TR201809456T4 - Alfa-2b adrenerjik reseptör agonistleri olan düzenleyici t hücrelerini aktifleştirme metodu. - Google Patents

Abstract

Burada Düzenleyici T-hücrelerinin yukarı doğru regüle edilmesi ve bir alfa 2 reseptör agonistinin uygulanmasıyla bu şekildeki yukarı doğru regülasyondan yararlanacak hastalıkların tedavi edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.

Description

TARIFNAME ALFA-ZB ADRENERJIK RESEPTÖR AGONISTLERI OLAN DÜZENLEYICI T HÜCRELERINI AKTIFLESTIRME METODU Ön Bilgi Burada T hücrelerinin alt türlerinde bulunan alfa-28 adrenerjik reseptörlerin kesfi ve bu alfa-2 reseptör agonistlerinin, bahsi geçen T hücrelerinin isleyislerini modüle etmek için kullanmabilecegi ve T hücrelerinin rol oynadigm nevrit, Guillan-Barre sendromu, romatoid artirit, tip 1 diyabet, multiple sclerosis (MS), graft versus host hastaligi i(GVHD), otoimün uveit, okuler inflamasyon, kuru göz sendromu, sjogren sendromu, atopik dermatit, sedef hastaligi,i iltihabi bagirsak hastalig , huzursuz bag rsak sendromu, astim ve aplastik anemi tedavisinde kullanTan medikal indikasyonun içindeki imidazolin veya imidazol bilesigini açiklamakta fakat, istemlerde tanmilandgü'izere özel bilesimleri buna dahil etmemektedir.

Bulusun Özeti Mevcut tarifname, bir hastanmi düzenleyici T hücreleri fonksiyonlariIiEiyukarüregüle eden, aynD sekilde benzer bir yukarü regülasyona ihtiyaç duyan hastaya alfa-28 reseptör agonisti verilmesinden olusan bir metot sun maktad in.

Baska bir düzenlemede, mevcut tarifname, bir hastan'n düzenleyici T hücreleri fonksiyonlar ni iyukari iregüle eden, ayni isekilde benzer bir yukari iregülasyona ihtiyaç duyan ve ciddi derecede alfa-2A reseptör agonisti faaliyetinden yoksun bir hastaya alfa-2 reseptör agonisti verilmesinden olusan bir metot sunmaktad r.

Bir diger düzenlemede, üstteki ilk iki paragrafta bahsi geçen düzenleyici T hücreler, CD25+, FoxP3+ T hücresidir.

Mevcut bulus kuru göz sendromunun tedavi metodunda kullanilmak üzere bir alfa-28 reseptör agonisti sunmaktad'r, ve alfa-2 agonisti asag dakilerin olusturdugu gurubun içinden seçilmistir: i) formülün bir bileseni olan bir imidazolin veya, farmakolojik olarak kabul görmüs benzer bir tuz; ve ii) asaglakilerin olusturdugu bir grubun içinden seçilmis bir imidazol: O ; veya bu hususta farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzdur.

Baska bir düzenlemede, mevcut bulus kuru göz sendromunun tedavi metodunda kullan Imak üzere ciddi derecede alfa-2A reseptör agonist faaliyeti yoksunlugu bulunan bir alfa-2 reseptör agonisti sunmaktadin, ve burada alfa-2 agonisti asaglîiiakilerin olusturdugu gurubun içinden seçilmistir: i) bir imidazolin olup, burada imidazolin formülün bir bilesenidir veya, farmakolojik olarak kabul görmüs benzer bir tuz; ve ii) bir imidazol olup, burada imidazol asagidakilerin olusturdugu bir grubun içinden seçilmistir: O ; veya bu hususta farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzdurz Baska bir düzenlemede, mevcut bulusun alfa-2 reseptör agonisti önce ilk süreçte verilir, daha sonra yoksunluk süreci geçince, ikinci süreçte tekrar verilir.

Baska bir düzenlemede, mevcut bulusun alfa-2 reseptör agonisti önce baslanm sürecinde verilir, daha sonra bir geri çekilme süreci geçince, ikinci süreçte tekrar verilir. Ilk, ikinci ve geri çekilme süreçleri bir, iki, üç, dört, bes, altî yedi, sekiz, dokuz, on, on bir, on iki, on üç veya on dört gün, ya da bir, iki, üç veya dört hafta olabilir.

Baska bir düzenlemede, mevcut bulusta yer alan alfa-2 reseptör agonisti asagmlaki grubun içinden seçilmistir: veya, farmakolojik olarak kabul görmüs benzer bir tuz.

O . ve veya bu hususta farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzdur.

Baska bir düzenlemede, alfa-2 agonist imidazolini forlmülün bir bileseni, veya, farmakolojik olarak kabul görmüs benzer bir tuzdur.

Baska bir düzenlemede, mevcut bulusta yer alan alfa-2-agonist imidazolü asagidaki grubun içinden seçilmis bir bilesendir: O ; veya bu hususta farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzdur. ggizimlerin Açiklamas: Sekil 1, qPCR aracmgwla insan T hücrelerinin alt kümelerinde bulunan 023- reseptörlerinin bir Açmlamasîiîgösterirken dgA-reseptörlerini içermemektedir.

Sekil 2, dalakta bulunan CD4+/CD25+ Treg hücreleri olan CD4+ T hücrelerinin frekansLitiLm, Alodinik Nöropatik AcL'nLm SNL Fare Modeli'nde bulunan Bilesen Biye göre sürekli art'sinii göstermektedir.

Sekil 3, Bilesen B aza-reseptör agonistinin sabit MS agrilarimda analjezik etki ettigini ve Treg hücrelerinin modülasyonunu göstermektedir.

Sekil 4, Bilesen B'nin rekürren ve tekrar eden EAE'nin proteolipidlerinin uyarühg: modelinin klinik seyrinde önemli etkilere yol açtgmiügöstermektedir.

Sekil 5, Bilesen B”nin rekürren ve tekrar eden EAElnin PLPlerinin uyarIdgimodelde, MSS'deki bag @[RIR hücrelerinin varlgIiEönemli ölçüde azalttEgmEgöstermektedir.

Sekil 6, Bilesen C'nin rekürren ve tekrar eden EAEinin proteolipidlerinin uyarTdrg_ modelinin klinik seyrinde önemli etkilere yol açtLgnLgöstermektedir.

Sekil 7, Bilesen C'nin rekürren ve tekrar eden EAE'nin PLPIerinin uyar ldlgl Imodelde, omurilikteki düzenleyici T hücrelerinin frekans ni` önemli ölçüde artt'rdlg n göstermektedir.

Sekil 8, Bilesen B'nin klinik hastalfklarda ve EAAU farelerinin göz sNFltarlTlidaki enflamatuar hücrelerin sayßüüzerinde önemli bir etkisi oldugunu göstermektedir.

Sekil 9, Bilesen B'nin EIU farelerinin göz sülmarmidaki protein konsantrasyonu üzerinde önemli bir etkisi oldugunu göstermektedir.

Sekil 10, Bilesen B”nin fare EIU modelinde kandaki nötrofil ve Ienfosit seviyesini normalize ettigini göstermektedir.

Sekil 11, donörün, kurutma stresinin baslangiç nda Bilesen B ile tedavi edilmesinin, aIIG nin göz yasindaki TNF-alfa ve IL17 seviyelerini ciddi bir biçimde azalttiglnl göstermektedir.

Sekil 12, fareleri kurutma stresine maruz blnakt ktan sonra terapötik modda Bilesen C verilmesinin, goblet hücresi kaybîilîve konjunktiv içine T hücresi sâmasmrlciddi bir biçimde azalttEgIiDgöstermektedir.

Bulusun AyrIitÜJZlTan I'nü Alfa-2 reseptör aqonistleri Alfa-2 reseptör agonistleri, alfa-2 adrenerjik reseptörleri aktive eden bilesenlerdir. Bu tür reseptörlerin A, B ve C olacak sekilde üç alt kategorisi vardi. Bir bilesigin, alfa-28 adrenerjik reseptörlerindeki brimonidine oranla %25'ten fazla etkinligi varsa o “alfa-28 reseptör agonisti”dir; Bir bilesigin, alfa-2C adrenerjik reseptörlerindeki brimonidine oranla de alfa-20 adrenerjik reseptörlerindeki brimonidine oranla %25'ten fazla etkinligi varsa o agonisti olan bir bilesik aynüzamanda alfa-ZB/ZC reseptör agonisti de olabilir. AyrlEa, alfa- 2C reseptör agonisti olan bir bilesik ayn Dzamanda alfa-ZB/ZC reseptör agonisti de olabilir.

Baska bir düzenlemede, mevcut bulusun metotlarîalfa-ZA reseptör alt türünde ciddi derecede eksikligi bulunan alfa-2 agonistleri kullanmaktadm. Eger agonistin alfa-2A reseptör alt türündeki brimonidin etkinligi %40'tan az ise, o agonist ciddi derecede alfa-2A reseptör etkinligi eksikligi gösterir. Bulusun bilesimleri, bu sebeple, alfa-28 reseptör agonistleri, ciddi derecede alfa-2A etkinligi eksikligi gösteren alfa-25 reseptör agonistleri; ciddi derecede alfa-2A etkinligi eksikligi gösteren alfa-2C reseptör agonistleri; ciddi derecede alfa-2A etkinligi eksikligi gösteren alfa 28/2C reseptör agonistleri içermektedir; Yukarmlaki bilesenlerin her biri alfa-2 reseptörleri dßîida herhangi baska reseptörleri baglasalar bile kullan Iabilmektedir; örnegin, alfa- ZC ve alfa-20 reseptör alt gruplarîidan yalnîca birindeki veya ikisindeki brimonidinin olmasEkaydß/Ia, alfa-1 reseptör agonistleri de kullanmabilir.

Intrensik aktivite olarak da bilinen etkinlik, bir bilesigin ulasabilecegi en üst reseptör aktivasyonun bir ölçüsüdür ve cAMP veya Reseptör Seçimi ve Amplifikasyon Teknolojisi (RSAT) gibi kabul görmüs herhangi bir alfa-adrenerjik deney kullan larak belirlenebilir. Etkinlik, bir ilacin en üst etkisinin her bir reseptör alt türünün en üst etkisine bir orani veya yüzdesi olarak temsil edilir. Kendisi de bir alfa-28 reseptör agonisti olan brimonidin (alfa-28 adrenerjik reseptörlerdeki brimonidin etkinligi Agonist etkinligi, örnegin Reseptör Seçimi ve Amplifikasyon Teknolojisi (RSAT) deneyleri sitosensör mikrofizyometrik deneyler kullanülarak karakterize edilebilir. (Neve et al., J. Biol. bir alfa-adrenerjik reseptör alt türü içeren hücreler veya tek bir rekombinant alfa-adrenerjik reseptör alt türü içeren transfeksiye hücreler kullanilarak gerçeklestirilir. Adrenerjik reseptör bir insan reseptörü veya benzer farmakolojideki insan reseptörü homologu olabilir.

RSAT deneyi, bitisik hücrelerin kar sik popülasyonundaki reseptör içeren hücrelerin seçici proliferasyonuna sebep olan reseptör aracTFtemas yasag Fkaybmrölçer. Hücre sayßthdaki artlS, beta-galaktosidaz gibi uygun, takip edilebilen markör genlerle, dilendigi takdirde, nüfuzu yüksek veya ultra yüksek formatljair deneyle degerlendirilir. G proteini aktive eden reseptörlerden Gq proliferatif tepkiye sebep olur. Normalde Gi ile birlesen alfa-adrenerjik reseptörler, Gq/i5 olarak belirlenmis Gi reseptör tanmia alanEiçeren hibrit Gq proteinini de Örnegin, bir RSAT deneyi temelde asag daki gibi gerçeklestirilir: NlH-3T3 hücreleri cm.lik kaplarda yogunlugu 2 x 106 olan hücreler ile kaplanin ve Dulbecco'nun %10 buzagHserumu ile güçlendirilmis Eagle ortamTîda muhafaza edilir. Bir gün sonra, hücreler, kod semasjp-SV-ß-galaktosidaz (5-10 pg), reseptör (1-2 pg) ve G protein (1-2 pg) olan memeli eksprezyon plazmitleri ile kalsiyum fosfat çökeltmesi ile ayn: zamanda transfekte olurlar. Ayrma, tasßrmiDNA da, örnegin 40 pg somon sperm DNA's: transfeksiyon verimliligini arttmmak için kullanmabilir. Taze besiyeri ertesi gün eklenir; Bir iki gün içinde hücreler, 50 deney alikotunda toplanarak dondurulur.

Transfekte edilen hücreler çözülür ve testedilecek bilesiklerin 100 pL'Iik alikotlarlia, 100 pL'lik hücreler eklenir ve, örnegin 96-b0sluklu kaba çesitli konsantrasyonda üç kere test edilerek yerlestirilir. Inkübasyon 37 °C`de 72-96 saat boyunca devam eder.

Fosfat tamponlanmis tuzlu su ile yikandiktan sonra ß-galaktosidaz aktivitesi, 200 pL kromojenik substrat (fosfat tamponlu sudaki 3,5 mM O-nitrofeniI-ß-D- galaktopiranozit/%O,5 NP-40) eklenerek belirlenir, gece boyunca 30 °C'de inkübe edilir ve 420 nm'deki optik dansitesi ölçülür. Hücre sayisina bagl olan ve reseptör araciiDproliferasyonu yansifan sogurganlfR, enzim aktivitesinin bir ölçümüdür. Her bir ilacî'i tüm reseptörlerindeki E050 ve en üst etkisi (etkinligi) belirlidir.

Ciddi derecede alfa-2A reseptör aktivitesi eksikligi olanlarüda içeren alfa-28 ve -2C reseptör agonistleri teknikte bilinmektedir. Alfa-2 agonistlerinin yapmar: sentezleri ve Isteyen birisi bulusun metotlarnda her türlü farmakolojik olarak kabul edilmis tuz, ön ilaç, izomer veya istemde bulunulan alfa-2 reseptör agonistinin raremik karßmhrkullanabilir. alifatik hidrokarbon grubudur. Tercih edilen alkil gruplarü zincirlerinde 1 ila 12 aras: karbon atomu bulundururlar. Daha çok tercih edilen alkil gruplarü zincirlerinde 1 ila 6 arasFkarbon atomu bulundururlar. DaIIH, bir ya da daha fazla metil, etil veya propil gibi alt alkil grubun, lineer bir alkil zincirine bagli blmas demektir. "Alt alkil” düz veya dalli olan bir zincirinde yaklasik 1 ila 6 arasi [karbon atomu bulundurdugu gruptur. ”AIkiI” degistirilemez veya her bir degiskeni halo, alkil, aril, heterosiklik, heteroaril, sikloalkil, siyano, hidroksi, alkoksi, altiktiyo, amino, oksim içeren gruplardan (örnegin: =N-OH), - NH(alkiI), -NH(sikI0aIkiI), -N(alkil)2, -O-C(O)-alkil, -O-C(O)-aril, -O-C(O)-sikloalkil, - SF5, carboksi ve -C(O)O-alkil) bagîlnsî seçilen, ayri :ya da farklüolan bir veya daha fazla degisken ile istege baglü olarak degistirilebilir. Uygun alkil gruplarîidan smülaylîtîolmayan örnekleri arasnda metil, etil, n-propil, izopropil ve t-bütil bulunur. en az bir karbon-karbon çift bagiiçeren alifatik hidrokarbon grubu anlamIidadI. Tercih edilen alkenil gruplar: zincirlerinde 2 ila 12 arasikarbon atomu bulundururlar; Ve daha çok tercih edilenler ise, zincirlerinde 2 ila 6 aras karbon atomu bulundururlar. Dalll, bir ya da daha fazla metil, etil veya propil gibi alt alkil grubun, lineer bir alkenil zincirine bagl olmasi idemektir. “Alt alkenil" düz veya dall olan bir zincirinde yaklas k 2 ila 6 aras karbon atomu bulundurdugu gruptur. "AIkeniI" degistirilemez veya her bir degiskeni halo, alkil, aril, sikloalkil, siyano, alkoksi ve -S(alkil) içeren gruplardan bagWhsü seçilen, aynFya da farklîolan bir veya daha fazla degisken ile istege bagl :olarak degistirilebilir. Uygun alkenil gruplarlin sîtîlayiüolmayan örnekleri arasnda ethenil, propenil, n-bütenil, 3- metilbüt-2-enil, n-pentenil, oktenil ve desenil bulunmaktad I. ile elde edilen çift fonksiyonlu grup demektir. Alkilenin sIiIlayîzüolmayan örnekleri metilen, etilen ve propilendir. atomu içeren ve bünyesinde en az bir karbon-karbon üçlü bag bulunduran alifatik hidrokarbon grubu anlam na gelmektedir. Tercih edilen alkinil gruplar, zincirlerinde 2 ila 12 aras karbon atomu bulundururlar; ve daha çok tercih edilenler ise, zincirlerinde 2 ila 4 arasîkarbon atomu bulundururlar. DaIII bir ya da daha fazla metil, etil veya propil gibi alt alkil grubun, lineer bir alkinil zincirine bagl:0lmasüdemektir. “Alt alkinil” düz veya dallüolan bir zincirinde yaklasER 2 ila 6 arasükarbon atomu bulundurdugu gruptur. Uygun alkinil gruplarIiIi snIIaymüolmayan örnekleri etinil, propinil, 2-butinil ve 3-metilbutinildir. “Alkinil” degistirilemez veya her bir degiskeni alkil, aril ve sikloalkil içeren gruplardan bagimsiz seçilen, ayn ya da farkli lolan bir veya daha fazla degisken ile istege bagll olarak degistirilebilir. veya multisiklik halka sistemi demektir. Aril grubu burada belirtildigi gibi aynüveya farkl: olabilen, bir veya daha fazla “halka sistem degiskeni“ ile istege baglüolarak degistirilebilir.

Uygun aril gruplarIiIi sIiIlayEriolmayan örnekleri arasnda fenil ve naftil bulunur. atomlarlidan birinin veya daha fazlasmiîti karbondan baska bir element oldugu (örnegin tek baslarîia veya bir kombinasyon seklinde, nitrojen, oksijen, sülfür gibi) aromatik monosiklik veya multisiklik halka sistemi demektir. Tercih edilen heteroariller ila 6 halka atomu içerirler. "Heteroaril”, burada belirtildigi gibi ayn veya farkli olabilen, bir veya daha fazla “halka sistem degiskeni” ile istege baglliolarak degistirilebilir. Heteroaril kök isminden önce gelen aza, oxa veya tiya ön ekleri, en azindan sras yla bir nitrojen, oksijen veya sülfür atomunun halka atomundaki varlFgFrliHbelirtir. Heteroaril grubundaki bir nitrojen atomu, kendisine karsm gelen N- oksit ile istege baglîolarak oksidize edilebilir. “Heteroaril” ayrßa, yukarEla belirtilen bir heteroaril grubunun, yukarîja belirtilen bir aril grubuna dahil olmasmiüda içerebilir.

Uygun heteroaril gruplarîtdan smmlaymüolmayan örnekler pridil, priazinil, furanil, tiyenil, pirimidinil, piridon (N-degistirilmis piridonlar da dahil olmak üzere), izoksazolil, izotiyazolil, tiyazolil, pirazolil, furazanil, pirolil, pirazolil, tiyazolil, 1,2,4-tiyadiyazolil. pirazinil, piradazinil, kuinokzailil, pitalazinil, oksindolil, imidazo[1,2-a]piridinil, imidazo[2,1-b]tiyazolil,benzofurazanil, indolil,azaind0lil,benzimidazolil, benzotiyenil, kuinolinil, imidazolil, tiyenopiridil, kuinazolinil, tiyenopirimidil, pirolopiridil, imidazopiridil,izokuinolinil, benzoazaindolil, 1,2,4-triazinil, benzotiyazolil ve benzerleridir. “Heteroaril" taniml layn zamanda, tetrahidroizokuinolil, tetrahidrokuinolil ve benzerleri gibi klSmen satüre edilmis heteroaril parçalar da kapsamaktad r. gruptur. Tercih edilen arilalkiller alt alkil gruplar: içerirler. Uygun arilalkil gruplarîil shîlaylî olmayan örnekleri araslida benzil, 2-fenetil ve naftalinmetil bulunur. Ana parçan bag :alkil üzerinden olur. anlamiriidadiri. Tercih edilen alkilariller alt alkil gruplariiiçerirler. Uygun alkilaril gruplarini n sini nlay c olmayan örnegi tolildir. Ana parçanin bag aril üzerinden olur. olmayan mono- veya multisiklik halka sistemi demektir. Tercih edilen sikloalkil halkalarü ila 7 halka atomu içerirler. “Sikloalkil”, burada belirtildigi gibi ayaneya farklEiolabilen, bir veya daha fazla “halka sistem degiskeni" ile istege baglîolarak degistirilebilir. Uygun monosiklik sikloalkillerin sîillaymüolmayan örnekleri arasmda siklopropil, siklopentil, sikloheksil, sikloheptil ve benzerleri bulunur. Uygun multisiklik sikloalkillerin SIiIIayErD olmayan örnekleri arasîida 1-dekalinil, norbornil, adamantil ve benzerleri bulunur. belirtilen gibi) bir alkil parça ile baglanmasi ldemektir. Uygun sikloalkilalkillerin s nirlayic olmayan örnekleri arasinda, sikloheksilmetil, adamantilmetil ve benzerleri bulunur. karbon atomu içeren aromatik olmayan mono veya multisiklik halka sistemi demektir.

Tercih edilen sikloalkenill halkalar:5 ila 7 halka atomu içerirler. “Sikloalkenil”, burada belirtildigi gibi aynîveya farklEiolabilen, bir veya daha fazla “halka sistem degiskeni” ile istege baglîolarak degistirilebilir. Uygun monosiklik sikloalkenillerin sIiIayEiEolmayan örnekleri arasîida ssiklopentenil, sikloheksenil, siklohepta-1,3-dienil ve benzerleri bulunur.

Uygun multisiklik sikloalkenillerin sliîlayEEblmayan örnegi norbornilenildir. belirtilen gibi) bir alkil parça ile baglanmasi demektir. Uygun sikloalkenilalkillerin s nirlayic olmayan örnekleri arasinda, siklopentenilmetil, sikloheksenilmetil ve benzerleri bulunur. klor ve bromdur. halka sisteminde uygun olan bir hidrojeni degistirir gibi, eklenen bir degisken demektir.

Halka sistem degiskenleri, her biri bagînsü bir sekilde alkil, alkenil, alkinil, aril, heteroaril, aralkil, alkilaril, heteroaralkil, heteroarilalkenil, heteroarilalkinil, alkilheteroaril, hidroksi, hidroksialkil, alkoksi, ariloksi, aralkoksi, asil, aryil, halo, nitro, siyano, karboksi, alkoksikarbonil, ariloksikarbonil, aralkoksikarbonil, alkilsulfonil, arilsulfonil, heteroarilsulfonil, alkiltiyo, ariltiyo, heteroariltiyo, aralkiltiyo, heteroaralkiltiyo, sikloalkil, heterosiklil -SF5, -OSF5 (aril için), -O-C(O)-alkil, -O-C(O)-aril, -O-C(O)-sikloalkil, -C(=N- CN)-NH2, -C(=NH)-NH2, -C(=NH)-NH(alkil), oksim (e.g., =N-OH), -NY1Y2, -alkil-NY1Y2, - C(O)NY1Y2, -SOgNY1Y2 ve Yq'in ve Yglnin bagînsî bir sekilde hidrojen, alkil, aril, sikloalkil ve aralkil arasmidan seçildigi, aynüya da farklüoldugu -SOzNY1Y2 arasîidan seçilerek ayaneya farkljolabilir. “Halka sistem degiskeni” aynEZamanda, ayn :anda iki yakm karbon atomunda ki iki hidrojen atomunun (her karbon için bir H atomu) yerini alan tek bir parçayüda kapsayabilir. Bu tarz parçalara örnek olarak; metilen dioksi, etilendioksi, -C(CH3)2- ve benzer parçalariolusturanlar, örnegin: (%5 121) ve b. belirtilen gibi) bir alkil parça ile baglanmaslîdemektir. Uygun heteroarillerin slîtlT'laymH olmayan örnekleri arasTida, 2-piridinilmetil, kuinolinilmetil ve benzerleri bulunur. “Hetersiklil” tercihen 5 ila 10 fakat ortalama 3 ila 10 halka atomu bulunduran ve bu halka atomlarmdan birinin veya daha fazlasIiIJ karbondan baska bir element oldugu (örnegin tek baslama veya bir kombinasyon seklinde, nitrojen, oksijen, sülfür gibi) aromatik olmayan doymus monosiklik veya multisiklik halka sistemi demektir. Halka sisteminde hiç yakIi oksijen ve/veya sülfür atomlarübulunmamaktadî. Tercih edilen heterosikliller 5 ila 6 halka atomu içerirler. Heterosiklil kök isminden önce gelen aza, oxa veya tiya ön ekleri, en azlidan srasLyla bir nitrojen, oksijen veya sülfür atomunun halka atomundaki varlgmiu belirtir.

Heterosiklil halkas nda herhangi bir -NH, bir -N(Boc), -N(CBz) veya -N(Tos) grubu ve benzeri bir sekilde korunarak yer alabilir; benzer korumalar da bu bulusun bir parças olarak degerlendirilmektedir. “Heterosiklil”, burada belirtildigi gibi ayn veya farki olabilen, bir veya daha fazla “halka sistem degiskeni“ ile istege bagli lolarak degistirilebilir.

Heterosiklildeki nitrojen veya sülfür atomu, kendilerine karsmk gelen N-oksit, S-oksit veya S,S-dioksit ile istege baglDolarak okside edilebilir. Uygun monosiklik heterosiklil halkalari shiîlayi: olmayan örnekleri arasida, piperidil, pirrolidinil, piperazinil, morfolinil, tiyomorfolinil, tiyazolidinil, 1,4-diokanil, tetrahydrofuranil, tetrahidrotiyofenil, Iaktam, Iakton ve benzerleri bulunur. “Heterosiklil” aynîzamanda yukaruda belirtilen gibi :onun aynD halkadaki iki hidrojen atomunu, karbon atomlarli ile degistiren heterosiklili de kapsamaktadln. Bu tarz parçaya örnek pirrolidondur. belirtilen gibi) bir alkil parça ile baglanmasudemektir. Uygun heterosiklalkillerin snLijach_ olmayan örnekleri arasinda piperidinilmetil, pierazinilmetil ve benzerleri bulunur. halka atomlarFrlidan birinin veya daha fazlasITliiTli karbondan baska bir element oldugu (örnegin tek baslarîia veya bir kombinasyon seklinde, nitrojen, oksijen, sülfür gibi) ve bunlarin en az birisinde karbon-karbon çift bagü veya karbon-nitrojen çift bag: bulunduran aromatik olmayan monosiklik veya multisiklik halka sistemi demektir.

Halka sisteminde hiç yakmi oksijen ve/veya sülfür atomlarübulunmamaktad I. Tercih edilen heterosiklenil halkalarljö ila 6 halka atomu içerirler. Heterosiklenil kök isminden önce gelen aza, oxa veya tiya ön ekleri, en azîidan smaswla bir nitrojen, oksijen veya sülfür atomunun halka atomunda mevcut oldugu anlamna gelir. Heterosiklenil, yukarida belirtildigi gibi “halka sistem degiskeni” ile bir veya daha fazla halka sistem degiskeni ile istege bagl 'olarak degistirilebilir. Heterosiklenildeki nitrojen veya sülfür atomu, kendilerine kars I k gelen N-oksit, S-oksit veya S,S-dioksit ile istege baglil olarak okside edilebilir. Uygun heterosiklenil gruplarinin slnlnlayicl !olmayan örnekleri tetrahidropiridinil, 1,4,5,6-tetrahidropirimidinil, 2-pirrolinil, 3-pirrolinil, 2-imidazolinil, 2- pirazolinil, dihidroimidazolil, dihidrooksazolil, dihidrooksadiazolil, dihidrotiyazolil, 3,4- dihidro-2H-piranil, dihidrofuranil, florodihidrofuranil, 7-oksabisiklo[2.2.1]heptenil, dihidrotiyofenil, dihidrotiyopiranil ve benzerleri bulunur. “Heterosiklenil” aynüzamanda yukarmla belirtilen gibi =O'nun aynÜhaIkadaki iki hidrojen atomunu, karbon atomlarD ile degistiren heterosiklenili de kapsamaktad I. Bu tarz parçaya örnek pirrolidinondur. (yukarida belirtilen gibi) bir alkil parça ile baglanmasüdemektir.

Bu bulusun hetero-atom içeren halka sistemlerinde, N, 0 veya S'e yakn karbon atomlarnda hiç hidroksil grup bulunmadgLve de, baska heteroatomlara yakLnl karbonlarda hiç N veya 8 gruplari bulunmadigl not edilmelidir. Bu sebeple, örnegin halkada: 2 ve 5 olarak isaretlenmis karbonlarda dogrudan bagl hiç -OH bulunmamaktad r.

Ayrma, örnegin parça gibi totomerik olan formlarm: bu bulusun belirli düzenlemelerinde esdeger oldugu da not edilmelidir. anlamlTiia gelir. Tercih edilen alkinilalkiller alt alkiniller veya alt alkil gruplar içerir. Ana parçanîî bagZalkil üzerinden olur. Uygun alkinilalkil gruplarmiîi sIiIIayElîolmayan örnegi proparjilmetildir. alkil- bir grup anlamma gelir. Tercih edilen heteroaralkiller alt alkil gruplarüiçerirler.

Uygun aralkil gruplarinin sin nlayic olmayan örnekleri aras nda piridilmetil ve kuinolin- 3-ilmetil yer alin Ana parçan n bagi alkil üzerinden olur.

Tercih edilen hidroksialkiller alt alkiller içerirler. Uygun hidroksialkil gruplarmimi smûlayßîolmayan örnekleri arasnda hidroksimetil ve 2-hidroksietil yer aim.

Ana parçanli bagEkarbonil üzerinden olur. Tercih edilen asiller alt alkiller içerirler. Uygun asil gruplarlin smilayßEblmayan örnekleri araslida formil, asetil ve propanoil yer aII. anlam ndadiri. Ana parçanin bagi Ikarbonil üzerinden olur. Uygun gruplarin snirlayic olmayan örnekleri arasinda benzoil ve 1-naft0il bulunur.

Uygun alkoksi gruplarFnlTii smmlayßm olmayan örnekleri arasinda metoksi, etoksi, n- propoksi, izopropoksi ve n-bütoksi yer all. Ana parçanm bag Eleter oksijen üzerinden olur.

Uygun ariloksi gruplarIJI sîiîlayEEolmayan örnekleri arasî'ida fenoksi ve naftoksi yer aim. Ana parçanIi bagEieter oksijen üzerinden olur. grubudur. Uygun aralkiloksi gruplarIiiIi SIiIIaymîolmayan örnekleri arasnda benziloksi ve 1- veya 2-naftalinemetoksi yer alin Ana parçanin bagi eter oksijen üzerinden olur.

Uygun alkiltiyo gruplarinin sin rlayic olmayan örnekleri arasinda metiltiyo ve etiltiyo bulunur. Ana parçann bagîsülfür üzerinden olur.

Uygun ariltiyo gruplarIiIi smmlaymüolmayan örnekleri arasîida feniltiyo ve naftiltiyo yer aim. Ana parçanIi bagüsülfür üzerinden olur. grubudur. Uygun aralkiltiyo gruplarinin s ninlayici iolmayan örnegi benziltiyodur. Ana parçan n bagi sülfür üzerinden olur. smûlayßîolmayan örnekleri araslida metoksikarbonil ve etoksikarbonil yer alI. Ana parçanîii bag Ü smîlayß: olmayan örnekleri arasîida fenoksikarbonil ve naftoksikarbonil bulunur.

Ana parçanmi bagü s nirlayic olmayan örnegi benziloksikarbonildir. Ana parçanin bagi karbonil üzerinden olur. edilir. Ana parçanm bagîsülfonil üzerinden olur. bahsi geçen atomlarIi var olan kosullardaki normal degerligini arttmmayacak ve degisimin bilesenin stabilitesini bozmayacak takdirde, yerlerine gösterilen gruptan bir grup ile yer degistirmesi demektir. Degisenlerin ve degiskenlerin kombinasyonlau yalnüca bahsi geçen kombinasyonlar stabil bilesimlere yol açtkça gerçeklesebilmektedir. “Stabil bilesim“ veya “stabil yapi'i, bir bilesimin kullanisli ibir saflik derecesinde, reaksiyon kar s minida izole edilebilecegi kadar dayan ki ve etkili bir tedavi ajan olmak üzere formüle edilebilecegi anlaminia gelmektedir. olarak kullan Imas :demektir. bilesimin sentetik proses sonrasEi(örnegin reaksiyon karSInj, veya dogal sebeplerle veya ikisinin bir kombinasyonu sebebiyle izole edilmesinden sonraki fiziksel durumunu belirmektedir. Bu yüzden, “saflastinilmls”, "saf formda” veya “izole ve saflastrllmls formda” tanimlarl,I bahsi geçen bilesimin yukar daki sekilde tan mlanan saflastinma islemi veya islemleriyle elde edilmesi veya yetenekli ustalarn iyi bildikleri gibi (kromatografi, yeniden kristallestirme ve benzerleri gibi) ya da yukar_da anlatiltan standart analitik tekniklerle yeterli safi Eta karakterize edildikten sonraki fiziksel durumunu belirmektedir.

Ayrma, metinlerde, semalarda, örneklerde ve tablolarda yer alan ve degerlikleri eslesmemis gözüken her karbonun veya heteroatomun degerliklerinin saglanmasüiçin yeterli sayIa hidrojen atomuna sahip olacaklarü sekilde degerlendirilecegi de not edilmelidir. Ve bu hidrojen atomlarIidan herhangi birisi veya hepsi döteryum olabilir.

Bilesimdeki bir fonksiyonel gruptan “korunmus” olarak bahsediliyorsa bu, grubun korundugu alanda bilesim bir reaksiyona maruz kaldig nda istenmeyen yari etkilerin görülmemesi için modifiye edilmis formda oldugunu göstermektedir. Uygun koruma gruplar iteknikte uzman olan kisiler tarafindan tanimacak ve “T. W. Greene et al, Protective Groups in organic Synthesis (1991), Wiley, New York” gibi standart ders kitaplarFriida referans olarak yer alacaklard m.

Herhangi bir degisken (örnegin aril, heterosiklik, R2, vb.) herhangi bir yapIasDveya Formül l'de birden fazla yer allica, her bir yer alßmdaki tanmnlarü diger yer alßlarlidaki tanmnlarîtdan bagmnsâ olacaktî.

Burada kullanÜdgZgibi, “komposizyon”, belirli bilesenlerin belirli oranlarda yer aldgü ürünü veya belirli bilesenlerin belirli oranlarda direkt veya indirekt olarak meydana getirdigi diger herhangi bir ürünü tan Ehlamak amacüla kullanürnaktadm.

Farmakoloiik olarak kabul edilmis tuzlar Alfa-2 reseptör agonistleri, kendilerinin farmakolojik olarak kabul edilmis tuzlar .yerine kullaniiabilirler. bilesene kgiasla verilen ve denek üzerinde zararlDya da istenmeyen hiç bir etki bmakmayan herhangi bir tuzdur. Farmakolojik olarak kabul edilmis tuz aynîzamanda, bir asit, baska bir tuz veya asit veya tuza dönüstürülmüs bir ön ilacin verilmesinin sonucu olarak canli içinde olusan herhangi bir tuz için de kullanilabilir.

Asidik fonksiyonel gruplarn farmakolojik olarak kabul edilmis tuzlar-organik ve inorganik temelli elde edilebilir. Tuz, tek veya çok degerlikli iyon olusturabilir. Özellikle ilgili olanlar, lityum, sodyum, potasyom, kalsiyum ve magnezyum gibi inorganik iyonlardm. Organik tuzlar aminlerden, özellikle mono-, di- ve trialkil aminler veya etanol aminleri gibi amonyum tuzlarlidan elde edilebilir. Tuzlar ayrlîta kafein, trometamin ve benzer moleküllerden de elde edilebilir. Hidroklorik asit veya bir diger farmakolojik olarak kabul edilen asit, amin veya piridin halkasi gibi bazik grup içeren bir bilesikle tuz olusturabilir. Ön ilaçlar- Referans boyutu Dileyen bir kisi herhangi bir alfa-2 reseptör agonistini ön ilaçlarini kompozisyonunda ve metotlarimda kullanabilir_ Bir “ön ilaç” verilmesinden sonra tedavisel olarak aktif bir bilesime dönüstürülen bir bilesimdir ve bu tanîn genel olarak teknikte en genis ölçüde anlasIdEgD gibi yorumlanmalîjl. Bulusun etki alannüküçültmek amaçlanmasa da, ester grubunun veya biyolojik olarak kararsü basak bir grubun hidrolizi ile dönüsüm görülebilir. Her zaman olmamakla birlikte genelde, ön ilaç, inaktif veya dönüstürüldügü tedavisel olarak aktif bilesenden daha az aktiftir. Bilesimin ester ön ilaçlarDburada belirtilmistir ve özel olarak tasarlanmßtl. Bir ester, C1'in karbolik asidinden (örnegin, dogal prostaglandinin sonunda ortaya çU$an karboksilik asit) veya, bir fenil halkasLmda oldugu gibi molekülün diger tarafIidaki karboksilik asit fonksiyonel grubundan elde edilebilir. KBIlaym:olmak amaçlanmasa da, bir ester alkil ester, ariI ester veya heteroaril ester olabilir. Bu kapsamda (“ön ilaç” tan'mimdaki), “alkil” tan mi,l genel olarak teknikte uzman kisiler taraf ndan anlas Imakta ve lineer, dalll [veya siklik alkil parçalar anlamina gelmektedir. 01.6 alkil esterleri, esterin alkik parçalar 1'den 6 ya kadar karbon atomu veya bununla kalmayarak metil, etil, propil, izopropil, n-bütil, sec-bütil, iso-bütil, t-bütil, pentil izomerler, heksil izomerler, siklopropil, siklobütil, siklopentil, sikloheksil ve olas:1 ile 6 aras j Bulusun alfa-2 reseptör agonistleri ya sentetik olarak ya da ön ilaç vücuda verildikten sonra vücut içinde üretilebilirler. Dolaysyla, “alfa-2 reseptör agonisti" tanmnrihem bir üretim islemi sonucu ortaya çikan bilesimleri hem de baska bir ilaç verilmesiyle canli l içinde olusan bilesimleri kapsamaktad r.

Izomerler ve rasemik kar-STnIar Dileyen birisi, bulusun komposizyonlarmda ve metotlarmida bir enantiomer, sterioizomer veya bir alfa-2 reseptör agonistinin baska bir izomerini kullanabilir.

Dileyen birisi, bulusun komposizyonlarmda ve metotlarlida ayrlîta, bir veya daha fazla rasemik karßîndan, diledigi oranda rasemik karßmn kullanabilir.

Kesin doz ve uygulan s n siki gi,l hastan n durumunun ciddiyetine ve dogal seyrine, ilacin verilis sekline, kullanilan bilesimin gücü ve farmakodinamigine, ve ilaci lyazan doktorun kararlriia göre degisir. Dozun belirlenmesi, teknikte uzman birisinin ayarlayabilecegi, rutin bir istir. Genelde, alfa-2 reseptör agonistleri, arzu edilen tedavisel etkiyi üretebilecek yeterlilikte, tedavisel olarak efektif dozlarda verilir.

Tek bir sekilde, bulusun içerigi (alfa-28 reseptör agonistleri); ciddi derecede alfa-2A etkinligi eksikligi gösteren alfa-28 reseptör agonistleri; ciddi derecede alfa-2A etkinligi eksikligi gösteren alfa-2C reseptör agonistleri; ve önemli miktarda alpha-2A aktivitesi yoksunlugu olan alpha-ZB/ZC reseptör agonistleri) uzun süren rahatlama saglamßtl ve bu rahatlama bilesikler blIaktlIlmtan bir gün veya daha fazla devam etmistir. Bu nedenle bir uygulamada bulusun yöntemi, ilk dönemde bulustaki bilesikleri hastaya uygulamaym ardlidan bmakma döneminden sonra bilesikleri ikinci dönemde yeniden uygulamayi lkapsar. Ilk, ikinci ve binakma dönemleri bir, iki, üç, dört, bes, alt, yedi, sekiz, dokuz, on, on bir, on iki, on üç veya on dört gün olabilirken bir, iki, üç veya dört hafta yahut ayn veya farkl !da olabilir. Bu sebeple örnegin, bulus bilesigi üç gün verilebilir ve ardndan son verilisinden itibaren en az üç gün sonra olmak kaydyla tekrar üç gün verilebilir; veya, bulus bilesigi iki hafta verilebilir ve ardhdan son verilisinden itibaren en az bir hafta sonra olmak kaydiýla tekrar bir hafta verilebilir.

Diger bir uygulamada ilk ve ikinci dönemler degisiklik göstermektedir ve bmakma dönemi sabittir. Bu uygulamada ilk ve ikinci bmakma dönemleri en az bir, iki, üç, dört, bes, altî yedi, sekiz, dokuz, on, on bir, on iki, on üç veya on dört gün olabilirken bir, iki, üç veya dört hafta olabilir. Bu sebeple örnegin, bulus bilesigi en az üç gün verilebilir ve ardindan son verilisinden itibaren en az alti Igün sonra olmak kaydiyla tekrar en az üç gün verilebilir; veya, bulus bilesigi en az bir hafta verilebilir ve ard ndan son verilisinden itibaren en az bir hafta sonra olmak kayd Fyla tekrar en az bir hafta verilebilir.

Eksipivanlar ve dozai sekilleri Teknikte uzman kisilerin bildigi üzere alpha-2 reseptör agonistler teknikte iyi bilinen farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyanlarla karîstIIabilir.

Sistematik olarak verilecek farmasötik karßîn toz, hap, tablet veya oral ya da parenteral uygulama için solüsyon, emülsiyon, süspansiyon, aerosol, surup yahut göze veya cilde uygulama için inhalasyon ya da topikal olarak uygun karlSlmlar halinde bulunabilir.

Katl dozaj sekiller veya ilaçlarin içerdigi toksik olmayan taslylcllara, sadece bunlarla slnlrll l olmamak kaydlyla eczacllkta kullan Ian mannitol, Iaktoz, nisasta, magnezyum stearat, sodyum sakkarin, polialkilen glikoller, talk pudrasî selüloz, glukoz, sakkaroz ve magnezyum karbonat dahildir. KatZdozaj formlarükaplüolmayabilir veya bagmsak yolunda çözünmesini ve emilimini geciktirerek daha uzun süre boyunca etkinligini korumasli: saglayan bilindik yöntemlerle kapi: olabilir. Örnegin, zaman gecikmesi saglayan materyallerden gliseril monostearat veya gliseril distearat uygulanmß olabilir. Ayrßa kontrol sürümleri için ozmotik tedavi tabletleri olusturmak üzere, ABD Patent No. olabilirler. Örnegin farmasötik olarak verilebilen sm_dozaj sekilleri, halen kullanLslLlolan bir veya daha fazla bilesik ile ve bir tasiglliaki opsiyonel su, salih, sulu dekstroz, gliserol, etanol ve benzeri farmasötik yardlmc lar ile bir solüsyon veya süspansiyon içerir. istenmesi durumunda verilen farmasötik bilesen suland rol lveya emülsiyonlastlnlc, pH tamponlama maddeleri gibi az miktarlarda toksik olmayan yard mc maddeler de içerebilir. Bu yardlmc maddelere tipik örnek olarak sodyum asetat, sodyum monolaurat, trietanolamin, sodyum asetat, trietanolamin oleat, vb. verilebilir. Bu tür dozaj sekillerini hazTIama metotlarFteknikte uzman kisilerce bilinir veya islem smasnda anlasIacaktI; örnegin bkz. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 16th Edition, 1980.

Herhangi bir durumda verilecek olan formulasyonun kompozisyonu istenilen tedavi etkisini saglamasüçin halen kullan SlEblan, verimli miktarda bir veya daha fazla bilesik içerir.

Parenteral uygulama genellikle deri altina, kas içine veya damar içine olarak enjeksiyon seklinde gerçeklesir. Enjekte edilebilen türler geleneksel sekillerde, s vl solüsyonlar veya süspansiyonlar, enjekte etmeden önce solüsyon veya süspansiyon olarak sivilastinmaya uygun katlîtürler veya emülsiyon seklinde haziTilanabilir. Bu eksipiyanlara örnek olarak su, salin, dekstroz, gliserol, etanol ve türevleri verilebilir. Ek olarak, istenmesi durumunda uygulanacak enjekte edilebilir farmasötik bilesenler sulandlßüveya emülsiyonlastîß: gibi az miktarlarda toksik olmayan yard mncimaddeler de içerebilir.

Aktiflestirici T hücreleri T hücreleri, gen yeniden düzenlemesi sonucunda üretilen spesifik T hücresi reseptörlerine (TCR'ler) sahip olan bir Ienfosit sîitfiîll. T hücreleri, gen ekspresyonunun ayrikalplar: taraf ndan ay rt edilebilen, T hücrelerinin farki alt kümelerinin farklilasmas yla elde edilen çesitli rollere sahiptir. TCR-d/ß ve TCRy/ö ve degismez dogal öldürücü hücreler gibi baz büyük T hücresi alt kümeleri reseptör ekspresyonuna dayanarak tanini r. Diger T hücresi alt kümeleri, bunlardan salgilanan yüzey molekülleri ve sitokinler tarafindan tanimlan r. Örnegin, T yardTncHhücreleri (CD4 hücreleri) sitokinleri salgfliar ve B hücrelerine ve sitotoksik T hücrelerine yardmicîolur ve efektör fonksiyonlarmiüsürdürür. Sitotoksik T hücreleri (CTL'Ier) genellikle CD8 hücreleridir ve enfekte olmus hücreler veya tümör hücreleri gibi hedef hücreleri öldürmek için uzmanlasm Islardl. Dogal katil (NK) hücreler T hücreleri ile iliskilidir, ancak TCR'leri yoktur ve T hücreleriyle bazEfonksiyonlarEpaylassalar da ve sitokinleri salgIayabilmelerine ve bazîhedef hücreleri öldürmelerine ragmen daha kBa bir ömre sahiptirler.

Insan ve fare periferik kanü T düzenleyici fenotipi (“Treg") ekspres eden küçük bir T hücresi Ienfosit popülasyonu içerir, yani hem CD4 hem de CD25 antijenleri için pozitiftir (yani CD25 için de belirgin olarak pozitif olan CD4 + T hücreleri). Ilk olarak farelerde karakterize edilen bu CD4* CD25+ popülasyonu, bazi idonörler CD4+ ve C025+ hücrelerinin daha farkli? bir popülasyonunu sergilemelerine ragmen, insan periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) sadece %5-10'unu veya CD4+ T hücrelerinin %2-7'sini temsil eder. Insan periferik kan PBMC'Ierinin yaklask %1-2'si hem CD4 pozitif (CD4+) hem de CD25 belirgin pozitif (CDZF) hücrelerdir.

Treg hücrelerinin birkaç alt kümesi vardin (Bluestone ve ark., Nature Rev. Immunol., 3:253 (2003)). Düzenleyici hücrelerin bir alt kümesi timusta gelisir. Timik kökenli Treg hücreleri, hücre-hücre temasinii iiçeren, sitokinden bagimsiz bir mekanizma ile islev görür (Shevach, Nature Rev. Immunol. 2:389 (2002)). Öz toleransiîii indüklenmesi ve sürdürülmesi ve otoimmünitenin önlenmesi için çok önemlidir (Shevach, Annu. Rev. delesyondan kaçan veya ekstratimik antijenleri tanwan otoreaktif T hücrelerinin aktivasyonunu ve proliferasyonunu önler, böylece homeostazi ve bagßtßlm düzenlemesi için ve aynü zamanda konakçgiü otoimmünitenin gelismesine karsD genellikle “profesyonel baskilaymîhücreler” olarak adland rrrm.

Bununla birlikte, Treg hücreleri olgun, periferal CD4+T hücrelerinin aktivasyonu ile de üretilebilir. Çalîsmalar, periferal olarak türetilen Treg hücrelerinin, dönüstürücü büyüme faktörü-beta (TGF-ß) ve IL-10 gibi immünosupresif sitokinler üreterek önleyici aktivitelere CD25 + T hücrelerinin proliferasyonunu spesifik olmadan baskiiayabilir ( immobilize anti- CD3 mAb tabanlübirlikte kültür baskIayîzüanalizlerinde düsük doz FACS smalamasüile Son zamanlarda Riley ve ark. (“Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and patolojik durumlarda düzenleyici T hücrelerinin büyük öneme sahip oldugunu göstermistir (Riley ve ark., 2009). CD25 +, FoxP3 + Treg'ler, konvansiyonel CD4 + yardIncDT hücreleri, B hücre antikoru üretimi, CD8 + sitotoksik aktivite ve antijen varlgînda hücre fonksiyonu ve olgunlasmasnüiçeren bir dizi hücre tipinin fonksiyonlarliübasktlayarak bagSJ'sIIs tepkilerini iltihaplanmayüve doku tahribini bloke etme kapasitesine sahiptir (Tang ve Bluestone, 2008). Birçok insan hastaliginda Treg'lerin sklgnda veya disfonksiyonunda azalma bildirilmistir (Tran ve Shevach, 2009).

Bir uygulamada bulusa ait yöntem, böyle bir yukarHregülasyonun yararlHolacaglTbir hastada düzenleyici T hücresi fonksiyonunu yukar: regüle etmek için bir alfa-2 agonistinin uygulanmasliüiçerir. Baska bir uygulamada düzenleyici T hücresi ise bir CD25+, FoxP3+ T cell. Baska bir uygulamada, bulusun yöntemi, nevrit, Guillan-Barre sendromu, romatoid artrit, tip I diyabet, multipl skleroz (MS), graft-versus-host hastalg:(GVHD), otoimmün üveit, oküler inflamasyon, kuru göz hastaltgü atopik dermatit, sedef hastalEgCJ inflamatuar bagmsak hastalg: astmn ve aplastik anemi gibi hastalIdarEii tedavisi için bir alfa-2 agonistinin uygulanmasmüçerir. Örnekler Bulus, asagidaki örneklerle açiklanmaktad r. Bu sadece açiklamak için gösterilmistir; çok daha fazla düzenleme mümkündür.

Düzenleyici T hücreleri üzerindeki alpha-ZB eylemine dair kanm Bulus sahipleri, GzB-SGÇICI bilesiklerin, bagßklk ile ilgili mekanizmalar yoluyla nöropatik agrîdurumlarlijdüzenleyip düzenlemediklerini test etmislerdir. 023 agonisti, Bilesik A ile tedavi, spinal sinir Iigasyonu cerrahisinin IL-2 düzeyindeki artSIiIEiazaltth (Tablo 1). IL- 2, T-Ienfosit proliferasyonunu düzenlemek için gerekli olan proinflamatuar bir sitokindir. Bu bulgu, akut ve kronik allodinin gerilemesi üzerindeki (:23 agonist etkisinin (ABD Patenti No. 7.345.065'te açtlglandtgügibi) bagîsikltli hücrelerinin, özellikle T hücreleri yoluyla aracim: edilebilecegini göstermektedir. Bulus sahipleri ayrica, qPCR araciiig yla insan T gözlemlemistir. Bulus sahiplerinin bilgisine göre bu, T hücrelerinde dgs-reseptör alt tipinin ekspresyonunun ilk gösterisidir (Sekil 1). Bagis klik hücrelerinin dgs-reseptör agonistlerinin aracmk ettigi sürekli agrTazaltma mekanizmalarFriidaki rolüne iliskin ek kaniti ikinci bir (125 agonistinin farkl:bir yapgla sahip Bilesik B'nin analjezik etkisinin, immünosüpresan ilaç FK506 ile bloke edilebilir olmasßila elde edilmistir (Tablo 2). Bu bulgu, dZB-reseptör ile indüklenen uzun süreli allodini gerilemesinin, aktive edilmis Ienfositlerin varlEgIi: gerektirdigini göstermektedir, çünkü FK506'nIi T-lenfosit aktivasyonunun güçlü bir engelleyicisi oldugu gösterilmistir (Small ve ark., 1996). Bu bulgu, FK506'da spinal sinir ligasyonu modelinde Bilesik C'nin uzun süreli analjezik aktivitesini bloke edebildigi farkli bir yapi olan Bilesik C'ye sahip bir baska (125 agonisti ile daha teyit edilmistir (Tablo 3).

Ayrßa, bulus sahipleri, dgs-reseptör arach'etkilere katilan T hücrelerinin alt tipini arastFrmß ve aga-reseptör agonistleri ile tedavi edilmis nöropatik agrm] hayvanlarda lenfatik organlardaki düzenleyici T Hücrelerinin (Tregs) sayßlda önemli ve kallü bir artîs kesfetmislerdir (Sekil 2). Bulus sahipleri, bilesigin naif (daha önce deney yapümamîs) hayvanlardaki Treg hücre sayilacüzerinde hiçbir etkisi olmadEgIiÜgözlemini yapm Islard I.

Bu, aZB-reseptör agonistlerinin Treg hücreleri üzerindeki etkisinin antijen uyarEnIia baglü oldugunu ve Treg hücrelerinin antijen-selektif genislemesi olabilecegini ileri sürmektedir.

Alfa-28 aqonistlerinin multipl skleroz modelinde etkisi Bulus sahipleri, bu aza-reseptör agonistleri mekanizmasinin, ikinci bir patolojik T hücresi aktivasyonu modeline, bir multipl skleroz modeline ve bir ikinci türe genellenebilir oldugunu göstermistir. Deneysel otoimmün ensefalomiyelitin yineleyici/düzelen bir formuna neden olan proteolipid proteini ile bagßliklik kazandiî'iilian farelerde, Bilesik B (ozmotik mini pompa ile 3 mg/kg/gün), seçici olarak Treg sayZsIiEi/e azalmîs agrßrEarttIdEISekil 3].

Tablo 1 Bilesik A veya tasi/mü ile muamele edilen SNL siîtanlarlidan aman çesitli dokularda (2,4 mq / kq / qün osmotik mini pompa yoluyla) IL-2 seviyelerinin zayiflatElîmasD lpsilateral lpsilateral lpsilateral Serum DRGL4 DRGL5, L6 omurilik Naif (daha yapilmamis) SNL s çanlari i 24 20,55 SNL sîsanlarü 138 35 + Veriler ortalama pg/mL ± standart hata olarak ifade edilir. Tüm gruplarda n=3-4.

Tasýîzgia göre anlam degerleri: *p< 0,05; **p< 0,01.

Tablo 2 Aledonik Nöropatik Agri ISNL Sioan Modelinde Bilesik B +/- FK506 ile Agr Gerilemesi SNL sîsanlarmida Ilaç Dozu 24 saat sonra 7 saat sonra (maskelenmis) pompa (7 günlük tedavi için) pompa + 3 mg/kg FK506 BID SC (7 gün boyunca Bilesik B ile tedavi ve gün boyunca FK506 ile tedavi) Tablo 3 Aledonik Nöropatik AGrHSNL Sßan Modelinde Bilesik C +/- FK506 ile Agri? Gerilemesi SNL Szanlarmda Ilaç Dozu 24 saat sonra 23 saat sonra (maskelenmis) oral tedavi için oral tedavi için + 3 mg/kg FK506 BID SC 5 günlük Veriler, ilaç öncesi aledoninin % gerilemesini temsil eden %MEE ortalamasîolarak ifade edilmistir ± ortalama standart sapma. Tüm gruplarda n=6. Onemlilik degerleri ile tas yloi k yaslamasl:l*p< 0,05; **p< 0,01.

Tablo 4, asag da A, B ve C Bilesiklerinin vap lar nl bösterir: BILESI K YAPI HOWNÄN CI Diger T hücre araciliîhastalik modellerinde calßmalar Nöropatik agrmimi Chung modelinde dgs-reseptör agonistlerinin aracIEB ettigi etkilerin ve MS-indüklü agr] modelindeki etkilere yönelik çalßmalar, lenfatik organlardaki varsayIan düzenleyici T Hücrelerinin (Tregler) sayßmda ciddi ve kalßü bir arts oldugunu göstermistir. Bulus sahipleri, hastalEgIi klinik seyri ve otoimmün üveit, endotoksin ile uyar Ian üveit ve Kuru göz hastaligi üzerindeki etkisi için MS modelinde aza-reseptör agonistlerini arastImLstLn. Yineleyici/düzelen deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) sekline neden olan proteolipid protein ile bagisiklastinilan farelerde, klinik hastaligin gelisimi slriasinida Bilesik B ile tedavi, MS semptomlariniini hafifletilmesi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir (Sekil 4). 7-10. günlerdeki tedavi, 14. (p <0,01) ve 24. günlerde nüks smasnda klinik skoru düsürdü. Fareler kesintisiz olarak tedavi edildiginde benzer sonuçlar elde edilir. EAE'de, proinflamatuvar CD4 + T hücreleri ve diger inflamatuar hücreler periferde çogall, karakterize edici özelligi ilerleyici bir felç olan bir demiyelinizasyona yol açan merkezi sinir sistemine (CNS) smar. Çalßmanîi sonunda akß sitometrisi yoluyla CNS'de immün hücre infiltrasyonunun analizi, Bilesik B ile yapman tedavinin, bagßklk hücrelerinin varIEgIiD önemli ölçüde azaltttgü ortaya koymustur (Sekil 5). Bu, Bilesik B'nin, CNS'de patojenik T hücrelerinin varlg'rii_ önledigi ve atenüe edilmis ensefalomiyelit ile sonuçlandig ni gösterir. Bilesik C, EAE'de de benzer etkinlik göstermistir. 7-13. günde TID oral dozlama (3 mg / kg / gün) takiben, klinik skor, araçla tedavi edilen farelere kiyasla, 13-24. günlerde anlamli Isekilde azaldi I(Sekil 6). 37. günde akis sitometrisi yoluyla CNS'de bagisiklik hücrelerinin analizi, Bilesik C'nin omurilikte düzenleyici T hücrelerinin (CD4 + CD25hiF0xP3 +) siRITgmriarttTdgmmortaya koymustur (Sekil 7).

Bulus sahipleri ayrica, oküler T hücre aracmîiltihaplanma modellerinde alfa 28 agonistlerinin faydasîiüarastîmak için çalßmalar yapmßtm. Deneysel otoimmün üveit (EAAU) anterior segmentte hastalk ile sonuçlanan antijene özgü bir T hücresi aracili iotoimmün yanitii Itemsil eder. EAAU indüksiyonunu takiben 1-18. veya 7-18. günden itibaren 1 mg / kg / gün veya EAAU indüksiyonunu takiben (3 gün sonra oral TID dozlamasi ive ard ndan ozmotik mini pompa yoluyla dozlama) verilen Bilesik B, anterior inflamasyonu ksmen ortadan kaldi'rimada etkili olmustur.

Bilesik B, anterior üveitin klinik skorlarIiEazalttDve sulu mizahtaki enflamatuar hücre saymarîtiazalttüßekil 8). Ek olarak Bilesik B, kandaki azalmß nötrofil hücre sayînlar: kandaki normalize lenfosit popülasyonlarüve dalaktaki normallestirilmis CD4 + T hücre popülasyonu ile görüldügü gibi bagîsklîg cevab“ normallestirilmesinde etkili oldugu görülmüstür. Bilesik B'nin benzer bir etkisi, akut endotoksin ile uyarülan üveit (EIU) modelinde de gözlenmistir. Bilesik B (ozmotik minipump tarafIidan verilen 1 mg / kg / gün), tedavi edilmemis veya araçla tedavi edilen (salin) kontrollerle karsüastlîdgnda, EIU s çanlar n n göz sivis nda protein eksüdasyonunu önemli ölçüde inhibe etmistir (Sekil 9).

LPS stimülasyonu sonucu kan nötrofillerindeki artis ve kan lenfosit popülasyonlarindaki düsüs, Bilesik B ile belirgin bir sekilde normalize edilmis, fakat araç tedavisi degil (Sekil ). Kuru göz hastalig modelinde adoptif bir transfer çaliSmas, oküler inflamasyon üzerindeki 025 agonist etkisinin T hücrelerini içerdigini göstermektedir. 3 mg / kg / gün Bilesik B veya araç (3 günlük oral TID dozlama ve ardmidan ozmotik mini pompa yoluyla dozlama) ile tedavi edilen farelerde 10 gün boyunca üflemeyle indüklenen kurutucu stresin ardîtdan CD4 + T hücreleri toplandüve sinojenik çjolak farelere aktarImStI.

Bilesik B ile tedavi edilen farelerden alman T hücrelerini alan alzzîfareler (üfleyiciye maruz kalma sIismda 10 gün boyunca), kuru göz hastalEgIia katkIa bulunan sitokinler olan lL-17 ve TNFoi sitokinlerinin seviyelerini önemli ölçüde düsürmüstür (Sekil 11).

Bilesik B ayrca terapötik bir modda test edilmis, burada daha önce üfleyiciye maruz bIakilian farelere tedavi (ozmotik mini pompa yoluyla 3 mg / kg / gün) verilmistir. Bu modda ayrica Bilesik B, goblet hücresi kaybini ive Siklosporin A'ya benzer sekilde konjunktiva içine T hücresi infiltrasyonunu önemli ölçüde önlemistir (Sekil 12). Bu çaliSmalar, Bilesik B, Bilesik C ve diger aga agonistlerinin mekanizmasriin immün modülasyonu içerdigi hipotezini desteklemektedir.

Yöntemler SEanlarda spinal sinir liqasvonu modeli Siçandaki SNL (veya Chung) Modeli, nöropatik agr ni ni kabul edilen standart bir hayvan modelidir ve semptomlara (koruyucu davran s, mekanik alodinia) ve farmakolojik ajanlarn hafifletilmesine bagli i olarak insan nedensel durumunun taklit edildigi düsünülmektedir. Örnegin, morfin, taktil allodiniyi hafifletmezken, Gabapentin (30 mg/kg p.o.),%50'lik bir allodininin hafifletilmesi ile sonuçlanmaktadi. SNL Modeli, açtklandg: gibi dokunma allodini veya hafif dokunmaya duyarImR olusturan L-5 ve L-6 spinal sinirleri skibir sekilde baglayarak gerçeklestirilir (Kim ve Chung, 1992). Erkek sprague-dawley fareleri (100-120 gram; Charles River, Wilmington, MA), bir izoforan / oksijen karßEnIiIi solunmasßila anestezi edilmistir. Cerrahi alan tras edilmis ve betadin ile hazIanmStî.

Torasik vertebra Xlll'den sakrumdan asagDdogru bir insizyon yapImStI. Kas, L4-82 seviyelerinde spinal vertebradan (sol taraf) ayrJTnStI. L6 vertebra yerlestirilmis ve daha sonra transvers süreç L4 - L6 spinal sinirleri görsel olarak tanmilamak için küçük bir rongeur ile dikkatlice çikarilmistiri. L5 ve L6 spinal sinirleri izole edilmis ve 6-0 ipek ipligi ile sikica baglanm stir1. Tam bir homeostasis dogrulanmls ve daha sonra yara sütüre edilmistir. Ameliyat süresi yaklasik 20 dakika olmustur. Kesilen alana küçük miktarda antibiyotik merhem uygulanmis ve hayvanlar, düzenlenmis bir isi isicaklg Iambas altîida bir plastik geri kazanmi kafesine aktarmnßtm. Hayvanlara ameliyat sonras- herhangi bir lokal veya lokal anestetik verilmemistir, çünkü bunlar incelenecek olan fenomen olan agrisendromunun gelismesini engelleyecektir.

Literatürde tarif edildigi gibi yukarBasagüsekilde cerrahi arka pençenin orta dikim bölgesinde bir dizi 8 Von Frey kIZIIe stimülasyon ile Chung cerrahisini almîs olan hayvanlarda allodini miktarüölçülür (Dixon, 1980). Von Frey k]]arü%50 esik olusana kadar tepkiye bagl_olarak yukar_asag_uygulanmaktadr. Von Frey killar+ cerrahi pençenin plantar yüzeyine, onlarübükecek kadar kuvvetle uygularil. Pençe keskin bir sekilde çekilirse pozitif bir yaniti kaydedilir. Sekiz VonFrey killari I3,61, 3,84, 4,08, (0,25 - 15 gram) elde edilmistir.

Von Frey Analizi: -Ilaç öncesi esik Ortalama ± SEM: Ortalama = allodini gerilemesi ortalamasiî SEM = n STDEV/ SQ ROOT Bilesiklerle test, stabil allodini olusturmak için ameliyattan 2-3 hafta sonra yapilin.

Tüm deney hayvanlarmda, bazal ölçümler ilaç uygulamasFriidan önce aliTnmß ve daha sonra Alzet ozmotik minipump ile dozlamadan 24 saat ve 5-23 gün sonra alîimîstm.

Arastmmacüilaç gruplarlimi kimligini bilmemektedir. % Allodini gerilemesi su sekilde hesaplanl: [(Ilaç sonrasEiesik - Ilaç öncesi esik)/(15-Ilaç öncesi esik)] X 100.

Farelerde proteolipid kavnaklEidenevsel otoimmün ensefalomivelit Deneysel otoimmün ensefalomiyelitin (EAE) fare modeli, MS'nin immünopatogenezinin altIida yatan mekanizmalarüanlamak için yaygn olarak kullanJJngstE. Myelin Binding Protein (MBP), Proteo-Lipid Protein (PLP) ve Myelin Oligodendrosit Glycopraotein (MOG) gibi miyelin proteinleri ile bagisiklastinilan fareler, MS hastalar na birçok benzerlik göstermektedir (Friese ve ark., 2006). T hücreleri, makrofaj ve antikorlar dahil olmak üzere bagisiklik sisteminin bilesenleri, EAE farelerinde miyelin y kiminia önemli katkida bulunur. Buna ilaveten, iltihaplanma ayrîa, kuyruk tonusu kaybî anormal yürüyüs ve kismi-tam arka arka bacak felci de dahil olmak üzere nörolojik disfonksiyonun klinik bulgulariile sonuçlanan multifokal bölgelerin demiyelinizasyonuna da yol açmaktadl.

PLP kaynaklIAE modeli, Allergan'da optimize ettigimiz çok amaçl:bir kavram olan MSS inflamasyonu ve demiyelinizasyon ve MS ile iliskili agrIlI'i patojenik mekanizmalarmü eszamanlüolarak arastIma fIsatEisunar. Steril teknik kullanmarak proteolipid protein miyelin peptidi (PLP) ( 1:1 orannda eksik Freund adjuvanU(IFA) ile karLstLnJir (2 mg/mL PLP'nin nihai konsantrasyonu). 8-10 haftalER Disi SJL farelerine (Taconic), 26 G igne kullanmarak sag ve sol arka taraftaki (0. gün) ile deri alt ndan enjekte edilir. Bu protokol kullan Iarak asilanan fareler, remisyon / klinik iyilesme dönemleri ile serpistirilmis motor bozuklugun ataklari ile tekrarlayan, uyanan bir klinik süreç tecrübe ederler. Ayrica, bu fareler klinik remisyon dönemlerinde en belirgin olan saglam bir agr fenotipi gösterir.

Bu protokol kullanilarak, SJL farelerde PLP ile indüklenen EAE'nin baslangIEi(~%90-100) bir insidansta meydana gelir ve genellikle immünizasyondan 12 gün sonra görülür ve 14.- 21. güne kadar hastaligi en üst noktaslia ulas: PLP-EAE fareleri nörolojik bozuklugun fiziksel semptomlarliîgösterir, kßmi kuyruk tonisitesinden kßmi tam arka bacak felcine kadar ilerler. Farelerin yaklask %75'i, motor bozulma ataklari-(arka bacak zayifligüve felç) ile çevrili remisyon dönemleri ile yineleyici-düzelen bir klinik seyir yasayacakt r. Histolojik olarak fareler, beyin ve omuriligin beyaz madde yollar nda (miyelinli aksonlar içeren alanlar), ilerleyici infiltrasyon ve enflamatuar hücre birikimi, demiyelinizasyon ve aksonal kaprta genis çaplFiiltihaplanma sergilerler. Siddetli EAE'ye sahip fareler genis hücresel infiltratlar ve demiyelinizasyonun yaygIJ odaklarmiügösterir. PLP ile immünize edilmis fareler tipik olarak nörolojik bozuklugun ilk döneminde (14.-21. günler) en siddetli klinik hastalEgDgösterir. Genel olarak, agrüfenotipi en basta baslangî; demiyelinizan olaydan kaynaklanan remisyondan sonra belirgindir ve fareler ötanize edilene kadar sürdürülür.

Fareler rutin olarak, davranßsal anormallikler için 0-5 arasmida bir ölçekte görsel olarak puanlanmßtl; O-anormallik yok, 1-k3mi kuyruk tonisitesi kayb:(kßmi cansâ kuyruk), 2- kuyruk tonisitesi kaybüve arka bacakta zayEtlÜg 3-dengesiz yürüyüs ve ki3mi arka bacak felci, 4-tam arka bacak felci ve 5-ölüm halinde ya da ölü. Puanlama, farelerin yasami isona erene kadar immünizasyon sonras '7. günden baslayarak gün asini iila her üç günde bir gerçeklestirilmistir. Allodini, daha önce belirtildigi gibi Von Frey kl yöntemi ile ölçülmüstür. ÇaliSma sonunda akis sitometrisi için dalak, servikal lenf dügümü, omurilik ve beyin toplanmßtm.

Farelerde Kuruluk, Kurutucu Stres (DS) CS7BL/6 (CSYBL/GNTac) and BG.Cg/NTac-F0xn1nuNE9, Taconic, Inc. sirketinden (Germantown, NY) satIi almmistm. Fareler 6-10 haftalkken kullanttmßtm. Hayvan çalSmalarDonayDAllergan Hayvan Bakmn ve Kullanîn Komitesi'nden alnmîstî. Tüm çalsmalar, Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research (Oftalmik ve Görme Arastmmalarîida Hayvanlarîii Kullanmht) için Association for Research iri Vision and Ophthalmology (Görme ve Oftalmoloji Arastirma Dernegi) bildirimine bagli ikalm stin.

Literatürde açiklandigi igibi sag ve sol taraflarda dönüsümlü olarak günde üç kez skopolamin hidrobrromid deri alti ienjeksiyonlari i(0,5 mg/0,2 mL; Sigma- Aldrich, St.

Louis, MO) ile farelerin tedavi edilmesiyle gözde kuruluk indüklenmistir (Neiderkorn ve ark., 2006) Fareler, bir çekerocakta (AirCIean Systems, Raleigh, NC) 16 saat/gün boyunca fanlardan gelen hava akgsiîmsaglamak (kafesin her bir tarafmda bir fan) için kafesin her bir tarafîida delikli plastik ekranlar içeren bir kafes içine yerlestirilmistir.

OdanIi nem oran :%40' altmida tutulmustur. Kurutucu stres (DS) 10 ardîstk gün için indüklenmistir. Dalaklar ve servikal lenf dügümleri (CLN), DS ve NS'ye maruz bmakIan farelerden toplandive bir dalagm veya CLN CD4+ hücresinin bir donör esdegeri, sinojenik çiplak farelere intraperitoneal olarak transfer edilmistir. Bir splenik T hücre esdegeri 5x107 hücreye esittir. Numuneler üç gün sonra analiz için toplanmlstin. Gözyasl !toplama için her bir göze 1,5 uL PBS yerlestirilmis ve sonra her iki gözden 1 uL gözyasl'ltopland _ve 8 uL sitokin deney tamponu (Beadlyte; Millipore, Billerica, MA) içine yerlestirilmistir. Tampon ve gözyasESErßîlateral kantusun gözyasü menisküsüne yerlestirilen 1-uL hacimli bir cam kÜbal tüp (Drummond Scientific, Broomhall, PA) kullanîarak kÜbal islem ile toplanmgstî. Numuneler, deney süresine kadar -80 °C'de donduruldu. Histolojik analizler, antikorlu gözyasübezi numunelerinin CD4 ve H&E yöntemleri ile boyanmasýla goblet hücrelerini ve konjonktivanli T hücrelerini ölçmek için gerçeklestirilmistir. Bilesikleri bir terapötik modda test etmek için, hayvanlar iki hafta boyunca kurutucu strese maruz bmakImß ve daha sonra uygun barmak kafeslerinde 7 gün dinlenmeye bmakjinßtl. Hayvanlar, daha sonra, kronik kuru göz hastal g n n nüksetme seklini taklit etmek için 7 gün daha kurutucu strese yeniden maruz binak Imistin. B Bilesigi ile ilaç tedavisi, kurutucu strese yeniden maruz kalmadan 2 gün önce baslatllmistin. Her iki çal smada da B Bilesigi 3 mg/kg/gün olarak dozlanm st r. Adoptif transfer, gözyas sitokin analizi ve histolojik analizler yukarma açklandTgTQIbi gerçeklestirilmistir.

SEanlarda Denevsel Otoimmün Anterior Uveoretinit saflastmmns MAA kompleksi ile tek bir sol arka ayak tabanüenjeksiyonuyla immünize edilmistir. MAA proteinleri, fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7,2) içinde askîia bLnakJmLs ve 1 ug/1OO uL Pertussis Toksin (PTx) emülsiyon karsaniUiçeren tam Freund adjuvanîida (CFA, VWR Scientific) emülsiye edilmistir (1:1 v/v). Kontrol hayvanlar ,'CFA ve PTx ile emülsifiye edilmis PBS ile enjekte edilmistir.

Immünizasyondan 7 gün sonra göz içi inflamasyonun degerlendirilmesi, yürütülmüstür. Hayvanlar, 7. ve 19. günler aras nda gün asinil olarak immünizasyondan sonra, @TR perdesi mikroskobu kullanliarak yapffan üveitin klinik bulgular:ve semptomlarüaçßmidan incelenmistir. Sulu hümör, enflamatuar hücrelerin ve protein seviyelerinin sayîsnüdegerlendirmek için toplanmîstî. Hücre sayînlarjsik mikroskobu altlida bir hemasitometre ile 10 uL ile gerçeklestirilmistir. Protein konsantrasyonu, protein standardüolarak BSA kullanIarak Bio-Rad'den bir Protein deney çözeltisi ile ölçülmüstür. Pro-inflamatuar sitokin ve kemokin seviyeleri Luminex (Biosource-Invitrogen, Carlsbad, CA) üzerinde ölçüldü. Kan Iökosit farki Iasmasinii,i Aks sitometrisi araciligiyla splenik T hücre aktivasyon durumunu ve histopatolojiyi belirlemek için 11., 14. ve 19. günlerde kan, dalak ve gözler toplanmistin.

SEanlarda endotoksin kavnaklEüveit: Disi Lewis sELanIarDUBO-ZOO gram) Charles River Laboratuvarjidan satI aIIimIstI.

Siztanlari ayak tabanîta çözeltisi (steril pirojensiz salin içinde) ya da . LPS enjeksiyonundan 24 saat sonra hayvanlarli yasam Iia son verilmistir. 8qu hümör toplandü ve enflamatuar hücre sayüiarîiü sitokin düzeylerini ve kemokin konsantrasyonunu ve ayrBa toplam protein konsantrasyonlarîiDbelirlemek için analiz edilmistir. Gerekli olmas: durumunda kan Iökosit farklilasmas ve histopatoloji de belirlenmistir.

Formüller: A Bilesigi, %50 DMSO (Sigma, St. Louis, MO) içinde formüle edilmistir. Bu çözelti, ilac_ 2,4 mg/kg/gün olarak nihai bir dozla sonuçlanan, 0,5 mm3/saat ( oranIida vermek üzere ayarlanan ozmotik mini pompalara (Model 1007D, Alzet Corp., Palo Alto, CA) yüklenmistir. Bu çalßmalara yönelik tasyiîij ozmotik mini pompalar aracngiýla 0,5 mm3/saat/kg ( oranlida uygulanan %50 DMSO bilesigidir.

B Bilesigi, %50 DMSO (dimetil sülfoksit; Sigma, St. Louis, MO) içinde formüle edilmistir. Bu çözelti, 0,3 veya 1 mg/kg oranLnida bir dozda oral TID olarak dozlanmßtm. Bilesik, ozmotik mini pompalarda (Model 10070, Alzet Corp., Palo Alto, CA) dozlama için 1 veya 3 mg/kg/gün oraniriida nihai bir doz verecek sekilde pompa setine yüklenmistir. Bu çaIiSmaIar için tasiyic , %50 DMSO bilesigidir.

C Bilesigi, ilk olarak% içinde formüle edildi, daha sonra 10 mg/mL'Iik bir çözelti için %30 DMSO içinde seyreltildi; 3 mg/mL'Iik bir çözelti için %15 DMSO içinde seyreltildi ve suda daha fazla seyreltme yapilrnßtl. Bilesik, smasiglla toplam günlük 1 veya 3 mg/kg/gün dozunda 0,3 veya 1 mg/kg'IIs bir dozda oral TID olarak dozlanmßtî.

Akis sitometrisi Yüzeysel servikal lenf dügümü hücreleri ve dalak hücreleri hafif mekanik islemle elde edilmistir. CD4*hücreleri, imalatçi-protokolüne göre bir CD4+ izolasyon sütunu (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) kullanilarak izole edilmistir. Beyin ve omurilik mekanik olarak ayrßtlmjü ve CNS'nin mononükleer hücreleri %375 Percoll (Sigma-Aldrich) kullanmarak izole edilmistir.

CD4 (YardInCZT hücreleri), CD8 (katil T hücreleri), CD25 (aktive edilmis yardmncüT hücreleri ve düzenleyici T hücreleri), CD45 (makrofaj ve mikrogliyal hücreler) ve ekspresyonunu belirlemek için BD biosciences, Mountain View, CA'dan uygun antikorlarla inkübe edilmistir. Antikorlarin her biri için izotip kontrol antikorlari l kullan lm stin. Hücreler iki kez FACS tamponunda yikand ve 5 x 105 hücre/100 uL tamponda yeniden ask da binakllmistin. Biyotin etiketli antikor içeren tüpler, 1,5 uL bir aksesuar boyama pigmenti (Streptavidin PerCP; BD-Pharmingen) aldee karanliRta dakika buz üzerine yerlestirilmistir. Ekspresyon analiz edildi (CeIIQuest yazmInIia sahip cihazüle FACSCalibur; BD Biosciences, Mountain View, CA).

Sitokinlerin Luminex analizi Sitokin seviyeleri, duyarl: bir floresan multipleks immünobead deneyi (Luminex; Biosource-Invitrogen, Carlsbad, CA) ile ölçülmüstür. Millipore'dan 9 pleksli sLçan sitokin/kemokin (RCYTO-80K-09) panel kullanîmßtm. Numunelerdeki sitokin seviyeleri, ilgili Millipore sitokin Beadmate çiftleri kullanilarak analiz edilmistir. 96 yuvali ibir filtre plakas (Millipore), 25 uL Beadlyte sitokin deney tamponu ile Luminex deneyi için önceden slatllmstln. Tamponun yuvalardan aspirasyon islemi gerçeklestirilmesi için bir vakum manifoldu (Millipore, Billerica, MA) kullanilmst r. Her bir yuvaya 25 uL numune yerlestirilmistir. Damlalar (25 uL) pipetlerle yuvalara aktarîmßtm. Millipore'dan satît aIIian standartlarIi uygun seyreltisinin 25 uL'sini yerlestirmek suretiyle her bir sitokin için standart egriler iki kopya halinde olusturuldu.

Plaka, 4°C'de karanlERta hafifçe çalkalanarak gece boyunca inkübe edilmistir.

Damlalar, Beadlyte sitokin deney tamponu (Millipore) ile yRand: ve bir vakum manifoldu kullanilarak yikama tamponu atTmßtm. Uygun biyotin-konjuge sekonder antikorun 25 uL'si (Millipore), oda sicakliginda 90 dakika boyunca hafif çalkalama ile ilave edilmistir. Damlalar, oda sicakliginda 30 dakika süreyle yavasça çalkalanarak Beadiyte streptavidin-fikoeritrin (Beadiyte deney tamponunda 1:25 diiüsyon) ile inkübe edilmistir. Damlalar ykanmß, 125 uL Beadiyte tamponu içinde yeniden asköa bmakImß ve Luminex 100 cihazD(Luminex Corporation, Austin, TX) ile analiz edilmistir. Sitokin minimum basîiia 50 damladan elde edilen ortalama floresan yogunluklarEUpstate Beadview yaZJEn:kullanÜ}3rak analiz edilmistir. Dört ya da bes parametrik bir lojistik egri kullanilarak standart egriler olusturuldu (iki kopya halinde sîm standart çalßma dahil 8 veri noktasi). R-kare degerleri 0,99 ile 1 arasmida olmustur. Veriler pg/mL veya ng/mL degerlerinde ifade edilmistir.

Claims (4)

ISTEMLER

1. Alfa-2 agonistinin asag dakilerden olusan gruptan seçilen, kuru göz hastalig nlri tedavisine yönelik bir yöntemde kullanim için bir alfa-28 reseptör agonisti: 5 i) bir imidazolin; burada ad :geçen imidazolin formülün bir bilesigidir veya bu hususta farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzdur; ve 10 ii) bir imidazol; burada imidazol asag Eakilerden olusan gruptan seçilen bir bilesiktir:

2. Alfa-2 agonistinin asagmlakilerden olusan gruptan seçildigi, kuru göz 15 hastaltgmimi tedavisine yönelik bir yöntemde kullanmn için anlamlüalfa-ZA reseptör agonist aktivitesine sahip olmayan bir alfa-2 reseptörü agonisti: i) formülün bir bileseni olan bir imidazolin veya, farmakolojik olarak kabul görmüs benzer bir tuz; ve ii) bir imidazol; burada imidazol asag dakilerden olusan gruptan seçilen bir bilesiktir: O ; veya bu hususta farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzdur.

3. Istem 1-2'den herhangi birinin kullanim için bu istemlerden herhangi birinin agonisti; burada agonist bir baslangß verme süresi için uyarlanm ve daha 10 sonra bir atmîn süresinin ard Iridan ikinci bir uygulama süresi geçmistir.

4. Istem 3'ün kullanînüiçin bu istemin bir agonisti; burada ilk, ikinci ve atÜEn süreleri bir, iki, üç, dört, bes, alt: yedi, sekiz, dokuz, on, on bir, on iki, on üç veya on dört gün veya bir, iki, üç veya dört haftadl.