JP6509307B2 - α−２Ｂアドレナリン受容体作動薬を用いて制御性Ｔ細胞を活性化する方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年８月１６日に出願された米国特許仮出願第６１／３７４，１２４号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Ｔ細胞のサブタイプにα−２Ｂアドレナリン受容体が存在すること、ならびにα−２受容体作動薬は、このようなＴ細胞の活性を調節し、それによって、Ｔ細胞の機能不全が関与する、神経炎、ギランバレー症候群、リウマチ性関節炎、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、自己免疫性ブドウ膜炎、眼性炎症、乾性角結膜炎（眼乾燥症候群）、シェーグレン症候群、アトピー性皮膚炎、乾癬、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、喘息、および再生不良性貧血を含む、疾患を治療するために使用することができるという発見を、本明細書に開示する。

本発明は、患者における制御性Ｔ細胞機能を上方制御する方法であって、このような上方制御を必要とする患者に、α−２Ｂ受容体作動薬を投与することを含む、方法を提供する。

別の実施形態において、本発明は、患者における制御性Ｔ細胞機能を上方制御する方法であって、このような上方制御を必要とする患者に、顕著なα−２Ａ受容体作動薬活性を欠いたα−２受容体作動薬を投与することを含む、方法を提供する。

別の実施形態において、前述の２つの段落で言及された制御性Ｔ細胞は、ＣＤ２５＋、ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞である。

別の実施形態において、本発明は、神経炎、ギランバレー症候群、リウマチ性関節炎、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主病、自己免疫性ブドウ膜炎、眼性炎症、眼乾燥性疾患、アトピー性皮膚炎、乾癬、炎症性腸疾患、喘息、および再生不良性貧血から選択される疾患の治療を、このような治療を必要とする患者に、α−２Ｂ受容体作動薬を投与することによって行う、方法を提供する。

別の実施形態において、本発明は、神経炎、ギランバレー症候群、リウマチ性関節炎、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主病、自己免疫性ブドウ膜炎、眼性炎症、眼乾燥性疾患、アトピー性皮膚炎、乾癬、炎症性腸疾患、喘息、および再生不良性貧血から選択される疾患の治療を、このような治療を必要とする患者に、顕著なα−２Ａ受容体作動薬活性を欠いたα−２受容体作動薬を投与することによって行う、方法を提供する。

別の実施形態において、本発明のα−２受容体拮抗薬は、初期の期間投与され、次いで、休薬期間が経過した後、第２の期間再度投与される。

別の実施形態において、本発明のα−２受容体拮抗薬は、初期の期間投与され、次いで、休薬期間が経過した後、第２の期間再度投与され、初期、第２、および休薬期間は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日間、または１、２、３、もしくは４週間である。

別の実施形態において、本発明のα−２受容体拮抗薬は、

からなる群から選択されるか、またはその薬学的に許容される塩である。

別の実施形態において、α−２作動薬は、チオ尿素、イミダゾール、イミダゾリン、オキサゾール、およびオキサゾリンからなる群から選択されるか、またはその薬学的に許容される塩である。

別の実施形態において、α−２作動薬は、チオ尿素、イミダゾール、イミダゾリン、およびオキサゾリンからなる群から選択されるか、またはその薬学的に許容される塩である。

別の実施形態において、α−２作動薬のチオ尿素は、式

の化合物、またはその薬学的に許容される塩である。

別の実施形態において、α−２作動薬のイミダゾリンは、式

の化合物、またはその薬学的に許容される塩である。

別の実施形態において、α−２作動薬のイミダゾールは、

からなる群から選択される化合物、またはその薬学的に許容される塩である。

別の実施形態において、α−２作動薬のオキサゾリンは、式

の化合物、またはその薬学的に許容される塩である。

別の実施形態において、本発明のα−２作動薬は、式Ｉ

の化合物、またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
ＲおよびＲ¹は、独立して、ハロゲンまたはアルキルであり、
Ｒ²は、Ｈであるか、あるいは非置換またはヘテロアリールもしくはアリールで置換されてもよいアルキルであり、
Ｈｅｔは、イミダゾリニルおよびオキサゾリニルからなる群から選択される、ヘテロシクリル基である。

別の実施形態において、式Ｉ中、
ＲおよびＲ¹は、独立して、ハロゲンまたはメチルであり、
Ｒ²アルキルは、ピリジルであるヘテロアリールで置換されたメチルである。

ｑＰＣＲによるヒトＴ細胞のサブセットにおける、α_2B受容体には見られるがα_2A受容体には見られない発現を示す。 異痛神経因性疼痛のＳＮＬラットモデルにおける、化合物Ｂによる、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞である脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の持続した増加を示す。 α_2B受容体作動薬の化合物Ｂが、確立されたＭＳの疼痛において、鎮痛性であることを示し、Ｔｒｅｇ細胞の調節を示す。 化合物Ｂが、再発寛解型ＥＡＥのプロテオリピド誘発モデルにおいて、疾患の臨床経過に対して有意な効果を有することを示す。 化合物Ｂが、再発寛解型ＥＡＥのＰＬＰ誘発モデルにおいて、ＣＮＳにおける免疫細胞の存在を有意に減少させたことを示す。 化合物Ｃが、再発寛解型ＥＡＥのプロテオリピド誘発モデルにおいて、疾患の臨床経過に対して有意な効果を有することを示す。 化合物Ｃが、再発寛解型ＥＡＥのＰＬＰ誘発モデルにおいて、脊髄における制御性Ｔ細胞の頻度を有意に増加させることを示す。 化合物Ｂが、ＥＡＡＵラットの房水において、臨床疾患および炎症細胞の数に対して、有意な効果を有することを示す。 化合物Ｂが、ＥＩＵラットの房水において、タンパク質濃度に対して有意な効果を有することを示す。 化合物Ｂが、ラットＥＩＵモデルにおいて、血中好中球およびリンパ球のレベルを正常化させることを示す。 乾燥ストレスの開始で始まる、化合物Ｂでのドナーの治療が、受容者の涙液のＴＮＦ−αおよびＩＬ１７のレベルを有意に減少させたことを示す。 マウスを乾燥ストレスへ晒した後に開始する、治療形態における、化合物Ｃでの治療が、杯細胞の損失および結膜へのＴ細胞の浸潤を有意に減少させたことを示す。

α−２受容体作動薬
α−２受容体作動薬は、α−２アドレナリン受容体を活性化させるような化合物である。この受容体には、Ａ、Ｂ、およびＣと示される３つのサブタイプが存在する。化合物は、α−２Ｂアドレナリン受容体において、ブリモニジンに対して２５％を超える有効性を有する場合、「α−２Ｂ受容体作動薬」であり、化合物は、α−２Ｃアドレナリン受容体において、ブリモニジンに対して２５％を超える有効性を有する場合、「α−２Ｃ受容体作動薬」であり、化合物は、α−２Ｂおよびα−２Ｃアドレナリン受容体の両方において、ブリモニジンに対して２５％を超える有効性を有する場合、「α−２Ｂ／２Ｃ受容体作動薬」である。定義は、相互に排他的ではなく、α−２Ｂ受容体作動薬である化合物は、α−２Ｂ／２Ｃ受容体作動薬でもあってもよく、α−２Ｃ受容体作動薬である化合物はまた、α−２Ｂ／２Ｃ受容体作動薬であってもよい。

一実施形態において、本発明の方法は、α−２Ａ受容体サブタイプにおける顕著な活性を欠いたα−２作動薬を使用する。作動薬は、その作動薬が、α−２Ａ受容体サブタイプにおいて、４０％未満のブリモニジンの有効性を有する場合、顕著なα−２Ａ受容体活性を欠いている。本発明の化合物には、したがって、α−２Ｂ受容体作動薬、顕著なα−２Ａ活性を欠いたα−２Ｂ受容体作動薬、α−２Ｃ受容体作動薬、顕著なα−２Ａ活性を欠いたα−２Ｃ受容体作動薬、α２Ｂ／２Ｃ受容体作動薬、顕著なα−２Ａ活性を欠いたα２Ｂ／２Ｃ受容体作動薬が含まれる。前述の化合物のいずれも、α−２受容体以外の受容体に結合する場合であっても使用可能であり、例えば、α−１受容体作動薬は、α−１作動薬もまた、α−２Ｂおよびα−２Ｃ受容体サブタイプのうちの１つまたは両方において、ブリモニジンに対して２５％を超える有効性を有し、顕著なα−２Ａ受容体活性を欠くことを条件に、使用可能である。

内因性活性としても既知の有効性は、化合物によって達成される最大受容体活性の尺度であり、α−アドレナリン受容体活性の任意の容認されたアッセイ、例えばｃＡＭＰまたは受容体選択および増幅技術（ＲＳＡＴ）等を使用して判定することができる。有効性は、各受容体サブタイプについて、薬物の最大効果と標準的な作動薬の最大効果との比率または割合として表される。それ自体がα−２Ｂ受容体作動薬であるブリモニジン（α−２Ｂアドレナリン受容体において、ブリモニジンの１００％の有効性を有する）を、α−２Ｂアドレナリン受容体の標準的な作動薬として使用する。

作動薬活性は、例えば、受容体選択および増幅技術（ＲＳＡＴ）アッセイ（Ｍｅｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．７６：３０８−１１（１９９５）、環状ＡＭＰアッセイ（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１６：１６０９−１６１９（１９６９））、および細胞センサマイクロフィジオメトリアッセイ（Ｎｅｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５７４８−２５７５３（１９９２））を含む、種々のルーチンアッセイのうちの任意のものを使用して特徴付けることができる。このようなアッセイは、一般的に、単一のα−アドレナリン受容体サブタイプのみを自然に発現する細胞を使用して、または単一の組み換え型α−アドレナリン受容体サブタイプを発現するトランスフェクト細胞を使用して、行われる。アドレナリン受容体は、ヒト受容体、または類似の薬理学を有するヒト受容体の相同体であってもよい。

ＲＳＡＴアッセイは、コンフルエント細胞の混合集団において受容体含有細胞の選択的な増殖をもたらす、接触阻止の受容体媒介性の損失を測定する。細胞数における増加は、所望であれば、高スループットまたは超高スループットのアッセイ形式で、β−ガラクトシダーゼ等の適切な検出可能マーカー遺伝子を用いて評価する。Ｇタンパク質、Ｇｑを活性化させる受容体は、増殖性反応を誘発する。通常Ｇｉに結合するα−アドレナリン受容体は、Ｇｑ／ｉ５と示される、Ｇｉ受容体認識ドメインを含有するハイブリッドＧｑタンパク質と共発現される場合に、ＲＳＡＴ反応を活性化させる。Ｃｏｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：２７４−６（１９９３））。

例示として、ＲＳＡＴアッセイは、本質的に次のように実行することができる。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、２×１０⁶細胞の密度で、１５ｃｍの皿に蒔き、１０％の仔ウシ血清を補充した、ダルベッコ変法イーグル培地に維持する。１日後、細胞を、ｐ−ＳＶ−β−ガラクトシダーゼ（５〜１０μｇ）、受容体（１〜２μｇ）、およびＧタンパク質（１〜２μｇ）をコードする哺乳動物発現プラスミドを用いたリン酸カルシウム沈殿によってコトランスフェクトする。トランスフェクション効率を増加させるために、担体ＤＮＡ、例えば４０μｇのサケ精子ＤＮＡもまた含んでもよい。翌日に新鮮培地を添加し、１〜２日後、細胞を採取して５０個のアッセイアリコート中で凍結させる。トランスフェクトした細胞を解凍し、１００μｌの細胞を、例えば、９６ウェルプレートにおいて、試験する化合物の１００μｌアリコートに、３通りで、アッセイする種々の濃度で添加する。７２〜９６時間、３７℃でインキュベートを続ける。リン酸緩衝生理食塩水での洗浄後、β−ガラクトシダーゼ活性を、２００μｌの発色性基質（リン酸緩衝生理食塩水中、３．５ｍＭ Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド／０．５％ＮＰ−４０）を添加することによって判定し、３０℃で一晩インキュベートし、４２０ｎｍで光学密度を測定する。吸光度は、酵素活性の尺度であり、細胞数に依存し、受容体媒介性の細胞増殖を反映する。各受容体における各薬物のＥＣ₅₀および最大効果（すなわち、有効性）を判定する。

顕著なα−２Ａ受容体活性を欠いたものを含む、α−２Ｂおよび−２Ｃ受容体作動薬は、当該技術分野で既知である。それらの構造、合成、および活性を含む、α−２作動薬に関する詳細情報は、米国特許第６，３２９，３６９号、同第６，５３４，５４２号、同第６，５４５，１８２号、同第６，７８７，５１７号、同第６，８４１，６８４号、および同第７，０９１，２３２号、米国特許出願公開第２００３／００９２７６６号、同第２００４／０１３２８２４号、同第２００４／０２２０４０２号、同第２００５／００７５３６６号、および同第２００５／０２６７１８６号、ならびに米国特許出願第１１／１７２，２２９号、同第１１／２３２，３２３号、同第１１／２３２，３４１号、同第６０／６１３，８７０号、同第６０／６９５，６５０号、同第６０／７４７，４４４号、同第６０／８８４，７１８号、同第６０／９１７，８２８号、同第６０／９１１，４２２号、同第６０／９１１，４７８号、および同第６０／９４８，３８９号に見出すことができ、これら全ての開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

いずれのα−２受容体作動薬のいずれの薬学的に許容される塩、プロドラッグ、異性体、またはラセミ体も、本発明の方法において使用することができる。

「アルキル」とは、直鎖または分枝鎖であってもよく、鎖中に約１個〜約２０個の炭素原子を含む、脂肪族炭化水素基を意味する。好ましいアルキル基は、鎖中に約１個〜約１２個の炭素原子を含む。より好ましいアルキル基は、鎖中に約１個〜約６個の炭素原子を含む。分枝鎖状とは、１つ以上の低級アルキル基、例えば、メチル、エチル、またはプロピルが、直鎖アルキル鎖に結合していることを意味する。「低級アルキル」とは、直鎖または分枝鎖であってもよい鎖中に、約１個〜約６個の炭素原子を有する基を意味する。「アルキル」は、非置換であってもよく、または任意で、同じか、もしくは異なってもよい、各置換基が、独立して、ハロ、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、シクロアルキル、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、オキシム（例えば、＝Ｎ−ＯＨ）、−ＮＨ（アルキル）、−ＮＨ（シクロアルキル）、−Ｎ（アルキル）₂、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−アリール、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル、−ＳＦ₅、カルボキシ、およびＣ（Ｏ）Ｏ−アルキルからなる群から選択される、１つ以上の置換基によって置換されてもよい。好適なアルキル基の非限定的な例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、およびｔ−ブチルが挙げられる。

「アルケニル」とは、直鎖または分枝鎖であってもよい、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含み、鎖中に約２個〜約１５個の炭素原子を含む、脂肪族炭化水素基を意味する。好ましいアルケニル基は、鎖中に約２個〜約１２個の炭素原子を有し、より好ましくは、鎖中に約２個〜約６個の炭素原子を有する。分枝鎖状とは、１つ以上の低級アルキル基、例えば、メチル、エチル、またはプロピルが、直鎖アルケニル鎖に結合していることを意味する。「低級アルケニル」とは、直鎖または分枝鎖であってもよい鎖中における、約２個〜約６個の炭素原子を意味する。「アルケニル」は、非置換であってもよく、または任意で、同じかまたは異なってもよい、各置換基が、独立して、ハロ、アルキル、アリール、シクロアルキル、シアノ、アルコキシ、およびＳ（アルキル）からなる群から選択される、１つ以上の置換基で置換されてもよい。好適なアルケニル基の非限定的な例には、エテニル、プロペニル、ｎ−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、ｎ−ペンテニル、オクテニル、およびデセニルが挙げられる。

「アルキレン」とは、上に定義されるアルキル基からの水素原子の除去によって得られる、二官能基を意味する。アルキレンの非限定的な例には、メチレン、エチレン、およびプロピレンが挙げられる。

「アルキニル」とは、直鎖または分枝鎖であってもよい、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含み、鎖中に約２個〜約１５個の炭素原子を含む、脂肪族炭化水素基を意味する。好ましいアルキニル基は、鎖中に約２個〜約１２個の炭素原子を有し、より好ましくは、鎖中に約２個〜約４個の炭素原子を有する。分枝鎖状とは、１つ以上の低級アルキル基、例えば、メチル、エチル、またはプロピルが、直鎖アルキニル鎖に結合していることを意味する。「低級アルキニル」とは、直鎖または分枝鎖であってもよい鎖中における、約２個〜約６個の炭素原子を意味する。好適なアルキニル基の非限定的な例には、エチニル、プロピニル、２−ブチニル、および３−メチルブチニルが挙げられる。「アルキニル」は、非置換であってもよく、または任意で、同じかまたは異なってもよい、各置換基が、独立して、アルキル、アリール、およびシクロアルキルからなる群から選択される、１つ以上の置換基で置換されてもよい。

「アリール」とは、約６個〜約１４個の炭素原子、好ましくは約６個〜約１０個の炭素原子を含む、芳香族の単環式または多環式の環系を意味する。アリール基は、任意で、同じかまたは異なってもよい、本明細書に定義されるような、１つ以上の「環系置換基」によって任意に置換されてもよい。好適なアリール基の非限定的な例には、フェニルおよびナフチルが挙げられる。

「ヘテロアリール」とは、約５個〜約１４個の環原子、好ましくは約５個〜約１０個の環原子を含み、環原子の１つ以上は、炭素以外の元素、例えば、窒素、酸素、または硫黄の、単独または組み合わせである、芳香族の単環式または多環式の環系を意味する。好ましいヘテロアリールは、約５個〜約６個の環原子を含む。「ヘテロアリール」は、同じかまたは異なってもよく、本明細書に定義されるような、１つ以上の「環系置換基」によって任意に置換されてもよい。ヘテロアリール語幹名の前の接頭辞アザ、オキサ、またはチアは、少なくとも窒素、酸素、または硫黄原子が、それぞれ、環原子として存在することを意味する。ヘテロアリールの窒素原子は、任意で、対応するＮオキシドに酸化されてもよい。「ヘテロアリール」はまた、上に定義されるようなアリールに融合した、上に定義されるようなヘテロアリールを含んでもよい。好適なヘテロアリールの非限定的な例には、ピリジル、ピラジニル、フラニル、チエニル、ピリミジニル、ピリドン（Ｎ−置換ピリドンを含む）、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピラゾリル、フラザニル、ピロリル、ピラゾリル、トリアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、キノキサリニル、フタラジニル、オキシインドリル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾリル、ベンゾフラザニル、インドリル、アザインドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチエニル、キノリニル、イミダゾリル、チエノピリジル、キナゾリニル、チエノピリミジル、ピロロピリジル、イミダゾピリジル、イソキノリニル、ベンゾアザインドリル、１，２，４−トリアジニル、ベンゾチアゾリル等が挙げられる。用語「ヘテロアリール」はまた、部分的に飽和したへテロアリール部分、例えば、テトラヒドロイソキノリル、テトラヒドロキノリル等を指す。

「アラルキル」または「アリールアルキル」とは、アリールおよびアルキルが、前述の通りである、アリール−アルキル基を意味する。好ましいアラルキルは、低級アルキル基を含む。好適なアラルキル基の非限定的な例には、ベンジル、２−フェネチル、およびナフタレニルメチルが挙げられる。親部分への結合は、アルキルを介する。

「アルキルアリール」とは、アルキルおよびアリールが、前述の通りである、アルキル−アリール基を意味する。好ましいアルキルアリールは、低級アルキル基を含む。好適なアルキルアリール基の非限定的な例は、トリルである。親部分への結合は、アリールを介する。

「シクロアルキル」とは、約３個〜約１０個の炭素原子、好ましくは約５個〜約１０個の炭素原子を含む、非芳香族の単環式または多環式の環系を意味する。好ましいシクロアルキル環は、約５個〜約７個の環原子を含む。シクロアルキルは、同じかまたは異なってもよい、上に定義されるような、１つ以上の「環系置換基」によって任意に置換されてもよい。好適な単環式シクロアルキルの非限定的な例には、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル等が挙げられる。好適な多環式シクロアルキルの非限定的な例には、１−デカリニル、ノルボルニル、アダマンチル等が挙げられる。

「シクロアルキルアルキル」とは、アルキル部分（上に定義される）を介して、親核へ結合される、上に定義されるようなシクロアルキル部分を意味する。好適なシクロアルキルアルキルの非限定的な例には、シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル等が挙げられる。

「シクロアルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、約３個〜約１０個の炭素原子、好ましくは約５個〜約１０個の炭素原子を含む、非芳香族の単環式または多環式の環系を意味する。好ましいシクロアルケニル環は、約５個〜約７個の環原子を含む。シクロアルケニルは、任意で、同じかまたは異なってもよい、上述のような１つ以上の「環系置換基」によって任意に置換されてもよい。好適な単環式シクロアルケニルの非限定的な例には、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプタ−１，３−ジエニル等が挙げられる。好適な多環式シクロアルケニルの非限定的な例は、ノルボルニレニルである。

「シクロアルケニルアルキル」とは、アルキル部分（上に定義される）を介して親核に結合される、上に定義されるようなシクロアルケニル部分を意味する。好適なシクロアルケニルアルキルの非限定的な例には、シクロペンテニルメチル、シクロヘキセニルメチル等が挙げられる。

「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を意味する。好ましいものは、フッ素、塩素、および臭素である。

「環系置換基」とは、例えば、環系上で利用可能な水素を置換する、芳香族または非芳香族の環系に結合される置換基を意味する。環系置換基は、同じかまたは異なってもよく、それぞれが、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アルキルアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロアリール、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アシル、アロイル、ハロ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アルキルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アラルキルチオ、ヘテロアラルキルチオ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、−ＳＦ₅、−ＯＳＦ₅（アリールに対して）、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−アリール、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル、−Ｃ（＝Ｎ−ＣＮ）−ＮＨ₂、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ₂、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ（アルキル）、オキシム（例えば、＝Ｎ−ＯＨ）、−ＮＹ₁Ｙ₂、−アルキル−ＮＹ₁Ｙ₂、−Ｃ（Ｏ）ＮＹ₁Ｙ₂、−ＳＯ₂ＮＹ₁Ｙ₂、および−ＳＯ₂ＮＹ₁Ｙ₂からなる群から選択され、式中、Ｙ₁およびＹ₂は、同じかまたは異なってもよく、独立して、水素、アルキル、アリール、シクロアルキル、およびアラルキルからなる群から選択される。「環系置換基」はまた、環系上で、２つの隣接する炭素原子上の２つの利用可能な水素（各炭素上の１つのＨ）を同時に置換する単一部分を意味しうる。このような部分の例は、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、−Ｃ（ＣＨ₃）₂−等であり、例えば、

等の部分を形成する。

「ヘテロアリールアルキル」とは、アルキル部分（上に定義される）を介して、親核に結合される、上に定義されるようなヘテロアリール部分を意味する。好適なヘテロアリールの非限定的な例には、２−ピリジニルメチル、キノリニルメチル等が挙げられる。
「ヘテロシクリル」とは、約３個〜約１０個の環原子、好ましくは約５個〜約１０個の環原子を含み、環系の原子の１つ以上が、炭素以外の元素、例えば、窒素、酸素、または硫黄の、単独または組み合わせである、非芳香族の飽和単環式または多環式の環系を意味する。この環系には、隣接する酸素および／または硫黄原子は存在しない。好ましいヘテロシクリルは、約５個〜約６個の環原子を含む。ヘテロシクリル語幹名の前の接頭辞アザ、オキサ、またはチアは、少なくとも窒素、酸素、または硫黄原子が、それぞれ、環原子として存在することを意味する。ヘテロシクリル環中のいずれのＮＨも、例えば、−Ｎ（Ｂｏｃ）、−Ｎ（ＣＢｚ）、−Ｎ（Ｔｏｓ）基等として保護されて存在することができ、このような保護はまた、本発明の一部であると考えられる。ヘテロシクリルは、任意で、同じかまたは異なってもよい、本明細書に定義されるような、１つ以上の「環系置換基」によって置換されてもよい。ヘテロシクリルの窒素または硫黄原子は、任意で、対応するＮ−オキシド、Ｓ−オキシド、またはＳ，Ｓ−ジオキシドに酸化されてもよい。好適な単環式ヘテロシクリル環の非限定的な例には、ピペリジル、ピロリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリジニル、１，４−ジオキサニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ラクタム、ラクトン等が挙げられる。「ヘテロシクリル」は、また、式中、＝Ｏが、同じ環炭素原子上で、２つの利用可能な水素を置換する、上に定義されるようなヘテロシクリル環を含む。このような部分の例は、ピロリドン

である。

「ヘテロシクリルアルキル」とは、アルキル部分（上で定義される）を介して親核に結合される、上で定義されるようなヘテロシクリル部分を意味する。好適なヘテロシクリルアルキルの非限定的な例には、ピペリジニルメチル、およびピペラジニルメチル等が挙げられる。

「ヘテロシクレニル」とは、約３個〜約１０個の環原子、好ましくは約５個〜約１０個の環原子を含み、環系の原子の１つ以上が、炭素以外の元素、例えば、窒素、酸素、または硫黄原子の単独または組み合わせであり、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含む、非芳香族の単環式または多環式の環系を意味する。この環系には、隣接する酸素および／または硫黄原子は存在しない。好ましいヘテロシクレニル環は、約５個〜約６個の環原子を含む。ヘテロシクレニル語幹名の前の接頭辞アザ、オキサ、またはチアは、少なくとも窒素、酸素、または硫黄原子が、それぞれ、環原子として存在することを意味する。ヘテロシクレニルは、任意で、１つ以上の環系置換基で置換されてもよく、「環系置換基」は、上に定義される通りである。ヘテロシクレニルの窒素または硫黄原子は、任意で対応するＮ−オキシド、Ｓ−オキシド、またはＳ，Ｓ−ジオキシドに酸化されてもよい。好適なヘテロシクレニル基の非限定的な例には、１，２，３，４−テトラヒドロピリジニル、１，２−ジヒドロピリジニル、１，４−ジヒドロピリジニル、１，２，３，６−テトラヒドロピリジニル、１，４，５，６−テトラヒドロピリミジニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、２−イミダゾリニル、２−ピラゾリニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラニル、ジヒドロフラニル、フルオロジヒドロフラニル、７−オキサビシクロ［２．２．１］へプテニル、ジヒドロチオフェニル、ジヒドロチオピラニル等が挙げられる。「ヘテロシクレニル」はまた、式中、＝Ｏが、同じ環炭素原子上の２つの利用可能な水素を置換する、上述のようなヘテロシクレニル環を含む。このような部分の例は、ピロリジノン

である。

「ヘテロシクレニルアルキル」とは、アルキル部分（上で定義される）を介して親核に結合される、上で定義されるようなヘテロシクレニル部分を意味する。

本発明のヘテロ原子含有環系においては、Ｎ、Ｏ、またはＳに隣接する炭素原子上にヒドロキシル基は存在しないこと、ならびに、別のヘテロ原子に隣接する炭素原子上にＮまたはＳ基は存在しないことに留意されたい。したがって、例えば、環

において、２および５で表される炭素に直接結合する−ＯＨは存在しない。

例えば、部分

等、互変異性型は、本発明のある実施形態において、同等物と考えられることにもまた、留意されたい。

「アルキニルアルキル」とは、アルキニルおよびアルキルが、前述の通りである、アルキニル−アルキル基を意味する。好ましいアルキニルアルキルは、低級アルキニルおよび低級アルキル基を含む。親部分への結合は、アルキルを介する。好適なアルキニルアルキル基の非限定的な例には、プロパルギルメチルが挙げられる。

「ヘテロアラルキル」とは、ヘテロアリールおよびアルキルが、前述の通りである、ヘテロアリール−アルキル基を意味する。好ましいヘテロアラルキルは、低級アルキル基を含む。好適なアラルキル基の非限定的な例には、ピリジルメチル、およびキノリン−３−イルメチルが挙げられる。親部分への結合は、アルキルを介する。

「ヒドロキシアルキル」とは、アルキルが、前に定義される通りである、ＨＯ−アルキル基を意味する。好ましいヒドロキシアルキルは、低級アルキルを含む。好適なヒドロキシアルキル基の非限定的な例には、ヒドロキシメチルおよび２−ヒドロキシエチルが挙げられる。

「アシル」とは、種々の基が前述の通りである、Ｈ−Ｃ（Ｏ）−、アルキル−Ｃ（Ｏ）−、またはシクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。親部分への結合は、カルボニルを介する。好ましいアシルは、低級アルキルを含む。好適なアシル基の非限定的な例には、ホルミル、アセチル、およびプロパノイルが挙げられる。

「アロイル」とは、アリール基が、前述の通りである、アリール−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。親部分への結合は、カルボニルを介する。好適な基の非限定的な例には、ベンゾイルおよび１−ナフトイルが挙げられる。

「アルコキシ」とは、アルキル基が、前述の通りである、アルキル−Ｏ−基を意味する。好適なアルコキシ基の非限定的な例には、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、およびｎ−ブトキシが挙げられる。親部分への結合は、エーテル酸素を介する。

「アリールオキシ」とは、アリール基が、前述の通りである、アリール−Ｏ−基を意味する。好適なアリールオキシ基の非限定的な例には、フェノキシおよびナフトキシが挙げられる。親部分への結合は、エーテル酸素を介する。

「アラルキルオキシ」とは、アラルキル基が、前述の通りである、アラルキル−Ｏ−基を意味する。好適なアラルキルオキシ基の非限定的な例には、ベンジルオキシ、および１−または２−ナフタレンメトキシが挙げられる。親部分への結合は、エーテル酸素を介する。

「アルキルチオ」とは、アルキル基が、前述の通りである、アルキル−Ｓ−基を意味する。好適なアルキルチオ基の非限定的な例には、メチルチオおよびエチルチオが挙げられる。親部分への結合は、硫黄を介する。

「アリールチオ」とは、アリール基が、前述の通りである、アリール−Ｓ−基を意味する。好適なアリールチオ基の非限定的な例には、フェニルチオおよびナフチルチオが挙げられる。親部分への結合は、硫黄を介する。

「アラルキルチオ」とは、アラルキル基が、前述の通りである、アラルキル−Ｓ−基を意味する。好適なアラルキルチオ基の非限定的な例は、ベンジルチオである。親部分への結合は、硫黄を介する。

「アルコキシカルボニル」とは、アルキル−Ｏ−ＣＯ−基を意味する。好適なアルコキシカルボニル基の非限定的な例には、メトキシカルボニルおよびエトキシカルボニルが挙げられる。親部分への結合は、カルボニルを介する。

「アリールオキシカルボニル」とは、アリール−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。好適なアリールオキシカルボニル基の非限定的な例には、フェノキシカルボニルおよびナフトキシカルボニルが挙げられる。親部分への結合は、カルボニルを介する。

「アラルコキシカルボニル」とは、アラルキル−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。好適なアラルコキシカルボニル基の非限定的な例は、ベンジルオキシカルボニルである。親部分への結合は、カルボニルを介する。

「アルキルスルホニル」とは、アルキル−Ｓ（Ｏ₂）−基を意味する。好ましい基は、アルキル基が、低級アルキルであるようなものである。親部分への結合は、スルホニルを介する。

「アリールスルホニル」とは、アリール−Ｓ（Ｏ₂）−基を意味する。親部分への結合は、スルホニルを介する。

用語「置換された」とは、指定された原子上の１つ以上の水素が、既存の状況下で指定された原子の通常の原子価が超過していないこと、およびその置換が、安定な化合物をもたらすことを条件に、示される基からの選択で置換されていることを意味する。置換基および／または変数の組み合わせは、このような組み合わせが、安定な化合物をもたらす場合にのみ、許容される。「安定な化合物」または「安定な構造体」により、反応混合物からの有用な純度への単離、および効果的な治療剤への製剤化に耐えるのに十分に頑強である化合物を意味する。

用語「任意に置換された」とは、指定された基、ラジカル、または部分での任意の置換を意味する。

化合物に対する用語「精製された」、「精製された形態にある」、または「単離および精製された形態にある」とは、合成プロセス（例えば、反応混合物）もしくは自然源またはその組み合わせから単離された後の前記化合物の物理的状態を指す。したがって、化合物に対する用語「精製された」、「精製された形態にある」、または「単離および精製された形態にある」とは、本明細書に記載もしくは当業者に周知の標準的な解析技術によって特徴付け可能であるために十分な純度の、精製プロセスまたは本明細書に記載もしくは当業者に周知のプロセス（例えば、クロマトグラフィー、再結晶化等）から得られた後の前記化合物の物理的状態を指す。

本明細書に記載の文章、スキーム、実施例、および表中において、不十分な原子価を有するいずれの炭素ならびにヘテロ原子も、その原子価を満たすのに十分な数の水素原子（複数を含む）を有するものと考えられることにもまた、留意されたい。さらに、これらの水素原子のうちの任意の１つまたはそれ以上は、重水素であってもよい。

化合物中の官能基が、「保護されている」と称される場合、これは、その基が、化合物が反応に供される際、保護された部位での望ましくない副反応を排除するために、修飾された形態にあることを意味する。好適な保護基は、当業者によって、ならびに標準的な教本、例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９１），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋへの参照によって、理解されるであろう。

任意の変数（例えば、アリール、ヘテロ環、Ｒ²等）が、任意の構成物または式Ｉにおいて、複数回発生する場合、各発生におけるその定義は、他の全ての発生におけるその定義から独立している。

本明細書に使用される際、用語「組成物」は、特定の成分を特定の量で含む生成物、ならびに特定の量の特定の成分の組み合わせから、直接的または間接的にもたらされるいずれの生成物をも包含することを意図する。

薬学的に許容される塩
α−２受容体作動薬は、それらの薬学的に許容される塩として使用可能である。

「薬学的に許容される塩」は、それが投与される対象およびそれが投与される状況において、親化合物の活性を保持し、親化合物と比較して、いずれの追加的な有害効果または悪影響をも及ぼさない、任意の塩である。薬学的に許容される塩はまた、酸、別の塩、または酸もしくは塩に変換されるプロドラッグの投与の結果として、インビボで生じる任意の塩を指す。

酸性官能基の薬学的に許容される塩は、有機または無機塩基に由来してもよい。塩は、一価または多価イオンを含んでもよい。無機イオンのリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、およびマグネシウムが、特に興味深い。有機塩は、アミン、特にアンモニウム塩、例えば、モノ、ジ、およびトリアルキルアミン、またはエタノールアミンで生成されてもよい。塩はまた、カフェイン、トロメタミン、および類似の分子で形成されてもよい。塩酸または何らかの他の薬学的に許容される酸は、アミンまたはピリジン環等の塩基性基を含む化合物で、塩を形成することができる。

プロドラッグ
本発明の組成物または方法において、任意のα−２受容体作動薬のプロドラッグを使用することができる。

「プロドラッグ」は、投与後に治療的に活性な化合物に変換される化合物であり、その用語は、本明細書において、一般的に当該技術分野で理解されるものと同程度に広範に解釈されるべきである。本発明の範囲を制限するように意図するものではないが、変換は、エステル基または何らかの他の生物学的に不安定な基の加水分解によって生じ得る。必ずしもそうとは限らないが、一般的に、プロドラッグは、不活性であるか、またはそれが変換された治療的に活性な化合物よりも活性が低い。本明細書に開示される化合物のエステルプロドラッグが、特に企図される。エステルは、Ｃ１のカルボン酸（すなわち、天然プロスタグランジンの末端カルボン酸）由来であってもよく、またはエステルは、フェニル環等、分子の別の部分のカルボン酸官能基に由来してもよい。制限するように意図するものではないが、エステルは、アルキルエステル、アリールエステル、またはヘテロアリールエステルであってもよい。これに関して（「プロドラッグ」の定義）、用語「アルキル」は、当業者によって一般的に理解される意味を有し、直鎖、分枝鎖、または環状アルキル部分を指す。エステルのアルキル部分が、１個〜６個の炭素原子を有し、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル異性体、ヘキシル異性体、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ならびに１個〜６個の炭素原子を有するそれらの組み合わせ等を含むが、これらに限定されない、Ｃ_1-6アルキルエステルが、特に有用である。

本発明のα−２受容体作動薬は、合成的に生成することができるか、またはプロドラッグの投与後に、体内で生成されてもよい。したがって、用語「α−２受容体作動薬」は、製造プロセスによって生成される化合物、および別の薬物が投与される際にインビボでのみ形成されるような化合物の両方を包含する。

異性体およびラセミ体
本発明の組成物および方法において、α−２受容体作動薬の鏡像異性体、立体異性体、または他の異性体を使用することができる。さらに、本発明の組成物および方法において、ラセミ混合物または１つもしくは両方のラセミ体を、任意の比率で使用することができる。

用量
投与の正確な用量および頻度は、患者の病状の重症度および性質、投与の形態、採用される具体的な化合物の効能および薬力学、ならびに処方医師の判断に依存する。用量を判定することは、十分に当業者の能力の範囲内である日常的な事柄である。一般的に、α−２受容体作動薬は、治療有効用量、すなわち、所望の治療効果をもたらすのに十分な用量で投与される。

一実施形態において、本発明の化合物（α−２Ｂ受容体作動薬、顕著なα−２Ａ活性を欠いたα−２Ｂ受容体作動薬、α−２Ｃ受容体作動薬、顕著なα−２Ａ活性を欠いたα−２Ｃ受容体作動薬、α２Ｂ／２Ｃ受容体作動薬、および顕著なα−２Ａ活性を欠いたα２Ｂ／２Ｃ受容体作動薬）は、長期的な緩和、すなわち、化合物を休薬した後、１日間以上持続する緩和を提供する。したがって、一実施形態において、本発明の方法は、本発明の化合物を、初期の期間投与し、次いで、休薬期間が経過した後、第２の期間投与することを含む。初期、第２、および休薬期間は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日間、または１、２、３、もしくは４週間であってもよく、同じかまたは異なってもよい。したがって、例えば、本発明の化合物を、３日間投与し、次いで、化合物の最終投与の３日後すぐに、再度化合物を３日間投与してもよく、または本発明の化合物を２週間投与し、次いで、化合物の最終投与の１週間後すぐに、再度化合物を１週間投与してもよい。

別の実施形態において、初期および第２の期間は可変であり、休薬期間は不変である。このような実施形態において、初期および第２の期間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日間、または１、２、３、もしくは４週間である。したがって、例えば、本発明の化合物を、少なくとも３日間投与し、次いで、化合物の最終投与の６日後すぐに、再度化合物を少なくとも３日間投与してもよく、または本発明の化合物を少なくとも１週間投与し、次いで、化合物の最終投与の１週間後すぐに、再度化合物を少なくとも１週間投与してもよい。

賦形剤および投与形態
当業者は、α−２受容体作動薬が、当該技術分野で周知の薬学的に許容される賦形剤と混合されてもよいことを、容易に理解するであろう。

全身的に投与される薬学的組成物は、経口もしくは非経口投与、吸入、または眼もしくは皮膚への局所投与に好適な、粉末、丸剤、錠剤等として、または溶液、乳剤、懸濁液、エアロゾル、シロップ、またはエリキシルとして調合することができる。

固形の投与形態または薬剤については、非毒性の担体には、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、ポリアルキレングリコール、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムが挙げられるがこれらに限定されない。固形の投与形態は、コーティングされていなくてもよく、または、それらは、胃腸管での分解および吸収を遅らせ、それによって、長期間にわたって持続した作用を提供するために、既知の技術によってコーティングされていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリン等の時間遅延物質が、採用されてもよい。それらはまた、制御放出のための浸透性治療的錠剤を形成するために、米国特許第４，２５６，１０８号、同第４，１６６，４５２号、同第４，２６５，８７４号に記載の技術によってコーティングされてもよい。液体の薬学的に投与可能な投与形態は、例えば、それによって溶液または懸濁液を形成するための、例えば、水、生理食塩水、含水デキストロース、グリセロール、エタノール等の担体中の、１つ以上の現在有用な化合物および任意の薬学的アジュバントの溶液または懸濁液を含んでもよい。所望であれば、投与される薬学的組成物はまた、少量の湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤等の非毒性の補助剤を含有してもよい。これらの補助剤の典型的な例は、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン、酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン等である。このような投与形態を調製する実際の方法は、当業者に既知であるか、または明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８０を参照されたい。投与される製剤の組成物は、いずれの事例においても、多数の現在有用な化合物の１つ以上を、所望の治療効果を提供するために効果的な量で含有する。

非経口投与は、一般的に、皮下、筋肉内、または静脈内のいずれかの注入によって特徴付けられる。注入可能物質は、液体溶液もしくは懸濁液、注入前の液体溶液もしくは懸濁液に好適な固形形態、または乳剤のいずれかとして、従来の形態で調製することができる。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等である。さらに、所望であれば、投与される注入可能な薬学的組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤等、少量の非毒性補助剤を含有してもよい。

Ｔ細胞の活性化
Ｔ細胞は、遺伝子再構成の結果として生成される、特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するリンパ球の類である。Ｔ細胞は、多様な役割を有し、それは、Ｔ細胞の異なるサブセットの分化によって達成され、遺伝子発現の別の形式によって認識可能である。いくつかの主要なＴ細胞のサブセットは、ＴＣＲ−α／βおよびＴＣＲγ／δ等の受容体発現、ならびにインバリアントナチュラルキラー細胞に基づいて認識される。他のＴ細胞のサブセットは、表面分子およびそこから分泌されるサイトカインによって定義される。例えば、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４細胞）はサイトカインを分泌し、Ｂ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の生存およびエフェクター機能の実行を助ける。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、一般的にＣＤ８細胞であり、それらは、感染細胞または腫瘍細胞等の標的細胞を破壊することに特化する。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、Ｔ細胞に関連するがＴＣＲを有さず、寿命はより短いが、いくつかの機能をＴ細胞と共有し、サイトカインを分泌して数種類の標的細胞を破壊することが可能である。

ヒトおよびマウスの末梢血は、Ｔ制御性表現型（「Ｔｒｅｇ」）、すなわちＣＤ４およびＣＤ２５抗原の両方に陽性であるもの（すなわち、ＣＤ２５にも極めて陽性であるＣＤ４⁺Ｔ細胞）を発現するＴ細胞リンパ球の小集団を含有する。まずマウスにおいて特徴付けると、それらは、リンパ節および脾臓ＣＤ４⁺Ｔ細胞集団の６〜１０％を構成し、このＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺細胞の集団は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のおおよそ５〜１０％のみ、またはＣＤ４⁺Ｔ細胞の２〜７％に相当するが、より明確なＣＤ４⁺およびＣＤ２５⁺細胞の集団を示すドナーもいる。約１〜２％のヒト末梢血ＰＢＭＣは、ＣＤ４に陽性（ＣＤ４⁺）およびＣＤ２５に鮮明に陽性（ＣＤ２５⁺）の両方である細胞である。

Ｔｒｅｇ細胞の複数のサブセットが存在する（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：２５３（２００３））。制御性細胞の１つのサブセットは、胸腺において発達する。胸腺由来のＴｒｅｇ細胞は、細胞間の接触を伴うサイトカイン非依存性機構によって機能する（Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３８９（２００２））。それらは、自己寛容の誘発および維持、ならびに自己免疫の防止に必須である（Ｓｈｅｖａｃｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：４２３−４４９（２０００）、Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｔａａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｓａｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：４３１−４４０（２０００）、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１８２：１８−３２（２００１））。これらの専門的な制御性細胞は、胸腺欠失を回避した自己反応性Ｔ細胞の活性化および増殖を防止するか、または胸腺外抗原を認識し、したがって、それらは、恒常性および免疫制御のため、ならびに自己免疫の発達から宿主を保護するために、重要である（Ｓｕｒｉ−Ｐａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：１７９９−１８０５（１９９６）、Ａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：３８７−３９６（１９９６）、Ｂｏｎｏｍｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６６０２−６６１１（１９９５）、Ｗｉｌｌｅｒｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：５２１−５３０（１９９５）、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１９６９−１９８０（１９９８）、Ｓａｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：４３１−４４０（２０００）、Ｒｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：２９５−３０２（２０００）。したがって、免疫制御性ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞は、しばしば、「専門的な抑制細胞」と称される。

しかしながら、Ｔｒｅｇ細胞はまた、成熟した、末梢ＣＤ４⁺Ｔ細胞の活性化によって生成することもできる。研究は、末梢に由来するＴｒｅｇ細胞が、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）およびＩＬ−１０等の免疫抑制サイトカインを生成することによって、それらの阻害活性を媒介することを示した（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：１０８０（２００２）、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：６２９−６４４（２００１））。抗原特異的活性化の後、これらのＴｒｅｇ細胞は、ＣＤ４⁺またはＣＤ２５⁺のいずれかのＴ細胞の増殖を非特異的に抑制することができる（Ｂａｅｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７（３）：１２４５−１２５３（２００１）による、低用量固定化抗−ＣＤ３ｍＡｂ系共培養抑制因子アッセイにおけるＦＡＣＳソート処理によって示される）。

近年、Ｒｉｌｅｙら（“Ｈｕｍａｎ Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔａｋｅ ａ ｂｉｌｌｉｏｎ ｏｒ ｓｏ ａｎｄ ｃａｌｌ ｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｒｎｉｎｇ，”Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３０（５），６５６−６６５（２００９））は、制御性Ｔ細胞が、免疫活性化を伴ういくつかの病的状態において、重要であることを示した（Ｒｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＣＤ２５＋、ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇは、通常型ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、Ｂ細胞抗体生成、ＣＤ８＋細胞傷害性活性、ならびに抗原提示細胞の機能および成熟を含む、多数の細胞型の機能を抑制することによって、免疫応答炎症および組織破壊を阻止する能力を有する（Ｔａｎｇ＆Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，２００８）。Ｔｒｅｇの頻度減少または機能不全が、多数のヒト疾患において報告されている（Ｔｒａｎ＆Ｓｈｅｖａｃｈ，２００９）。

一実施形態において、本発明の方法は、制御性Ｔ細胞機能を上方制御するために、α−２作動薬を、このような上方制御が有益であろう患者に投与することを含む。別の実施形態において、制御性Ｔ細胞は、ＣＤ２５＋、ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞である。別の実施形態において、本発明の方法は、神経炎、ギランバレー症候群、リウマチ性関節炎、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、自己免疫性ブドウ膜炎、眼性炎症、眼乾燥性疾患、アトピー性皮膚炎、乾癬、炎症性腸疾患、喘息、および再生不良性貧血等の疾患を治療するために、α−２作動薬を投与することを含む。

本発明を、以下の実施例によって例示する。これは、例示目的でのみ提供され、さらに多くの実施形態が可能である。

制御性Ｔ細胞に対するα−２Ｂ作用の根拠
発明者らは、α_2B選択的化合物が、免疫関連機構を介して、神経因性疼痛の状態を制御するかどうかを試験した。α_2B作動薬である化合物Ａでの治療は、脊髄神経結紮手術に誘発されたＩＬ−２レベルの増加を軽減した（表１）。ＩＬ−２は、Ｔ−リンパ球増殖を制御するために必須の炎症促進性サイトカインである。この発見は、急性および慢性異痛症の回復（米国特許第７，３４５，０６５に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）へのα_2B作動薬の作用が、免疫細胞、特にＴ細胞を介して媒介され得ることを示す。発明者らはまた、ｑＰＣＲにより、ヒトＴリンパ球の異なるサブタイプにおいてα_2B受容体の発現は観察したが、α_2A受容体の発現は観察しなかった。発明者らの知る限り、これは、Ｔ細胞におけるα_2B受容体サブタイプの発現の初の実証である（図１）。α_2B−受容体作動薬によって媒介される、持続痛の軽減機構における、免疫細胞の役割についての更なる根拠は、異なる構造を有する第２のα_2B作動薬である化合物Ｂの鎮痛効果が、免疫抑制薬ＦＫ５０６で阻止可能であるという事実によって得られた（表２）。この発見は、α_2B受容体に誘発された長期的な異痛症の回復は、ＦＫ５０６がＴ−リンパ球活性化の強力な遮断薬であることが示されたため、活性化されたリンパ球の存在を必要とすることを示唆する（Ｓｍａｌｌ ｅｔ ａｌ，１９９６）。この発見は、異なる構造を有する、さらに別のα_2B作動薬である化合物Ｃを用いて確認され、ＦＫ５０６においては、脊髄結紮モデルにおいて、化合物Ｃの長期的な鎮痛活性を阻止することが可能であった（表３）。

さらに、発明者らは、α_2B−受容体媒介の効果に関与するＴ細胞のサブタイプについて調査しており、α_2B−受容体作動薬で治療された神経因性疼痛を有する動物のリンパ器官において、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数の有意かつ持続的な増加を観察する（図２）。発明者らは、未感作動物において、Ｔｒｅｇ細胞数への化合物の影響を観察しなかった。これは、α_2B−受容体作動薬のＴｒｅｇ細胞への作用は、抗原刺激に依存性であり、Ｔｒｅｇ細胞の抗原選択的な増大が存在し得ることを示唆する。

多発性硬化症モデルにおけるα−２Ｂ作動薬の効果
発明者らは、α_2B−受容体作動薬のこの機構が、病理学的Ｔ細胞活性の第２のモデルである、多発性硬化症のモデル、および第２の種に汎用化可能であることを示した。実験的自己免疫性脳脊髄炎の再発寛解型を引き起こす、プロテオリピドタンパク質で免疫付与したマウスにおいて、化合物Ｂ（３ｍｇ／ｋｇ／日、浸透圧ミニポンプによる）は、Ｔｒｅｇ数を選択的に高め、疼痛を減少させた（図３）。

他のＴ細胞媒介性疾患モデルにおける研究
神経因性疼痛のＣｈｕｎｇモデルおよびＭＳ誘発の疼痛モデルにおけるα_2B−受容体作動薬媒介効果の機構の研究は、リンパ器官中の推定制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）の数の有意かつ持続的な増加を示した。発明者らは、疾患の臨床経過への効果についてＭＳモデルにおいて、ならびに自己免疫性ブドウ膜炎、内毒素誘発のブドウ膜炎、および眼乾燥性疾患において、α_2B−受容体作動薬をさらに研究した。実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の再発寛解型を引き起こす、プロテオリピドタンパク質で免疫付与したマウスにおいて、臨床疾患発達時の化合物Ｂでの治療は、ＭＳの症状の緩和に有意な効果を有する（図４）。７日目〜１０日目の治療は、１４日目（ｐ＜０．０１）および２４日目の再発時、臨床スコアを減少させた。マウスを継続的に治療する場合、同様の結果が得られる。ＥＡＥにおいて、炎症促進性ＣＤ４＋Ｔ細胞および他の炎症性細胞は、末梢中で増殖し、中枢神経系（ＣＮＳ）に浸潤し、それが進行性麻痺を特徴とする脱髄につながる。研究の終わりに、フローサイトメトリーを介するＣＮＳ中への免疫細胞の浸潤の分析は、化合物Ｂでの治療が、免疫細胞の存在を有意に減少させたことを明らかにした（図５）。これは、化合物Ｂが、ＣＮＳ中の病原性Ｔ細胞の存在を阻止し、脳脊髄炎の緩和をもたらしたことを示す。化合物Ｃもまた、ＥＡＥにおいて同様の効果を示した。７日目〜１３日目の１日３回の経口投与（３ｍｇ／ｋｇ／日）の後、臨床スコアは、ビヒクルで治療した１３日目〜２４日目のマウスと比較して、有意に減少した（図６）。３７日目におけるフローサイトメトリーを介したＣＮＳ中の免疫細胞の分析は、化合物Ｃが、脊髄における制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３＋）の頻度を増加させたことを明らかにした（図７）。発明者らはまた、眼のＴ細胞媒介性炎症のモデルにおいて、α２Ｂ作動薬の有用性を調査するために研究を行った。実験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＡＵ）は、前部の疾患をもたらす、抗原特異的なＴ細胞媒介性自己免疫応答を示す。ＥＡＡＵ誘発（１日３回、３日間の経口投与に続いての浸透圧ミニポンプを介する投与）に続いて、１日目〜１８日目、または７日目〜１８日目に１ｍｇ／ｋｇ／日で投与した、化合物Ｂは、前部の炎症を部分的に抑止することに効果的であった。

化合物Ｂは、前部ブドウ膜炎の臨床スコアを減少させ、房水中の炎症細胞数を減少させた（図８）。さらに、化合物Ｂは、血中の好中球数の減少でわかるように、免疫応答を正常化させることに効果があることがわかり、血中のリンパ球集団を正常化し、脾臓中のＣＤ４⁺Ｔ細胞集団を正常化した。化合物Ｂの同様の効果が、急性内毒素誘発ブドウ膜炎（ＥＩＵ）モデルにおいても観察された。化合物Ｂ（１ｍｇ／ｋｇ／日、浸透圧ミニポンプにより送達）は、未治療またはビヒクル治療（生理食塩水）対照と比較すると、ＥＩＵラットの房水へのタンパク質の浸出を有意に阻害した（図９）。ＬＰＳ刺激の結果としての血中好中球の増加および血中リンパ球集団の減少は、化合物Ｂによって有意に正常化されたが、ビヒクル治療は正常化されなかった（図１０）。眼乾燥性疾患のモデルにおける養子移入研究は、眼性炎症へのα_2B作動薬の効果は、Ｔ細胞に関与することを示す。３ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ｂまたはビヒクル（３日間の経口での１日３回の投薬に続いて浸透圧ミニポンプを介する投薬）で治療したマウスにおける、１０日間の送風機誘発の乾燥ストレスの後、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、採取し同種のヌードマウスに移入した。化合物Ｂで治療したマウス（１０日間の送風機への露出中）からＴ細胞を受容した受容マウスは、眼乾燥性疾患に寄与する主要なサイトカインである、サイトカインＩＬ−１７およびＴＮＦαのレベルを有意に減少させた（図１１）。化合物Ｂを、治療形態においてもまた試験し、その治療（３ｍｇ／ｋｇ／日、浸透圧ミニポンプを介して）は、事前に送風機に晒したマウスに対して施された。この形態においてもまた、化合物Ｂは、シクロスポリンＡと同程度に、杯細胞損失および結膜へのＴ細胞の浸潤を有意に阻止した（図１２）。これらの研究は、化合物Ｂ、化合物Ｃ、および他のα_2B作動薬の機構が、免疫調節に関与するという仮説を支持する。

方法
ラットの脊髄神経結紮モデル
ラットのＳＮＬ（またはＣｈｕｎｇ）モデルは、神経因性疼痛の認められた標準的な動物モデルであり、症状（保護挙動、機械的異痛症）および薬理剤による軽減に関して、ヒト灼熱痛症状を模倣すると考えられる。例えば、モルヒネは、接触性異痛症を軽減しないが、一方でガバペンチン（３０ｍｇ／ｋｇ、経口）は、異痛症の５０％の軽減をもたらす。ＳＮＬモデルは、記載のように、接触性異痛症または軽い接触に対する感受性を発生させる、Ｌ−５およびＬ−６の脊髄神経を堅く結紮することによって実行した（Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｈｕｎｇ，１９９２）。雄性のスプラーグドーリーラット（１００〜１２０グラム、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）は、イソフルラン／酸素混合物の吸入を通じて麻酔した。手術部位を剪毛し、ベタジンで調製した。切開を、第ＸＩＩＩ胸椎から仙骨に向かって行った。筋肉を、Ｌ４〜Ｓ２のレベルで脊髄の椎骨（左側）から分離した。Ｌ６椎骨を配置し、次いで、Ｌ４〜Ｌ６脊髄神経を視覚的に特定するために、小型の骨鉗子で横突起を注意深く除去した。Ｌ５およびＬ６脊髄神経を単離し、６−０絹糸で堅く結紮した。完全な恒常性を確認し、次いで、創傷を縫合した。手術持続時間は、おおよそ２０分であった。少量の抗生物質軟膏を切開範囲に塗布し、制御された加熱温度照明下で、動物をプラスチック製回復ケージに移した。動物には、術後、研究する現象である疼痛症候群の発達を阻害することになるため、いずれの局所または局部麻酔も施さなかった。

異痛症を、文献中に記載のように、アップダウン式で手術の後足中央の足底領域への一連の８つのＶｏｎ Ｆｒｅｙヘアを用いた刺激によって、Ｃｈｕｎｇ手術を受けた動物において定量化する（Ｄｉｘｏｎ，１９８０）。Ｖｏｎ Ｆｒｅｙヘアを、５０％閾値が、確立されるまで、応答に応じてアップダウン式で適用させる。Ｖｏｎ Ｆｒｅｙヘアを、それらを曲げるのに十分な程度の力で、手術の足の足底表面に適用させる。肯定反応は、足が敏速に引き出されると、記録される。８つのＶｏｎＦｒｅｙヘア、３．６１、３．８４、４．０８、４．３１、４．５６、４．７４、４．９３、および５．１８を使用し、０．２５〜１５グラムのグラム重量を得た。

Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ分析：

平均±平均値の標準誤差：
平均＝異痛症回復の平均
平均値の標準誤差＝標準誤差／ｎの平方根

化合物での試験を、手術の２〜３週間後に行い、安定した異痛症を確立する。全ての実験動物において、ベースライン測定を、薬物投与前、続いて、Ａｌｚｅｔ浸透圧ミニポンプでの投薬の２４時間および５〜２３日後に、取得した。調査官には、薬物群の識別は知らされなかった。％異痛症回復は、次のように計算した。［（投薬後の閾値−投薬前の閾値）／（１５−投薬前の閾値）］×１００

マウスにおけるプロテオリピド誘発の実験的自己免疫性脳脊髄炎
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のマウスモデルを、ＭＳの根本的な免疫病原性機構を理解するために、広く使用した。ミエリン結合タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）等のミエリンタンパク質で免疫付与したマウスは、ＭＳを有する患者に多数の類似点を示す（Ｆｒｉｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）。Ｔ細胞、マクロファージ、および抗体を含む、免疫系の構成要素は、ＥＡＥマウスにおけるミエリン破壊の重要な寄与因子である。さらに、炎症はまた、尾部弾力性の損失、異常歩行、および部分的から完全な後肢麻痺を含む、神経機能不全の臨床的兆候に至る、多発病巣領域の脱髄を発生させる。ＰＬＰ誘発のＥＡＥモデルは、ＣＮＳ炎症および脱髄、ならびにＭＳ関連疼痛の発症機構、すなわちＡｌｌｅｒｇａｎにおいてここで最適化した多重標的型概念を、同時に調査する能力を提供する。滅菌技術を使用して、プロテオリピドタンパク質ミエリンペプチド（ＰＬＰ）（１３９−１５９：ＣＨＣＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦＶＧＩＴＹＡＬ）を、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と１：１で混合する（最終濃度２ｍｇ／ｍｌ ＰＬＰ）。８〜１０週齢の雌性ＳＪＬマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に、２６Ｇの針を使用して、１００μｌのＰＬＰ／ＩＦＡ（２００μｇのＰＬＰ／注入）を、右および左両方の足側面に皮下注入する（０日目）。このプロトコルを使用して免疫付与したマウスは、寛解／臨床改善の期間を有する運動障害の発作を伴う再発寛解型臨床経過を経験する。さらに、これらのマウスは、臨床寛解の期間中に、最も顕著な強い疼痛表現型を示す。

このプロトコルを使用して、ＳＪＬマウスにおけるＰＬＰ誘発のＥＡＥの発病は、（約９０〜１００％）の発生率で生じ、一般的に、免疫付与後約１２日までに明白となり、１４〜２１日までに疾患のピークに達する。ＰＬＰ−ＥＡＥマウスは、神経障害の身体症状を示し、尾部弾力性の部分的な損失から、部分〜完全後肢麻痺へと進行する。最大７５％のマウスは、運動障害（後肢の衰弱および麻痺）の発現が伴われる寛解期間を伴う、再発寛解型臨床経過を経験する。組織学的に、マウスは、脳および脊髄の白質管（有髄軸索を含む領域）内の広範な炎症、炎症細胞の進行性浸潤および蓄積、脱髄、ならびに軸索損失を示す。重度のＥＡＥを有するマウスは、広範な細胞浸潤、広範囲に及ぶ脱髄病巣を示す。ＰＬＰ免疫付与型マウスは、典型的に、神経障害の最初の発症時（１４〜２１日目）に、最も重度の臨床疾患を示す。一般的に、疼痛表現型は、最初の脱髄発症からの寛解後に、最も顕著に発症し、マウスが安楽死するまで持続する。

マウスは、行動障害について、０−異常なし、１−尾部弾力性の部分的な損失（部分的な尾部の引きずり）、２−尾部弾力性の損失および後肢の衰弱、３−不安定歩行および部分的な後肢麻痺、４−完全な後肢麻痺、ならびに５−瀕死または死亡、の０〜５段階で、日常的に視覚的に採点した。採点は、マウスを屠殺するまで、免疫付与７日後に開始して１日〜２日おきに実行した。異痛症を、前述のようにＶｏｎ Ｆｒｅｙヘア法により測定した。研究の最後に、脾臓、頸部リンパ節、脊髄、および脳を収集してフローサイトメトリーを行った。

マウスにおける乾燥、乾燥ストレス（ＤＳ）
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ）およびＢ６．Ｃｇ／ＮＴａｃ−Ｆｏｘｎ１ｎｕＮＥ９を、Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から購入した。マウスを、６〜１０週齢で使用した。動物実験の認可は、ｔｈｅ Ａｌｌｅｒｇａｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから得た。全ての研究は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ ＯｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙのＵｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈについての記載に従った。文献に記載のように、１日３回、左側と右側に交互に臭化水素酸スコポラミン（０．５ｍｇ／０．２ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の皮下注入でマウスを処置することによって、眼乾燥を誘発させた（Ｎｅｉｄｅｒｋｏｒｎ ｅｔ ａｌ，２００６）。マウスを、送風機（ケージの各側面に１つの送風機）からの通気を可能にするために、ケージの各側面に孔あきプラスチックスクリーンを有するケージに、１６時間／日、フード内に入れた（ＡｉｒＣｌｅａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）。室内湿度を、４０％未満に維持した。乾燥ストレス（ＤＳ）を、連続１０日間、誘発した。脾臓および頸部リンパ節（ＣＬＮ）を、ＤＳおよびＮＳに供したマウスから収集し、１つのドナーに対応する脾臓またはＣＬＮ ＣＤ４＋細胞のいずれかを、同種ヌードマウスに腹腔内移入した。１つの脾臓に対応するＴ細胞は、５×１０⁷個の細胞に等しい。３日後に、分析のために試料を収集した。涙液収集のために、１．５μＬのＰＢＳを各眼に入れ、次いで１μＬの涙液を、両眼から収集し、８μＬのサイトカインアッセイ緩衝液（Ｂｅａｄｌｙｔｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に入れた。緩衝液および涙液を、外眼角の涙液メニスカスに設置した、１μＬ容積のガラス製毛細管（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｏｏｍｈａｌｌ，ＰＡ）を使用して、毛細管作用によって収集した。試料を、アッセイ時まで−８０℃で凍結させた。組織学的分析は、結膜中の杯細胞およびＴ細胞を定量化するために、涙腺試料を、ＣＤ４に対する抗体で染色し、Ｈ＆Ｅ染色することによって、行った。治療形態にある化合物を試験するために、動物を、乾燥ストレスに２週間晒し、次いで、７日間通常の収容ケージで休養させた。動物を、続いて、再度さらに７日間乾燥ストレスに晒し、慢性眼乾燥性疾患の再発型を模倣させた。化合物Ｂでの薬物治療は、再度乾燥ストレスに晒す２日前に開始した。いずれの研究においても、化合物Ｂは、３ｍｇ／ｋｇ／日で投与した。養子伝達、涙液サイトカイン分析、および組織学的分析を、上述のように実行した。

ラットにおける実験的自己免疫性前部網膜ブドウ膜炎
雄性のＬｅｗｉｓラット（１８０〜２００ｇ）に、１５０μｇ（１００μＬ中）の精製したウシ眼からのＭＡＡ複合体を単回左後部足蹠注入することによって、免疫付与した。ＭＡＡタンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）中に懸濁し、１μｇ／１００μｌの百日咳毒素（ＰＴｘ）乳剤混合物を含有する完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ，ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で乳化させた（１：１ｖ／ｖ）。対照動物に、ＣＦＡおよびＰＴｘで乳化させたＰＢＳを注入した。

眼内炎症の評価は免疫付与の７日後に開始して実行し、動物を、ブドウ膜炎の臨床兆候および症状について、免疫後７日目〜１９日目に１日おきに、細隙灯顕微鏡を使用して試験した。房水を、炎症細胞数およびタンパク質レベルを評価するために収集した。細胞の計数は、光学顕微鏡下で、血球計を用いて１０ｕｌで行った。タンパク質濃度は、ＢＳＡをタンパク質基準として使用して、Ｂｉｏ−Ｒａｄからのタンパク質アッセイ溶液で測定した。炎症促進性サイトカインおよびケモカインのレベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で測定した。血液、脾臓、および眼を、１１、１４、および１９日目に摘出し、フローサイトメトリーを介して、血中白血球分化、脾臓Ｔ細胞活性化状態、ならびに病理組織学を判定した。
ラットにおける内毒素誘発のブドウ膜炎：

雌性のＬｅｗｉｓラット（１８０〜２００グラム）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ラットに、１００μｌの１ｍｇ／ｍｌ ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）溶液（滅菌ピロゲン不含生理食塩水）または１５０μｌの滅菌ピロゲン不含生理食塩水のいずれかを、足蹠注入（後部左側）した。動物を、ＬＰＳ注入の２４時間後に屠殺した。房水を収集し、炎症細胞数、サイトカインおよびケモカイン濃度のレベル、ならびに全タンパク質濃度を判定した。血中白血球分化および病理組織学もまた、必要であれば判定した。
製剤：

化合物Ａを、５０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中に製剤化した。この溶液を、０．５ｕｌ／時間の速度で薬物を送達し、２．４ｍｇ／ｋｇ／日の最終用量をもたらすように設定された、浸透圧ミニポンプ（Ｍｏｄｅｌ １００７Ｄ、Ａｌｚｅｔ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）に充填した。これらの研究に対するビヒクルは、０．５ｕｌ／時間／ｋｇの速度で浸透圧ミニポンプを介して投与される５０％ＤＭＳＯである。

化合物Ｂを、５０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中に製剤化した。この溶液を、経口で１日３回、０．３または１ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。浸透圧ミニポンプ（Ｍｏｄｅｌ １００７Ｄ，Ａｌｚｅｔ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）における投与のため、化合物を１または３ｍｇ／ｋｇ／日のいずれかの最終用量を送達するように設定したポンプに充填した。これらの研究に対するビヒクルは、５０％ＤＭＳＯである。

化合物Ｃを、まず１００％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中に製剤化し、１０ｍｇ／ｍｌ溶液用に３０％ＤＭＳＯ中、３ｍｇ／ｍｌ溶液用に１５％ＤＭＳＯ中に希釈し、さらに水中に希釈した。化合物を、経口で１日３回、０．３または１ｍｇ／ｋｇのいずれかの用量で、それぞれ、１または３ｍｇ／ｋｇ／日の合計１日用量を投与した。

フローサイトメトリー
浅頸リンパ節細胞および脾臓細胞を、緩やかな機械処理によって得た。ＣＤ４⁺細胞を、ＣＤ４＋単離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して、製造業者の手順に従って、単離した。脳および脊髄を、機械的に脱凝集させ、ＣＮＳの単核細胞を、３７．５％パーコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して単離した。

ＣＤ４（ヘルパーＴ細胞）、ＣＤ８（キラーＴ細胞）、ＣＤ２５（活性化ヘルパーＴ細胞および制御性Ｔ細胞）、ＣＤ４５（マクロファージおよびミクログリア細胞）、ならびにＦ４／８０（マクロファージおよびミクログリア細胞）の表面発現を判定するために、５×１０⁵細胞／１００μＬ ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．０２％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および２％ウシ血清アルブミン）を、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡからの適切な抗体でインキュベートした。アイソタイプ対照抗体を、抗体のそれぞれに使用した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、５×１０⁵細胞／１００μＬ緩衝液で再懸濁した。ビオチン標識化した抗体を含有する管に、１．５μＬの補助染色色素（ストレプトアビジンＰｅｒＣＰ、ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を入れ、暗所で２０分間氷上に置いた。発現を分析した（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを有するＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）。

サイトカインのＬｕｍｉｎｅｘ分析
サイトカインのレベルを、感応性の蛍光多重イムノビーズアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて測定した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅからの９項目ラットサイトカイン／ケモカイン（ＲＣＹＴＯ−８０Ｋ−０９）パネルを使用した。試料中のサイトカインレベルを、対応するＭｉｌｌｉｐｏｒｅのサイトカインＢｅａｄｍａｔｅペアを使用して、分析した。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイについては、９６ウェルフィルタプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、２５μｌのＢｅａｄｌｙｔｅサイトカインアッセイ緩衝液で事前に湿潤させた。真空マニホールド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して、ウェルから緩衝液を吸引した。２５μｌの試料を各ウェルに設置した。ビーズ（２５μｌ）を、ピペットでウェルに入れた。各サイトカインの標準曲線を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した標準物の２５μｌの適切な希釈を設置することによって、２部生成した。プレートを、４℃で暗所において穏やかに振動させながら一晩インキュベートした。ビーズをＢｅａｄｌｙｔｅサイトカインアッセイ緩衝液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で洗浄し、洗浄緩衝液を、真空マニホールドを使用して排除した。２５μｌの適切なビオチン結合２次抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、穏やかに振動させながら、室温で９０分間、各ウェルに添加した。ビーズを、Ｂｅａｄｌｙｔｅストレプトアビジン−フィコエリトリン（Ｂｅａｄｌｙｔｅアッセイ緩衝液中１：２５希釈）で、穏やかに振動させながら室温で３０分間インキュベートした。ビーズを洗浄し、１２５μｌのＢｅａｄｌｙｔｅ緩衝液中に再懸濁し、Ｌｕｍｉｎｅｘ １００機器（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ， ＴＸ）によって分析した。最低限サイトカイン１個あたり５０個のビーズから得られた平均蛍光強度を、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｅａｄｖｉｅｗソフトウェアを使用して分析した。４または５パラメータのロジスティック曲線を使用して、標準曲線（ゼロ標準線を２通り含む８つのデータポイント）を生成した。Ｒ−２乗値は、０．９９〜１であった。データは、ｐｇ／ｍｌまたはｎｇ／ｍｌの値で表す。

Claims (4)

1. 患者における移植片対宿主病の治療のための薬学的組成物であって、
   下記式
   

   

   の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、前記薬学的組成物。
2. 前記薬学的組成物が、初期の期間の投与、次いで、休薬期間が経過した後の第２の期間の投与に適合されている、請求項１記載の薬学的組成物。
3. 前記初期、第２、および休薬期間は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日間、または１、２、３、もしくは４週間である、請求項２に記載の薬学的組成物。
4. 患者における移植片対宿主病を治療するための薬学的組成物の製造のための化合物の使用であって、
   前記化合物が、下記式
   

   

   の化合物またはその薬学的に許容される塩である、上記使用。

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