TR201806652T4 - Sübstitüe edilmiş sodyum-1H-pirazol-5-olat. - Google Patents

Abstract

Mevcut başvuru, sodyum-1-[6-{morfolin-4-il)pirimidin-4-il]-4-(1H-1,2,3-triazol-1-il)-1H-pirazol-5-olat, bunun üretilmesine yönelik yöntem, bunun özellikle de kardiyovasküler ve hematolojik hastalıklar, böbrek hastalıkları olmak üzere hastalıkların tedavisine ve/veya profilaksisine yönelik kullanılması ve bunun hastalıkların tedavisine ve/veya profilaksisine yönelik ilaçlar üretilmesine ve yaraların iyileşmesini desteklemeye yönelik kullanılması ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME SÜBSTITÜE EDILMIS SODYUM-1H-PIRAZOL-5-OLAT pirazoI-5-olat, bunun üretilmesine yönelik yöntem, bunun özellikle de kardiyovasküler ve hematolojik hastaliklar, böbrek hastaliklari olmak üzere hastaliklarin tedavisine ve/veya profilaksisine yönelik kullanilmasi ve bunun hastaliklarin tedavisine ve/veya profilaksisine yönelik ilaçlar üretilmesine ve yaralarin iyilesmesini desteklemeye yönelik kullanilmasi ile ilgilidir. bilesigi (enol biçimi; formül (Ia)) veya 2-[6-(morfolin-4-iI)pirimidin-4-il]-4-(1H-1,2,3- bilinmektedir.

Formülün (I) bilesigi, HIF-proIiI-4-hidroksilaz inhibitörü etkisi göstermekte ve in vi'vo olarak bu spesifik etki mekanizmasi nedeni ile parenteral veya oral uygulama ardindan örnegin eritropoetin gibi HIF hedef genlerin ve bunun neden oldugu örnegin eritropoez gibi biyolojik süreçlerin indüklenmesine yol açmaktadir.

Formülün (I) bilesigi higroskopiktir ve olagan ortam kosullarinda (20-35°C. normal basinç) havadaki bagil nem oraninin %20 üzerinde olmasi halinde agirlikça %6'ya varan oranda su emmektedir. Havadaki bagil nemin %30 olmasi durumunda agirlikça bagil nemin %30 altinda azalmasi halinde içerdigi suyun bir kismini yeniden vermektedir. Bu sekilde suyun emilmesi veya verilmesi Örnegin tartim islemlerinde formülün (l) bilesiginin kullanilmasini ve ilaçlarda kullanima veya formülün (I) bilesigini içeren ilaçlarin üretiminde kullanima yönelik degismeyen, stabil ve tanimli bir biçimde üretilmesini zorlastirmaktadir. Bundan dolayi özellikle de örnegin tabletler, granüller veya içilebilir çözeltiler gibi formülün (I) bilesigini içeren uygulama biçimlerinin üretimindeki teknik maliyet artmaktadir, çünkü formülün (I) bilesiginin konsantrasyonunun degismemesi için havadaki nemin kontrolüne ve regülasyonuna yönelik önlemler alinmasi gerekmektedir.

Sasirtici bir sekilde formülün (I) bilesiginden formülün (I) bilesigine göre önemli avantajlara sahip olan bir sodyum tuzu üretilebilecegi bulunmustur.

Mevcut bulusun konusu, formülün (II) bilesigine göre sodyum-1-[6-(morfolin-4- il)pirimidin-4-iI]-4-(1H-1,2,3-triazoI-1-iI)-1H-pirazoI-5-olat bilesigidir Mevcut bulus çerçevesinde sodyum-1-[6-(morfolin-4-il)pirimidin-4-il]-4-(1H-1,2,3-triazol- 1-il)-1H-pirazoI-5-olat (formülün (II) bilesigi) kristalize biçimdedir.

Formülün (II) bilesiginin bulusa göre kullanilmasi sayesinde havadaki nemin degismesi halinde bilinen formülün (I) bilesigine kiyasla su emme veya verme bakimindan büyük ölçüde daha fazla stabilite saglanmaktadir. Sodyum-1-[6-(m0rfolin-4-iI)pirimidin-4-iI]-4- (1 H-1,2,3-triazoI-1-iI)-1 H-pirazol-5-olat (formülün (II) bilesigi) agirlikça %0,5'den daha az su içermektedir, higroskopik degildir ve olagan ortam kosullarinda (20-35°C, normal basinç) havadaki bagil nemin %90'a varan oranlara yükselmesi halinde dahi içerdigi su miktarini sadece minimum düzeyde, baska bir deyisle agirlikça % 0,5'ten daha az degistirmektedir. Formülün (II) bilesigi teknik olarak. baska bir deyisle tartim islemlerinde ve özellikle de örnegin granül, içilebilir çözelti veya tablet gibi bir uygulama biçiminde formülün (II) bilesiginin konsantrasyonunun degismemesini saglamak gerektiginde çok daha kolay kullanilabilmektedir. Ayrica formülün (I) bilesigine göre formülün (II) bilesiginin suda çözünürlügü daha yüksektir.

Bulusun bir diger konusu, bulusa göre formülün (II) bilesiginin üretilmesine yönelik, özelligi formülün (I) bilesiginin bir çözücü madde içinde sodyum hidroksit veya sulu sodyum hidroksit çözeltisi veya bir sodyum tuzu ile gerekiyorsa bir baz eklenerek reakte edilmesi olan bir yöntemdir.

Bulusa göre formülün (Il) bilesiginin üretilmesine yönelik, özelligi formülün (l) bilesiginin bir çözücü madde içinde sulu sodyum hidroksit çözeltisi ile gerekiyorsa bir baz eklenerek reakte edilmesi olan bir yöntem tercih edilmektedir.

Bulusa göre formülün (II) bilesiginin üretilmesine yönelik, özelligi formülün (l) bilesiginin bir çözücü madde içinde sulu sodyum hidroksit çözeltisi ile trietilamin eklenerek reakte edilmesi olan bir yöntem tercih edilmektedir.

Sodyum hidroksit veya sulu sodyum hidroksit çözeltisi veya bir sodyum tuzu ile reaksiyon genel olarak bir çözücü madde içinde, tercihen 20°C ila 120°C sicaklik araliginda, özellikle tercihen 40°C ila 70°C sicaklik araliginda normal basinçta gerçeklesmektedir. Formülün (ll) bilesigi -20°C ve 80°C arasinda bir sicaklikta, tercihen O°C ila 20°C sicaklikta, normal basinçta filtrasyon yolu ile elde edilen süspansiyondan izole edilmekte ve ardindan kurutulmaktadir.

Reaksiyonun bir baz eklenerek gerçeklesmesi halinde genel olarak formülün (l) bilesigi önce organik bir baz eklenerek 20°C ila 120°C sicaklikta, tercihen 40°C ila 70°C sicaklikta normal basinçta bir çözücü madde içinde çözülmekte ve ardindan formülün (II) bilesigi sodyum hidroksit veya sulu sodyum hidroksit çözeltisi veya bir sodyum tuzu eklenerek 20°C ila 120°C sicaklikta, tercihen 40°C ila 70°C sicaklikta normal basinçta çöktürülmektedir. Formülün (II) bilesigi -20°C ve 80°C arasinda bir sicaklikta, tercihen O°C ila 20°C sicaklikta, normal basinçta filtrasyon yolu ile elde edilen süspansiyondan izole edilmekte ve ardindan kurutulmaktadir.

Sodyum hidroksit ve sulu sodyum hidroksit çözeltisi ve sodyum tuzu, formülün (l) bilesigine göre 0,8 ila 2 mol esdeger mol oraninda kullanilmaktadir. Sodyum hidroksit ve sulu sodyum hidroksit çözeltisi ve sodyum tuzu, formülün (I) bilesigine göre tercihen 1,0 ila 1,4 mol esdeger mol oraninda kullanilmaktadir.

Sodyum tuzu olarak örnegin sodyum asetat veya sodyum sitrat olmak üzere sodyum karboksilatlar gibi organik asitlerin tuzlari veya örnegin sodyum karbonat, sodyum hidrojen karbonat, sodyum fosfat, sodyum hidrojen fosfat veya sodyum klorür gibi anorganik asitlerin tuzlari uygundur. Çözücü madde olarak örnegin metanol, etanol, n-propanol, izo-propanol, n-bütanol, sek-bütanol, izo-bütanol, 1-pentanol gibi düsük alkoller veya tetrahidrofuran veya asetonitril veya toluol veya 1,4-dioksan veya belirtilen çözücü maddelerin karisimlari veya belirtilen çözücü maddelerin su ile karisimlari uygundur. Metanol, etanol, 2- propanol, tetrahidrofuran veya belirtilen çözücü maddelerin su ile karisimlari tercih edilmektedir. Metanolün su ile veya etanolün su ile 1 : 1 ve 50 : 1 (v/v) arasinda bir oranda karisimlari özellikle tercih edilmekte, metanolün su ile 7 : 3 ve 30 : 1 (v/v) arasinda bir oranda karisimlari son derece tercih edilmektedir.

Organik bazlar olarak örnegin trietilamin veya diizopropiletilamin gibi tersiyer aminler uygundur. Trietilamin tercih edilmektedir. Organik baz formülün (I) bilesigine göre 0 ila 4 mol esdeger oranda kullanilmaktadir. Organik baz formülün (I) bilesigine göre tercihen 0,7 ila 1,5 mol esdeger oranda kullanilmaktadir.

Bulusa göre formülün (Il) bilesiginin üretimi asagidaki reaksiyon semasi ile gösterilebilmektedir: r` 'N .' ' ' " ` sodyum bid'at-.m HO ›. ` veya N 2' N suI-u sodyum 4 hidrohsii çanlmi .

J' sodyum tuzu N "4 N 1 ( I ] › N› . N .

Sekillerin açiklamalari: Sekil 1: Formülün (II) bilesigi ve formülün (I) bilesiginin IR spektrumlari Sekil 2: Formülün (II) bilesigi ve formülün (I) bilesiginin Raman spektrumlari Sekil 3: Formülün (Il) bilesigi ve formülün (I) bilesiginin UVNIS spektrumlari Sekil 4: Formülün (II) bilesiginin 1H-NMR spektrumu Sekil 5: Formülün (I) bilesiginin 1H-NMR spektrumu Sekil 6: Formülün (II) bilesiginin 13C-NMR spektrumu Sekil 7: Formülün (l) bilesiginin 13C-NMR spektrumu Sekil 8: Formülün (II) bilesiginin kütle spektrumu Sekil 9: Formülün (l) bilesiginin kütle spektrumu Sekil 10: Formülün (II) bilesiginin X isini kirinim görüntüsü Sekil 11: X isini kirinim görüntüsü formülün (I) bilesigi Formülün (II) bulusa göre bilesigi, ön görülemeyen, degerli bir farmakolojik etki spektrumu göstermektedir. Bu nedenle insanlarda ve hayvanlardaki hastaliklarin tedavisine ve/veya profilaksisine yönelik ilaç olarak kullanima uygundur.

Formülün (II) bulusa göre bilesigi, spesifik HIF-ProIiI-4-hidr0ksilaz inhibitörü özelligine sahiptir.

Formülün (II) bulusa göre bilesigi, farmakolojik özelliklerinden dolayi özellikle kalp yetmezligi, koroner kalp hastaligi, angina pektoris, miyokard enfarktüsü, inrne, arteroskleroz, esansiyel, pulmoner ve malign hipertansiyon ve periferik arter tikanikligi hastaligi olmak üzere kardiyovasküler hastaliklarin tedavisine ve/veya profilaksisine yönelik olarak kullanilabilmektedir.

Formülün (II) bulusa göre bilesigi ayrica örnegin idyopatik anemiler, renal anemi ve bir tümör hastaligi esliginde görülen anemiler (özellikle de kemoterapinin tetikledigi anemi) gibi kan üretimi bozukluklari, enfeksiyon (özellikle de HIV enfeksiyonu) veya örnegin romatoid artrit gibi baska bir iltihapli hastaligin tedavisine ve/veya profilaksisine uygundur. Formülün (II) bulusa göre bilesigi bundan baska kan kaybina bagli anemilerin, demir eksikligine bagli aneminin, vitamin eksikligine bagli aneminin (örnegin B12 vitamini eksikligi sonucu veya folik asit eksikligi sonucu), hipoplastik ve aplastik aneminin, hemolitik aneminin destekleyici tedavisine veya demir kullanimi bozukluklarina bagli anemilerin (sidero-arkestik anemi) veya diger endokrinal bozukluklara (örnegin tiroit yetmezligi) bagli anemilerin destekleyici tedavisine uygundur.

Formülün (II) bulusa göre bilesigi ayrica operasyonlardan önce otologöz kan bagisina yönelik kan elde etme amaci ile hematokritin artirilmasina da uygundur.

Formülün (II) bulusa göre bilesigi ayrica operasyona bagli iskemi durumlarinin ve bunlarin özellikle de kalp ve akciger makinesi kullanilan kalp müdahaleleri (örnegin baypas operasyonlari, kalp kapakçigi implantlari), sah damarlarina yapilan müdahaleler, vücut arterine yapilan müdahaleler (aort'a) ve kafatasinin üst bölümünü aletle açilan veya içine girilen müdahaleler olmak üzere cerrahi müdahaleler sonraki sonuçlarinin tedavisine ve/veya profilaksisine yönelik olarak da kullanilabilmektedir.

Formülün (II) bulusa göre bilesigi, ayrica yaranin iyilesmesini hizlandirma ve konvalesans süresini kisaltma amaci ile cerrahi müdahalelerde genel tedavi ve/veya profilaksiye de uygundur.

Formülün (II) bulusa göre bilesigi, beyindeki akut ve uzun süreli iskemi durumlarinin sonuçlarinin tedavisine ve profilaksisine de uygundur (örnegin inme, dogum asfiksisi).

Formülün (II) bulusa göre bilesigi ayrica kanser tedavisine ve/veya profilaksisine ve özellikle de sitostatikler, antibiyotikler ve isin ile tedavi sonrasinda olmak üzere kanser tedavisi sirasinda saglik durumunda ortaya çikan olumsuz etkilerin tedavisine ve/veya profilaksisine yönelik olarak kullanilabilmektedir.

Formülün (II) bulusa göre bilesigi ayrica romatizmal spektrum bozuklugu hastaliklarinin ve otoimmün hastaliklari arasinda kabul edilen diger hastalik biçimlerinin tedavisine ve/veya profilaksisine ve özellikle de böyle bir hastaligin ilaçla tedavisi sirasinda saglik durumunda ortaya çikan olumsuz etkilerin tedavisine ve/veya profilaksisine uygundur.

Bundan baska formülün (II) bulusa göre bilesigi göz hastaliklarinin (örnegin glokom), beyin hastaliklarinin (örnegin Parkinson hastaligi, Alzheimer hastaligi, demans, kronik agri hissi), kronik böbrek hastaliklarinin, böbrek yetmezliginin ve akut böbrek yetmezliginin tedavisine ve/veya profilaksisine ve yaralarin iyilesmesini desteklemeye yönelik kullanilabilmektedir.

Formülün (II) bulusa göre bilesigi ayrica özellikle de ileri yaslarda sik görülen genel bedensel zayifligin ve kaseksinin tedavisine ve/veya profilaksisine uygundur.

Formülün (II) bulusa göre bilesigi bundan baska cinsel islev bozuklugu tedavisine ve/veya profilaksisine uygundur.

Formülün (II) bulusa göre bilesigi ayrica diabetes mellitus ve bunun örnegin diyabetik makro ve mikro anjiyopati, diyabetik nefropati ve nöropati gibi sonuçlarinin tedavisine ve/veya profilaksisine uygundur.

Formülün (II) bulusa göre bilesigi ayrica örnegin kalp, akciger ve karaciger fibrotik hastaliklarinin tedavisine ve/veya profilaksisine uygundur.

Formülün (Il) bulusa göre bilesigi özellikle de erken dogan retinopatisinin (retinopathia praematurorum) profilaksisine ve tedavisine uygundur.

Mevcut bulusun bir diger konusu, formülün (II) bulusa göre bilesiginin özellikle de yukarida belirtilen hastaliklar olmak üzere hastaliklarin tedavisine ve/veya önlenmesine yönelik olarak kullanilmasidir.

Mevcut bulusun bir diger konusu, formülün (II) bulusa göre bilesiginin özellikle de yukarida belirtilen hastaliklar olmak üzere hastaliklarin tedavisine ve/veya önlenmesine yönelik bir ilaç üretmeye yönelik olarak kullanilmasidir.

Mevcut bulusun bir diger konusu, formülün (II) bulusa göre bilesiginin etkin bir miktari kullanilarak özellikle de yukarida belirtilen hastaliklar olmak üzere hastaliklarin tedavisine ve/veya önlenmesine yönelik bir yöntemdir.

Formülün (II) bulusa göre bilesigi tek basina veya ihtiyaç halinde baska aktif bilesenler ile kombine edilerek kullanilabilmektedir. Mevcut bulusun bir diger konusu, özellikle yukarida belirtilen hastaliklarin tedavisine ve/veya önlenmesine yönelik, formülün (II) bulusa göre bilesigi ve bir veya daha fazla aktif bilesen içeren ilaçlardir. Kombine etmeye uygun aktif bilesenler için örnek olarak ve tercihen asagidakiler sayilabilir: ACE inhibitörleri, anjiyotensin II reseptörü antagonistleri, Beta reseptörü blokerleri. kalsiyum antagonistleri, PDE inhibitörleri, mineralokortikoid reseptörü antagonistleri, diüretikler, Aspirin, demir takviyeleri, 812 vitamini ve folik asit takviyeleri, statinler, dijitalis (digoksin) türevleri, tümör kemoterapötikleri ve antibiyotikler.

Bulusun tercih edilen bir düzenlemesinde formülün (Il) bulusa göre bilesigi, örnek olarak ve tercihen enalapril, kaptopril, Iizinopril, ramipril, delapril, fozinopril, kinopril, perindopril veya trandopril olmak üzere bir ACE inhibitörü ile kombine edilerek uygulanir.

Bulusun tercih edilen bir düzenlemesinde formülün (II) bulusa göre bilesigi, örnek olarak ve tercihen Iosartan, kandesartan, valsartan, telmisartan veya embusartan ile olmak üzere bir anjiyotensin AII antagonisti ile kombine edilerek uygulanir.

Bulusun tercih edilen bir düzenlemesinde formülün (Il) bulusa göre bilesigi, örnek olarak ve tercihen propranolol, atenolol, timolol, pindolol, alprenolol, oksprenolol, penbütolol, bupranolol, metipranolol, nadolol, mepindolol, karazalol, sotalol, metoprolol, betaksolol, seliprolol, bizoprolol, karteolol, esmolol, labetalol, karvedilol, adaprolol, kombine edilerek uygulanir.

Bulusun tercih edilen bir düzenlemesinde formülün (II) bulusa göre bilesigi, örnek olarak ve tercihen nifedipin, amlodipin, verapamil veya diltiazem olmak üzere bir kalsiyum antagonisti ile kombine edilerek uygulanir.

Bulusun tercih edilen bir düzenlemesinde formülün (II) bulusa göre bilesigi, örnek olarak ve tercihen milrinon, amrinon, pimobendan, silostazol, sildenafil, vardenafil veya tadalafil olmak üzere bir fosfodiesteraz (PDE) inhibitörü ile kombine edilerek uygulanir.

Bulusun tercih edilen bir düzenlemesinde formülün (II) bulusa göre bilesigi, örnek olarak ve tercihen spironolakton, eplerenon, kanrenon veya potasyum kanrenoat olmak üzere bir mineralokortikoid reseptörü antagonisti ile kombine edilerek uygulanir.

Bulusun tercih edilen bir düzenlemesinde formülün (Il) bulusa göre bilesigi, örnek olarak ve tercihen furosemid, bümetanid, torsemid, bendroflumetiazid, klortiazid, hidroklortiazid, hidroflumetiazid, metiklotiazid, politiazid, triklormetiazid, klortalidon, indapamid, metolazon, kinetazon, asetazolamid, diklorfenamid, metazolamid, gliserin, izosorbid, mannitol, amilorid veya triamteren olmak üzere bir diüretik ile kombine edilerek uygulanir.

Bulusun tercih edilen bir düzenlemesinde formülün (Il) bulusa göre bilesigi, örnek olarak ve tercihen Iovastatin, simvastatin, pravastatin, fluvastatin, atorvastatin, rosuvastatin, serivastatin veya pitavastatin olmak üzere statinler sinifindan bir HMG- CoA redüktaz inhibitörü ile kombine edilerek uygulanir.

Bulusun tercih edilen bir düzenlemesinde formülün (II) bulusa göre bilesigi, örnek olarak ve tercihen sisplatin ve karboplatin gibi platin kompleksleri, örnegin siklofosfamid ve klorambusil gibi alkilantiler, örnegin 5-fl0rürasil ve metotreksat gibi anitmetabolitler, örnegin etoposid ve kaptotesin gibi topoizomeraz inhibitörleri, örnegin doksorubisin ve daunorubisin gibi antibiyotikler veya örnegin sorafenib ve sunitinib gibi kinaz inhibitörleri sinifindan olmak üzere bir tümör kematerapötigi ile kombine edilerek uygulanir.

Bulusun tercih edilen bir düzenlemesinde formülün (Il) bulusa göre bilesigi, örnek olarak ve tercihen örnegin siprofloksasin ve moksifloksasin gibi penisilin, sefalosporin veya kinolon grubundan bir antibiyotik ile kombine edilerek uygulanir.

Mevcut bulusun bir diger konusu, genellikle bir veya birden fazla inert, toksik olmayan, farmasötik olarak uygun bir yardimci madde ile birlikte formülün (II) bulusa göre bilesigini içeren ilaçlar ve bunlarin yukarida belirtilen amaçlara yönelik kullanimidir.

Formülün (II) bulusa göre bilesigi sistemik ve/veya lokal etki gösterebilir. Bu amaçla örnegin oral, parenteral, pulmonal, nazal, sublingual, Iingual, bukkal, rektal, dermal, transdermal, konjunktival, otik veya implant veya stent olarak olmak üzere uygun sekilde uygulanabilir.

Bu uygulama yollari için formülün (Il) bulusa göre bilesigi uygun uygulama biçimlerinde uygulanabilir.

Oral uygulamaya yönelik olarak örnegin tabletler (kaplamasiz veya kaplamali tabletler, örnegin mide sivisina dirençli veya gecikmeli çözünen veya çözünmeyen, bulusa göre bilesigin serbest kalmasini kontrol eden kaplamalar), agiz boslugunda hizli bir sekilde parçalanan tabletler veya filmler/kaseler, filmler/Iiyofilizatlar, kapsüller (örnegin sert veya yumusak jelatin kapsüller), drajeler, granüller, peletler, tozlar, emülsiyonlar, süspansiyonlar, aerosoller veya çözeltiler gibi önceki teknige göre çalisan ve formülün (Il) bulusa göre bilesigini hizli ve/veya modifiye bir sekilde birakan uygulama biçimleri uygundur.

Parenteral uygulama, rezorpsiyon adimi atlanarak (örnegin intravenöz, intraarteriyel, intrakardiyal, intraspinal veya intralumbal) veya rezorpsiyon devreye sokularak (örnegin intramüsküler, subkutan, intrakutan, perkutan veya intraperitoneal) gerçeklesebilir.

Parenteral uygulama için çözeltiler, süspansiyonlar, emülsiyonlar, Iiyofilizatlar veya steril tozlar biçiminde enjeksiyon ve infüzyon preparatlari da uygundur.

Diger uygulama yollari için örnegin inhalan ilaç biçimleri (aralarinda toz solunum cihazlari, nebülizörler bulunur), burun damlalari, çözeltileri veya spreyieri, Iingual, sublingual veya bukkal uygulanan tabletler, filmler/kaseler veya kapsüller, supozituarlar, kulak veya göz preparatlari. vajinal kapsüller, sulu süspansiyonlar (losyonlar, sallama karisimlari), lipofil süspansiyonlar, merhemler, kremler, transdermal terapötik sistemler (örnegin yara bandi), süt, macunlar, köpükler, pudralar, implantlar veya stentler uygundur. Özellikle oral ve intravenöz uygulama olmak üzere oral veya parenteral uygulama tercih edilir.

Formülün (II) bulusa göre bilesigi belirtilen uygulama biçimlerinde sevk edilebilir. Bu bilinen sekilde inert, toksik olmayan, farmasötik olarak uygun yardimci maddeler ile karistirma yolu ile gerçeklestirilebilir. Bu yardimci maddeler arasinda substratlar (örnegin mikro kristalize selüloz, Iaktoz, mannitol), çözücü madde (örnegin sivi polietilenglikol), emülgatörler ve dispersiyon maddeleri veya sürfaktanlar (örnegin sodyum dodesilsulfat, polioksizorbitanoleat), baglayicilar (örnegin polivinilpirolidon), sentetik ve dogal polimerler (örnegin albümin), stabilizatörler (örnegin askorbik asit gibi antioksidanlar), renklendiriciler (örnegin demir oksitler gibi anorganik pigmentler) ve lezzet ve/veya koku degistiriciler bulunur.

Genel olarak parenteral uygulamada etkili sonuçlarin elde edilmesi için her bir vücut uygulamanin avantajli oldugu görülmüstür. Oral uygulamada dozaj her bir vücut agirligi tercihen yaklasik 0,1 ila 10 mg/kg'dir.

Buna ragmen bazi durumlarda belirtilen miktarlari ve vücut agirligina, uygulama yoluna ve bireyin aktif bilesene karsi davranisina bagli olarak preparatin türünü, uygulamanin gerçeklestirilecegi zamani veya zaman araligini degistirmek gerekebilir. Örnegin bazi vakalarda yukarida belirtilen minimum miktarlardan daha azi yeterli olabilirken, baska vakalarda belirtilen üst sinirin asilmasi gerekebilir. Büyük miktarlarda uygulama yapilmasi halinde bunun birçok münferit uygulama halinde gün boyunca dagitilmasi önerilir.

Asagidaki düzenleme örnekleri bulusu açiklamaktadir. Bulus, örneklerle sinirli degildir.

Asagidaki testlerde ve örneklerde verilen yüzdelik bilgiler aksi belirtilmedigi sürece agirlikça yüzdeler; birimler birim agirliktir. Sivi/sivi çözeltilerinin çözücü madde oranlari, inceltme oranlari ve konsantrasyon bilgileri hacme göredir.

A. Örnekler Kisaltmalar: ACN Asetonitril bS Genis tekli (NMR spektrumlarinda) D Ikili (NMR spektrumlarinda) DSC Dinamik diferansiyel kalorimetri (Differential Scanning Calorimetry) Gew% Agirlikça yüzde M Çoklu (NMR spektrumlarinda) n.d. saptanmadi NMR Nükleer manyetik rezonans (nuclear magnetic resonance) rF bagil nem S Tekli (NMR spektrumlarinda) sec Saniye T Üçlü (NMR spektrumlarinda) v/v Hacim/hacim ö Deformasyon titresimleri v Gerilme titresimleri Baslangiç bilesikleri: örnek 1A 2-(1H-1,2,3-Triazol-1-il)akrilik asit metil ester trietilamin eklenir ve 16 saat 22°C'de karistirilir. Ardindan vakumda tüm çözücü maddeler destile edilerek giderilir. Yag olarak 410 g basliktaki bilesik elde edilir. 3-(dimetilamino)-2-(1H-1,2,3-triazol-1-il)akrilik asit metil ester asetal eklenir ve isitilarak kaynama noktasina getirilir. Ortaya çikan düsük sicaklikta kaynayan fraksiyonlar destile edilerek giderilir. 4 saat sonra sogutularak 55°C'ye getirilir ve 1050 ml metiI-tert-bütileter/Z-propanol (3 : 1 v/v) eklenir. Elde edilen süspansiyon sogutularak 22°C'ye getirilir ve filtrelenir. Filtre keki birkaç kez metil-tert-bütileter ile yikanir ve vakumda 40°C'de kurutulur. Kati olarak 493 g basliktaki bilesik elde edilir. Örnek 3A 1,2-dihidro-3H-pirazol-3-on (keto biçimi; formül (Ib)) triazoI-1-il)akrilik asit metil estere 210 ml etil asetat içinde 5,84 9 trifloro asetik asit eklenir ve 24 saat geri akimda karistirilir. Elde edilen süspansiyon sogutularak 0°C'ye getirilir ve filtrelenir. Filtre keki etil asetat ile yikanir, etkili bir sekilde emilerek temizlenir ve ardindan 160 ml su içinde süspanse edilir. Süspansiyona 4,5 ml asetik asit eklenerek pH 5 olarak ayarlanir, 15 dakika daha karistirilir ve filtrelenir. Filtre keki iki kez 50 ml su ile yikanir ve ardindan vakumda 40°C'de kurutulur. Kazanim: 26,0 9 (teorik degerin %79,4'ü) basliktaki bilesik. etil ester (örnek no. 39A) ve 3-(dimetilamino)-2-(1H-1,2,3-triazoI-1-il)akrilik asit etil ester (örnek no. 71).

Düzenleme örnekleri: (formülün (II) bilesigi) Örnek 3A'daki bilesikten 10 g 50 ml metanol/su (9 : 1 v/v) içinde süspanse edilir.

Süspansiyona karistirilarak 3,4 9 %45'Iik sodyum hidroksit çözeltisi katilir ve 50 ml daha metanoI/su (9 : 1 v/v) eklenir. Süspansiyon isitilarak 50°C'ye getirilir ve 2 saat 50°C'de karistirilir. Ardindan sogutularak 0°C'ye getirilir, 1 saat 0°C'de yeniden karistirilir ve filtrelenir. Elde edilen filtre keki metanoI/su (9 : 1 v/v) ile yikanir ve kurutulur. Kazanim: 10,1 9 formülün (II) bilesigi; agirlikça %6,8 Na Örnek 3A'daki bilesikten 5 g 60 ml etanol/su (1 : 1 v/v) içinde süspanse edilir ve ve 2 saat 20°C'de karistirilir. Kati madde filtrelenerek alinir, 10 ml su ile yikanir ve kurutulur. Kazanim: 4 g formülün (Il) bilesigi. edilir. 13,3 ml trietilamin eklenir ve karisim isitilarak 60°C'ye getirilir. 15 dakika sonra elde edilen neredeyse berrak çözelti filtrelenir. filtre 10 ml metanoI/su (9 : 1 v/v) ile yikanir ve toplanan filtrata 60°C'de yavasça 10,3 9 %45'Iik sodyum hidroksit çözeltisi eklenir. Elde edilen süspansiyona formülün (Il) bilesiginin birkaç kristali eklenir, 1 saat 60°C yeniden karistirilir. ardindan yavasça sogutularak 0°C`ye getirilir ve filtrelenir.

Filtre keki 15 ml metanol/su (9 : 1 v/v) ile yikanir ve vakumda 40°C'de kurutulur.

Kazanim: 25,1 9 formülün (II) bilesigi. ml trietilamin eklenir. Elde edilen çözelti isitilarak 60°C'ye getirilir ve mit 8,5 9 %45'Iik sodyum hidroksit çözeltisi eklenir. Elde edilen süspansiyon yavasça sogutularak 22°C'ye getirilir, 2 saat 22°C'de ve ardindan 1 saat 0-5°C`de karistirilir. Filtrelemenin ardindan filtre keki 15 ml metanoI/su (1 : 1 v/v) ile yikanir ve vakumda 40°C'de kurutulur. Kazanim: 26 g formülün (II) bilesigi.

Dinamik diferansiyel kalorimetri (DSC): Termogramlar, Perkin-Elmer firmasinin bir DSC 7 veya Pyris-1 Differential Scanning Calorimeter ve TGA 7 Thermogravimetric Analyser cihazlari kullanilarak elde edilmistir.

DSC 7 veya Pyris-1 Differential Scanning Calon'meier; Üretici: Perkin-Elmer; Isitma hizi: 2 ve 20 K/dakika: Püskürtme gazi: nitrojeri; Kroze: gaz sizdirmaz olmayan alüminyum kroze; Numune ön hazirligi: yok.

TGA 7 Thermogravimetric Analyzer; Üretici: Perkin-Elmer; Isitma hizi: 10 Kdakika'1; Püskürtme gazi: nitrojen, 20-30 mI/dakika; Kroze: açik platin kroze; Numune ön hazirligi: yok. (formülün (II) bilesigi), 300°C üzerinde erimeden bozunur.

Su buhari adsorpsiyonu ve su buhari desorpsiyonu: Nem emme izotermi, Hiden Analytical firmasinin bir IGA Sorp Dynamic Vapour Sorption Analyzer cihazi ile kaydedilmistir. Ölçüm sicakligi 25°C'dir. Numune ön hazirligi yoktur. olat (formülün (II) bilesigi) su buhari adsorpsiyonu ve su buhari desorpsiyonu Formülün (II) bilesigi Formülün (I) bilesigi Göreceli Adsorpsiyon Desorpsiyon Adsorpsiyon Desorpsiyon bagil nem %10 %0 %0 %0,2 %0,1 Formülün (II) bilesigi Formülün (l) bilesigi Göreceli Adsorpsiyon Desorpsiyon Adsorpsiyon Desorpsiyon Çözünürlük verileri: Metot: Test edilen maddenin doymus çözeltileri süspansiyonun 25°C'de su içinde 16 saat karistirilmasi ile üretilmistir. Elde edilen süspansiyonlar ardindan filtrelenmis ve HPLC ölçümü yardimi ile filtrat içerigi tayin edilmistir.

Tablo 2: Su içinde çözünürlükler Formülün (ll) bilesigi Formülün (l) bilesigi Formülün (II) bilesiginin IR ve Raman spektrumlarinin ölçülmesine yönelik olarak asagidaki parametreler ile Bruker IFS 66V FT/IR spektrometre ve Bruker MultiRAM FT/Raman spektrometre kullanilmistir: Spektral çözünürlük 2 cm'1 2 cm'1 Münferit ölçüm (tarama) sayisi 32 64 Numune ön hazirligi KBr pres ürün yok Tablo 3: Formülün (II) bilesigine ait IR veya Raman spektrumlarinda karakteristik titresim bantlarinin siniflandirilmasi Yapi elemani lR bant konumu (cm4) 6 :C'H es fazli 987 - 1439 Raman bant konumu (cm1) 3153 - 3010 2978 - 2856 1623 - 1401 Formülün (I) bilesiginin IR ve Raman spektrumlarinin ölçülmesine yönelik olarak asagidaki parametreler ile Bruker Vertex 80V FT/IR spektrometre ve Bruker MultiRAM FT/Raman spektrometre kullanilmistir: Spektral çözünürlük 2 cm'1 2 cm'1 Münferit ölçüm (tarama) sayisi 32 64 Numune ön hazirligi KBr pres ürün yok Tablo 4: Formülün (I) bilesigine ait IR veya Raman spektrumlarinda karakteristik titresim bantlarinin siniflandirilmasi Yapi elemani V C'Oeter 3135 - 3108 2965 - 2884 1636 - 1345 Raman bant konumu (cm1) 3134 - 3006 2967 - 2884 1650 - 1345 UVIVIS spektroskopi: UV/VIS spektrumlari, asagidaki kosullar veya parametreler ile bir Perkin Elmer spektrometrede (Lambda 4OP) ölçülmüstür: Banyo teknesi: Geçis uzunlugu 1om; kuvars cam Dalga sayisi araligi: 200 - 800 nm Açiklik araligi: 1 nm Numune ön hazirligi: Yaklasik 1 mg/100ml asetonitriI/su 1:1 Tablo 5: Spesifik absorpsiyonun ve molar absorpsiyon katsayisinin hesaplanmasi Formülün Çözücü Dalga Spesifik absorpsiyon Molar absorpsiyon bilesigi madde boyu A°/°11cm(litre/g*cm) katsayisi s (litre/mol * NMR spektroskopi: NMR spektrumlari, asagidaki kosullar ve parametreler ile bir Bruker NMR spektrometrede (Advance) kaydedilmistir: Formülün (Il) bilesigi 1H-NMR spektrumu 13C-NMR spektrumu Çözücü madde Trifloro asetik asit Trifloro asetik asit Konsantrasyon 6,84 mg/ml 42,7 mg/ml Dahili standart Tetrametilsilan (TMS) Tetrametilsilan (TMS) Numune borusu çapi 5 mm 5 mm Formülün (ll) bilesigi Sicaklik Spektral genislik Dijital çözünürlük Darbe süresi Kayit süresi Relaksasyon zamani Serbest indüksiyon bozunma Formülün (I) bilesigi Çalisma frekansi Çözücü madde Konsantrasyon Dahili standart Numune borusu çapi Sicaklik Spektral genislik Dijital çözünürlük Darbe süresi Kayit süresi Relaksasyon zamani 1H-NMR spektrumu Fourier dönüsümü teknigi ,65 ppm 2,83 usaniye, 30° sapma 6,399 saniye 0,5 saniye 1H-NMR spektrumu 500,13 MHz Dimelhil sü Ifoksit-de 6,3 mg/ml Tetrametilsilan (TMS) Fourier dönüsümü teknigi ,65 ppm 3,1 usaniye, 30° sapma 6,344 saniye 0,5 saniye 13C-N MR spektrumu Fourier dönüsümü teknigi 245,41 ppm 0,4710 Hz/Pt 9,1 usaniye, 90° sapma 1,06 saniye 4 saniye 13C-NMR spektrumu 125,76 MHz Dimetil sülfoksit-ds ,8 mg/ml Tetrametilsilan (TMS) Fourier dönüsümü teknigi 240,89 ppm 0,9248 Hz/Pt 7,0 usaniye, 90° sapma 1,08 saniye 4 saniye Formülün (l) bilesigi 1H-NMR spektrumu 13C-NMR spektrumu Serbest indüksiyon bozunma 32 1024 Ilgili NMR sinyalleri siniflandirmasi ile formülün (ll) bilesigi ve formülün (I) bilesiginin yapisal formülleri ` O 1 5. O 2 tbN `L4N'i 4`N Niluê 3 N; l \ N; 3 Tablo 6: Formülün (II) bilesiginin 1H-NMR spektrumu - Kimyasal kayma, sinyal çoklugu, bagil proton sayisi (H atomlarinin numarasi, ilgili NMR sinyallerinin siniflandirilmasina yönelik yapisal formüllere göredir) H atomlari Kimyasal kayma ö Çokluk ve eslesme Molekül basina proton (ppm) sabitleri sayisi Sodyum-1-[6-(morfolin-4-il) pirimidin-4-il]- H-2 8,72 8 1 H-5 7.77 8 1 H atomlari Kimyasal kayma ö Çokluk ve eslesme Molekül basina proton (ppm) sabitleri sayisi 4-(1H-1,2,3-triazol- 1-ii)- 8.64 DJ= 1.4 Hz 1 H-4 8.98 DJ= 1.4 Hz 1 1H-pirazoI-5-0Iat H-3 8.68 8 1 Tablo 7: Formülün (I) bilesiginin 1H-NMR spektrumu - Kimyasal kayma, sinyal çoklugu, bagil proton sayisi (H atomlarinin numarasi, ilgili NMR sinyallerinin siniflandirilmasina yönelik yapisal formüllere göredir) Hatomlari Kimyasal kayma ö Çokluk ve eslesme Molekül basina proton (ppm) sabitleri sayisi 1-[6-(morfolin-4-il) H-2; H-3; H-5; 3.71 8 8 pirimidin-4-il]- H-2 8,55 8 1 H-5 7,42 8 1 4-(1H-1,2,3-triazoI-1-il)- H-4 7.86 D(O.6Hz) 1 H-5 8:38 D(0.6Hz) 1 1H-pirazoI-5-0I H atomlari Kimyasal kayma ö Çokluk ve eslesme Molekül basina proton (ppm) sabitleri sayisi H-3 08:27 T 1 -OH n.d.(c) n.d. 1 Tablo 8: Formülün (ll) bilesiginin 13C-NMR spektrumu - Kimyasal kayma, sinyal çoklugu, formülün (II) bilesigindeki bagil C çekirdek sayisi (C atomlarinin numarasi, ilgili NMR sinyallerinin siniflandirilmasina yönelik yapisal formüllere göredir) Kimyasal kayma ö Çokluk ve eslesme Molekül basina C çekirdek (ppm) sabitleri sayisi Sodyum-1-[6-(morfolin-4-il) C-2; 0- 67.80 T 2 0-3; C- 48.21 T 2 pirimidin-4-il]- 0-2 151.65 D 1 0-4 152.01 8 1 C-5 91.48 D 1 C-6 159.90 8 1 4-(1H-1,2,3-triazoI-1-il)- 130.93 D 1 129.57 D 1 1H-pirazol-5-0Iat C Kimyasal kayma atomu (ppm) C-3 138.03 C-4 106.99 C-5 157.43 6 Çokluk ve sabitleri eslesme Molekül basina C çekirdek Tablo 9: Formülün (l) bilesiginin 13C-NMR spektrumu - Kimyasal kayma, sinyal çoklugu, formülün (I) bilesigindeki bagil C çekirdek sayisi (C atomlarinin numarasi, ilgili NMR sinyallerinin siniflandirilmasina yönelik yapisal formüllere göredir) Catomu Kimyasal kayma ö Çokluk ve eslesme Molekül basina C 1-[6-(m0rfolin-4-il C-2; C-6 65.56 0-3, 0-5 44.29 pirimidin-4-il]- C-2 154.08 0-4 152.43 05 85.62 C-6 161 .99 4-(1H-1,2,3- triazoI-1-il)- 0-4 132.94 0-5 123.68 1H-pirazoI-5-0I sa bitleri çekirdek sayisi Catomu Kimyasal kayma ö Çokluk ve eslesme Molekül basina C (ppm) sabitleri çekirdek sayisi 0-3 135.84 D 1 0-4 102.82 8 1 0-5 154.70 8 1 Kütle spektroskopisi: Kütle spektrumu, asagida belirtilen kosullar veya parametreler ile bir Waters kütle spektrometrede (ZQ) kaydedilmistir: Iyonizasyon metodu ESI (Electronic Spray Ionization) Çözücü madde AsetonitriI/su Tablo 10: Formülün (Il) bilesigine ait kütle spektrumunun yorumlanmasi Kütle numarasi (MZ) Tablo 11: Formülün (I) bilesigine ait kütle spektrumunun yorumlanmasi Kütle numarasi (MZ) Elementer analiz: Tablo 12: Formülün (Il) bilesigine ait elementer analizin sonuçlari Element Ölçülen (%) Hesaplanan (%) Fark (%) Element Ölçülen (%) Hesaplanan (%) Fark (%) C 46.1 46.4 0.3 H 4.0 3.9 0.1 N 33.1 33.3 0.2 Tablo 13: Formülün (I) bilesigine ait elementer analizin sonuçlari Element Ölçülen (%) Hesaplanan (%) Fark (%) C 49.5 49.7 0.2 H 4.4 4.5 0.1 N 35.5 35.7 0.2 0 12.6 10.2 2.4 X isini kirinim ölçümü: PIXceI sayaç bulunan PANalyticaI X'Pert PRO aktarim kirinim ölçer (çok kanalli): Birincil monokromatör: Odaklayan X isini aynasi Dalga boyu (K1): 1,5406 Ä Dalga boyu (K2): 1,5444 Ä Jeneratör parametreleri: 40 W, 40 mA Ölçüm araligi: 2-38° Ortam kosullari: 25°C, bagil nem %40 - 60 STOE toz kirinim sistemi: Kirinim ölçer: Transmisyon Monokromatör: Egri Germanyum (111) Jeneratör: 45 kV, 35 mA Dalga boyu: 1.540598 Cu Detektör: Lineer PSD Tarama Modu: Transmisyon/Hareketli PSD/Sabit omega Tarama Tipi: 2Teta:Omega Ortam kosullari: 25°C, bagil nem %40 - 60 Tablo 14: Formülün (ll) bilesiginin toz X isini kirinim ölçümü Formülün (Il) bilesigi Yansimalar [2 Teta] ,7 23,6 11,5 25,3 13,2 26,4 13,7 26,9 ,8 27,7 16,4 27,7 18,4 29,4 18,9 29,9 19,3 30,0 21,0 30,7 22,0 31,5 23,1 31,6 Tablo 15: Formülün (l) bilesiginin toz X isini kirinim ölçümü Formülün (I) bilesigi Yansimalar [2 Teta] ,6 24,6 Formülün (l) bilesigi Yansimalar [2 Teta] 14,4 24,8 14,9 25,1 16,3 26,3 16,5 26,8 17,6 28 17,8 28,5 18,2 29 18,5 29,9 19 32,4 19,7 32,7 21,6 33,2 22 33,8 22,4 34,7 22,9 35,7 24 36,4 24,5 36,7 B. Farmakolojik etkinligin degerlendirmesi Bulusa göre bilesiklerin farmakolojik özellikleri asagidaki tayinlerde gösterilebilir: Kisaltmalar: DMEM Dulbecco Modifiye Eagle Ortami FCS Fötal Sigir Serumu TMB 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin Tris Tris(hidroksimetil)-aminometan 1. HIF prolil-4-hidroksilaz inhibitörlerinin etkinliginin ve seçiciliginin tavinine yonelik in vitro testler 1.a) HIF prolilhidroksilaz etkinliginin inhibe edilmesi: Hidroksile edilmis HIF, spesifik olarak von HippeI-Lindau Protein-Elongin B-Elongin C kompleksine (VBC kompleksine) baglanir. Bu etkilesim, yalnizca HIF'in konserve bir prolil radikaline hidroksile edilmis olmasi halinde ortaya çikar. HIF prolilhidroksilaz etkinliginin biyokimyasal tayininin temelini teskil eder. Test tarif edildigi gibi yürütülür 74-80 (2004)]: Seffaf, NeutrAvidin HBC kaplamali, 96 delikli bir mikro titrasyon plakasi (Pierce firmasi) dakika bloker kazein ile enkübe edilir. Ardindan plaka üç kez delik basina 200'er pl yikama tamponu (50 mM Tris, pH 7.5, bloker kazein, %0,05 (v/v) Tween 20) ile yikanir. Biotin-DLDLEMLAPYIPMDDDFQL peptidi (Eurogentec eklenir. Bu Peptid, polilhidroksilasyon için substrat görevi görür ve mikro titrasyon plakasina baglanir. 60 dakika enkübasyonun ardindan plaka üç kez yikama tamponu ile yikanir, 30 dakika 1 mM biotin ile bloker kazein Içinde enkübe edilir ve daha sonra yeniden üç kez yikama tamponu ile yikanir.

Prolilhidroksilaz reaksiyonun gerçeklestirilmesi amaci ile plakaya baglanan peptid substrati 1 ila 60 dakika Prolilhidroksilaz içeren bir hücre Iizati ile enkübe edilir. pM-1 mM 2-0ksoglutarat, 10 uM FeSO4, 2 mM askorbat) içinde oda sicakliginda gerçeklesir. Reaksiyon karisimi ayrica farkli konsantrasyonlarda test edilecek prolilhidroksilaz inhibitörü içerir. Test edilen madde sadece bununla sinirli olmamak üzere tercihen 1 nM ve 100 pM arasinda konsantrasyonlarda kullanilir. Plakanin yikama tamponu ile üç kez yikanmasi ile reaksiyon durdurulur.

Prolilhidroksilasyonun miktar tayini amaci ile hem E. coli menseli tiyoredoksin hem de VBC kompleksi içeren bir füzyon proteini 80 ul baglama tamponuna (50 mM Tris, pH 7.5, eklenir. 15 dakika sonra baglama tamponuna tavsan menseli poliklonal anti tiyoredoksin antikorlarinin 10 pl çözeltisi eklenir. 30 dakika daha geçtikten sonra baglama tamponuna 10 pl yaban turbu peroksidazi ile bagli anti tavsan immünoglobulin çözeltisi eklenir. Oda sicakliginda 30 dakika enkübasyonun ardindan baglanmayan VBC kompleksini ve antikorlari uzaklastirmak amaci ile üç kez yikama tamponu ile yikanir. Baglanan VBC kompleksinin miktarini tayin etmek amaci ile 15 dakika TMB ile enkübe edilir. Renk reaksiyonu, 100 pl 1 M sülfürik asit eklenerek sonlandirilir. 450 nm'de optik yogunluk ölçülerek baglanan VBC kompleksinin miktari tayin edilir. Bu miktar, peptid substrati içindeki hidroksilize prolin miktari ile dogru orantilidir.

Prolilhidroksilasyonun saptanmasina yönelik olarak bunu yerine Europium (Perkin Elmer firmasi) ile bagli bir VBC kompleksi kullanilabilir. Bu durumda baglanan VBC kompleksinin miktari zamana göre çözümlenen floresans ile tayin edilir. Ayrica [358]- metiyonin ile isaretlenen VBC kompleksi kullanilmasi da mümkündür. Bu amaçla radyoaktif olarak isaretlenen VBC kompleksi, retikülosit Iizat içinde in vitro transkripsiyon-translasyon yolu ile üretilebilir.

Formülün (II) bulusa göre bilesigi, bu testteki HIF prolilhidroksilaz etkinligini 0,47 uM (EGLN2/PHD1 ortalama degeri) veya IC50 degeri ile inhibe eder. 1.b) Selüler, fonksiyonel in vitro test: Bulusa göre bilesiklerin etkinliginin miktar tayini, rekombinant bir hücre dizisi yardimi ile tayin edilir. Bu hücrenin orijini bir insan akcigeri karsinom hücre dizisidir (A549, ATCC: American Type Culture Collection, Manassas, VA . Test hücresi dizisi, yapay bir minimal promotor kontrolü altinda Photinus pyralis lusiferaz (bundan böyle lusiferaz olarak anilacaktir) haberci genini içeren bir vektör ile stabil bir sekilde transfekte edilir. Minimal promotor, bir TATA kutusu akisinin aksi yönünde hipoksiden sorumlu iki elemandan meydana gelir [Oehme F., Ellinghaus P., Kolkhof P., Smith T.J., Ramakrishnan S., Hütter J., Schramm M., Flamme I., Biochem. Biophys. Res. esliginde kültüre alma) etkisi altinda veya seçici olmayan dioksijenaz inhibitörleri (örnegin 100 uM konsantrasyonda desferroksamin, 100 ;M konsantrasyonda kobalt klorür veya 1 mM konsantrasyonda N-oksalilglikindietilester) etkisi altinda test hücresi dizisi uygun biyoluminesans reaktifleri (örnegin Steady-GIO® Luciferase Assay System, Promega Corporation, Madison, WI ve uygun bir Iüminometre yardimi ile saptanabilen ve miktari tayin edilebilen Iusiferaz üretir.

Test seyri: Hücreler testin yapilacagi günden bir gün önce tam olarak ölçülü bir mikro titrasyon plakalarina alinir ve bir hücre enkübatöründe (%96 hava nemi, %5 v/v 002, 37°C) tutulur. Test gününde test maddeleri kültür ortamina kademeli konsantrasyonlarda eklenir. Negatif kontrol görevi gören preparasyonlarda hücrelere test maddesi eklenmez. Hücrenin inhibitörlere yönelik duyarliligini tayine yönelik pozitif kontrol olarak örnegin nihai konsantrasyonu 100 pM olan desferroksamin eklenir. Test maddelerinin mikro titrasyon plakalarinin deliklerine nakledilmesinin ardindan alti ile 24 saat sonra ortaya çikan isik sinyali Iüminometrede ölçülür. Ölçüm degerleri ile yari maksimum efektif konsantrasyonun (EC50 degeri olarak adlandirilir) belirlenmesine esas teskil eden bir doz etkisi iliskisi kurulur.

Formülün (II) bulusa göre bilesiginin burada tarif edilen testteki EC50 degeri 7 uM'dir. 1.c) Gen ekspresyonu degisikligine yönelik selüler, fonksiyonel in vitro test: Test maddeleri uygulandiktan sonra insan hücresi dizilerindeki belirli mRNA'Iarin ekspresyonundaki degisikligi incelemek amaci ile asagidaki hücre dizileri 6 veya 24 delikli plakalarda kültüre alinir: insan hepatom hücreleri (HUH, JCRB Cell Bank, Japonya), insan embriyonal böbrek fibroblastlari (HEK/293, ATCC, Manassas, VA ABD), insan göbek kordonu toplar damar endotelyal hücreleri (HUVEC, Cambrex, East Rutherford, New Jersey . Test maddeleri eklendikten 24 saat sonra hücreler fosfat tamponlu salin ile yikanir ve uygun bir metot kullanilarak bunlardan tam RNA elde edilir (örnegin Trizol® reaktifi, Invitrogen GmbH, 76131 Karlsruhe, Almanya).

Tipik bir analiz deneyi için bu sekilde elde edilen tam RNA'nin her 1 ug'si, DNaz I ile sindirilir ve uygun bir ters transkriptaz reaksiyonu (ImProm-Il Reverse Transcription System, Promega Corporation, Madison, WI kullanilan translasyon ile komplementer DNA (cDNA) haline getirilir. Bu sekilde elde edilen cDNA preparasyonunun %2,5'i polimeraz zincir reaksiyonu için kullanilir. Incelenen genlerin mRNA'sinin ifade seviyesi, bir ABI Prism 7700 dizi algilama aygiti (Applied Biosystems, Inc. firmasi) kullanilarak gerçek zamanli nicel polimeraz zincir reaksiyonu Primer Express 1.5 yazilimi (Applied Biosystems, Inc. firmasi) araciligi ile olusturulur.

Münferit olarak eritropoetin, karboanhidraz IX, Iaktatdehidrojenaz A ve vasküler endoteliyal hücre büyüme faktörü mRNA'Iari incelenir. g. Kardivovasküler sistemde etkinligin iSßtina yönelik in vivo testlg 2.a) Gen ekspresyonu degisikligine yönelik in vivo test: Farelere veya siçanlara girtlak sondasi uygulamasi yolu ile oral olarak, intraperitoneal veya intravenöz olarak uygun çözücü maddeler içinde çözülen test bilesikleri uygulanir. ve 300 mg maddedir. Kontrol hayvanlarina sadece çözücü madde verilir. Test maddesi verildikten 4, 8 veya 24 saat sonra hayvanlar asiri dozda izofluran ve ardindan boyunlari kirilarak öldürülür ve incelenecek organlar alinir. Organlarin parçalari sivi nitrojende soklanarak dondurulur. Organ parçalarindan B.1.a) basliginda tarif edildigi gibi tam RNA elde edilir ve bunlar transkripsyon ile cDNA haline getirilir. Incelenen genlerin mRNA'sinin ifade seviyesi, bir ABI Prism 7700 dizi algilama aygiti (Applied Biosystems, Inc. firmasi) kullanilarak gerçek zamanli nice/ polimeraz zincir reaksiyonu Mevcut bulusa göre madde, plasebo kontrol grubuna kiyasla oral veya parenteral uygulamanin ardindan böbrekteki eritropoetinin mRNA'sinda doza bagli, büyük ölçüde bir artisa yol açar. 2.b) Serum içindeki eritropoetin seviyesinin tayini: Farelere veya siçanlara uygun bir çözücü madde içinde test maddesi intraperitoneal veya oral olarak günde bir veya iki kez uygulanir. Her bir kg vücut agirligi ve uygulama hayvanlarina sadece çözücü madde verilir. Uygulamadan önce ve maddenin son verilmesinin ardindan dört saat sonra kisa anestezide retroorbital toplar damar pleksusundan veya kuyruk toplar damarindan hayvanlarin kani alinir. Kan Iityum heparin eklenerek pihtilasamaz hale getirilir. Santrifüj yolu ile kan plazmasi elde edilir.

Bu kan plazmasinda bir eritropoetin ELISA (Quantikine® mouse Epo lmmunoassay, R&D Systems, Inc., Minneapolis, ABD) yardimi ile üreticinin talimatlarina uygun olarak eritropoetin miktari tayin edilir. Ölçüm degerleri, fare eritropoetini için yapilan bir referans ölçümü yardimi ile hesaplanarak pg/ml birimine dönüstürülür.

Mevcut bulusa göre madde, oral ve parenteral uygulamanin ardindan plazma eritropoetinin baslangiç degerine ve plasebo kontrol grubuna göre doza bagli, büyük ölçüde artmasina yol açar. 2.0) Periferik kan selüler bilesiminin tayini: Farelere veya siçanlara uygun bir çözücü madde içinde test maddesi intraperitoneal veya oral olarak birkaç gün boyunca günde bir veya iki kez uygulanir. Her bir kg vücut mg maddedir. Kontrol hayvanlarina sadece çözücü madde verilir. Deneyin sonunda kisa narkozda gözün ucundaki toplar damar pleksusundan veya kuyruk toplar damarindan hayvanlarin kani alinir ve sodyum sitrat eklenerek pihtilasamaz hale getirilir. Uygun bir elektronik ölçüm cihazinda kan numunelerindeki eritrosit, Iökosit ve trombosit konsantrasyonlari tayin edilir. Retikülositlerin konsantrasyonu, 1000'er eritrosit mikroskobik olarak tarama yolu ile bu is için uygun bir boya çözeltisi (KABE Labortechnik firmasi, Nümbrecht) ile boyanan kan yaymalari araciligi ile tayin edilir.

Hematokrit tayini için retroorbital toplar damar pleksusundan bir hematokrit kilcali araciligi ile kan alinir ve kilcal bu is için uygun bir santrifüj içinde santrifüj edildikten sonra hematokrit degeri manuel olarak okunur.

Mevcut bulusa göre madde, oral ve parenteral uygulamanin ardindan hematokritin, eritrosit sayisinin ve retikülositlerin baslangiç degerine ve plasebo kontrol grubuna göre doza bagli, büyük ölçüde artmasina yol açar.

C. Farmasötik bilesimlere yönelik düzenleme örnekleri Bulusa göre bilesikler, asagidaki gibi farmasötik preparatlar haline getirilebilir: Bilesim: 100 mg bulusa göre bilesik, 50 mg Iaktoz (monohidrat), 50 mg misir nisastasi (dogal), mg polivinilpirolidon (PVP 25) (BASF firmasi, Ludwigshafen, Almanya) ve 2 mg magnezyum stearat.

Tablet agirligi 212 mg. Çap 8 mm, bombe yari çapi 12 mm.

Bulusa göre bilesikten, Iaktozdan ve nisastadan meydana gelen bilesik, %5'Iik bir PVP çözeltisi (m/m) ile su içinde granül haline getirilir. Granül kurutulduktan sonra 5 dakika magnezyum stearat ile karistirilir. Bu karisim, olagan birtablet presi ile preslenir (tablet biçimi için yukari bakiniz). Presleme referans degeri olarak 15 kN presleme kuvveti kullanilir.

Oral uygulanabilir sü_spansivon: Bilesim: sakizi, FMC firmasi, Pennsylvania, USA) ve 99 9 su.

Bulusa göre bilesigin 100 mg'lik tek dozu, 10 ml oral süspansiyona esittir. Üretim: Rhodigel etanol içinde süspanse edilir, bulusa göre bilesik süspansiyona eklenir.

Karistirilarak su katilir. Rhodigel'in kabarmasi durana kadar yaklasik 6 saat karistirilir.

Oral uygulanabilir çözelti: Bilesim: bilesigin 100 mg'lik tek dozu, 20 g oral çözeltiye esittir. Üretim: Bulusa göre bilesik, polietilenglikol ve polizorbattan meydana gelen karisimda karistirilarak süspanse edilir. Karistirma islemi, bulusa göre bilesik tamamen çözünene kadar devam ettirilir. i.v. çözelti: Bulusa göre bilesik, doyma çözünürlügü altinda bir konsantrasyonda fizyolojik olarak zararsiz bir çözücü madde (örnegin izotonik sofra tuzu çözeltisi, %5 glukoz çözeltisi ve/veya %30 PEG 400 çözeltisi) içinde çözülür. Çözelti steril bir sekilde filtrelenir ve steril ve pirojensiz enjeksiyon konteynerlerine doldurulur.

Sekil 1: Formülün (II) bilesigi ve formülün (I) bilesiginin IR spektrumlari .Absorpsiyon orani

Claims (11)

ISTEMLER
1. . Formülün (Il) bilesigine göre sodyum-1-[6-(morfolin-4-il)pirimidin-4-iI]-4-(1H- 1 ,2,3-triazoI-1-il)-1H-pirazoI-S-olattir
2. . Istem 1'e göre formülün (II) bilesigi olup, özelligi formülün (Il) bilesiginin kristalize biçimde olmasi ile karakterize edilmesidir.
3. . Istem 1'e göre formülün (II) bilesigini üretmeye yönelik yöntem olup, özelligi formülün (I) bilesiginin iIl'cil iji) (IM bir çözücü madde içinde sodyum hidroksit veya sulu sodyum hidroksit çözeltisi veya bir sodyum tuzu ile gerekiyorsa bir baz eklenerek reakte edilmesi ile karakterize edilmesidir.
4. . Istem 3'e göre formülün (II) bilesigini üretmeye yönelik yöntem olup, özelligi formülün (l) bilesiginin bir çözücü madde içinde sulu sodyum hidroksit çözeltisi ile gerekiyorsa bir baz eklenerek reakte edilmesi ile karakterize edilmesidir.
5. . Istem 3'e göre formülün (II) bilesigini üretmeye yönelik yöntem olup, özelligi formülün (I) bilesiginin bir çözücü madde içinde sulu sodyum hidroksit çözeltisi ile trietilamin eklenerek reakte edilmesi ile karakterize edilmesidir.
6. . Istem 1 veya 2'den birine göre hastaliklarin tedavisine ve/veya profilaksisine yönelik bilesiktir.
7. 7. Istem 1 veya 2'den birine göre bilesigin hastaliklarin tedavisine ve/veya profilaksisine yönelik ilaç üretmeye yönelik olarak kullanilmasidir.
8. 8. Istem 1 veya 2'den birine göre bilesigin kalp-dolasim hastaliklari, kalp yetmezligi, anemi, kronik böbrek hastaliklari ve böbrek yetmezliginin tedavisine ve/veya profilaksisine yönelik ilaç üretmeye yönelik olarak kullanilmasidir.
9. 9. Istem 1 veya 2'ye göre bilesik ile birlikte inert, toksik olmayan, farmasötik olarak uygun bir yardimci madde içeren ilaçlardir.
10. 10. Istem 1 veya 2'ye göre bilesik ile birlikte bir diger aktif bilesen içeren ilaçlardir.
11. 11. Istem 9 veya 10'den birine göre kalp-dolasim hastaliklari, kalp yetmezligi, anemi, kronik böbrek hastaliklari ve böbrek yetmezliginin tedavisine ve/veya profilaksisine yönelik ilaçlardir.