TH21694U - ชุดน้ำยาตรวจวินิจฉัยทารกในครรภ์ก่อนคลอด (prenatal diagnosis) สำหรับโรคโฮโมซัยกัสเบต้าธาลัสซีเมีย (homozygous beta-thalassemia disease) และโรคเบต้าธาลัสซีเมีย/ฮีโมโกลบินอี (beta-thalassemia/hemoglobin E disease) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) - Google Patents

Abstract

หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า บทสรุปการประดิษฐ์ ชุดนํ้ายาตรวจวินิจฉัยทารกในครรภ์ก่อนคลอด (prenatal diagnosis) สำหรับโรคโฮโม ซัยกัสเบต้าธาลัสซีเมีย (homozygous (สัญลักษณ์)-thalassemia disease) และโรคเบต้าธาลัสซีเมีย/ ฮีโมโกลบินอี ((สัญลักษณ์)-thalassemia/hemoglobin E disease) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) เป็นชุดนํ้ายาสำหรับตรวจตัวอย่างนํ้าคร่ำและเลือดที่เจาะจากสาย สะดือของทารกที่อยู่ในครรภ์ที่ผสมสารกันเลือดแข็งอีดีทีเอ (EDTA blood) โดยไม่ต้องสกัดดีเอ็นเอ ซึ่งชุดนํ้ายาดังกล่าวประกอบด้วย นํ้ายกที่ใช้เตรียมตัวอย่างเลือด สารละลายบัฟเฟอร์ (buffer) ดี เอ็นทีพีเบส (dNTPs base) สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (MgCl2) สารละลายบีเทน (Betaine) สารละลายไดเมทิล ซัลฟอกไซด์ (Dimethyl sulfoxide) นํ้ากลั่นปราศจากเชื้อ และ ไพรเมอร์ (primer)

Claims (6)

------25/11/2564------(OCR) 1. ชุดน้ำยาตรวจวินิจฉัยทารกในครรภ์ก่อนคลอด (prenatal diagnosis) สำหรับโรคโฮโมซัยกัสเบต้าธาลัสซีเมีย (homozygous (3-thalassemia disease) และโรคเบต้าธาลัสซีเมีย/ฮีโมโกลบินอี ((3-thalassemia/hemoglobin E disease) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chainreaction) ประกอบไปด้วย ก. น้ำยาที่ใช้เตรียมตัวอย่างเลือด ประกอบไปด้วย โซเดียมไฮดรอกไซด์ (NaOH) ความเข้มข้น 0.005โมลาร์, โซเดียมคลอไรด์ (NaCl) ความเข้มข้น 0.1 โมลาร์, ไตรตันเอ็กซ์-100 (Triton X-100) ความเข้มข้นร้อยละ 1 โดยน้ำหนักต่อปริมาตร และไดเมทิล ซัลฟอกไซด์ (dimethyl sulfoxide) ความเข้มข้นร้อยละ 5 โดยน้ำหนักต่อปริมาตร ข. สารละลายบัฟเฟอร์ (buffer) ที่ประกอบไปด้วย ทริส-ไฮโดรคลอริก (Tris- HCI) ที่มีค่าพีเอช 9.0ความเข้มข้น 20 มิลลิโมลาร์, โพแทสเซียมคลอไรด์ (KCI) ความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์, แอมโมเนียมซัลเฟต(NH4)2SO4)ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ และเจลาติน (gelatin) ความเข้มข้นร้อยละ 0.1 โดยน้ำหนักต่อปริมาตร ค. ดีเอ็นทีพีเบส (dNTPs base) (ประกอบด้วยเอ (A) ที (T) ซี (0 และจี (G) รวมกัน) ความเข้มข้น รวมทั้งหมด 0.4 มิลลิโมลาร์ ง. สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (MgCl2) ความเข้มข้น 2 มิลลิโมลาร์ จ. สารละลายบีเทน (Betaine) ความเข้มข้น 1.005 โมลาร์ ฉ. สารละลายไดเมทิล ซัลฟอกไซด์ (Dimethyl sulfoxide) ความเข้มข้นร้อยละ 4 โดยน้ำหนักต่อปริมาตร ช. น้ำกลั่นปราศจากเชื้อ สำหรับปรับปริมาตร ซ. ชุดไพรเมอร์ (primer) ที่ซึ่งแบ่งออกเป็น 3 กลุ่มตามลักษณะทางพันธุกรรมอันเปีนสาเหตุของโรคหรือจีโนไทบี (genotype) ทั้ง 3 แบบ โดยไพรเมอร์ทั้ง 3 กลุ่ม คือ กลุ่มที่ 1 คอมพาวด์เฮทเทอโรไซกัสเบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียชนิดโคดอน 41/42/เบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียชนิดโคดอน 17 (compound heterozygous (เบตา องศา-thalassemia (codon 41/42)/ (เบตา องศา-thalassemia (codon17)) ประกอบด้วย -ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ แกมมา4 (forward primer; แกมมา4) ความเข้มข้น 0.9 พีโคโมล -รีเวิร์ดไพร์เมอร์ แกมมาร5 (reverse primer; แกมมา5) ความเข้มข้น 0.9 พีโคโมล - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอส1 (forward primer; S1) ความเข้มข้น 1.5 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี22 (reverse primer; G22) ความเข้มข้น 0.6 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี18 (reverse primer; G18) ความเข้มข้น 1.02 พิโคโมล กลุ่มที่ 2 คอมพาวด์เฮทเทอโรไซกัสเบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียชนิดโคดอน 41/42/ยีนฮีโมโกลบินอี (compound heterozygous (3?-thalassemia (codon 41/42)/hemoglobin E gene) ประกอบด้วย - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี163 (forward primer; G163) ความเข้มข้น 0.0255 พิโคโมล -รีเวิร์ดไพร์เมอร์ เอช5 (reverse primer; H5) ความเข้มข้น 0.0255 พิโคโมล -ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี148 (forward primer; G148) ความเข้มข้น 1.8 พิโคโมล -ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี24 (forward primer; G24) ความเข้มข้น 0.3 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพรเมอร์ เอส3 (reverse primer; S3) ความเข้มข้น 0.3 พิโคโมล กลุ่มที่ 3 คอมพาวด์เฮทเทอโรไซกัสเบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียชนิดโคดอน 17/ยีนฮีโมโกลบินอี(compound heterozygous (เบตา องศา-thalassemia (codon 17)/hemoglobin E gene) ประกอบด้วย -ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอสเอฟ14 (forward primer; SF14) ความเข้มข้น 0.3 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพร์เมอร์ จี10 (reverse primer; G10) ความเข้มข้น 0.3 พิโคโมล - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอส1 (forward primer; S1) ความเข้มข้น 2.1 พิโคโมล -รีเวิร์ดไพรเมอร์จี18 (reverse primer; G18) ความเข้มข้น 2.1 พิโคโมล -ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี24 (forward primer; G24) ความเข้มข้น 0.9 พิโคโมล -รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี72 (reverse primer; G72) ความเข้มข้น 0.9 พิโคโมล 2. ชุดน้ำยาตรวจวินิจฉัยทารกในครรภ์ก่อนคลอด (prenatal diagnosis) สำหรับโรคโฮโมซัยกัสณต้าธาลัสซีเมีย (homozygous (3-thalassemia disease) และโรคเบต้าธาลัสซีเมีย/ฮีโมโกลบินอี (เบตา-thalassemia/hemoglobin E disease) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chainreaction) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง ไพรเมอร์กลุ่มที่ 1 คอมพาวด์เฮทเทอโรไซกัสเบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียชนิดโคดอน 41/42/เบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียชนิดโคดอน 17 (compound heterozygous (เบตา องศา-thalassemia (codon41/42)/ (เบตา องศา-thalassemia (codon 17)) มีลำดับเบส ดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ แกมมา4 (forward primer; แกมมา4) 5’ GGCCTAAAACCACAGAGT 3’ -รีเวิร์ดไพร์เมอร์ แกมมาร (reverse primer; แกมมา5) 5’ CCAGAAGCGAGTGTGTGGAA 3’ -ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอส1 (forward primer; ร!) 5’ TGTCATcACTTAGACCTcAC 3’ -รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี22 (reverse primer; G22) 5’ GAGTGGACAGATCCCCAAAGGACTCAACCT 3’ -รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี18 (reverse primer; G18) 5’ ACTTCATCCACGTTCACCTA 3’ 3.ชุดน้ำยาตรวจวินิจฉัยทารกในครรภ์ก่อนคลอด (prenatal diagnosis) สำหรับโรคโฮโมซัยกัสเบต้าธาลัสซีเมีย (homozygous (เบตา-thalassemia disease) และโรคเบต้าธาลัสซีเมีย/ฮีโมโกลบินอี (เบตา- thalassemia/hemoglobin E disease) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chainreaction) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง ไพรเมอร์กลุ่มที่ 2 คอมพาวด์เฮทเทอโรไซกัสเบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียชนิดโคดอน 41/42/ยี น ฮีโมโกลบิน อี (compound heterozygous (เบตา องศา-thalassemia (codon41/42)/hemoglobin E gene) มีลำดับเบส ดังนี้ -ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี163 (forward primer; G163) 5’ CCCTGGCCCACAAGTACTAC 3’ -รีเวิร์ดไพร์เมอร์ เอช 5 (reverse primer; H5) 5’GCAGCCTCACCTTCTTTCATGG 3’ -ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี148 (forward primer; G148) 5’ CCCTTGGACCCAGAGGTTG 3’ -ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี24 (forward primer; G24) 5’ CGT GG ATG AAGTT GGTGGTA 3’ -รีเวิร์ดไพรเมอร์ เอส3 (reverse primer; S3) 5’ T ccc ATAG ACT c ACCCT G AA 3’ 4.ชุดน้ำยาตรวจวินิจฉัยทารกโนครรภ์ก่อนคลอด (prenatal diagnosis) สำหรับโรคโฮโมซัยกัสเบต้าธาลัสซีเมีย (homozygous (3-thalassemia disease) และโรคเบต้าธาลัสซีเมีย/ฮีโมโกลบินอี ((เบตา-thalassemia/hemoglobin E disease) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chainreaction) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง ไพรเมอร์กลุ่มที่ 3 คอมพาวด์เฮทเทอโรไซกัสเบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียชนิดโคดอน 17/ยีนฮีโมโกลบินอี (compound heterozygous (เบตา องศา-thalassemia (codon 17)/hemoglobin Egene) มีลำดับเบส ดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอสเอฟ14 (forward primer; SF14) 5’ TCCCTCAGAAAAGGATTCAA 3’ -รีเวิร์ดไพร์เมอร์ จี10 (reverse primer; G10) 5’ AGACTAGCACTGCAGATTCC 3’ -ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอส1 (forward primer; S1) 5’ TGTCATCACTTAGACCTCAC 3’ -รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี18 (reverse primer; G18) 5’ ACTTCATCCACGTTCACCTA 3’ -ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี24 (forward primer; G24) 5’ CGTGGATGAAGTTGGTGGTA 3’ -รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี72 (reverse primer; G72) 5’ GACCACCAGCAGCCTAAGGG 3’ 5.ชุดน้ำยาตรวจวินิจฉัยทารกในครรภ์ก่อนคลอด (prenatal diagnosis) สำหรับโรคโฮโมซัยกัสเบต้าธาลัสซีเมีย (homozygous (3-thalassemia disease) และโรคเบต้าธาลัสซีเมีย/ฮีโมโกลบินอี (เบตา-thalassemia/hemoglobin E disease) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chainreaction) ตามข้อถือสิทธิที่ 1-4 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่งมีขั้นตอนการใช้ดังนี้ ก. เตรียมตัวอย่างสำหรับตรวจ กรณีตัวอย่างน้ำครํ่า ให้นำน้ำครํ่าปริมาตร 1.5 มิลลิลิตร ไปปั่นที่ความเร็วรอบ 8000 อารีพีเอ็ม (rpm) เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นดูดส่วนใสด้านบนปริมาตร 1.4 มิลลิลิตร ออกทิ้ง ผสมนํ้าคร่ำและตะกอนที่เหลือปริมาตร 0.1 มิลลิลิตร เข้าด้วยกัน จะได้เป็นนํ้าคร่ำเข้มข้น โดยใน 1 ปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น(polymerase chain reaction) จะใช้นํ้าครํ่าเข้มข้น 3 ไมโครลิตรในการทำปฏิกิริยากรณีตัวอย่างเลือด ให้นำตัวอย่างเลือดที่เจาะจากสายสะดือของทารกที่อยูในครรภ์ที่ผสมสารกันเลือดแข็งอีดีทีเอ (EDTA blood)แล้ว นำมาผสมกับสาร ก. นํ้ายาที่ใช้เตรียมตัวอย่างเลือด ในอัตราส่วน 1 ต่อ 5โดยใน 1 ปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) จะใช้ตัวอย่างเลือดที่ผ่านขั้นตอนการเตรียม 1 ไมโครลิตรในการทำปฏิกิริยา ข. จากนั้นผสมน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chainreaction) โดยผสมสารจากชุดน้ำยาตรวจวินิจฉัยตามข้อถือสิทธิที่ 1 (สารข้อ ข.-ซ.) ให้เข้ากันดี โดยเลือกผสมชุดไพรเมอร์ (primer) ตามกลุ่มไพรเมอร์ที่ต้องการตรวจ ค. จากนั้นเติมน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction)ลงในหลอดทดลอง โดย 1 ปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) จะต้องเติมน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) ปริมาณ 46.6ไมโครลิตร ง. จากนั้นเติมเอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (DNA polymerase enzyme) (ซึ่งไม่ได้ระบุอยู่ในชุด น้ำยา) ลงในหลอดทดลองที่มีน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chainreaction) แล้วผสมให้เข้ากันดี โดยใน 1 ปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction)ที่มีน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) ปริมาณ 46.6ไมโครลิตร จะใช้เอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (DNA polymerase enzyme) 0.4 ไมโครลิตรในการทำปฏิกิริยา) จ. จากนั้นเติมน้ำครํ่าเข้มข้นหรือตัวอย่างเลือดที่ผ่านขั้นตอนการเตรียมตามปริมาณที่ระบุลงในหลอดทดลองที่มีน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) และเอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (DNA polymerase enzyme) ผสมกันรอแล้ว แล้วผสมให้เข้ากันดี ฉ. นำไปเพิ่มปริมาณชิ้นส่วนดีเอ็นเอหรือพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction)โดยจะอยู่ภายใต้เงื่อนไขของเทคนิคอัลลีลสเปซิฟิกพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (allele specific polymerasechain reaction, ASPCR) จากดีเอ็นเอต้นแบบ (DNA template) ที่อยู่ในตัวอย่างนํ้าครํ่าหรือเลือด โดยเครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมโดยอาศัยปฏิกิริยาลูกโซ่ (thermal cycle) ซ. นำชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เพิ่มปริมาณแล้วมาแยกด้วยวิธีอะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟรีซีส (agarose gelelectrophoresis) โดยใช้เจลอะกาโรส (agarose gel) ความเข้มข้นร้อยละ 2 แล้วนำไปตรวจสอบโดยผ่านเครื่องถ่ายภาพเจลโดยอาศัยแสงจากหลอดไฟอัลตร้าไวโอเลต 6. การใช้ชุดนํ้ายาตรวจวินิจฉัยทารกในครรภ์ก่อนคลอด (prenatal diagnosis) สำหรับโรคโฮโมซัยกัสเบต้าธาลัสซีเมีย (homozygous (เบตา-thalassemia disease) และโรคเบต้าธาลัสซีเมีย/ฮีโมโกลบินอี (เบตา- thalassemia/hemoglobin E disease) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chainreaction) ตามข้อถือสิทธิที่ 5 ที่ซึ่ง เครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมโดยอาศัยปฏิกิริยาลูกโซ่ (thermal cycle)ตั้งโปรแกรมและอุณหภูมิดังนี้ ขั้นที่ 1 อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที (เฉพาะรอบที่หนึ่ง) ขั้นที่ 2 อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 นาที ขั้นที่ 3 อุณหภูมิ 63 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 นาที (สำหรับคอมพาวด์เฮทเทอโรไซกัสเบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียชนิดโคดอน 41/42/เบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียชนิดโคดอน 17 (compound heterozygous (เบตา องศา-thalassemia (codon 41/42)/(เบตา องศา-thalassemia (codon 17)) อุณหภูมิ 62 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 นาที (สำหรับคอมพาวด์เฮทเทอโรไซกัสเบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียชนิดโคดอน 41/42/ยีนฮีโมโกลบินอี (compound heterozygous (เบตา องศา-thalassemia (codon 41/42)/hemoglobin E gene) อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 นาที (สำหรับคอมพาวด์เฮทเทอโรไซกัสเบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียซนิดโคดอน 17/ยีนฮีโมโกลบินอี (compound heterozygous (เบตา องศา-thalassemia (codon 17)/hemoglobinE gene) ขั้นที่ 4 อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 90 วินาที โดยขั้นที่ 2-4 ทำซํ้าจำนวน 36 รอบ ขั้นที่ 5 อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10 นาที (เฉพาะรอบสุดท้าย)เมื่อสิ้นสุดปฏิกิริยาตั้งอุณหภูมิไว้ที่ 10 องศาเซลเซียส จนกว่าจะนำเอาชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เพิ่มปริมาณเรียบร้อยแล้วไปตรวจสอบ ------------ หน้า 1 ของจำนวน 5 หน้า ข้อถือสิทธิ

1. ชุดน้ำยาตรวจวินิจฉัยทารกในครรภ์ก่อนคลอด (prenatal diagnosis) สำหรับโรคโฮโม ซัยกัสเบต้าธาลัสซีเมีย (homozygous (สัญลักษณ์)-thalassemia disease) และโรคเบต้าธาลัสซีเมีย/ฮีโมโกลบินอี ((สัญลักษณ์)- thalassemia/hemoglobin E disease) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) ประกอบไปด้วย ก. น้ำยาที่ใช้เตรียมตัวอย่างเลือด ประกอบไปด้วย โซเดียมไฮดรอกไซด์ (NaOH) ความเข้มข้น 0.005 โมลาร์, โซเดียมคลอไรด์ (NaCl) ความเข้มข้น 0.1 โมลาร์, ไตรตันเอ็กซ์-100 (Triton X-100) ความเข้มข้น 1 เปอร์เซ็นต์ และไดเมทิล ซัลฟอกไซด์ (dimethyl sulfoxide) ความเข้มข้นร้อยละ 5 ข. สารละลายบัฟเฟอร์ (buffer) ที่ประกอบไปด้วย ทริส-ไฮโดรคลอริก (Tris- HCI) ที่มีค่าพีเอช 9.0 ความเข้มข้น 20 มิลลิโมลาร์, โพแทสเซียมคลอไรด์ (KCl) ความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์, แอมโมเนียมซัลเฟต (NH4)2SO4) ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ และเจลาติน (gelatin) ความเข้มข้นร้อยละ 0.1 ค. ดีเอ็นทีพีเบส (dNTPs base) (ประกอบด้วยเอ (A) ที (T) ซี (C) และจี (G) รวมกัน) ความเข้มข้น รวมทั้งหมด 0.4 มิลลิโมลาร์ ง. สารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (MgCl2) ความเข้มข้น 2 มิลลิโมลาร์ จ. สารละลายบีเทน (Beyaine) ความเข้มข้น 1005 โมลาร์ ฉ. สารละลายไดเมทิล ซัลฟอกไซด์ (Dimethyl sulfoxide) ความเข้มข้นร้อยละ 4 ช. น้ำกลั่นปราศจากเชื้อ สำหรับปรับปริมาตร ซ. ชุดไพรเมอร์ (primer) ที่ซึ่งแบ่งออกเป็น 3 กลุ่มตามลักษณะทางพันธุกรรมอันเป็นสาเหตุของโรค หรือจีโนไทป์ (genotype) ทั้ง 3 แบบ โดยไพรเมอร์ทั้ง 3 กลุ่ม คือ กลุ่มที่ 1 คอมพาวด์เฮทเทอโรไซกัสเบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียชนิดโคดอน 41/42/เบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียชนิด โคดอน 17 (compound heterozygous (สัญลักษณ์)0-thalassemia (codon 41/42)/ (สัญลักษณ์)0-thalassemia (codon 17)) ประกอบด้วย - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ แกมมา4 (forward primer; (สัญลักษณ์)4) ความเข้มข้น 0.9 พีโคโมล - รีเวิร์ดไพร์เมอร์ แกมมา5 (reverse primer; (สัญลักษณ์)5) ความเข้มข้น 0.9 พีโคโมล - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอส1 (forward primer; S1) ความเข้มข้น 1.5 พีโคโมล - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี22 (reverse primer; G22) ความเข้มข้น 0.6 พีโคโมล - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี18 (reverse primer; G18) ความเข้มข้น 1.02 พีโคโมล กลุ่มที่ 2 คอมพาวด์เฮทเทอโรไซกัสเบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียชนิดโคดอน 41/42/ยีนฮีโมโกลบินอี (compound heterozygous (สัญลักษณ์)0-thalassemia (codon 41/42)/hemoglobin E gene) ประกอบด้วย - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี163 (forward primer; G163) ความเข้มข้น 0.0255 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพร์เมอร์ เอช5 (reverse primer; H5) ความเข้มข้น 0.0255 พิโคโมล - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี148 (forward primer; G148) ความเข้มข้น 1.8 พิโคโมล หน้า 2 ของจำนวน 5 หน้า - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี24 (forward primer; G24) ความเข้มข้น 0.3 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพรเมอร์ เอส3 (reverse primer; S3) ความเข้มข้น 0.3 พิโคโมล กลุ่มที่ 3 คอมพาวด์เฮทเทอโรไซกัสเบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียขนิดโคดอน 17/ยีนฮีโมโกลบินอี (compound heterozygous (สัญลักษณ์)0-thalassemia (codon 17)/hemoglobin E gene) ประกอบด้วย - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอสเอฟ14 (forward primer; SF14) ความเข้มข้น 0.3 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพร์เมอร์ จี10 (reverse primer; G10) ความเข้มข้น 0.3 พิโคโมล - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอส1 (forward primer; S1) ความเข้มข้น 2.1 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี18 (reverse primer; G18) ความเข้มข้น 2.1 พิโคโมล - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี24 (forward primer; G24) ความเข้มข้น 0.9 พิโคโมล - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี72 (reverse primer; G72) ความเข้มข้น 0.9 พิโคโมล

2. ชุดน้ำยาตรวจวินิจฉัยทารกในครรภ์ก่อนคลอด (prenatal diagnosis) สำหรับโรคโฮโม ซัยกัสเบต้าธาลัสซีเมีย (homozygous (สัญลักษณ์)-thalassemia disease) และโรคเบต้าธาลัสซีเมีย/ฮีโมโกลบินอี (สัญลักษณ์)- thalassemia/hemoglobin E disease) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง ไพรเมอร์กลุ่มที่ 1 คอมพาวด์เฮทเทอโรไซกัสเบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียชนิดโค ดอน 41/42/เบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียชนิดโคดอน 17 (compound heterozygous (สัญลักษณ์)0-thalassemia (codon 41/42)/ (สัญลักษณ์)0-thalassemia (codon 17)) มีลำดับเบส ดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ แกมมา4 (forward primer; (สัญลักษณ์)4) 5’ GGCCTAAAACCACAGAGT 3’ - รีเวิร์ดไพร์เมอร์ แกมมา5 (reverse primer; (สัญลักษณ์)5) 5’ CCAGAAGCGAGTGTGTGGAA 3’ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอส1 (forward primer; S1) 5’ TGTCATCACTTAGACCTCAC 3’ - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี22 (reverse primer; G22) 5’ GAGTGGACAGATCCCCAAAGGACTCAACCT 3’ - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี18 (reverse primer; G18) 5’ ACTTCATCCACGTTCACCTA 3’

3. ชุดน้ำยาตรวจวินิจฉัยทารกในครรภ์ก่อนคลอด (prenatal diagnosis) สำหรับโรคโฮโม ซัยกัสเบต้าธาลัสซีเมีย (homozygous ((สัญลักษณ์)-thalassemia disease) และโรคเบต้าธาลัสซีเมีย/ฮีโมโกลบินอี ((สัญลักษณ์)- thalassemia/hemoglobin E disease) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง ไพรเมอร์กลุ่มที่ 2 คอมพาวด์เฮทเทอโรไซกัสเบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียชนิดโค ดอน 41/42/ยีน ฮีโมโกลบิน อี (compound heterozygous (สัญลักษณ์)0-thalassemia (codon 41/42)/hemoglobin E gene) มีลำดับเบส ดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี163 (forward primer; G163) 5’ CCCTGGCCCACAAGTACTAC 3’ - รีเวิร์ดไพร์เมอร์ เอช5 (reverse primer; H5) 5’ GCAGCCTCACCTTCTTTCATGG 3’ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี148 (forward primer; G148) 5’ CCCTTGGACCCAGAGGTTG 3’ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี24 (forward primer; G24) 5’ CGTGGATGAAGTTGGTGGTA 3’ หน้า 3 ของจำนวน 5 หน้า - รีเวิร์ดไพรเมอร์ เอส3 (reverse primer; S3) 5’ TCCCATAGACTCACCCTGAA 3’

4. ชุดน้ำยาตรวจวินิจฉัยทารกในครรภ์ก่อนคลอด (prenatal diagnosis) สำหรับโรคโฮโม ซัยกัสเบต้าธาลัสซีเมีย (homozygous (สัญลักษณ์)-thalassemia disease) และโรคเบต้าธาลัสซีเมีย/ฮีโมโกลบินอี ((สัญลักษณ์)- thalassemia/hemoglobin E disease) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง ไพรเมอร์กลุ่มที่ 3 คอมพาวด์เฮทเทอโรไซกัสเบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียชนิดโค ดอน 17/ยีนฮีโมโกลบินอี (compound heterozygous (สัญลักษณ์)0-thalassemia (codon 17)/hemoglobin E gene) มีลำดับเบส ดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอสเอฟ14 (forward primer; SF14) 5’ TCCCTCAGAAAAGGATTCAA 3’ - รีเวิร์ดไพร์เมอร์ จี10 (reverse primer; G10) 5’ AGACTAGCACTGCAGATTCC 3’ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอส1 (forward primer; S1) 5’ TGTCATCACTTAGACCTCAC 3’ - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี18 (reverse primer; G18) 5’ ACTTCATCCACGTTCACCTA 3’ - ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ จี24 (forward primer; G24) 5’ CGTGGATGAAGTTGGTGGTA 3’ - รีเวิร์ดไพรเมอร์ จี72 (reverse primer; G72) 5’ GACCACCAGCAGCCTAAGGG 3’

5. ชุดน้ำยาตรวจวินิจฉัยทารกในครรภ์ก่อนคลอด (prenatal diagnosis) สำหรับโรคโฮโม ซัยกัสเบต้าธาลัสซีเมีย (homozygous (สัญลักษณ์)-thalassemia disease) และโรคเบต้าธาลัสซีเมีย/ฮีโมโกลบินอี ((สัญลักษณ์)- thalassemia/hemoglobin E disease) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) ตามข้อถือสิทธิที่ 1-4 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่งมีขั้นตอนการใช้ดังนี้ ก. เตรียมตัวอย่างสำหรับตรวจ กรณีตัวอย่างน้ำครํ่า ให้นำน้ำครํ่าปริมาตร 1.5 มิลลิลิตร ไปปั่นที่ความเร็วรอบ 8000 อาร์พีเอ็ม (rpm) เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นดูดส่วนใสด้านบนปริมาตร 1.4 มิลลิลิตร ออกทิ้ง ผสมน้ำครํ่าและตะกอนที่เหลือ ปริมาตร 0.1 มิลลิลิตร เข้าด้วยกัน จะได้เป็นน้ำคร่ำเข้มข้น โดยใน 1 ปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) จะใช้น้ำครํ่าเข้มข้น 3 ไมโครลิตรในการทำปฏิกิริยา กรณีตัวอย่างเลือด ให้นำตัวอย่างเลือดที่เจาะจากสายสะดือของทารกที่อยู่ในครรภ์ที่ผสมสารกันเลือด แข็งอีดีทีเอ (EDTA blood)แล้ว นำมาผสมกับสาร ก. น้ำยาที่ใช้เตรียมตัวอย่างเลือด ในอัตราส่วน 1 ต่อ 5 โดยใน 1 ปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) จะใช้ตัวอย่างเลือดที่ผ่านขั้นตอน การเตรียม 1 ไมโครลิตรในการทำปฏิกิริยา ข. จากนั้นผสมน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) โดยผสมสารจาก ข้อ ข. - ซ. ตามข้อถือสิทธิที่ 1 เข้ากันดี โดยเลือกผสมสาร ข้อ ซ. ตามกลุ่มไพร เมอร์ที่ต้องการตรวจ ค. จากนั้นเติมน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) ลงในหลอดทดลอง โดย 1 ปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) จะต้องเติม หน้า 4 ของจำนวน 5 หน้า น้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) ปริมาณ 46.6 ไมโครลิตร ง. จากนั้นเติมเอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (DNA polymerase enzyme) (ซึ่งไม่ได้ระบุอยู่ในชุด น้ำยา) ลงในหลอดทดลองที่มีน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) แล้วผสมให้เข้ากันดี โดยใน 1 ปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) ที่มีน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) ปริมาณ 46.6 ไมโครลิตร จะใช้เอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (DNA polymerase enzyme) 0.4 ไมโครลิตรในการทำ ปฏิกิริยา) จ. จากนั้นเติมน้ำครํ่าเข้มข้นหรือตัวอย่างเลือดที่ผ่านขั้นตอนการเตรียมตามปริมาณที่ระบุลงในหลอด ทดลองที่มีน้ำยาสำหรับการทำปฏิกิริยาพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) และ เอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (DNA polymerase enzyme) ผสมกันรอแล้ว แล้วผสมให้เข้ากันดี ฉ. นำไปเพิ่มปริมาณชิ้นส่วนดีเอ็นเอหรือพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) โดยจะอยู่ภายใต้เงื่อนไขของเทคนิคอัลลีลสเปซิฟิกพอลิเมอเรสเชนรีแอคชั่น (allele specific polymerase chain reaction, ASPCR) จากดีเอ็นเอต้นแบบ (DNA template) ที่อยู่ในตัวอย่างน้ำครํ่าหรือเลือด โดยเครื่อง เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมโดยอาศัยปฏิกิริยาลูกโซ่ (thermal cycle) ช. นำชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เพิ่มปริมาณแล้วมาแยกด้วยวิธีอะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟรีซีส (agarose gel electrophoresis) โดยใช้เจลอะกาโรส (agarose gel) ความเข้มข้นร้อยละ 2 แล้วนำไปตรวจสอบโดยผ่าน เครื่องถ่ายภาพเจลโดยอาศัยแสงจากหลอดไฟอัลตร้าไวโอเลต

6. การใช้ชุดน้ำยาตรวจวินิจฉัยทารกในครรภ์ก่อนคลอด (prenatal diagnosis) สำหรับโรคโฮโม ซัยกัสเบต้าธาลัสซีเมีย (homozygous (สัญลักษณ์)-thalassemia disease) และโรคเบต้าธาลัสซีเมีย/ฮีโมโกลบินอี ((สัญลักษณ์)- thalassemia/hemoglobin E disease) ด้วยเทคนิคพอลิเมอเรสเซนรีแอคชั่น (polymerase chain reaction) ตามข้อถือสิทธิที่ 5 ที่ซึ่ง เครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมโดยอาศัยปฏิกิริยาลูกโซ่ (thermal cycle) ตั้งโปรแกรมและอุณหภูมิดังนี้ ขั้นที่ 1 อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที (เฉพาะรอบที่หนึ่ง) ขั้นที่ 2 อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 นาที ขั้นที่ 3 อุณหภูมิ 63 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 นาที (สำหรับคอมพาวด์เฮทเทอโรไซกัสเบต้าศูนย์ ธาลัสซีเมียชนิดโคดอน 41/42/เบต้าศูนย์ธาลัสซีเมียชนิดโคดอน 17 (compound heterozygous (สัญลักษณ์)0- thalassemia (codon 41/42)/(สัญลักษณ์)0-thalassemia (codon 17)) อุณหภูมิ 62 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 นาที (สำหรับคอมพาวด์เฮทเทอโรไซกัสเบต้าศูนย์ธาลัสซีเมีย ชนิดโคดอน 41/42/ยีนฮีโมโกลบินอี (compound heterozygous (สัญลักษณ์)0-thalassemia (codon 41/42)/hemoglobin E gene) หน้า 5 ของจำนวน 5 หน้า อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 นาที (สำหรับคอมพาวด์เฮทเทอโรไซกัสเบต้าศูนย์ธาลัสซีเมีย ชนิดโคดอน 17/ยีนฮีโมโกลบินอี (compound heterozygous (สัญลักษณ์)0-thalassemia (codon 17)/hemoglobin E gene) ขั้นที่ 4 อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 90 วินาที โดยขั้นที่ 2 - 4 ทำซํ้าจำนวน 36 รอบ ขั้นที่ 5 อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10 นาที (เฉพาะรอบสุดท้าย) เมื่อสิ้นสุดปฏิกิริยาตั้งอุณหภูมิไว้ที่ 10 องศาเซลเซียส จนกว่าจะนำเอาชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เพิ่มปริมาณ เรียบร้อยแล้วไปตรวจสอบ