族群之其他成員所進行之廣泛分布及廣泛功 能，因此重要地是可錨定出α4次族群之選擇性抑制劑。 已發現數種酯為α4整合素之強效且具選擇性之抑制劑。 該化合物於例如本文所述之細胞分析中，在對其他亞族群 之α整合素通常不具作用或具有最小抑制作用之濃度下，可 抑制α4整合素如α4β 1及/或α4β7 ◦ 發明内容 因此依據本發明一目的係提供式⑴之化合物：

86141 10- 200404782 -ch2ch2〇ch3、 其中 R1 為-ch3、_(ch2)3ch3、-ch2ch2oh -ch2ch2och2ch2oh、-ch2ch2och2ch2och3、 -ch2ch2~n

或-ch2ch2-n N—ch3 基； 及其鹽、溶劑化物及N-氧化物。 實施方式 而J解式（1)化合物可存在有對映異構物或非對映显才 物。本發明需了解係延伸至所有使對映異構物、非對映』 構物及其混合物，包含消旋體。式 1 式⑴化合物欲代表所有 別兴構物及其混合物，除非另有說明。 本發明化合物之鹽包含醫藥 1丄 接文性鹽例如衍生自A 士 或有機酸之酸加成鹽。 目 酸加成鹽包含鹽酸鹽、氫溴 、穴敗爲、虱璜酸頤、 鹽如甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸蹢 ^ ^ /、敗_或秀瓴代酸 如對-甲苯磺酸鹽、苯磺酸鹽 ^ 、I规4奈飧酸鹽、 硯酸氫鹽、乙酸鹽、三氟 目 ^鹽、 丁、廉1蹢符v ^ 丙酸鹽、檸檬酸鹽、0

丁％—鉍鹽、反丁烯二酸鹽、 ]L J —吸鹽、丁 - 蹢、勺； 鹽、草酸鹽、酒石酸鹽及苯甲酸鹽。 一礼 本發明化合物之特別可 甘^ 用 < 鹽包含醫藥可接受性_，少、 其是酸加成之醫藥可接受性鹽。 接又f生義，尤 本發明化合物為： (2S)-2-(2-溴-3-氧代，3 5]壬小婦小 於驗酿基）胺基]苯基}丙酸斗3-(4似5_二氯異 基乙酯及其鹽、溶劑化物 86141 200404782 及N-氧化物； (2S)-2-(2-溴各氧代-螺[3·5]壬-1-缔小基胺基）各{4_[(3,5-二氯異 菸鹼醯基）胺基]苯基}丙酸2_(2_羥基乙氧基）乙酯及其鹽、溶 劑化物及Ν-氧化物； (2S)-2-(2-溴-3-氧代-螺[3.5]壬-1-缔基胺基）各{4-[(3,5_二氯異 菸鹼醯基）胺基]苯基}丙酸2_(孓甲氧基乙氧基）乙酯及其鹽、 溶劑化物及N-氧化物； (2S)-2-(2- 7臭-3-氧代-螺[3.5]壬-1-缔小基胺基）各{4-[(3,5_二氯異 菸鹼醯基）胺基]苯基}丙酸2_(嗎啉斗基）乙酯及其鹽、溶劑化 物及N-氧化物； (2S)-2-(2-溴-3-氧代-螺[3·5]壬小烯+基胺基）_3_{4_[(3,5_二氯異 菸鹼驢基）胺基]苯基}丙酸2-(4-甲基哌畊小基）乙酯及其鹽、 溶劑化物及Ν-氧化物； 且特別是· (2S)-2-(2-溴各氧代-螺[3·5]壬小烯+基胺基）_3_{4_旧，5_二氯異 菸鹼醯基）胺基]苯基}丙酸丁酯及其鹽、溶劑化物及氧化 物； (2S)-2-(2-溴_3_氧代-螺[3·5]壬小烯小基胺基）各{4_旧,5_二氯異 菸鹼醯基）胺基]苯基}丙酸2_羥基乙酯及其鹽、溶劑化物及N_ 氧化物； (2S>2_(2_ 溴 氧代 _螺[3·5]壬 dll·基胺基）·3-{4_[(3,5_二氯異 菸鹼醯基）胺基]笨基丨丙酸甲酯及其鹽、溶劑化物及队氧化 物。 本喬明《化合物為α4整合素之強校且具選擇性之抑制 86141 -12- 200404782 劑二該化合物依此方式作用之能力可簡單利用測試例如後 文貫例中所述之細胞分析加以測定。 該化合物可用以調節細胞黏著且特別適用於預防及治療 其中白血球外滲扮演重要角色之疾病或失調（包含發幻之用 途且本發明延伸至此用途及該化合物用以製造供治療此疾 病或失调之醫樂之用途。 此類疾病或失調包含發炎性關節炎如風濕性關節炎、脈 管或多皮肌炎、多發性硬化、異體移植排斥、糖尿病、發 炎：皮膚病如牛皮癬或皮膚炎、氣喘及發炎性腸疾病。 ^ t、防或/Q療疾病而·^，本發明化合物可以醫藥組合物 才又木，且依據本發明另-目的提供-種醫藥組合物，其包 式⑴化口物及一或多種醫藥可接受性载劑、賦形劑或稀 釋劑。 妹：發明之醫藥組合物可製成適合經口、頰内、非經腸道、 ^局13卩或、纟·^直腸投藥劑型或製成適合藉吸入或灌注投 藥之劑型。 經口投越而士· 、、 、 木 口’遠醫樂組合物可作成例如鍵劑、扁藥劑 或膠囊，係葬贺i：、， 于猎.自知万式與醫藥可接受性賦形劑如 預明膠化之玉米妒κ ^ 1 教私、聚乙烯基吡咯啶酮或羥丙基甲基纖 維素），填充劑（如受丨丄、

糖、微晶纖維素或磷酸氫舞）；潤滑劍（如 硬脂酸鎂、滑石或备^ a lU • 、、 &虱化矽），崩解劑（如馬鈴薯澱粉或乙醇酸 納）’或濕潤劑（如日 、 _ 月桂基硫酸鈉）混合而製備。該錠劑可藉 本技藝已知方法白、 、 、 g农。經口投藥之液體製劑可作成例如溶 液、糖漿或顯淫读 i ^ 或其可製備成乾燥製品在使用前以水 86141 -13 - 200404782 或其他適宜載體復原。此液體製劑可藉習知方式以醫藥可 接受性懸浮劑、乳化劑、非水性載體及保存劑製備。該製 劑若需要亦可含缓衝鹽、矯味劑、著色劑及甜味劑。 經口投藥之製劑可適當地調配成使活性化合物經控制地 釋出。 就頰内投藥而言，該組合物可藉習知方式調配作成錠劑 或爲藥劑。 式⑴化合物可調配成藉注射非經腸道投藥，如藉丸粒注 射或灌注。注射用調配物可成單位劑型，如於玻璃安♦瓦中 或多劑量容器中，例如玻璃小瓶中。注射用組合物可成在 油性或水性載體中之懸浮液、溶液或乳液劑型且可含調配 劑如懸浮劑、安定劑、保存劑及/或分散劑。或者，該活性 成分可成粉末劑型在使用前以適當載體如殺菌無熱源之水 復原。 除了上述調配物以外，式⑴化合物亦可調配成袋狀製劑。 此長效性調配物可藉植入或藉肌肉内注射而投藥。月 就經鼻投藥或藉吸入投藥而言，本發明所用之化合物， 以氣溶膠噴霧劑型遞送，藉加壓包裝或噴霧器使用適當: 進劑如二氯二氟曱烷、三氯-氟曱烷、二氯四氟乙燒、：: 化碳或其他通罝氣體或氣體混合物遞送。 可含一或多種單位劑型（其含活性 。該包裝或分配裝置可附有投藥 該組合物若需要可置於 成分）之包裝或分配裝置中 之指示單。 所需之本發明 預防或治療特定病况 化合物量將隨所選^ % 86141 200404782 化合物及欲治恭士 、 奈克/公 ^^患狀況而定。但通常曰劑量可自約100 藥_毫克：'克:…範圍’㈣ 太 見斤土 40毫克/公斤體重，就非經腸道投藥約ι〇 :A至5〇晕克/公斤體重及經鼻投藥或藉吸入或吹入於 藥約〇,05毫克至約1000毫克，例如0.5毫克至約1000毫克。又

彥式（1)<酯可依據後述實例所述之方法製備。通常此包 含使式⑺之中間物酸酯化： G

係使用本技蟄已知方法如與式R10H之醇在酸觸媒如對-甲苯 磺酸存在下反應。可利用另外之縮合劑例如二醯亞胺如丨_(3_ 二甲胺基丙基）-3-乙基碳二醯亞胺或N，NL二環己基碳二醯亞 胺，宜在觸媒如N-羥基化合物如N-羥基三唑如卜羥基苯并三 唑存在下使用。 式（2)之中間物可使用後述實例所述方法製備。 或者式（1)之酯可經歷轉醋化反應，較好在酸觸媒存在下 進行，或得式（1)之另一酯。 式⑴之酯亦可藉由使式（3)之胺：

86141 -15 - 200404782 與式（4)之活化酸偶合而製備：

(4) _ u π Ί又处T例所巡万法 轉化成醯氯而活化。該偶合反岸 、、^ 、 反I、了在驗如氰化物如氫化鈉 或胺如三乙胺或Ν-甲基嗎啉存在下，太、、办 卜 在/谷剑如函化烴例如 一氯甲或四氯化碳或雙核性非皙子 开貝亍/合劑如醯胺例如二甲 基甲醯胺或醚如環狀醚如四氫呋喃中 L大雨肀，在例如周圍溫度進 行。或者，式（4)之酸可使用縮合劑例如二醯胺如H3-二甲 胺基丙基）-3-乙基碳二醯亞胺或N，N，-二環己基碳二醯亞胺， 宜在觸媒如N-羥基化合物如N-羥基三唑如^羥基苯并三唑存 在下直接與式（3)之胺偶合。或者，在所需醯化反應之前， $亥故可與氯甲酸酷如氯甲酸乙酯反應。 式⑶之胺可使用下列反應圖A所述之一般路徑製備。

86141 -16- 200404782 、Q此式⑺之胺可藉使式（5)之硝基化合物還原而製備。 、卞件可包$使用例如氫在金屬觸媒例如鈀/擔體如鈀/碳 f在下，在落劑如醚例如四氫呋喃或醇例如甲醇或乙醇中 似化性氫化。該反應可在大氣壓下或高達100 pS1之壓力下進 灯。可利用其中使用例如金屬如錫或鐵在酸如鹽酸存在下 《另一化學還原反應。 式(5)y基化合物可藉使式⑺之;m與式⑹之胺反 應而氣備。該反應可在惰性溶劑或溶劑混合物中，例如烴 ::族烴例如苯或甲苯及/或自化烴如二氯乙燒或二氯甲 月Γ時’至回流溫度進行。若需要，例如當使用式⑹之 女，，可添加有機鹼如二異丙基乙基胺。 式⑹之胺可使用本技藝已 之W基笨基丙胺酸酷化。万法製備，如使平售 法；中間物可使用國際專利申請號一 _所述方 此外，式（1)化合物之 化氳在酸如乙酸存在下 之氮鹼氧化或使過氧酸 圍溫度反應而製備。 N-氧化物可例#使用氧化劑如過氧 ’在升溫例如约阶至80t使對應 如過乙酸在溶劑如二氯甲烷中在周 式⑴之鹽化合物可择— 使式（1)化合物與適當 溶劑混合物如有機溶劑 在通且落劑 用習知程库H 如醚例如乙醚或醇例如乙醇中， 用白知矛王序反應而製備。 f 丁 當需要獲得式⑴化合物之特 使對應異構物解析之任#、胃、77構物時，其可使. 任何通宜習知程序，自對應對映^ 86141 -17- 200404782 物之混合物製備 因 此，例如非對映異構之衍生物如蹢 異構物混合物如消 ：::切)之，映 所需之對映異::心鳴映異構物為鹽時)處理而回收 另—解析方法中，式⑴之消旋物 體層析儀分離。或者，芒命i如 ^手^性此硬 4 述製程之—中使用適 性中間物可獲得特定對映異構物。或者，藉由 對映:構物特異之酵素生物轉化反應如使用醋酶進行醋水 解接著自未反應之g旨對硬體僅純化對映異構上純的 酸，獲得特定對映異構物。 网品要I得本發明之特定幾何異構物時，.中間物或終產 物亦可使用層析法、再結晶法及其他習知分離程序。 實施方^ 下列Μ例說明本發明化合物之分離 用下列縮寫： ΝΜΜ- N-甲基嗎啉； EtOAc- 乙酸乙酯； MeOH- 甲醇； BOC- 丁氧基羰基； DCM- 二氯甲烷； AcOH- 乙酸； DIPEA- 一^異丙基乙胺； EtOH- 乙醇； Pyr- 吡啶； Ar- 芳基； DMSO- 二甲基亞砜； iPr- 異丙醇； Et20- 乙_ ; Me- 甲基； 86141 -18- 200404782 THF- 四氫呋喃； DMF- N，N-二甲基甲醯胺； HOBT- 1-羥基苯并三唑；FMOC- 9-芴基甲氧基羰基； DBU- 1，8-二氮雜雙環[5,4-0]十一碳-7-烯； DMAP- 4-(二甲胺基）^比啶。 所有NMR’s在300 MHz或400 MHz上獲得。所有中間物及實例 乙 Beilstein Autonom(購自 MDL 資訊系統 GmbH，Therdor-Heuss-Allee 108D 60486，法蘭克福，德國）之助命名或似乎相符之命名， 但丙烷酸鹽以IUPAC命名而非以俗名（丙酸鹽）稱之及異菸鹼 醯基（俗名）用以替代吡啶-4-羰基。 中間物1 3,5-二氣吡啶-4-羧酸 3,5-二氯吡啶（5.00克，33.8毫莫耳）之THF(25毫升）溶液在-78 °C及氮氣中，添加至LDA[自nBuLi(2.5 Μ於己烷溶液，14.9毫 升，37.2毫莫耳）及二異丙基胺（4.10克，5.7毫升，40.6毫莫耳） 產生]之THF(25毫升）溶液中，獲得黃色/棕色漿液。該反應 在-78t攪拌30分鐘接著通入C02獲得透明棕色溶液，其缓慢 獲得沉澱，以2小時溫至室溫，接著以水（20毫升）驟冷並分 配於Et2〇（100毫升）及1 M Na〇H(100毫升）之間。分離水層並以 濃鹽酸酸化至pH 1接著以10%Me〇H之DCM萃取（100毫升x3)。 合併之有機層乾燥（MgS〇4)且真空移除溶劑獲得棕色固體， 其自乙醇再結晶並真空乾燥獲得粉紅色結晶之標題化合物 (2·63 克，41%)。δΗ (DMSOd6) 8.74 (2H，s)，3C(DMS〇-d6) 163.5, 147.7, 141.0, 126.7。 中間物2 (2SV2-K第三-丁氧基羰基）胺基二氯異菸 鹼醯基）胺基1苯基丨丙酸乙酯 -19- 86141 200404782 中間物1之化合物（51.2克，0.267莫耳）之DCM(195毫升）及亞 硫醯氯（195毫升，2.67莫耳）漿液以DMF(5滴）處理並回流加熱 4小時。反應真空濃縮並與甲苯（2x50毫升）共沸獲得黃色固 體，其未進一步純化使用。（S)-3-(4-胺基苯基）-2-(第三-丁氧 羰基胺基）丙烷乙酯（130.8克，0.425莫耳）之DCM(800毫升）溶 液冷卻至0°C並以NMM(56.0毫升，0.51莫耳）處理，攪拌5分 鐘接著滴加醯氯（98.3克，0.468莫耳）之DCM(2⑻毫升）溶液且 反應溫度維持低於5°C。反應攪拌1小時，以NaHC03溶液（500 毫升）騾冷，分離有機層，以NaHC03溶液（500毫升）、10%擰 檬酸溶液（500毫升）及NaHC03溶液（500毫升）洗滌，乾燥（MgS04) 並真空濃縮，獲得黃色固體，其再結晶（EtOAc/己烷）獲得標 題化合物（140 克，69%)。δΗ (DMSO d6) 8.8 (2H，s)，7.55 (2H，dj 8.5Hz)， 7.23 (2H，d，I 8·5Ηζ)，4.0 (3H，m)，3·4 (2H，b s)，2.9 (1H，m)，2.8 (1H，m)，1·3 (9H，s)，1.25 (3H，t); (ES+，70V) 504 (MNa+)。 中間物3 (2SV2-胺基-3-Μ-ΙΎ3,5-二氯異菸鹼醯基）胺基1苯基} 丙酸乙酯鹽酸鹽 中間物2化合物（70克，0.146莫耳）之Et〇Ac(500毫升）及1，4-二 噚烷（50毫升）溶液以HC1之EtOAc溶液（5⑻毫升，3M)處理並在 室溫攪拌4小時。反應真空濃縮，獲得黃色固體，其以Et20 分散接著再結晶（EtOAc/己烷）獲得標題化合物（59.3克，92%)。 δΗ (DMSO d6)，11.10 (1H，s)，8·70 (2H，s)，7.55 (2H，d，！ 8.4Hz)，7.25 (2H，d， J 8.4Hz)5 4.10 (3H? m)? 3.10 (2H? m)5 1.10 (3H? m); m/z (ES+? 70V) 382 (MH+) ° 中間物4 (2SV2-(3-氧代螺Γ3.51壬小烯小基胺基）-3-{4-「（3,5-二 86141 -20- 200404782 氣異菸鹼醯基）胺某1笨基丨丙酸乙酯 · 1-酮基-3-羥基螺[3,5]壬-2-烯（400毫克，2.6毫莫耳）[依據 . Wasserman，Η·Η·等人，有機化學期刊，赵，1451-1455(1973)之方法 製備]及中間物3之游離鹼（400毫克，ΐ·〇4毫莫耳）之THF( 10毫 升）溶液在室溫攪拌48小時。真空移除揮發物且殘留物層析 (Si02 ; EtOAc)獲得白色粉末之標題化合物（512毫克，0.99毫 莫耳，95%)。δΗ (CDC13, 300K) 10.86 (1H，s)，8·78 (2H，s)，8·34 (1H，d，！ 8·5Ηζ)，7.56 (2H，d，1 8·5Ηζ)，7·25 (2H，d，J 8·5Ηζ)，4·36 (1H，s)，4.20-4.11 (3H，_ m)，3·13 (1H，dd，！，13.8, 5·3Ηζ)，3·00 (1H，dd，！，9.2, 13·8Ηζ)，1·67-1·19 (10H， m) ，1.17 (3H，t，I，4.1Hz); n^(ES+，70V) 516.0 及 518.0 (MH+)。 土間物5 (2SV2-(2-溴-3-氧代螺「3.51壬-1-烯小基胺基V3-M-「（3,5-二氯異於驗酿基）胺基1苯基丨丙酸乙酉旨 含中間物4(500毫克，0.97毫莫耳）及三乙胺（2當量，270微 升）之THF(10毫升）溶液在0°C以溴（1·1當量，170毫克）之THF(5 毫升）溶液逐滴處理。20分鐘後，反應溫至室溫後以Et〇Ac( 1⑻ 毫升）稀釋。粗反應混合物以飽和NaHC03水溶液（20毫升）及鲁 食鹽水（20毫升）洗滌，乾燥（MgS〇4)，過濾並真空濃縮。殘留 泡沫經層析（Si〇2 ; EtOAc)獲得白色粉末之標題化合物（511毫 克，0.86 毫莫耳，95%)。δΗ (CDC13, 300K) 8·48 (2H，s)，8·05 (1H，s br)，7·52 (2Η? d? J 8.4Hz), 7.04 (2H? d5 J 8.5Hz)? 5.81 (1H5 d? br? J 8.3Hz)5 4.98-4.91 (1H? n) ，4.21 (2H，q，J 7.1Hz)，3.21 (2H，d，！，5.3Hz)，1.70-1.66 (4H，m)，1.53-1.44 (4H，m)，1.28 (3H，t，L 7.1Hz)，1.20-1.16 (2H，m); _ (ES+，70V) 597.9 及 595.0 (MH+)。 中間物6〔2SV2-(2-溴各氧代螺「3.51壬-1-烯-1-基胺基V3-{_4^ 86141 -21 - 200404782 JH5-二氯異菸鹼醯基）胺基1笨基丨丙酸 中間物5之化合物（511毫克，0.86毫莫耳）之THF(5毫升）以 LiOH.H2O(50毫克，1·19毫莫耳）於H20(1毫升）中單次處理且反 應在室溫攪拌2小時。反應接著藉添加HOAc(冰醋酸，1毫升） 騾冷並真空移除揮發物。接著於殘留物中添加水（10毫升）以 進行沉殿。真空過濾、收集沉澱及殘留物以水（2x5毫升）洗滌·。 真空乾燥獲得細白色固體之標題化合物（421毫克，0.74毫莫 耳，87%)。3H(DMSOd6, 390K) 10.34 (lH，s)，8.67 (2H，s)，7.53 (2H，sbr)， 7·26 (2H，d，J 8·26Ηζ)，4.67 (1H，m)，3.26-3.22 (1H，m)，3·13-3·08 (1H，m)， 1.67-1.21 (10H，m); _ (ES+，70V) 569.9 及 567.9 (MH+)。 J 例 1 (2S)-2-(2- >臭-3-氧代螺「3.51 壬-1-缔-1·基月安基）-3- {4-『（3,5-二 農異於驗醒基）胺基1苯基丨丙酸2-經基乙酉旨

於中間物6之化合物（0.5克，0.89毫莫耳）之DMF(2毫升）溶 液中添加EDC(190毫克，0.97毫莫耳）、HOBT(140毫克，1.03毫 莫耳）及乙二醇（2·5毫升）。混合物在室溫攪拌48小時接著分 配於EtOAc(15毫升）及水（10毫升）之間。分離水層且有機相以 水（3x5毫升）、食鹽水（10毫升）洗滌，乾燥（Na2S04)，過濾並真 空濃縮，獲得固體。粗產物層析（Si02 ; EtOAc)獲得白色粉末 之標題化合物（287 毫克，53%)。δΗ (300 MHz，DMSO d6) 8.88 (1H，d， J 92·Ηζ)，8.79 (2H，s)，7·59 (1H，d，J 8.5Hz)，7·26 (2H，d，J 8·5Ηζ)，4.86 (1H， m)，3.62 (1H，m)，3·25 (1H，dd，J 14.0 4·6Ηζ)，3.04 (1H，dd，J，14.0, 9.4Hz)， 1,58-1.79 (6H，m)，1.37 (1H，d，J 12.7Hz)，1.11 (2H，br); m/? (ES+，70V) 610 (ΜΗ V 實例 2 (2SV2J2-溴-3-氧代螺[~3·51 壬-1-烯-l-基胺基Μ-ΙΎ3.5-二 86141 -22- 200404782 氯異菸鹼醯基）胺基1苯基丨丙酸甲酯 使用類似製備實例1之酯之程序[酸（0.50克，0.9毫莫耳）、 EDC(0.19 克）、Η〇ΒΤ(0·14 克）、甲醇（1.0 毫升）、DMF(5 毫升）]製 備標題化合物（0.42 克，80%)。Ή NMR (400 MHz，d6 DMSO) δ 1.17 (2Η，br)，1·38 (1Η，d，J=11.8Hz)，1.58-1.80 (7Η，m)，3·05 (1Η，dd，J=9.6, 14.8Hz)，3.25 (1H，dd，>4.6, 14·0Ηζ)，3.78 (3H，s)，3.62 (1H，m)，4.87 (1H，m)， 7.29 (2H，d，J=8.4Hz)，7.62 (2H，d，J=8.4Hz)，8_83 (2H，s)，8.95 (1H，d， J=9.2Hz)。(ESI，70V) MH+ 580。 實例3 (2SV2_(2-溴各氣代螺「3.51壬-1-烯小基胺基）-3- Μ·「（3.5-二 氯異菸鹼醯基）胺基1苯基丨丙酸丁酯 使用類似製備實例1之酯之程序[酸（0.50克，0.9毫莫耳）、 EDC(0.19克）、ΗΟΒΤ(0·14克）、正-丁醇（1.0毫升）、DMF(5 毫升）] 製備標題化合物（0.48 克，86%)。Ή NMR (400 MHz，d6 DMSO) δ 0.91 (3Η，t，J=7_4Hz)，1.18 (1Η，br)，1.47-1.82 (13Η，m)，3·09 (1Η，dd，J二9.6, 13·8Ηζ)，3·25 (1H，dd，J=5.1，13.8Hz)，4.18 (2H，t，J=6.3)，4·84 (1H，m)，7·31 (2H，d，J=8_5Hz)，7·62 (2H，d，J二8·5Ηζ)，8.84 (2H，s)，8·95 (1H，d，J=9.1Hz). m/2 (E% 70V) MH+ 622。 下列細胞分析可用以證明本發明化合物之效力及選擇 性。各該等分析中，對各化合物測定IC5Q值且代表達到細胞 黏著抑制50%所需之化合物濃度，其中100%=無測試化合物 時分析之黏著性，及〇%二未接受細胞之洞中之吸收度。 α4β1整合素-相關之Jl]rkat細胞對VCAM-Ig之黏著 96洞NUNC盤以F(ab)2片段之羊抗-人類IgG Fey-特異之抗體 [Jackson免疫研究室109-006-098: 100微升在2微克/毫升之0.1 Μ -23- 86141 200404782

NaHC03，pH 8·4]塗佈，在4°C隔夜。盤於磷酸鹽缓衝之食鹽 水（PBS)中洗滌（3x)接著於PBS/1% BSA中在室溫在震動板上阻 斷1小時。洗滌（3x於PBS中）後，添加稀釋於PBS/1% BSA中之35 奈克/毫升之純化2d VCAM-1-hFc且盤在室溫於搖晃板上放置 60分鐘。盤經洗滌（3x於PBS中）接著在37°C以含2.5xl05 Jurkat細 胞之200微升總體積在所滴定之測試化合物存在或不存在下 進行分析30分鐘。 各盤以培養基洗務（2x)且黏附細胞以1〇〇微升甲醇固定1 〇分 鐘接著在洗條一次。在室溫添加100微升〇·25% (w/v) Rose Bengal (Sigma R4507)之PBS歷時5分鐘且盤在PBS中洗滌（3x)。添加100 微升50%(v/v)乙醇之PBS且盤放置60分鐘隨後測定吸收度（570 nm) ° α4β7整合素-相關之JY細胞對MAdCAM-每之黏著 與α4β1分析之相同方式進行此分析，但使用MAdCAM-hFc(300奈克/毫升）替代2d VCAM-l-hFc並使用β-淋巴胚胎細胞 株JY之亞細胞株替代Jurkat細胞。如α4β1整合素分析所述般 對各測試化合物測定IC5()值。 α5β1整合素-相關之K562細胞對纖維黏連蛋白之黏著 96洞組織培養盤以以5微克/毫升之人類血漿纖維黏連蛋白 (Sigma F0895)之鱗酸鹽缓衝之食鹽水（PBS)塗佈，在37°C歷時2 分鐘。該盤經洗滌（3x於PBS中）接著再100微升PBS/1% BSA中 在室溫於搖晃板上阻斷1小時。阻斷之板經洗滌（3x於PBS中） 接著在37°C以總體積200微升之含2.5xlOsK562細胞、10奈克/ 毫升之大戟二萜醇-12-肉苴蔻酸酯-13-乙酸酯及在滴定之測 -24- 86141 200404782 試化合物存在或不存在下進行分析。培育時間30分鐘。各 板如上述α4β1所述般固定及著色。 οαηβ2-相關之人類多形核嗜鹼性白血球對塑膠之黏著 96洞組織培養盤以RPMI 1640/10% FCS塗佈，在37°C歷時2小 時。在10奈克/毫升大戟二萜醇-12-肉苴蔻酸酯-13-乙酸酯存 在下且在測試化合物存在或不存在下，以總體積200微升添 加2xl05新單離之人類靜脈多形核嗜鹼性白血球（PMN)並在 37°C培育20分鐘，接著在室溫培育30分鐘。該盤以培養基洗 滌並於各洞中添加100微升0.1% (w/v) HMB (溴化十六烷基三甲 基銨，Sigma H5882)之0.05 Μ磷酸甲緩衝液（pH 6.0)。盤接著在 搖晃器上在室溫放置60分鐘。接著使用四甲基聯苯胺（TMB) 如下分析内生性過氧化酶活性：PMN溶胞物樣品與0.22% H202 (Sigma)及 50 微克 / 毫升 TMB (Boehringer Mannheim)於 0.1 Μ 乙酸鋼 / 擰檬酸缓衝液(pH 6.0)中混合並在630 nm測量吸收度。 αΙΙί)/β3-相關之人類血小板凝集作用 使用在Chronolog全血發光凝集量測計上之阻抗凝集評估人 類血小板凝集作用。以0.38% (v/v)檸檬酸三鈉予以抗凝血之 新鮮人類靜脈血液在220xg旋轉10分鐘獲得富含人類血小板 之血漿（PRP)並於自體血漿中稀釋至細胞密度6xl08/毫升。小 量杯含等體積之PRP及過濾之Tyrode’s緩衝液（克/升：NaCl 8.0 ; Mga2.H2〇 0.427 ; CaCl20.2 ; KC1 0.2 ; D-葡萄糖 1.0 ; NaHC〇3 1.0 ; NaHP〇4.2H20 0·065)。在抑制劑存在或不存在下添加2.5 μΜ ADP (Sigma)追蹤凝集作用。 上述分析中，本發明化合物如實例所述化合物一般在α4β1 -25 - 86141 200404782 分析中之IC5Q為1 μιη及在α4β7分析中為5 μΜ或以下。因此對 實例1之化合物而言在α4β1分析中之IC5()為4ηΜ。 86141 -26-

Claims (1)

1. 200404782 拾、申請專利範圍： 1. 一種式（1)化合物，

   C Br

   其中 R1 為 _CH3、_(CH2)3CH3、_CH2CH2OH、-CH2CH2OCH3、 -CH2CH2OCH2CH2OH、-CH2CH2OCH2CH2OCH3、

   基； 及其鹽、溶劑化物及N-氧化物。 2·如申請專利範圍第1項之化合物，其為（2S)_2_(孓溴！氧代-螺[3.5]壬-1-晞_丨_基胺基）_3_ {4- [(3,5_二氯異菸鹼醯基）胺基] 私基}丙fe 丁酿及其鹽、溶劑化物及队氧化物。 化&物’其為（2S)-2-(2-溴-3-氧代-螺[3·5]壬-1-烯-1-基 胺基）-3- {4-[(3,5-二氯異於驗酸基）胺基]苯基丨丙酸丁酯。 申μ專利範圍第1項之化合物，其為（2S)_2—(2_溴各氧代_ $ [3·5]壬+晞小基胺基）各{4_[(3,5_二氯異菸鹼醯基）胺基] 苯基}丙酸2-羥基乙酯及其鹽、溶劑化物及斗氧化物。

   86141 200404782 胺基）3- {4- [(3,5- 一氯兴於驗廳基）胺基]苯基}丙酸幾基 乙酉旨。 6·如申請專利範圍第丄項之化合物，其為（2S)么（2_溴各氧代- 螺[3.5]壬-1-晞-丨_基胺基）各{4— [(3,5_二氯異菸鹼醯基）胺基] 表基}丙fe:甲g旨及其鹽、溶劑化物及氧化物。 7· 一種化合物，其為（2S>2-(2-溴各氧代-螺[3.5]壬小烯小基胺 基）各{4-[(3,5_二氯異菸鹼醯基）胺基]苯基}丙酸甲酯。 8. —種醫樂組合物，其包括如申請專利範圍第1至7項中任 一項《化合物與一或多種醫藥可接受性載劑、賦形劑或 稀釋劑。 製^如申睛專利範圍第1至7項中任一項之化合物之 方法’其包括以醇R10H使式（2)之酸酯化：

   種製造如申請專利範圍第 法c括使式（3)之胺： 方法，包捂 1至7項中任一項之化合物之

   Ο 86141 200404782 與式（4)之活化酸偶合： 86141 CI

   COOH CI 200404782 柒、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（ ）圖。 (二) 本代表圖之元件代表符號簡單說明： 捌、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式·· 86141

   -6-