TH2003000756C3 - ชุดน้ำยาตรวจหายีนเบต้าธาลัสซีเมีย ((beta)-thalassemia) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) จากตัวอย่างเลือด - Google Patents

Abstract

หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า บทสรุปการประดิษฐ์ ชุดนํ้ายาตรวจหายีนเบต้าธาลัสซีเมีย ((สัญลักษณ์)-thalassemia) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) จากตัวอย่างเลือด โดยตัวอย่างเลือดดังกล่าวผสมสารกันเลือดแข็งอี ดีทีเอ (EDTA blood) และไม่ต้องสกัดดีเอ็นเอ โดยชุดนํ้ายาดังกล่าวประกอบไปด้วย นํ้ายาที่ใช้ เตรียมตัวอย่างเลือด สารละลายบัฟเฟอร์ที่มีค่าพีเอชสูง ดีเอ็นทีพีเบส (dNTPs base) สารละลาย แมกนีเซียมคลอไรด์ (MgCl2) สารบีเทน (Betaine) สารละลายไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (Dimethyl sulfoxide) นํ้ากลั่นปราศจากเชื้อ และไพรเมอร์ (primer) ที่ใช้ตรวจสอบยีนเบต้าธาลัสซีเมีย โดยชุด นํ้ายาดังกล่าวจะช่วยให้การตรวจหายีนเบต้าธาลัสซีเมียที่พบบ่อยในประเทศไทยถึง 7 การกลายพันธุ์ ซึ่งเป็นประโยชน์อย่างมากต่อ แพทย์ผู้ให้คำปรึกษาทางพันธุกรรม (genetic counseling) แก่คู่สามี ภรรยาที่วางแผนจะมีทายาทในอนาคตหรือให้การวินิจฉัยโรคธาลัสซีเมีย เพื่อการควบคุมและป้องกัน โรคธาลัสซีเมียชนิดรุนแรงข้างต้นอย่างมีประสิทธิภาพยิ่งขึ้นต่อไป

Claims (6)

ชุดนํ้ายาตรวจหายีนเบต้าธาลัสซีเมีย (บีต้า-thalassemia) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น(polymerase chain reaction) จากตัวอย่างเลือด ประกอบด้วย ก. นํ้ายาที่ใช้เตรียมตัวอย่างเลือด ประกอบไปด้วย โซเดียมโฮดรอกไซด์ (NaOH) ความเข้มข้น0.005 โมลาร์, โซเดียมคลอไรด์ (NaCl) ความเข้มข้น 0.1 โมลาร์, ไตรตันเอ็กซ์-100 (Triton X-100) ความเข้มข้นร้อยละ 1 โดยนํ้าหนักต่อปริมาตร และไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (dimethyl sulfoxide) ความเข้มข้นร้อยละ 5 โดยน้ำหนักต่อปริมาตร ข. สารละลายบัฟเฟอร์ (buffer) ที่ประกอบไปด้วย ทริส-ไฮโดรคลอริก (Tris- HCI) ที่มีค่าพีเอซ9.0 ความเข้มข้น 20 มิลลิโมลาร์, โพแทสเซียมคลอไรด์ (KCI) ความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์, แอมโมเนียมซัลเฟต ((NH4)2S04) ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ และเจลาติน (gelatin) ความเข้มข้นร้อยละ 0.1 โดยนํ้าหนักต่อปริมาตร ค. ดีเอ็นทีพีเบส (dNTPs base) (ประกอบด้วยเบสชนิด A T C และ G รวมกัน) ความเข้มข้น 0.4มิลลิโมลาร์ง. สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (MgCl2) ความเข้มข้น 2 มิลลิโมลาร์จ. สาระละลายบีเทน (Betaine) ความเข้มข้น L005 โมลาร์ฉ. สารละลายไดเมทีลซัลฟอกไซด์ (Dimethyl sulfoxide) ที่มีความเข้มข้นของไดเมทีลซัลฟอกไซด์ ร้อยละ 4 โดยนํ้าหนักต่อปริมาตรซ. น้ำกลั่นปราศจากเชื้อซ. ไพรเมอร์ (primer) ที่ซึ่งมี 3 กลุ่มตามลักษณะการกลายพันธ์ของยีนเบต้าธาลัสซีเมีย โดยไพรเมอร์ทั้ง 3 กลุ่ม คือกลุ่มที่ 1โคดอน 41/42 (codon 41/42)โคดอน 17 (codon 17)และ นิวคลีโอไทด์ -28(nucleotide -28) ประกอบด้วย- ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอส1 (forward primer; SI) ความเข้มข้น 1.5 พิโคโมล- รีเวิร์ดไพรเมอร์ เอส3 (reverse primer; S3) ความเข้มข้น 0.9 พิโคโมล- พ่อร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี148 (forward primer; G148) ความเข้มข้น 1.5 พิโคโมล-รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี18 (reverse primer; G18 ความเข้มข้น 0.42 พิโคโมล--รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี31 (reverse primer; G31) ความเข้มข้น 0.3 พิโคโมล- ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี163 (forward primer; G163) ความเข้มข้น 0.18 พิโคโมล-รีเวิร์ดไพร์เมอร์ เอช5 (reverse primer; H5) ความเข้มข้น 0.18 พิโคโมลกลุ่มที่ 2 โคดอน 71/72 (codon 71/72) และ อินเตอร์วินิ่งซีเควนซ์ 1-5 (interveningsequence 1-5) ประกอบด้วย - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอส1 (forward primer; S1) ความเข้มข้น 2.1 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี20 (reverse primer; G20) ความเข้มข้น 2.1 พิโคโมล - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี14 (forward primer; G14) ความเข้มข้น 0.6 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพรเมอร์ เอส3 (reverse primer; S3) ความเข้มข้น 0.6 พิโคโมล - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี161 (forward primer; G161) ความเข้มข้น 0.6 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพร์เมอร์ เอช5 (reverse primer; H5) ความเข้มข้น 0.6 พิโคโมลกลุ่มที่ 3 อินเตอร์วีนิ่งซีเควนซ์ l-1 (intervening sequence l-1) และ อินเตอร์วีนิ่งซีเควนซ์ II-654 (intervening sequencell-654) ประกอบด้วย - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอส1 (forward primer; SI) ความเข้มข้น 0.3 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี16อาร์ (reverse primer; G16R) ความเข้มข้น 0.3 พิโคโมล - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี12อาร์ (forward primer; G12R) ความเข้มข้น 2.1 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี8 (reverse primer; G8) ความเข้มข้น 2.1 พิโคโมล - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร เอสเอฟ14 (forward primer; SF14) ความเข้มข้น 0.9 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพร์เมอร์ จี10 (reverse primer; G10) ความเข้มข้น 0.9 พิโคโมล 2. ชุดนํ้ายาตรวจหายีนเบต้าธาลัสซีเมีย (บีต้า-thaLassemia) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น(polymerase chain reaction) จากตัวอย่างเลือด ตามข้อลือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง ไพรเมอร์กลุ่มที่ 1 โคดอน41/42 (codon 41/42) โคดอน 17 (codon 17) และ นิวคลีโอไทด์ -28 (nucleotide -28) มีลำดับเบสแต่ละเส้นดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอส 1 (forward primer; SI) 5’ TGTCATCACTTAGACCTCAC 3’ - รีเวิร์ดไพรเมอร์ เอส3 (reverse primer; S3) 5’ TCCCATAGACTCACCCTGAA 3’ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี148 (forward primer; G148) 5’ CCCTTGGACCCAGAGGTTG 3’ - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี18 (reverse primer; G18) 5’ ACTTCATCCACGTTCACCTA 3’ -รีเวิร์ดไพรเมอร์31 (reverse primer; G31) 5’ GATGGCTCTCTGCCCTGACI I c 3’ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี163 (forward primer; G163) 5; CCCTGGCCCACAAGTACTAC y - รีเวิร์ดไพรเมอร เอซ5 (reverse primer; H5) 5! GCAGCCTCACCTTCTTTCAlGG 3 3. ชุดนํ้ายาตรวจหายีนเบต้าธาลัสซีเมีย (บีต้า-thalassemia) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น(polymerase chain reaction) จากตัวอย่างเลือด ตามข้อถือสิทธิที่ 1ที่ซึ่งไพรเมอร์กลุ่มที่ 2โคดอน71/72 (codon 71/72) และ อินเตอร์วีนิ่งซีเควนซ์ l-5 (intervening sequence 1-5) มีลำดับเบสแต่ละเส้นดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอส1 (forward primer; S1) 5’ TGTCATCACTTAGACCTCAC 3’ - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี20 (reverse primer; G20) 5' CTGTCTTGTAACCTTGATAG 3' - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี14 (forward primer; G14) 5’ AAAGTGCTCGGTGCCTTTAA 3’ -รีเวิร์ดไพรเมอร์ เอส3 (reverse primer; S3) 5’ TCCCATAGACTCACCCTGAA 3’ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี161 (forward primer; G161) 5’ TGAGTCCAAGCTAGGCCCTT 3’ -รีเวิร์ดไพร์เมอร์ เอช5 (reverse primer; H5) 5’ GCAGCCTCACGl IGl I ICATGG 3’ 4.ชุดนํ้ายาตรวจหายีนเบต้าธาลัสซีเมีย (เบต้า-thalassemia) ด้วยเทคนิคพอสิเมอเรสเชนรีแอคชั่น(polymerase chain reaction) จากตัวอย่างเลือด ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง ไพรเมอร์กลุ่มที่ 3 อินเตอร์วีนิ่งซีเควนซ์ 1-1 (intervening sequence 1-1) และ อินเตอร์วีนิ่งซีเควนซ์ll-654 (intervening sequencell-654) มีลำดันเบสแต่ละเส้นดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอส1 (forward primer; S1) 5’ TGTCATCAgI IAGACCTCAC 3’ - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี16อาร์ (reverse primer; G16R) 5’ CTTGTAACCTTGATACC AAA 3’ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี12อาร์ (forward primer; G12R) 5’GTAATAATTTCTGGGTTAACGT 3’ -รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี8 (reverse primer; G8) 5’ CGAACCTGAGTCTTATTAG 3’ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอสเอฟ14 (forward primer; SF14) 5, TCCCTCA6AA4AGGATTCAA 3’ -รีเวิร์ดไพร์เมอร์ จี10 (reverse primer; G10) 5’ AG ACTAGCACTGCAGATTcc 3’ 5. ขุดนํ้ายาตรวจหายีนเบต้าธาลัสซีเมีย ((3-thalassemia) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น(polymerase chain reaction) จากตัวอย่างเลือด ตามข้อถือสิทธิที 1-4 ข้อใดข้อหนึ่ง ทีซึ่งมีขั้นตอนการใช้ดังนี้ ขั้นตอนที่ 1 เตรียมตัวอย่างสำหรับตรวจ โดยนำตัวอย่างเลือดที่ผสมสารกันเลือดแข็งอีดีทีเอ(EDTA blood) แล้ว ผสมกับสาร ก. นํ้ายาที่ใช้เตรียมตัวอย่างเลือด ในชุดนํ้ายาตรวจหายีนเบต้าธาลัสซีเมีย(เบต้า-thalassemia) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) ในอัตราส่วน 1ต่อ 5 โดยใน 1 ปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) จะใช้ตัวอย่างเลือดที่ผ่านขั้นตอนการเตรียม 1 ไมโครลิตรในการทำปฏิกิริยา ขั้นตอนที่ 2 จากนั้นผสมนํ้ายาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerasechain reaction) โดยเป็นสารจาก ข้อ ข. - ซ. แล้วให้เข้ากันดี โดยเลือกผสมสาร ข้อ ซ. ตามกลุ่มไพรเมอร์ที่ต้องการตรวจ ขั้นตอนที่ 3 จากนั้นเติมนํ้ายาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerasechain reaction) ลงในหลอดทดลอง โดย 1 ปฏิกิริยาพอสิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chainreaction) จะต้องเติมนั้ายาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอสิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chainreaction/ ปริมาณ 46.0 ไมโครลิตร ขั้นตอนที่ 4 จากนั้นเติมเอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (DNA polymerase enzyme) (ซึ่งไม่ได้ระบุอยู่ในชุดนํ้ายา) ลงในหลอดทดลองที่มีนํ้ายาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerasechain reaction) แล้วผสมให้เข้ากันดี โดยใน 1 ปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chainreaction) ที่มีนํ้ายาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction)ปริมาณ 46.6 ไมใครลิตร จะใช้เอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (DNA polymerase enzyme) 0.4 ไมใครลิตรในการทำปฏิกิริยา ขั้นตอนที่ 5 จากนั้นเติมตัวอย่างเลือดที่ผ่านขั้นตอนการเตรียมตามปริมาณที่ระบุลงในหลอดทดลองที่มีนํ้ายาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) และเอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (DNA polymerase enzyme) ผสมให้เข้ากัน ขั้นตอนที่ 6 นำไปเพิ่มปริมาณชิ้นส่วนดีเอ็นเอหรือพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chainreaction) โดยจะอยู่ภายใต้เงื่อนไขของเทคนิคอัลลีลสเปซิฟิกพอสิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (allele specific polymerase chain reaction, ASPCR) จากดีเอ็นเอต้นแบบ (DNA template) ที่อยู่ในตัวอย่างเลือด โดยเครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมโดยอาศัยปฏิกิริยาลูกโซ่ (thermal cycle) ขั้นที่ 7 นำชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เพิ่มปริมาณแล้วมาแยกด้วยวิธีอะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟรีซีส (agarosegel electrophoresis) โดยไข้เจลระกาโรส (agarose gel) ความเข้มข้นร้อยละ 2 แล้วนำไปตรวจสอบโดยผ่านเครื่องถ่ายภาพเจลโดยอาศัยแสงจากหลอดไฟอัลตร้าไวโอเลต 6.การใช้ชุดนํ้ายาตรวจหายีนเบต้าธาลัสซีเมีย ((3-thalassemia) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) จากตัวอย่างเลือด ตามข้อถือสิทธิที่ 5 ที่ซึ่ง เครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมโดยอาศัยปฏิกิริยาลูกโซ่ (thermal cycle) ตั้งโปรแกรมและอุณหภูมิดังนี้ ขั้นที่ 1 อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที (เฉพาะรอบที่หนึ่ง) ขั้นที่ 2 อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 นาที ขั้นที่ 3 อุณหภูมิ 58 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 นาที (สำหรับโคดอน 41/42 (codon 41/42)โคดอน 17 (codon 17) และนิวคลีโอไทด์ -28 (nucleotide -28)) อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 นาที (สำหรับโคดอน 71/72 (codon 71/72) และอินเตอร์วีนิ่งซีเควนซ์ 1-5 (intervening sequence 1-5)) อุณหภูมิ 53 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 นาที (สำหรับอินเตอร์วีนิ่งซีเควนซ์ i-1 (intervening sequence 1-1) และ อินเตอร์วีนิ่งซีเควนซ์ ll-654 (intervening sequence ll-654)) ขั้นที่ 4 อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 90 วินาที โดยขั้นที่ 2-4 ทำซํ้าจำนวน 36 รอบ ขั้นที่ 5 อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10 นาที (เฉพาะรอบสุดท้าย) เมื่อสิ้นสุดปฏิกิริยาตั้งอุณหภูมิไว้ที่ 10 องศาเซลเซียส จนกว่าจะนำเอาชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เพิ่มปริมาณเรียบร้อยแล้วไปตรวจสอบ ------------ หน้า 1 ของจำนวน 4 หน้า ข้อถือสิทธิ

1. ชุดน้ำยาตรวจหายีนเบต้าธาลัสซีเมีย ((สัญลักษณ์)-thalassemia) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) จากตัวอย่างเลือด ประกอบด้วย ก. น้ำยาที่ใช้เตรียมตัวอย่างเลือด ประกอบไปด้วย โซเดียมไฮดรอกไซด์ (NaOH) ความเข้มข้น 0.005 โมลาร์, โซเดียมคลอไรด์ (NaCl) ความเข้มข้น 0.1 โมลาร์, ไตรตันเอ็กซ์-100 (Triton X-100) ความ เข้มข้นร้อยละ 1 และไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (dimethyl sulfoxide) ความเข้มข้นร้อยละ 5 ข. สารละลายบัฟเฟอร์ (buffer) ที่ประกอบไปด้วย ทริส-ไฮโดรคลอริก (Tris- HCl) ที่มีค่าพีเอช 9.0 ความเข้มข้น 20 มิลลิโมลาร์, โพแทสเซียมคลอไรด์ (KCl) ความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์, แอมโมเนียม ซัลเฟต ((NH4)2SO4) ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ และเจลาติน (gelatin) ความเข้มข้นร้อยละ 0.1 ค. ดีเอ็นทีพีเบส (dNTPs base) (ประกอบด้วยเบสชนิด A T C และ G รวมกัน) ความเข้มข้น 0.4 มิลลิโมลาร์ ง. สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (MgCl2) ความเข้มข้น 2 มิลลิโมลาร์ จ. สาระละลายบีเทน (Betaine) ความเข้มข้น 1.005 โมลาร์ ฉ. สารละลายไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (Dimethyl sulfoxide) ความเข้มข้นร้อยละ 4 ช. น้ำกลั่นปราศจากเชื้อ ซ. ไพรเมอร์ (primer) ที่ซึ่งมี 3 กลุ่มตามลักษณะการกลายพันธุ์ของยีนเบต้าธาลัสซีเมีย โดยไพร เมอร์ทั้ง 3 กลุ่ม คือ กลุ่มที่ 1โคดอน 41/42 (codon 41/42) โคดอน 17 (codon 17) และ นิวคลีโอไทด์ -28 (nucleotide -28) ประกอบด้วย - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอส1 (forward primer; S1) ความเข้มข้น 1.5 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพรเมอร์ เอส3 (reverse primer; S3) ความเข้มข้น 0.9 พิโคโมล - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี148 (forward primer; G148) ความเข้มข้น 1.5 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี18 (reverse primer; G18) ความเข้มข้น 0.42 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี31 (reverse primer; G31) ความเข้มข้น 0.3 พิโคโมล - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี163 (forward primer; G163) ความเข้มข้น 0.18 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพร์เมอร์ เอช5 (reverse primer; H5) ความเข้มข้น 0.18 พิโคโมล กลุ่มที่ 2 โคดอน 71/72 (codon 71/72) และ อินเตอร์วีนิ่งซีเควนซ์ I-5 (intervening sequence 1-5) ประกอบด้วย - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอส1 (forward primer; S1) ความเข้มข้น 2.1 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี20 (reverse primer; G20) ความเข้มข้น 2.1 พิโคโมล - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี14 (forward primer; G14) ความเข้มข้น 0.6 พิโคโมล หน้า 2 ของจำนวน 4 หน้า - รีเวิร์ดไพรเมอร์ เอส3 (reverse primer; S3) ความเข้มข้น 0.6 พิโคโมล - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี161 (forward primer; G161) ความเข้มข้น 0.6 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพร์เมอร์ เอช5 (reverse primer; H5) ความเข้มข้น 0.6 พิโคโมล กลุ่มที่ 3 อินเตอร์วีนิ่งซีเควนซ์ I-1 (intervening sequence I-1) และ อินเตอร์วีนิ่งซีเควนซ์ II- 654 (intervening sequence II-654) ประกอบด้วย - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอส1 (forward primer; S1) ความเข้มข้น 0.3 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี16อาร์ (reverse primer; G16R) ความเข้มข้น 0.3 พิโคโมล - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี12อาร์ (forward primer; G12R) ความเข้มข้น 2.1 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี8 (reverse primer; G8) ความเข้มข้น 2.1 พิโคโมล - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอสเอฟ14 (forward primer; SF14) ความเข้มข้น 0.9 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพร์เมอร์ จี10 (reverse primer; G10) ความเข้มข้น 0.9 พิโคโมล

2. ชุดน้ำยาตรวจหายีนเบต้าธาลัสซีเมีย ((สัญลักษณ์)-thalassemia) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) จากตัวอย่างเลือด ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง ไพรเมอร์กลุ่มที่ 1 โคดอน 41/42 (codon 41/42) โคดอน 17 (codon 17) และ นิวคลีโอไทด์ -28 (nucleotide -28) มีลำดับเบสแต่ ละเส้นดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอส1 (forward primer; S1) 5’ TGTCATCACTTAGACCTCAC 3’ - รีเวิร์ดไพรเมอร์ เอส3 (reverse primer; S3) 5’ TCCCATAGACTCACCCTGAA 3’ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี148 (forward primer; G148) 5’ CCCTTGGACCCAGAGGTTG 3’ - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี18 (reverse primer; G18) 5’ ACTTCATCCACGTTCACCTA 3’ - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี31 (reverse primer; G31) 5’ GATGGCTCTCTGCCCTGACTTC 3’ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี163 (forward primer; G163) 5’ CCCTGGCCCACAAGTACTAC 3’ - รีเวิร์ดไพร์เมอร์ เอช5 (reverse primer; H5) 5’ GCAGCCTCACCTTCTTTCATGG 3’

3. ชุดน้ำยาตรวจหายีนเบต้าธาลัสซีเมีย ((สัญลักษณ์)-thalassemia) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) จากตัวอย่างเลือด ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง ไพรเมอร์กลุ่มที่ 2 โคดอน 71/72 (codon 71/72) และ อินเตอร์วีนิ่งซีเควนซ์ I-5 (intervening sequence I-5) มีลำดับเบสแต่ละ เส้นดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอส1 (forward primer; S1) 5’ TGTCATCACTTAGACCTCAC 3’ - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี20 (reverse primer; G20) 5’ CTGTCTTGTAACCTTGATAG 3’ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี14 (forward primer; G14) 5’ AAAGTGCTCGGTGCCTTTAA 3’ - รีเวิร์ดไพรเมอร์ เอส3 (reverse primer; S3) 5’ TCCCATAGACTCACCCTGAA 3’ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี161 (forward primer; G161) 5’ TGAGTCCAAGCTAGGCCCTT 3’ หน้า 3 ของจำนวน 4 หน้า - รีเวิร์ดไพร์เมอร์ เอช5 (reverse primer; H5) 5’ GCAGCCTCACCTTCTTTCATGG 3’

4. ชุดน้ำยาตรวจหายีนเบต้าธาลัสซีเมีย ((สัญลักษณ์)-thalassemia) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) จากตัวอย่างเลือด ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง ไพรเมอร์กลุ่มที่ 3 อินเตอร์วี นิ่งซีเควนซ์ I-1 (intervening sequence I-1) และ อินเตอร์วินิ่งซีเควนซ์ II-654 (intervening sequence II-654) มีลำดับเบสแต่ละเส้นดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอส1 (forward primer; S1) 5’ TGTCATCACTTAGACCTCAC 3’ - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี16อาร์ (reverse primer; G16R) 5’ CTTGTAACCTTGATACCAAA 3’ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี12อาร์ (forward primer; G12R) 5’GTAATAATTTCTGGGTTAACGT 3’ - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี8 (reverse primer; G8) 5’ CGAACCTGAGTCTTATTAG 3’ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอสเอฟ14 (forward primer; SF14) 5’ TCCCTCAGAAAAGGATTCAA 3’ - รีเวิร์ดไพร์เมอร์ จี10 (reverse primer; G10) 5’ AGACTAGCACTGCAGATTCC 3’

5. ชุดน้ำยาตรวจหายีนเบต้าธาลัสซีเมีย ((สัญลักษณ์)-thalassemia) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) จากตัวอย่างเลือด ตามข้อถือสิทธิที่ 1-4 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่งมีขั้นตอนการ ใช้ดังนี้ ก. เตรียมตัวอย่างสำหรับตรวจ โดยนำตัวอย่างเลือดที่ผสมสารกันเลือดแข็งอีดีทีเอ (EDTA blood) แล้ว ผสมกับสาร ก. น้ำยาที่ใช้เตรียมตัวอย่างเลือด ในชุดน้ำยาตรวจหายีนเบต้าธาลัสซีเมีย ((สัญลักษณ์)- thalassemia) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) ในอัตราส่วน 1 ต่อ 5 โดยใน 1 ปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) จะใช้ตัวอย่างเลือดที่ผ่าน ขั้นตอนการเตรียม 1 ไมโครลิตรในการทำปฏิกิริยา ข. จากนั้นผสมน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) โดยเป็นสารจาก ข้อ ข. - ซ. แล้วให้เข้ากันดี โดยเลือกผสมสาร ข้อ ซ. ตามกลุ่มไพรเมอร์ที่ ต้องการตรวจ ค. จากนั้นเติมน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) ลงในหลอดทดลอง โดย 1 ปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) จะต้องเติมน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) ปริมาณ 46.6 ไมโครลิตร ง. จากนั้นเติมเอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (DNA polymerase enzyme) (ซึ่งไม่ได้ระบุอยู่ในชุด น้ำยา) ลงในหลอดทดลองที่มีน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) แล้วผสมให้เข้ากันดี โดยใน 1 ปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) ที่มีน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) หน้า 4 ของจำนวน 4 หน้า ปริมาณ 46.6 ไมโครลิตร จะใช้เอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (DNA polymerase enzyme) 0.4 ไมโครลิตร ในการทำปฏิกิริยา จ. จากนั้นเติมตัวอย่างเลือดที่ผ่านขั้นตอนการเตรียมตามปริมาณที่ระบุลงในหลอดทดลองที่มีน้ำยา สำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) และเอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิ เมอเรส (DNA polymerase enzyme) ผสมให้เข้ากัน ฉ. นำไปเพิ่มปริมาณชิ้นส่วนดีเอ็นเอหรือพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) โดยจะอยู่ภายใต้เงื่อนไขของเทคนิคอิลลีลสเปซิฟิกพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (allele specific polymerase chain reaction, ASPCR) จากดีเอ็นเอต้นแบบ (DNA template) ที่อยู่ในตัวอย่างเลือด โดย เครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมโดยอาศัยปฏิกิริยาลูกโซ่ (thermal cycle) ช. นำชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เพิ่มปริมาณแล้วมาแยกด้วยวิธีอะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟรีซีส (agarose gel electrophoresis) โดยใช้เจลอะกาโรส (agarose gel) ความเข้มข้นร้อยละ 2 แล้วนำไปตรวจสอบโดยผ่าน เครื่องถ่ายภาพเจลโดยอาศัยแสงจากหลอดไฟอัลตร้าไวโอเลต

6. การใช้ชุดน้ำยาตรวจหายีนเบต้าธาลัสซีเมีย ((สัญลักษณ์)-thalassemia) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเชนรี แอคชั่น (polymerase chain reaction) จากตัวอย่างเลือด ตามข้อถือสิทธิที่ 5 ที่ซึ่ง เครื่องเพิ่มปริมาณ สารพันธุกรรมโดยอาศัยปฏิกิริยาลูกโซ่ (thermal cycle) ตั้งโปรแกรมและอุณหภูมิดังนี้ ขั้นที่ 1 อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที (เฉพาะรอบที่หนึ่ง) ขั้นที่ 2 อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 นาที ขั้นที่ 3 อุณหภูมิ 58 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 นาที (สำหรับโคดอน 41/42 (codon 41/42) โคดอน 17 (codon 17) และนิวคลีโอไทด์ -28 (nucleotide -28)) อุณหภูิมิ 60 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 นาที (สำหรับโคดอน 71/72 (codon 71/72) และ อินเตอร์วีนิ่งซีเควนซ์ I-5 (intervening sequence 1-5)) อุณหภูมิ 53 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 นาที (สำหรับอินเตอร์วีนิ่งซีเควนซ์ 1-1 (intervening sequence 1-1) และ อินเตอร์วีนิ่งซีเควนซ์ II-654 (intervening sequence II-654)) ขั้นที่ 4 อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 90 วินาที โดยขั้นที่ 2-4 ทำซํ้าจำนวน 36 รอบ ขั้นที่ 5 อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10 นาที (เฉพาะรอบสุดท้าย) เมื่อสิ้นสุดปฏิกิริยาตั้งอุณหภูมิไว้ที่ 10 องศาเซลเซียส จนกว่าจะนำเอาชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เพิ่ม ปริมาณเรียบร้อยแล้วไปตรวจสอบ