SU644760A1 - Способ получени иммобилизованных ферментов - Google Patents

Description

I

Насто щее изобретение относитс  к способу получени  иммобилизованных ферментов , в частности к способу получени  иммобилизованных ферментов углеводного обмена , которые могут найти применение при промышленном получении глюкозы из крахмала и инвертного сиропа. В литературе описано большое число способов получени  иммобилизованных ферментов 1. Несмотр  на это обсто тельство поиски оптимальных в промышленном отношении носителей и способов иммобилизации продолжаютс . С технологической точки зрени  наиболее оптимальными  вл ютс  неорганические носители. Разработаны различные способы активации этих носителей дл  последующей иммобилизации на них белков-ферментов 1. Однако эти способы обычно трудоемки и часто активность иммобилизованных ферментов невысока.

Известен, например, способ получени  иммобилизованных ферментов 2 путем ковалентного св зывани  ферментов с. неорганическим носителем, активированным кремнийорганическими соединени ми обшей формулы:

yrtSiR4-n,

где У - радикал, содержаший амино-, карбонильную , карбоксильную, оксифенильную

или сульфгидрильную группы; R - алкоксиили фенокси-радикал, галоген; .

В этом способе активированный носитель не имеет функциональных групп, способных непосредственно взаимодействовать с функциональными группами белка с образованием устойчивой ковалентной св зи. Дл  образовани  такой св зи требуетс  или дополнительна  активаци  функциональных групп носител  перед иммобилизацией, или иммобилизацию провод т в присутствии сшивающих агентов.

Целью описываемого способа  вл етс  устранение недостатков известного способа, т. е. упрощение процесса иммобилизации и повышение активности иммобилизованных ферментов. Указанна  цель достигаетс  за счет того, что иммобилизацию ферментов провод т на неорганическом носителе, активированном у-глицедоксипропилтриэтоксиСиланом

(С2Н50)&1Сснр-Осн,гн-сн, оо

Силанизированный носитель содержит активные эпоксидные группы, -способные непосредственно взаимодействовать с функциональными группами белка. Иммобилизацию белка обычно осуществл ют при знэчени х рН, близких к рН-оптимуму действи  ферментов; это способствует сохранению активности ферментов и при температуре 20-40°С, что значительно сокращает врем  иммобилизации.

Согласно изобретению, описываетс  упрощенный способ получени  иммобилизованных ферментов, обладающих высокой активностью . Способ заключаетс  в том, что ферменты иммобилизуют на «еорганических носител х, активированных предварительно у-глицедоксипропилтриэтоксисиланом .

Предпочтительно процесс провод т следующим образом.

I стади  - актив аци  носител . Неорганический носитель обрабатывают 2,5- 10%-«ым. раствором -у лицедоксипропилтриэтоксисилана в апротонном растворителе . Активированный носитель промывают апротонным растворителем и сушат. Активированный носитель суспендируют в растворе фермента при значени х рН, близких к рН-оптимуму действи  иммобилизуемого фермента, и провод т иммобилизацию при 20-40°С. После промывки буфером и водой определ ют активность иммобилизованного фермента. За единицу активности глюкоамилазы прин то количество фермента, производ щего 1 мкмоль глюкозы за 1 мин при гидролизе 1%-ного раствора крахмала (0,1 М ацетатный буфер, рН 4,7, 30°С). За единицу активности глюкозооксидазы прин то количество фермента, производ и1,его 1 мкмоль Н202 за 1 мин при инкубации в 3%-ном растворе глюкозы (0,1 М ацетатный буфер, рН 5,6, 30°С). Активность определ ли титрометрическим методом или по убыли глюкозы. За единицу активности инвертазы принимают количество фермента, которое превращает 1 мкмоль сахарозы в глюкозу и фруктозу за 1 мин при инкубации в 7%- ом растворе сахарозы (01 М ацетатный буфер, рН 4,7, 30°С).

Пример l.KlOr силохрома С-80 прибавл ли 30 мл 2,5% (об.) раствора у-глицедоксипропилтриэтоксисилана в ацетоне и оставл ли в контакте на 15 мин ; затем избыток жидкости сливали, а силохром высущивали при 100°С в течние 5 ч. К 0,5 г модифицированного силохрома прибавл ли раствор глюкозооксидазы с активностью 25 ед. в 5 мл ацетатного буфера (рН 5,6) и перемещивали на качалке нри в течение 2 ч. Активность иммобилизованной глюкозооксидазы составл ла 30 ед./г носител , т. е. 60% от исходной активности.

Пример 2. В качестве известного способа дл  сравнени  активности иммобилизованных ферментов был вз т способ иммобилизации , описанный в прототипе 2.

Смесь 2 г силохрома и 10 мл 10%-ного (об.) раствора 7 минопропилтриэтоксисилана в толуоле кип тили 10 ч, затем силохром отфильтровывали, промывали ацетоном и высущивали на воздухе. К 2 г полученного силохрома прибавл ли 1 г п-нитробензойной кислотьГи 10 мл 10%-ного дициклогексилкарбодиимида в тетрагидрофу5 ране и перемещивали в течение 2 суток при комнатной температуре. Силохром отфильтровывали , примывалн гор чим метанолом (200 мл) и водой, а затем нрибавл ли 5 г дитнопита натри  в 500 мл воды. Смесь

10 кип тили 0,5 ч, затем силохром промывали водой, ацетоном и высущивали.

К 1 г полученного силохрома прибавл ли 10 мл 0,1 н. раствора ПС1 и после охлаждени  до 6°С порци ми прибавл ли 50 мг

15 нитритацатри . Затем силохром промывали холодной дистиллированной водой, прибавл ли 10 мл охлажденного раствора глюкозооксидазы (50 ед.) и перемещивали при 6°С в течение ночн. Активность иммобилизованной глюкозооксидазы 24,6 ед., что составл ет 50% от исходной активности. Таким образом, применение способа, согласно изобретению, позвол ет получить иммобилизованную глюкозооксидазу с активностью

5 па 10% больше, чем по способу, описанному в прототипе.

Пример 3. К 0,5 г силохрома, активированного у-глицедоксипропилтриэтоксисиланом , согласно прнмеру 1, прибавл ли

0 5 мл раствора инвертазы с активностью 400 ед. в ацетатном буфере с рН 4,5 и перемещивали 2,5 ч при 30°С. Активность иммобилизованной инвертазы 656 ед/г носител , что составл ет 82% от исходной ак5 тивности.Дл  сравнени  проводили иммобилизацию инвертазы по методике, описанной в прототипе. Активность полученного иммобилизованного препарата инвертазы 496 ед/г

0 носител , что .составл ет 62% от исходной активности. Таким образом, способ, согласно изобретению, позвол ет получать препарат иммобилизованной инвертазы с активностью на 20% больше, чем по известному

5 снособу.

Пример 4. К 10 г силохрома, активированного у-глпцедоксипропилтриэтиоксисиланом , согласно примеру 1, прибавл ли

0 10 мл раствора глюкоамилазы с активностью 200 ед. в ацетатном буфере с рН 4,7 и перемешивали 2 ч при 40°С. Активность иммобилизованной глюкоамилазы 280 ед/г носител , что составл ет 70% от исходной

5 активности.

Дл  сравнени  нроводнли иммобилизацию глюкоамилазы по методике, описанной в прототипе. Активность иммобилизованной глюкоамилазы 60 ед/г носител  ( активность нативного фермента 100 ед.), что составл ет 60% от исходной активности. Таким образом, способ согласно изобретению позвол ет получить иммобилизованную глюкоамилазу с активностью на 10% выше,

чем по известному методу.

Claims (9)

1.Способ получени  иммобилизованных ферментов путем ковалентного св зывани  ферментов с неорганическим носителем, активированным органосиланом, отличающийс  тем, что, с целью упрощени  процесса иммобилизации и повышени  активности иммобилизованных ферментов, в качестве органосилана используют глицедоксипропилтриэтоксисилан .

2.Способ по п. 1, отличающийс  тем, что дл  активации носител  используют 2,5-10%-ный раствор -глицедоксипропилтриэтоксисила на.

3.Способ по п. I, отличающийс  тем, что иммобилизацию провод т при значени х рН, близких к рН-оптимуму действи  ферментов.

4.Способ по п. 1, отличающийс  тем, что иммобилизацию провод т при 20- 40°С.

5.Способ по п. 1, отличающийс  тем, что в качестве фермента используют глюкоамилазу.

6.Способ по п. 1, otличaющийc  тем, что в качестве фермента используют

инвертазу.

7.Способ по п. 1, отличающийс  тем, что Б качестве фермента используют глюкозооксидазу.

8. Способ по п. 1, отличающийс  тем, что в качестве неорганического носител  используют силохром.

9. Способ по п. I, отличающийс  тем, что в качестве неорганического носител  используют силикагель.

Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе

1.Иммобилизованные ферменты. Т. 1, 2. Ред. И. В. Березин, В, К- Антонов и

К. Мартинек. МГУ, 1976.

2.Патент США № 3519538, кл. 195-63, опубл. 1970 (прототип).